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19 OFICINA ESPA˜
NOLA DE
PATENTES Y MARCAS
ESPA˜
NA
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11 N.◦de publicaci´on: ES 2 073 357
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21 N´ume o de solici ud: 9301641
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51 In . Cl.6:C12M 1/36
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12 PATENTEDEINVENCION B1
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22 Fecha de p esen aci´on: 21.07.93
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73 Ti ula /es: Uni e sidad de Se illa
Vice ec o ado de In es igaci´on
C/ San Fe nando, 4
41004 Se illa, ES
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43 Fecha de publicaci´on de la solici ud: 01.08.95
Fecha de concesi´on: 29.01.96
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72 In en o /es: Ma ´ın Fo ce, En ique y
Ben´ı ez Fe nandez, Tah´ıa
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45 Fecha de anuncio de la concesi´on: 01.03.96
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45 Fecha de publicaci´on del olle o de pa en e:
01.03.96
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74 Agen e: No cons a
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54 T´ı ulo: P ocedimien o pa a la selecci´on de le adu as supe p oduc o as de amino´acidos.
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57 Resumen:
P ocedimien o pa a la selecci´on de le adu as su-
pe p oduc o as de amino´acidos en cul i o con inuo
con olado po pH, aplicable en la indus ia alimen-
a ia pa a p oduci biomasa con al o con enido en
amino´acidos como suplemen o nu icional animal y
humano, ca ac e izado po que la en ada de medio
desde el anque de alimen aci´on (1) has a el an-
que de cul i o (2) es ´a egulada po una bomba pe-
is ´al ica (3) conec ada al pH-me o (4) que mide la
acidez del medio de cul i o. El anque de alimen-
aci´on con iene al as concen aciones de un an´alogo
´oxico del amino´acido que se desea supe p oduci . La
en ada de medio esco en el anque de cul i o p o-
oca el en enenamien o de la poblaci´on de le adu as,
excep o aqu´ellas que supe p oduzcan el amino´acido
en cues i´on, que se ´an las que c ezcan. Al c ece
baja ´an el pH p o ocando una nue a en ada de me-
dio con mayo es concen aciones del ´oxico (y po lo
an o de p oducci´on de amino´acidos), has a que se
alcance la concen aci´on m´axima que las le adu as
puedan ole a .
A iso: Se puede ealiza consul a p e is a po el a ◦37.3.8 LP.
Ven ade asc´ıculos: O icina Espa˜nola de Pa en es y Ma cas. C/Panam´a, 1 – 28036 Mad id
ES 2 073 357 B1
1ES 2 073 357 B1 2
DESCRIPCION
T´ı ulo
P ocedimien o pa a la selecci´on de le adu as
supe p oduc o as de amino´acidos.
Obje o de la in encion
La p esen e in enci´on se e ie e a un p ocedi-
mien o pa a la selecci´on de le adu as supe p o-
duc o as de de e minados amino´acidos en cul i o
con ´ınuo con olado po pH. El p ocedimien o se
puede u iliza pa a la p oducci´on de biomasa, a
pa i de cepas indus iales de le adu as, con ele-
ado con enido en de e minados amino´acidos, po
ejemplo, aqu´ellos en los cuales son de ici a ias
las die as de alimen aci´on animal y/o humana,
a modo de suplemen o nu icional.
Es ado de la ´ecnica
La egulaci´on de la biosin esis de amino´acidos
se ha es udiado u ilizando an´alogos ´oxicos pa a
la selecci´on de mu an es con al e aciones en la
u a de biosin esis (A in y Gan , 1983). Uno de
los usos p ´ac icos del empleo de an´alogos ´oxicos
es que los mu an es esis en es suelen se supe -
p oduc o es del an´alogo na u al (Alix, 1982). Se
han aislado mu an es de le adu as en cul i os dis-
con inuos que son esis en es al an´alogo ´oxico
hid oxino alina y p oducen en e 15 y 30 e-
ces m´as eonina que la cepa sil es e (Ramos e
al., 1991). La mu aci´on se asoci´oalap esencia
de una de las enzimas en la u a de biosin esis
de eonina, la aspa a o kinasa, insensible a e-
p esi´on po eonina. Cuando el gen que codi ica
es a enzima se in odujo en una cepa sil es e,
po ingenie ´ıa gen´e ica, los ans o man es p o-
duc´ıan en e 3 y 4 eces m´as eonina que la cepa
sil es e (Ma ´ın-Rendon e al. 1993).
Sin emba go, debido a nume osos e ec os ines-
pec´ı icos p oducidos po el an´alogo ´oxico, la
mayo ´ıa de los mu an es y ans o man es e-
sis en es al ´oxico aislados c ecen peo que la
cepa sil es e y exp esan muchos e ec os nega-
i os: baja iabilidad, sensibilidad a empe a-
u a, e c. (Ramos e al., 1991; Ma ´ın-Rendon e
al., 1993). La selecci´on de mu an es capaces de
esis i las mayo es concen aciones de an´alogos
´oxicos, supe p oduciendo las mayo es concen a-
ciones de amino´acidos posibles, acumulando nu-
me osas mu aciones y al mismo iempo c eciendo
a elocidades simila es e incluso mayo es que las
del ipo sil es e es ex emadamen e di ´ıcil. El
aislamien o de ales mu an es equie e necesa ia-
men e ´ecnicas de selecci´on en cul i o con inuo y
du an e pe ´ıodos muy la gos, pa a que el o ga-
nismo acumule aquellas mu aciones que le pe mi-
an simul ´aneamen e supe p oduci amino´acidos
y c ece a la m´axima elocidad.
Desc ipci´on de la in encion
El nue o p ocedimien o se basa, undamen-
almen e, en la u ilizaci´on de un quimios a o
como u bidos a o con olado po pH pa a la se-
lecci´on de cepas de le adu as supe p oduc o as
de amino´acidos, y en gene al pa a selecciona
cepas cuya elocidad de o maci´on de p oduc o
sea m´axima, siendo los p oduc os unci´on de la
elocidad de c ecimien o, y siemp e que exis a
un an´alogo ´oxico que pe mi a selecciona s´olo
aquella acci´on de la poblaci´onquenoseen-
enena po supe p oducci´on del co espondien e
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compues o isiol´ogico.
En el quimios a o con encional exis e un an-
que de alimen aci´on con medio nu i i o que, a
a ´es de una bomba pe is ´al ica egulada po el
in es igado , pasa ´a al co espondien e anque de
cul i o. Simul ´aneamen e y de o ma con inuada,
po g a edad i ´an pasando medio de cul i o y
c´elulas a un e ce anque de desecho.
Cuando la en ada de nu ien es es muy len a
o cuando es ´ap esen ealg´un compues o ´oxico,
las c´elulas del cul i o c ecen muy len amen e,
bien po que ago an ´apidamen e los nu ien es, de
modo que el c ecimien o es muy len o (ya que la
elocidad a la que las c´elulas c ecen y se di iden
es ´a limi ada po la al a de nu ien es), o bien
po que una acci´on impo an e de la poblaci´on
es ´a mu iendo debido a la p esencia del com-
pues o ´oxico. Si la elocidad de o maci´on de un
p oduc o depende de la asa de c ecimien o, dicho
p oduc o, po ejemplo amino´acidos, se o ma ´a
muy len amen e, ya sea po que oda la poblaci´on
i a e enado su c ecimien o po el nu ien e li-
mi an e,opo quelap esenciadel ´oxico hace que
s´olo una acci´on peque˜na de la poblaci´on, la que
esis e al ´oxico po supe p oducci´on del an´alogo
isiol´ogico, es ´e p oduciendo el compues o de in-
e ´es. En casos l´ımi es es a p oducci´on puede se
ce o.
El quimios a o adicional iene un pH-me o
que egula el pH del medio con dos bombas pe-
is ´al icas que a˜naden sosa o ´acido cuando el pH
es ´a po debajo o po encima de cie os l´ımi es
ma cados po el in es igado . La egulaci´on del
pH se hace necesa ia po que las le adu as, al c e-
ce , ienden a acidi ica el medio, y una acidez ex-
cesi a pod ´ıa hace que el cul i o deja a de c ece
a´un con eniendo nu ien es en exceso.
Es a acidi icaci´on del medio, po o a pa e,
puede se ap o echada pa a la selecci´on de le a-
du as supe p oduc o as de amino´acidos. El an-
quedealimen aci´on (1) que apo a los nu ien-
es es ´a suplemen ado con dosis al ´ısimas de un
an´alogo ´oxico del amino´acido que in e esa su-
pe p oduci . La llegada de nu ien es desde el
anque de alimen aci´on has a el medio de cul i o
(2) donde se encuen an las le adu as se hace a
a ´es de una bomba pe is ´al ica (3) conec ada
al pH-me o (4), de mane a que no unciona au-
om´a icamen e de o ma con inua sino que se co-
nec a y desconec a selec i amen e, dependiendo
del pH del medio donde es ´an c eciendo las le a-
du as y que es medido po el pH-me o a a ´es de
una sonda (5). La medida del pH-me o a su ez
depende de si las c´elulas es ´anonoc eciendo. La
elocidad de en ada de nu ien es, y po lo an o
del ´oxico, iene egulada po la elocidad de c e-
cimien o de las c´elulas. Si, po ejemplo, se egula
la bomba de mane a que se conec a a pH po de-
bajo de 5 y se desconec a a pH supe io a 5.2, si
las c´elulas es ´an c eciendo acidi ica ´an el medio a
una elocidad p opo cional a la elocidad de c e-
cimien o. Supongamos que hay en ada de medio
de mane a que el pH del cul i o sube po encima
de 5.2: la bomba en onces se desconec a y deja
de en a medio. La en ada de medio con ´oxico
ma a ´aalamayo ´ıa de la poblaci´on, y la acci´on
de c´elulas que sob e i an po supe p oducci´on del
amino´acido isiol´ogico se ´a la que c ece ´a aunque
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3ES 2 073 357 B1 4
a da ´an en baja el pH.
Cuando el pH baje po debajo de 5, la bomba
ol e ´a a conec a se y a a˜nadi medio, aumen-
ando la concen aci´on del ´oxico en el anque
de cul i o donde se encuen an las c´elulas. Es e
inc emen o conduci ´a a un aumen o de la asa
de mue e, excep o en aquellas c´elulas que su-
pe p oduzcan su icien e can idad del amino´acido
isiol´ogico como pa a con a es a el e ec o del
´oxico. Nue os ciclos de c ecimien o y acidi i-
caci´on i ´an aumen ando p og esi amen e la con-
cen aci´on del ´oxico en el anque de cul i o y se-
leccionando aquellas c´elulas que m´as amino´acido
p oduzcan, has a alcanza la m´axima supe p o-
ducci´on posible pa a el amino´acido en cues i´on.
Las en ajas de es e p ocedimien o son las si-
guien es:
1. Pe mi en ob ene supe p oduc o es de un
amino´acido en pa icula , en unci´on del
an´alogo ´oxico que se u ilice.
2. La elocidad de en ada del ´oxico iene
egulada po la p opia elocidad de c eci-
mien o del cul i o, al es a egulada dicha
en ada po la elocidad de acidi icaci´on.
3. Al mismo iempo, la concen aci´on del ´o-
xico pe mi e la selecci´on de s´olo aquella
acci´on de la poblaci´on esis en e po su-
pe p oducci´on del amino´acido isiol´ogico.
4. A lo la go del iempo, el aumen o de la con-
cen aci´on del ´oxico pe mi e el aislamien o
de cepas cada ez m´as supe p oduc o as.
5. Al au o egula se la en ada de medio po la
capacidad de c ece de las c´elulas, el p oceso
pe mi e aisla las cepas capaces de m´axima
supe p oducci´on, c eciendo adem´as a la
m´axima elocidad.
Caso p ´ac ico: ob enci´on de cepas de le adu as
supe p oduc o as de me ionina y eonina
Como caso p ´ac ico de u ilidad del p ocedi-
mien o, que debe en ende se no iene ca ´ac e li-
mi a i o de la in enci´on, se desc ibe la aplicaci´on
del quimios a o con olado po pH y los an´alogos
´oxicos p esen es en el anque de alimen aci´on
pa a el aislamien o de cepas supe p oduc o as de
me ionina y eonina.
Un cul i o con inuo con olado po pH se
u iliz´o pa a selecciona aquellas le adu as que
e an mas ole an es a e ionina, an´alogo ´oxico
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de la me ionina, y a hid oxino alina, an´alogo
´oxico de la eonina. Es as le adu as ole an-
es e an supe p oduc o as de los co espondien es
amino´acidos me ionina y eonina. El anque de
alimen aci´on se llen´oconmediom´ınimo de le a-
du as (SD) y p olina como uen e de ni ´ogeno, y
se suplemen ´o con e ionina has a 10 mM, o con
hid oxino alina has a 5mM. El anque de cul-
i o se inocul´o en ambos casos con 15 ml de un
cul i o en ase es aciona ia (5·108c´elulas/ml) de
una cepa indus ial de le adu a, u ilizable pa a
suplemen o nu icional animal y humano. Al c e-
ce , las c´elulas acidi ica on el medio, p o ocando
la conexi´on de la bomba pe is ´al ica al baja el
pH y dando luga al paso de medio desde el an-
que de alimen aci´on al de cul i o. Cada ez que
es a ope aci´on se epe ia y pasaba medio, aumen-
aba la concen aci´on del ´oxico e ionina o hid o-
xino alina en el anque de cul i o. La eloci-
dad de en ada del medio en´ıa con olada po
la elocidad de acidi icaci´on del cul i o, que a su
ez depend´ıa de la capacidad de esis encia de
las c´elulas al an´alogo ´oxico del medio, es deci ,
de la capacidad de supe p oduci el amino´acido
isiol´ogico. Aquellas c´elulas poco esis en es al
an´alogo ´oxico, no supe p oduc o as e incapaces
de c ece , an quedando eliminadas del medio de
cul i o, mien as que las m´as esis en es y supe -
p oduc o as c ecen m´as ´apidamen e, y an en i-
queciendo el cul i o. A lo la go de odo el p o-
cedimien o, el medio de cul i o a ´ıa desde no
ene an´alogo ´oxico, e ionina o hid oxino alina,
has a ene la concen aci´on m´axima que las ce-
pas m´as esis en es son capaces de ole a , pues o
que mien as haya c´elulas capaces de c ece hab ´a
acidi icaci´on y, po lo an o, en ada de medio con
an´alogo ´oxico. Cuando las c´elulas m´as esis en-
es ya no c ecen y consecuen emen e no acidi ican,
no hay m´as en ada de medio po que la bomba
no se conec a, con lo que se ha conseguido se-
lecciona , de en e una g an poblaci´on de le adu-
as, aquellas c´elulas m´as esis en es a los an´alogos
´oxicos, que c ecen m´as ´apidamen e y supe p o-
ducen amino´acidos.
Po es e p ocedimien o se han seleccionado
dos cepas, una denominada S. C MBI, y o a de-
nominada S.C. MB2, capaces de p oduci 160 e-
ces m´as me ionina y 40 eces m´as eonina, es-
pec i amen e, que la cepa de pa ida. Es as cepas
han sido deposi adas en la Colecci´on Espa˜nola
de Cul i os Tipo, es ando el Depa amen o de
Gen´e ica de la Uni e sidad de Se illa en posesi´on
de los co espondien es ce i icados de iabilidad.
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REIVINDICACIONES
1. P ocedimien o pa a la selecci´on de le a-
du as supe p oduc o as de amino´acidos en cul-
i o con inuo con olado po pH, aplicable pa a
la p oducci´on de biomasa con al o con enido en
amino´acidos como suplemen o nu icional animal
y humano, ca ac e izado po que la en ada de
medio desde el anque de alimen aci´on has a el
anque de cul i o es ´a egulada po una bomba
pe is ´al ica conec ada al pH-me o que mide la
acidez del medio de cul i o. El anque de ali-
men aci´on con iene al as concen aciones de un
an´alogo ´oxico del amino´acido que se desea supe -
p oduci , de o ma que la en ada de medio esco
en el anque de cul i o p o oca el en enenamien o
de la poblaci´on de c´elulas, excep o aqu´ellas que
p oduzcan el amino´acido en cues i´on, que se ´an
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las que c ezcan, lo cual p o oca ´a una acidi i-
caci´on del medio, bajada de pH, pues a en un-
cionamien o de la bomba pe is ´al ica y nue a en-
ada de medio con ´oxico, y as´ı sucesi amen e,
has a que se alcance la concen aci´on m´axima que
las le adu as puedan ole a .
2. P ocedimien o pa a la selecci´on de le adu-
as, seg´un ei indicaci´on 1a
¯, que pe mi e ob e-
ne cepas supe p oduc o as de un amino´acido en
pa icula , en unci´on del an´alogo ´oxico que se
u ilice.
3. P ocedimien o pa a la selecci´on de le a-
du as, seg´un ei indicaciones 1a
¯y2
a
¯,enelque
la elocidad de en ada del ´oxico iene egulada
po la p opia elocidad de c ecimien o del cul i o,
lo cual pe mi e aisla aquellas cepas que, adem´as
de se capaces de la m´axima supe p oducci´on, lo
hacen c eciendo a la m´axima elocidad.
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OFICINA ESPA˜
NOLA
DE PATENTES Y MARCAS
ESPA˜
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11 ES 2 073 357
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21 N.◦solici ud: 9301641
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22 Fecha de p esen aci´on de la solici ud: 21.07.93
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32 Fecha de p io idad:
INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA
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DOCUMENTOS RELEVANTES
Ca ego ´ıa Documen os ci ados Rei indicaciones
a ec adas
AEP-0065895-A (L’AIR LIQUIDE, SOCIETE ANONYME POUR L’ETUDE ET
L’EXPLOITATION DES PROCEDES GEORGES CLAUDE) 01.12.82
AUS-3472765-A (WILLIAM E. BUDD e al.) 14.10.69
Ca ego ´ıa de los documen os ci ados
X:
Y:
A:
de pa icula ele ancia
de pa icula ele ancia combinado con o o/s de la
misma ca ego ´ıa
e leja el es ado de la ´ecnica
O:
P:
E:
e e ido a di ulgaci´on no esc i a
publicado en e la echa de p io idad y la de p esen aci´on
de la solici ud
documen o an e io , pe o publicado despu´es de la echa
de p esen aci´on de la solici ud
El p esen e in o me ha sido ealizado
×pa a odas las ei indicaciones pa a las ei indicaciones n◦:
Fecha de ealizaci´on del in o me Examinado P´agina
23.06.95 M. Yba a Fe n´andez 1/1