Procedimiento para la selección de levaduras superproductoras de aminoácidos

k 19 OFICINA ESPA˜ NOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPA˜ NA k 11 N.◦de publicaci´on: ES 2 073 357 k 21 N´umero de solicitud: 9301641 k 51 Int. Cl.6:C12M 1/36 k 12 PATENTEDEINVENCION B1 k 22 Fecha de presentaci´on: 21.07.93 k 73 Titular/es: Universidad de Sevilla Vicerrectorado de Investigaci´on C/ San Fernando, 4 41004 Sevilla, ES k 43 Fecha de publicaci´on de la solicitud: 01.08.95 Fecha de concesi´on: 29.01.96 k 72 Inventor/es: Mart´ın Force, Enrique y Ben´ıtez Fernandez, Tah´ıa k 45 Fecha de anuncio de la concesi´on: 01.03.96 k 45 Fecha de publicaci´on del folleto de patente: 01.03.96 k 74 Agente: No consta k 54 T´ıtulo: Procedimiento para la selecci´on de levaduras superproductoras de amino´acidos. k 57 Resumen: Procedimiento para la selecci´on de levaduras superproductoras de amino´acidos en cultivo continuo controlado por pH, aplicable en la industria alimentaria para producir biomasa con alto contenido en amino´acidos como suplemento nutricional animal y humano, caracterizado porque la entrada de medio desde el tanque de alimentaci´on (1) hasta el tanque de cultivo (2) est´a regulada por una bomba perist´altica (3) conectada al pH-metro (4) que mide la acidez del medio de cultivo. El tanque de alimentaci´on contiene altas concentraciones de un an´alogo t´oxico del amino´acido que se desea superproducir. La entrada de medio fresco en el tanque de cultivo provoca el envenenamiento de la poblaci´on de levaduras, excepto aqu´ellas que superproduzcan el amino´acido en cuesti´on, que ser´an las que crezcan. Al crecer bajar´an el pH provocando una nueva entrada de medio con mayores concentraciones del t´oxico (y por lo tanto de producci´on de amino´acidos), hasta que se alcance la concentraci´on m´axima que las levaduras puedan tolerar. Aviso: Se puede realizar consulta prevista por el art◦37.3.8 LP. Ventadefasc´ıculos: Oficina Espa˜nola de Patentes y Marcas. C/Panam´a, 1 – 28036 Madrid ES 2 073 357 B1 1ES 2 073 357 B1 2 DESCRIPCION T´ıtulo Procedimiento para la selecci´on de levaduras superproductoras de amino´acidos. Objeto de la invencion La presente invenci´on se refiere a un procedimiento para la selecci´on de levaduras superproductoras de determinados amino´acidos en cultivo cont´ınuo controlado por pH. El procedimiento se puede utilizar para la producci´on de biomasa, a partir de cepas industriales de levaduras, con elevado contenido en determinados amino´acidos, por ejemplo, aqu´ellos en los cuales son deficitarias las dietas de alimentaci´on animal y/o humana, a modo de suplemento nutricional. Estado de la t´ecnica La regulaci´on de la biosintesis de amino´acidos se ha estudiado utilizando an´alogos t´oxicos para la selecci´on de mutantes con alteraciones en la ruta de biosintesis (Arfin y Gantt, 1983). Uno de los usos pr´acticos del empleo de an´alogos t´oxicos es que los mutantes resistentes suelen ser superproductores del an´alogo natural (Alix, 1982). Se han aislado mutantes de levaduras en cultivos discontinuos que son resistentes al an´alogo t´oxico hidroxinorvalina y producen entre 15 y 30 veces m´as treonina que la cepa silvestre (Ramos et al., 1991). La mutaci´on se asoci´oalapresencia de una de las enzimas en la ruta de biosintesis de treonina, la aspartato kinasa, insensible a represi´on por treonina. Cuando el gen que codifica esta enzima se introdujo en una cepa silvestre, por ingenier´ıa gen´etica, los transformantes produc´ıan entre 3 y 4 veces m´as treonina que la cepa silvestre (Mart´ın-Rendon et al. 1993). Sin embargo, debido a numerosos efectos inespec´ıficos producidos por el an´alogo t´oxico, la mayor´ıa de los mutantes y transformantes resistentes al t´oxico aislados crecen peor que la cepa silvestre y expresan muchos efectos negativos: baja viabilidad, sensibilidad a temperatura, etc. (Ramos et al., 1991; Mart´ın-Rendon et al., 1993). La selecci´on de mutantes capaces de resistir las mayores concentraciones de an´alogos t´oxicos, superproduciendo las mayores concentraciones de amino´acidos posibles, acumulando numerosas mutaciones y al mismo tiempo creciendo a velocidades similares e incluso mayores que las del tipo silvestre es extremadamente dif´ıcil. El aislamiento de tales mutantes requiere necesariamente t´ecnicas de selecci´on en cultivo continuo y durante per´ıodos muy largos, para que el organismo acumule aquellas mutaciones que le permitan simult´aneamente superproducir amino´acidos y crecer a la m´axima velocidad. Descripci´on de la invencion El nuevo procedimiento se basa, fundamentalmente, en la utilizaci´on de un quimiostato como turbidostato controlado por pH para la selecci´on de cepas de levaduras superproductoras de amino´acidos, y en general para seleccionar cepas cuya velocidad de formaci´on de producto sea m´axima, siendo los productos funci´on de la velocidad de crecimiento, y siempre que exista un an´alogo t´oxico que permita seleccionar s´olo aquella fracci´on de la poblaci´onquenoseenvenena por superproducci´on del correspondiente 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 compuesto fisiol´ogico. En el quimiostato convencional existe un tanque de alimentaci´on con medio nutritivo que, a trav´es de una bomba perist´altica regulada por el investigador, pasar´a al correspondiente tanque de cultivo. Simult´aneamente y de forma continuada, por gravedad ir´an pasando medio de cultivo y c´elulas a un tercer tanque de desecho. Cuando la entrada de nutrientes es muy lenta o cuando est´apresentealg´un compuesto t´oxico, las c´elulas del cultivo crecen muy lentamente, bien porque agotan r´apidamente los nutrientes, de modo que el crecimiento es muy lento (ya que la velocidad a la que las c´elulas crecen y se dividen est´a limitada por la falta de nutrientes), o bien porque una fracci´on importante de la poblaci´on est´a muriendo debido a la presencia del compuesto t´oxico. Si la velocidad de formaci´on de un producto depende de la tasa de crecimiento, dicho producto, por ejemplo amino´acidos, se formar´a muy lentamente, ya sea porque toda la poblaci´on viva ve frenado su crecimiento por el nutriente limitante,oporquelapresenciadelt´oxico hace que s´olo una fracci´on peque˜na de la poblaci´on, la que resiste al t´oxico por superproducci´on del an´alogo fisiol´ogico, est´e produciendo el compuesto de inter´es. En casos l´ımites esta producci´on puede ser cero. El quimiostato tradicional tiene un pH-metro que regula el pH del medio con dos bombas perist´alticas que a˜naden sosa o ´acido cuando el pH est´a por debajo o por encima de ciertos l´ımites marcados por el investigador. La regulaci´on del pH se hace necesaria porque las levaduras, al crecer, tienden a acidificar el medio, y una acidez excesiva podr´ıa hacer que el cultivo dejara de crecer a´un conteniendo nutrientes en exceso. Esta acidificaci´on del medio, por otra parte, puede ser aprovechada para la selecci´on de levaduras superproductoras de amino´acidos. El tanquedealimentaci´on (1) que aporta los nutrientes est´a suplementado con dosis alt´ısimas de un an´alogo t´oxico del amino´acido que interesa superproducir. La llegada de nutrientes desde el tanque de alimentaci´on hasta el medio de cultivo (2) donde se encuentran las levaduras se hace a trav´es de una bomba perist´altica (3) conectada al pH-metro (4), de manera que no funciona autom´aticamente de forma continua sino que se conecta y desconecta selectivamente, dependiendo del pH del medio donde est´an creciendo las levaduras y que es medido por el pH-metro a trav´es de una sonda (5). La medida del pH-metro a su vez depende de si las c´elulas est´anonocreciendo. La velocidad de entrada de nutrientes, y por lo tanto del t´oxico, viene regulada por la velocidad de crecimiento de las c´elulas. Si, por ejemplo, se regula la bomba de manera que se conecta a pH por debajo de 5 y se desconecta a pH superior a 5.2, si las c´elulas est´an creciendo acidificar´an el medio a una velocidad proporcional a la velocidad de crecimiento. Supongamos que hay entrada de medio de manera que el pH del cultivo sube por encima de 5.2: la bomba entonces se desconecta y deja de entrar medio. La entrada de medio con t´oxico matar´aalamayor´ıa de la poblaci´on, y la fracci´on de c´elulas que sobrevivan por superproducci´on del amino´acido fisiol´ogico ser´a la que crecer´a aunque 2 3ES 2 073 357 B1 4 tardar´an en bajar el pH. Cuando el pH baje por debajo de 5, la bomba volver´a a conectarse y a a˜nadir medio, aumentando la concentraci´on del t´oxico en el tanque de cultivo donde se encuentran las c´elulas. Este incremento conducir´a a un aumento de la tasa de muerte, excepto en aquellas c´elulas que superproduzcan suficiente cantidad del amino´acido fisiol´ogico como para contrarrestar el efecto del t´oxico. Nuevos ciclos de crecimiento y acidificaci´on ir´an aumentando progresivamente la concentraci´on del t´oxico en el tanque de cultivo y seleccionando aquellas c´elulas que m´as amino´acido produzcan, hasta alcanzar la m´axima superproducci´on posible para el amino´acido en cuesti´on. Las ventajas de este procedimiento son las siguientes: 1. Permiten obtener superproductores de un amino´acido en particular, en funci´on del an´alogo t´oxico que se utilice. 2. La velocidad de entrada del t´oxico viene regulada por la propia velocidad de crecimiento del cultivo, al estar regulada dicha entrada por la velocidad de acidificaci´on. 3. Al mismo tiempo, la concentraci´on del t´oxico permite la selecci´on de s´olo aquella fracci´on de la poblaci´on resistente por superproducci´on del amino´acido fisiol´ogico. 4. A lo largo del tiempo, el aumento de la concentraci´on del t´oxico permite el aislamiento de cepas cada vez m´as superproductoras. 5. Al autorregularse la entrada de medio por la capacidad de crecer de las c´elulas, el proceso permite aislar las cepas capaces de m´axima superproducci´on, creciendo adem´as a la m´axima velocidad. Caso pr´actico: obtenci´on de cepas de levaduras superproductoras de metionina y treonina Como caso pr´actico de utilidad del procedimiento, que debe entenderse no tiene car´acter limitativo de la invenci´on, se describe la aplicaci´on del quimiostato controlado por pH y los an´alogos t´oxicos presentes en el tanque de alimentaci´on para el aislamiento de cepas superproductoras de metionina y treonina. Un cultivo continuo controlado por pH se utiliz´o para seleccionar aquellas levaduras que eran mas tolerantes a etionina, an´alogo t´oxico 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 de la metionina, y a hidroxinorvalina, an´alogo t´oxico de la treonina. Estas levaduras tolerantes eran superproductoras de los correspondientes amino´acidos metionina y treonina. El tanque de alimentaci´on se llen´oconmediom´ınimo de levaduras (SD) y prolina como fuente de nitr´ogeno, y se suplement´o con etionina hasta 10 mM, o con hidroxinorvalina hasta 5mM. El tanque de cultivo se inocul´o en ambos casos con 15 ml de un cultivo en fase estacionaria (5·108c´elulas/ml) de una cepa industrial de levadura, utilizable para suplemento nutricional animal y humano. Al crecer, las c´elulas acidificaron el medio, provocando la conexi´on de la bomba perist´altica al bajar el pH y dando lugar al paso de medio desde el tanque de alimentaci´on al de cultivo. Cada vez que esta operaci´on se repetia y pasaba medio, aumentaba la concentraci´on del t´oxico etionina o hidroxinorvalina en el tanque de cultivo. La velocidad de entrada del medio ven´ıa controlada por la velocidad de acidificaci´on del cultivo, que a su vez depend´ıa de la capacidad de resistencia de las c´elulas al an´alogo t´oxico del medio, es decir, de la capacidad de superproducir el amino´acido fisiol´ogico. Aquellas c´elulas poco resistentes al an´alogo t´oxico, no superproductoras e incapaces de crecer, van quedando eliminadas del medio de cultivo, mientras que las m´as resistentes y superproductoras crecen m´as r´apidamente, y van enriqueciendo el cultivo. A lo largo de todo el procedimiento, el medio de cultivo var´ıa desde no tener an´alogo t´oxico, etionina o hidroxinorvalina, hasta tener la concentraci´on m´axima que las cepas m´as resistentes son capaces de tolerar, puesto que mientras haya c´elulas capaces de crecer habr´a acidificaci´on y, por lo tanto, entrada de medio con an´alogo t´oxico. Cuando las c´elulas m´as resistentes ya no crecen y consecuentemente no acidifican, no hay m´as entrada de medio porque la bomba no se conecta, con lo que se ha conseguido seleccionar, de entre una gran poblaci´on de levaduras, aquellas c´elulas m´as resistentes a los an´alogos t´oxicos, que crecen m´as r´apidamente y superproducen amino´acidos. Por este procedimiento se han seleccionado dos cepas, una denominada S. C MBI, y otra denominada S.C. MB2, capaces de producir 160 veces m´as metionina y 40 veces m´as treonina, respectivamente, que la cepa de partida. Estas cepas han sido depositadas en la Colecci´on Espa˜nola de Cultivos Tipo, estando el Departamento de Gen´etica de la Universidad de Sevilla en posesi´on de los correspondientes certificados de viabilidad. 3 5ES 2 073 357 B1 6 REIVINDICACIONES 1. Procedimiento para la selecci´on de levaduras superproductoras de amino´acidos en cultivo continuo controlado por pH, aplicable para la producci´on de biomasa con alto contenido en amino´acidos como suplemento nutricional animal y humano, caracterizado porque la entrada de medio desde el tanque de alimentaci´on hasta el tanque de cultivo est´a regulada por una bomba perist´altica conectada al pH-metro que mide la acidez del medio de cultivo. El tanque de alimentaci´on contiene altas concentraciones de un an´alogo t´oxico del amino´acido que se desea superproducir, de forma que la entrada de medio fresco en el tanque de cultivo provoca el envenenamiento de la poblaci´on de c´elulas, excepto aqu´ellas que produzcan el amino´acido en cuesti´on, que ser´an 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 las que crezcan, lo cual provocar´a una acidificaci´on del medio, bajada de pH, puesta en funcionamiento de la bomba perist´altica y nueva entrada de medio con t´oxico, y as´ı sucesivamente, hasta que se alcance la concentraci´on m´axima que las levaduras puedan tolerar. 2. Procedimiento para la selecci´on de levaduras, seg´un reivindicaci´on 1a ¯, que permite obtener cepas superproductoras de un amino´acido en particular, en funci´on del an´alogo t´oxico que se utilice. 3. Procedimiento para la selecci´on de levaduras, seg´un reivindicaciones 1a ¯y2 a ¯,enelque la velocidad de entrada del t´oxico viene regulada por la propia velocidad de crecimiento del cultivo, lo cual permite aislar aquellas cepas que, adem´as de ser capaces de la m´axima superproducci´on, lo hacen creciendo a la m´axima velocidad. 4 ES 2 073 357 B1 5 OFICINA ESPA˜ NOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPA˜ NA k 11 ES 2 073 357 k 21 N.◦solicitud: 9301641 k 22 Fecha de presentaci´on de la solicitud: 21.07.93 k 32 Fecha de prioridad: INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA k 51 Int. Cl.6:C12M 1/36 DOCUMENTOS RELEVANTES Categor´ıa Documentos citados Reivindicaciones afectadas AEP-0065895-A (L’AIR LIQUIDE, SOCIETE ANONYME POUR L’ETUDE ET L’EXPLOITATION DES PROCEDES GEORGES CLAUDE) 01.12.82 AUS-3472765-A (WILLIAM E. BUDD et al.) 14.10.69 Categor´ıa de los documentos citados X: Y: A: de particular relevancia de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categor´ıa refleja el estado de la t´ecnica O: P: E: referido a divulgaci´on no escrita publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci´on de la solicitud documento anterior, pero publicado despu´es de la fecha de presentaci´on de la solicitud El presente informe ha sido realizado ×para todas las reivindicaciones para las reivindicaciones n◦: Fecha de realizaci´on del informe Examinador P´agina 23.06.95 M. Ybarra Fern´andez 1/1