Determinación de la actividad biológica y de la biomasa en sistemas de depuración: Aplicación en la detección de estados de inhibición o toxicidad

Determinación de la actividad biológica y de la biomasa en sistemas de depuración. Aplicación en la detección de estados de inhibición o toxicidad Laura lsac y Carmen Arnáiz*. Departamento de !ngeniería Química y Ambiental, Escuela Universitaria Pol¡técnica. Universidad de Sevilla. Virgen de iñrica,7.41011 Sevilla, España. Biomass Characterization and Biological Attit,itl. Tests itt Wastewater Treatruent. Ap¡tlicabilitv fo the Assessntent of Inhibitott and Toxic Pollutants. Determinació de I'activitctt biológica i de la bionrussa en .sistemes de depuració. Aplicació ett la detecciti cl'estctts cl'inhíbició o toxicitat. Recibido: 25-lV-2005 RESUMEN Los ensayos de detección de la toxicidad en el fango activo que son realizados sobre los propios microorganismos del sistema están basados en la estimación de la viabilidad y niveles de actividad biológica de dichos microorganismos en respuesta al uimpacto, ambiental recibido. Viabilidad y actividad de la biomasa microbiana son de por si parámetros de control del proceso cuyas determinaciones pueden ser adaptadas a los procedimientos de evaluación de Ia inhibición o toxicidad ejercidos por determinados compuestos presentes en los influentes de las estaciones depuradoras. En este trabajo se realiza una revisión de los principales métodos de determinación de la actividad biológica y de la biomasa, así como de sus aplicaciones a la detección de estados de inhibición/toxicidad sobre una muestra de fango activo. Palabras claye.' Actividad biológica. Biomasa. Fango activo. Métodos. Toxicidad. Tratamiento de aguas residuales. SUMMARY The toxicity assessment of pollutants on the activated sludge process is based on the determination of the physiological state, the viability and the activity of the heterotrophic bíomass. Viability and biomass activity are important process control parameters and their determinations could be employed in order to evaluate the toxicity of contaminants in wastewater treatments. ln this work, advanced and conventional analytical methods for activity and biomass determination in the activated sludge process are reviewed. Key words: Activated sludge. Biomass. Biomass activity. Methods. Toxicity. Wastewater treatment. RESUM Els assaigs de detecció de la toxicitat en el fang actiu que es realitzen sobre els propis microorganismes del sistema es basen en I'estimació de la viabilitat i dels nivells d'activitat biológica dels esmentats microorganismes en resposta a «l'impacte,> ambiental rebut. Viabilitat i activitat de la biomassa microbiana són de per si parámetres de control del procés, podent-se adaptar la seva determinació als procediments d,avaluació de la inhibició o toxicitat ocas¡onats per determinats compostos presents en els influents de les estacions depuradores. En aquest treball, es realitza una revisió dels principals métodes de determinació de l'activitat bioldgica i de la biomassa, així com de les seves aplicacions a la detecció d'estats d'inhibició/toxicitat sobre una mostra de fang actiu. Mots clau: Activitat biológica. Biomassa. Fang actiu. Métodes. Toxicitat, Tractament d,aigües residuals. 1. INTRODUCCIÓN En cualquier estación depuradora de aguas residuales (EDAR), la práctica más extendida de evaluación de factores tan importantes como la viabilidad o el nivel de actividad biológica del cultivo depurador consiste en el empleo * Autor para la correspondencia: Carmen Arnáiz. Teléfono: 95 455 28 12 Fax 95 42827 77 e-mail: [email protected] 197 de los métodos clásicos de estimación de la biomasa (peso seco o métodos directos de recuento celular, p. ej.). Sin embargo, el funcionamiento de una EDAR está influenciado, en gran medida, por la calidad de la biomasa en el sistema, cuya actividad puede ser determinada. Las medidas de actividad biológica deben servir para que el explotador se anticipe a estados de baja eficacia en la depuración y pueda adoptar las medidas pertinentes en prevención. En algunas ocasiones, ciertos contaminantes llegados al sistema son los responsables de dichos estados de baja eficacia depuradora, que son detectados una vez que se han producido bajos niveles de actividad biológica. En otras ocasiones, la operación de cloración mal planificada en el reactor es responsable de un drástico descenso en la actividad biológica, con repercusión sobre los rendimientos depuradores, los cuales no son restablecidos hasta la "recuperación, de la biomasa. En este trabajo se tratarán distintos métodos de cuantificación de la actividad biológica y determinación de la biomasa, procedimientos que entre sus apl¡caciones cuentan con Ia detección de estados de inhibición o toxicidad de la biomasa y que, por definición, permiten conocer la respuesta ofrecida por la propia suspensión biológica somet¡da a estud¡o. 2. MÉToDoS INDIREcTos DE EVALUAoIÓN DE LA BIOMASA. ESTIMACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA. Los métodos ¡nd¡rectos de evaluación de la biomasa se basan, fundamentalmente, en la cuantificación de alguna actividad enzimática (métodos bioquímicos), en la medida de consumo de un sustrato o en la formación de algún producto (métodos cinéticos), o en la determinación de algún componente celular específico (ATP, p. ej.). Los métodos bioquímicos y cinéticos determinan, más que la viabilidad de las bacterias, su actividad, ya que dependen más del estado metabólico de los microorganismos que del número de individuos. 2.1. Métodos bioquímicos En su mayoría, la medida de actividades enzimáticas se lleva a cabo mediante la conversión de sustratos específicos a productos coloreados que son cuantificados fotométricamente. Los ensayos enzimáticos son simples de realizar y sus resultados se obtienen rápidamente, empleando un equipamiento que no es ni costoso ni complejo('). Sin embargo, las principales desventajas de los métodos bioquímicos son la variación de las actividades enzimáticas celulares con los cambios fisiológicos y, que una vez que los microorganismos mueren, algunas enzimas liberadas pueden permanecer act¡vas. El estudio de las actividades enzimáticas es una cuestión de interés por las siguientes razones: - Las actividades enzimáticas desempeñan un importante papel en la mineralización e hidrólisis de la contaminación de las aguas(''t'o'. - La caracterización de las actividades enzimáticas proporciona infonnación sobre la tratabilidad de ciertos compuestos xenobióticos(u). - Enzimas y, en su defecto, microorganismos portadores de determinadas actividades enzimáticas, pueden ser adicionados a_procesos de tratam¡ento para la mejora de la eficacia(u''). - Ciertos patrones de actividad enzimática pueden servir en la caracterización de la actividad de una población microbiana('). La actividad enzimática, comprendida como un indicador bioquímico, con frecuencia ha sido empleada para medir actividad microbiológica o estimar biomasa microbiana en suelos(t' n), cauces naturales('o), fangos activos('' "' "' " to', influentesí "), sistemas de tratamiento de biomasa fi¡aí'''u''6'") reactores SBR (sequenc ing batch reactor)\" "' y en procesos anaerobios('n''). También se ha empleado en el estudio de la biodegradación de compuestos específicos("). Las medidas de una determinada actividad enzimática pueden ser también utilizadas para cuantificar el impacto de un tóxico sobre dicha enzima e indirectamente sobre el sistema biológico. Cambios en actividades enzimáticas, medidos como variaciones en la concentración de los productos metabólicos o de los sustratos de dichas enzimas, constituyen la base para que estos ensayos microbiológicos puedan ser empleados en la detección de estados de inhibición o toxicidad de una determinada biomasa''''. Dependiendo de los objetivos del estudio, la actividad enzimática puede estar presente en la mayoría o en la totalidad de los microorganismos (p. ej., actividad deshidrogenasa). Si, por el contrario, se trata de una actividad enzimática específica (p. ej., nitrato reductasa o nitrogenasa), los efectos son estudiados sobre un grupo bacteriano muy concreto. 2.1.1. Actividades enzimáticas hidrolíticas La medida de Ia actividad enzimática se presenta como una alternativa a los métodos tradicionales de estimación de la biomasa y de la actividad biológica. Las enzimas hidrolíticas extracelulares están d¡rectamente i m pl icadas en la rotura de sustratos complejos en otros más sencillos de bajo peso molecular. Dichos sustratos, de otra forma, no podrían ser introducidos en la célula y empleados como fuentes de carbono y de energía tras ser incorporados al metabolismo celularde oxidación, donde son sustratos de enzimas intracelulares('' "). Algunas de estas enzimas de actividad extracelular son las enzimas h¡drolíticas a- y B-glucosidasas y las proteasas, las cuales desempeñan un papel muy importante en las primeras etapas de la depuración, puesto que la mayor parte de la fracción orgánica de un agua residual está compuesta, precisamente, por carbohidratos y proteínas. Mientras que las cr- y B-glucosidasas actúan rompiendo los enlaces glucosídicos de los disacáridos resultados de la degradación de polisacáridos, la proteasa (aminopeptidasa) rompe las uniones peptídicas de proteínas. Entre tales aminopeptidasas se encuentra la exopeptidasa específica para el aminoácido alanina, denominada L-a/a-ami- nopeptidasa. La fosfatasa es la enzima que hidroliza los ésteres de fosfato y produce la liberación de los grupos fosfato. Las fosfatasas ácida y alcalina, además de diferir en el pH óptimo para la actividad máxima, se diferencian en el mecanismo de acción sobre los d¡stintos sustratos. La cuantificación de estas cinco enzimas, fosfatasas alcalina y ácida, cr- y ¡3-glucosidasas y proteasa, se realiza de forma similar, es decir, med¡ante cuantificación espectrofotométr¡ca del producto resultado de las respectivas acti, vidades enzimáticas sobre los sustratos específicos suministrados inicialmente en cada ensayo(3). En líneas generales, en la bibliografía se encuentra que las actividades esterasa y L-ala-aminopeptidasa son mayores que las cr- y B-glucosidasas y fosfatasas. por otra parte, el patrón de distribución y la cuantía de las distintas enzimas medidas sobre suspensiones de fango activo se muestran en relación con las características del agua de entrada a plantaí). También se ha hallado una relacidn line- 198 al entre estas activ¡dades enzimáticas y la concentración de biomasa0 q. En cuanto a una posible relación entre dichas actividades enzimáticas y parámetros de funcionamiento del proceso, existen autores que la rebaten('). Otros autores, sin embargo, encontraron cierta relación entre estas actividades enzimát¡cas y la carga de operación en el reactor''''. En cualquier caso, la localización de las enzimas hidrolíticas habrá de ser tenida en cuenta, ya que el hecho de que sean retenidas próximas a la célula o a los EPS (extracellular polymeric substancesJ del flóculo, en vez de libres en disolución, evita la continua inversión energética de los microorganismos con el fin de reemplazarlase'o'. Esto significa que actividad enzimáticahidrolítica y act¡vidad metabólica han de ser tratadas por separado. Este hecho habrá de tenerse espec¡almente en cuenta en el caso de sistemas anaerobios, en los que la biomasa tratada ha sido recirculada y proviene de otros compaftimentos, en los que ha podido ocurrir tal acumulación, sobre todo por el carácter estable de estas enzimas't'. Los trabajos sobre actividades enzimáticas son amplios y han sido aplicados en estudios tan diversos como el seguimiento de la respuesta metabólica de fangos act¡vos ante determinadas «cargas de choque" de origen industrial. Tal es el caso de Kibret et a/.''', quienes realizaron un seguimiento de la actividad del fango activo de un piloto sometido a pulsos crecientes de fenol mediante la caracter¡zación de la actividad pirocatecasa. La pirocatecasa está implicada en los primeros pasos de la degradación aerobia del fenol. El procedimiento de medida emplea la cuantificación espectrofotométrica y constituye un ejemplo más de la aplicabilidad de las medidas enzimáticas. En cualquier caso, trabajos como el de Dalzell et al.('o) demuestran la menor sensibilidad de la actividad enzimática L-ala-aminopeptidasa en la detección de estados de toxicidad de la biomasa, frente a otros ensayos microbiológicos de medida de la toxicidad como la inhibición de la nitrificación, la tasa de respiración, la inhibición de Ia luminiscencia o la medida de ATP. 2.1.2. Actividad esterasa Las esterasas desempeñan un ¡mportante papel en la biodegradación de muchas sustancias naturales presentes en las aguas residuales tales como lípidos, proteínas y algunos compuestos químicos sintéticosí'), siendo enzimas ampliamente distribuidas y constantes en el fango activo. Son fácilmente ensayadas y han sido empleadas en la determinación de biomasa y actividad microbiana en suelos, aguas residuales y fangos activosí'''"'"'"'. En estudios de suelos han sido empleadas de forma conjunta con la tasa de respiración, encontrándose una buena relación entre ambas medidas('). No así en cultivos en fase de crecimiento exponencial de agua residual o fango act¡vo, en los que la medida del ATP y la tasa de respiración mostraron un buen grado de correlación entre sí, pero no respecto a la hidrólisis del d¡acetato de fluoresceína("). Lemmer et al.\"t, quienes emplearon la actividad esterasa como medida de la actividad degradadora heterótrofa en un sistema de fangos act¡vos, encontraron un comportam¡ento parecido con el resto de actividades hidrolíticas (cr- y 0- glucosidasa, f osf atasa y L-a/a-aminopeptidasa). En algunos de los trabajos anteriormente citados, los sustratos empleados como modelos de ésteres son el p-nitrofenol, a-naftol o el diacetato de fluoresceína. El diacetato de fluoresceína (FDA) es el sustrato más ampliamente utilizado en la medida de la actividad esterasa. Es un compuesto que puede ser hidrolizado por enzimas tales como proteasas, l¡pasas y esterasas, siendo el producto de dicha conversión enzimát¡ca la fluoresceína('). La fluoresceína puede ser visualizada mediante el empleo de la microscopía de epifluorescencia o cuantificada med¡ante espectrofotometría tras ser extraída con disolventes orgánicos. En el campo de la epifluorescencia se han utilizado derivados del FDA como el diacetato de 6-carboxifluoresceína (CFDA) y el diacetato de 5- (y 6-) sulfofluoresceína (SFDA). Este último, que será mencionado posteriormente en el apartado de técnicas de epifluorescencia, se ha revelado como el más apropiado por el momento("). 2. 1.3. Actividad deshidrogenasa (D HA) En una muestra biológica, la determinación de la actividad del sistema de transporte electrónico puede realizarse mediante cuantificación de la DHA. Todos los microorganismos aerobios poseen un sistema de transporte electrónico en el que el más importante aceptor terminal de electrones es el oxígeno. En la corriente principal de este transporte electrónico part¡c¡pan, entre otras, las deshidrogenasas, enzimas de oxido-reducción que mediante la transferenc¡a de hidrógeno intervienen en el transporte de electrones desde un sustrato orgánico a un aceptor final de electrones. La determinación de la DHA y en su extensión de la actividad respiratoria microbiológica, puede realizarse midiendo lacapacidad de los microorganismos para reducir un indicador o colorante redox, de los que las sales de tetrazolio son las empleadas con mayor frecuencia. Entre dichas sales se encuentran el cloruro de 2,3,5-trife- niltetrazolio fffC) V el cloruro de 2-(p-iodofenit)-3(p-nitro- fenil)-S-fenil tetrazolio (lNT). Ambas se caracterizan por ser solubles en agua en su forma ox¡dada y por formar depósitos celulares insolubles de formazán, TTO-formazán e INT-formazán, respect¡vamente, cuando son reducidas por la actividad respiratoria. Estos depósitos rojizos de formazán, al ser observados microscópicamente (Figura 1), permiten distinguir en muestras acuosas las bacterias que respiran de aquellas que no (determinación directa de la biomasa). O bien, el formazán es extraído con disolventes orgánicos y determ ipado espectrofotométricamente, permitiendo la cuantificación de la actividad respiratoria de la muestra (determinación indirecta de la biomasa). a'r3.r {{' *. ,-'! ' - \ Figura 1. Ensayo bioquímico de la DHA. (A) Depósitos intracelulares de INT-formazán (+) en bacterias filamentosas. I 000X, campo claro. (B) Depósitos intracel ulares de fo rmazán en bacterias formadoras de flóculos. 1000X, campo claro. 199 'i §'Y ?,: t.l El ácido bencenosulfónico 3'{1 -[(fenilamino)-carbonil]-3,4- tetrazoliol-.bis (4-metoxi-6-nitro) (XTT), a diferencia con los otros colorantes redox, presenta la particularidad de producir formazán solubfe en agua, lo que evita el procedimiento de extracción('o). El TTC, al igual que el azul de metileno (MEB), presenta el inconveniente de su elevada sensibilidad al oxígeno("). El INT no tiene esta limitación y su uso está muy extendido. En este sentido, el CTC (cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil tetrazolio), fluorocromo de más reciente desarrollo, está extendiéndose cada vez más en el campo de la epifluorescencia para la determinación directa de la biomasa con muy buenos resultados, sobre todo al ser empleado en combinación con otros marcadores (apartado 3.2). En la Tabla I quedan recogidos distintos trabajos en los que han sido empleados varios colorantes redox en diversas apli- TABLA ¡ Aplicaciones de las sales de tetrazolio en estudios medioambientales. Autores Colorante redox Aplicación Nybroe ef a/.(') INT Determinación de la actividad biológica en fangos act¡vos y aguas residuales de distintas EDAR y de un piloto Goel et a/.(') INT Determinación de la actividad en un reactor SBR Blenkinsopp y Lock('o) INT Determinación de la DHA en biopelículas en ríos Le Bihan y Lessardnu) TTC Caracterización de la biomasa de un biofiltro Fonseca et a/.íu) INT Actividad microbiana en biofiltros para potabilización Kriebitzsch et a/.í') XTT/CTC Determinación de la actividad en un reactor SBR de alimentación sintética Chung y Neethlingín) INT Determinación de la actividad biológica en digestión anaerobia Bhupathiraju et a/.eo) cTc Determinación de la actividad DHA de microorganismos anaerobios y facultat¡vos J@rgensen('u) MB Determinación de la DHA en fangos act¡vos Logue ef a/.e') INT Determinación de la DHA en fangos activos con problemas de proliferación filamentosa Awong ef a/.(") INT Determinación de la DHA en espum¿¡s nocardias López et al.t'nr INT Actividad de fangos act¡vos Anderson et a/.(to) INT Medida de la inhibición de la actividad biológica inducida por metales pesados en fangos activos Kim et al.(t') INT Medida de la inhibición en cultivos puros y fangos activos por efecto del H,O, y el Clz Bensaid et a/.(t') Estimación de la actividad en cultivos de fangos activos bajo distintos regímenes de alimentación lsac(t"' INT Determinación de la DHA en fangos activos y detección de la inhibición ejerc¡da sobre éstos por compuestos xenobióticos Li y Zhao@) TTC Detección de la inhibición microb¡ológica en fangos act¡vos Kalmbach ef a/.0') crc Determinación de la densidad y actividad metabólica bacteriana en la formación del biofilm en aguas potables CTC: cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil tetrazolio; INT: cloruro de 2-(p-iodofenil)-3(p-nitrofenil)-S-fenil tetrazol¡o; MB: azul de metileno; XTT: ácido bencenosulfónico 3 -{1-[(fenilamino)-carbonil]-3,4-tetrazolio]-bis (4-metoxi-6-nitro); SBR: seq u e n c i n g batch reactor; TTC: 2, 3,S-trifen i ltetrazolio. 200 caciones en la determinación de la actividad de la biomasa, en otros campos además del de las aguas residuales. Las experiencias llevadas a cabo por Smith y McFeters('u) en Escheichia coll han indicado que, en la cadena de transporte electrónico, la reducción del INT y el CTC se localiza principalmente a nivel de dos deshidrogenasas flavín dependientes: el complejo succinato-deshidrogenasa y la NADH-deshidrogenasa. El CTC, además, parece ser reducido por otras deshidrogenasas celulares. De la misma manera, el INT podría serlo por la ubiquinona, posiblemente los c¡tocromos bsss ! bsm, el anión superóxido y alguna otra deshidrogenasa donadora de electrones a la ubiquinona. Estos mismos autores, Smith y McFeters, han estudiado el nivel de reducción de estos colorantes redox bajo condiciones de anaerobiosis y en las que son inducidas rutas distintas de transporte electrónico en el organismo anaerobio facultativo E. coli. Los resultados indicaron que ambas sales (lNT y CTC) pueden ser reducidas bajo tales condiciones de oxidorreducción, pero principalmente en la ruta de fermentación de la glucosa. Bhupathiraju et a/.€o) quienes estudiaron distintos organismos anaerobios facultat¡- vos y obligados en su relación con la capacidad de reducir el CTC, hallaron que, efectivamente, ex¡ste reducción del colorante, sin evidencias de que ocurriera extracelularmente o de forma abiótica. Chung y Neethlingí") emplearon con anterioridad la DHA dependiente del sustrato INT como parámetro de control de la digestión anaerobia. Estos autores encontraron una buena correlación entre dicha determinación, el contenido de ATP y otras medidas ¡ndirectas de la actividad biológica anaerobia (tasa de producción de biogas, pH y concentración de ácidos grasos volátiles). La DHA se ha encontrado que guarda buena relación con otros parámetros de medida de la actividad como es la tasa de respiración"t t'28 4'30 3r'32's). Li y Zhao@)detectaron inhibición de la biomasa en fangos activos mediante la reducción de los niveles de DHA dependiente del sustra- to TTC y de la tasa de respiración específica, descensos de la actividad biológica que se relacionaron con d¡sm¡- nuciones de la eliminación de la DQO (demanda química de oxígeno) por el sistema de tratamiento. Si bien los métodos enzimát¡cos anter¡ormente citados basados en las actividades de proteasas, glucosidasas, etc., han resultado de utilidad en dist¡ntas aplicaciones, presentan el inconveniente de que la hidrólisis de un determinado compuesto no está directamente relacionada con el procesamiento del carbono o el metabolismo celular energético, como el transporte electrónico o la fosforilación oxidativa en el caso de la DHA(''). De hecho, Le Bihan y Lessard('u), quíenes utilizaron la DHA con el sustrato TTC y la B-glucosidasa en la caracterización de la biomasa de un biofiltro, encontraron que la exo-enzima presenta un patrón de variación en función a la temperatura que no se repite con la DHA, reafirmando la idea de medida enzimática estable de esta última. Jung et a/.r) confirmaron el carácter estable de estas enzimas en sus experiencias de extracción y recuperación de actividades enzimáticas de sobrenadantes de fangos en exceso, en las que la DHA medida era muy inferior respecto al resto de actividades enzimáticas extracelulares (proteasa, glucosidasa y lipasa) y respecto a los niveles de act¡vidad medidos en el fango inicialmente. 2.1.4. Actividad catalasa La actividad catalasa está ampliamente distribuida en la naturaleza, encontrándose presente en células animales, vegetales y bacterianas. La cuantificación de la actividad catalasa se efectúa tradicionalmente mediante el seguimiento espectrofotométrico o mediante valoración de la desaparición del sustrato de esta enzima, el peróxido de hidrógeno. Otra aproximación a la determinación de esta actividad se encuentra en los trabajos de Guwy et al.tn'"u'"'). En ellos se expone un método de medida de la actividad catalasa que puede ser utilizado en la cuantificac¡ón de biomasa activa en lodos de depuradora, suelos, etc., dada la buena correlación que esta actividad enzimática guarda con otras medidas como las respirométr¡cas't". Ofrece, además, la posibilidad de ser adaptada al seguimiento en continuo de la biomasa en procesos como el de fangos activos. El método se basa en el uso de un medidor de flujo gaseoso''u' capaz de detectar el oxígeno liberado resultado de la actividad catalasa, cuando una muestra biológica es puesta en contacto con HzO, en unacámara de reacción. Aunque este método no ha sido utilizado en la cuantificac¡ón de efectos tóxicos o inhibitorios de suspensiones b¡ológicas, la detección de un mínimo de nueve unidades de catalasa por gramo de peso seco de una muestra de suelo, permite plantear futuras aplicaciones para esta actividad enzimática. 2.1.5. Actividad ATPasa Esta determinación de la actividad biológica está basada en la cuantificación de la actividad enzimática ATPasa más que en la estimación del contenido en ATP, parámetro utilizado durante largo tiempo como índice de biomasa microbiana. El método esencialmente consiste en un ensayo in vitro, en el que tras la adición del tóxico a la enzima y transcurrido un tiempo de contacto suficiente, se ensaya la actividad ATPasa mediante la adición de ATP como sustrato("). Se trata éste de un ensayo enzimático empleado específicamente en la detección de la toxicidad. 2.2. Métodos cinéticos La base de estos métodos es el seguimiento de la producción o consumo de un determinado compuesto de concentración conocida por parte de un cultivo de microorganismos, generalmente en un ensayo en discontinuo. El ejemplo más típico en procesos aerobios es la determinación de la DBO (demanda bioquímica de oxígeno), que indica la biodegradabilidad de un sustrato en disolución a través del consumo de oxígeno del medio. 2.2.1. Tasa de respiración (OUFi, oxygen uptake rateJ Se denomina respiración al consumo de oxígeno de los microorganismos presentes en una muestra biológica debido a la respiración endógena de mantenimiento celular y a la oxidación del sutrato orgánico presente en ella, en ausencia de nitrificación. Así pues, se denomina OUR (mg* L-' d-'¡ a la velocidad con la que los microorganismos utilizan el oxígeno en función de estos dos conceptos('n). La tasa de respiración básica (OUR") es la originada por la respiración endógena de manten¡miento celular en ausencia de nitrificación y por una pequeña parte de materia orgánica adherida a la masa de microorganismos. En la práctica, se considera que es constante a temperatura y concentración de microorganismos fijos. Un decrecimien- to anormal de la OURu en estas condiciones representa un signo inequívoco de inhibición respiratoria y de posible toxicidad del medio. La tasa de respiración exógena (OUR") es la originada durante la oxidación del sustrato orgánico rápidamente biodegradable y es proporcional al mismo. En el caso de que exista un proceso de nitrificación, OUR" incluye la tasa de respiración por este concepto (OUR."). En la Figura 2 se representa un esquema del comportamiento de la OUR de un fango activo a lo largo del tiempo bajo condiciones batch. La OUR total referida a la concentración de microorganismos, expresada esta última como sólidos en suspensión 201 volátiles (SSV), es la tasa de respiración específica (SOUR, specific oxygen uptake rate) (ecuación 1): souR = ${.n", g*"'' d'') 0) Su principal característica es que define la actividad biológica de una biomasa específica en un momento dado y además está relacionada con la proporción "alimento/ microorganism6s" (F/M, "foodlmicroorgan¡'sms" en terminología anglosajona), ya que comprende la OUR" (proporcional a la DBO) y los SSV del cultivo biológico'""'. Una estación depuradora recibe aguas residuales urbanas con una gran variabilidad en cuanto a caudal y composición, con oscilaciones estacionales, diarias y horarias en estrecha relación con los regímenes de evacuación de los diferentes tipos de aguas domésticas, de actividades comerciales, industriales, etc. Por esta razón, para una concentración constante de sólidos en suspensión (SS) en el tanque de aireación, sería de esperar que tanto oxígeno disuelto (OD) como SOUR presentaran una respuesta a tales cambios en la composición del influente. Así lo confirmaron autores como Schulze y Kooistra'o'), quienes no sólo hallaron una relación directa entre OUR y SOUR con relación a la DQO del influente, sino también un patrón de comportamiento diario y estacional de ambas tasas de respiración en paralelo con la carga orgánica y el caudal influente. No obstante, Duggan y Cleasby'o'' encontraron que la OUR puede variar independientemente de las características del influente, hecho que atribuyeron a la respiración endógena y a la acumulación de sustancias de reserva en la población bacteriana sobre la que se efectuó el estudio. Edwards y SherrardFn' no encontraron relación alguna entre la OUR en el reactor biológico y variaciones en el influente, en cuanto a carga orgánica o a caudal; estos resultados fueron cuestionados por otros autores que consideraron que las condiciones de trabajo eran fluctuantes, aunque sin poder considerarse de estrés para la biomasa. Huang y Cheng(ot) hallaron una estrecha relación entre el valor de SOUR en el reactor biológico y la DQO soluble del efluente, que sin embargo no fue confirmada en el trabajo de Chandra et a/.('n) A pesar de este ambiente de contrariedades entre los resultados obtenidos por distintos investigadores, es cierto que la respirometría o la medida e interpretación de la OUR vía biológica, ha sido y sigue siendo objeto de numerosas investigaciones dadas sus diversas aplicaciones. Una de tales aplicaciones se encuentra en estrecha relación con el desarrollo de modelos dinámicos en el proceso de fangos act¡vos durante las últimas décadas. Así, el Modelo no 1 para fangos activos (ASM1), presentado por la IAWPRC TlLsa dc rcspiración altr loridacií» dc sustratos liicilnrcnlc hiodcgrailablus) I Tasr cic rcspiracirin cncftigcna I (lnternational Assoc,ation on Water Pollution Research and Controf en 1 987{*) ha sido aceptado y empleado en muchos estudios de simulación de plantas de tratamiento de aguas residuales. La simulación se considera una henamienta de trabajo muy práctica, que permite al explotador la exploración y ensayo de un amplio rango de estrategias de depuración sin riesgos para la planta. La denominada "calibración del modelo", en la que se requiere principalmente la caracterización del influente y del lodo de la planta sometida a estudio, necesita de abundante información obtenida de experiencias a nivel laboratorio en las que la respirometría y en concreto la determinación de la OUR, desempeñan un papel esencial. La caracterización de las distintas fracciones del agua residual en cuanto a biodegradabilidad, así como la estimación de los parámetros cinéticos que rigen el comportamiento de la biomasa heterótrofa en condiciones aerobias, son circunstancias que han exigido, pero también derivado, en importantes avances en torno a la respirometría(46 47'4'4q'50 51), Un campo de avance ha sido el desarrollo de nuevas técnicas respirométricas y aparatos de medida que ofrecen la posibilidad de ser empleados bajo condiciones dinámicas de funcionamiento. Esta situación permite, entre otras, la determinación on-line de la OUR en el proceso de fangos activos. Esto supone un importante avance en las estrategias de control, pues con dicha determinación se logran mantener unas condiciones óptimas en el proceso de tratamiento bajo diversas circunstancias: en la fluctuación de la carga, en la detección inmediata de efectos causados por sustancias tóxicas en el inf luente, etc.'u'' *'*' Bajo condiciones de laboratorio han sido también diversas las técnicas respirométricas y los procedimientos desarrollados para la determinación de un protocolo de medida de la inhibición resp¡rator¡a del fango activo, causada por la toxicidad ejerqida por ciertos compuestos presentes en las aguas residuales. La OECD (Organization for Economic Co-operation and Development) emitió su propio protocolo de medida de la inhibición respiratoria en el fango activo, el test OECD 209, que ha sido evaluado por distintos autores("). La versión oficial española de la Norma Europea UNE-EN ISO 81 92 de fecha enero de 1 995 se denomina "Ensayo de inhibición del consumo de oxígeno por lodo activado» y adopta íntegramente la Norma lnternacional ISO 8192:1986. La USEPA (United States Environmental Protection Agency\, en su inventario de ensayos, recoge la medida de la SOUR entre otros protocolos de tipo respirométrico. Los Métodos Normalizados@) recogen también la OUR como uno de los ensayos tipo a realizar sobre el lodo (2710 B). En Nirmalakhandan et a/.64, se presenta un ensayo basado en la inhibición de la respiración que emplea una mezcla de doce bacterias como organismos test. Es el prepa- 'lusa de rcspiracirin birja I o\idilci(in dc suslratos de biodcgradrción lcnta) Figura 2. Comportamiento de la tasa de respiración de una muestra de fango activo bajo condiciones batch (En: Seviour y Blackdl@). c C Tienrfo (h) 202 rado comerc¡al Polytox@, en el que la respuesta tóxica se mide con base a una reducción del consumo de oxígeno por parte de los microorganismos de ensayo. Las técnicas respirométricas han sido también empleadas en la caracterización de los distintos grupos funcionales de microorganismos que forman parte de la comunidad del fango activo, además de los heterótrofos. Es decir las poblaciones nitr¡ficantes y desnitrificantes, determinadas a través de las medidas de las tasas de utilización de amonio (AUR, ammonium uptake rate) y nitrato (NUR, nltrate uptake rate\, respectivamente(o'' ut). Otra aproximación a la medida de la OUR es la tasa de producción de COz. El fundamento de este procedimiento es el hecho de que la producción de COz por parte de un cultivo bacteriano es el reflejo de una serie de reacciones bioquímicas, que constituyen el proceso de respiración de los microorganismos. Una aplicación de este procedimiento en la detección de latoxicidad ejercida por metales pesados se encuentra en Jardim et a/.("n) 2.2.2. Tasa de desaparición de sustrato Es el método más convencional para determinar la actividad de una población de microorganismos. La disminución de la concentración de sustrato en el tiempo puede hacerse a través de métodos indirectos como Ia DQO o el carbono orgánico total (COT), o mediante técnicas específ icas, f undamentalmente cromatográf icas. La búsqueda de nuevos métodos ha llevado al empleo de técnicas basadas en el uso de electrodos selectivos, en los que el cálculo de la actividad de la muestra biológica se realiza con base al tiempo requerido para que se produzca el 50% de la desaparición del sustrato sum¡n¡strado y para el que ql electrodo es específico. En el trabajo de Olah y Princz6o)se presenta la aplicación de un electrodo select¡vo de glucosa. 2.3. Estimación de componentes celulares específ¡cos Cualquier componente celular seleccionado para la estimación de la biomasa viva de una muestra debe responder a tres criterios fundamentales: (1) estar presente únicamente en células vivas, (2) ser rápidamente degradado cuando las células mueren y (3) ser relativamente constante en concentración respecto a cambios en el estado fisiológico celular y entre distintas especies. Hasta el momento, no se conoce ningún componente celular que cumpla estos tres requerimientos. Sin embargo, los más adecuados para est¡mar biomasa viva son los ácidos nucleicos, las proteínas, los polisacáridos, los lípidos y el ATP. 23.1. Ácidos nucleicos El ADN y el ARN son dos componentes de las bacterias cuyas síntesis son proporcionales a la tasa de crecimien- to. Mientras que las concentraciones de ARN varían considerablemente con el estado fisiológico celular, la cantidad de ADN es relat¡vamente constante. La cantidad de ADN se determina mediante espectrofotometría, tras su extracción y purificación. Existen diversas técnicas, si bien presentan la desventaja de que los procedimientos de purificación son complejos, con diversas interferencias y bastante costosos. Además, el contenido en ADN del fango activo ha sido empleado como una medida de la biomasa con poco éxito, debido a circunstancias como su acumulación en los polímeros extracelulares(oo). 2.3.2. Proteínas Existen varias técnicas para el análisis de proteínas tota- Ies de una muestra biológica. Algunas están muy extendidas y se caracterizan por su sensibilidad, rapidez y simplicidad, t^al es el caso de las técn¡cas de Lowry et al.t"') y Bradford(t'). La principal desventaja de la determinación de proteínas es que su cantidad en las células está sujeta afuertes variaciones debidas, fundamentalmente, a cambios en las condiciones físico-químicas y al estado fisiológico celular. 2.3.3. Polisacáridos La mayoría de las células procariotas contienen el peptidoglicano ácido murámico como componente de la pared celular. Existen varias técnicas para la determinación del ácido murámico en muestras que contengan microorganismos. Todas ellas se basan en la conversión del ácido murámico a lactato, seguida del análisis enzimático o químico de la concentración de lactato. El ácido murámico se extrae de las células mediante una hidrólisis alcalina y se purifica posteriormente mediante crom atografía de intercambio r<ínrco. Otros anális¡s más sensibles necesitan del uso de cromatografía líquida de alta resolución o gaseosa. Todas estas técnicas son laboriosas, consumen mucho t¡empo y necesitan de un equipamiento caro. 2.3.4. Lípidos Los lípidos son un componente fundamental de las membranas celulares que se encuentra en cantidades relativamente constantes, con un contenido específ¡co alto. Aproximadamente, entre un g0-98% de los lípidos de las membranas celulares está en forma de fosfolípidosl*). Su determinación para la estimación de la biomasa viva de una población bacteriana ofrece muchas ventajas sobre otros métodos, como por ejemplo que no forman parte de las reservas celulares y que se degradan rápidamente durante la lisis bacteriana. Lastécnicas de anáisis se basan, fundamentalmente, en la extracción celular de los fosfolípidos con un disolvente orgánico, su poster¡or hidrólisis ácida para liberar el fosfato y, por último, la determinación colorimétrica de éste. Son técnicas relativamente sencillas, reproducibles y sensibles, con límites de detección de 0,1 a 1 nmol de fosfato(uo). Los lípidos han sido ampliamente empleados en estudios medioambientales'uo) y más recientemente se han aplicado en sistemas de filtración biológica para potabilización('u) y en reactores anaerobios de lecho fluidizado(t'' *). 2.3,5, ATP El ATP es un componente bioquímico central presente en todos los microorganismos y específico de los vivos al ser destruido rápidamente tras la muerte celular, característica que le permite ser relacionado con la biomasa viva. Una de las técnicas más utilizadas para medir ATP se basa en la reacción lucíferina-luciferasa, proceso responsable de la luz emitida por las luciérnagas, que ha sido ampliamente estudiado. En este mecanismo de luminiscencia se sabe que intervienen la luciferina (LHz), la enzima luciferas (E), ATp, cationes de magnesio y oxígeno en un proceso de oxidorreducción que ocurre en doble etapa: LHz + ATP + E - E - LH,-AMP + PPi y, posteriormente, E-LHTAMP + 02 * L + HzO + bioluminiscencia. Ya que por cada molécula de luciferina oxidada se emite un cuanto de luz, la determinación del ATP en una muestra biológica puede hacerse mediante extracción por ebullición en tampón Tris (hipocloruro de tris-hidroximetil-aminoetano) del ATP, incubación con luciferina-luciferasa y posterior medida de la luz producida en un fotómetro con reg¡stro. La mayor desventaja de esta técnica es la necesidad de procesar la muestra con rapidez, ya que el estado f¡siológico de las células cambia rápidamente tras la toma de muestras. Este tipo de ensayo ha sido aplicado en la detección de la toxicidad de distintos compuestos o efluentes industria- 203 les sobre fangos activos('o'u'), como parámetro de control del proceso de fangos activos6t), como parámetro estimador de la biomasa en aguas res¡duales y fangos activos"'), en el seguim¡ento de los efectos de la cloración sobre bacterias filamentosas(t'' un), en el seguimiento de la actividad biológica de espumas de origen filamentoso en reactores biológicos(")y en digestores anaerobiosoo). En todas estas ocasiones ha demostrado ser un parámetro apropiado de estimación de la biomasa viable. En Awong et al.t") y Kim et a/.(") se pone de man¡fiesto la buena correlación existente entre el contenido de ATP, la DHA y la OUR en muestras de fango activo. 3. MÉTODOS DIRECTOS DE EVALUACIóN DE LA BIOMASA Los métodos clásicos de estimación de la biomasa están basados en el peso seco o en métodos directos de enumeración celular. Los métodos de cómputo de células emplean procedimientos de observación que se basan en propiedades físicas o en la actividad metabólica, incluyéndose métodos de enumeración de células totales y métodos de enumeración de células viables. Los métodos de estimación directa de la biomasa constituyen un campo de estudio que ha adquirido un gran avance durante los últimos años. Esto ha sido posible gracias al empleo combinado de nuevos marcadores fluorescentes y a la adaptación a los estudios medioambientales de una técnica tradicionalmente empleada en clínica, la citometría de flujo. Nebe-von-Caron et al.?'t, en un exhaustivo trabajo en el que se combinan varios marcadores fluorescentes y el análisis mediante citometría de flujo, desglosan el concepto de viabilidad más allá de Ia antigua definición de «crec¡miento reproductivo demostrable". Así pues, una célula viva se distinguirá en función a su estado fisiológico como: célula con crecimiento reproductivo, célula con actividad metabólica o célula con la membrana íntegra. Puesto que de estos tres estados fisiológicos el más restrictivo es el de crecimiento reproduct¡vo, autores como Ziglio et al.o'', por simplicidad, han utilizado tal estado como criterio de viabilidad, mientras que el estado de actividad celular lo han asociado con el de actividad metabólica. 3.1. Métodos clásicos de evaluación de la biomasa Entre los métodos clásicos de evaluación directa de la biomasa, se encuentran: peso seco, espectrofotometría y turbidimetría, métodos microscópicos de recuento celular en cámaras y métodos de siembra. La clásica estimación de la biomasa de una muestra en términos de peso seco por unidad de volumen, ya sean SSV o sólidos en suspensión totales (SST), presenta el inconveniente de que en tal determinación quedan incluidos sustratos i nertes, polímeros extracelulares, materia orgánica y microorganismos muertos, además de microorganismos activos. Los métodos espectrofotométricos se basan en la existencia de una relación directa entre el número total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la determinación de la turbidez en la suspensión celular mediante espectrofotometría, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. Por ello, antes de utilizar la turbidez como método de recuento, hay que realizar una recta de calibrado que relacione medidas directas (microscópicas, peso seco o recuento en placa) con las indirectas de fa turbidez'"'. Son métodos poco sensibles con interferencias por el t¡po de cultivo, medio de crecimiento o por interferencias con partículas. El recuento celular entratamientos de depuración mediante cámaras no es un método muy exacto debido a irregularidades en la distribución de la muestra, a que pueden confundirse las células con otras formas orgánicas e inorgánicas existentes en el medio y a que no permite distinguir células vivas de células muertas. Sin embargo, en el caso de procesos de fangos activos con problemas de esponjamiento filamentoso (bulking) o espumas (foaming) o en el seguimiento de la operación de cloración en el reactor, es frecuente el empleo de cámaras de recuento en la cuantificación de tales tipos bacter¡anoso"''. Tradicionalmente, en los métodos de siembra, el recuen- to de microorganismos viables se fundamentaba en la capacidad de una célula de desarrollar una colonia visible en un medio de cultivo apropiado. Hoy en día, se considera que el concepto de viabilidad engloba otros estados que no implican necesariamente la capacidad de crecer en un medio de cultivol71,72'75). Puede ocurrir, simplemente, que las condiciones de crecimiento en placa sean poco favorables (medio de cultivo, ausencia de nutrientes, condic¡ones redox, t¡empo de incubación, etc.) e impidan que un organismo viable pueda desarrollar una coloniasu " "''n'. Por esta razón, se consideran métodos infraestimativos y estadísticamente cuestionables. 3.2. Técnicas microscópicas basadas en la epifluorescencia. Métodos rn situ El cómputo del número de microorganismos totales en una muestra puede realizarse mediante técnicas que emplean la microscopía óptica con iluminación de epifluorescencia. El método consiste en teñir las bacterias presentes en la muestra con un agente fluorocromo para, tras un tiempo de contacto, someterla a filtración y realizar el recuen- to. Dicho recuento podrárealizarse mediante observación directa con un microscopio con iluminación de epifluorescencia o adaptándolo a un sistema de análisis digital de imágenes que realice la cuantificación'*'"". Estos procedimientos han sido recientemente mejorados mediante el análisis de la muestra con la c¡tometría de flujo, técnica que permite el rápido recuento de células marcadas en una muestrar''"'"''. Los principales fluorocromos empleados en la estimación de la población total de una muestra son el naranja de acridina (NA) y el 4', 6-diamidino-2-fenilindot (DAPI). Ambos permiten identificar bacterias no sólo por su color, sino también por su forma y tamaño, distinguiéndolas de partículas inorgánicas presentes en la suspensión. Mientras que el NA colorea tanto ADN como ARN y algunos componentes de la pared celular, el DAPI es específico para el ADN y un buen marcador bacter¡ano para estudios de transporte a corto plazo en ecología m¡crobiana(*'*). pero a pesar de las ventajas que supone el uso de estos fluorocromos, no permiten distinguir entre células muertas, metabólicamente inactivas, y células vivas, ya que el ADN conserva sus propiedades incluso en células muertas. Otros fluorocromos como las sales de magnesio del ácido 1 -anilino-8-naftalensulfónico (Mg-ANS) tiñen principalmente componentes celulares como proteínas, lípidos o membranas celulares. EI comportam¡ento de éstos, en cambio, sigue siendo el de sobrestimación del número de células viables al no distinguir células vivas de muertas. Más recientemente, se han ido desarrollando nuevos colorantes fluorescentes específicos de ácidos nucleicos tales como: Yo-Pro-1, SYBR Green I (posteriormente llamado SYBR D, SYBR il(*), SyBR Gold, SyTOx Green@a, picoGreen y RiboGreen. Algunos de ellos han sido empleados en la cuantificación de bacterias mediante citometría de flujo. Dados los ¡nconvenientes presentados por los agentes intercalantes de ácidos nucleicos, son muchos los estudios medioambientales en los que se combina el marcado total de células con otro marcaje que responde a una actividad metabólica específica fl-abla ll). La mayoría de las veces, dicha actividad metabólica es la de un marca- 204 TABLA I¡ Estudios de estimación directa de la biomasa en los que se han combinado distintos marcajes. Autores Técnicas Aplicación Schaule et a/.('u) CTC + DAP Cuantificación de bacterias activas en aguas de consumo humano Winding etal.r") CTC + NA Cuantificación de bacterias activas en suelos Huang et a/.(t') CTC + DAPI Guantificación de bacterias activas en biopelículas tras cloración Zimmermann etal.@) INT + NA Cuantificación de bacterias activas en respiración en muestras de agua dulce (lago) y marina King y Parke/") INT + DAPI Cuantificación de células viables y metabólicamente activas en aguas subterráneas Rodríguez et al.tul CTC + DAPI Cuantificación de bacterias activas en aguas res¡duales, subterráneas y marinas Yu et a/,itn) CTC + DAPI Cuantificación de bacterias act¡vas en suelos Pyle et a/.(no) CTC + DAPI Cuantificación de la actividad respiratoria en cultivos de Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium y Escherichia coli Saby et a/,P') CTC + DAPI Cuantificación de bacterias activas tras cloración en suspensiones de E. coli Witzig ef a/.P') FISH + DAPI Caracterización de la biomasa de un biorreactor de membranas en tratamiento aerobio ¡ Bitton y Koopman(nt) INT + VM Evaluación de la viabilidad de bacterias filamentosas en el fango activo tras cloración Dutton et a/.{*) INT + VM Determinación de bacterias act¡vas en fangos biológicos Saby ef a/.e') CTC + DAPI lmpacto de la cloración sobre bacterias del fango activo Karner y Fuhrman(nn) CTC + DAPI Cuantificación de bacterias activas en agua de mar CTC: cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil tetrazolio; INT: cloruro de 2-(p-iodofenil)-S(p-nitrofenil)-S-fenil tetrazol¡o; NA: naran- ja de acridina; DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol; VM: verde malaquita; FISH: fluorescent in situ hybridization. dor redox como el CTC o el lNT, el cual pone de manifies- to la proporción de organismos metabólicamente act¡vos en una muestrá86'87'&'8e) o en un cultivo puro(to n'). Estudios más actuales combinan el DAPI o el marcaje redox con la hibridación con sondas de oligonucleótidos de ARNr (FlSH, f/uorescent in situ hybridization),lo que está permitiendo llegar a importantes conclusiones referidas, no sólo a la identificac¡ón de bacterias, sino también al estado fisiológico de las mismas?''n'). Otro fluorocromo que permite distinguir bacterias metabólicamente activas en una muestra biológica, en la que se ha empleado un agente intercalante (DAPI, NA, etc.), es el SFDA('"). La observación microscópica se corresponde con el producto fluorescente resultado de la actividad metabólica para Ia que es específico, la actividad esterasa. CTC y SFDA son fluorocromos que ponen de manifiesto actividades metabólicas, pero sin cuantificarlas. Una opción diferente, anteriormente empleada por otros autores, ha sido la de contrat¡nción de la muestra sobre la que se evalúa la actividad microbiana (lNT, p. ej.), con colorantes como el verde malaquita(" no), el azul de metileno o azul alciano (Figura 3), los cuales no requieren de iluminación de epifluorescencia y permiten igualmente la observación del total de células (Iabla ll). Una alternativa a los agentes intercalantes se presenta en Bhupathiraju et al.rq, en el que el agente fluorocromo que estima la total¡dad de la población bacteriana es un derivado de la fluoresceína, el 5-(4,6-diclorotriazinil am¡nofluoresceína) (DTAF). El DTAF se une covalentemente a las paredes celulares y puede emplearse en combinación con marcadores que ponen de manifiesto una actividad metabólica determinada, como el CTC. En la Tabla ll se observa que una de las aplicaciones de la epifluorescencia con relación al estudio de la viabilidad 205