Determinación de la actividad biológica y de la biomasa en sistemas de depuración: Aplicación en la detección de estados de inhibición o toxicidad

De e minación de la ac i idad biológica y de la biomasa en sis emas de depu ación. Aplicación en la de ección de es ados de inhibición o oxicidad Lau a lsac y Ca men A náiz*. Depa amen o de !ngenie ía Química y Ambien al, Escuela Uni e si a ia Pol¡ écnica. Uni e sidad de Se illa. Vi gen de iñ ica,7.41011 Se illa, España. Biomass Cha ac e iza ion and Biological A i ,i l. Tes s i Was ewa e T ea uen . Ap¡ licabili o he Assessn en o Inhibi o and Toxic Pollu an s. De e minació de I'ac i i c biológica i de la bion ussa en .sis emes de depu ació. Aplicació e la de ecci i cl'es c s cl'inhíbició o oxici a . Recibido: 25-lV-2005 RESUMEN Los ensayos de de ección de la oxicidad en el ango ac i o que son ealizados sob e los p opios mic oo ga- nismos del sis ema es án basados en la es imación de la iabilidad y ni eles de ac i idad biológica de dichos mic oo ganismos en espues a al uimpac o, ambien al ecibido. Viabilidad y ac i idad de la biomasa mic obia- na son de po si pa áme os de con ol del p oceso cuyas de e minaciones pueden se adap adas a los p ocedi- mien os de e aluación de Ia inhibición o oxicidad eje - cidos po de e minados compues os p esen es en los in luen es de las es aciones depu ado as. En es e abajo se ealiza una e isión de los p incipales mé odos de de e minación de la ac i idad biológica y de la biomasa, así como de sus aplicaciones a la de ección de es ados de inhibición/ oxicidad sob e una mues a de ango ac i o. Palab as claye.' Ac i idad biológica. Biomasa. Fango ac i o. Mé odos. Toxicidad. T a amien o de aguas esi- duales. SUMMARY The oxici y assessmen o pollu an s on he ac i a ed sludge p ocess is based on he de e mina ion o he phy- siological s a e, he iabili y and he ac i i y o he he e- o ophic bíomass. Viabili y and biomass ac i i y a e impo an p ocess con ol pa ame e s and hei de e - mina ions could be employed in o de o e alua e he oxici y o con aminan s in was ewa e ea men s. ln his wo k, ad anced and con en ional analy ical me - hods o ac i i y and biomass de e mina ion in he ac i- a ed sludge p ocess a e e iewed. Key wo ds: Ac i a ed sludge. Biomass. Biomass ac i i y. Me hods. Toxici y. Was ewa e ea men . RESUM Els assaigs de de ecció de la oxici a en el ang ac iu que es eali zen sob e els p opis mic oo ganismes del sis ema es basen en I'es imació de la iabili a i dels ni ells d'ac i i a biológica dels esmen a s mic oo ga- nismes en espos a a «l'impac e,> ambien al ebu . Viabili a i ac i i a de la biomassa mic obiana són de pe si pa áme es de con ol del p océs, poden -se adap a la se a de e minació als p ocedimen s d,a aluació de la inhibició o oxici a ocas¡ona s pe de e mina s com- pos os p esen s en els in luen s de les es acions depu- ado es. En aques eball, es eali za una e isió dels p incipals mé odes de de e minació de l'ac i i a bioldgica i de la biomassa, així com de les se es aplicacions a la de ec- ció d'es a s d'inhibició/ oxici a sob e una mos a de ang ac iu. Mo s clau: Ac i i a biológica. Biomassa. Fang ac iu. Mé odes. Toxici a , T ac amen d,aigües esiduals. 1. INTRODUCCIÓN En cualquie es ación depu ado a de aguas esiduales (EDAR), la p ác ica más ex endida de e aluación de ac- o es an impo an es como la iabilidad o el ni el de ac i- idad biológica del cul i o depu ado consis e en el empleo * Au o pa a la co espondencia: Ca men A náiz. Telé ono: 95 455 28 12 Fax 95 42827 77 e-mail: [email p o ec ed] 197 de los mé odos clásicos de es imación de la biomasa (peso seco o mé odos di ec os de ecuen o celula , p. ej.). Sin emba go, el uncionamien o de una EDAR es á in luencia- do, en g an medida, po la calidad de la biomasa en el sis- ema, cuya ac i idad puede se de e minada. Las medi- das de ac i idad biológica deben se i pa a que el explo ado se an icipe a es ados de baja e icacia en la depu ación y pueda adop a las medidas pe inen es en p e ención. En algunas ocasiones, cie os con aminan es llegados al sis ema son los esponsables de dichos es a- dos de baja e icacia depu ado a, que son de ec ados una ez que se han p oducido bajos ni eles de ac i idad bio- lógica. En o as ocasiones, la ope ación de clo ación mal plani icada en el eac o es esponsable de un d ás ico descenso en la ac i idad biológica, con epe cusión sob e los endimien os depu ado es, los cuales no son es a- blecidos has a la " ecupe ación, de la biomasa. En es e abajo se a a án dis in os mé odos de cuan i i- cación de la ac i idad biológica y de e minación de la bio- masa, p ocedimien os que en e sus apl¡caciones cuen- an con Ia de ección de es ados de inhibición o oxicidad de la biomasa y que, po de inición, pe mi en conoce la espues a o ecida po la p opia suspensión biológica some ¡da a es ud¡o. 2. MÉToDoS INDIREcTos DE EVALUAoIÓN DE LA BIOMASA. ESTIMACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA. Los mé odos ¡nd¡ ec os de e aluación de la biomasa se basan, undamen almen e, en la cuan i icación de alguna ac i idad enzimá ica (mé odos bioquímicos), en la medi- da de consumo de un sus a o o en la o mación de algún p oduc o (mé odos ciné icos), o en la de e minación de algún componen e celula especí ico (ATP, p. ej.). Los mé o- dos bioquímicos y ciné icos de e minan, más que la ia- bilidad de las bac e ias, su ac i idad, ya que dependen más del es ado me abólico de los mic oo ganismos que del núme o de indi iduos. 2.1. Mé odos bioquímicos En su mayo ía, la medida de ac i idades enzimá icas se lle a a cabo median e la con e sión de sus a os espe- cí icos a p oduc os colo eados que son cuan i icados o omé icamen e. Los ensayos enzimá icos son sim- ples de ealiza y sus esul ados se ob ienen ápida- men e, empleando un equipamien o que no es ni cos- oso ni complejo('). Sin emba go, las p incipales des en ajas de los mé odos bioquímicos son la a ia- ción de las ac i idades enzimá icas celula es con los cambios isiológicos y, que una ez que los mic oo ga- nismos mue en, algunas enzimas libe adas pueden pe - manece ac ¡ as. El es udio de las ac i idades enzimá icas es una cues ión de in e és po las siguien es azones: - Las ac i idades enzimá icas desempeñan un impo an- e papel en la mine alización e hid ólisis de la con ami- nación de las aguas('' 'o'. - La ca ac e ización de las ac i idades enzimá icas p o- po ciona in onnación sob e la a abilidad de cie os com- pues os xenobió icos(u). - Enzimas y, en su de ec o, mic oo ganismos po ado es de de e minadas ac i idades enzimá icas, pueden se adicionados a_p ocesos de a am¡en o pa a la mejo a de la e icacia(u''). - Cie os pa ones de ac i idad enzimá ica pueden se i en la ca ac e ización de la ac i idad de una población mic obiana('). La ac i idad enzimá ica, comp endida como un indicado bioquímico, con ecuencia ha sido empleada pa a medi ac i idad mic obiológica o es ima biomasa mic obiana en suelos( ' n), cauces na u ales('o), angos ac i os('' "' "' " o', in luen esí "), sis emas de a amien o de biomasa i¡aí'''u''6'") eac o es SBR (sequenc ing ba ch eac o ) " "' y en p oce- sos anae obios('n''). También se ha empleado en el es u- dio de la biodeg adación de compues os especí icos("). Las medidas de una de e minada ac i idad enzimá ica pue- den se ambién u ilizadas pa a cuan i ica el impac o de un óxico sob e dicha enzima e indi ec amen e sob e el sis ema biológico. Cambios en ac i idades enzimá icas, medidos como a iaciones en la concen ación de los p o- duc os me abólicos o de los sus a os de dichas enzimas, cons i uyen la base pa a que es os ensayos mic obiológi- cos puedan se empleados en la de ección de es ados de inhibición o oxicidad de una de e minada biomasa''''. Dependiendo de los obje i os del es udio, la ac i idad enzi- má ica puede es a p esen e en la mayo ía o en la o ali- dad de los mic oo ganismos (p. ej., ac i idad deshid oge- nasa). Si, po el con a io, se a a de una ac i idad enzimá ica especí ica (p. ej., ni a o educ asa o ni oge- nasa), los e ec os son es udiados sob e un g upo bac e- iano muy conc e o. 2.1.1. Ac i idades enzimá icas hid olí icas La medida de Ia ac i idad enzimá ica se p esen a como una al e na i a a los mé odos adicionales de es imación de la biomasa y de la ac i idad biológica. Las enzimas hid olí icas ex acelula es es án d¡ ec amen e i m pl icadas en la o u a de sus a os complejos en o os más sencillos de bajo peso molecula . Dichos sus a os, de o a o ma, no pod ían se in oducidos en la célula y empleados como uen es de ca bono y de ene gía as se inco po ados al me abolismo celula de oxidación, donde son sus a os de enzimas in acelula es('' "). Algunas de es as enzimas de ac i idad ex acelula son las enzimas h¡d olí icas a- y B-glucosidasas y las p o ea- sas, las cuales desempeñan un papel muy impo an e en las p ime as e apas de la depu ación, pues o que la mayo pa e de la acción o gánica de un agua esidual es á com- pues a, p ecisamen e, po ca bohid a os y p o eínas. Mien as que las c - y B-glucosidasas ac úan ompiendo los enlaces glucosídicos de los disacá idos esul ados de la deg adación de polisacá idos, la p o easa (aminopep i- dasa) ompe las uniones pep ídicas de p o eínas. En e ales aminopep idasas se encuen a la exopep idasa espe- cí ica pa a el aminoácido alanina, denominada L-a/a-ami- nopep idasa. La os a asa es la enzima que hid oliza los és e es de os- a o y p oduce la libe ación de los g upos os a o. Las os- a asas ácida y alcalina, además de di e i en el pH óp i- mo pa a la ac i idad máxima, se di e encian en el mecanismo de acción sob e los d¡s in os sus a os. La cuan i icación de es as cinco enzimas, os a asas alcalina y ácida, c - y ¡3-glucosidasas y p o easa, se ealiza de o - ma simila , es deci , med¡an e cuan i icación espec o o- omé ¡ca del p oduc o esul ado de las espec i as ac i, idades enzimá icas sob e los sus a os especí icos suminis ados inicialmen e en cada ensayo(3). En líneas gene ales, en la bibliog a ía se encuen a que las ac i idades es e asa y L-ala-aminopep idasa son mayo- es que las c - y B-glucosidasas y os a asas. po o a pa - e, el pa ón de dis ibución y la cuan ía de las dis in as enzimas medidas sob e suspensiones de ango ac i o se mues an en elación con las ca ac e ís icas del agua de en ada a plan aí). También se ha hallado una elacidn line- 198 al en e es as ac i ¡dades enzimá icas y la concen ación de biomasa0 q. En cuan o a una posible elación en e dichas ac i idades enzimá icas y pa áme os de uncionamien o del p oceso, exis en au o es que la eba en('). O os au o- es, sin emba go, encon a on cie a elación en e es as ac i idades enzimá ¡cas y la ca ga de ope ación en el eac- o ''''. En cualquie caso, la localización de las enzimas hid o- lí icas hab á de se enida en cuen a, ya que el hecho de que sean e enidas p óximas a la célula o a los EPS (ex a- cellula polyme ic subs ancesJ del lóculo, en ez de lib es en disolución, e i a la con inua in e sión ene gé ica de los mic oo ganismos con el in de eemplaza lase'o'. Es o sig- ni ica que ac i idad enzimá ica- hid olí ica y ac ¡ idad me a- bólica han de se a adas po sepa ado. Es e hecho hab á de ene se espec¡almen e en cuen a en el caso de sis e- mas anae obios, en los que la biomasa a ada ha sido eci - culada y p o iene de o os compa imen os, en los que ha podido ocu i al acumulación, sob e odo po el ca ác e es able de es as enzimas' '. Los abajos sob e ac i idades enzimá icas son amplios y han sido aplicados en es udios an di e sos como el segui- mien o de la espues a me abólica de angos ac ¡ os an e de e minadas «ca gas de choque" de o igen indus ial. Tal es el caso de Kib e e a/.''', quienes ealiza on un segui- mien o de la ac i idad del ango ac i o de un pilo o some- ido a pulsos c ecien es de enol median e la ca ac e ¡za- ción de la ac i idad pi oca ecasa. La pi oca ecasa es á implicada en los p ime os pasos de la deg adación ae o- bia del enol. El p ocedimien o de medida emplea la cuan- i icación espec o o omé ica y cons i uye un ejemplo más de la aplicabilidad de las medidas enzimá icas. En cualquie caso, abajos como el de Dalzell e al.('o) demues an la meno sensibilidad de la ac i idad enzimá- ica L-ala-aminopep idasa en la de ección de es ados de oxicidad de la biomasa, en e a o os ensayos mic obio- lógicos de medida de la oxicidad como la inhibición de la ni i icación, la asa de espi ación, la inhibición de Ia lumi- niscencia o la medida de ATP. 2.1.2. Ac i idad es e asa Las es e asas desempeñan un ¡mpo an e papel en la bio- deg adación de muchas sus ancias na u ales p esen es en las aguas esiduales ales como lípidos, p o eínas y algunos compues os químicos sin é icosí'), siendo enzi- mas ampliamen e dis ibuidas y cons an es en el ango ac i o. Son ácilmen e ensayadas y han sido empleadas en la de e minación de biomasa y ac i idad mic obiana en suelos, aguas esiduales y angos ac i osí'''"'"'"'. En es u- dios de suelos han sido empleadas de o ma conjun a con la asa de espi ación, encon ándose una buena elación en e ambas medidas('). No así en cul i os en ase de c e- cimien o exponencial de agua esidual o ango ac ¡ o, en los que la medida del ATP y la asa de espi ación mos- a on un buen g ado de co elación en e sí, pe o no es- pec o a la hid ólisis del d¡ace a o de luo esceína("). Lemme e al. " , quienes emplea on la ac i idad es e asa como medida de la ac i idad deg adado a he e ó o a en un sis- ema de angos ac ¡ os, encon a on un compo am¡en o pa ecido con el es o de ac i idades hid olí icas (c - y 0- glucosidasa, os a asa y L-a/a-aminopep idasa). En algunos de los abajos an e io men e ci ados, los sus a- os empleados como modelos de és e es son el p-ni o enol, a-na ol o el diace a o de luo esceína. El diace a o de luo- esceína (FDA) es el sus a o más ampliamen e u ilizado en la medida de la ac i idad es e asa. Es un compues o que pue- de se hid olizado po enzimas ales como p o easas, l¡pasas y es e asas, siendo el p oduc o de dicha con e sión enzimá- ¡ca la luo esceína('). La luo esceína puede se isualizada median e el empleo de la mic oscopía de epi luo escencia o cuan i icada med¡an e espec o o ome ía as se ex aída con disol en es o gánicos. En el campo de la epi luo escen- cia se han u ilizado de i ados del FDA como el diace a o de 6-ca boxi luo esceína (CFDA) y el diace a o de 5- (y 6-) sul- o luo esceína (SFDA). Es e úl imo, que se á mencionado pos- e io men e en el apa ado de écnicas de epi luo escencia, se ha e elado como el más ap opiado po el momen o("). 2. 1.3. Ac i idad deshid ogenasa (D HA) En una mues a biológica, la de e minación de la ac i idad del sis ema de anspo e elec ónico puede ealiza se median e cuan i icación de la DHA. Todos los mic oo ga- nismos ae obios poseen un sis ema de anspo e elec- ónico en el que el más impo an e acep o e minal de elec ones es el oxígeno. En la co ien e p incipal de es e anspo e elec ónico pa ¡c¡pan, en e o as, las deshi- d ogenasas, enzimas de oxido- educción que median e la ans e enc¡a de hid ógeno in e ienen en el anspo e de elec ones desde un sus a o o gánico a un acep o inal de elec ones. La de e minación de la DHA y en su ex en- sión de la ac i idad espi a o ia mic obiológica, puede ea- liza se midiendo lacapacidad de los mic oo ganismos pa a educi un indicado o colo an e edox, de los que las sales de e azolio son las empleadas con mayo ecuencia. En e dichas sales se encuen an el clo u o de 2,3,5- i e- nil e azolio C) V el clo u o de 2-(p-iodo eni )-3(p-ni o- enil)-S- enil e azolio (lNT). Ambas se ca ac e izan po se solubles en agua en su o ma ox¡dada y po o ma depó- si os celula es insolubles de o mazán, TTO- o mazán e INT- o mazán, espec ¡ amen e, cuando son educidas po la ac i idad espi a o ia. Es os depósi os ojizos de o - mazán, al se obse ados mic oscópicamen e (Figu a 1), pe mi en dis ingui en mues as acuosas las bac e ias que espi an de aquellas que no (de e minación di ec a de la biomasa). O bien, el o mazán es ex aído con disol en es o gánicos y de e m ipado espec o o omé icamen e, pe - mi iendo la cuan i icación de la ac i idad espi a o ia de la mues a (de e minación indi ec a de la biomasa). a' 3. {{' *. ,-'! ' - Figu a 1. Ensayo bioquímico de la DHA. (A) Depósi os in a- celula es de INT- o mazán (+) en bac e ias ilamen osas. I 000X, campo cla o. (B) Depósi os in acel ula es de o mazán en bac e ias o mado as de lóculos. 1000X, campo cla o. 199 'i §'Y ?,: .l El ácido bencenosul ónico 3'{1 -[( enilamino)-ca bonil]-3,4- e azoliol-.bis (4-me oxi-6-ni o) (XTT), a di e encia con los o os colo an es edox, p esen a la pa icula idad de p o- duci o mazán solub e en agua, lo que e i a el p ocedi- mien o de ex acción('o). El TTC, al igual que el azul de me ileno (MEB), p esen a el incon enien e de su ele ada sensibilidad al oxígeno("). El INT no iene es a limi ación y su uso es á muy ex endido. En es e sen ido, el CTC (clo u o de 5-ciano-2,3-di olil e a- zolio), luo oc omo de más ecien e desa ollo, es á ex en- diéndose cada ez más en el campo de la epi luo escen- cia pa a la de e minación di ec a de la biomasa con muy buenos esul ados, sob e odo al se empleado en com- binación con o os ma cado es (apa ado 3.2). En la Tabla I quedan ecogidos dis in os abajos en los que han sido empleados a ios colo an es edox en di e sas apli- TABLA ¡ Aplicaciones de las sales de e azolio en es udios medioambien ales. Au o es Colo an e edox Aplicación Nyb oe e a/.(') INT De e minación de la ac i idad biológica en angos ac ¡ os y aguas esiduales de dis in as EDAR y de un pilo o Goel e a/.(') INT De e minación de la ac i idad en un eac o SBR Blenkinsopp y Lock('o) INT De e minación de la DHA en biopelículas en íos Le Bihan y Lessa dnu) TTC Ca ac e ización de la biomasa de un bio il o Fonseca e a/.íu) INT Ac i idad mic obiana en bio il os pa a po abilización K iebi zsch e a/.í') XTT/CTC De e minación de la ac i idad en un eac o SBR de alimen ación sin é ica Chung y Nee hlingín) INT De e minación de la ac i idad biológica en diges ión anae obia Bhupa hi aju e a/.eo) cTc De e minación de la ac i idad DHA de mic oo ganismos anae obios y acul a ¡ os J@ gensen('u) MB De e minación de la DHA en angos ac ¡ os Logue e a/.e') INT De e minación de la DHA en angos ac i os con p oblemas de p oli e ación ilamen osa Awong e a/.(") INT De e minación de la DHA en espum¿¡s noca dias López e al. 'n INT Ac i idad de angos ac ¡ os Ande son e a/.( o) INT Medida de la inhibición de la ac i idad biológica inducida po me ales pesados en angos ac i os Kim e al.( ') INT Medida de la inhibición en cul i os pu os y angos ac i os po e ec o del H,O, y el Clz Bensaid e a/.( ') Es imación de la ac i idad en cul i os de angos ac i os bajo dis in os egímenes de alimen ación lsac( "' INT De e minación de la DHA en angos ac i os y de ección de la inhibición eje c¡da sob e és os po compues os xenobió icos Li y Zhao@) TTC De ección de la inhibición mic ob¡ológica en angos ac ¡ os Kalmbach e a/.0') c c De e minación de la densidad y ac i idad me abólica bac e iana en la o mación del bio ilm en aguas po ables CTC: clo u o de 5-ciano-2,3-di olil e azolio; INT: clo u o de 2-(p-iodo enil)-3(p-ni o enil)-S- enil e azol¡o; MB: azul de me ileno; XTT: ácido bencenosul ónico 3 -{1-[( enilamino)-ca bonil]-3,4- e azolio]-bis (4-me oxi-6-ni o); SBR: seq u e n c i n g ba ch eac o ; TTC: 2, 3,S- i en i l e azolio. 200 caciones en la de e minación de la ac i idad de la biomasa, en o os campos además del de las aguas esiduales. Las expe iencias lle adas a cabo po Smi h y McFe e s('u) en Escheichia coll han indicado que, en la cadena de ans- po e elec ónico, la educción del INT y el CTC se locali- za p incipalmen e a ni el de dos deshid ogenasas la ín dependien es: el complejo succina o-deshid ogenasa y la NADH-deshid ogenasa. El CTC, además, pa ece se edu- cido po o as deshid ogenasas celula es. De la misma mane a, el INT pod ía se lo po la ubiquinona, posiblemen e los c¡ oc omos bsss ! bsm, el anión supe óxido y alguna o a deshid ogenasa donado a de elec ones a la ubiquinona. Es os mismos au o es, Smi h y McFe e s, han es udiado el ni el de educción de es os colo an es edox bajo con- diciones de anae obiosis y en las que son inducidas u as dis in as de anspo e elec ónico en el o ganismo anae- obio acul a i o E. coli. Los esul ados indica on que ambas sales (lNT y CTC) pueden se educidas bajo ales condi- ciones de oxido educción, pe o p incipalmen e en la u a de e men ación de la glucosa. Bhupa hi aju e a/.€o) quie- nes es udia on dis in os o ganismos anae obios acul a ¡- os y obligados en su elación con la capacidad de edu- ci el CTC, halla on que, e ec i amen e, ex¡s e educción del colo an e, sin e idencias de que ocu ie a ex acelu- la men e o de o ma abió ica. Chung y Nee hlingí") emple- a on con an e io idad la DHA dependien e del sus a o INT como pa áme o de con ol de la diges ión anae obia. Es os au o es encon a on una buena co elación en e dicha de e minación, el con enido de ATP y o as medidas ¡ndi- ec as de la ac i idad biológica anae obia ( asa de p o- ducción de biogas, pH y concen ación de ácidos g asos olá iles). La DHA se ha encon ado que gua da buena elación con o os pa áme os de medida de la ac i idad como es la asa de espi ación" '28 4'30 3 '32's). Li y Zhao@)de ec a on inhibición de la biomasa en angos ac i os median e la educción de los ni eles de DHA dependien e del sus a- o TTC y de la asa de espi ación especí ica, descensos de la ac i idad biológica que se elaciona on con d¡sm¡- nuciones de la eliminación de la DQO (demanda química de oxígeno) po el sis ema de a amien o. Si bien los mé odos enzimá ¡cos an e ¡o men e ci ados basados en las ac i idades de p o easas, glucosidasas, e c., han esul ado de u ilidad en dis ¡n as aplicaciones, p esen an el incon enien e de que la hid ólisis de un de e - minado compues o no es á di ec amen e elacionada con el p ocesamien o del ca bono o el me abolismo celula ene gé ico, como el anspo e elec ónico o la os o ila- ción oxida i a en el caso de la DHA(''). De hecho, Le Bihan y Lessa d('u), quíenes u iliza on la DHA con el sus a o TTC y la B-glucosidasa en la ca ac e ización de la biomasa de un bio il o, encon a on que la exo-enzima p esen a un pa ón de a iación en unción a la empe a u a que no se epi e con la DHA, ea i mando la idea de medida enzimá- ica es able de es a úl ima. Jung e a/. ) con i ma on el ca ác e es able de es as enzimas en sus expe iencias de ex acción y ecupe ación de ac i idades enzimá icas de sob enadan es de angos en exceso, en las que la DHA medida e a muy in e io espec o al es o de ac i idades enzimá icas ex acelula es (p o easa, glucosidasa y lipa- sa) y espec o a los ni eles de ac ¡ idad medidos en el an- go inicialmen e. 2.1.4. Ac i idad ca alasa La ac i idad ca alasa es á ampliamen e dis ibuida en la na u aleza, encon ándose p esen e en células animales, ege ales y bac e ianas. La cuan i icación de la ac i idad ca alasa se e ec úa adicionalmen e median e el segui- mien o espec o o omé ico o median e alo ación de la desapa ición del sus a o de es a enzima, el pe óxido de hid ógeno. O a ap oximación a la de e minación de es a ac i idad se encuen a en los abajos de Guwy e al. n'"u'"'). En ellos se expone un mé odo de medida de la ac i idad ca alasa que puede se u ilizado en la cuan i icac¡ón de biomasa ac i- a en lodos de depu ado a, suelos, e c., dada la buena co elación que es a ac i idad enzimá ica gua da con o as medidas como las espi omé ¡cas' ". O ece, además, la posibilidad de se adap ada al seguimien o en con inuo de la biomasa en p ocesos como el de angos ac i os. El mé o- do se basa en el uso de un medido de lujo gaseoso''u' capaz de de ec a el oxígeno libe ado esul ado de la ac i- idad ca alasa, cuando una mues a biológica es pues a en con ac o con HzO, en unacáma a de eacción. Aunque es e mé odo no ha sido u ilizado en la cuan i icac¡ón de e ec os óxicos o inhibi o ios de suspensiones b¡ológicas, la de ección de un mínimo de nue e unidades de ca ala- sa po g amo de peso seco de una mues a de suelo, pe - mi e plan ea u u as aplicaciones pa a es a ac i idad enzi- má ica. 2.1.5. Ac i idad ATPasa Es a de e minación de la ac i idad biológica es á basa- da en la cuan i icación de la ac i idad enzimá ica ATPasa más que en la es imación del con enido en ATP, pa á- me o u ilizado du an e la go iempo como índice de bio- masa mic obiana. El mé odo esencialmen e consis e en un ensayo in i o, en el que as la adición del óxico a la enzima y anscu ido un iempo de con ac o su icien- e, se ensaya la ac i idad ATPasa median e la adición de ATP como sus a o("). Se a a és e de un ensayo enzi- má ico empleado especí icamen e en la de ección de la oxicidad. 2.2. Mé odos ciné icos La base de es os mé odos es el seguimien o de la p o- ducción o consumo de un de e minado compues o de con- cen ación conocida po pa e de un cul i o de mic oo - ganismos, gene almen e en un ensayo en discon inuo. El ejemplo más ípico en p ocesos ae obios es la de e mi- nación de la DBO (demanda bioquímica de oxígeno), que indica la biodeg adabilidad de un sus a o en disolución a a és del consumo de oxígeno del medio. 2.2.1. Tasa de espi ación (OUFi, oxygen up ake a eJ Se denomina espi ación al consumo de oxígeno de los mic oo ganismos p esen es en una mues a biológica debi- do a la espi ación endógena de man enimien o celula y a la oxidación del su a o o gánico p esen e en ella, en ausencia de ni i icación. Así pues, se denomina OUR (mg* L-' d-'¡ a la elocidad con la que los mic oo ganismos u i- lizan el oxígeno en unción de es os dos concep os('n). La asa de espi ación básica (OUR") es la o iginada po la espi ación endógena de man en¡mien o celula en ausen- cia de ni i icación y po una pequeña pa e de ma e ia o gánica adhe ida a la masa de mic oo ganismos. En la p ác ica, se conside a que es cons an e a empe a u a y concen ación de mic oo ganismos ijos. Un dec ecimien- o ano mal de la OURu en es as condiciones ep esen a un signo inequí oco de inhibición espi a o ia y de posible oxicidad del medio. La asa de espi ación exógena (OUR") es la o iginada du an e la oxidación del sus a o o gánico ápidamen e biodeg adable y es p opo cional al mismo. En el caso de que exis a un p oceso de ni i icación, OUR" incluye la asa de espi ación po es e concep o (OUR."). En la Figu a 2 se ep esen a un esquema del compo amien o de la OUR de un ango ac i o a lo la go del iempo bajo condiciones ba ch. La OUR o al e e ida a la concen ación de mic oo ganis- mos, exp esada es a úl ima como sólidos en suspensión 201 olá iles (SSV), es la asa de espi ación especí ica (SOUR, speci ic oxygen up ake a e) (ecuación 1): souR = ${.n", g*"'' d'') 0) Su p incipal ca ac e ís ica es que de ine la ac i idad bio- lógica de una biomasa especí ica en un momen o dado y además es á elacionada con la p opo ción "alimen o/ mic oo ganism6s" (F/M, " oodlmic oo gan¡'sms" en e mi- nología anglosajona), ya que comp ende la OUR" (p opo - cional a la DBO) y los SSV del cul i o biológico'""'. Una es ación depu ado a ecibe aguas esiduales u banas con una g an a iabilidad en cuan o a caudal y composi- ción, con oscilaciones es acionales, dia ias y ho a ias en es echa elación con los egímenes de e acuación de los di e en es ipos de aguas domés icas, de ac i idades come ciales, indus iales, e c. Po es a azón, pa a una concen ación cons an e de sólidos en suspensión (SS) en el anque de ai eación, se ía de espe a que an o oxíge- no disuel o (OD) como SOUR p esen a an una espues a a ales cambios en la composición del in luen e. Así lo con- i ma on au o es como Schulze y Koois a'o'), quienes no sólo halla on una elación di ec a en e OUR y SOUR con elación a la DQO del in luen e, sino ambién un pa ón de compo amien o dia io y es acional de ambas asas de es- pi ación en pa alelo con la ca ga o gánica y el caudal in luen e. No obs an e, Duggan y Cleasby'o'' encon a on que la OUR puede a ia independien emen e de las ca ac e ís icas del in luen e, hecho que a ibuye on a la espi ación endó- gena y a la acumulación de sus ancias de ese a en la población bac e iana sob e la que se e ec uó el es udio. Edwa ds y She a dFn' no encon a on elación alguna en e la OUR en el eac o biológico y a iaciones en el in luen- e, en cuan o a ca ga o gánica o a caudal; es os esul a- dos ue on cues ionados po o os au o es que conside- a on que las condiciones de abajo e an luc uan es, aunque sin pode conside a se de es és pa a la biomasa. Huang y Cheng(o ) halla on una es echa elación en e el alo de SOUR en el eac o biológico y la DQO soluble del e luen e, que sin emba go no ue con i mada en el aba- jo de Chand a e a/.('n) A pesa de es e ambien e de con a iedades en e los esul- ados ob enidos po dis in os in es igado es, es cie o que la espi ome ía o la medida e in e p e ación de la OUR ía biológica, ha sido y sigue siendo obje o de nume osas in es igaciones dadas sus di e sas aplicaciones. Una de ales aplicaciones se encuen a en es echa elación con el desa ollo de modelos dinámicos en el p oceso de an- gos ac ¡ os du an e las úl imas décadas. Así, el Modelo no 1 pa a angos ac i os (ASM1), p esen ado po la IAWPRC TlLsa dc cspi ación al lo idacií» dc sus a os liiciln cnlc hiodcg ailablus) I Tas cic cspi aci in cnc igcna I (ln e na ional Assoc,a ion on Wa e Pollu ion Resea ch and Con o en 1 987{*) ha sido acep ado y empleado en muchos es udios de simulación de plan as de a amien o de aguas esiduales. La simulación se conside a una henamien a de abajo muy p ác ica, que pe mi e al explo ado la explo- ación y ensayo de un amplio ango de es a egias de depu- ación sin iesgos pa a la plan a. La denominada "calib a- ción del modelo", en la que se equie e p incipalmen e la ca ac e ización del in luen e y del lodo de la plan a some- ida a es udio, necesi a de abundan e in o mación ob eni- da de expe iencias a ni el labo a o io en las que la espi- ome ía y en conc e o la de e minación de la OUR, desempeñan un papel esencial. La ca ac e ización de las dis in as acciones del agua esidual en cuan o a biode- g adabilidad, así como la es imación de los pa áme os ciné icos que igen el compo amien o de la biomasa he e- ó o a en condiciones ae obias, son ci cuns ancias que han exigido, pe o ambién de i ado, en impo an es a an- ces en o no a la espi ome ía(46 47'4'4q'50 51), Un campo de a ance ha sido el desa ollo de nue as éc- nicas espi omé icas y apa a os de medida que o ecen la posibilidad de se empleados bajo condiciones dinámi- cas de uncionamien o. Es a si uación pe mi e, en e o as, la de e minación on-line de la OUR en el p oceso de an- gos ac i os. Es o supone un impo an e a ance en las es a- egias de con ol, pues con dicha de e minación se log an man ene unas condiciones óp imas en el p oceso de a- amien o bajo di e sas ci cuns ancias: en la luc uación de la ca ga, en la de ección inmedia a de e ec os causados po sus ancias óxicas en el in luen e, e c.'u'' *'*' Bajo condiciones de labo a o io han sido ambién di e - sas las écnicas espi omé icas y los p ocedimien os desa- ollados pa a la de e minación de un p o ocolo de medi- da de la inhibición esp¡ a o ¡a del ango ac i o, causada po la oxicidad eje qida po cie os compues os p esen- es en las aguas esiduales. La OECD (O ganiza ion o Economic Co-ope a ion and De elopmen ) emi ió su p o- pio p o ocolo de medida de la inhibición espi a o ia en el ango ac i o, el es OECD 209, que ha sido e aluado po dis in os au o es("). La e sión o icial española de la No ma Eu opea UNE-EN ISO 81 92 de echa ene o de 1 995 se deno- mina "Ensayo de inhibición del consumo de oxígeno po lodo ac i ado» y adop a ín eg amen e la No ma ln e nacional ISO 8192:1986. La USEPA (Uni ed S a es En i onmen al P o ec ion Agency , en su in en a io de ensayos, ecoge la medida de la SOUR en e o os p o o- colos de ipo espi omé ico. Los Mé odos No malizados@) ecogen ambién la OUR como uno de los ensayos ipo a ealiza sob e el lodo (2710 B). En Ni malakhandan e a/.64, se p esen a un ensayo basa- do en la inhibición de la espi ación que emplea una mez- cla de doce bac e ias como o ganismos es . Es el p epa- 'lusa de cspi aci in bi ja I o idilci(in dc susl a os de biodcg ad ción lcn a) Figu a 2. Compo amien o de la asa de espi ación de una mues- a de ango ac i o bajo condi- ciones ba ch (En: Se iou y Blackdl@). c C Tien o (h) 202 ado come c¡al Poly ox@, en el que la espues a óxica se mide con base a una educción del consumo de oxígeno po pa e de los mic oo ganismos de ensayo. Las écnicas espi omé icas han sido ambién empleadas en la ca ac e ización de los dis in os g upos uncionales de mic oo ganismos que o man pa e de la comunidad del ango ac i o, además de los he e ó o os. Es deci las poblaciones ni ¡ ican es y desni i ican es, de e minadas a a és de las medidas de las asas de u ilización de amo- nio (AUR, ammonium up ake a e) y ni a o (NUR, nl a e up ake a e , espec i amen e(o'' u ). O a ap oximación a la medida de la OUR es la asa de p o- ducción de COz. El undamen o de es e p ocedimien o es el hecho de que la p oducción de COz po pa e de un cul- i o bac e iano es el e lejo de una se ie de eacciones bio- químicas, que cons i uyen el p oceso de espi ación de los mic oo ganismos. Una aplicación de es e p ocedimien o en la de ección de la oxicidad eje cida po me ales pesa- dos se encuen a en Ja dim e a/.("n) 2.2.2. Tasa de desapa ición de sus a o Es el mé odo más con encional pa a de e mina la ac i i- dad de una población de mic oo ganismos. La disminu- ción de la concen ación de sus a o en el iempo puede hace se a a és de mé odos indi ec os como Ia DQO o el ca bono o gánico o al (COT), o median e écnicas espe- cí icas, undamen almen e c oma og á icas. La búsqueda de nue os mé odos ha lle ado al empleo de écnicas basadas en el uso de elec odos selec i os, en los que el cálculo de la ac i idad de la mues a biológica se ealiza con base al iempo eque ido pa a que se p o- duzca el 50% de la desapa ición del sus a o sum¡n¡s a- do y pa a el que ql elec odo es especí ico. En el abajo de Olah y P incz6o)se p esen a la aplicación de un elec- odo selec ¡ o de glucosa. 2.3. Es imación de componen es celula es especí ¡cos Cualquie componen e celula seleccionado pa a la es i- mación de la biomasa i a de una mues a debe espon- de a es c i e ios undamen ales: (1) es a p esen e úni- camen e en células i as, (2) se ápidamen e deg adado cuando las células mue en y (3) se ela i amen e cons- an e en concen ación espec o a cambios en el es ado isiológico celula y en e dis in as especies. Has a el momen o, no se conoce ningún componen e celu- la que cumpla es os es eque imien os. Sin emba go, los más adecuados pa a es ¡ma biomasa i a son los áci- dos nucleicos, las p o eínas, los polisacá idos, los lípidos y el ATP. 23.1. Ácidos nucleicos El ADN y el ARN son dos componen es de las bac e ias cuyas sín esis son p opo cionales a la asa de c ecimien- o. Mien as que las concen aciones de ARN a ían con- side ablemen e con el es ado isiológico celula , la can i- dad de ADN es ela ¡ amen e cons an e. La can idad de ADN se de e mina median e espec o o o- me ía, as su ex acción y pu i icación. Exis en di e sas écnicas, si bien p esen an la des en aja de que los p o- cedimien os de pu i icación son complejos, con di e sas in e e encias y bas an e cos osos. Además, el con enido en ADN del ango ac i o ha sido empleado como una medi- da de la biomasa con poco éxi o, debido a ci cuns ancias como su acumulación en los políme os ex acelula es(oo). 2.3.2. P o eínas Exis en a ias écnicas pa a el análisis de p o eínas o a- Ies de una mues a biológica. Algunas es án muy ex endi- das y se ca ac e izan po su sensibilidad, apidez y sim- plicidad, ^al es el caso de las écn¡cas de Low y e al. "') y B ad o d( '). La p incipal des en aja de la de e minación de p o eínas es que su can idad en las células es á suje a a ue es a ia- ciones debidas, undamen almen e, a cambios en las con- diciones ísico-químicas y al es ado isiológico celula . 2.3.3. Polisacá idos La mayo ía de las células p oca io as con ienen el pep i- doglicano ácido mu ámico como componen e de la pa ed celula . Exis en a ias écnicas pa a la de e minación del ácido mu ámico en mues as que con engan mic oo ga- nismos. Todas ellas se basan en la con e sión del ácido mu ámico a lac a o, seguida del análisis enzimá ico o quí- mico de la concen ación de lac a o. El ácido mu ámico se ex ae de las células median e una hid ólisis alcalina y se pu i ica pos e io men e median e c om a og a ía de in e - cambio <ín co. O os anális¡s más sensibles necesi an del uso de c oma og a ía líquida de al a esolución o gaseo- sa. Todas es as écnicas son labo iosas, consumen mucho ¡empo y necesi an de un equipamien o ca o. 2.3.4. Lípidos Los lípidos son un componen e undamen al de las mem- b anas celula es que se encuen a en can idades ela i a- men e cons an es, con un con enido especí ¡co al o. Ap oximadamen e, en e un g0-98% de los lípidos de las memb anas celula es es á en o ma de os olípidosl*). Su de e minación pa a la es imación de la biomasa i a de una población bac e iana o ece muchas en ajas sob e o os mé odos, como po ejemplo que no o man pa e de las ese as celula es y que se deg adan ápidamen e du an e la lisis bac e iana. Las écnicas de anáisis se basan, undamen almen e, en la ex acción celula de los os olí- pidos con un disol en e o gánico, su pos e ¡o hid ólisis ácida pa a libe a el os a o y, po úl imo, la de e minación colo imé ica de és e. Son écnicas ela i amen e senci- llas, ep oducibles y sensibles, con lími es de de ección de 0,1 a 1 nmol de os a o(uo). Los lípidos han sido ampliamen e empleados en es udios medioambien ales'uo) y más ecien emen e se han aplica- do en sis emas de il ación biológica pa a po abilización('u) y en eac o es anae obios de lecho luidizado( '' *). 2.3,5, ATP El ATP es un componen e bioquímico cen al p esen e en odos los mic oo ganismos y especí ico de los i os al se des uido ápidamen e as la mue e celula , ca ac e ís i- ca que le pe mi e se elacionado con la biomasa i a. Una de las écnicas más u ilizadas pa a medi ATP se basa en la eacción lucí e ina-luci e asa, p oceso esponsable de la luz emi ida po las lucié nagas, que ha sido ampliamen e es udiado. En es e mecanismo de luminiscencia se sabe que in e - ienen la luci e ina (LHz), la enzima luci e as (E), ATp, ca io- nes de magnesio y oxígeno en un p oceso de oxido e- ducción que ocu e en doble e apa: LHz + ATP + E - E - LH,-AMP + PPi y, pos e io men e, E-LHTAMP + 02 * L + HzO + bioluminiscencia. Ya que po cada molécula de luci- e ina oxidada se emi e un cuan o de luz, la de e minación del ATP en una mues a biológica puede hace se median- e ex acción po ebullición en ampón T is (hipoclo u o de is-hid oxime il-aminoe ano) del ATP, incubación con luci- e ina-luci e asa y pos e io medida de la luz p oducida en un o óme o con eg¡s o. La mayo des en aja de es a écnica es la necesidad de p ocesa la mues a con api- dez, ya que el es ado ¡siológico de las células cambia ápi- damen e as la oma de mues as. Es e ipo de ensayo ha sido aplicado en la de ección de la oxicidad de dis in os compues os o e luen es indus ia- 203 les sob e angos ac i os('o'u'), como pa áme o de con ol del p oceso de angos ac i os6 ), como pa áme o es ima- do de la biomasa en aguas es¡duales y angos ac i os"'), en el seguim¡en o de los e ec os de la clo ación sob e bac- e ias ilamen osas( '' un), en el seguimien o de la ac i idad biológica de espumas de o igen ilamen oso en eac o es biológicos(")y en diges o es anae obiosoo). En odas es as ocasiones ha demos ado se un pa áme o ap opiado de es imación de la biomasa iable. En Awong e al. ") y Kim e a/.(") se pone de man¡ ies o la buena co elación exis en e en e el con enido de ATP, la DHA y la OUR en mues as de ango ac i o. 3. MÉTODOS DIRECTOS DE EVALUACIóN DE LA BIOMASA Los mé odos clásicos de es imación de la biomasa es án basados en el peso seco o en mé odos di ec os de enu- me ación celula . Los mé odos de cómpu o de células emplean p ocedimien os de obse ación que se basan en p opiedades ísicas o en la ac i idad me abólica, inclu- yéndose mé odos de enume ación de células o ales y mé odos de enume ación de células iables. Los mé odos de es imación di ec a de la biomasa cons i- uyen un campo de es udio que ha adqui ido un g an a an- ce du an e los úl imos años. Es o ha sido posible g acias al empleo combinado de nue os ma cado es luo escen- es y a la adap ación a los es udios medioambien ales de una écnica adicionalmen e empleada en clínica, la ci o- me ía de lujo. Nebe- on-Ca on e al.?' , en un exhaus i o abajo en el que se combinan a ios ma cado es luo es- cen es y el análisis median e ci ome ía de lujo, desglo- san el concep o de iabilidad más allá de Ia an igua de i- nición de «c ec¡mien o ep oduc i o demos able". Así pues, una célula i a se dis ingui á en unción a su es a- do isiológico como: célula con c ecimien o ep oduc i o, célula con ac i idad me abólica o célula con la memb a- na ín eg a. Pues o que de es os es es ados isiológicos el más es ic i o es el de c ecimien o ep oduc ¡ o, au o- es como Ziglio e al.o'', po simplicidad, han u ilizado al es ado como c i e io de iabilidad, mien as que el es a- do de ac i idad celula lo han asociado con el de ac i i- dad me abólica. 3.1. Mé odos clásicos de e aluación de la biomasa En e los mé odos clásicos de e aluación di ec a de la bio- masa, se encuen an: peso seco, espec o o ome ía y u - bidime ía, mé odos mic oscópicos de ecuen o celula en cáma as y mé odos de siemb a. La clásica es imación de la biomasa de una mues a en é minos de peso seco po unidad de olumen, ya sean SSV o sólidos en suspensión o ales (SST), p esen a el incon enien e de que en al de e minación quedan inclui- dos sus a os i ne es, políme os ex acelula es, ma e ia o gánica y mic oo ganismos mue os, además de mic o- o ganismos ac i os. Los mé odos espec o o omé icos se basan en la exis- encia de una elación di ec a en e el núme o o al de mic oo ganismos p esen es en una mues a y su alo de u bidez. T as la de e minación de la u bidez en la sus- pensión celula median e espec o o ome ía, el esul ado se exp esa en unidades de abso bancia. Po ello, an es de u iliza la u bidez como mé odo de ecuen o, hay que ea- liza una ec a de calib ado que elacione medidas di ec- as (mic oscópicas, peso seco o ecuen o en placa) con las indi ec as de a u bidez'"'. Son mé odos poco sensi- bles con in e e encias po el ¡po de cul i o, medio de c e- cimien o o po in e e encias con pa ículas. El ecuen o celula en a amien os de depu ación median- e cáma as no es un mé odo muy exac o debido a i egu- la idades en la dis ibución de la mues a, a que pueden con undi se las células con o as o mas o gánicas e ino - gánicas exis en es en el medio y a que no pe mi e dis in- gui células i as de células mue as. Sin emba go, en el caso de p ocesos de angos ac i os con p oblemas de esponjamien o ilamen oso (bulking) o espumas ( oaming) o en el seguimien o de la ope ación de clo ación en el eac- o , es ecuen e el empleo de cáma as de ecuen o en la cuan i icación de ales ipos bac e ¡anoso"''. T adicionalmen e, en los mé odos de siemb a, el ecuen- o de mic oo ganismos iables se undamen aba en la capa- cidad de una célula de desa olla una colonia isible en un medio de cul i o ap opiado. Hoy en día, se conside a que el concep o de iabilidad engloba o os es ados que no implican necesa iamen e la capacidad de c ece en un medio de cul i ol71,72'75). Puede ocu i , simplemen e, que las condiciones de c ecimien o en placa sean poco a o- ables (medio de cul i o, ausencia de nu ien es, condi- c¡ones edox, ¡empo de incubación, e c.) e impidan que un o ganismo iable pueda desa olla una coloniasu " "''n'. Po es a azón, se conside an mé odos in aes ima i os y es adís icamen e cues ionables. 3.2. Técnicas mic oscópicas basadas en la epi luo escencia. Mé odos n si u El cómpu o del núme o de mic oo ganismos o ales en una mues a puede ealiza se median e écnicas que emplean la mic oscopía óp ica con iluminación de epi luo escen- cia. El mé odo consis e en eñi las bac e ias p esen es en la mues a con un agen e luo oc omo pa a, as un iem- po de con ac o, some e la a il ación y ealiza el ecuen- o. Dicho ecuen o pod á ealiza se median e obse ación di ec a con un mic oscopio con iluminación de epi luo- escencia o adap ándolo a un sis ema de análisis digi al de imágenes que ealice la cuan i icación'*'"". Es os p o- cedimien os han sido ecien emen e mejo ados median e el análisis de la mues a con la c¡ ome ía de lujo, écnica que pe mi e el ápido ecuen o de células ma cadas en una mues a ''"'"''. Los p incipales luo oc omos empleados en la es imación de la población o al de una mues a son el na anja de ac i- dina (NA) y el 4', 6-diamidino-2- enilindo (DAPI). Ambos pe mi en iden i ica bac e ias no sólo po su colo , sino ambién po su o ma y amaño, dis inguiéndolas de pa - ículas ino gánicas p esen es en la suspensión. Mien as que el NA colo ea an o ADN como ARN y algunos com- ponen es de la pa ed celula , el DAPI es especí ico pa a el ADN y un buen ma cado bac e ¡ano pa a es udios de anspo e a co o plazo en ecología m¡c obiana(*'*). pe o a pesa de las en ajas que supone el uso de es os luo- oc omos, no pe mi en dis ingui en e células mue as, me abólicamen e inac i as, y células i as, ya que el ADN conse a sus p opiedades incluso en células mue as. O os luo oc omos como las sales de magnesio del áci- do 1 -anilino-8-na alensul ónico (Mg-ANS) iñen p incipal- men e componen es celula es como p o eínas, lípidos o memb anas celula es. EI compo am¡en o de és os, en cambio, sigue siendo el de sob es imación del núme o de células iables al no dis ingui células i as de mue as. Más ecien emen e, se han ido desa ollando nue os colo- an es luo escen es especí icos de ácidos nucleicos ales como: Yo-P o-1, SYBR G een I (pos e io men e llamado SYBR D, SYBR il(*), SyBR Gold, SyTOx G een@a, picoG een y RiboG een. Algunos de ellos han sido empleados en la cuan i icación de bac e ias median e ci ome ía de lujo. Dados los ¡ncon enien es p esen ados po los agen es in e calan es de ácidos nucleicos, son muchos los es u- dios medioambien ales en los que se combina el ma ca- do o al de células con o o ma caje que esponde a una ac i idad me abólica especí ica l-abla ll). La mayo ía de las eces, dicha ac i idad me abólica es la de un ma ca- 204 TABLA I¡ Es udios de es imación di ec a de la biomasa en los que se han combinado dis in os ma cajes. Au o es Técnicas Aplicación Schaule e a/.('u) CTC + DAP Cuan i icación de bac e ias ac i as en aguas de consumo humano Winding e al. ") CTC + NA Cuan i icación de bac e ias ac i as en suelos Huang e a/.( ') CTC + DAPI Guan i icación de bac e ias ac i as en biopelículas as clo ación Zimme mann e al.@) INT + NA Cuan i icación de bac e ias ac i as en espi ación en mues as de agua dulce (lago) y ma ina King y Pa ke/") INT + DAPI Cuan i icación de células iables y me abólicamen e ac i as en aguas sub e áneas Rod íguez e al. ul CTC + DAPI Cuan i icación de bac e ias ac i as en aguas es¡duales, sub e áneas y ma inas Yu e a/,i n) CTC + DAPI Cuan i icación de bac e ias ac ¡ as en suelos Pyle e a/.(no) CTC + DAPI Cuan i icación de la ac i idad espi a o ia en cul i os de Klebsiella pneumoniae, Salmonella yphimu ium y Esche ichia coli Saby e a/,P') CTC + DAPI Cuan i icación de bac e ias ac i as as clo ación en suspensiones de E. coli Wi zig e a/.P') FISH + DAPI Ca ac e ización de la biomasa de un bio eac o de memb anas en a amien o ae obio ¡ Bi on y Koopman(n ) INT + VM E aluación de la iabilidad de bac e ias ilamen osas en el ango ac i o as clo ación Du on e a/.{*) INT + VM De e minación de bac e ias ac ¡ as en angos biológicos Saby e a/.e') CTC + DAPI lmpac o de la clo ación sob e bac e ias del ango ac i o Ka ne y Fuh man(nn) CTC + DAPI Cuan i icación de bac e ias ac i as en agua de ma CTC: clo u o de 5-ciano-2,3-di olil e azolio; INT: clo u o de 2-(p-iodo enil)-S(p-ni o enil)-S- enil e azol¡o; NA: na an- ja de ac idina; DAPI: 4',6-diamidino-2- enilindol; VM: e de malaqui a; FISH: luo escen in si u hyb idiza ion. do edox como el CTC o el lNT, el cual pone de mani ies- o la p opo ción de o ganismos me abólicamen e ac ¡ os en una mues á86'87'&'8e) o en un cul i o pu o( o n'). Es udios más ac uales combinan el DAPI o el ma caje edox con la hib idación con sondas de oligonucleó idos de ARN (FlSH, /uo escen in si u hyb idiza ion),lo que es á pe mi- iendo llega a impo an es conclusiones e e idas, no sólo a la iden i icac¡ón de bac e ias, sino ambién al es ado isio- lógico de las mismas?''n'). O o luo oc omo que pe mi e dis ingui bac e ias me a- bólicamen e ac i as en una mues a biológica, en la que se ha empleado un agen e in e calan e (DAPI, NA, e c.), es el SFDA('"). La obse ación mic oscópica se co esponde con el p oduc o luo escen e esul ado de la ac i idad me a- bólica pa a Ia que es especí ico, la ac i idad es e asa. CTC y SFDA son luo oc omos que ponen de mani ies o ac i i- dades me abólicas, pe o sin cuan i ica las. Una opción di e en e, an e io men e empleada po o os au o es, ha sido la de con a ¡nción de la mues a sob e la que se e alúa la ac i idad mic obiana (lNT, p. ej.), con colo- an es como el e de malaqui a(" no), el azul de me ileno o azul alciano (Figu a 3), los cuales no equie en de ilumina- ción de epi luo escencia y pe mi en igualmen e la obse - ación del o al de células (Iabla ll). Una al e na i a a los agen es in e calan es se p esen a en Bhupa hi aju e al. q, en el que el agen e luo oc omo que es ima la o al¡dad de la población bac e iana es un de i- ado de la luo esceína, el 5-(4,6-diclo o iazinil am¡no- luo esceína) (DTAF). El DTAF se une co alen emen e a las pa edes celula es y puede emplea se en combinación con ma cado es que ponen de mani ies o una ac i idad me a- bólica de e minada, como el CTC. En la Tabla ll se obse a que una de las aplicaciones de la epi luo escencia con elación al es udio de la iabilidad 205