ÁREA DE MEDICINA
FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA
APROXIMACIÓN A LA METÁSTASIS A TRAVÉS
DE LA CÉLULA TUMORAL CIRCULANTE: DESDE EL
NICHO PREMETASTÁSICO A LA MONITORIZACIÓN
CLÍNICA
Memo ia que p esen a
Ja ie Ma iscal Á ila
pa a op a al g ado de Doc o
Fdo. Ja ie Ma iscal Á ila
San iago de Compos ela, 2016
La p esen e esis doc o al ha sido inanciada pa cialmen e po el P og ama de
Ayudas P edoc o ales de la Escuela de Doc o ado In e nacional de la Uni e sidad
de San iago de Compos ela.
El D . Miguel Abal Posada, in es igado es abilizado del Sis ema Nacional
de Salud, y el D . Ra ael López López, Je e del Se icio de Oncología del Hospi-
al Clínico Uni e si a io de San iago de Compos ela.
CERTIFICAN:
Que la p esen e esis doc o al p esen ada po Ja ie Ma iscal Á ila, que lle a
po í ulo: “Ap oximación a la me ás asis a a és de la Célula Tumo al
Ci culan e: desde el nicho p eme as ásico a la moni o ización clínica”,
ha sido ealizada bajo su di ección en el Labo a o io de Oncología Médica
T aslacional en el Hospi al Clínico Uni e si a io de San iago de Compos ela,
es imando que se encuen a concluida y en condiciones de se p esen ada pa a
op a al g ado de Doc o .
Re isada la misma, au o izamos su p esen ación pa a se juzgada como
esis doc o al po el co espondien e ibunal, y pa a que cons e i mamos la
p esen e en San iago de Compos ela a 19 de Sep iemb e de 2016.
Fdo. Miguel Abal Fdo. Ra ael López
RESUMEN
Ap oximación a la me ás asis a a és de la célula umo al
ci culan e: desde el nicho p eme as ásico a la moni o ización clínica
El cánce es una de las en e medades más de as ado as en la sociedad
mode na. Mien as que en sus es adios iniciales el cánce se p esen a como
una en e medad con al e na i as clínicas, la de ección de masas umo ales
diseminadas de e mina un cambio en el escena io clínico que obliga a un abo -
daje con escasas al e na i as e apéu icas. Biológicamen e, la diseminación
me as ásica se de ine como la secuencia de e en os median e el cual la célula
umo al con inada se inco po a al o en e sanguíneo y sob e i e en ci culación
has a que es e en ualmen e e enida en un ó gano dis an e. Una ez e eni-
da, se inco po a á al pa énquima del ejido huésped y comenza á a p oli e a
dando luga así a nue as masas umo ales. Es e p oceso dispe si o cons i uye
en su conjun o un e en o complejo en el que la me ás asis no es me amen e
un p oceso celula in asi o, sino que a acompañado de una g an plas icidad
in luenciada po el ambien e umo al. Es e ambien e con o ma a su ez una
ac i a ed de comunicación que a o ece en úl ima ins ancia la p og esión de
las lesiones me as ásicas.
El abajo aquí desa ollado iene como obje i o p o undiza en el conoci-
mien o del modo en el que se desa olla la diseminación me as ásica a pa i de
dos de sus pa icipan es. La Célula Tumo al Ci culan e como unidad biológica
esponsable de la o mación de nue as masas umo ales; y el exosoma umo-
al como esícula de comunicación en e la célula, su en o no y pa ícipe del
acondicionamien o del nicho p e-me as ásico.
La de ección y elabo ación de un pe il de exp esión especí ico de CTCs de
cánce de pulmón de célula no-pequeña (NSCLC) nos ha pe mi ido iden i ica
un pe il ansc ipcional o ien ado a la supe i encia, p oli e ación y mo ilidad
celula a la ez que iden i ica NOTCH1 como pa ícipe de las ca ac e ís icas de
es a subpoblación celula . En es a di ección, NOTCH1 ha sido asociado con an-
e io idad a p og esión umo al en NSCLC inculado a un en o no de ansición
Epi elio-Mesénquima (EMT). Asimismo, los da os ob enidos p opo cionan una
se ie de bioma cado es de i ados de CTCs con alo clínico pa a Supe i-
encia lib e de p og esión y Supe i encia global. En es e sen ido, la u a
de No ch ep esen a una diana e apéu ica de g an in e és y cuya inhibición
es á siendo e aluada en dis in os ensayos clínicos.
Conside ando la in luencia del p oceso de EMT en la plas icidad de la
célula umo al, hemos desa ollado un análisis p o eico po SILAC del p o-
eoma, sec e oma soluble y exosoma de la línea de cánce de endome io
HEC-1A den o de un ma co de EMT. Es e modelo nos ha pe mi ido es able-
ce di e encias en la acción sec e ada -sec e oma soluble y exosoma- de-
i adas de un cambio en el p og ama ansc ipcional de la célula umo al y
de e mina su in luencia en el anidamien o de la célula umo al. Es os análi-
sis iden i ican un p o eoma y sec e oma o ien ado a la supe i encia celula
como consecuencia del p oceso de EMT de e minado po la sob eexp esión
de ETV5. Asimismo, iden i icamos la p esencia de dis in os componen es de
ma iz ex acelula den o del ca go exosomal de HEC-1A, lo que, a la is a
de nues os esul ados, a o ece el anidamien o de la célula umo al en ci -
culación al ejido endo elial.
Los esul ados ob enidos pa icipan de la hipó esis de Seed & Soil p o-
pues a po S. Paye en 1889 a la ez que en an en consonancia con in-
es igaciones más ecien es que des acan el papel de los exosomas en el
acondicionamien o del nicho p e-me as ásico. De acue do a es e modelo, el
anidamien o de la CTC, con ca ac e ís icas pseudo-mesenquimales, se se -
i ía del p e-acondicionamien o del ejido endo elial de i ado del exosoma
p oceden e del umo p ima io, el cual es á compues o mayo i a iamen e
po células umo ales de ca ac e ís icas epi eliales.
TABLA DE CONTENIDOS
INTRODUCCIÓN
Capí ulo 1. La me ás asis
1.1. Epidemiología de la me ás asis: cánce de
pulmón y cánce de endome io...............................21
1.2. La colonización me as ásica..............................25
1.2.1. La Célula Tumo al Ci culan e
1.2.2. In a asación de la CTC
1.2.3. Ci culación hema ógena
1.2.4. Ex a asación de la CTC
1.2.4.1. A es o
1.2.4.2. T anslocación endo elial
1.2.5. Fo mación de mic o-me ás asis
1.2.6. EMT asociada a la Célula Tumo al Ci culan e
1.2.6.1. ETV5 como p omo o de EMT
1.3. El nicho p e-me as ásico...................................33
1.3.1. La hipó esis de “Seed & soil”
1.4. El exosoma y la diseminación me as ásica........35
1.4.1. El exosoma y el nicho p e-me as ásico
1.4.2. El exosoma y la Célula Tumo al Diseminada
11.8.4. Te apia di igida
11.8.4.1. Te apia di igida con a ALK
11.8.4.2. Te apia di igida con a EGFR
11.8.4.3. Te apia di igida con a ROS1
11.8.4.4. O as e apias di igidas en desa ollo
11.8.5. Inmuno e apia
11.9. Fac o es p onós ico y p edic i os en CP.....170
11.9.1. Fac o es clínico-pa ológicos
11.9.2. Bioma cado es
Capí ulo 12. El ca cinoma de endome io
12.1.Elú e o: es uc u a y unción....................173
12.2. Fac o es de iesgo del CE.......................... 174
12.3. P e ención y sc eening del CE...................175
12.4. Sin oma ología del CE................................176
12.5. Diagnós ico del CE.....................................176
12.6.Clasi icación del CE....................................176
12.6.1.Clasi icación his opa ológica
12.6.1.1. Lesiones p e-in asi as
12.6.1.2. Adenoca cinoma endome ioide
12.6.1.3. Adenoca cinoma no-endome ioide
12.6.2.Clasi icaciónclínico-pa ológica
12.6.3.Clasi icaciónsegúnelg adodein asión umo al:
Es adi icaciónF.I.G.O.
12.7. Pa ología molecula del CE.........................181
12.7.1. Cánce de endome io de ipo I
12.7.2. Cánce de endome io de ipo II
12.8. T a amien o del CE....................................184
12.8.1. Te apia adyu an e
12.8.1.1. Radio e apia
12.8.1.2. Quimio e apia
12.8.1.3. Te apia ho monal
12.8.1.4. Te apias di igidas
12.9. Fac o es p onós ico y p edic i os en CE.....186
12.9.1. Fac o es clínico-pa ológicos
12.9.2. Bioma cado es
REFERENCIAS..................................................191
LISTA DE FIGURAS..........................................213
LISTA DE TABLAS.............................................216
LISTA DE ABREVIATURAS............................221
AGRADECIMIENTOS.......................................227
INTRODUCCIÓN
21
Capí ulo 1. La me ás asis
1.1. Epidemiología de la me ás asis:
cánce de pulmón y cánce de
endome io
El cánce es un p oblema de salud pública global y una de las en e me-
dades que mayo impac o ienen a ni el clínico y social. El p oceso oncológico
a anzado cons i uye además una en e medad sis émica cuya in luencia se ex-
iende más allá del umo p ima io, siendo la diseminación umo al y la apa i-
ción de me ás asis la causa p incipal de mue e en oncología1. Ac ualmen e se
han iden i icado más de cien ipos umo ales dis in os cen ándose es e abajo
en el cánce de pulmón y cánce de endome io como modelos de abajo.
El cánce de pulmón (CP) se ca ac e iza po una incidencia especialmen e
signi ica i a siendo el cánce con mayo núme o de mue es asociadas1. Ade-
más, el CP p esen a un abo daje clínico complejo en el que la de ección de
la en e medad es a día y más del 60% de los diagnós icos p esen an en e -
medad diseminada; lo cual las a se e amen e la supe i encia del pacien e
(Figu a 1)1. Po su pa e, el cánce de ú e o ep esen a el cua o cánce más
ecuen e en muje es y el p ime o de o igen ginecológico1. El 75% de los diag-
nós icos ocu en en muje es pos -menopáusicas siendo más del 80% diag-
nos icadas cuando la en e medad es á aún localizada. Es o hace del cánce de
ú e o un cánce de buen p onós ico con una supe i encia a 5 años del 76%,
pe o en el que aquella acción de pacien es con núcleos me as ásicos dis an es
al diagnós ico la supe i encia a 5 años alcanza únicamen e el 15% (Figu a 1).
In oducción
22
Es a dispa idad en el p onós ico clínico es á sus en ada po un cambio en
el escena io en el que se desa olla la en e medad. Mien as es adios iniciales
pe mi en al e na i as ela i amen e e icaces den o de un ma co local, es a-
dios a anzados obligan a un abo daje global ca ac e izado a menudo po su
baja e iciencia e inespeci icidad.
En cánce de pulmón de células no-pequeñas (NSCLC; Non-Small Cell
Lung Cance ) -el cual ep esen a el 85% de los casos o ales-, es adios I, II y
III son a menudo a ados qui ú gicamen e pudiendo inclui adio e apia y/o
quimio e apia en adyu ancia o neoadyu ancia2. En cambio, es adios más a an-
zados a menudo p esen a án núcleos diseminados que imposibili an un abo -
daje qui ú gico. En es os casos es ecuen e el uso de dis in os egímenes de
quimio e apia que end án de e minados po la ex ensión umo al y el es ado
del pacien e2.
E en ualmen e, es posible ambién un abo daje local en el caso de umo-
es con inados a los pulmones o que se han p opagado pun ualmen e. Tumo es
de es as ca ac e ís icas en ocasiones e ie en me ás asis ce eb ales únicas que
pueden se a adas con ci ugía y/o adio e apia (gene almen e adioci ugía
es e eo ác ica seguida de WBRT; Whole B ain Radio he apy) al ma gen del
a amien o de las lesiones pulmona es3. En el caso de p opagación pun ual a
o os ó ganos -como glándulas ad enales, hueso o hígado- es posible ambién
el uso de adio e apia local en sus dis in as a ian es2.
Figu a 1. Tasa de supe i encia a 5 años en cánce de pulmón y cánce de ú e o en
unción del g ado de diseminación umo al (EEUU 2005-2011). Adap ado de Siegel e
al1.
Diseminación umo al y me ás asis
23
En cánce es de pulmón ampliamen e p opagados se p ocede á sin emba -
go a una e aluación his ológica de las lesiones y la búsqueda de ma cado es
gené icos que o ien en la decisión clínica. La de ección de al e aciones gené i-
cas en EGFR, ALK o ROS1 pe mi en ac ualmen e el uso de es a egias di igidas.
En el caso de cánce es sin ca ac e ís icas molecula es que pe mi an el uso de
e apias di igidas la quimio e apia aba ca á las p incipales opciones de a a-
mien o. Es os egímenes suelen inclui la combinación de dos compues os qui-
mio e ápicos -a menudo incluyendo de i ados del pla ino y/o axoles- aunque
es posible la adminis ación de un solo compues o o incluso adio e apia en si-
uaciones en las que el es ado ísico del pacien e lo ecomiende. La p og esión
de la en e medad, du an e o después del a amien o, implica á gene almen e
la u ilización de una nue a combinación de quimio e ápicos en segunda o e -
ce a línea. Ocasionalmen e, es posible ambién la adminis ación de la e apia
en ausencia de p og esión clínica como medida de con ol de la en e medad en
la denominada e apia de man enimien o2.
En cánce de endome io (CE), al con a io que ocu e en cánce de
pulmón, la mayo ía de los casos son diagnós icados en es adios emp anos po
lo que la opción qui ú gica ecoge la mayo ía de los a amien os con una i-
nalidad cu a i a. El a amien o de la en e medad me as ásica o ecu en e -la
asa de ecu encia es del 15% alcanzando has a el 50% en pacien es con es-
adios a anzados o his ologías ag esi as- incluye p incipalmen e ecu encias
pél icas aisladas o con un sólo núcleo me as ásico4; y en el que el a amien o
suele inclui un abo daje local median e ci ugía o adio e apia alcanzándose
una supe i encia a 5 años que oscila en e el 20-40%4. En es e sen ido, la
adio e apia en pacien es de iesgo ha demos ado bene icio clínico ealizán-
dose p e e en emen e median e la exposición di ec a de las células umo ales
a a és de la agina (b aqui e apia aginal) en e a la e apia de adiación
ex e na.
En el caso de diseminación pe i oneal el manejo de la en e medad se
o ien a á ambién hacia una ci ugía ci o educ o a o e apia local ese ándose
el a amien o con quimio e ápicos en pacien es no ope ables5. Ac ualmen e la
combinación de ca bopla ino-pacli axel ep esen a la ap oximación quimio e á-
pica más ecuen e en es e g upo de pacien es4. Asimismo, el a amien o con
In oducción
24
amoxi eno y de i ados de la p oges e ona ha demos ado una espues a de
en o no al 30% en es adios a anzados a ojando a su ez asas de espues a
a iables (10-50%) en pacien es ecu en es o me as ásicos4.
His ológicamen e, podemos iden i ica ambién de e minadas ca ac e ís-
icas inculadas a la en e medad diseminada en cánce de pulmón y cánce
de endome io. En un es udio ealizado po Riihimaki e al. en más de 6.000
cánce es de pulmón a anzado se iden i icó una p opo ción desigual de pacien-
es me as ásicos en unción de la his ología6. Más del 60% de los casos de
adenoca cinomas y cánce de pulmón de células pequeñas (SCLC; Small Cell
Lung Cance ) p esen a on me ás asis mien as que el ca cinoma de células es-
camosas (SCC, Squamous Cell Ca cinoma) de ec ó me ás asis únicamen e en
el 41% de los pacien es. SCLC p esen ó además p e e encia a la diseminación
en hígado y ce eb o en e a los adenoca cinomas que me as a iza on ambién
con ecuencia en hueso y pulmón6. Po o o lado, el cánce de endome io de
ipo II -o no endome ioide- ep esen a menos del 10-15% del o al de casos
diagnos icados, pe o que sin emba go, ep esen a el 40% de las mue es en
cánce de endome io. Es os umo es p esen an un al o g ado his ológico con
p opensión a la diseminación po lo que cons i ui án los es adios más a anza-
dos y con peo p onós ico, siendo a su ez nódulos lin á icos, agina, pe i oneo
y pulmón los ejidos de diseminación más ecuen es4.
En es e escena io, el es adio de la en e medad y la p esencia, núme o y
localización de los ocos me as ásicos ep esen an a iables clínicas inculadas
al desa ollo umo al con g an pode p onós ico en CP7. Asimismo, el g ado de
in asión y el ipo his ológico p esen an un po en e alo p onós ico en CE8.
Todas es as obse aciones ponen de elie e la in luencia de la en e medad
me as ásica en el p ceso umo al a la ez que señalan la necesidad de un abo -
daje o ien ado hacia la misma. En es e sen ido, una b e e e isión de la si ua-
ción y manejo clínico del cánce de pulmón -cen ado en NSCLC- y del cánce
de endome io puede se consul ada en el anexo incluido al inal del documen o
(Anexo, página 153).
Diseminación umo al y me ás asis
25
1.2. La colonización me as ásica
El p oceso de me ás asis se compone de una sucesión compleja de dis in-
as e apas: 1) in asión local e in a asación en asos sanguíneos y lin á icos.
2) ánsi o en ci culación y e asión del sis ema inmune 3) ex a asación en el
pa énquima de ó ganos dis an es. 4) colonización y o mación de mic o-me-
ás asis pa a inalmen e su (5) p og esión a mac o-me ás asis. Es as e apas
ienen de e minadas no sólo po las p opiedades de la célula umo al sino
ambién po el mic oambien e local que p opo ciona las condiciones necesa-
ias pa a la supe i encia y p oli e ación umo al -el nicho me as ásico-. Es e
mic oambien e pi o a a su ez sob e una in ensa comunicación en e las cé-
lulas umo ales y el ejido huésped llegándose a es ablece an es incluso de la
llegada de la p opia célula umo al diseminada –el denominado nicho p e-me-
as ásico-9. A día de hoy, aunque la exis encia biológica del nicho p e-me as á-
sico es á ampliamen e acep ada, queda po elucida su in luencia a la ho a de
de e mina la p og esión me as ásica10,11.
1.2.1. La Célula Tumo al Ci culan e
La Célula Tumo al Ci culan e (CTC) se de ine como aquella célula umo al
desp endida del umo p ima io o me as ásico e inco po ada a la ci culación
ía sanguínea o lin á ica. Es as células cons i uyen una subpoblación umo al
con unas ca ac e ís icas molecula es que pe mi en su supe i encia den o
del ambien e hos il que cons i uye el o en e ci cula o io; siendo algunas de
las cuales capaces de abandona la ci culación y p oli e a en localizaciones
dis an es. Biológicamen e, la CTC cons i uye un p onunciado cuello de bo ella
en el p oceso de diseminación umo al y en el que las CTCs ep esen an un
po cen aje muy bajo espec o al o al de células umo ales, debiendo además
supe a una se ie de e apas ca ac e izadas po su baja e iciencia12.
Dado los obje i os de es e abajo ha emos una pequeña e isión o ien-
ada a la diseminación hema ógena exis iendo a su ez excelen es abajos
o ien ados a la diseminación ía lin á ica13. Las dis in as e apas que con o man
la cascada de diseminación me as ásica y la pa icipación de la CTC den o de
la misma se de allan a con inuación (Figu a 2):
In oducción
32
des acada de ETV4 y ETV5 en el desa ollo mama io y enal; algo que des a-
can ambién los modelos animales knock-ou 43. Dichos modelos han epo ado
ambién una impo an e unción del eje ETV4 / ETV5 en el desa ollo de los
ó ganos geni ales44. ETV1 pa ece, sin emba go, pa icipa undamen almen e
en desa ollo del sis ema mo o 42.
En es e escena io, se ha obse ado cómo la sob eexp esión de ETV5 co e-
laciona con la sob eexp esión de la oncop o eína E bB2 en cánce de mama42.
Además, son dis in os los es udios que han inculado la sob eexp esión de
ETV5 con un p onós ico des a o able45,46, llegándose incluso a es ablece una
co elación en e el g ado de in asión miome ial y los ni eles de ETV547. A aíz
de es as obse aciones, la sob eexp esión de ETV5 ha demos ado p omo e
un p oceso de EMT mediado po la ac i ación de miemb os de la amilia de
ac o es de ansc ipción ZEB y la ep esión de E-cadhe ina; a o eciendo así
la emodelación de con ac os célula-célula y célula-sus a o y o o gando un
eno ipo mig a o io e in asi o (Figu a 4)48. Cohe en emen e, modelos in i o
han demos ado una mayo capacidad de diseminación e in asión en dis in as
líneas celula es de cánce de endome io po ado as de la sob eexp esión de
ETV549.
En es e abajo, la sob eexp esión de ETV5 en células inmo alizadas de
ca cinoma endome ial (HEC-1A; Human Endome ial Cance 1A) nos se i á
como modelo de abajo pa a la de e minación de la in luencia del con enido
exosomal en el anidamien o me as ásico den o en un ma co de EMT.
Figu a 4. La sob eexp esión de ETV5 en HEC-1A desencadena un p oceso de EMT.
Células epi eliales man ienen la pola idad celula y con ac os célula-célula. La sob eexp esión
de ETV5 a o ece un eno ipo celula mó il y al amen e in asi o. Adap ado de Colás e al48.
Diseminación umo al y me ás asis
33
1.3. El nicho p e-me as ásico
1.3.1. La hipó esis de ”Seed & soil”
La diseminación me as ásica no ocu e de mane a aza osa sino que exis-
en una se ie de ac o es que pa icipan en su des ino. Es a obse ación ue
inicialmen e es ablecida po el ci ujano inglés S ephen Page en 188950, el cual,
en un es udio sob e 735 au opsias de cánce de mama, obse ó la exis encia
de nichos de anidamien o p obables. A aíz de es a obse ación o muló la
eo ía del nicho p e-me as ásico -o de “Seed & soil”- que con o ma aún en día
la base del en endimien o del p oceso de diseminación umo al. Es a eo ía
pos ula que la semilla -la Célula Tumo al Ci culan e- coloniza á de mane a se-
lec i a el “suelo o soil” de ó ganos dis an es en los cuales exis e un ambien e
a o able pa a su supe i encia. La adquisición de es e ambien e a o able
es lo que adicionalmen e se ha denominado el condicionamien o del nicho
p e-me as ásico como an esala del nicho me as ásico madu o.
Es e nicho iene de e minado po una se ie de ca ac e ís icas, algunas
di ec amen e inculadas a la biología umo al y o as in luidas po la misma
median e la p omoción de espues as abe an es en el ejido huésped (Figu a
5)51-53. Es a espues a en é minos gene ales puede se englobada en unción
de sus ca ac e ís icas (Tabla 1). Todos es os p ocesos con o man un ambien e
complejo en el que múl iples ipos celula es es ablecen elaciones an o homo-
como he e o ípicas y en el que células gené icamen e no males pa icipan ac-
i amen e de la p og esión umo al. En es e con ex o, el desa ollo del cánce ,
y de la me ás asis en pa icula , depende en g an pa e de la habilidad de las
células malignas de sub e i y explo a los p ocesos isiológicos del hués-
ped. Consecuen emen e, la comunicación umo -huésped se e ela como un
de e minan e c ucial a la ho a de de e mina el de eni del p oceso umo al.
Asimismo, den o de es a comunicación umo al, las esículas ex acelula es y
los exosomas han ido p og esi amen e adqui iendo mayo ele ancia a la ho a
de de e mina la o mación del nicho p e-me ás asico58.
In oducción
34
Figu a 5. El mic oambien e umo al pa icipa en la diseminación y colonización umo al.
Mac ó agos asociados a umo (TAMs), plaque as y Células Mad es Mesenquimales (MSC)
pa icipan en la inducción de EMT en el umo p ima io. Fib oblas os p o- umo ales (CAFs),
TAMs y p ogeni o es mieloides pa icipan en la inmunosup esión umo al. TAMs a o ecen
la ex a asación umo al mien as que las plaque as pa icipan en la p o ección, e asión del
sis ema inmune y ex a asación de la célula umo al en ci culación. Simul áneamen e, la
comunicación ía exosomas pa icipa en la e asión inmune y p og esión de la célula umo al.
HPC: Célula Hema opoyé ica P ogeni o a; MDSC: Célula Sup eso a Mieloide. Adap ado
de Quail & Joyce51.
Ca ac e ís icas
P ecu so es
Remodelación de la MEC
Deg adación de la MEC
Rees uc u ación de la MEC
- Exp esión de p o easas y MMPs
- De egulación de inhibido es de p o easas
- P oducción / ac i ación de p ecu so es de p o easas
- Sob eexp esión de ib onec ina
- Sob eexp esión de in eg inas
- C osslinking de la ma iz de colágeno
Homeos asis p o- umo al
- In lamación c ónica
- Respues a ib ó ica
Exp esión de señales ó gano-
especí icas
- Quimio- opismo
- Reconocimien o celula
Descenso del seguimien o inmune
- Modulación del econocimien o umo al
- Dis unción de las células T
- Pola ización de mac ó agos
- Inhibición ci o oxicidad NK
Reclu amien o de p ecu so es celula es
Fib oblas os asociados al umo
Células de i adas de médula ósea
Células ascula es
Mac ó agos asociados a umo
- Neo- ascula ización
- Aumen o de la pe meabilidad ascula
- Acondicionamien o del nicho
- P oducción de quimio-g adien es
- Reo ganización del ci oesquele o
Adap ado de 52, 54–57
Tabla 1. Ca ac e ís icas del mic oambien e umo al
Diseminación umo al y me ás asis
35
1.4. El exosoma y la diseminación
me as ásica
La p ime a e e encia a los exosomas apa ece desc i a po T ams y cola-
bo ado es en 1981 como una se ie de mic o- esículas con ac i idad enzimá ica
ex oliadas de líneas de cul i o neoplásicas; siendo es udios pos e io es los que
de ini ían algunas de las ca ac e ís icas p incipales de es a población59-60.
Los exosomas se de inen como una población de esículas lipídicas de
o igen endosomal con un amaño comp endido en e los 50 y 120 nm. Es as
esículas se o iginan en los denominados cue pos mul i esicula es (MVBs),
los cuales, llegado el momen o, se usiona án con la memb ana plasmá ica
libe ando los exosomas al medio ex acelula (Figu a 6)61. A endiendo a su
dis ibución encon amos que los exosomas es án p esen es en la inmensa
mayo ía de los luidos biológicos no implicando necesa iamen e una unción
pa ológica (Figu a 6). Es impo an e econoce ambién que los exosomas o -
man pa e de las denominadas esículas ex acelula es (EVs), pe o no son
pa e exclusi a, sino que incluyen ambién esículas de o a na u aleza como
cue pos apop ó icos o mic o esículas con o o o igen y unción biológica62. Es-
as esículas ex acelula es han sido conside adas du an e muchos años como
con enedo es de p o eínas obsole as y moléculas de desecho; y no es has a la
úl ima década con la de ección de mRNAs y miRNAs den o del ca go exosomal
cuando el exosoma ha a aído la a ención sob e su in luencia en la comunica-
ción umo al63.
La biogénesis de los exosomas es á egulada p incipalmen e po el comple-
jo ESCRT (Endosomal So ing Complexes Requi ed o T anspo ) compues o
po 4 módulos que uncionan coope a i amen e en la madu ación de los cue -
pos mul i esicula es y la o mación de las in aginaciones in aluminales que
da án luga a los exosomas64. Adicionalmen e, es udios ealizados po Thé y
y colabo ado es han demos ado la pa icipación de la amilia de p o eínas
Rab como egulado es cla es del á ico exosomal; habiendo asociado incluso
Rab27 a la p og esión umo al65,66.
In oducción
36
Den o del ca go exosomal se encuen an con ecuencia p o eínas in-
culadas a la amilia de las e aspaninas (CD9, CD63 y CD81 en e o as), el
á ico esicula (miemb os de la amilia Rab) y el complejo ESCRT. Las e-
aspaninas (TM4SF; T asmemb ane 4 supe amily) con o man una amilia de
p o eínas con 4 dominios ansmemb ana y un dominio ex acelula al amen e
conse ado pa icipando como mediado es del econocimien o celula , la se-
lección del ca go exosomal y la libe ación/in e nalización de esículas. Se ha
obse ado además cómo miemb os de es a amilia pa icipan en la adhesión de
la célula umo al a la MEC pa icipando en la ac i ación de ías p o- umo ales67.
En é minos de es abilidad, los exosomas p opo cionan una cubie a p o-
ec o a a las moléculas incluidas en su ca go que p e iene su deg adación y
pe mi en, además de una comunicación loco- egional, una comunicación de
mayo ango y con capacidad de gene a un impac o sis émico. Una ez al-
canzan la célula ecep o a, los exosomas pueden se in e nalizados median e
endoci osis, agoci osis, pinoci osis o simple usión de memb anas68.
Figu a 6. O igen de las esículas ex acelula es y su dis ibución. El á ico in a-celula
en e los dis in os compa imen os celula es ( esículas de ca ga) o hacia la memb ana
plasmá ica ( esículas de sec eción) se ca ac e iza po un con enido esicula in aluminal.
Las esículas sec e adas se ca ac e izan po un con enido ci oplasmá ico. Podemos dis ingui
aquellas esículas que ienen su o igen en la memb ana plasmá ica (mic o esículas), o igen
i al o agmen os de memb ana. Al e na i amen e, exis en esículas que ienen su o igen
en compa imen os in a-celula es pa a se libe adas al medio ex acelula median e su
usión con la memb ana plasmá ica. Es as esículas pasa án a denomina se exosomas una
ez libe adas. Finalmen e, algunos i us son capaces ambién de ale se de la maquina ia
exosomal pa a su sec eción. Adap ado de Thé y e al61 y Yáñez-Mó e al63.
Diseminación umo al y me ás asis
37
Al ma gen de los componen es es uc u ales, los exosomas son po ado es
de p o eínas, lípidos y ácidos nucleicos de dis in a na u aleza cons i uyendo un
complejo dinámico que e leja el ipo y es ado de la célula del que p ocede.
En es e sen ido, se ha iden i icado, po ejemplo, el an ígeno asociado a umo
Ma -1 en exosomas p oceden es de melanoma69, la p esencia de HER2 en
células de cánce de mama po ado as de la sob eexp esión es a p o eína70, o
la sec eción de TNFα ía exosomas en ca diomioci os en hipoxia71. Todas es as
obse aciones con o man un escena io en el que el exosoma ep esen a un
pe il especí ico y dinámico que pa icipa ac i amen e en la p og esión umo al
a la ez que cons i uye una opo unidad pa a la e aluación, a amien o y se-
guimien o del p oceso umo al.
1.4.1. El exosoma y el nicho p e-me as ásico
La pa icipación del exosoma en la o mación del nicho p e-me as ásico
ha a aído g an in e és en los úl imos años y ha pe mi ido a su ez el es able-
cimien o de ínculos en e es a población esicula , la p og esión umo al y el
p onós ico clínico72,73. En es a di ección se obse ado una pa icipación di ec a
de las esículas ex acelula es y el exosoma en la adquisición de ca ac e ís icas
que con o man el nicho p e-me as ásico desde sus es adios más iniciales me-
dian e la deses uc u ación de la MEC y el descenso del seguimien o inmune,
has a una e apa madu a a a és del eclu amien o de p ecu so es p o- umo-
ales y el es ablecimien o de una homeoes asis p o- umo igénica en el ejido
huésped72,73.
La MEC es á o mada po dos componen es es uc u ales p incipales: la
memb ana basal y la ma iz in e s icial. En ambos dominios el colágeno cons-
i uye el componen e es uc u al p incipal y sob e el que se incluyen glicop o-
eínas -como la laminina y la enascina- y p o eoglicanos que in e accionan con
la ma iz adyacen e y las células esiden es de la MEC. Es as células esiden es
se componen mayo i a iamen e de ib oblas os y mio ib oblas os que se
enca gan de la p oducción de los componen es de la MEC y la in eg ación de
señales ex e nas cons i uyendo la MEC un sopo e dinámico sensible a ac o es
ex e nos y bajo cons an e emodelación74.
In oducción
38
Du an e el p e-acondicionamien o umo al, los exosomas han demos ado
pa icipa ac i amen e en es a dinámica de deses uc u ación y emodelación
de la MEC median e la inclusión de MMPs o moléculas ac i ado as den o de
su ca go; o bien median e las p omoción de es a emodelación en células esi-
den es75,76. Son ambién a ios los es udios que han conseguido es ablece una
asociación en e un pe il ib ó ico de la MEC y el á ico exosomal ía TGFβ77.
El eclu amien o de mio ib oblas os ía exosomas -p oceden es de la di e en-
ciación de ib oblas os o p ecu so es mesenquimales78,79- o igina un aumen o
en la p oducción y deposición de MEC mediada po TGFβ; el cual al e a a su ez
la unción inmune y es imula la angiogénesis80. Recien emen e se ha epo ado
ambién la sob eexp esión de ib onec ina, un componen e ib oso de la MEC,
ía exosomas77. La ib onec ina es capaz de media en la adhesión célula-MEC
median e su in e acción con in eg inas; las cuales han demos ado un papel
cla e a la ho a de de e mina el des ino de las lesiones me as ásicas81.
Sin emba go, la in luencia del exosoma umo al no se limi a únicamen e
a la deses uc u ación de la MEC, sino que ambién son capaces de p omo e
una espues a p o- asculogénica en el ejido endo elial. Se ha obse ado como
exosomas umo ales son capaces de es imula la angiogénesis median e la
ans e encia ho izon al de EGFR a células endo eliales82. G ange e al. demos-
a on que exosomas umo ales son capaces de mo iliza las células endo e-
liales hacia la o mación de pseudo-capila es in i o; además de es imula la
exp esión de MMP-2, MMP-9 y VEGFR83. Adicionalmen e, Peinado y colabo a-
do es han demos ado un inc emen o de la pe meabilidad del endo elio y el e-
clu amien o de p ecu so es de médula ósea mediado po exosomas en células
de melanoma73.
Finalmen e, se ha epo ado ambién la pa icipación del exosoma umo al
en la modulación del seguimien o inmune. Exosomas p oceden es de cánce
de pulmón son capaces induci la ac i ación de mac ó agos pa icipando en la
in lamación del nicho84. Además, se ha obse ado cómo los exosomas umo a-
les pa icipan en la modulación de la espues a inmune limi ando la ac i idad
de las células T85.
Diseminación umo al y me ás asis
39
1.4.2. El exosoma y la Célula Tumo al
Diseminada
No debemos ol ida sin emba go que la me ás asis se a a de un p oceso
en la que no sólo exis e una comunicación umo –huésped, sino que es a co-
municación se p oduce de mane a bidi eccional pa icipando el nicho me as á-
sico en la supe i encia de la célula umo al diseminada.
En es e sen ido se ha obse ado cómo exosomas p oceden es de dis in os
p ecu so es del nicho p e-me as ásico pa icipan en la p og esión de la lesión
me as ásica. La sec eción de miRNA-223 ía exosomas po pa e de mac ó-
agos ac i ados es capaz de inc emen a la in asión y mig ación de dis in as
líneas de cánce de mama86; de mane a simila Luga y colabo ado es demos-
a on la capacidad de p omo e la mo ilidad y la o mación de p o usiones en
células umo ales de cánce de mama po medio de exosomas p oceden es de
ib oblas os. Cohe en emen e, la inyección conjun a de las células umo ales y
ib oblas os inc emen ó su capacidad me as ásica87.
Exosomas p oceden es de células es omales han demos ado inc emen a
la esis encia a e apia en cánce de mama88. Del mismo modo, se ha obse a-
do la p omoción de do mancia ía exosomas en células de cánce de mama89.
Se ha epo ado ambién la ans e encia in i o de p o eínas oncogénicas ía
exosomas en e dis in as células umo ales pa icipando de es e modo en la
supe i encia umo al90.
Finalmen e, los exosomas no sólo pa icipan en la in asi idad y supe i-
encia umo al, sino que son ambién dis in os los es udios que han epo ado
un inc emen o de la capacidad me as ásica mediada po la ans e encia de
moléculas de adhesión en e las células umo ales y plaque as91.
Todas es as obse aciones ponen de elie e la in luencia de la comunica-
ción ía exosoma en el de eni de las lesiones me as ásicas y la impo ancia de
desa olla es a egias di igidas con a la misma.
40
Capí ulo 2. La biopsia líquida
2.1. U ilidad clínica de la biopsia líquida
A día de hoy la oma de mues as de ejido ep esen a la al e na i a p in-
cipal pa a la ealización de análisis gené icos en la oncología clínica. T adi-
cionalmen e es as biopsias se han enido ealizado a a és de punciones o
ap oximaciones qui ú gicas con el in de ex ae una mues a ep esen a i a
del ejido umo al. Sin emba go, es e abo daje p esen a una se ie de limi a-
ciones no p esen es en la biopsia líquida. La biopsia líquida o o ga una se ie de
posibilidades has a hace poco no disponibles como son un acceso inmedia o y
poco in asi o, la posibilidad de la moni o ización de la en e medad o, además,
su ca ác e global pe mi e abo da la e aluación clínica den o de la he e oge-
neidad umo al (Tabla 2).
Si bien es cie o que la biopsia líquida o ece múl iples en ajas, p esen a
ambién una se ie de limi aciones de i adas de la escasez de moléculas diana
en sang e. Además, quedan a día de hoy p egun as de ca ác e biológico que
deben se abo dadas an es de una comple a implemen ación de la biopsia lí-
quida en clínica. Se desconoce po ejemplo si odos los umo es y me ás asis
p oducen c DNA de mane a homogénea o has a qué pun o es os ni eles de
c DNA en ci culación es án in luenciados po la localización umo al -acceso a
asos sanguíneos po ejemplo-; del mismo modo se desconoce ambién qué
subpoblaciones de la célula umo al en ci culación pa icipan en la o mación
de las me ás asis92,93.
La biopsia líquida
41
2.2. Bioma cado es en ci culación
La e aluación de bioma cado es umo ales en sopo e líquido se ha ba-
sado gene almen e en la de ección de p o eínas mayo i a ias indicado as de
p ocesos umo ales. Algunos de es os ma cado es se encuen an ac ualmen-
e comple amen e implemen ados en clínica pe o en ocasiones ca ecen de la
sensibilidad y especi icidad su icien e96–98. Du an e los úl imos años, un conoci-
mien o más de allado de las bases molecula es del p oceso umo al jun o con
el desa ollo de nue as ecnologías ha pe mi ido la de ección de al e aciones
gené icas en mues as de sang e pe i é ica, ab iendo así un amplio abanico
de posibilidades pa a el desa ollo de bioma cado es diagnós ico, p onós ico y
p edic i os en oncología.
Den o del ma e ial gené ico con enido en la biopsia líquida se pueden
dis ingui a ias uen es de ácidos nucleicos de o igen umo al siendo las p in-
cipales la Célula Tumo al Ci culan e, el c DNA, los miRNAs y el exosoma94,99.
Ven ajas de la biopsia líquida
Limi aciones de la biopsia de ejido
Al a accesibilidad
- Mínima in asi idad
- Al a elegibilidad del pacien e
- Ba a o. De u ina.
Accesibilidad limi ada
- Punción /Ci ugía
- E ec os secunda ios ad e sos
- Ca o. Necesidad de equipamien o
especí ico
Dinámica
- Posibilidad de e-e aluación
- E aluación de la espues a a a amien o
y desa ollo de esis encias
- Seguimien o de la secuencia de
acumulación de mu aciones
Es á ica
- Limi ada po la can idad de ejido
disponible
- In luida de la celula idad umo al
- Mues eo pun ual
Sis émica
- E aluación de la he e ogeneidad in a-
umo al
- E aluación de la he e ogeneidad in e -
me ás asis
Local
- No siemp e cen ada en la pa e
más ag esi a del umo
- Pa cial. No conside a
he e ogeneidad in a- umo al
Aplicabilidad al a
- Iden i icación de nue as dianas
e apéu icas
- Sc eening / Diagnosis emp ana
- Moni o ización de la en e medad
Aplicabilidad limi ada
Adap ado de Bude e al.
94
y Pan el & Alix-Panabiè es
95
Tabla 2. Ven ajas de la biopsia líquida como he amien a clínica
In oducción
48
Biológicamen e, el o igen de es os bioma cado es no es á cla amen e es a-
blecido. Inicialmen e se ha a ibuido a una libe ación a la ci culación sanguínea
como consecuencia de p ocesos in lama o ios y de daño celula . Sin emba go,
la in luencia de las esículas ex acelula es en la comunicación celula y la
p esencia de miRNAs den o de su ca go ha abie o el deba e sob e su o igen.
Ac ualmen e, son algunos los abajos que aluden a la comunicación umo al
como o igen de una acción de los miRNAs en ci culación. Recien emen e, una
e ce a al e na i a, aboga ambién po una sec eción ac i a esícula-indepen-
dien e de es os miRNAs. Si bien los ácidos ibonucleicos lib es se ca ac e izan
po su escasa es abilidad, los miRNAs en ci culación pa ecen es a asociados
a ag egados p o eicos que es abiliza ían eno memen e su es uc u a145,146. En
consonancia, se ha epo ado la p esencia de miRNAs en sob enadan es de
plasma p e iamen e deplecionados de esículas147.
Son nume osos los miRNA p opues os como po enciales bioma cado es
habiéndose es ablecido una inculación con la biología umo al pa a algunos
de ellos148. En cánce de pulmón se ha iden i icado la exp esión di e encial de
a ios miemb os de la amilia le -7 miRNA en plasma y esículas plasmá i-
cas149,150; implicando a su ez la pa icipación de miemb os de es a amilia en la
egulación de oncogenes como RAS o MYC en cánce de pulmón151,152. miR200c,
un miRNA implicado en la egulación del p oceso de EMT36, ambién ha sido
encon ado sob eexp esado en pacien es de NSCLC y cánce de endome io
de mal p onós ico153,154. La de ección de es os miRNAs ha se ido a su ez de
sopo e pa a el desa ollo de un es diagnós ico en plasma de pacien es de
NSCLC de al o iesgo basado en la e aluación de 34 miRNAs dis in os155.
2.2.4. Vesículas ex acelula es y exosomas
Las esículas ex acelula es (EVs) y los exosomas ep esen an la úl ima
de las acciones de la biopsia líquida que ha a aído la a ención po su po-
encial clínico. En los úl imos años, las EVs, y los exosomas en conc e o, han
demos ado se con enedo es de nume osas moléculas con ac i idad biológica
(lípidos, p o eínas, mRNAs, RNAs no codi ican es, miRNAs, DNAs) demos an-
do algunas de las cuales una pa icipación cla e en la comunicación umo al. El
con enido p o eico y ibonucleico de las EVs p oceden es del plasma, así como
La biopsia líquida
49
su núme o, se ha demos ado al e ado en mul i ud de ipos umo ales des a-
cando al plasma sanguíneo como ehículo de una población de EVs de o igen
umo al73,77,156,157, y ab iendo así la posibilidad pa a su uso como pla a o ma
pa a el desa ollo de nue os bioma cado es de u ilidad clínica.
Ac ualmen e se desconocen g andes aspec os de la biología de las EVs. T a-
dicionalmen e, la pu i icación de exosomas se ha limi ado a un en iquecimien o
en esículas en un ango de amaño de 50-120 nm po medio de una se ie de
cen i ugaciones di e enciales158. Es e p ocedimien o no es especí ico y esul a
ambién en la co-p ecipi ación de ag egados p o eicos y o as esículas de o i-
gen no exosomal159. En los úl imos años han apa ecido mul i ud de al e na i as
des inadas a simpli ica y es anda iza la pu i icación de exosomas aunque a
día de hoy las al e na i as disponibles p esen an una se ie de limi aciones que
hacen su uso más o menos adecuado en unción de los obje i os157,160–163.
La ul acen i ugación de exosomas ep esen a el abo daje más sencillo
y con mayo endimien o, pe o su ez el menos especí ico. Pa a sal agua da
es a limi ación es ecuen e el uso de p o ocolos complemen a ios como la
ul acen i ugación en g adien e de suc osa que, si bien educe el endimien o
o al, pe mi e la ob ención de p epa aciones de mayo pu eza158. El aislamien-
o median e c oma og a ía de exclusión po amaño ep esen a ambién una
al e na i a pa a la pu i icación de exosomas no dependien e de ma cado es ni
de equipos de ul acen i ugación164. Pa alelamen e, se han desa ollado abo -
dajes basados en p ocesos de inmuno-a inidad que pe mi en un aislamien o
especí ico de los exosomas en unción de un de e minado ma cado p o eico
-p incipalmen e miemb os de la amilia de las e aspaninas o EpCAM-160. Es e
abo daje p esen a como p incipal en aja la g an pu eza de los aislados pe o
se encuen a limi ado po la ausencia de ma cado es exosomales especí icos,
la pé dida de subpoblaciones exosomales y el bloqueo de p o eínas de mem-
b ana que pudie an limi a la uncionalidad del exosoma. Es po ello, que es e
abo daje es á especialmen e indicado pa a es udios de ca ac e ización en e a
es udios uncionales162.
In oducción
50
Clínicamen e, los exosomas p esen an algunas ca ac e ís icas a ines al
c DNA como es su accesibilidad o su p esencia casi ubicua en líquidos biológi-
cos; mien as que, po el con a io, p esen an ambién algunas ca ac e ís icas
compa idas con las CTCs como es la posibilidad de ealiza es udios o ien-
ados al p o eoma o la p esencia de una bicapa lipídica que p o ege el ca go
molecula . A endiendo a sus ca ac e ís icas, los exosomas esul an especial-
men e in e esan es en la búsqueda de bioma cado es nucleicos po su mayo
abundancia en sang e que en el caso de las CTCs y po su mayo es abilidad e
in eg idad que los ácidos nucleicos lib es en ci culación -habiéndose epo ado
po ejemplo la mu ación de BRCA2 en exosomas de una pacien e no ope able
y cuyo c DNA no pe mi ió la ob ención de ma e ial de calidad su icien e como
pa a la iden i icación de la mu ación165-. Además, la mayo es abilidad de los
ácidos nucleicos encapsulados pe mi i ía su acumulación y e aluación en es a-
dios más emp anos aumen ando así su ango de aplicabilidad165.
Biológicamen e los exosomas son un e lejo del umo del que p oceden.
En un es udio ealizado po Taylo y colabo ado es se iden i icó un pe il de
miRNAs ca ac e ís ico de células de cánce de o a io a pa i de sus exosomas
pe mi iendo su uso como ma cado umo al166. Además, son nume osos los
es udios que han epo ado un inc emen o en la exp esión de ma cado es de
exosomas en ci culación como consecuencia de la p og esión umo al llegándo-
se incluso a es ablece una co elación con el g ado de di e enciación, es adio
umo al y supe i encia73,167. Po o o lado, se ha epo ado ambién un en i-
quecimien o del ca go exosomal en miRNAs168, siendo nume osos los es udios
que han inculado la p esencia de miRNAs asociados a mic o esículas como
indicado es de en e medad169,170. Al e na i amen e, son a ios los es udios que
han demos ado la posibilidad de de ec a al e aciones gené icas en el RNA
codi ican e de EVs171-172.
Po úl imo, son dis in os los au o es que han des acado el uso de los exo-
somas, no sólo como bioma cado es umo ales, sino ambién una posible apli-
cabilidad e apéu ica de los mismos. Es os exosomas en ci culación pueden se
ex aídos de un indi iduo y deco ados o ca gados con una molécula o á maco
especí ico pa a su e-adminis ación p opo cionando un ehículo esis en e a la
deg adación, liposoluble y al amen e especí ico173.
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
55
Capí ulo 3. Hipó esis y obje i os
El p oceso de me ás asis ep esen a un e en o de e minan e en la p ác ica
oncológica. Sin emba go, pese a su ele ancia, las e apias di igidas de mane a
especí ica a p e eni la p og esión me as ásica son limi adas. Biológicamen e,
la p og esión me as ásica se compone de una secuencia de e apas en las que
el p oceso umo al es ablece una in ensa emodelación del en o no y en el que,
de acue do a la hipó esis de Paye de Seed & soil, la diseminación de la célula
umo al en ci culación ocu i á de mane a p e e en e en ó ganos p e-acondi-
cionados po es e en o no, en lo que se ha denominado la o mación del nicho
p e-me as ásico. El es udio aquí desa ollado pa e de es a hipó esis con el
obje o de p o undiza en el conocimien o de la diseminación y anidamien o
me as ásico a a és de dos de sus pa icipan es: la Célula Tumo al Ci culan e,
como p incipal esponsable de la gene ación de me ás asis a dis ancia; y el
exosoma umo al incluido en un ma co de EMT, como he amien a de comuni-
cación en e la célula umo al, su en o no y pa ícipe del condicionamien o del
nicho p e-me as ásico.
Hemos u ilizado el cánce de pulmón NSCLC como modelo de abajo al a-
men e in asi o y con g an capacidad de diseminación pa a la ca ac e ización
de las CTCs; mien as que, po o o lado, hemos u ilizado el cánce de endo-
me io como pun o de pa ida pa a el desa ollo de un modelo de in asi idad
umo al guiado po EMT con el in de ealiza su ca ac e ización y e alua la
in luencia de es e p og ama ansc ipcional en la comunicación y anidamien o
umo al.
56
Ca ac e izacióndelpe ilmolecula delaCélula
Tumo al Ci culan e (CTC) en Cánce de Pulmón de
CélulaNo-Pequeña(NSCLC)
• Inmunoaislamien o, en iquecimien o y ca ac e ización de CTCs
EpCAM+ en sang e pe i é ica de pacien es de NSCLC a anzado
• Análisis de las unciones molecula es y u as de señalización
implicadas en la adquisición del pe il de CTCs en pacien es de
NSCLC
• Iden i icación y alidación de bioma cado es especí icos de
CTCs y de e minación de su alo clínico en NSCLC
Ob encióndelpe ilp o eicodelalíneadecánce
de endome io HEC-1A en un ma co de EMT
• Ca ac e ización po SILAC del con enido p o eico del p o eoma,
sec e oma soluble y exosoma de la línea celula de cánce de
endome io HEC-1A en un ma co de EMT inducido po ETV5
E aluacióndelain luenciadelexosoma umo al
en el anidamien o de la Célula Tumo al Ci culan e
al ejido endo elial
• De e minación del e ec o del exosoma umo al sob e el ejido
endo elial en un escena io de diseminación y anidamien o
umo al
• E aluación de di e encias uncionales en el exosoma umo al
de i adas de EMT
Ma e iales y Mé odos
64
Incubada la eacción (25°C, 5’; 50°C, 2h; 70°C, 15’) las mues as se a-
a on con RNase H pa a elimina los es os de RNA (37°C, 20’; In i ogen) y se
conse a on a -20°C has a su uso.
4.1.4. P e-ampli icaciónyRT-qPCR
P e io a la ealización de la RT-qPCR (Re e se T ansc ip ion Polyme ase
Chain Reac ion) se some ió el cDNA a una eacción de p e-ampli icación (Ta-
qman® P eAmp Mas e Mix Ki , Applied Biosys ems) con el in de inc emen a
la sensibilidad de la eacción. Es a eacción pe mi e la ampli icación di igida
de agmen os de cDNA de mane a uni o me y sin in oduci sesgos. Pa a ello,
se añadie on 4,17 µL de cDNA a una mezcla de 3,28 µL de TE 1x po eacción
y 0,07 µL de cada sonda Taqman® a p e-ampli ica (M&M 6.4. Tabla 7) has a
comple a un olumen de eacción de 12,5 µL. A con inuación se añadie on
12,5 µL del p epa ado P eamp Mas e Mix (Applied Biosys ems) pa a un olu-
men inal de 25 µL. Es a mezcla se incubó du an e 14 ciclos de ampli icación
(95°C, 10’; (95°C, 15’’; 60°C, 4’) x14) y se diluyó 1:10 en TE 1x an es de
p ocede a la RT-qPCR.
La PCR cuan i a i a en iempo eal es una a ian e de la PCR que pe -
mi e simul áneamen e ampli ica y cuan i ica de o ma absolu a el p oduc o
de ampli icación median e la inco po ación de un oligonucleó ido luo escen e
(Taqman®, Applied Biosys ems) di igido de mane a especí ica a una secuen-
cia diana. Es e oligonucleó ido al se inco po ado libe a el luo ó o o acoplado
pe mi iendo medi la asa de gene ación de uno o más p oduc os especí icos
al inal de cada ciclo de ampli icación. Las eacciones de RT-qPCR se lle a on
a cabo en placas de 96 pocillos pa a las sondas co espondien es (M&M 6.4.
Tabla 7) e incluyendo en odo caso duplicados y con oles nega i os. Cada e-
acción de ampli icación se cons i uyó de 9 µL de cDNA diluido
1/4
en
H2O
lib e
de nucleasas, 1 µL de la sonda TaqMan® co espondien e y 10 µL de TaqMan
Gene Exp ession Mas e Mix (Applied Biosys ems). Cada eacción de RT-qPCR
es u o compues a po un ciclo de p e-ampli icación (50°C, 2’; 95°C, 10’) se-
guido de 40 ciclos de ampli icación (95°C, 15’’; 60°C, 1’). El equipo u ilizado
ue un e mociclado 7500 Real-Time PCR Sys em (Applied Biosys ems).
Ca ac e ización de CTCs en NSCLC
65
Pa a su análisis, el ni el de exp esión pa a las dis in os genes se ep esen-
a como 40-C siendo 40 el núme o de ciclos de ampli icación o al y C (Cycle
Th eshold) el pun o de in e sección en e la cu a de ampli icación y el umb al
de de ección es ablecido (C h eshold= 0,1). Pa a la de e minación de la ca ga
de CTCs pa a cada mues a, los alo es medios de exp esión de GAPDH -un
housekeeping gene indicado de celula idad- ue on sus aídos de la señal p o-
ceden e de PTPRC -un ma cado de célula hema opoyé ica- del mismo modo al
u ilizado po Ba bazán y colabo ado es174.
4.2. Pe ildeexp esióndeCTCs EpCAM+
Con i mada la p esencia de CTCs en ci culación en pacien es NSCLC se
p ocedió a la de e minación de su pe il de exp esión po Gene Exp ession Mi-
c oa ay en 10 mues as independien es. El p ocedimien o empleado pa a el
en iquecimien o de CTCs y ex acción de RNA o al ue el mismo al especi icado
en el pun o M&M 4.1.2. pa a después p ocede a la ampli icación del ansc ip-
oma comple o de acue do al p ocedimien o indicado.
4.2.1. Ampli icacióndel ansc ip omayGene
Exp ession Mic oa ay
La ampli icación del ansc ip oma comple o de las CTCs ue lle ada a cabo
con el ki Whole T ansc ip ome Ampli ica ion (WTA2, Sigma; S . Louis, MO,
USA) de acue do a las especi icaciones del ab ican e. Se inco po ó la máxima
can idad de RNA o al pa a la c eación de una lib e ía de cDNA del ansc ip o-
ma pa a cada pacien e / con ol, y a con inuación se p ocedió a su ampli ica-
ción po PCR (94°C, 2’; (94°C, 30’’; 70°C, 5’) x17).
La lib e ía de cDNA esul an e ue en onces ma cada con el compues o
luo escen e Cy3® e hib idada sob e un mic oa ay de exp esión génica según
las indicaciones del p o eedo (In Si u DNA Mic o ay 4x44 k, Agilen Technol-
ogies; New Cas le, DE, USA). La señal b u a ue ecogida en un Agilen scanne
G2565B (Agilen Technologies) y analizada de acue do a los c i e ios e e idos
a con inuación.
Ma e iales y Mé odos
66
4.2.2. Análisisdesigni icación
El Análisis de Signi icación de Mic oa ays (SAM) ue ealizado en colabo a-
ción con Gómez-Ta o A. y Casa es-de Cal MA., inculados ambos a la Facul ad
de Ma emá icas de la Uni e sidad de San iago de Compos ela.
Los da os b u os ue on segmen ados con el so wa e p opo cionado po el
ab ican e de acue do al p o ocolo GE1- 5_95 (Agilen Fea u e Ex ac ion So -
wa e 9.5, Agilen Technologies). Un p ocesado inicial de los da os pe mi ió
limi a la sa u ación de la señal y la eliminación de señal de ondo de acue do
a los c i e ios indicados175,176. Aquellos genes que no alcanza on alguno de los
c i e ios de calidad ue on desca ados: a) señal no uni o me o eplicados dis-
pa es b) señal signi ica i amen e no di e en e al ondo de señal c) señal en el
ango de los con oles nega i os.
A con inuación se p ocedió a la no malización po cuan iles de la señal del
mic oa ay con el so wa e lib e Bioconduc o 177. Sólo aquellas señales po en-
cima de 211 unidades as de su no malización ue on conside adas óp imas. Fi-
nalmen e, aquellas sondas con ausencia de señal en más de un pacien e ue on
desca adas. Depu ada la señal, se p ocedió a la búsqueda de secuencias sig-
ni ica i amen e más exp esadas en pacien es que en con oles de acue do al
algo i mo de SAM incluido en el paque e de R sam 178.
4.2.3. In e p e ación biológica de los da os
Los da os p ocesados ue on olcados en el so wa e Ingenui y Pa hway
Analysis 2.0 (IPA, Ingenui y Sys ems; Redwood Ci y, CA, USA) pa a la de e -
minación de u as y unciones biológicas signi ica i as. El es de Fishe de una
cola empleado nos pe mi e es ima la p obabilidad de que una asociación es-
ablecida pa a nues o se de genes se deba al aza . Adicionalmen e, los da os
ue on con as ados con la he amien a de acceso lib e GeneCodis3 pa a la de-
e minación de las unciones más ele an es en el pe il de las CTCs de acue do
a un es hipe geomé ico co egido179. La signi icación quedó es ablecida pa a
un p alo <0,05 en ambos casos.
Ca ac e ización de CTCs en NSCLC
67
4.3. Validación y con as e con
a iables clínicas
4.3.1. Selección y alidación de genes
candida o
El análisis de unción des aca la p esencia signi ica i a de genes incula-
dos a la u a de No ch1 en el pe il de CTCs. De en e los genes inculados a
la u a de No ch1 po IPA se selecciona on una se ie de candida os (LGALS3,
PTP4A3 e ITGB3) con enidos en el pe il de exp esión de CTCs pa a la alida-
ción po RT-qPCR del mic oa ay y de la u a de señalización de acue do a la
me odología indicada en los pun os M&M 4.1.3. y M&M 4.1.4. GAPDH ue in-
co po ado como no malizado celula y PTPRC se incluyó como no malizado
de aislamien o inespecí ico. Finalmen e, HES1 ue inco po ado como e ec o
down-s eam de la u a de No ch1 con el in de ce i ica la ac i ación de la
u a. La signi icación es adís ica se de e minó de acue do a un Mann-Whi ney
U- es de dos colas. El so wa e u ilizado ue el G aphPad P ism 6 (G aphPad
So wa es Inc.; San Diego, CA, USA). El análisis de co elación NOTCH1-HES1
se ealizó a a és del es adís ico de Pea son. La signi icación ue ijada pa a
un p alo <0,05 en odo caso.
4.3.2. Con as e con a iables clínicas
El con as e clínico de los ma cado es alidados se lle ó a cabo de acue do
a las ecomendaciones REMARK pa a la búsqueda y e aluación de ma cado-
es180. El análisis de ROC ue es ablecido pa a una dis ibución no pa amé ica y
un in e alo de con ianza del 95%. La Supe i encia lib e de p og esión (PFS)
y Supe i encia global (OS) se analiza on median e log- ank es y la elabo-
ación de cu as de Kaplan-Meie . La p og esión emp ana ue de inida como
aquellas p og esiones acaecidas en los 4 meses siguien es al diagnós ico. El
es adís ico de Cox ue u ilizado pa a la elabo ación de los análisis uni a ian es
y mul i a ian es pa a los ma cado es y las a iables clínicas. El so wa e u ili-
zado ue el IBM SPSS S a is ics 20.0 (IBM Co p.©; Chicago, IL, USA). Un p alo
<0,05 ue conside ado es adís icamen e signi ica i o.
Ma e iales y Mé odos
68
4.4. Inhibición de No ch in i o
4.4.1. Cul i o celula : cánce de pulmón
La línea humana inmo alizada de NSCLC A549 ue ob enida de la ATCC
(ATCC® CCL-185™). Es a línea ue man enida en cul i o en medio Dulbecco’s
Modi iedEagleMedium(DMEM, Gibco; G and Island, NY, USA) al 10% de Sue o
Fe al Bo ino (FBS, Gibco), 1% ( / ) de penicilina (100 U/mL) -es ep omicina
(100 µg/mL) (PenS ep, Gibco) y una a mós e a adecuada (37°C, 95% HR, 5%
CO2). Las células se subcul i a on de monocapas subcon luen es y dilución 1:8.
4.4.2. P oli e ación en ausencia de sus a o
En la célula somá ica la ausencia de sus a o es un po en e es ímulo que
a o ece la en ada en apop osis. Una de las ca ac e ís icas de la célula in a-
si a es su capacidad pa a so ea es a señal y p oli e a en la ausencia de un
sus a o i me. Pa a su e aluación se p ocedió al apizado de la base de cada
pocillo de una placa de P96 con 30 µL de aga osa Low Mel ing Poin (V2111,
P omega; Madison, WI, USA) al 0,6% (w/ ). Una ez geli icado se añadie on
5x103 células de la línea celula A549 con enidas en 100 µL de aga osa LMP al
0,3% (w/ ). La aga osa se geli icó en medio DMEM al 2% de FBS. Las células
se deja on asen a du an e 16h y a con inuación se añadie on los a amien os
co espondien es pa a un olumen inal de 100 µL de medio de cul i o FBS-.
La inhibición de No ch1 se ealizó median e el inhibido químico de γ-sec e asa
DAPT (CAS 208255-80-5. IC50 115 nM, San a C uz Bio echnology; Dallas, TX,
USA).
Las células se cul i a on du an e 4 días has a su e elado en 50 µL de
una dilución 1:10 de Alama Blue® Cell Viabili y Reagen (DAL1025, In i o-
gen). Finalmen e, se midie on los alo es de luo escencia a 590 nm en un
lec o FLUO S a Op ima (BMG Lab ech; O enbe g, AL). Las di e encias en p o-
li e ación se de e mina on median e su no malización a un con ol nega i o. 5
eplicados in a-expe imen ales ue on incluidos pa a cada mues a. La signi i-
cación es adís ica se es ableció pa a p <0,05 de acue do a un es de Wilcoxon.
69
Capí ulo 5.
Ca ac e ización del p o eoma y
acción sec e ada de HEC-1A y
H-ETV5
5.1. Ob ención de exosomas de HEC-1A
y H-ETV5
5.1.1. Cul i o celula : cánce de endome io
La línea de cul i o de cánce de endome io u ilizada ue la HEC-1A (ATCC®
HTB-112™). Es a línea p ocede de un adenoca cinoma de endome io aislado
en 1968 de una pacien e con cánce endome ial es adio IA. P esen a una mo -
ología epi elial y ca ac e ís icas de cul i o adhe en es.
A pa i de es a línea celula , Monge y colabo ado es gene a on la línea
celula H-ETV5 modi icada pa a la sob eexp esión de ETV5 (EX-F080000-
L 105; NM_004454, GeneCopoieia; Rock ille, MD, USA)46. La sob eexp esión
de ETV5 es capaz de induci un p oceso de EMT adop ando es as células un
eno ipo pseudo-mesenquimal y al amen e in asi o (In oducción 1.2.6.1). La
selección del ec o de sob eexp esión se man u o con G-418 (Gene icina®
500 µg/mL, Gibco).
De es e modo se cons i uyó un modelo dico ómico en el que el eno ipo
epi elial queda ep esen ado po HEC-1A y su con apa ida, con eno ipo me-
senquimal y po ado de la sob eexp esión de ETV5, H-ETV5.
Ma e iales y Mé odos
70
Ambas líneas de cul i o se man u ie on en medio McCoy‘s 5A (Gibco) su-
plemen ado al 10% FBS y 1% ( / ) de PenS ep (Gibco) en una a mós e a
adecuada. El subcul i o se ealizó po ipsinización y dilución 1:6-1:8.
5.1.2. Pu i icacióndeexosomasdemedios
condicionados
Pa a la ob ención de los medios condicionados se es ablecie on unas u-
inas de cul i o ijas pa a las líneas celula es HEC-1A y H-ETV5. La asa de
p oli e ación de ambas líneas celula es es equi alen e sucediéndose un ciclo
de di isión celula comple o cada 22h. Las células ue on c ecidas en medio
comple o has a un 70% de con luencia, la adas en PBS y pos e io men e man-
enidas du an e 48h en medio FBS- pa a su condicionamien o. De cada placa
se ealiza on dos ondas de condicionamien o p ocesadas de igual mane a.
La pu i icación de exosomas p oceden es de medios condicionados se lle ó
a cabo de acue do a las di ec ices es ablecidas po Thé y e al158. Una ez los
medios condicionados se limpia on de impu ezas po cen i ugación di e en-
cial se p ocedió al en iquecimien o de exosomas median e su ul acen i uga-
ción (100.000 g, 90’, 4°C), la ado en PBS y pos e io ecupe ación (Figu a 8).
Las cen i ugaciones ue on ealizadas en un o o SW32Ti (Beckman Coul e ;
B ea, CA, USA). Una ez pu i icados los exosomas, se esuspendie on en la
solución y olumen co espondien e y se p ocedió a su e aluación de u ina po
Ze aSize Nano ZS (M&M 5.2.3.). Las mues as gene adas ue on conse adas
a 4°C has a su uso en un plazo in e io a 24h.
5.2. Ca ac e ización de exosomas
El abajo con exosomas es un campo en el que la o ma de ob ención
y manejo de las mues as iene g an in luencia sob e los esul ados. Adicio-
nalmen e, a día de hoy no exis en p ocedimien os uni e sales que pe mi an
dis ingui en e los dis in os ipos de esículas ex acelula es siendo a menudo
e e enciado como exosomas lo que se a a de una suspensión en iquecida de
dis in os ipos de esículas ex acelula es. Exis en sin emba go di e sas pau as
ampliamen e acep adas y que pe mi en aco a el abajo con exosomas162.
Ca ac e ización de exosomas po SILAC
71
5.2.1. Mon aje de exosomas comple os pa a
mic oscopia elec ónica TEM
Una ez ul acen i ugado el medio condicionado se p ocede a la ijación
di ec a de los exosomas comple os median e su esuspensión en 50 µL de PFA
2%. 5 µL de es a suspensión es di ec amen e deposi ada en a ias ejillas de
o m a -ca bono, secada al ai e du an e 20-30’ y la ada en PBS (x3). Po úl i-
mo, las mues as son con as adas con ácido os o úngs ico (H3PW12O40; 5’, TA,
pH 6.8) y obse adas al mic oscopio elec ónico de ansmisión (JEOL 120KV
mod. JEM2010, JEOL L d.; Akishima, Tokio, JP) pa a la obse ación di ec a de
los aislados de exosomas.
5.2.2. Ma cado es de exosomas
Ac ualmen e no se conoce la exis encia de p o eínas exclusi as del exo-
soma y cuya de ección pe mi a con i ma de mane a inequí oca la na u aleza
de los aislados. Se ha obse ado sin emba go una se ie de p o eínas cuya
p esencia apa ece en iquecida en exosomas y que gene almen e se u ilizan
pa a la ce i ica su aislamien o162. Den o de es e g upo apa ecen p o eínas de
dis in a na u aleza y en e las que des aca la supe amilia de las e aspaninas
Figu a 8. Flujo de abajo empleado pa a el aislamien o de exosomas a pa i de medios
condicionados. Se eliminan secuencialmen e las células a as adas y mue as y es os celula es
pa a después p ecipi a los exosomas po ul acen i ugación. A con inuación se ealiza un la ado
en PBS pa a elimina co-p ecipi ados p o eicos y se uel en a ecupe a los exosomas.
Ma e iales y Mé odos
72
-como CD9, CD63 o CD81- implicadas en p ocesos de adhesión, econocimien-
o y usión de esículas181. Asimismo PDCD6IP - ambién e e ida como ALIX- es
una p o eína de o igen ci osólico u ilizada ambién como e idencia de un en i-
quecimien o exosomal.
Adicionalmen e, la ausencia de ma cado es especí icos de exosomas hace
más ele an e si cabe la e aluación de de e minadas p o eínas “no deseables”
en los aislados de exosomas. La de ección de es as p o eínas e idencia ía una
ob ención inadecuada de la mues a (la lisis celula po ejemplo libe a ía g an
can idad de esículas no deseables) o un p ocesamien o de icien e. HSP90B1
- ambién conocida como GRP94- es una p o eína implicada en la es abilización
y plegamien o de p o eínas de nue a sín esis en el e ículo endoplasmá ico po
lo que su p esencia se desaconseja en p epa aciones de exosomas. Pa a su
e aluación se ealizó la de ección de es a p o eína en p epa aciones de exo-
somas pa alelamen e a un con ol posi i o cons i uido po 10 µg de un lisado
celula .
La p esencia de es os ma cado es de exosomas ue con i mada / desca a-
da po Wes e n Blo de acue do a los p o ocolos indicados en el apa ado M&M
6.3.5.3. y los eac i os co espondien es (M&M 6.4. Tabla 7). La de ección de
al menos de una de las e aspaninas, una p o eína ci osólica y la ausencia de
esículas con aminan es es conside ada como su icien e pa a ce i ica la na-
u aleza de los aislados.
5.2.3. Pe ilde amañodeexosomas
El Ze asize Nano ZS (Mal e n Ins umen s L d.; Wo ce s e shi e, UK) es
analizado de al o endimien o que pe mi e e alua la dispe sión de pa ículas
en suspensión bajo el mo imien o b owniano y la con ie e en una dis ibución
de amaño. En el caso de exosomas, la dis ibución de amaño es a iable en
unción del ipo celula , el p ocesamien o o el p ocedimien o de adquisición, sin
emba go, exis e un amplio consenso de que su amaño oscila en e los 50-120
nm.
Ca ac e ización de exosomas po SILAC
73
Pa a la alo ación u ina ia de los pu i icados de exosomas se p ocedió a
la es imación de la concen ación y pe il de amaño de los aislados de exo-
somas en una dilución 1:10 en PBS bajo unos pa áme os ijos (25°C, ángulo
de medida 173°, 5 epe iciones po medida, du ación de la epe ición 10’’,
a enuado ijo en 8). Las medidas ue on ealizadas en cube as de polies i eno
ZEN0040 (Mal e n Ins umen s L d.). Los pe iles ep esen ados ep esen an
la media de 3 medidas independien es. La es imación de la concen ación de
cada mues a se ealizó a pa i del núme o medio de cuen as po segundo
(kcps) bajo las condiciones an es señaladas y un olumen conocido. Los a a-
mien os in i o se ealiza on de acue do a un a io de dilución equi alen e pa a
los dis in os ensayos y eplicados.
5.3. Ca ac e ización p o eica po SILAC
del p o eoma, sec e oma y exosoma de
HEC-1A y H-ETV5
5.3.1. SILAC: S able Iso ope Labeling wi h
Amino acids in Cell cul u e
El SILAC es una écnica p o eómica que pe mi e es ablece di e encias
en la abundancia ela i a de p o eínas especí icas pa a una se ie de mues as
pa eadas182. El SILAC se basa en la inco po ación po pa e células me abólica-
men e ac i as de aminoácidos ma cados (hea y) en e a o a población c e-
cida en p esencia de sus equi alen es sin ma ca (ligh ) o de un peso in e io
(middle). Es e ma caje gene almen e implica iso opos es ables del hid ógeno
(H2), ca bono (C13) o ni ógeno (N15) que, si bien químicamen e se compo an
de mane a idén ica, sus di e encias a ómicas sí son egis ables po espec o-
me ía de masas (MS). En el cul i o celula con es os isó opos, después de un
núme o de di isiones celula es, la p o eína ma cada desplaza á a la p o eína
sin ma ca has a consegui un ma caje uni o me de odo el con enido p o eico.
El SILAC p opo ciona además una se ie de en ajas no ables en e a o os
abo dajes p o eómicos: 1) Pa ejas de pép idos químicamen e idén icos, pe o
de di e en e composición iso ópica -es deci , p oceden es de dis in as poblacio-
Ma e iales y Mé odos
80
una ma iz de α-ciano (4 mg/mL en 70% ACN / 0,1% TFA; 1,2 µL/min). Final-
men e se p ocedió a la adquisición de los espec os de MS y MS/MS de los c o-
ma og amas esul an es en un MALDI-TOF/TOF (4800 ABSciex; F amingham,
MA, USA) de acue do a las condiciones e e idas po Ma eos e al187. Se u ilizó
una in ensidad ija de 3.600 kV y 1.500 dispa os po acción. La selección de
los p ecu so es pa a MS/MS se ealizó usando un mé odo Job-Wide (has a 12
p ecu so es po acción, señal / uido >80). La agmen ación de los pép idos
se lle ó a cabo pa a un ol aje de 4.400 kV y 2.000 dispa os po espec o.
La iden i icación y cuan i icación de los dis in os espec os de masas y
agmen ación se ealizó de mane a sepa ada pa a cada mues a con el so -
wa e P o ein Pilo 3.0 (ABSciex) y su con as e con la base de da os UniP o _
human. Pa alelamen e se lanza on en UniP o _all pa a la de ección de posibles
con aminaciones. Los pa áme os de búsqueda ue on especi icados pa a SI-
LAC, alquilación con IAA, diges ión en ipsina y como ac o es especí icos se
incluye on la iden i icación basada en gel y dena u alización en u ea.
El umb al de de ección de p o eínas ue es ablecido pa a 1,3 con una con-
ianza del 95%. La de e minación de la modulación iene de e minada po la
elación en e ambos ma cajes -middle y hea y-. Un a io ≥1,2 (o ≤0,83 en su
de ec o) ue conside ado es adís icamen e signi ica i o. Po la me odología u i-
lizada, la modulación posi i a puede se in e p e ada como la sob eexp esión
en una de e minada mues a o bien la subexp esión en la mues a pa eada.
5.3.4.1. Tinción con ni a o de pla a
La inción con ni a o de pla a (AgNO3) pe mi e una ap oximación al a-
men e sensible capaz de de ec a can idades de p o eína del ango de nano-
g amos. Finalizada la elec o o esis (1D- SDS PAGE) se p ocedió a la ijación
de las mues as en una solución de 40% e anol / 10% acé ico du an e 2h. El
exceso de ijado ue la ado y el gel sensibilizado en iosul a o sódico 0,02%
(NaTio). A con inuación, se iñó el gel du an e 30’ en AgNO3 0,2% y o malina
al 0,075%. Du an e la inción los iones Ag se compleja án con la p o eína y se
educi án o mando un coloide que se deposi a á sob e las bandas de p o eína.
Po úl imo, la inción se e eló en 3% KCO3, 0,025% o malina y 12,5 mg/L
NaTio du an e 5-10’ y se de u o el e elado con T is 3% / Acé ico 10%.
Ca ac e ización de exosomas po SILAC
81
5.3.4.2. Análisis de unción pa a SILAC
La e aluación de unciones, u as e in e acciones biológicas signi ica i as
p oceden es del análisis p o eómico po SILAC se ealizó a a és del so wa e
Ingenui y Pa hways Analysis 2.0 (IPA, Ingenui y Sys ems). El es adís ico u ili-
zado pa a la búsqueda de u as y edes signi ica i amen e ep esen adas ue el
es de Fishe de una cola. Complemen a iamen e es os da os ue on ambién
con as ados po GeneCodis3 y e aluados po un es hipe geomé ico. La sig-
ni icación ue es ablecida pa a un p alo <0,05%.
Adicionalmen e, los da os ue on con as ados en la base de da os ExoCa -
a (www.exoca a.o g) o ien ada al abajo con esículas ex acelula es y el
so wa e lib e asociado FunchRich 2.1.1. (Func ional En ichmen Analysis Tool,
www. un ich.o g)188 pa a la elabo ación de análisis de unción y biodis ibución.
82
Capí ulo 6.
Impac o del exosoma umo al
en el anidamien o de la Célula
Tumo al Ci culan e
6.1. Ob ención de células endo eliales
6.1.1. Cul i o celula : células endo eliales
La línea celula endo elial EA.hy926 (ATCC®CRL-2922™) se empleó pa a la
ealización de ensayos de anidamien o umo al in i o. Es a línea p ocede de
la hib idación de células somá icas endo eliales de la ena umbilical con células
de la línea inmo alizada de cánce de pulmón A549. EA.hy926 ue man enida
en cul i o en medio DMEM (Gibco) al 10% de FBS, 1% ( / ) de PenS ep (Gib-
co) y en una a mós e a adecuada. El subcul i o se lle ó a cabo en diluciones
de 1:8 y ipsinización de monocapas subcon luen es.
6.1.2. Cul i o celula : células p ima ias de
ena umbilical (HUVEC)
Pa a la ob ención de células HUVEC se oma on pedazos de 10-20 cm de
co dón umbilical esco en PBS (4°C) y se dispuso a su inmedia o p ocesamien-
o. B e emen e, as e i a los ex emos de co dón y limpia en abundan e
PBS los es os de sang e e impu ezas, se dispuso a la canulación y la ado de la
ena umbilical. Una ez limpia la ena, se p ocedió al cebado de la misma con
Exosoma y anidamien o umo al
83
colagenasa 22 U/mL (Gibco) e incubación du an e 5’ a 37°C. Un sua e masajeo
a o ece á el desp endimien o de las células endo eliales. Finalizada la incu-
bación, se ecupe a on las células endo eliales en medio de cul i o comple o y
se la a on con sua idad. Las células ob enidas se decan a on (300 g, 5’, TA)
y semb a on en una placa apizada con gela ina al 0,2% (Gela in om bo ine
skin ype B G932-100G, Sigma). Se deja on adhe i las células du an e 16h y
se la a on con PBS (x3) pa a elimina células con aminan es -glóbulos ojos
mayo i a iamen e-. Una ez es abilizado el cul i o, es as células se mezcla on
con 2-3 ex acciones de HUVEC con el in de cons i ui un pool de células.
El cul i o de es as células se ealizó en Endo helial Cell Basal Medium-2
(EBM®2 CC-3156, Lonza; Walke s ille, MD, USA) suplemen ado con EGM2 Sin-
gleQuo s® (CC-4176; FBS 10 mL, hid oco isona 0,2 mL, hFGF-B 2 mL, VEGF
0,5 mL, R3-IGF-1 0,5 mL, ácido ascó bico 0,5 mL, hEGF 0,5 mL, GA-1000 0,5
mL, hepa ina 0,5 mL, Lonza) pa a un olumen de 500 mL. Las células se cul-
i a on a 37°C, 95% HR y 5% CO2. El cul i o es ablecido no se u ilizó du an e
más de 6 pases y con una dilución máxima de 1:6 en placas de cul i o p e ia-
men e a adas con gela ina 0,2% (Sigma). El medio de cul i o ue eno ado
cada 2 días.
6.2. Depleción de exosomas del sue o
Alícuo as de 500 mL de FBS (Gibco) ue on descongeladas a 4°C y cen i-
ugadas du an e 16h (100.000 g, 4°C, SW28 Beckman Coul e ) pa a la com-
ple a depleción de componen es esicula es. El sob enadan e esul an e ue
il ado (ø po o 0,22 µm, Millipo e™) y congelado a -20°C en alícuo as de 55
mL has a su uso.
No se obse a on di e encias en la iabilidad y p oli e ación celula en el
cul i o bajo depleción de exosomas pa a las líneas celula es indicadas.
Ma e iales y Mé odos
84
6.3. El exosoma en el anidamien o
umo al
6.3.1. Adhesiónaunasupe icie uncionalizada
con exosomas
Los exosomas u ilizados en es os ensayos ue on ex aídos en pa alelo
pa a ambas líneas celula es y siguiendo la u ina de aislamien o e e ida en el
apa ado M&M 5.1.2.
La adhesión de las células umo ales a los dis in os exosomas ue p ecedi-
da po el apizado de la supe icie de una placa con 30 µL de una p epa ación
de exosomas en PBS pa a cada línea celula . Es os pocillos ue on dejados se-
ca du an e 24 h y, una ez ijados los exosomas al ondo de placa, se p ocedió
a la siemb a de 1x105 células en un olumen inal de 100 µL de medio de cul-
i o comple o. La línea celula umo al co espondien e ue p e iamen e eñida
con el colo an e i al luo escen e calceína (Calcein AM C3100MP, In i ogen)
según el p o ocolo especi icado po el ab ican e. A e ec os de es anda ización
y no malización se p ocedió a comp oba la uni o midad de la señal de calceína
en odos los pocillos inmedia amen e después de la siemb a de las células u-
mo ales. T ascu idos 45’ se la a on en PBS (x3) aquellas células no adhe idas
y se egis ó la señal luo escen e de las células emanen es en un lec o de
placas (485 nm, FLUO S a Op ima, BMG Lab ech; O enbe g, AL). La acción
de células adhe idas se de e minó al no maliza la in ensidad de luo escencia
con el alo ob enido a iempo inicial. Todos los ensayos incluye on con oles
nega i os pa a los dis in os g upos.
6.3.2. Adhesión a ma iz ex acelula
Se semb a on de 1x105 células de la línea celula umo al co espondien e
eñida con el luo ó o o calceína (In i ogen) sob e los dis in os sus a os de
ma iz incluidos en el ECM Cell Adhesion A ay Ki ECM540 (Millipo eTM). Se
incuba on las células umo ales du an e 45’ y, as la ados en PBS (x3), se de-
e minó el núme o de células adhe idas en unción de la luo escencia emi ida.
Exosoma y anidamien o umo al
85
6.3.3. Adhesión a monocapas endo eliales
P ime amen e se p ocedió al cul i o de una monocapa de células de la
línea endo elial inmo alizada EA.hy926 o del cul i o p ima io de HUVEC. Se
semb a on 2x104 células endo eliales po pocillo de P96 y se dejó o ma y es-
abiliza la monocapa du an e 16-24h. El a amien o con exosomas se ealizó
en p esencia de un 2% de FBS deplecionado de exosomas du an e 8 ho as
(FBS Exo-16h, M&M 6.2).
Finalizado el a amien o, se la a on las monocapas y se añadie on 1x105
células umo ales H-ETV5 eñidas con calceína en medio comple o. Se midió la
señal de luo escencia inicial (485 nm., FLUO S a Op ima, BMG) y, as incuba
du an e 45’ y la a en PBS (x3), se de e minó el po cen aje de células adhe i-
das a la monocapa endo elial.
6.3.4. Ac i ación del endo elio con exosomas
umo ales
Pa a la de e minación de la ac i ación endo elial como espues a al a a-
mien o con exosomas se semb a on 5x104 células HUVEC o EA.hy926 en me-
dio comple o 16-24h an es de inco po a los a amien os. Los exosomas se
añadie on esuspendidos en EBM2 sin ac o es en 2% FBS Exo-16h y se in-
cuba on du an e 8h a 37°C y 5% de CO2. Pa alelamen e al a amien o con
exosomas se incluye on un con ol nega i o y posi i o de ac i ación. El con ol
posi i o ue ealizado median e el a amien o con TNFα 10 ng/mL (Human-
kine™, ecombinan , exp essed in hek 293 cells, Sigma). Acabado el a a-
mien o se la a on los pocillos en PBS (x3) y se asca on las células en p esen-
cia de una solución de lisis pa a la ex acción de RNA o al. Los lisados ue on
congelados a -80°C has a su uso.
Ma e iales y Mé odos
86
6.3.4.1. Ex acción de RNA o al de cul i o celula
La ex acción u ina ia de RNA o al de líneas celula es se ealizó con el
High Pu e RNA Isola ion Ki (Roche Applied Science; Indianapolis, IN, USA) de
acue do a las ins ucciones del ab ican e. B e emen e se p ocedió a la cap u a
de los ácidos nucleicos en memb ana, diges ión con DNasa, la ado de p o eí-
nas y o os con aminan es; y inalmen e solubilización y elución del RNA o al.
6.3.4.2. De e minación del endimien o de RNA o al
La e aluación u ina ia del RNA o al se lle ó a cabo a a és de la elación
de A260/280 en un Nanod op 2000 (The moScien i ic; Wal ham, MA, USA). Los
ácidos nucleicos p esen an su máximo de abso bancia a 260 nm lo que, a a-
és de la ley de Bee -Lambe , pe mi e incula la can idad de luz abso bida
de una mues a con su concen ación. La elación A260/280 nos pe mi i á además
es ima la pu eza de la mues a ya que p o eínas, enoles y o os con ami-
nan es p esen an una ue e abso ción a 280 nm. Una elación A260/280≈ 2,0 es
conside ada como adecuada.
6.3.4.3. Re o ansc ipción
La ansc ipción in e sa es una eacción que implica la gene ación de una
cadena de DNA complemen a io (cDNA) a pa i de una cadena simple de RNA.
Pa a ello se p ocedió a la adición de 1 µg de RNA o al de acue do a la siguien e
ó mula pa a un olumen inal de 20 µL.
• 1 µL Random Hexame s 50 µM (The moFishe . Re N8080127)
• 1 µL MulV 5000 uni s (The moFishe . Re N8080018)
• 1 µL RNAase Inhibi o (The moFishe . Re N8080119)
• 2 µL dNTP Mix 10 mM (The moFishe . Re 18427013)
• 4 µL MgCl2 solu ion 25 mM (The moFishe . Re 448224)
• 2 µL 10xPCRBu e II (The moFishe . Re 4376212)
La eacción se desa olló du an e 45’ a 42°C, seguida de 5’ a 95°C. Pa a su
almacenamien o a medio plazo se conse a on las mues as a -20°C.
Exosoma y anidamien o umo al
87
6.3.4.4. RT-qPCR
Las eacciones de RT-qPCR se lle a on a cabo en placas de 96 pocillos
pa a las sondas co espondien es (M&M 6.4. Tabla 7) incluyendo en odo caso
con oles nega i os de eacción, medidas po duplicado y un housekeeping
gene (GAPDH) con el que se no maliza on las dis in as medidas. Cada eacción
de ampli icación se cons i uyó con 9 µL de cDNA diluido 1:4 en H2O lib e de
nucleasas, 1 µL de la sonda TaqMan® co espondien e y 10 µL de la TaqMan
Gene Exp ession Mas e Mix (Applied Biosys ems). Cada eacción de RT-qPCR
se compuso de un ciclo de p eampli icación (50°C, 2’; 95°C, 10’) seguido de 40
ciclos de ampli icación (95°C, 15’’; 60°C, 1’). El equipo u ilizado ue un 7500
Real-Time PCR Sys em (Applied Biosys ems).
6.3.5. Exp esión de p o eína
6.3.5.1. Ex acción de p o eína o al
Pa a la e aluación de la exp esión p o eica en células endo eliales se p o-
cedió al semb ado de 5x105 células endo eliales y su cul i o du an e 16-24h.
El a amien o de exosomas se añadió, p e io la ado en PBS, esuspendido en
EBM®-2 al 2% de FBS Exo-16h y 1% ( / ) de PenS ep (Gibco). Una ez a a-
das las células se p ocedió a la ecogida de la p o eína o al con ayuda de un
sc ape en 60 µL de solución RIPA (T is-HCl 25 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM, 1%
NP-40, 1% DOC, 0,1% SDS) y en p esencia de inhibido es de os a asas (NaF
4 mM, NaSOV4 2 mM, Sigma P o ease Inhibi o Cock ail 1x y PMSF 1 mM). El
lisado se incubó du an e 10’ en hielo en agi ación pa a a o ece la lisis celula
y inalmen e se elimina on los es os de memb ana median e su cen i ugación
(10.000 g, 5’, 4°C). Las mues as se conse a on a -80°C has a su uso.
6.3.5.2. Cuan i icacióndep o eína o al
El mé odo u ilizado ue la cuan i icación po BCA (Bicinchoninic Acid
Solu ion B9643, Sigma). Es a cuan i icación combina la eacción de Biu e ( e-
acción de la p o eína con el ion Cu2+ en un medio alcalino pa a p oduci Cu+)
con la o mación de un complejo soluble de colo pú pu a al in e acciona el
Ma e iales y Mé odos
88
BCA con el ion Cu+ esul an e. Es e complejo exhibe una ue e abso bancia a
562 nm y su medida co elaciona obus amen e con la can idad de p o eína. La
ex apolación de es a abso bancia en unción de una ec a pa ón de BSA (Bo-
ine Se um Albimun A9418, Sigma) de concen ación conocida nos pe mi i á
la de e minación de la can idad de p o eína o al de nues o ex ac o p o eico
6.3.5.3. Wes e n blo
El Wes e n Blo es una écnica analí ica que pe mi e de ec a p o eínas es-
pecí icas den o de un ex ac o p o eico. Pa a ello, 20-40 µg de p o eína o al
ue on desna u alizados (95°C, 5’) en p esencia de solución de Laemmli 1X
(Sigma) y ca gados en un gel de SDS-poliac ilamida al 7-10%. Las mues as
se esol ie on du an e 1h a 80-120V embebidas en una solución de elec o-
o esis (T is 25mM, Glicina 192 mM, SDS 0,1% w/ ). Una ez esuel o el gel,
se ans i ie on las p o eínas a una memb ana de PVDF, p e iamen e ac i ada
en me anol, du an e 1h 30’ a 300 mA y en una solución de ans e encia (T is
25 mM, Glicina 192 mM, 20% me anol). Se iñó la memb ana con solución de
Ponceau S (0,1% w/ en 5% ácido acé ico, Sigma) y se bloqueó la memb ana
en leche al 5% en TBS-T (T is 20 mM, NaCl 500 mM, Tween 0,05%) du an e
1h. A con inuación, se p ocedió a la incubación con el an icue po p ima io co -
espondien e (M&M 6.4. Tabla 8; 16h, 4°C), la ado en TBS-T (x3, 10’, TA) e
incubación con el an icue po secunda io co espondien e en TBS-T (1h, TA) y
conjugado con la HRP (Ho se adish Pe oxidase) (M&M 6.4. Tabla 8). Una ez
inalizada la incubación y la ado el exceso (x4) de an icue po se p ocedió al
e elado del mismo median e la de ección de la señal bioluminiscen e de la
HRP (Immobilon Wes e n Blo ing, MF-Millipo e™).
6.3.6. Análisis es adís icos
La ecopilación y p ocesamien o de los da os b u os se ealizó a a és de
los paque es de so wa e de Mic oso O ice2013 pa a Windows. El análisis
es adís ico de los da os se ealizó a a és del so wa e G aphPad P ism 6.0
(G aphPad So wa es Inc; San Diego, CA, USA). La signi icación es adís ica
(p<0,05) ue de e minada po el es de Wilcoxon.
Exosoma y anidamien o umo al
89
Gen
Sonda Taqman®
Re seq
Ca ac e ización de
CTCs
HES1 Hs00172878_m1 NM_005515.1
ITGB3 Hs01001469_m1 NM_000212.2
LGALS3 Hs00173587_m1
NM_001177388.1
NM_002306.3
NOTCH1 Hs01062014_m1 NM_017617.3
PTP4A3 Hs02341135_m1 NM_007079.3
NM_116000.1
Común
GAPDH Hs99999905_m1 NM_002046.4
PTPRC Hs00894734_m1 NM_002829.3
Ca ac e ización de exosomas de cánce de endome io
ESR2 Hs01100353_m1
NM_001040275.1
NM_001214902.1
NM_00124903.1
NM_001271876.1
ETV5 Hs00231790_m1 NM_004454.2
GDF15 Hs00171132_m1 NM_004855.2
ICAM1 Hs00164932_m1 NM_000201.2
SELE Hs00950401_m1 NM_000450.2
SELP Hs00927900_m1 NM_003005.3
SNAI1 Hs00195591_m1 NM_005985.3
TGFB1 Hs00998133_m1 NM_000660.4
VCAM1 Hs01003372_m1
NM_001078.3
NM_001199834.1
NM_080682.2
ZEB1 Hs01566407_m1
NM_001128128.2
NM_001174093.1
NM_001174094.1
NM_001174095.1
NM_001174096.1
NM_030751.5
ZEB2 Hs00207691_m1
NM_001171653.1
NM_014795.3
Tabla 7. Sondas Taqman® empleadas en el es udio
6.4. Ma e iales suplemen a ios
An ígeno /Epí opo
Dilución
P o eedo
α-ac ina
1:1000
Abcam; Camb idge, UK
ALIX (NB-100-65678)
1:500
No us Biologics; Li le on, CO, USA
CD81 (sc-7637)
1:500
San a C uz Bio ech.; Dallas, TX, USA
CD9 (sc-13118)
1:500
San a C uz Bio ech.; Dallas, TX, USA
HSP90B1 (NBP1-04346)
1:500
No us Biologics; Li le on, CO, USA
VCAM1 (sc-1504)
1:500
San a C uz Bio ech.; Dallas, TX, USA
An i-Mouse HRP
1:1000
San a C uz Bio ech.; Dallas, TX, USA
An i-Goa HRP
1:1000
San a C uz Bio ech.; Dallas, TX, USA
Tabla 8. An icue pos u ilizados pa a Wes e n blo
Resul ados
96
men e. La no malización de los da os a ojó 1.810 sondas con una exp esión
supe io a 211 en al menos 8 pacien es y 2 con oles; de las cuales 853 sondas
esul a on signi ica i amen e más de ec adas en el g upo de pacien es pa a un
False Disco e y Ra e=0% y Del a=2,46. Finalmen e, sólo aquellas sondas con
un log2 a io supe io a 1,5 ue on conside adas esul ando 305 secuencias.
Aquellas sondas de ec adas únicamen e en pacien es y con una señal con o me
a los c i e ios de calidad ue on incluidas ambién en los análisis (Tablas S7 y
S8 incluidas en el CD adjun o).
Pa alelamen e, el Análisis de Componen es P incipales de los da os c ib-
ados nos pe mi e iden i ica las mues as de pacien es de NSCLC como una
población con un pe il de exp esión di e en e de las mues as de con oles
sanos (Figu a 12).
7.1.3. Biología de las CTCs EpCAM+ en NSCLC
a anzado
Pa a la in e p e ación biológica de los da os del mic oa ay se p ocedió a
su con as e con el so wa e asociado a Ingenui y Pa hway Analysis (IPA). Un
análisis uncional de los genes c ibados des aca la p esencia signi ica i a de
unciones inculadas al mo imien o celula , la supe i encia y el desa ollo,
el c ecimien o y p oli e ación celula es (Tabla 9). Podemos obse a a su ez
cómo es as unciones apa ecen undamen almen e o ques adas po las u as
PI3K/AKT, ERK1/2 y NFkB siendo NOTCH1 un componen e des acado den o de
es a ed uncional (Figu a 13).
Figu a 12. Análisis de Componen es
P incipales pa a las mues as incluidas
en el mic oa ay. Las mues as p oceden es
de pacien es de NSCLC (n=10) p esen an
un pe il de exp esión di e en e espec o al
iden i icado en con oles sanos (n=4).
Ca ac e ización de CTCs en NSCLC
97
Figu a 13. Red de in e acción
pa a las unciones de
mo imien o, desa ollo,
c ecimien o y p oli e ación
celula es con enidas en el
mic oa ay de exp esión de
CTCs de NSCLC. NOTCH1
apa ece como uno de los
genes o ques ando es a ed de
in e acción.
Pa alelamen e, un análisis on ológico po GeneCodis3 des aca la p esencia
de secuencias implicadas en p ocesos de adhesión celula , desa ollo y la o ga-
nización de la ma iz ex acelula además de una ac i a unción de anspo e
y ansducción de señales (Tabla 10).
Ca ego ía
Función
Moléculas
p alo
Mo imien o celula
Mig ación de
células umo ales
Ak , CCL19, CD3, CDX1, ERK1/2, ITGB3, KRT8,
LGALS3, MUC4, NFkB, NOTCH1, P38, MAPK,
PI3K, PTP4A3, SENP1, SPHK1
5,90x10
-6
Mo imien o de las
células umo ales
Ak , CCL19, CD3, CDX1, ERK1/2, ITGB3, Jnk,
KRT8, LGALS3, MUC4, NFkB, NOTCH1, P38,
MAPK, PI3K, PTP4A3, SENP1, SPHK1
3,74x10
-5
Mue e celula y
supe i encia
Nec osis
Ak , APOL1, ATM, CCL19, CD3, CDX1, DIABLO,
DNM1, ERK1/2, IgG, In e e ón α, ITGB3, Jnk,
KRT8, LGALS3, MAP3K10, MUC4, NFkB,
NGFRAP1, NOTCH1, P38 MAPK, PI3K, PTAFR,
SENP1, SLC6A3, SPHK1
8,24x10
-5
Desa ollo celula ,
c ecimien o y
p oli e ación celula ,
desa ollo de ejidos
P oli e ación de
células epi eliales
Ak , C8o 44-SGK3/SGK3, ERK1/2, ITGB3,
NOTCH1, PI3K, PTAFR, SPHK1
9,55x10
-5
Tabla 9. Funciones signi ica i amen e ep esen adas en el pe il de exp esión de CTCs
pa a NSCLC a anzado
Resul ados
98
Figu a 14. Exp esión de NOTCH1
y HES1 en CTCs de NSCLC. A) La
exp esión de NOTCH1 en pacien es
de NSCLC (n=42) se encuen a
signi ica i amen e inc emen ada espec o
a con oles sanos (n=16). B) La exp esión
de HES1 se encuen a inc emen ada en
pacien es de NSCLC (n=42) en e a
con oles (n=16). C) HES1 en CTCs
co elaciona signi ica i amen e con la
exp esión de NOTCH1 (n=42). Señal
no malizada a PTPRC.
Función Moléculas p alo
T ansducción de
señales
MAP3K10, TNR, CSNK1E, CASKIN1, MAP3K6, MCC,
PLEKHG5, SPHK1, ARGHGAP33, P2RX1, CLTCL1, CHRNA4,
GPSM1, ATM, CHKA
<0,01
T anspo e
ansmemb ana
HCN2, SLC14A2, SLC26A1, SLC11A1, KCNH3, MFSD10,
SLC24A16, SLC6A3, SLC39A5, SFXN5 <0,05
Adhesión celula
TNR, COL11A2, PDZD2, CASS4, KIRREL2, SORBS3, GP9,
MUC4, PGM5 <0,05
Di e enciación
celula MDFI, NHLH2, CATSPERG, NKX2.5, LGALS3, GPSM1, SCXA <0,05
Desa ollo
emb iona io MDFI, FOXP3, NOTCH1, DLK1 <0,05
O ganización de la
ma iz ex acelula TNR, OLFML2A, APBB2, LGALS3 <0,05
Tabla 10. Funciones des acadas en el pe il de exp esión de CTCs po GeneCodis3
Finalmen e, la ac i ación de NOTCH1 en nues as mues as en iquecidas
en CTCs de pacien es de NSCLC ue con i mada po RT-qPCR (p alo <0,001;
Figu a 14A). Asimismo, la exp esión de HES1, un gen e ec o down-s eam en
la u a de No ch1, esul ó signi ica i amen e inc emen ada en pacien es (p a-
lo =0,041; Figu a 14B) es ableciéndose una co elación posi i a con los ni eles
de exp esión de NOTCH1 (p alo =0,003; Figu a 14C). Es os esul ados con i -
man la ele ancia de NOTCH1 en el pe il de exp esión de las CTCs en NSCLC.
Ca ac e ización de CTCs en NSCLC
99
7.1.4. Validación del mic oa ay de exp esión
génica po RT-qPCR
Pa alelamen e a la e aluación de la unción biológica de NOTCH1 se p oce-
dió a la alidación del pe il de exp esión génica pa a CTCs EpCAM+ en pacien-
es con NSCLC a anzado. Pa a ello, se de e minó la exp esión pa a un núme o
limi ado de genes candida o inc emen ados signi ica i amen e en mues as de
pacien es de NSCLC y inculados a la ed de NOTCH1 po IPA. Los genes ana-
lizados ue on LGALS3 (Lec in Galac oside-Binding Soluble 3), ITGB3 (In eg in
be a 3) y PTP4A3 (P o ein y osine phospha ase ype IVA 3). El análisis de la
señal po RT-qPCR con i ma un inc emen o de exp esión signi ica i o pa a los
genes seleccionados compa ado en compa ación con las mues as p oceden es
de con oles sanos (Figu as 15A, 15B y 15C).
Figu a 15. Validación del pe il de exp esión
génica de CTCs EpCAM+ en NSCLC y
unción de la u a de NOTCH1. LGALS3 (p
alo <0,001), ITGB3 (p alo <0,05) y PTP4A3
(p alo <0,01) p esen an una exp esión
di e encial en CTCs EpCAM+ de pacien es de
NSCLC (n=42) en e a con oles sanos (n=16)
po RT-qPCR.
Resul ados
100
7.2. La inhibición de No ch p e iene la
p oli e ación en ausencia de sus a o
Con el in de con i ma la in luencia de la u a de No ch en la supe i en-
cia y p oli e ación de las CTCs que da án luga a las me ás asis se p ocedió a
e alua la capacidad de p oli e a en ausencia de sus a o de la línea celula
de adenoca cinoma A549 en p esencia de un po en e inhibido de la u a de
No ch, el inhibido de γ-sec e asa DAPT.
El a amien o con DAPT ue capaz de educi de mane a signi ica i a la
p oli e ación en ausencia de sus a o in i o de es as células a dis in as con-
cen aciones demos ando la in luencia de la u a de No ch en la colonización
celula (p alo =0,031; Figu a 16).
7.3. Valo p onós ico de los
bioma cado es alidados
Con el obje i o de p o undiza en la u ilidad clínica de las CTCs inmu-
noaisladas en pacien es con NSCLC a anzado, el pe il de exp esión de CTCs
nos p opo cionó de una se ie de po enciales ma cado es pa a el diagnós ico y
p onós ico clínico. Pa a ello, de inimos un g upo de mal p onós ico pa a cada
bioma cado den o de nues a coho e de pacien es compues o po el 33% de
los pacien es (n=14) con la señal más al a po RT-qPCR pa a la elación ma -
ke -PTPRC.
Figu a 16. Inhibición de No ch en A549. El
a amien o con el inhibido de No ch DAPT
es capaz de disminui signi ica i amen e la
p oli e ación en ausencia de sus a o de la línea
de cánce de pulmón A549 (n=6).
Ca ac e ización de CTCs en NSCLC
101
El análisis de Cox uni a ian e pe mi ió iden i ica capacidad p onós ico
pa a Supe i encia Lib e de P og esión (PFS) en NOTCH1 (p alo =0,034),
PTP4A3 (p alo =0,003), LGALS3 (p alo =0,044) e ITGB3 (p alo =0,046);
del mismo modo pa a ITGB3 y Supe i encia Global (OS) (p=0,006) (Tabla 11,
panel supe io ). GAPDH, un ma cado indi ec o de la ca ga umo al, p esen a
consecuen emen e alo clínico en la p edicción de PFS (p alo =0,001) y OS
(p alo =0,001) (Tabla 11, panel supe io ).
Del mismo modo, el con as e con algunas las a iables clínicas más im-
po an es nos pe mi ió iden i ica la p esencia de me ás asis óseas como la
única a iable clínica con alo p onós ico den o de nues a co e de pacien es
(p alo =0,014). La a iable Es ado Funcional (del inglés, Pe o mance S a-
us), conside ada la a iable clínica con mayo po encia p onós ica en cánce
de pulmón, mues a un alo ce cano a la signi icación (p alo =0,055) pa a
OS (Tabla 11, panel in e io ).
Sup. lib e de p og esión
Supe i encia global
Análisis de Cox uni a ian e
RR (95% IC)
p alo
RR (95% IC)
p alo
GAPDH
(mal s. buen p onós ico)
5,71 (2,4-13,4)
<0,001
9,11 (3,5-23,9)
<0,001
NOTCH1
(mal s. buen p onós ico)
2,11 (1,0-4,2)
0,034
1,16 (0,6-2,4)
0,689
PTP4A3
(mal s. buen p onós ico)
3,10 (1,5-6,5)
0,003
1,45 (0,7-3,0)
0,305
LGALS3
(mal s. buen p onós ico)
2,03 (1,0-4,0)
0,044
1,60 (0,8-3,2)
0,193
ITGB3
(mal s. buen p onós ico)
2,02 (1,0-4,0)
0,046
2,74 (1,3-5,6)
0,006
Es ado Funcional
(PS2-3 s. PS0-1)
1,67 (0,7-3,9)
0,236
1,56 (0,7-3,6)
0,055
Sexo
(homb e s. muje )
1,11 (0,5-2,4)
0,792
1,08 (0,4-2,6)
0,863
His ología
(escamoso s. adenoca cinoma)
1,45 (0,7-3,0)
0,319
1,08 (0,5-2,4)
0,847
Es adio pa ológico
(IIIA/IIIB s. IV)
1,08 (0,4-2,6)
0,859
1,13 (0,4-2,9)
0,803
T
(T3/T4 s. T0/T1/T2)
1,52 (0,8-3,0)
0,234
1,00 (0,5-2,1)
0,990
N
(N3 s. N0/N1/N2)
1,72 (0,9-3,3)
0,101
1,37 (0,7-2,7)
0,364
Nº de me ás asis
(≥2 s. <2)
1,37 (0,7-2,6)
0,359
1,78 (0,9-3,7)
0,118
Me ás asis óseas
(Sí s. No)
2,39 (1,2-4,8)
0,014
1,82 (0,9-3,7)
0,096
HR: Riesgo Rela i o; CI: In e alo de con ianza.
Tabla 11. Análisis de Cox uni a ian e pa a los ma cado es de CTCs y pa áme os
clínico-pa ológicos
Resul ados
102
Figu a 17. Cu as Kaplan-Meie pa a los
ma cado es de CTCs alidados (GAPDH,
NOTCH1, PTP4A3, LGALS3 e ITGB3)
en NSCLC pa a Supe i encia Lib e de
P og esión: G upos de mal p onós ico pa a
cada ma cado de inidos como el 33% de los
pacien es con mayo exp esión po RT-qPCR
(n=14). G upo de baja exp esión (n=28)
compues o po el 77% de los pacien es
es an es pa a un o al de 42 pacien es.
Valo es de exp esión pa a cada ma cado
no malizados a la exp esión de PTPRC.
IC: in e alo de con ianza.
Asimismo, las cu as Kaplan-Meie con i man el alo p onós ico de
NOTCH1, PTP4A3, LGALS3, ITGB3 y GAPDH pa a PFS (Figu a 17); y de GAPDH
e ITGB3 pa a OS (Figu a S1. Ma e ial Supl. 8.6).
Ca ac e ización de CTCs en NSCLC
103
Finalmen e, el análisis mul i a ian e del panel de bioma cado es con la
p esencia de me ás asis óseas -como única a iable clínica con alo p onós i-
co en nues a coho e- o o ga un alo p onós ico independien e de PFS pa a
GAPDH, NOTCH1 y PTP4A3; del mismo modo que GAPDH e ITGB3 pa a OS
(Tabla 12).
A aíz de es os esul ados, se p ocedió a la ealización de un análisis de
eg esión logís ica pa a el panel de bioma cado es con el in de e alua su alo
clínico pa a p og esión emp ana (<4 meses) en NSCLC. La composición en el
modelo de GAPDH, PTP4A3 y NOTCH1 p esen a el mayo alo p onós ico den-
o de nues a coho e de pacien es (AUROC= 0,772; Figu a 18).
Supe i encia lib e de
p og esión
Supe i encia global
Análisis de Cox mul i a ian e
RR (95% IC)
p alo
RR (95% IC)
p alo
GAPDH
GAPDH
(mal s. buen p onós ico)
Me ás asis ósea
(Sí s. No)
5,67 (2,1-15,6)
1,16 (0,5-2,7)
0,001
0,727
10,29(3,4-30,7)
0,74 (0,3-1,8)
<0,001
0,503
NOTCH1
NOTCH1
(mal s. buen p onós ico)
Me ás asis ósea
(Sí s. No)
2,20 (1,1-4,4)
2,48 (1,2-5,0)
0,027
0,011
1,22 (0,6-2,5)
1,86 (0,9-3,7)
0,582
0,087
PTP4A3
PTP4A3
(mal s. buen p onós ico)
Me ás asis ósea
(Sí s. No)
3,17 (1,5-6,7)
2,45 (1,2-4,9)
0,002
0,012
1,57 (0,8-3,2)
1,92 (0,9-3,9)
0,222
0,073
LGALS3
LGALS3
(mal s. buen p onós ico)
Me ás asis ósea
(Sí s. No)
1,93 (0,9-3,9)
2,29 (1,1-4,6)
0,067
0,021
1,59 (0,8-3,2)
1,81 (0,9-3,7)
0,204
0,101
ITGB3
ITGB3
(mal s. buen p onós ico)
Me ás asis ósea
(Sí s. No)
1,72 (0,8-3,5)
2,12 (1,0-4,3)
0,134
0,040
2,72 (1,3-5,6)
1,59 (0,8-3,3)
0,007
0,211
RR: Riesgo ela i o; IC: In e alo de con ianza.
Tabla 12. Análisis de Cox mul i a ian e pa a los ma cado es de CTCs y p esencia de
me ás asis óseas
Figu a 18. Modelo de eg esión logís ica
pa a los ma cado es de CTCs en NSCLC. La
combinación de GAPDH, NOTCH1 y PTP4A3
ep esen a el mejo ajus e al modelo den o de
nues a coho e (n=42).
Resul ados
104
Adicionalmen e, la de inición de una a iable compues a po inc emen o de
alguno de es os es bioma cado es de CTCs incluidos en el modelo y con alo
p onós ico independien e nos pe mi e de e mina su alo p onós ico pa a PFS
y OS po Kaplan-Meie (Figu a 19); del mismo modo que un análisis de Cox
mul i a ian e en combinación con la p esencia de me ás asis óseas iden i ica
su alo p onós ico independien e pa a PFS y OS (Tabla 13).
Figu a 19. Cu as Kaplan-Meie pa a PFS y OS y la acumulación de bioma cado es
de CTCs incluidos en el modelo de eg esión logís ica. Va iable cons uida en unción de
la p esencia de algún bioma cado en el g upo de mal p onós ico. G upo de mal p onós ico
de inido como el 33% de las exp esiones más al as pa a cada bioma cado en la coho e de
42 pacien es de NSCLC. A) Pacien es con algún ma cado p onós ico ele ado p esen an una
SFP signi ica i amen e meno . B) OS pa a aquellos pacien es con alguno de los ma cado es
de CTCs ele ados es signi ica i amen e in e io a aquellos que no p esen an alo es de
exp esión en el g upo de mal p onós ico pa a alguno de los bioma cado es.
Supe i encia lib e de
p og esión Supe i encia global
Análisis de Cox mul i a ian e RR (95% IC) p alo RR (95% IC) p alo
Acumulación de bioma cado es*
Bioma c. de CTC (1,2 o 3 al os s. ninguno)
Me ás asis ósea (Sí s. No)
3,06 (1,5-6,3)
2,22 (1,1-4,5)
0,002
0,028
2,33 (1,1-4,8)
1,91 (0,9-3,9)
0,022
0,077
*Acumulación pa a los bioma cado es de CTCs GAPDH, NOTCH1 y PTP4A3 de inidos en el modelo de eg esión
logís ica y con alo p onós ico independien e. Exp esión al a pa a cada ma cado indi idual cuando incluida en el
pe cen il 33 más al o pa a la coho e de 42 pacien es de NSCLC. RR: Riesgo ela i o; IC: In e alo de con ianza.
Tabla 13. Análisis de Cox mul i a ian e pa a la acumulación de ma cado es de CTCs y
p esencia de me ás asis óseas
105
Capí ulo 8.
Ca ac e ización de exosomas de
HEC-1A y H-ETV5 e in luencia en el
anidamien o umo al al endo elio
8.1. Ob ención de exosomas de cánce
de endome io
Las esículas ex acelula es y su unción han demos ado en los úl imos
años ep esen a un abo daje p ome edo en el es udio y manejo de dis in as
en e medades. Ac ualmen e el abajo con exosomas es á condicionado po
una se ie de limi aciones écnicas y de manejo que di icul an el es ablecimien-
o de una u ina de abajo es ánda . A es a si uación se une a menudo una
e minología con usa e imp ecisa que di icul a la de inición de las dis in as sub-
poblaciones de EVs. Exis en, sin emba go, unas di ec ices p opues as po la
Sociedad In e nacional pa a las Vesículas Ex acelula es (ISEV) ampliamen e
acep adas y que p e enden aco a el abajo con esículas ex acelula es158,162.
De acue do a es as di ec ices los exosomas ue on ca ac e izados desde
es ap oximaciones dis in as: 1) La obse ación di ec a po mic oscopia elec-
ónica TEM de exosomas en e os. 2) La de ección de de e minadas p o eínas
e e encia cuya p esencia apa ece en iquecida / disminuida en las p epa acio-
nes de exosomas. 3) La e aluación de u ina de la concen ación y dis ibución
de amaño de los aislados de exosomas de aco de a unos pa áme os es able-
cidos.
Resul ados
112
Figu a 28. P oli e ación de HEC-
1A y H-ETV5 a concen aciones
dec ecien es de L-A ginina y L-Lisina.
Concen aciones de pa ida s anda d pa a
medios de cul i o de u ina L-A g (84
mg/L) y L-Lys (148 mg/L).
Figu a 27. Ca ac e ís icas eno ípicas HEC-1A y H-ETV5 du an e el ma caje SILAC.
La u ilización de eac i os SILAC no a ec a a las ca ac e ís icas mic oscópicas de las células.
La línea célula H-ETV5 man iene un eno ipo mesenquimal de i ado de EMT.
8.4.1. Fase de adap ación
La ealización de SILAC implica el uso de eac i os especí icos en los
que se ha ealizado la depleción de los aminoácidos na u ales L-Lys y L-A g.
Es os aminoácidos esenciales debe án se añadidos de mane a ex e na.
Como e leja la Figu a 27 la u ilización de los eac i os especí icos de SILAC
no p o ocó al e ación en las ca ac e ís icas eno ípicas y de p oli e ación.
Pa alelamen e, el exceso de L-Lys y L-A g ue p e is o median e el ajus e
de la can idad disponible de es os aminoácidos. La p oli e ación de ambas
líneas a concen aciones dec ecien es de es os aminoácidos de e minó las
concen aciones de 28 mg/L pa a L-A g y 73 mg/L pa a L-Lys, una dilución
1/3 y ½ de las concen aciones o iginales, como concen aciones su icien es
pe o no excesi as pa a el ma caje de las líneas po SILAC (Figu a 28).
Ca ac e ización de exosomas po SILAC
113
8.4.2. Fase expe imen al
Una ez es ablecidas las condiciones de ma caje y acondicionadas
las células a es as se p ocedió a la inco po ación del ma caje me abólico
median e su inco po ación al medio de cul i o. Se puede obse a como
ambas líneas p oli e an con no malidad independien emen e del ma caje
inco po ado (Figu a 29A).
T anscu idos 8 ciclos de di isión se omó de una mues a del p o eoma
pa a la de e minación de la e iciencia del ma caje po LC-MS. Los esul ados
nos pe mi en con i ma un ma caje ap oximado del 98% pa a ambas líneas
celula es (Figu a 29B; no mos ado pa a H-ETV5). Hecho es o, se p ocedió
a la ob ención de las dis in as acciones de p o eoma, sec e oma soluble y
exosoma pa a su análisis po LC-MS de acue do a los p o ocolos e e idos.
8.4.3. Análisis de las mues as de p o eoma,
sec e oma y exosoma
Ex aídas las dis in as acciones se p ocedió a ce i ica su es ado medi-
an e su inción con ni a o de pla a (Figu a 30). A con inuación, de p ocedió
a su análisis po LC-MS/MS de acue do a los p o ocolos especi icados en el
apa ado M&M 5.3.4. En el caso de las mues as de exosomas se p ocedió
adicionalmen e al análisis conjun o de las acciones p oceden es de HEC-1A
hea y / H-ETV5 middle (Figu a 30, Gel C).
Figu a 29. Ma caje pa a SILAC. A) HEC-1A y H-ETV5 p oli e an con no malidad
independien emen e del ma caje inco po ado. B) T anscu idos 8 ciclos de di isión la
e iciencia del ma caje con L-Lys y L-A g se ap oxima a la uni o midad pa a una mues a de
p o eoma de HEC-1A.
Resul ados
114
De acue do a lo e e ido en el apa ado de M&M, p e io a su lanzamien-
o, los sec e omas solubles ue on deplecionados comple amen e de exoso-
mas po ul acen i ugación du an e 16h (100.000 g, 4°C) (M&M 5.3.3.3).
Pa alelamen e se ealizó una depleción de exosomas menos ag esi a (90’)
en el caso de que la p o eína del sec e oma pudie a esul a al e ada en una
cen i ugación an in ensa. En la Figu a 30 (Gel B) podemos e el pe il de
p o eína pa a las mues as hea y una ez deplecionados y concen ados los
sec e omas pudiendo conclui que los sec e omas no se en signi ica i a-
men e al e ados du an e el p oceso de ul acen i ugación. Finalmen e se
p ocedió al lanzamien o y análisis de las dis in as mues as de acue do a los
c i e ios mencionados (M&M 5.3.4.).
8.4.3.1. P o eínas moduladas pa a el p o eoma
Un análisis de allado po FunRich de las p o eínas iden i icadas en el
p o eoma celula de ambas líneas (453 e en os. Tabla S9. Disponible en el
CD adjun o) mues a un en iquecimien o en p o eínas de localización ci o-
plasmá ica (>60%) o nuclea (49%; no mos ado).
Figu a 30. Geles de poliac ilamida eñidos con ni a o de pla a pa a las dis in as
acciones de p o eoma (A), sec e oma soluble (B) y exosoma (C). No se obse an
di e encias en el pe il p o eico de las mues as de sec e oma con una depleción de esículas
ex acelula es de 90’ y aquellas deplecionadas de esículas ex acelula es du an e 16 ho as.
Ca ac e ización de exosomas po SILAC
115
De en e las p o eínas moduladas en el p o eoma se encon a on 44
p o eínas signi ica i amen e up- eguladas en H-ETV5 mien as que 34 e-
sul a on signi ica i amen e moduladas en sen ido opues o (M&M 8.6. Tablas
S1 y S2). De en e las p o eínas signi ica i amen e moduladas en H-ETV5
encon amos p o eínas inculadas a p ocesos de glicolisis / gluconeogénesis
además de la modulación posi i a de DHRS2 -o Hep27- del mismo modo al
iden i icado po Monge y colabo ado es189 con an e io idad. En es e sen ido,
la modulación posi i a de DHRS2 ha demos ado una ac i idad p o ec o a
a la apop osis inducida po es és median e la es abilización de p53/TP53.
Consecuen emen e, encon amos la modulación de dis in os genes incu-
lados a espues a a es és (HS90AA1, HS90AB1, HSPA4, HSPD1, HSPA9,
HSPA8). Finalmen e, somos capaces de iden i ica ambién la p esencia de
dis in as ci oque a inas (KRT18, KRT19, KRT7, KRT8) cuya exp esión se en-
cuen a inc emen ada en HEC-1A, algo en consonancia con su eno ipo.
8.4.3.2. P o eínas moduladas pa a el sec e oma
El análisis de los sec e omas deplecionados de exosomas pe mi ió la
iden i icación de 512 p o eínas (Tabla S10. Disponible en el CD adjun o).
Del o al de iden i icaciones 166 de ellas ue on localizadas simul áneamen-
e en el p o eoma y en el sec e oma (Figu a 31A). Como es de espe a , de
en e las p o eínas iden i icadas exclusi amen e en el p o eoma y aquellas
Figu a 31. Pe il p o eico del sec e oma soluble de HEC-1A y H-ETV5 po SILAC.
A) Núme o de e en os iden i icados pa a cada una de las acciones e iden i icaciones en
común. B) Dis ibución celula de las p o eínas iden i icadas de mane a exclusi a en el
p o eoma o el sec e oma.
Resul ados
116
exclusi as del sec e oma encon amos un en iquecimien o en cuan o su dis-
ibución celula cuando analizado po FunRich. Mien as que las p o eínas
iden i icadas de mane a exclusi a en el p o eoma ienen un pe il p e e-
en emen e ci oplasmá ico y nuclea , la acción del sec e oma mues a un
en iquecimien o en p o eínas de localización ex acelula (Figu a 31B).
Se iden i ica on 35 p o eínas moduladas posi i amen e en H-ETV5 apa-
eciendo únicamen e 3 de ellas en e las moduladas en el p o eoma (TPI1,
TCP1 y AHCY). De en e las moduladas en el sec e oma de HEC-1A se iden-
i ica on 76 p o eínas signi ica i amen e up- eguladas en el sec e oma,
apa eciendo únicamen e FLNA en e las modulaciones del p o eoma (M&M
8.6. Tablas S3 y S4). El análisis de las p o eínas moduladas posi i amen e
pa a H-ETV5 e ela la p esencia signi ica i a de moléculas inculadas a la
ed “Cell dea h & Su i al” (p alo =1,86x10-2 – 2,67x10-6; Figu a 32A) en
consonancia con las obse aciones ealizadas en el p o eoma. A endiendo
a aquellas p o eínas que apa ecen moduladas pa a el sec e oma de HEC-
1A (M&M 8.6. Tabla S4), un análisis o ien ado a la búsqueda de u as mo-
lecula es ep esen adas des aca la señalización y emodelación de uniones
adhe en es a a és de la u a de ILK (In eg in-linked kinase; Figu a 32B).
Figu a 32. P o eínas moduladas posi i amen e en el sec e oma. A) Red de in e acción
pa a la unción Cell dea h & Su i al de en e las p o eínas moduladas posi i amen e en
el sec e oma de H-ETV5 po IPA. 21 moléculas implicadas en la ed (28%). B) Funciones
des acadas de en e las p o eínas moduladas posi i amen e en el sec e oma de HEC-1A po
IPA.
Ca ac e ización de exosomas po SILAC
117
8.4.3.3. P o eínas moduladas pa a el exosoma
Pa a el análisis de las p o eínas moduladas en el exosoma se p ocedió
adicionalmen e a la ealización de un swi ch del ma caje. Se analiza on po
an o 4 mues as: HEC-1A middle, HEC-1A hea y, H-ETV5 middle y H-ETV5
hea y (M&M. 5.3.1.).
El o al de p o eínas iden i icadas en las mues as de exosomas es de
119. De las cuales 56 de ellas iden i icadas en ambos ma cajes de mane a
independien e, es ando a su ez el 88.9% de ellas iden i icadas como p o-
eínas de localización exosomal po FunRich. De en e el o al de iden i ica-
ciones (Tabla S11. Disponible en el CD adjun o), 16 p o eínas se de ec a on
de mane a conjun a en ambos ma cajes de exosomas y ausen es en el
sec e oma (Tabla 14). Des aca la p esencia en es e g upo de es e aspa-
ninas (CD9, CD63 y CD81) ecuen emen e u ilizadas como ma cado es de
memb ana pa a p epa aciones de exosomas; y de PCD6IP como ma cado
ci osólico de exosomas. Encon amos ambién la p esencia de EpCAM, el
cual ha sido p opues o en ocasiones como ma cado de esículas ex ace-
lula es y como p o eína a pa i de la cual lle a a cabo el en iquecimien o
de EVs en medios condicionados y líquidos biológicos de mane a simila a
como se iene ealizando en el abajo con CTCs. Cohe en emen e, den o
de es as iden i icaciones no apa ece HSP90B1, el cual se u iliza como con-
ol nega i o de aislados de exosomas y que sí apa ece iden i icado en el
p o eoma.
A endiendo a las p o eínas encon adas moduladas se iden i ica on 10
p o eínas up- eguladas en el exosoma de H-ETV5; de las cuales CLTC y
CCT2 se iden i ica on ambién de en e las moduladas en el p o eoma. No
se iden i ica on modulaciones coinciden es en e el exosoma de H-ETV5 y su
sec e oma. Pa alelamen e se iden i ica on 21 p o eínas como up- eguladas
en el exosoma de HEC-1A (M&M 8.6. Tablas S5 y S6) habiendo sido ANXA1
iden i icada ambién como modulada en el p o eoma . Adicionalmen e, 13 de
ellas se iden i ica on ambién como moduladas pa a el sec e oma de HEC-
1A (TNC, NID2, TINALGL1, LGALS3BP, HSPG2, VCAN, LAMA5, COL18A1,
LAMC1, ACTG1, AGRN, TUBA1B y EZR).
Resul ados
118
Símbolo Nomb e Función
De ección en
exosomas* Obse aciones
CD63 CD63 an igen Mig ación. T ansp.
endosomal
CRC, mel,
P os
Ma cado de
exosomas
CD81 CD81 an igen Modulación inmune.
P oli e ación.
CRC, Blad,
mel, P os ,
OV, Asc
Ma cado de
exosomas
CD9 CD9 an igen Modulación inmune.
Mig ación. In asión.
CRC, Asc, mel,
OV, P os
Ma cado de
exosomas
EPCAM
Epi helial cell
adhesión
molecule
Adhesión. P oli e ación CRC, Asc, OV,
P os
Ma cado de
exosomas
FTH1 Fe i in hea y
chain
T anspo e esicula pos -
Golgi. HCC, OV
HIST1H2AA His one H2A Es abilización del DNA -
Ma cado
esículas
apop ó icas
ITGA3 In eg in alpha-3 Adhesión. In asión CRC, Blad, mel,
OV, P os
In e acciona
con CD9, ITGB1
ITGB1 In eg in be a-1
Adhesión célula-célula y
con la ma iz ex acelula .
Mig ación. P oli e ación.
CRC, HCC, mel,
OV, P os
LYZ Lysozyme C Ci ólisis. Respues a
in lama o ia. CRC
MFGE8 Lac adhe in Adhesión. Angiogénesis.
Fagoci osis
CRC, mel, HCC,
Blad, OV, P os
MVP Majo aul
p o ein P oli e ación. CRC, HCC, mel,
OV
PCD6IP
P og ammed
cell dea h 6-
in e ac ing
p o ein
C ecimien o umo al CRC, HCC, me,
OV, P os
Ma cado de
exosomas
PTGFRN
P os aglandin
F2 ecep o
nega i e
egula o
T anspo e ans-Golgi CRC, HCC, mel,
OV, P os
Vinculada a
CD9, CD63 y
CD81
RPL6 Ribosomal
p o ein 60S Complejo ibosomal CRC, HCC, mel
SDCB1 Syn enin-1 In asión CRC, mel Sec eción de
exosomas
SLC1A5
Neu al amino
acid anspo e
B (0)
T anspo ado de
amino-ácidos
CRC, mel, OV,
P os
* Moléculas iden i icadas con an e io idad en exosomas umo ales de dis in a na u aleza po ExoCa a. CRC: Cánce
colo ec al; mel: Melanoma; HCC: Ca cinoma hepa ocelula ; Blad: Cánce de ejiga; OV: Cánce de o a io; P os :
Cánce de p ós a a; Asc: Asci is.
Tabla 14. P o eínas iden i icadas po SILAC en ambas p epa aciones de exosomas y
ausen es en el sec e oma
Ca ac e ización de exosomas po SILAC
119
Un análisis uncional po IPA de las p o eínas moduladas posi i amen e
pa a H-ETV5 iden i ica las unciones “Cell dea h & su i al” como la un-
ción más des acada (p alo = 4,60x10-2 – 9,63x10-5) en consonancia con
el pe il ob enido pa a el p o eoma y el sec e oma. Finalmen e, la búsque-
da po IPA de u as signi ica i amen e ep esen adas en e las p o eínas
up- eguladas en HEC-1A nos emi e a la unción Tissue & Cell mo phology
(p alo =1,05x10-10–3,25x10-4) aludiendo a una mo ología ano mal de la
memb ana basal y al mo imien o e in asión umo al (Tabla 15). Además,
un análisis uncional po GeneCodis3 pe mi e iden i ica que más de la mi ad
de las modulaciones posi i as pa a HEC-1A es án di ec amen e inculadas a
p ocesos de adhesión (p alo = 2,82x10-9).
De en e las p o eínas iden i icadas como moduladas posi i amen e
pa a el exosoma de HEC-1A se selecciona on 7 de ellas pa a su alidación
po MRM (Mul iple Reac ion Moni o ing) en plasma en una coho e de 85
pacien es de cánce de endome io. Adicionalmen e, las e aspaninas C9,
CD63 y CD81; y EpCAM se incluye on como ma cado es de exosomas y no -
malizado es in e nos del con enido exosomal.
Ca ego ía
Función
Moléculas
p alo
Mo ología y
desa ollo isula
Mo ología ano mal de la
memb ana basal
COL18A1, HSPG2, ITGA3, LAMC1,
NID1
1,05x10-10
Fo mación de la memb ana basal
HSPG2, LAMB1, LAMC1, NID1
7,77x10-9
Mo imien o y
mo ología celula
Mo imien o de las células
umo ales
COL18A1, EZR, ITGA3, LAMA5,
TNC, VCAN
5,32x10-9
In asión celula
ANXA1, ANXA2, COL18A1, EZR,
ITGA3, LAMA5, LAMC1, TNC, VCAN
3,29x10-7
Sp ou ing
AGRN, ANXA2, COL18A1, EZR,
HSPG2, ITGA3, TNC
1,44x10-7
Tabla 15. Funciones incluidas en la ed Tissue & Cell Mo phology po IPA
Resul ados
120
8.5. In luenciadelexosomaenel
anidamien o umo al
8.5.1. Adhesión de las células umo ales a
exosomas
El análisis p o eico po SILAC de los exosomas di e encia en e un pe il
adhesi o en los exosomas p oceden es de HEC-1A en e a un pe il o ien-
ado a la supe i encia e in asión en los aislados de exosomas de H-ETV5.
La uncionalización en placa con exosomas nos pe mi e obse a cómo
el exosoma es un e lejo del eno ipo de la célula de la que p ocede. El
p oceso de EMT en HEC-1A de i a en un eno ipo con una g an mo ilidad
-H-ETV5- pe o que po el con a io e disminuida su capacidad de adhesión
signi ica i amen e (p alo =0,031; Figu a 33A). Asimismo, mien as que
la uncionalización de una supe icie de cul i o con exosomas de HEC-1A
es capaz de a o ece la adhesión celula (p alo =0,031; Figu a 33A). La
uncionalización con exosomas de H-ETV5 no es capaz de inc emen a su
p opia adhesión (p alo =0,562). Es a obse ación no es línea-especí ica,
sino que la uncionalización con exosomas de HEC-1A es capaz de a o ece
la adhesión de la línea poco adhesi a H-ETV5 (p alo = 0,031; Figu a 33B).
Po el con a io, la uncionalización con exosomas de H-ETV5 es capaz de
disminui la adhesión de la línea HEC-1A (p alo = 0,031; Figu a 33B) .
Figu a 33. E ec o del exosoma en la adhesión de las células umo ales de CE. A) El
p oceso de EMT disminuye la capacidad de adhesión de HEC-1A (n=6). El exosoma de
HEC-1A inc emen a la adhesión de la célula umo al (n=6). B) El exosoma de HEC-1A es
capaz de inc emen a la adhesión de la línea mesenquimal H-ETV5 (n=6).
El exosoma en el anidamien o umo al
121
Figu a 34. Adhesión de HEC-1A y
H-ETV5 a componen es de la ma iz.
H-ETV5 p esen a mayo capacidad de
adhesión que HEC-1A a componen es de
la ma iz ex acelula (n=2). Valo es de
adhesión no malizados a la adhesión de
HEC-1A
8.5.2. Adhesión de las células umo ales a
ma iz ex acelula
Dada la p esencia de nume osas p o eínas de ma iz iden i icadas como
moduladas posi i amen e en el exosoma de HEC-1A se p ocedió a e alua la
capacidad de adhesión de las células umo ales HEC-1A y H-ETV5 a dis in-
os componen es de la ma iz ex acelula . Los esul ados a ojan un inc e-
men o en la capacidad de la célula H-ETV5 de adhe i se a dichos sus a os
(Figu a 34).
8.5.3. Adhesión de las células umo ales a
endo elio condicionado po exosomas
Una ez de e minada la in luencia de los exosomas en la capacidad de
adhesión de las células umo ales a la supe icie de cul i o se p ocedió a
e alua su in luencia sob e monocapas de células endo eliales de la línea de
cul i o EA.hy926 o células HUVEC de cul i o p ima io. El condicionamien-
o du an e 8h de monocapas de células HUVEC con exosomas de HEC-1A
p oduce un inc emen o signi ica i o en la capacidad de adhesión de la línea
célula H-ETV5 en monocapas de HUVEC (p alo =0,031). En el caso de
monocapas de Ea.hy926 se obse a una endencia no llegándose a la signi-
icación (p alo =0,125; Figu as 35A y 35B).
Ma e iales y Mé odos
128
Símbolo* Acceso* % Cob** Nomb e
N
°
Pép***
HEC-1A :
H-ETV5
p alo
CLTC Q00610 23,4 Cla h in hea y chain 1 14 0,437 0
HIST4H4 P62805 29,1 His one H4 4 0,446 <0,05
MFGE8 Q08431 46,3 Lac adhe in 4 0,507 <0,01
GAPDH P04406 32,5 Glyce aldehyde-3-phospha e dehyd ogenase 5 0,755 <0,05
HSPA8 P11142 26,2 / 31,2+Hea shock cogna e 71 kDa p o ein 4 / 4+0,806 / 0,771+<0,05
FTH1 P02794 31,2 Fe i in hea y chain 3 0,168 <0,05
RPS5 P46782 25,5 40S ibosomal p o ein S5 2 0,315 <0,05
NID1 P14543 39,4 Nidogen-1 24 0,320 0
COL4A2 P08572 27,5 Collagen alpha-2(IV) chain 8 0,481 <0,05
CCT2 P78371 31,2 T-complex p o ein 1 subuni be a 4 0,639 <0,05
*Núme o de acceso y ab e ia u a pa a la base de da os Unip o ; ** Cobe u a de secuencia; *** Pép idos iden i icados con más del
95% de con ianza
+ Iden i icada en ambos ma cajes
Tabla S5. P o eínas signi ica i amen e moduladas pa a el exosoma de HEC-1A / H-ETV5
po SILAC
P o eínas más exp esadas en el exosoma de H-ETV5 espec o a HEC-1A
Símbolo* Acceso* % Cob** Nomb e
N
°
Pép***
HEC-1A :
H-ETV5
p alo
HEXA P06865 38,4 Be a-hexosaminidase subuni alpha 6 1,875 <0,05
PTPRF P10586 39,5 Recep o - ype y osine-p o ein phospha ase F 9 1,865 0
NPEPPS P55786 28,7 Pu omycin-sensi i e aminopep idase 5 1,861 <0,05
TARS P26639 21,6 Th eonyl- RNA syn he ase, cy oplasmic 2 1,847 <0,01
CTSZ Q9UBR2 46,5 Ca hepsin Z 3 1,847 <0,05
HSPA4 P34932 40,7 Hea shock 70 kDa p o ein 4 10 1,832 <0,01
PPP2R1A P30153 30,9 Se ine/ h eonine-p o ein phospha ase
2A 65 kDa egula o y subuni A alpha 4 1,830 <0,01
GLB1 P16278 41,8 Be a-galac osidase 12 1,749 <0,05
FDPS P14324 7,6 Fa nesyl py ophospha e syn hase 2 1,726 <0,05
ALCAM Q13740 47,3 CD166 an igen 13 1,701 <0,001
PKM P14618 80,6 Py u a e kinase isozymes M1/M2 46 1,678 0
RNH1 P13489 38,8 Ribonuclease inhibi o 3 1,677 <0,05
GGH Q92820 51,9 Gamma-glu amyl hyd olase 10 1,644 <0,01
LSR Q86X29 34,5 Lipolysis-s imula ed lipop o ein ecep o 5 1,573 <0,01
VCL P18206 56,1 Vinculin 13 1,531 <0,001
EZR P15311 58,7 Ez in 12 1,507 <0,01
BCAM P50895 29,3 Basal cell adhesion molecule 4 1,497 <0,05
DSG2 Q14126 44,7 Desmoglein-2 14 1,482 0
NEU1 Q99519 32,5 Sialidase-1 6 1,478 <0,05
LDHA P00338 41 L-lac a e dehyd ogenase A chain 8 1,445 <0,05
UBA1 P22314 43,8 Ubiqui in-like modi ie -ac i a ing enzyme 1 13 1,414 <0,01
TIMP1 P01033 61,4 Me allop o einase inhibi o 1 16 1,373 <0,05
PLOD3 O60568 24,4
P ocollagen-lysine,2-oxoglu a a e 5-
dioxygenase 3
4 1,358 <0,01
HSP90AB1 P08238 67,3 Hea shock p o ein HSP 90-be a 30 1,355 <0,05
SPTAN1 Q13813 42 Spec in alpha chain, b ain 19 1,344 <0,05
FUCA2 Q9BTY2 37 Plasma alpha-L- ucosidase 12 1,318 <0,01
TXNRD1 Q16881 48,2 Thio edoxin educ ase 1, cy oplasmic 10 1,318 <0,01
*Núme o de acceso y ab e ia u a pa a la base de da os Unip o ; ** Cobe u a de secuencia; *** Pép idos iden i icados con
más del 95% de homología
Tabla S4 con inuación. P o eínas signi ica i amen e moduladas pa a el sec e oma de
HEC-1A / H-ETV5 po SILAC. Pa e 2 de 2.
P o eínas más exp esadas en el sec e oma de HEC-1A espec o a H-ETV5
En neg i a p o eínas inculadas a la u a ILK y/o emodelación de uniones adhe en es
Ma e iales suplemen a ios
129
Símbolo* Acceso* % Cob** Nomb e
N
°
Pép***
HEC-1A :
H-ETV5
p alo
TNC P24821 20,4 Tenascin 13 32,755 0
LAMC1 P11047 16,8 Laminin subuni gamma-1 6 6,937 <0,01
ANXA1 P04083 37,6 Annexin A1 4 5,723 <0,05
COL18A1 P39060 26,2 / 27,1+Collagen alpha-1(XVIII) chain 15 / 17 5,483 / 1,379+<0,001
LAMA5 O15230 30,1 / 30,9+Laminin subuni alpha-5 36 / 24 4,813 / 1,206+<0,001
LAMB1 P07942 10,0 Laminin subuni be a-1 2 4,691 <0,05
HSPG2 P98160 30,9
Basemen memb ane-speci ic hepa an
sul a e p o eoglycan
48 3,773 / 2,380+0
LGALS3BP Q08380 48,2 / 42,9+Galec in-3-binding p o ein 27 / 19 3,732 / 2,198+0
NID2 Q14112 17,7 Nidogen-2 9 3,424 <0,001
TINAGL1 Q9GZM7 43,3 / 32,1+Tubuloin e s i ial neph i is an igen-like 9 / 6 3,414 / 3,116+<0,001
ANXA2 P07355 35,1 / 34,2+Annexin A2 4/ 7+3,184 / 1,554+<0,001
VCAN P13611 5,9 Ve sican co e p o ein 53,133 / 1,859+<0,01
AGRN O00468 38,2 Ag in 32 3,087 <0,01
HIST4H4 P62805 58,3 His one H4 10 2,075 0
EZR P15311 18,1 Ez in 2 2,058 <0,05
HIST1H2BC
P62807 78,6 His one H2B ype 1-C/E/F/G/I 11 1,935 <0,05
ITGA3 P26006 15,3 In eg in alpha-3 2 1,471 <0,05
TUBA1B P68363 29,9 Tubulin alpha-1B chain 5 1,450 <0,05
TUBB P07437 33,8 Tubulin be a chain 7 1,390 <0,01
ACTG1 P63261 62,9 Ac in, cy oplasmic 2 12 1,370 <0,01
NID1 P14543 19,8 Nidogen-1 6 1,222 <0,05
CCT2 P78371 31,2 T-complex p o ein 1 subuni be a 4 0,639 <0,05
*Núme o de acceso y ab e ia u a pa a la base de da os Unip o ; ** Cobe u a de secuencia; *** Pép idos iden i icados con más del
95% de con ianza
+ Iden i icada en ambos ma cajes
Tabla S6. P o eínas signi ica i amen e moduladas pa a el exosoma de HEC-1A / H-ETV5
po SILAC
P o eínas más exp esadas en el exosoma de HEC-1A espec o a H-ETV5
DISCUSIÓN
133
Capí ulo 9. Discusión
La apa ición de en e medad diseminada en oncología ep esen a el e en o
ad e so de mayo ele ancia en el p onós ico clínico. Mien as que aquellos
umo es que son de ec ados en es adios no diseminados p esen an un p onós-
ico clínico mode adamen e a o able y accesible a la esección, son aquellos
umo es con una diagnosis a día los que p esen an un peo p onós ico. Es po
ello, que la me ás asis ep esen a un e o clínico de p ime a en e gadu a y un
conocimien o de allado de sus mecanismos molecula es y celula es p ome e
ab i una nue a e a en la medicina oncológica.
La me ás asis ep esen a un e en o complejo e in luido po mul i ud de
ac o es, y no es sino en los úl imos años cuando es amos siendo e dade a-
men e conscien es de la complejidad del mismo. Pa alelamen e, el desa ollo
de nue as ecnologías pe mi e un abo daje cada ez más exhaus i o de la di-
seminación umo al y ab e nue as en anas pa a la in e ención e apéu ica.
Mejo as en las écnicas de imagen pe mi en la de ección de lesiones oligome-
as ásicas mien as que la inco po ación de écnicas qui ú gicas y adiológicas
asis idas pe mi en el a amien o de pacien es o o a no ope ables - éase VATS
Video Assis ed Tho acic Su ge y o SBRT S e eo ac ic Body Radio The apy en el
manejo de en e medad me ás asica-190,191. Del mismo modo, un inc emen o en
la especi icidad y sensibilidad del equipamien o disponible en el diagnós ico en
sopo e líquido ab e nue as on e as en el manejo oncológico95,99.
Ac ualmen e, la biopsia de ejido pe manece como e e encia en la decisión
clínica de NSCLC. Sin emba go, es as biopsias pueden esul a incómodas, in-
asi as y pueden no iden i ica de mane a ele an e al e aciones molecula es
-debido a una adquisición subóp ima o he e ogeneidad umo al-. Las pla a o -
mas de diagnós ico líquido ienen el po encial de sal agua da muchas de es as
Discusión
134
limi aciones pe mi iendo una iden i icación ápida y p ecisa de mu aciones
-de no o o de ecu encia-, la moni o ización en iempo eal de la espues a
a a amien o o la de ección de en e medad esidual o de ecu encia.
Complemen a iamen e, la in es igación en Células Tumo ales
Ci culan es (CTC) ha inc emen ado su in e és clínico en los úl imos años po
su implicación di ec a en la diseminación umo al. El aislamien o de CTCs a
pa i de una mues a de sang e pe i é ica de un pacien e con en e medad
diseminada no sólo pe mi e una moni o ización clínica, sino ambién una
opo unidad pa a p o undiza en la biología de es a población celula y el de-
sa ollo de e apias di igidas192. La cap u a de es a subpoblación de células
en ci culación hace de las CTCs una sue e de “ ase líquida” de la p og esión
umo al, la cual pe mi e ene acceso a células umo ales sin necesidad
de accede di ec amen e al ejido umo al193. Adicionalmen e, el o en e
sanguíneo ep esen a un medio hos il en el que la p og esión umo al su-
e un cuello de bo ella, o o gando así la opo unidad de un impac o global
en el de eni de la en e medad a a és del a amien o de una pequeña
subpoblación umo al. Es po ello que la e aluación y ca ac e ización de las
CTCs en pacien es de NSCLC -donde la en e medad diseminada es ecuen e
al diagnós ico- ep esen a una es a egia pa icula men e a ac i a pa a la
comp ensión del mecanismo de diseminación umo al y la moni o ización
clínica con el in de guia la es a egia e apéu ica194,195.
Las CTCs apa ecen en ci culación en un núme o muy bajo po lo que
su manejo equie e de mé odos al amen e sensibles. En la úl ima década
se han enido desa ollando dis in as ecnologías pa a el aislamien o de
CTCs -no limi adas exclusi amen e al inmunoaislamien o128,196- y que han
mos ado esul ados p ome edo es en NSCLC; sin emba go la can idad de
in o mación disponible es limi ada en compa ación con o os ipos umo a-
les197,198. Dis in os es udios con Cell Sea ch® -la única ecnología acep ada
po la FDA pa a la enume ación de CTCs- ha demos ado la u ilidad de la
enume ación de CTCs en NSCLC y su asociación con un peo p onós ico
clínico122,199,200. Sin emba go, la dependencia del ma cado epi elial EpCAM
pa a el inmunoaislamien o de CTCs ep esen a un e o pa a la aplicabilidad
de es a me odología en pacien es de NSCLC. Se ha obse ado que las CTCs
Ap oximación a la me ás asis
135
de NSCLC p esen an una exp esión especialmen e he e ogénea de es a p o-
eína y en ocasiones la de ección de es e ma cado ípicamen e epi elial
puede disminui como consecuencia de la exp esión de un pa ón ansc ip-
cional pseudo-mesenquimal41.
Pa alelamen e, se ha desc i o la exp esión de EpCAM ecuen emen-
e inc emen ada en NSCLC sugi iendo su pa icipación en la ca cinogéne-
sis201,202. Es po ello que nos cen amos en es a subpoblación de CTCs Ep-
CAM+ pa a la ca ac e ización de su pe il de exp esión génica en NSCLC y
con el in de p o undiza en el conocimien o de su biología. En es e sen ido,
poco se conoce de la biología de las CTCs EpCAM- en NSCLC y su in luencia
en la p og esión de la lesión me as ásica; habiendo an o es udios que abo-
gan po una pa icipación ac i a de es a subpoblación en la p og esión u-
mo al137, como es udios en NSCLC en los que inciden en la limi ación de es a
subpoblación pa a dic amina el de eni clínico203. Sin duda, el desa ollo de
nue as ecnologías EpCAM-independien es y un conocimien o más p o undo
de la biología de las CTCs con ibui án al pe eccionamien o de la e aluación
de CTCs en NSCLC como he amien a clínica.
En es e escena io, dis in os es udios p e ios o ien ados a la ca ac e i-
zación de la exp esión génica de CTCs en NSCLC han abo dado el análisis
de de e minados subg upos de genes - inculados p incipalmen e a un pe il
epi elial- en mues as en iquecidas en CTCs204,205. En es e abajo, la combi-
nación del inmunoaislamien o de CTCs EpCAM-dependien e seguido de una
ca ac e ización global de su pe il de exp esión median e la ampli icación
del ansc ip oma comple o e hib idación en mic oa ay de la lib e ía de
cDNA esul an e pe mi e la ob ención de un pe il de exp esión de CTCs
pa a NSCLC. Es e pe il de exp esión des aca una inculación con unciones
celula es elacionadas con mo imien o, adhesión y di e enciación celula es;
además de una ac i a comunicación célula-célula a a és de las u as PI3K/
AKT, ERK1/2 y NF-kB -desc i as con an e io idad en p og esión umo al y
me ás asis del cánce de pulmón206,207. Finalmen e, iden i icamos NOTCH1
como un conduc o cen al den o de es a ed de in e acciones y cuya ex-
p esión en pacien es se asocia a un p onós ico pob e.
Discusión
136
La ía de No ch es una u a de comunicación in e -celula al amen e
conse ada implicada en la egulación del desa ollo y di e enciación celula-
es208. No ch ha demos ado pa icipa ac i amen e en la homeoes asis y la
epa ación de daño celula en el pulmón, habiéndose obse ado su de egula-
ción asociada a la pa ogénesis de dis in as en e medades pulmona es como
en e medad pulmona obs uc i a c ónica, asma, ib osis pulmona , hipe -
ensión pulmona , cánce de pulmón y lesiones pulmona es congéni as209.
Además, en un ecien e me a-análisis, Yuan e al. consiguie on incula la
sob eexp esión de es a ía con un mayo iesgo de diseminación lin á ica,
mayo es adio umo al y meno supe i encia en NSCLC210. Complemen a-
iamen e, la exp esión de HES1, un e ec o subyacen e en la u a de No ch,
ha demos ado es a asociado a una meno supe i encia en NSCLC210. En
es e con ex o, y conside ando que la exp esión de la ía de No ch se en-
cuen a al e ada en más del 30% de los NSCLC211, el desa ollo de e apias
di igidas ep esen a un a ac i o clínico siendo a su ez los inhibido es de
γ-sec e asa (GSI) e inhibido es de ADAM las dianas más ecuen es pa a la
egulación de la ía (Figu a 37)212,213.
Figu a 37. La ía de señalicación de
No ch e inhibido es de la u a. La
unión a ligando p omue e la escisión
del dominio ex acelula del ecep o
de No ch po me alop o easas de
la amilia ADAM. El agmen o
ca boxilo e minal anclado a
memb ana es p ocesado po el
complejo γ-sec e asa -cons i uido po
p esenilin y nicas in en e o os- pa a
da luga a un dominio in e celula
de No ch (NICD) que se ansloca á
al núcleo celula pa a pa icipa
en la egulación de la exp esión
génica. Los 4 ipos de ecep o es
de No ch son sin e izados como
pép idos inmadu os en el e ículo
endoplasmá ico y p ocesados en el
apa a o de Golgi pa a su mig ación y
he e odime ización en la supe icie de
la memb ana celula . La inhibición de
ADAM o el complejo de la γ-sec e asa
esul a ía en la in e upción de la u a
de señalización de No ch. Adap ado
de Fo ini e al214.
Ap oximación a la me ás asis
137
Den o de es a u a de señalización, la ac i idad de No ch1 juega un
papel c í ico en la mig ación y adhesión umo ales mediada po la pé dida
de in e acciones célula-célula e inducción de ca ac e ís icas de célula ma-
d e215. La ablación in i o de No ch1 en modelos mu inos de adenoca cino-
ma ha demos ado educi d amá icamen e la o mación y ca ga umo al;
demos ando así la implicación de No ch1 en la iniciación, p oli e ación y
supe i encia de modelos de NSCLC216. Asimismo, la inhibición de la ía de
No ch con GSIs ha demos ado induci la apop osis en SCC de mane a cas-
pasa-dependien e e independien e217. Complemen a iamen e, la down- e-
gulación de No ch1 ha demos ado co elaciona con la up- egulación de
miR-34a, implicado en la inhibición de la p oli e ación e in asión en NSCLC
a la ez que es imula la apop osis218.
Son a ios los es udios que abogan po una pa icipación de la ía de
No ch en la adquisición de ca ac e ís icas de EMT inculadas a esis encia a
e apia y me ás asis219,220; del mismo modo que su silenciamien o con siRNA
ha demos ado e e i el p oceso de EMT y disminui la in asión y p oli e-
ación en NSCLC221. Finalmen e, No ch1 ha demos ado ambién p omo e
la in asión en cánce de pulmón median e la egulación de MMPs y cuya
exp esión se e signi ica i amen e educida as el a amien o con GSI222.
Con o me a es os esul ados p opo cionamos ambién una se ie de ge-
nes alidados po RT-qPCR de i ados del pe il de las CTCs EpCAM+ en NS-
CLC a anzado y inculados a la ía de señalización de No ch1. Galec ina-3,
una lec ina egulado a de la p oli e ación y adhesión celula es indicado a de
una mala p ognosis en NSCLC pa icipando de la mo ilidad, in asión celula
y me ás asis223–225. De mane a simila , la exp esión de PTP4A3 en NSCLC
se ha encon ado asociada al es adio clínico y la diseminación me as ásica
mediada po la o mación de asos ascula es y lin á icos226. Cohe en e-
men e, la sup esión de PTP4A3 in i o con siRNAs ha demos ado inhibi la
mig ación e in asión de células de cánce de pulmón227,228. Po úl imo, ITGB3
ha sido desc i a ecien emen e como un mediado de la adhesión ocal pa -
icipando en la egulación de Ras229, y cuya inhibición po miR-98230 o miR
le -7c231 p e iene la p oli e ación, mig ación e in asión en NSCLC.
Discusión
144
ción celula ía in eg inas. En es e sen ido se ha epo ado una impo an e
capacidad de los exosomas68 de in e acciona y emodela la ma iz ex a-
celula pa icipando de es e modo en el mic oambien e umo al, además, la
comunicación ía in eg inas ha demos ado una unción cla e en la de e mi-
nación de las lesiones me as ásicas81.
Cohe en emen e, hemos iden i icado un descenso signi ica i o en la
capacidad de adhesión in i o de la línea umo al H-ETV5 asociado a su
eno ipo mesenquimal. En cambio, sí que se obse a un inc emen o en la
capacidad de es as células de adhe i se a dis in os sus a os p esen es en
la MEC. Dis in os ensayos ealizados po Colás y colabo ado es a ibuyen
es e inc emen o a la capacidad de H-ETV5 de es ablece adhesiones ocales
ápidamen e con dis in os componen es de la ma iz48, lo que a su ez a-
cili a ía las p opiedades mig a o ias e in asi as epo adas pa a es a línea
celula 48,251. A aíz de es as obse aciones, hemos podido demos a que la
uncionalización de la supe icie de una placa con exosomas de HEC-1A es
capaz de a o ece de mane a signi ica i a la adhesión de la p opia célula
umo al; mien as que la uncionalización con exosomas de H-ETV5 no es
capaz de p oduci es e e ec o. Sin emba go, sí podemos obse a que la
adhesión de H-ETV5 se e inc emen ada in i o cuando expues a a una
supe icie uncionalizada con exosomas p oceden es de HEC-1A, algo que
concue da con la composición di e encial del exosoma y que a o ece ía el
es ablecimien o de pun os de anclaje en e H-ETV5 y los exosomas ijados a
la supe icie de la placa. Asimismo, el es udio ealizado po Colás e al. iden-
i icó LLP (Lipoma p e e ed pa ne p o ein) como una molécula implicada
en la egulación de ETV5 pe o que a su ez pa icipa en la ansducción de
señales de i adas de las adhesiones ocales pe mi iendo es ablece un ín-
culo en e la o mación de adhesiones ocales, EMT y la in asi idad umo al
den o de nues o modelo48.
Po úl imo, a endiendo a la diseminación umo al hema ógena, la lá-
mina endo elial cons i uye la p ime a ba e a ísica que la Célula Tumo al
Ci culan e debe a a esa en su p oceso colonizado . Es a colonización u-
mo al es á a su ez a o ecida po una inducción sos enida del es ímulo in-
lama o io de i ado del p oceso umo al252,253. Es a in lamación es capaz de
Ap oximación a la me ás asis
145
al e a la homeos asis ascula a o eciendo un inc emen o de la pe meabi-
lidad celula y la exp esión de p o eínas de adhesión des inadas a acili a la
ex a asación de leucoci os en ci culación -diapedesis-254. En es e sen ido,
se ha epo ado en dis in as ocasiones cómo el a amien o con exosomas
umo ales a o ece la ac i ación y pe meabilidad del ejido endo elial73,255.
Nues os esul ados a ojan un inc emen o de la adhesión de H-ETV5 a mo-
nocapas endo eliales de Ea.hy926 y células HUVEC cuando a adas p e ia-
men e con exosomas p oceden es de HEC-1A. Es e inc emen o de adhesión
esponde a la exp esión de moléculas de adhesión (SELE, VCAM1 e ICAM1)
sob e la supe icie del endo elio y que cuya sob eexp esión ha demos ado
an e io men e pa icipa en el homing de la célula umo al256,257. En es e
sen ido, una limi ación de la espues a in lama o ia inhibi ía p esumible-
men e la capacidad de las células umo ales de anida en el ejido endo e-
lial. Adicionalmen e, VCAN, una p o eína signi ica i amen e modulada pa a
el exosoma de HEC-1A, ha demos ado implicación en el eclu amien o de
células lin oides y mieloides que pa icipan en la p oducción de ci oquinas
in lama o ias y cuya inhibición se ha suge ido como una posible diana e a-
péu ica o ien ada a la me ás asis258.
Todas es as obse aciones cons i uyen un escena io en el que el exo-
soma pa icipa de mane a c ucial en la colonización me as ásica ía he-
ma ógena; des acando a su ez la in luencia del exosoma de HEC-1A en el
p oceso de condicionamien o y adhesión de la Célula Tumo al Ci culan e.
HEC-1A es una célula de eno ipo epi elial e inicialmen e no des inada a
alcanza la ci culación y anida en ejidos dis an es; sin emba go, podemos
obse a cómo su in luencia a más allá de un simple p o eedo de células
umo ales, sino que a a és de la acción exosomal pa icipa de mane a
ac i a en la diseminación me as ásica (Figu a 38). Compa a i amen e, ob-
se amos cómo el exosoma de H-ETV5, además de ep esen a una acción
muy mino i a ia del o al del exosoma umo al en ci culación, ca ece de
algunas de las ca ac e ís icas que pa icipan en el acondicionamien o del
nicho p e-me as ásico.
Discusión
146
De con i ma se es as obse aciones, un abo daje clínico o ien ado a la
me ás asis debe ía conside a la in luencia de los exosomas a la ez que
en a iza en la necesidad de in e eni en es a u a de comunicación umo al
median e la limi ación de la can idad de exosomas umo ales libe ados -ya
sea median e una educción de la ca ga umo al b u a o la dis upción de la
capacidad de las células umo ales de libe a es as esículas- o bien limi an-
do la capacidad de es as esículas de in e acciona con el ejido huésped -ya
sea limi ando la uncionalidad de es os exosomas umo ales o a o eciendo
una ac i idad p o ec o a en las células ecep o as-. Finalmen e, el desa o-
llo de es a egias o ien adas al exosoma epi helial-like pe mi i ía e-e alua
y a ae de nue o la a ención sob e la pa icipación e in luencia del umo
p ima io en el p oceso de me ás asis.
Figu a 38. El exosoma umo al en el anidamien o de la Célula Tumo al Diseminada.
En umo p ima io es á compues o po una mayo ía de células umo ales epi eliales.
En e ualmen e algunas de las cuales su i án un p oceso de EMT a o eciendo su
mo ilidad e inco po ación al o en e sanguíneo. Algunas de es as células abandona án
el o en e sanguíneo pa a da luga a nue os núcleos umo ales. Algunas de es as
células diseminadas su i án un p oceso in e so de EMT ecupe ando así algunas de
las p opiedades de célula epi elial. El exosoma umo al p oceden e del umo p ima io
pa icipa en el anidamien o umo al median e el condicionamien o del nicho umo al. Es e
exosoma umo al p ocede á de odo el conjun o de células umo ales que cons i uyen
el umo p ima io exis iendo una ep esen ación mayo i a ía de exosoma p oceden e de
célula umo al epi elial. Es e exosoma en ci culación p ese a la capacidad de ac i a
el ejido endo elial además de conse a una capacidad adhesi a ausen e en el exosoma
de i ado de célula umo al pseudo-mesenquimal. EMT: T ansición Epi elio-Mesénquima.
TEM: T ansición Mesénquima-Epi elio. Fuen e p opia.
CONCLUSIONES
151
Capí ulo 10. Conclusiones
1- El inmuno-aislamien o y en iquecimien o de CTCs EpCAM+ pe mi e la
ob ención de un pe il de exp esión génica especí ico de CTC en NSCLC.
2- El pe il de exp esión de CTCs en NSCLC des aca la p esencia de
unciones inculadas a la supe i encia, p oli e ación y mo ilidad celula .
3- NOTCH1 pa icipa de mane a ele an e en la biología de la CTCs. La
inhibición de la ía de No ch ep esen a una po encial diana
e apéu ica especí ica de CTC de in e es clínico.
4- La exp esión de GAPDH, NOTCH1, LGALS3, ITGB3 y PTP4A3 en
mues as en iquecidas de CTCs de NSCLC p esen an capacidad
p onós ica e elándose como po enciales bioma cado es en ci culación.
5- El SILAC ep esen a una al e na i a adecuada pa a la búsqueda de
bioma cado es en exosomas.
6- El p og ama ansc ipcional de EMT en HEC-1A p o oca un descenso
en la capacidad de adhesión de la Célula Tumo al Ci culan e.
7- P o eoma y sec e oma de H-ETV5 p esen an un pe il de EMT
o ien ado a la supe i encia celula y la e asión de la apop osis.
8- El exosoma en ci culación p oceden e de la célula umo al epi elial
con iene p o eínas de ma iz que pa icipan en la adhesión y
anidamien o de la Célula Tumo al Ci culan e.
9- El exosoma umo al de HEC-1A p omue e la ac i ación y exp esión de
p o eínas de adhesión en el ejido endo elial.
ANEXO
Escena io clínico del cánce de
pulmón y cánce de endome io
