De e minación de la ac i idad biológica y
de la biomasa en sis emas de depu ación.
Aplicación en la de ección de es ados
de inhibición o oxicidad
Lau a lsac y Ca men A náiz*.
Depa amen o de !ngenie ía Química y Ambien al, Escuela Uni e si a ia Pol¡ écnica.
Uni e sidad de Se illa. Vi gen de iñ ica,7.41011 Se illa, España.
Biomass Cha ac e iza ion and Biological A i ,i l. Tes s i Was ewa e T ea uen .
Ap¡ licabili o he Assessn en o Inhibi o and Toxic Pollu an s.
De e minació de I'ac i i c biológica i de la bion ussa en .sis emes de depu ació.
Aplicació e la de ecci i cl'es c s cl'inhíbició o oxici a .
Recibido: 25-lV-2005
RESUMEN
Los ensayos de de ección de la oxicidad en el ango
ac i o que son ealizados sob e los p opios mic oo ga-
nismos del sis ema es án basados en la es imación de
la iabilidad y ni eles de ac i idad biológica de dichos
mic oo ganismos en espues a al uimpac o, ambien al
ecibido. Viabilidad y ac i idad de la biomasa mic obia-
na son de po si pa áme os de con ol del p oceso cuyas
de e minaciones pueden se adap adas a los p ocedi-
mien os de e aluación de Ia inhibición o oxicidad eje -
cidos po de e minados compues os p esen es en los
in luen es de las es aciones depu ado as.
En es e abajo se ealiza una e isión de los p incipales
mé odos de de e minación de la ac i idad biológica y de
la biomasa, así como de sus aplicaciones a la de ección
de es ados de inhibición/ oxicidad sob e una mues a de
ango ac i o.
Palab as claye.' Ac i idad biológica. Biomasa. Fango
ac i o. Mé odos. Toxicidad. T a amien o de aguas esi-
duales.
SUMMARY
The oxici y assessmen o pollu an s on he ac i a ed
sludge p ocess is based on he de e mina ion o he phy-
siological s a e, he iabili y and he ac i i y o he he e-
o ophic bíomass. Viabili y and biomass ac i i y a e
impo an p ocess con ol pa ame e s and hei de e -
mina ions could be employed in o de o e alua e he
oxici y o con aminan s in was ewa e ea men s.
ln his wo k, ad anced and con en ional analy ical me -
hods o ac i i y and biomass de e mina ion in he ac i-
a ed sludge p ocess a e e iewed.
Key wo ds: Ac i a ed sludge. Biomass. Biomass ac i i y.
Me hods. Toxici y. Was ewa e ea men .
RESUM
Els assaigs de de ecció de la oxici a en el ang ac iu
que es eali zen sob e els p opis mic oo ganismes del
sis ema es basen en I'es imació de la iabili a i dels
ni ells d'ac i i a biológica dels esmen a s mic oo ga-
nismes en espos a a «l'impac e,> ambien al ebu .
Viabili a i ac i i a de la biomassa mic obiana són de pe
si pa áme es de con ol del p océs, poden -se adap a
la se a de e minació als p ocedimen s d,a aluació de la
inhibició o oxici a ocas¡ona s pe de e mina s com-
pos os p esen s en els in luen s de les es acions depu-
ado es.
En aques eball, es eali za una e isió dels p incipals
mé odes de de e minació de l'ac i i a bioldgica i de la
biomassa, així com de les se es aplicacions a la de ec-
ció d'es a s d'inhibició/ oxici a sob e una mos a de ang
ac iu.
Mo s clau: Ac i i a biológica. Biomassa. Fang ac iu.
Mé odes. Toxici a , T ac amen d,aigües esiduals.
1. INTRODUCCIÓN
En cualquie es ación depu ado a de aguas esiduales
(EDAR), la p ác ica más ex endida de e aluación de ac-
o es an impo an es como la iabilidad o el ni el de ac i-
idad biológica del cul i o depu ado consis e en el empleo
* Au o pa a la co espondencia:
Ca men A náiz.
Telé ono: 95 455 28 12
Fax 95 42827 77
e-mail: [email p o ec ed]
197
de los mé odos clásicos de es imación de la biomasa (peso
seco o mé odos di ec os de ecuen o celula , p. ej.). Sin
emba go, el uncionamien o de una EDAR es á in luencia-
do, en g an medida, po la calidad de la biomasa en el sis-
ema, cuya ac i idad puede se de e minada. Las medi-
das de ac i idad biológica deben se i pa a que el
explo ado se an icipe a es ados de baja e icacia en la
depu ación y pueda adop a las medidas pe inen es en
p e ención. En algunas ocasiones, cie os con aminan es
llegados al sis ema son los esponsables de dichos es a-
dos de baja e icacia depu ado a, que son de ec ados una
ez que se han p oducido bajos ni eles de ac i idad bio-
lógica. En o as ocasiones, la ope ación de clo ación mal
plani icada en el eac o es esponsable de un d ás ico
descenso en la ac i idad biológica, con epe cusión sob e
los endimien os depu ado es, los cuales no son es a-
blecidos has a la " ecupe ación, de la biomasa.
En es e abajo se a a án dis in os mé odos de cuan i i-
cación de la ac i idad biológica y de e minación de la bio-
masa, p ocedimien os que en e sus apl¡caciones cuen-
an con Ia de ección de es ados de inhibición o oxicidad
de la biomasa y que, po de inición, pe mi en conoce la
espues a o ecida po la p opia suspensión biológica
some ¡da a es ud¡o.
2. MÉToDoS INDIREcTos DE EVALUAoIÓN
DE LA BIOMASA. ESTIMACIÓN DE
LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA.
Los mé odos ¡nd¡ ec os de e aluación de la biomasa se
basan, undamen almen e, en la cuan i icación de alguna
ac i idad enzimá ica (mé odos bioquímicos), en la medi-
da de consumo de un sus a o o en la o mación de algún
p oduc o (mé odos ciné icos), o en la de e minación de
algún componen e celula especí ico (ATP, p. ej.). Los mé o-
dos bioquímicos y ciné icos de e minan, más que la ia-
bilidad de las bac e ias, su ac i idad, ya que dependen
más del es ado me abólico de los mic oo ganismos que
del núme o de indi iduos.
2.1. Mé odos bioquímicos
En su mayo ía, la medida de ac i idades enzimá icas se
lle a a cabo median e la con e sión de sus a os espe-
cí icos a p oduc os colo eados que son cuan i icados
o omé icamen e. Los ensayos enzimá icos son sim-
ples de ealiza y sus esul ados se ob ienen ápida-
men e, empleando un equipamien o que no es ni cos-
oso ni complejo('). Sin emba go, las p incipales
des en ajas de los mé odos bioquímicos son la a ia-
ción de las ac i idades enzimá icas celula es con los
cambios isiológicos y, que una ez que los mic oo ga-
nismos mue en, algunas enzimas libe adas pueden pe -
manece ac ¡ as.
El es udio de las ac i idades enzimá icas es una cues ión
de in e és po las siguien es azones:
- Las ac i idades enzimá icas desempeñan un impo an-
e papel en la mine alización e hid ólisis de la con ami-
nación de las aguas('' 'o'.
- La ca ac e ización de las ac i idades enzimá icas p o-
po ciona in onnación sob e la a abilidad de cie os com-
pues os xenobió icos(u).
- Enzimas y, en su de ec o, mic oo ganismos po ado es
de de e minadas ac i idades enzimá icas, pueden se
adicionados a_p ocesos de a am¡en o pa a la mejo a
de la e icacia(u'').
- Cie os pa ones de ac i idad enzimá ica pueden se i
en la ca ac e ización de la ac i idad de una población
mic obiana(').
La ac i idad enzimá ica, comp endida como un indicado
bioquímico, con ecuencia ha sido empleada pa a medi
ac i idad mic obiológica o es ima biomasa mic obiana en
suelos( ' n), cauces na u ales('o), angos ac i os('' "' "' " o',
in luen esí "), sis emas de a amien o de biomasa i¡aí'''u''6'")
eac o es SBR (sequenc ing ba ch eac o ) " "' y en p oce-
sos anae obios('n''). También se ha empleado en el es u-
dio de la biodeg adación de compues os especí icos(").
Las medidas de una de e minada ac i idad enzimá ica pue-
den se ambién u ilizadas pa a cuan i ica el impac o de
un óxico sob e dicha enzima e indi ec amen e sob e el
sis ema biológico. Cambios en ac i idades enzimá icas,
medidos como a iaciones en la concen ación de los p o-
duc os me abólicos o de los sus a os de dichas enzimas,
cons i uyen la base pa a que es os ensayos mic obiológi-
cos puedan se empleados en la de ección de es ados de
inhibición o oxicidad de una de e minada biomasa''''.
Dependiendo de los obje i os del es udio, la ac i idad enzi-
má ica puede es a p esen e en la mayo ía o en la o ali-
dad de los mic oo ganismos (p. ej., ac i idad deshid oge-
nasa). Si, po el con a io, se a a de una ac i idad
enzimá ica especí ica (p. ej., ni a o educ asa o ni oge-
nasa), los e ec os son es udiados sob e un g upo bac e-
iano muy conc e o.
2.1.1. Ac i idades enzimá icas hid olí icas
La medida de Ia ac i idad enzimá ica se p esen a como
una al e na i a a los mé odos adicionales de es imación
de la biomasa y de la ac i idad biológica. Las enzimas
hid olí icas ex acelula es es án d¡ ec amen e i m pl icadas
en la o u a de sus a os complejos en o os más sencillos
de bajo peso molecula . Dichos sus a os, de o a o ma,
no pod ían se in oducidos en la célula y empleados como
uen es de ca bono y de ene gía as se inco po ados al
me abolismo celula de oxidación, donde son sus a os de
enzimas in acelula es('' ").
Algunas de es as enzimas de ac i idad ex acelula son
las enzimas h¡d olí icas a- y B-glucosidasas y las p o ea-
sas, las cuales desempeñan un papel muy impo an e en
las p ime as e apas de la depu ación, pues o que la mayo
pa e de la acción o gánica de un agua esidual es á com-
pues a, p ecisamen e, po ca bohid a os y p o eínas.
Mien as que las c - y B-glucosidasas ac úan ompiendo
los enlaces glucosídicos de los disacá idos esul ados de
la deg adación de polisacá idos, la p o easa (aminopep i-
dasa) ompe las uniones pep ídicas de p o eínas. En e
ales aminopep idasas se encuen a la exopep idasa espe-
cí ica pa a el aminoácido alanina, denominada L-a/a-ami-
nopep idasa.
La os a asa es la enzima que hid oliza los és e es de os-
a o y p oduce la libe ación de los g upos os a o. Las os-
a asas ácida y alcalina, además de di e i en el pH óp i-
mo pa a la ac i idad máxima, se di e encian en el
mecanismo de acción sob e los d¡s in os sus a os. La
cuan i icación de es as cinco enzimas, os a asas alcalina
y ácida, c - y ¡3-glucosidasas y p o easa, se ealiza de o -
ma simila , es deci , med¡an e cuan i icación espec o o-
omé ¡ca del p oduc o esul ado de las espec i as ac i,
idades enzimá icas sob e los sus a os especí icos
suminis ados inicialmen e en cada ensayo(3).
En líneas gene ales, en la bibliog a ía se encuen a que las
ac i idades es e asa y L-ala-aminopep idasa son mayo-
es que las c - y B-glucosidasas y os a asas. po o a pa -
e, el pa ón de dis ibución y la cuan ía de las dis in as
enzimas medidas sob e suspensiones de ango ac i o se
mues an en elación con las ca ac e ís icas del agua de
en ada a plan aí). También se ha hallado una elacidn line-
198
al en e es as ac i ¡dades enzimá icas y la concen ación
de biomasa0 q. En cuan o a una posible elación en e dichas
ac i idades enzimá icas y pa áme os de uncionamien o
del p oceso, exis en au o es que la eba en('). O os au o-
es, sin emba go, encon a on cie a elación en e es as
ac i idades enzimá ¡cas y la ca ga de ope ación en el eac-
o ''''. En cualquie caso, la localización de las enzimas hid o-
lí icas hab á de se enida en cuen a, ya que el hecho de
que sean e enidas p óximas a la célula o a los EPS (ex a-
cellula polyme ic subs ancesJ del lóculo, en ez de lib es
en disolución, e i a la con inua in e sión ene gé ica de los
mic oo ganismos con el in de eemplaza lase'o'. Es o sig-
ni ica que ac i idad enzimá ica- hid olí ica y ac ¡ idad me a-
bólica han de se a adas po sepa ado. Es e hecho hab á
de ene se espec¡almen e en cuen a en el caso de sis e-
mas anae obios, en los que la biomasa a ada ha sido eci -
culada y p o iene de o os compa imen os, en los que ha
podido ocu i al acumulación, sob e odo po el ca ác e
es able de es as enzimas' '.
Los abajos sob e ac i idades enzimá icas son amplios y
han sido aplicados en es udios an di e sos como el segui-
mien o de la espues a me abólica de angos ac ¡ os an e
de e minadas «ca gas de choque" de o igen indus ial. Tal
es el caso de Kib e e a/.''', quienes ealiza on un segui-
mien o de la ac i idad del ango ac i o de un pilo o some-
ido a pulsos c ecien es de enol median e la ca ac e ¡za-
ción de la ac i idad pi oca ecasa. La pi oca ecasa es á
implicada en los p ime os pasos de la deg adación ae o-
bia del enol. El p ocedimien o de medida emplea la cuan-
i icación espec o o omé ica y cons i uye un ejemplo más
de la aplicabilidad de las medidas enzimá icas.
En cualquie caso, abajos como el de Dalzell e al.('o)
demues an la meno sensibilidad de la ac i idad enzimá-
ica L-ala-aminopep idasa en la de ección de es ados de
oxicidad de la biomasa, en e a o os ensayos mic obio-
lógicos de medida de la oxicidad como la inhibición de la
ni i icación, la asa de espi ación, la inhibición de Ia lumi-
niscencia o la medida de ATP.
2.1.2. Ac i idad es e asa
Las es e asas desempeñan un ¡mpo an e papel en la bio-
deg adación de muchas sus ancias na u ales p esen es
en las aguas esiduales ales como lípidos, p o eínas y
algunos compues os químicos sin é icosí'), siendo enzi-
mas ampliamen e dis ibuidas y cons an es en el ango
ac i o. Son ácilmen e ensayadas y han sido empleadas
en la de e minación de biomasa y ac i idad mic obiana en
suelos, aguas esiduales y angos ac i osí'''"'"'"'. En es u-
dios de suelos han sido empleadas de o ma conjun a con
la asa de espi ación, encon ándose una buena elación
en e ambas medidas('). No así en cul i os en ase de c e-
cimien o exponencial de agua esidual o ango ac ¡ o, en
los que la medida del ATP y la asa de espi ación mos-
a on un buen g ado de co elación en e sí, pe o no es-
pec o a la hid ólisis del d¡ace a o de luo esceína("). Lemme
e al. " , quienes emplea on la ac i idad es e asa como
medida de la ac i idad deg adado a he e ó o a en un sis-
ema de angos ac ¡ os, encon a on un compo am¡en o
pa ecido con el es o de ac i idades hid olí icas (c - y 0-
glucosidasa, os a asa y L-a/a-aminopep idasa).
En algunos de los abajos an e io men e ci ados, los sus a-
os empleados como modelos de és e es son el p-ni o enol,
a-na ol o el diace a o de luo esceína. El diace a o de luo-
esceína (FDA) es el sus a o más ampliamen e u ilizado en
la medida de la ac i idad es e asa. Es un compues o que pue-
de se hid olizado po enzimas ales como p o easas, l¡pasas
y es e asas, siendo el p oduc o de dicha con e sión enzimá-
¡ca la luo esceína('). La luo esceína puede se isualizada
median e el empleo de la mic oscopía de epi luo escencia o
cuan i icada med¡an e espec o o ome ía as se ex aída
con disol en es o gánicos. En el campo de la epi luo escen-
cia se han u ilizado de i ados del FDA como el diace a o de
6-ca boxi luo esceína (CFDA) y el diace a o de 5- (y 6-) sul-
o luo esceína (SFDA). Es e úl imo, que se á mencionado pos-
e io men e en el apa ado de écnicas de epi luo escencia,
se ha e elado como el más ap opiado po el momen o(").
2. 1.3. Ac i idad deshid ogenasa (D HA)
En una mues a biológica, la de e minación de la ac i idad
del sis ema de anspo e elec ónico puede ealiza se
median e cuan i icación de la DHA. Todos los mic oo ga-
nismos ae obios poseen un sis ema de anspo e elec-
ónico en el que el más impo an e acep o e minal de
elec ones es el oxígeno. En la co ien e p incipal de es e
anspo e elec ónico pa ¡c¡pan, en e o as, las deshi-
d ogenasas, enzimas de oxido- educción que median e la
ans e enc¡a de hid ógeno in e ienen en el anspo e de
elec ones desde un sus a o o gánico a un acep o inal
de elec ones. La de e minación de la DHA y en su ex en-
sión de la ac i idad espi a o ia mic obiológica, puede ea-
liza se midiendo lacapacidad de los mic oo ganismos pa a
educi un indicado o colo an e edox, de los que las sales
de e azolio son las empleadas con mayo ecuencia.
En e dichas sales se encuen an el clo u o de 2,3,5- i e-
nil e azolio C) V el clo u o de 2-(p-iodo eni )-3(p-ni o-
enil)-S- enil e azolio (lNT). Ambas se ca ac e izan po se
solubles en agua en su o ma ox¡dada y po o ma depó-
si os celula es insolubles de o mazán, TTO- o mazán e
INT- o mazán, espec ¡ amen e, cuando son educidas po
la ac i idad espi a o ia. Es os depósi os ojizos de o -
mazán, al se obse ados mic oscópicamen e (Figu a 1),
pe mi en dis ingui en mues as acuosas las bac e ias que
espi an de aquellas que no (de e minación di ec a de la
biomasa). O bien, el o mazán es ex aído con disol en es
o gánicos y de e m ipado espec o o omé icamen e, pe -
mi iendo la cuan i icación de la ac i idad espi a o ia de la
mues a (de e minación indi ec a de la biomasa).
a' 3.
{{' *.
,-'! ' -
Figu a 1. Ensayo bioquímico de la DHA. (A) Depósi os in a-
celula es de INT- o mazán (+) en bac e ias ilamen osas.
I 000X, campo cla o. (B) Depósi os in acel ula es de o mazán
en bac e ias o mado as de lóculos. 1000X, campo cla o.
199
'i §'Y
?,: .l
El ácido bencenosul ónico 3'{1 -[( enilamino)-ca bonil]-3,4-
e azoliol-.bis (4-me oxi-6-ni o) (XTT), a di e encia con los
o os colo an es edox, p esen a la pa icula idad de p o-
duci o mazán solub e en agua, lo que e i a el p ocedi-
mien o de ex acción('o).
El TTC, al igual que el azul de me ileno (MEB), p esen a el
incon enien e de su ele ada sensibilidad al oxígeno("). El
INT no iene es a limi ación y su uso es á muy ex endido.
En es e sen ido, el CTC (clo u o de 5-ciano-2,3-di olil e a-
zolio), luo oc omo de más ecien e desa ollo, es á ex en-
diéndose cada ez más en el campo de la epi luo escen-
cia pa a la de e minación di ec a de la biomasa con muy
buenos esul ados, sob e odo al se empleado en com-
binación con o os ma cado es (apa ado 3.2).
En la Tabla I quedan ecogidos dis in os abajos en los que
han sido empleados a ios colo an es edox en di e sas apli-
TABLA ¡
Aplicaciones de las sales de e azolio en es udios medioambien ales.
Au o es Colo an e edox Aplicación
Nyb oe e a/.(') INT De e minación de la ac i idad biológica en angos ac ¡ os y aguas
esiduales de dis in as EDAR y de un pilo o
Goel e a/.(') INT De e minación de la ac i idad en un eac o SBR
Blenkinsopp y Lock('o) INT De e minación de la DHA en biopelículas en íos
Le Bihan y Lessa dnu) TTC Ca ac e ización de la biomasa de un bio il o
Fonseca e a/.íu) INT Ac i idad mic obiana en bio il os pa a po abilización
K iebi zsch e a/.í') XTT/CTC De e minación de la ac i idad en un eac o SBR de alimen ación
sin é ica
Chung y Nee hlingín) INT De e minación de la ac i idad biológica en diges ión anae obia
Bhupa hi aju e a/.eo) cTc De e minación de la ac i idad DHA de mic oo ganismos
anae obios y acul a ¡ os
J@ gensen('u) MB De e minación de la DHA en angos ac ¡ os
Logue e a/.e') INT De e minación de la DHA en angos ac i os con p oblemas de
p oli e ación ilamen osa
Awong e a/.(") INT De e minación de la DHA en espum¿¡s noca dias
López e al. 'n INT Ac i idad de angos ac ¡ os
Ande son e a/.( o) INT Medida de la inhibición de la ac i idad biológica inducida po
me ales pesados en angos ac i os
Kim e al.( ') INT Medida de la inhibición en cul i os pu os y angos ac i os po
e ec o del H,O, y el Clz
Bensaid e a/.( ') Es imación de la ac i idad en cul i os de angos ac i os bajo
dis in os egímenes de alimen ación
lsac( "' INT De e minación de la DHA en angos ac i os y de ección de
la inhibición eje c¡da sob e és os po compues os xenobió icos
Li y Zhao@) TTC De ección de la inhibición mic ob¡ológica en angos ac ¡ os
Kalmbach e a/.0') c c De e minación de la densidad y ac i idad me abólica bac e iana en
la o mación del bio ilm en aguas po ables
CTC: clo u o de 5-ciano-2,3-di olil e azolio; INT: clo u o de 2-(p-iodo enil)-3(p-ni o enil)-S- enil e azol¡o; MB: azul
de me ileno; XTT: ácido bencenosul ónico 3 -{1-[( enilamino)-ca bonil]-3,4- e azolio]-bis (4-me oxi-6-ni o); SBR:
seq u e n c i n g ba ch eac o ; TTC: 2, 3,S- i en i l e azolio.
200
caciones en la de e minación de la ac i idad de la biomasa,
en o os campos además del de las aguas esiduales.
Las expe iencias lle adas a cabo po Smi h y McFe e s('u)
en Escheichia coll han indicado que, en la cadena de ans-
po e elec ónico, la educción del INT y el CTC se locali-
za p incipalmen e a ni el de dos deshid ogenasas la ín
dependien es: el complejo succina o-deshid ogenasa y la
NADH-deshid ogenasa. El CTC, además, pa ece se edu-
cido po o as deshid ogenasas celula es. De la misma
mane a, el INT pod ía se lo po la ubiquinona, posiblemen e
los c¡ oc omos bsss ! bsm, el anión supe óxido y alguna o a
deshid ogenasa donado a de elec ones a la ubiquinona.
Es os mismos au o es, Smi h y McFe e s, han es udiado
el ni el de educción de es os colo an es edox bajo con-
diciones de anae obiosis y en las que son inducidas u as
dis in as de anspo e elec ónico en el o ganismo anae-
obio acul a i o E. coli. Los esul ados indica on que ambas
sales (lNT y CTC) pueden se educidas bajo ales condi-
ciones de oxido educción, pe o p incipalmen e en la u a
de e men ación de la glucosa. Bhupa hi aju e a/.€o) quie-
nes es udia on dis in os o ganismos anae obios acul a ¡-
os y obligados en su elación con la capacidad de edu-
ci el CTC, halla on que, e ec i amen e, ex¡s e educción
del colo an e, sin e idencias de que ocu ie a ex acelu-
la men e o de o ma abió ica. Chung y Nee hlingí") emple-
a on con an e io idad la DHA dependien e del sus a o INT
como pa áme o de con ol de la diges ión anae obia. Es os
au o es encon a on una buena co elación en e dicha
de e minación, el con enido de ATP y o as medidas ¡ndi-
ec as de la ac i idad biológica anae obia ( asa de p o-
ducción de biogas, pH y concen ación de ácidos g asos
olá iles).
La DHA se ha encon ado que gua da buena elación con
o os pa áme os de medida de la ac i idad como es la
asa de espi ación" '28 4'30 3 '32's). Li y Zhao@)de ec a on
inhibición de la biomasa en angos ac i os median e la
educción de los ni eles de DHA dependien e del sus a-
o TTC y de la asa de espi ación especí ica, descensos
de la ac i idad biológica que se elaciona on con d¡sm¡-
nuciones de la eliminación de la DQO (demanda química
de oxígeno) po el sis ema de a amien o.
Si bien los mé odos enzimá ¡cos an e ¡o men e ci ados
basados en las ac i idades de p o easas, glucosidasas,
e c., han esul ado de u ilidad en dis ¡n as aplicaciones,
p esen an el incon enien e de que la hid ólisis de un de e -
minado compues o no es á di ec amen e elacionada con
el p ocesamien o del ca bono o el me abolismo celula
ene gé ico, como el anspo e elec ónico o la os o ila-
ción oxida i a en el caso de la DHA(''). De hecho, Le Bihan
y Lessa d('u), quíenes u iliza on la DHA con el sus a o TTC
y la B-glucosidasa en la ca ac e ización de la biomasa de
un bio il o, encon a on que la exo-enzima p esen a un
pa ón de a iación en unción a la empe a u a que no se
epi e con la DHA, ea i mando la idea de medida enzimá-
ica es able de es a úl ima. Jung e a/. ) con i ma on el
ca ác e es able de es as enzimas en sus expe iencias de
ex acción y ecupe ación de ac i idades enzimá icas de
sob enadan es de angos en exceso, en las que la DHA
medida e a muy in e io espec o al es o de ac i idades
enzimá icas ex acelula es (p o easa, glucosidasa y lipa-
sa) y espec o a los ni eles de ac ¡ idad medidos en el an-
go inicialmen e.
2.1.4. Ac i idad ca alasa
La ac i idad ca alasa es á ampliamen e dis ibuida en la
na u aleza, encon ándose p esen e en células animales,
ege ales y bac e ianas. La cuan i icación de la ac i idad
ca alasa se e ec úa adicionalmen e median e el segui-
mien o espec o o omé ico o median e alo ación de la
desapa ición del sus a o de es a enzima, el pe óxido de
hid ógeno.
O a ap oximación a la de e minación de es a ac i idad se
encuen a en los abajos de Guwy e al. n'"u'"'). En ellos se
expone un mé odo de medida de la ac i idad ca alasa que
puede se u ilizado en la cuan i icac¡ón de biomasa ac i-
a en lodos de depu ado a, suelos, e c., dada la buena
co elación que es a ac i idad enzimá ica gua da con o as
medidas como las espi omé ¡cas' ". O ece, además, la
posibilidad de se adap ada al seguimien o en con inuo de
la biomasa en p ocesos como el de angos ac i os. El mé o-
do se basa en el uso de un medido de lujo gaseoso''u'
capaz de de ec a el oxígeno libe ado esul ado de la ac i-
idad ca alasa, cuando una mues a biológica es pues a
en con ac o con HzO, en unacáma a de eacción. Aunque
es e mé odo no ha sido u ilizado en la cuan i icac¡ón de
e ec os óxicos o inhibi o ios de suspensiones b¡ológicas,
la de ección de un mínimo de nue e unidades de ca ala-
sa po g amo de peso seco de una mues a de suelo, pe -
mi e plan ea u u as aplicaciones pa a es a ac i idad enzi-
má ica.
2.1.5. Ac i idad ATPasa
Es a de e minación de la ac i idad biológica es á basa-
da en la cuan i icación de la ac i idad enzimá ica ATPasa
más que en la es imación del con enido en ATP, pa á-
me o u ilizado du an e la go iempo como índice de bio-
masa mic obiana. El mé odo esencialmen e consis e en
un ensayo in i o, en el que as la adición del óxico a
la enzima y anscu ido un iempo de con ac o su icien-
e, se ensaya la ac i idad ATPasa median e la adición de
ATP como sus a o("). Se a a és e de un ensayo enzi-
má ico empleado especí icamen e en la de ección de la
oxicidad.
2.2. Mé odos ciné icos
La base de es os mé odos es el seguimien o de la p o-
ducción o consumo de un de e minado compues o de con-
cen ación conocida po pa e de un cul i o de mic oo -
ganismos, gene almen e en un ensayo en discon inuo. El
ejemplo más ípico en p ocesos ae obios es la de e mi-
nación de la DBO (demanda bioquímica de oxígeno), que
indica la biodeg adabilidad de un sus a o en disolución a
a és del consumo de oxígeno del medio.
2.2.1. Tasa de espi ación (OUFi, oxygen up ake a eJ
Se denomina espi ación al consumo de oxígeno de los
mic oo ganismos p esen es en una mues a biológica debi-
do a la espi ación endógena de man enimien o celula y
a la oxidación del su a o o gánico p esen e en ella, en
ausencia de ni i icación. Así pues, se denomina OUR (mg*
L-' d-'¡ a la elocidad con la que los mic oo ganismos u i-
lizan el oxígeno en unción de es os dos concep os('n).
La asa de espi ación básica (OUR") es la o iginada po la
espi ación endógena de man en¡mien o celula en ausen-
cia de ni i icación y po una pequeña pa e de ma e ia
o gánica adhe ida a la masa de mic oo ganismos. En la
p ác ica, se conside a que es cons an e a empe a u a y
concen ación de mic oo ganismos ijos. Un dec ecimien-
o ano mal de la OURu en es as condiciones ep esen a un
signo inequí oco de inhibición espi a o ia y de posible
oxicidad del medio.
La asa de espi ación exógena (OUR") es la o iginada
du an e la oxidación del sus a o o gánico ápidamen e
biodeg adable y es p opo cional al mismo. En el caso de
que exis a un p oceso de ni i icación, OUR" incluye la asa
de espi ación po es e concep o (OUR."). En la Figu a 2
se ep esen a un esquema del compo amien o de la OUR
de un ango ac i o a lo la go del iempo bajo condiciones
ba ch.
La OUR o al e e ida a la concen ación de mic oo ganis-
mos, exp esada es a úl ima como sólidos en suspensión
201
olá iles (SSV), es la asa de espi ación especí ica (SOUR,
speci ic oxygen up ake a e) (ecuación 1):
souR = ${.n", g*"'' d'') 0)
Su p incipal ca ac e ís ica es que de ine la ac i idad bio-
lógica de una biomasa especí ica en un momen o dado y
además es á elacionada con la p opo ción "alimen o/
mic oo ganism6s" (F/M, " oodlmic oo gan¡'sms" en e mi-
nología anglosajona), ya que comp ende la OUR" (p opo -
cional a la DBO) y los SSV del cul i o biológico'""'.
Una es ación depu ado a ecibe aguas esiduales u banas
con una g an a iabilidad en cuan o a caudal y composi-
ción, con oscilaciones es acionales, dia ias y ho a ias en
es echa elación con los egímenes de e acuación de los
di e en es ipos de aguas domés icas, de ac i idades
come ciales, indus iales, e c. Po es a azón, pa a una
concen ación cons an e de sólidos en suspensión (SS) en
el anque de ai eación, se ía de espe a que an o oxíge-
no disuel o (OD) como SOUR p esen a an una espues a
a ales cambios en la composición del in luen e. Así lo con-
i ma on au o es como Schulze y Koois a'o'), quienes no
sólo halla on una elación di ec a en e OUR y SOUR con
elación a la DQO del in luen e, sino ambién un pa ón de
compo amien o dia io y es acional de ambas asas de es-
pi ación en pa alelo con la ca ga o gánica y el caudal
in luen e.
No obs an e, Duggan y Cleasby'o'' encon a on que la OUR
puede a ia independien emen e de las ca ac e ís icas
del in luen e, hecho que a ibuye on a la espi ación endó-
gena y a la acumulación de sus ancias de ese a en la
población bac e iana sob e la que se e ec uó el es udio.
Edwa ds y She a dFn' no encon a on elación alguna en e
la OUR en el eac o biológico y a iaciones en el in luen-
e, en cuan o a ca ga o gánica o a caudal; es os esul a-
dos ue on cues ionados po o os au o es que conside-
a on que las condiciones de abajo e an luc uan es,
aunque sin pode conside a se de es és pa a la biomasa.
Huang y Cheng(o ) halla on una es echa elación en e el
alo de SOUR en el eac o biológico y la DQO soluble del
e luen e, que sin emba go no ue con i mada en el aba-
jo de Chand a e a/.('n)
A pesa de es e ambien e de con a iedades en e los esul-
ados ob enidos po dis in os in es igado es, es cie o que
la espi ome ía o la medida e in e p e ación de la OUR ía
biológica, ha sido y sigue siendo obje o de nume osas
in es igaciones dadas sus di e sas aplicaciones. Una de
ales aplicaciones se encuen a en es echa elación con
el desa ollo de modelos dinámicos en el p oceso de an-
gos ac ¡ os du an e las úl imas décadas. Así, el Modelo no
1 pa a angos ac i os (ASM1), p esen ado po la IAWPRC
TlLsa dc cspi ación al
lo idacií» dc sus a os
liiciln cnlc hiodcg ailablus)
I
Tas cic cspi aci in cnc igcna
I
(ln e na ional Assoc,a ion on Wa e Pollu ion Resea ch and
Con o en 1 987{*) ha sido acep ado y empleado en muchos
es udios de simulación de plan as de a amien o de aguas
esiduales. La simulación se conside a una henamien a de
abajo muy p ác ica, que pe mi e al explo ado la explo-
ación y ensayo de un amplio ango de es a egias de depu-
ación sin iesgos pa a la plan a. La denominada "calib a-
ción del modelo", en la que se equie e p incipalmen e la
ca ac e ización del in luen e y del lodo de la plan a some-
ida a es udio, necesi a de abundan e in o mación ob eni-
da de expe iencias a ni el labo a o io en las que la espi-
ome ía y en conc e o la de e minación de la OUR,
desempeñan un papel esencial. La ca ac e ización de las
dis in as acciones del agua esidual en cuan o a biode-
g adabilidad, así como la es imación de los pa áme os
ciné icos que igen el compo amien o de la biomasa he e-
ó o a en condiciones ae obias, son ci cuns ancias que
han exigido, pe o ambién de i ado, en impo an es a an-
ces en o no a la espi ome ía(46 47'4'4q'50 51),
Un campo de a ance ha sido el desa ollo de nue as éc-
nicas espi omé icas y apa a os de medida que o ecen
la posibilidad de se empleados bajo condiciones dinámi-
cas de uncionamien o. Es a si uación pe mi e, en e o as,
la de e minación on-line de la OUR en el p oceso de an-
gos ac i os. Es o supone un impo an e a ance en las es a-
egias de con ol, pues con dicha de e minación se log an
man ene unas condiciones óp imas en el p oceso de a-
amien o bajo di e sas ci cuns ancias: en la luc uación de
la ca ga, en la de ección inmedia a de e ec os causados
po sus ancias óxicas en el in luen e, e c.'u'' *'*'
Bajo condiciones de labo a o io han sido ambién di e -
sas las écnicas espi omé icas y los p ocedimien os desa-
ollados pa a la de e minación de un p o ocolo de medi-
da de la inhibición esp¡ a o ¡a del ango ac i o, causada
po la oxicidad eje qida po cie os compues os p esen-
es en las aguas esiduales. La OECD (O ganiza ion o
Economic Co-ope a ion and De elopmen ) emi ió su p o-
pio p o ocolo de medida de la inhibición espi a o ia en el
ango ac i o, el es OECD 209, que ha sido e aluado po
dis in os au o es("). La e sión o icial española de la No ma
Eu opea UNE-EN ISO 81 92 de echa ene o de 1 995 se deno-
mina "Ensayo de inhibición del consumo de oxígeno po
lodo ac i ado» y adop a ín eg amen e la No ma
ln e nacional ISO 8192:1986. La USEPA (Uni ed S a es
En i onmen al P o ec ion Agency , en su in en a io de
ensayos, ecoge la medida de la SOUR en e o os p o o-
colos de ipo espi omé ico. Los Mé odos No malizados@)
ecogen ambién la OUR como uno de los ensayos ipo a
ealiza sob e el lodo (2710 B).
En Ni malakhandan e a/.64, se p esen a un ensayo basa-
do en la inhibición de la espi ación que emplea una mez-
cla de doce bac e ias como o ganismos es . Es el p epa-
'lusa de cspi aci in bi ja
I o idilci(in dc susl a os
de biodcg ad ción lcn a)
Figu a 2. Compo amien o de la
asa de espi ación de una mues-
a de ango ac i o bajo condi-
ciones ba ch (En: Se iou y
Blackdl@).
c
C
Tien o (h)
202
ado come c¡al Poly ox@, en el que la espues a óxica se
mide con base a una educción del consumo de oxígeno
po pa e de los mic oo ganismos de ensayo.
Las écnicas espi omé icas han sido ambién empleadas
en la ca ac e ización de los dis in os g upos uncionales
de mic oo ganismos que o man pa e de la comunidad
del ango ac i o, además de los he e ó o os. Es deci las
poblaciones ni ¡ ican es y desni i ican es, de e minadas
a a és de las medidas de las asas de u ilización de amo-
nio (AUR, ammonium up ake a e) y ni a o (NUR, nl a e
up ake a e , espec i amen e(o'' u ).
O a ap oximación a la medida de la OUR es la asa de p o-
ducción de COz. El undamen o de es e p ocedimien o es
el hecho de que la p oducción de COz po pa e de un cul-
i o bac e iano es el e lejo de una se ie de eacciones bio-
químicas, que cons i uyen el p oceso de espi ación de los
mic oo ganismos. Una aplicación de es e p ocedimien o
en la de ección de la oxicidad eje cida po me ales pesa-
dos se encuen a en Ja dim e a/.("n)
2.2.2. Tasa de desapa ición de sus a o
Es el mé odo más con encional pa a de e mina la ac i i-
dad de una población de mic oo ganismos. La disminu-
ción de la concen ación de sus a o en el iempo puede
hace se a a és de mé odos indi ec os como Ia DQO o el
ca bono o gánico o al (COT), o median e écnicas espe-
cí icas, undamen almen e c oma og á icas.
La búsqueda de nue os mé odos ha lle ado al empleo de
écnicas basadas en el uso de elec odos selec i os, en
los que el cálculo de la ac i idad de la mues a biológica
se ealiza con base al iempo eque ido pa a que se p o-
duzca el 50% de la desapa ición del sus a o sum¡n¡s a-
do y pa a el que ql elec odo es especí ico. En el abajo
de Olah y P incz6o)se p esen a la aplicación de un elec-
odo selec ¡ o de glucosa.
2.3. Es imación de componen es celula es especí ¡cos
Cualquie componen e celula seleccionado pa a la es i-
mación de la biomasa i a de una mues a debe espon-
de a es c i e ios undamen ales: (1) es a p esen e úni-
camen e en células i as, (2) se ápidamen e deg adado
cuando las células mue en y (3) se ela i amen e cons-
an e en concen ación espec o a cambios en el es ado
isiológico celula y en e dis in as especies.
Has a el momen o, no se conoce ningún componen e celu-
la que cumpla es os es eque imien os. Sin emba go,
los más adecuados pa a es ¡ma biomasa i a son los áci-
dos nucleicos, las p o eínas, los polisacá idos, los lípidos
y el ATP.
23.1. Ácidos nucleicos
El ADN y el ARN son dos componen es de las bac e ias
cuyas sín esis son p opo cionales a la asa de c ecimien-
o. Mien as que las concen aciones de ARN a ían con-
side ablemen e con el es ado isiológico celula , la can i-
dad de ADN es ela ¡ amen e cons an e.
La can idad de ADN se de e mina median e espec o o o-
me ía, as su ex acción y pu i icación. Exis en di e sas
écnicas, si bien p esen an la des en aja de que los p o-
cedimien os de pu i icación son complejos, con di e sas
in e e encias y bas an e cos osos. Además, el con enido
en ADN del ango ac i o ha sido empleado como una medi-
da de la biomasa con poco éxi o, debido a ci cuns ancias
como su acumulación en los políme os ex acelula es(oo).
2.3.2. P o eínas
Exis en a ias écnicas pa a el análisis de p o eínas o a-
Ies de una mues a biológica. Algunas es án muy ex endi-
das y se ca ac e izan po su sensibilidad, apidez y sim-
plicidad, ^al es el caso de las écn¡cas de Low y e al. "') y
B ad o d( ').
La p incipal des en aja de la de e minación de p o eínas
es que su can idad en las células es á suje a a ue es a ia-
ciones debidas, undamen almen e, a cambios en las con-
diciones ísico-químicas y al es ado isiológico celula .
2.3.3. Polisacá idos
La mayo ía de las células p oca io as con ienen el pep i-
doglicano ácido mu ámico como componen e de la pa ed
celula . Exis en a ias écnicas pa a la de e minación del
ácido mu ámico en mues as que con engan mic oo ga-
nismos. Todas ellas se basan en la con e sión del ácido
mu ámico a lac a o, seguida del análisis enzimá ico o quí-
mico de la concen ación de lac a o. El ácido mu ámico
se ex ae de las células median e una hid ólisis alcalina y
se pu i ica pos e io men e median e c om a og a ía de in e -
cambio <ín co. O os anális¡s más sensibles necesi an del
uso de c oma og a ía líquida de al a esolución o gaseo-
sa. Todas es as écnicas son labo iosas, consumen mucho
¡empo y necesi an de un equipamien o ca o.
2.3.4. Lípidos
Los lípidos son un componen e undamen al de las mem-
b anas celula es que se encuen a en can idades ela i a-
men e cons an es, con un con enido especí ¡co al o.
Ap oximadamen e, en e un g0-98% de los lípidos de las
memb anas celula es es á en o ma de os olípidosl*). Su
de e minación pa a la es imación de la biomasa i a de
una población bac e iana o ece muchas en ajas sob e
o os mé odos, como po ejemplo que no o man pa e de
las ese as celula es y que se deg adan ápidamen e
du an e la lisis bac e iana. Las écnicas de anáisis se basan,
undamen almen e, en la ex acción celula de los os olí-
pidos con un disol en e o gánico, su pos e ¡o hid ólisis
ácida pa a libe a el os a o y, po úl imo, la de e minación
colo imé ica de és e. Son écnicas ela i amen e senci-
llas, ep oducibles y sensibles, con lími es de de ección
de 0,1 a 1 nmol de os a o(uo).
Los lípidos han sido ampliamen e empleados en es udios
medioambien ales'uo) y más ecien emen e se han aplica-
do en sis emas de il ación biológica pa a po abilización('u)
y en eac o es anae obios de lecho luidizado( '' *).
2.3,5, ATP
El ATP es un componen e bioquímico cen al p esen e en
odos los mic oo ganismos y especí ico de los i os al se
des uido ápidamen e as la mue e celula , ca ac e ís i-
ca que le pe mi e se elacionado con la biomasa i a. Una
de las écnicas más u ilizadas pa a medi ATP se basa en
la eacción lucí e ina-luci e asa, p oceso esponsable de
la luz emi ida po las lucié nagas, que ha sido ampliamen e
es udiado.
En es e mecanismo de luminiscencia se sabe que in e -
ienen la luci e ina (LHz), la enzima luci e as (E), ATp, ca io-
nes de magnesio y oxígeno en un p oceso de oxido e-
ducción que ocu e en doble e apa: LHz + ATP + E - E -
LH,-AMP + PPi y, pos e io men e, E-LHTAMP + 02 * L +
HzO + bioluminiscencia. Ya que po cada molécula de luci-
e ina oxidada se emi e un cuan o de luz, la de e minación
del ATP en una mues a biológica puede hace se median-
e ex acción po ebullición en ampón T is (hipoclo u o de
is-hid oxime il-aminoe ano) del ATP, incubación con luci-
e ina-luci e asa y pos e io medida de la luz p oducida en
un o óme o con eg¡s o. La mayo des en aja de es a
écnica es la necesidad de p ocesa la mues a con api-
dez, ya que el es ado ¡siológico de las células cambia ápi-
damen e as la oma de mues as.
Es e ipo de ensayo ha sido aplicado en la de ección de la
oxicidad de dis in os compues os o e luen es indus ia-
203
les sob e angos ac i os('o'u'), como pa áme o de con ol
del p oceso de angos ac i os6 ), como pa áme o es ima-
do de la biomasa en aguas es¡duales y angos ac i os"'),
en el seguim¡en o de los e ec os de la clo ación sob e bac-
e ias ilamen osas( '' un), en el seguimien o de la ac i idad
biológica de espumas de o igen ilamen oso en eac o es
biológicos(")y en diges o es anae obiosoo). En odas es as
ocasiones ha demos ado se un pa áme o ap opiado de
es imación de la biomasa iable.
En Awong e al. ") y Kim e a/.(") se pone de man¡ ies o la
buena co elación exis en e en e el con enido de ATP, la
DHA y la OUR en mues as de ango ac i o.
3. MÉTODOS DIRECTOS DE EVALUACIóN
DE LA BIOMASA
Los mé odos clásicos de es imación de la biomasa es án
basados en el peso seco o en mé odos di ec os de enu-
me ación celula . Los mé odos de cómpu o de células
emplean p ocedimien os de obse ación que se basan en
p opiedades ísicas o en la ac i idad me abólica, inclu-
yéndose mé odos de enume ación de células o ales y
mé odos de enume ación de células iables.
Los mé odos de es imación di ec a de la biomasa cons i-
uyen un campo de es udio que ha adqui ido un g an a an-
ce du an e los úl imos años. Es o ha sido posible g acias
al empleo combinado de nue os ma cado es luo escen-
es y a la adap ación a los es udios medioambien ales de
una écnica adicionalmen e empleada en clínica, la ci o-
me ía de lujo. Nebe- on-Ca on e al.?' , en un exhaus i o
abajo en el que se combinan a ios ma cado es luo es-
cen es y el análisis median e ci ome ía de lujo, desglo-
san el concep o de iabilidad más allá de Ia an igua de i-
nición de «c ec¡mien o ep oduc i o demos able". Así
pues, una célula i a se dis ingui á en unción a su es a-
do isiológico como: célula con c ecimien o ep oduc i o,
célula con ac i idad me abólica o célula con la memb a-
na ín eg a. Pues o que de es os es es ados isiológicos
el más es ic i o es el de c ecimien o ep oduc ¡ o, au o-
es como Ziglio e al.o'', po simplicidad, han u ilizado al
es ado como c i e io de iabilidad, mien as que el es a-
do de ac i idad celula lo han asociado con el de ac i i-
dad me abólica.
3.1. Mé odos clásicos de e aluación de la biomasa
En e los mé odos clásicos de e aluación di ec a de la bio-
masa, se encuen an: peso seco, espec o o ome ía y u -
bidime ía, mé odos mic oscópicos de ecuen o celula en
cáma as y mé odos de siemb a.
La clásica es imación de la biomasa de una mues a en
é minos de peso seco po unidad de olumen, ya sean
SSV o sólidos en suspensión o ales (SST), p esen a el
incon enien e de que en al de e minación quedan inclui-
dos sus a os i ne es, políme os ex acelula es, ma e ia
o gánica y mic oo ganismos mue os, además de mic o-
o ganismos ac i os.
Los mé odos espec o o omé icos se basan en la exis-
encia de una elación di ec a en e el núme o o al de
mic oo ganismos p esen es en una mues a y su alo de
u bidez. T as la de e minación de la u bidez en la sus-
pensión celula median e espec o o ome ía, el esul ado
se exp esa en unidades de abso bancia. Po ello, an es de
u iliza la u bidez como mé odo de ecuen o, hay que ea-
liza una ec a de calib ado que elacione medidas di ec-
as (mic oscópicas, peso seco o ecuen o en placa) con
las indi ec as de a u bidez'"'. Son mé odos poco sensi-
bles con in e e encias po el ¡po de cul i o, medio de c e-
cimien o o po in e e encias con pa ículas.
El ecuen o celula en a amien os de depu ación median-
e cáma as no es un mé odo muy exac o debido a i egu-
la idades en la dis ibución de la mues a, a que pueden
con undi se las células con o as o mas o gánicas e ino -
gánicas exis en es en el medio y a que no pe mi e dis in-
gui células i as de células mue as. Sin emba go, en el
caso de p ocesos de angos ac i os con p oblemas de
esponjamien o ilamen oso (bulking) o espumas ( oaming)
o en el seguimien o de la ope ación de clo ación en el eac-
o , es ecuen e el empleo de cáma as de ecuen o en la
cuan i icación de ales ipos bac e ¡anoso"''.
T adicionalmen e, en los mé odos de siemb a, el ecuen-
o de mic oo ganismos iables se undamen aba en la capa-
cidad de una célula de desa olla una colonia isible en
un medio de cul i o ap opiado. Hoy en día, se conside a
que el concep o de iabilidad engloba o os es ados que
no implican necesa iamen e la capacidad de c ece en un
medio de cul i ol71,72'75). Puede ocu i , simplemen e, que
las condiciones de c ecimien o en placa sean poco a o-
ables (medio de cul i o, ausencia de nu ien es, condi-
c¡ones edox, ¡empo de incubación, e c.) e impidan que
un o ganismo iable pueda desa olla una coloniasu " "''n'.
Po es a azón, se conside an mé odos in aes ima i os y
es adís icamen e cues ionables.
3.2. Técnicas mic oscópicas basadas en
la epi luo escencia. Mé odos n si u
El cómpu o del núme o de mic oo ganismos o ales en una
mues a puede ealiza se median e écnicas que emplean
la mic oscopía óp ica con iluminación de epi luo escen-
cia. El mé odo consis e en eñi las bac e ias p esen es en
la mues a con un agen e luo oc omo pa a, as un iem-
po de con ac o, some e la a il ación y ealiza el ecuen-
o. Dicho ecuen o pod á ealiza se median e obse ación
di ec a con un mic oscopio con iluminación de epi luo-
escencia o adap ándolo a un sis ema de análisis digi al
de imágenes que ealice la cuan i icación'*'"". Es os p o-
cedimien os han sido ecien emen e mejo ados median e
el análisis de la mues a con la c¡ ome ía de lujo, écnica
que pe mi e el ápido ecuen o de células ma cadas en
una mues a ''"'"''.
Los p incipales luo oc omos empleados en la es imación
de la población o al de una mues a son el na anja de ac i-
dina (NA) y el 4', 6-diamidino-2- enilindo (DAPI). Ambos
pe mi en iden i ica bac e ias no sólo po su colo , sino
ambién po su o ma y amaño, dis inguiéndolas de pa -
ículas ino gánicas p esen es en la suspensión. Mien as
que el NA colo ea an o ADN como ARN y algunos com-
ponen es de la pa ed celula , el DAPI es especí ico pa a
el ADN y un buen ma cado bac e ¡ano pa a es udios de
anspo e a co o plazo en ecología m¡c obiana(*'*). pe o
a pesa de las en ajas que supone el uso de es os luo-
oc omos, no pe mi en dis ingui en e células mue as,
me abólicamen e inac i as, y células i as, ya que el ADN
conse a sus p opiedades incluso en células mue as.
O os luo oc omos como las sales de magnesio del áci-
do 1 -anilino-8-na alensul ónico (Mg-ANS) iñen p incipal-
men e componen es celula es como p o eínas, lípidos o
memb anas celula es. EI compo am¡en o de és os, en
cambio, sigue siendo el de sob es imación del núme o de
células iables al no dis ingui células i as de mue as.
Más ecien emen e, se han ido desa ollando nue os colo-
an es luo escen es especí icos de ácidos nucleicos ales
como: Yo-P o-1, SYBR G een I (pos e io men e llamado
SYBR D, SYBR il(*), SyBR Gold, SyTOx G een@a, picoG een
y RiboG een. Algunos de ellos han sido empleados en la
cuan i icación de bac e ias median e ci ome ía de lujo.
Dados los ¡ncon enien es p esen ados po los agen es
in e calan es de ácidos nucleicos, son muchos los es u-
dios medioambien ales en los que se combina el ma ca-
do o al de células con o o ma caje que esponde a una
ac i idad me abólica especí ica l-abla ll). La mayo ía de
las eces, dicha ac i idad me abólica es la de un ma ca-
204
TABLA I¡
Es udios de es imación di ec a de la biomasa en los que se han combinado dis in os ma cajes.
Au o es Técnicas Aplicación
Schaule e a/.('u) CTC + DAP Cuan i icación de bac e ias ac i as en aguas de consumo humano
Winding e al. ") CTC + NA Cuan i icación de bac e ias ac i as en suelos
Huang e a/.( ') CTC + DAPI Guan i icación de bac e ias ac i as en biopelículas as clo ación
Zimme mann e al.@) INT + NA Cuan i icación de bac e ias ac i as en espi ación en mues as de
agua dulce (lago) y ma ina
King y Pa ke/") INT + DAPI Cuan i icación de células iables y me abólicamen e ac i as en
aguas sub e áneas
Rod íguez e al. ul CTC + DAPI Cuan i icación de bac e ias ac i as en aguas es¡duales,
sub e áneas y ma inas
Yu e a/,i n) CTC + DAPI Cuan i icación de bac e ias ac ¡ as en suelos
Pyle e a/.(no) CTC + DAPI Cuan i icación de la ac i idad espi a o ia en cul i os de
Klebsiella pneumoniae, Salmonella yphimu ium y Esche ichia coli
Saby e a/,P') CTC + DAPI Cuan i icación de bac e ias ac i as as clo ación en suspensiones
de E. coli
Wi zig e a/.P') FISH + DAPI Ca ac e ización de la biomasa de un bio eac o de memb anas
en a amien o ae obio ¡
Bi on y Koopman(n ) INT + VM E aluación de la iabilidad de bac e ias ilamen osas en el ango
ac i o as clo ación
Du on e a/.{*) INT + VM De e minación de bac e ias ac ¡ as en angos biológicos
Saby e a/.e') CTC + DAPI lmpac o de la clo ación sob e bac e ias del ango ac i o
Ka ne y Fuh man(nn) CTC + DAPI Cuan i icación de bac e ias ac i as en agua de ma
CTC: clo u o de 5-ciano-2,3-di olil e azolio; INT: clo u o de 2-(p-iodo enil)-S(p-ni o enil)-S- enil e azol¡o; NA: na an-
ja de ac idina; DAPI: 4',6-diamidino-2- enilindol; VM: e de malaqui a; FISH: luo escen in si u hyb idiza ion.
do edox como el CTC o el lNT, el cual pone de mani ies-
o la p opo ción de o ganismos me abólicamen e ac ¡ os
en una mues á86'87'&'8e) o en un cul i o pu o( o n').
Es udios más ac uales combinan el DAPI o el ma caje edox
con la hib idación con sondas de oligonucleó idos de ARN
(FlSH, /uo escen in si u hyb idiza ion),lo que es á pe mi-
iendo llega a impo an es conclusiones e e idas, no sólo
a la iden i icac¡ón de bac e ias, sino ambién al es ado isio-
lógico de las mismas?''n').
O o luo oc omo que pe mi e dis ingui bac e ias me a-
bólicamen e ac i as en una mues a biológica, en la que
se ha empleado un agen e in e calan e (DAPI, NA, e c.), es
el SFDA('"). La obse ación mic oscópica se co esponde
con el p oduc o luo escen e esul ado de la ac i idad me a-
bólica pa a Ia que es especí ico, la ac i idad es e asa. CTC
y SFDA son luo oc omos que ponen de mani ies o ac i i-
dades me abólicas, pe o sin cuan i ica las.
Una opción di e en e, an e io men e empleada po o os
au o es, ha sido la de con a ¡nción de la mues a sob e la
que se e alúa la ac i idad mic obiana (lNT, p. ej.), con colo-
an es como el e de malaqui a(" no), el azul de me ileno o
azul alciano (Figu a 3), los cuales no equie en de ilumina-
ción de epi luo escencia y pe mi en igualmen e la obse -
ación del o al de células (Iabla ll).
Una al e na i a a los agen es in e calan es se p esen a en
Bhupa hi aju e al. q, en el que el agen e luo oc omo que
es ima la o al¡dad de la población bac e iana es un de i-
ado de la luo esceína, el 5-(4,6-diclo o iazinil am¡no-
luo esceína) (DTAF). El DTAF se une co alen emen e a las
pa edes celula es y puede emplea se en combinación con
ma cado es que ponen de mani ies o una ac i idad me a-
bólica de e minada, como el CTC.
En la Tabla ll se obse a que una de las aplicaciones de
la epi luo escencia con elación al es udio de la iabilidad
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