Aproximación a la metástasis a través de la Célula Tumoral Circulante: desde el nicho premetastásico a la monitorización clínica

ÁREA DE MEDICINA FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA APROXIMACIÓN A LA METÁSTASIS A TRAVÉS DE LA CÉLULA TUMORAL CIRCULANTE: DESDE EL NICHO PREMETASTÁSICO A LA MONITORIZACIÓN CLÍNICA Memoria que presenta Javier Mariscal Ávila para optar al grado de Doctor Fdo. Javier Mariscal Ávila Santiago de Compostela, 2016 La presente tesis doctoral ha sido financiada parcialmente por el Programa de Ayudas Predoctorales de la Escuela de Doctorado Internacional de la Universidad de Santiago de Compostela. El Dr. Miguel Abal Posada, investigador estabilizado del Sistema Nacional de Salud, y el Dr. Rafael López López, Jefe del Servicio de Oncología del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela. CERTIFICAN: Que la presente tesis doctoral presentada por Javier Mariscal Ávila, que lleva por título: “Aproximación a la metástasis a través de la Célula Tumoral Circulante: desde el nicho premetastásico a la monitorización clínica”, ha sido realizada bajo su dirección en el Laboratorio de Oncología Médica Traslacional en el Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela, estimando que se encuentra concluida y en condiciones de ser presentada para optar al grado de Doctor. Revisada la misma, autorizamos su presentación para ser juzgada como tesis doctoral por el correspondiente tribunal, y para que conste firmamos la presente en Santiago de Compostela a 19 de Septiembre de 2016. Fdo. Miguel Abal Fdo. Rafael López RESUMEN Aproximación a la metástasis a través de la célula tumoral circulante: desde el nicho premetastásico a la monitorización clínica El cáncer es una de las enfermedades más devastadoras en la sociedad moderna. Mientras que en sus estadios iniciales el cáncer se presenta como una enfermedad con alternativas clínicas, la detección de masas tumorales diseminadas determina un cambio en el escenario clínico que obliga a un abordaje con escasas alternativas terapéuticas. Biológicamente, la diseminación metastásica se define como la secuencia de eventos mediante el cual la célula tumoral confinada se incorpora al torrente sanguíneo y sobrevive en circulación hasta que es eventualmente retenida en un órgano distante. Una vez retenida, se incorporará al parénquima del tejido huésped y comenzará a proliferar dando lugar así a nuevas masas tumorales. Este proceso dispersivo constituye en su conjunto un evento complejo en el que la metástasis no es meramente un proceso celular invasivo, sino que va acompañado de una gran plasticidad influenciada por el ambiente tumoral. Este ambiente conforma a su vez una activa red de comunicación que favorece en última instancia la progresión de las lesiones metastásicas. El trabajo aquí desarrollado tiene como objetivo profundizar en el conocimiento del modo en el que se desarrolla la diseminación metastásica a partir de dos de sus participantes. La Célula Tumoral Circulante como unidad biológica responsable de la formación de nuevas masas tumorales; y el exosoma tumoral como vesícula de comunicación entre la célula, su entorno y partícipe del acondicionamiento del nicho pre-metastásico. La detección y elaboración de un perfil de expresión específico de CTCs de cáncer de pulmón de célula no-pequeña (NSCLC) nos ha permitido identificar un perfil transcripcional orientado a la supervivencia, proliferación y movilidad celular a la vez que identifica NOTCH1 como partícipe de las características de esta subpoblación celular. En esta dirección, NOTCH1 ha sido asociado con anterioridad a progresión tumoral en NSCLC vinculado a un entorno de transición Epitelio-Mesénquima (EMT). Asimismo, los datos obtenidos proporcionan una serie de biomarcadores derivados de CTCs con valor clínico para Supervivencia libre de progresión y Supervivencia global. En este sentido, la ruta de Notch representa una diana terapéutica de gran interés y cuya inhibición está siendo evaluada en distintos ensayos clínicos. Considerando la influencia del proceso de EMT en la plasticidad de la célula tumoral, hemos desarrollado un análisis proteico por SILAC del proteoma, secretoma soluble y exosoma de la línea de cáncer de endometrio HEC-1A dentro de un marco de EMT. Este modelo nos ha permitido establecer diferencias en la fracción secretada -secretoma soluble y exosomade- rivadas de un cambio en el programa transcripcional de la célula tumoral y determinar su influencia en el anidamiento de la célula tumoral. Estos análisis identifican un proteoma y secretoma orientado a la supervivencia celular como consecuencia del proceso de EMT determinado por la sobreexpresión de ETV5. Asimismo, identificamos la presencia de distintos componentes de matriz extracelular dentro del cargo exosomal de HEC-1A, lo que, a la vista de nuestros resultados, favorece el anidamiento de la célula tumoral en circulación al tejido endotelial. Los resultados obtenidos participan de la hipótesis de Seed & Soil propuesta por S. Payet en 1889 a la vez que entran en consonancia con investigaciones más recientes que destacan el papel de los exosomas en el acondicionamiento del nicho pre-metastásico. De acuerdo a este modelo, el anidamiento de la CTC, con características pseudo-mesenquimales, se serviría del pre-acondicionamiento del tejido endotelial derivado del exosoma procedente del tumor primario, el cual está compuesto mayoritariamente por células tumorales de características epiteliales. TABLA DE CONTENIDOS INTRODUCCIÓN Capítulo 1. La metástasis 1.1. Epidemiología de la metástasis: cáncer de pulmón y cáncer de endometrio...............................21 1.2. La colonización metastásica..............................25 1.2.1. La Célula Tumoral Circulante 1.2.2. Intravasación de la CTC 1.2.3. Circulación hematógena 1.2.4. Extravasación de la CTC 1.2.4.1. Arresto 1.2.4.2. Translocación endotelial 1.2.5. Formación de micro-metástasis 1.2.6. EMT asociada a la Célula Tumoral Circulante 1.2.6.1. ETV5 como promotor de EMT 1.3. El nicho pre-metastásico...................................33 1.3.1. La hipótesis de “Seed & soil” 1.4. El exosoma y la diseminación metastásica........35 1.4.1. El exosoma y el nicho pre-metastásico 1.4.2. El exosoma y la Célula Tumoral Diseminada 11.8.4. Terapia dirigida 11.8.4.1. Terapia dirigida contra ALK 11.8.4.2. Terapia dirigida contra EGFR 11.8.4.3. Terapia dirigida contra ROS1 11.8.4.4. Otras terapias dirigidas en desarrollo 11.8.5. Inmunoterapia 11.9. Factores pronóstico y predictivos en CP.....170 11.9.1. Factores clínico-patológicos 11.9.2. Biomarcadores Capítulo 12. El carcinoma de endometrio 12.1.Elútero: estructura y función....................173 12.2. Factores de riesgo del CE.......................... 174 12.3. Prevención y screening del CE...................175 12.4. Sintomatología del CE................................176 12.5. Diagnóstico del CE.....................................176 12.6.Clasificación del CE....................................176  12.6.1.Clasificación histopatológica 12.6.1.1. Lesiones pre-invasivas 12.6.1.2. Adenocarcinoma endometrioide 12.6.1.3. Adenocarcinoma no-endometrioide 12.6.2.Clasificaciónclínico-patológica  12.6.3.Clasificaciónsegúnelgradodeinvasióntumoral:  EstadificaciónF.I.G.O. 12.7. Patología molecular del CE.........................181 12.7.1. Cáncer de endometrio de tipo I 12.7.2. Cáncer de endometrio de tipo II 12.8. Tratamiento del CE....................................184 12.8.1. Terapia adyuvante 12.8.1.1. Radioterapia 12.8.1.2. Quimioterapia 12.8.1.3. Terapia hormonal 12.8.1.4. Terapias dirigidas 12.9. Factores pronóstico y predictivos en CE.....186 12.9.1. Factores clínico-patológicos 12.9.2. Biomarcadores REFERENCIAS..................................................191 LISTA DE FIGURAS..........................................213 LISTA DE TABLAS.............................................216 LISTA DE ABREVIATURAS............................221 AGRADECIMIENTOS.......................................227 INTRODUCCIÓN 21 Capítulo 1. La metástasis 1.1. Epidemiología de la metástasis: cáncer de pulmón y cáncer de endometrio El cáncer es un problema de salud pública global y una de las enfermedades que mayor impacto tienen a nivel clínico y social. El proceso oncológico avanzado constituye además una enfermedad sistémica cuya influencia se extiende más allá del tumor primario, siendo la diseminación tumoral y la aparición de metástasis la causa principal de muerte en oncología1. Actualmente se han identificado más de cien tipos tumorales distintos centrándose este trabajo en el cáncer de pulmón y cáncer de endometrio como modelos de trabajo. El cáncer de pulmón (CP) se caracteriza por una incidencia especialmente significativa siendo el cáncer con mayor número de muertes asociadas1. Además, el CP presenta un abordaje clínico complejo en el que la detección de la enfermedad es tardía y más del 60% de los diagnósticos presentan enfermedad diseminada; lo cual lastra severamente la supervivencia del paciente (Figura 1)1. Por su parte, el cáncer de útero representa el cuarto cáncer más frecuente en mujeres y el primero de origen ginecológico1. El 75% de los diagnósticos ocurren en mujeres post-menopáusicas siendo más del 80% diagnosticadas cuando la enfermedad está aún localizada. Esto hace del cáncer de útero un cáncer de buen pronóstico con una supervivencia a 5 años del 76%, pero en el que aquella fracción de pacientes con núcleos metastásicos distantes al diagnóstico la supervivencia a 5 años alcanza únicamente el 15% (Figura 1). Introducción 22 Esta disparidad en el pronóstico clínico está sustentada por un cambio en el escenario en el que se desarrolla la enfermedad. Mientras estadios iniciales permiten alternativas relativamente eficaces dentro de un marco local, estadios avanzados obligan a un abordaje global caracterizado a menudo por su baja eficiencia e inespecificidad. En cáncer de pulmón de células no-pequeñas (NSCLC; Non-Small Cell Lung Cancer) -el cual representa el 85% de los casos totales-, estadios I, II y III son a menudo tratados quirúrgicamente pudiendo incluir radioterapia y/o quimioterapia en adyuvancia o neoadyuvancia2. En cambio, estadios más avanzados a menudo presentarán núcleos diseminados que imposibilitan un abordaje quirúrgico. En estos casos es frecuente el uso de distintos regímenes de quimioterapia que vendrán determinados por la extensión tumoral y el estado del paciente2. Eventualmente, es posible también un abordaje local en el caso de tumores confinados a los pulmones o que se han propagado puntualmente. Tumores de estas características en ocasiones refieren metástasis cerebrales únicas que pueden ser tratadas con cirugía y/o radioterapia (generalmente radiocirugía estereotáctica seguida de WBRT; Whole Brain Radiotherapy) al margen del tratamiento de las lesiones pulmonares3. En el caso de propagación puntual a otros órganos -como glándulas adrenales, hueso o hígadoes posible también el uso de radioterapia local en sus distintas variantes2. Figura 1. Tasa de supervivencia a 5 años en cáncer de pulmón y cáncer de útero en función del grado de diseminación tumoral (EEUU 2005-2011). Adaptado de Siegel et al1. Diseminación tumoral y metástasis 23 En cánceres de pulmón ampliamente propagados se procederá sin embargo a una evaluación histológica de las lesiones y la búsqueda de marcadores genéticos que orienten la decisión clínica. La detección de alteraciones genéticas en EGFR, ALK o ROS1 permiten actualmente el uso de estrategias dirigidas. En el caso de cánceres sin características moleculares que permitan el uso de terapias dirigidas la quimioterapia abarcará las principales opciones de tratamiento. Estos regímenes suelen incluir la combinación de dos compuestos quimioterápicos -a menudo incluyendo derivados del platino y/o taxolesaunque es posible la administración de un solo compuesto o incluso radioterapia en situaciones en las que el estado físico del paciente lo recomiende. La progresión de la enfermedad, durante o después del tratamiento, implicará generalmente la utilización de una nueva combinación de quimioterápicos en segunda o tercera línea. Ocasionalmente, es posible también la administración de la terapia en ausencia de progresión clínica como medida de control de la enfermedad en la denominada terapia de mantenimiento2. En cáncer de endometrio (CE), al contrario que ocurre en cáncer de pulmón, la mayoría de los casos son diagnósticados en estadios tempranos por lo que la opción quirúrgica recoge la mayoría de los tratamientos con una finalidad curativa. El tratamiento de la enfermedad metastásica o recurrente -la tasa de recurrencia es del 15% alcanzando hasta el 50% en pacientes con estadios avanzados o histologías agresivasincluye principalmente recurrencias pélvicas aisladas o con un sólo núcleo metastásico4; y en el que el tratamiento suele incluir un abordaje local mediante cirugía o radioterapia alcanzándose una supervivencia a 5 años que oscila entre el 20-40%4. En este sentido, la radioterapia en pacientes de riesgo ha demostrado beneficio clínico realizándose preferentemente mediante la exposición directa de las células tumorales a través de la vagina (braquiterapia vaginal) frente a la terapia de radiación externa. En el caso de diseminación peritoneal el manejo de la enfermedad se orientará también hacia una cirugía citorreductora o terapia local reservándose el tratamiento con quimioterápicos en pacientes no operables5. Actualmente la combinación de carboplatino-paclitaxel representa la aproximación quimioterápica más frecuente en este grupo de pacientes4. Asimismo, el tratamiento con Introducción 24 tamoxifeno y derivados de la progesterona ha demostrado una respuesta de en torno al 30% en estadios avanzados arrojando a su vez tasas de respuesta variables (10-50%) en pacientes recurrentes o metastásicos4. Histológicamente, podemos identificar también determinadas características vinculadas a la enfermedad diseminada en cáncer de pulmón y cáncer de endometrio. En un estudio realizado por Riihimaki et al. en más de 6.000 cánceres de pulmón avanzado se identificó una proporción desigual de pacientes metastásicos en función de la histología6. Más del 60% de los casos de adenocarcinomas y cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC; Small Cell Lung Cancer) presentaron metástasis mientras que el carcinoma de células escamosas (SCC, Squamous Cell Carcinoma) detectó metástasis únicamente en el 41% de los pacientes. SCLC presentó además preferencia a la diseminación en hígado y cerebro frente a los adenocarcinomas que metastatizaron también con frecuencia en hueso y pulmón6. Por otro lado, el cáncer de endometrio de tipo II -o no endometrioiderepresenta menos del 10-15% del total de casos diagnosticados, pero que sin embargo, representa el 40% de las muertes en cáncer de endometrio. Estos tumores presentan un alto grado histológico con propensión a la diseminación por lo que constituirán los estadios más avanzados y con peor pronóstico, siendo a su vez nódulos linfáticos, vagina, peritoneo y pulmón los tejidos de diseminación más frecuentes4. En este escenario, el estadio de la enfermedad y la presencia, número y localización de los focos metastásicos representan variables clínicas vinculadas al desarrollo tumoral con gran poder pronóstico en CP7. Asimismo, el grado de invasión y el tipo histológico presentan un potente valor pronóstico en CE8. Todas estas observaciones ponen de relieve la influencia de la enfermedad metastásica en el prceso tumoral a la vez que señalan la necesidad de un abordaje orientado hacia la misma. En este sentido, una breve revisión de la situación y manejo clínico del cáncer de pulmón -centrado en NSCLC- y del cáncer de endometrio puede ser consultada en el anexo incluido al final del documento (Anexo, página 153). Diseminación tumoral y metástasis 25 1.2. La colonización metastásica El proceso de metástasis se compone de una sucesión compleja de distintas etapas: 1) invasión local e intravasación en vasos sanguíneos y linfáticos. 2) tránsito en circulación y evasión del sistema inmune 3) extravasación en el parénquima de órganos distantes. 4) colonización y formación de micro-me- tástasis para finalmente su (5) progresión a macro-metástasis. Estas etapas vienen determinadas no sólo por las propiedades de la célula tumoral sino también por el microambiente local que proporciona las condiciones necesarias para la supervivencia y proliferación tumoral -el nicho metastásico-. Este microambiente pivota a su vez sobre una intensa comunicación entre las células tumorales y el tejido huésped llegándose a establecer antes incluso de la llegada de la propia célula tumoral diseminada –el denominado nicho pre-me- tastásico-9. A día de hoy, aunque la existencia biológica del nicho pre-metastá- sico está ampliamente aceptada, queda por elucidar su influencia a la hora de determinar la progresión metastásica10,11. 1.2.1. La Célula Tumoral Circulante La Célula Tumoral Circulante (CTC) se define como aquella célula tumoral desprendida del tumor primario o metastásico e incorporada a la circulación vía sanguínea o linfática. Estas células constituyen una subpoblación tumoral con unas características moleculares que permiten su supervivencia dentro del ambiente hostil que constituye el torrente circulatorio; siendo algunas de las cuales capaces de abandonar la circulación y proliferar en localizaciones distantes. Biológicamente, la CTC constituye un pronunciado cuello de botella en el proceso de diseminación tumoral y en el que las CTCs representan un porcentaje muy bajo respecto al total de células tumorales, debiendo además superar una serie de etapas caracterizadas por su baja eficiencia12. Dado los objetivos de este trabajo haremos una pequeña revisión orientada a la diseminación hematógena existiendo a su vez excelentes trabajos orientados a la diseminación vía linfática13. Las distintas etapas que conforman la cascada de diseminación metastásica y la participación de la CTC dentro de la misma se detallan a continuación (Figura 2): Introducción 32 destacada de ETV4 y ETV5 en el desarrollo mamario y renal; algo que destacan también los modelos animales knock-out43. Dichos modelos han reportado también una importante función del eje ETV4 / ETV5 en el desarrollo de los órganos genitales44. ETV1 parece, sin embargo, participar fundamentalmente en desarrollo del sistema motor42. En este escenario, se ha observado cómo la sobreexpresión de ETV5 correlaciona con la sobreexpresión de la oncoproteína ErbB2 en cáncer de mama42. Además, son distintos los estudios que han vinculado la sobreexpresión de ETV5 con un pronóstico desfavorable45,46, llegándose incluso a establecer una correlación entre el grado de invasión miometrial y los niveles de ETV547. A raíz de estas observaciones, la sobreexpresión de ETV5 ha demostrado promover un proceso de EMT mediado por la activación de miembros de la familia de factores de transcripción ZEB y la represión de E-cadherina; favoreciendo así la remodelación de contactos célula-célula y célula-sustrato y otorgando un fenotipo migratorio e invasivo (Figura 4)48. Coherentemente, modelos in vivo han demostrado una mayor capacidad de diseminación e invasión en distintas líneas celulares de cáncer de endometrio portadoras de la sobreexpresión de ETV549. En este trabajo, la sobreexpresión de ETV5 en células inmortalizadas de carcinoma endometrial (HEC-1A; Human Endometrial Cancer 1A) nos servirá como modelo de trabajo para la determinación de la influencia del contenido exosomal en el anidamiento metastásico dentro en un marco de EMT. Figura 4. La sobreexpresión de ETV5 en HEC-1A desencadena un proceso de EMT. Células epiteliales mantienen la polaridad celular y contactos célula-célula. La sobreexpresión de ETV5 favorece un fenotipo celular móvil y altamente invasivo. Adaptado de Colás et al48. Diseminación tumoral y metástasis 33 1.3. El nicho pre-metastásico 1.3.1. La hipótesis de ”Seed & soil” La diseminación metastásica no ocurre de manera azarosa sino que existen una serie de factores que participan en su destino. Esta observación fue inicialmente establecida por el cirujano inglés Stephen Paget en 188950, el cual, en un estudio sobre 735 autopsias de cáncer de mama, observó la existencia de nichos de anidamiento probables. A raíz de esta observación formuló la teoría del nicho pre-metastásico -o de “Seed & soil”- que conforma aún en día la base del entendimiento del proceso de diseminación tumoral. Esta teoría postula que la semilla -la Célula Tumoral Circulantecolonizará de manera selectiva el “suelo o soil” de órganos distantes en los cuales existe un ambiente favorable para su supervivencia. La adquisición de este ambiente favorable es lo que tradicionalmente se ha denominado el condicionamiento del nicho pre-metastásico como antesala del nicho metastásico maduro. Este nicho viene determinado por una serie de características, algunas directamente vinculadas a la biología tumoral y otras influidas por la misma mediante la promoción de respuestas aberrantes en el tejido huésped (Figura 5)51-53. Esta respuesta en términos generales puede ser englobada en función de sus características (Tabla 1). Todos estos procesos conforman un ambiente complejo en el que múltiples tipos celulares establecen relaciones tanto homocomo heterotípicas y en el que células genéticamente normales participan activamente de la progresión tumoral. En este contexto, el desarrollo del cáncer, y de la metástasis en particular, depende en gran parte de la habilidad de las células malignas de subvertir y explotar los procesos fisiológicos del huésped. Consecuentemente, la comunicación tumor-huésped se revela como un determinante crucial a la hora de determinar el devenir del proceso tumoral. Asimismo, dentro de esta comunicación tumoral, las vesículas extracelulares y los exosomas han ido progresivamente adquiriendo mayor relevancia a la hora de determinar la formación del nicho pre-metástasico58. Introducción 34 Figura 5. El microambiente tumoral participa en la diseminación y colonización tumoral. Macrófagos asociados a tumor (TAMs), plaquetas y Células Madres Mesenquimales (MSC) participan en la inducción de EMT en el tumor primario. Fibroblastos pro-tumorales (CAFs), TAMs y progenitores mieloides participan en la inmunosupresión tumoral. TAMs favorecen la extravasación tumoral mientras que las plaquetas participan en la protección, evasión del sistema inmune y extravasación de la célula tumoral en circulación. Simultáneamente, la comunicación vía exosomas participa en la evasión inmune y progresión de la célula tumoral. HPC: Célula Hematopoyética Progenitora; MDSC: Célula Supresora Mieloide. Adaptado de Quail & Joyce51. Características Precursores Remodelación de la MEC Degradación de la MEC Reestructuración de la MEC - Expresión de proteasas y MMPs - Deregulación de inhibidores de proteasas - Producción / activación de precursores de proteasas - Sobreexpresión de fibronectina - Sobreexpresión de integrinas - Crosslinking de la matriz de colágeno Homeostasis pro-tumoral - Inflamación crónica - Respuesta fibrótica Expresión de señales órganoespecíficas - Quimio-tropismo - Reconocimiento celular Descenso del seguimiento inmune - Modulación del reconocimiento tumoral - Disfunción de las células T - Polarización de macrófagos - Inhibición citotoxicidad NK Reclutamiento de precursores celulares Fibroblastos asociados al tumor Células derivadas de médula ósea Células vasculares Macrófagos asociados a tumor - Neo-vascularización - Aumento de la permeabilidad vascular - Acondicionamiento del nicho - Producción de quimio-gradientes - Reorganización del citoesqueleto Adaptado de 52, 54–57 Tabla 1. Características del microambiente tumoral Diseminación tumoral y metástasis 35 1.4. El exosoma y la diseminación metastásica La primera referencia a los exosomas aparece descrita por Trams y colaboradores en 1981 como una serie de micro-vesículas con actividad enzimática exfoliadas de líneas de cultivo neoplásicas; siendo estudios posteriores los que definirían algunas de las características principales de esta población59-60. Los exosomas se definen como una población de vesículas lipídicas de origen endosomal con un tamaño comprendido entre los 50 y 120 nm. Estas vesículas se originan en los denominados cuerpos multivesiculares (MVBs), los cuales, llegado el momento, se fusionarán con la membrana plasmática liberando los exosomas al medio extracelular (Figura 6)61. Atendiendo a su distribución encontramos que los exosomas están presentes en la inmensa mayoría de los fluidos biológicos no implicando necesariamente una función patológica (Figura 6). Es importante reconocer también que los exosomas forman parte de las denominadas vesículas extracelulares (EVs), pero no son parte exclusiva, sino que incluyen también vesículas de otra naturaleza como cuerpos apoptóticos o microvesículas con otro origen y función biológica62. Estas vesículas extracelulares han sido consideradas durante muchos años como contenedores de proteínas obsoletas y moléculas de desecho; y no es hasta la última década con la detección de mRNAs y miRNAs dentro del cargo exosomal cuando el exosoma ha atraído la atención sobre su influencia en la comunicación tumoral63. La biogénesis de los exosomas está regulada principalmente por el complejo ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) compuesto por 4 módulos que funcionan cooperativamente en la maduración de los cuerpos multivesiculares y la formación de las invaginaciones intraluminales que darán lugar a los exosomas64. Adicionalmente, estudios realizados por Théry y colaboradores han demostrado la participación de la familia de proteínas Rab como reguladores claves del tráfico exosomal; habiendo asociado incluso Rab27 a la progresión tumoral65,66. Introducción 36 Dentro del cargo exosomal se encuentran con frecuencia proteínas vinculadas a la familia de las tetraspaninas (CD9, CD63 y CD81 entre otras), el tráfico vesicular (miembros de la familia Rab) y el complejo ESCRT. Las tetraspaninas (TM4SF; Trasmembrane 4 superfamily) conforman una familia de proteínas con 4 dominios transmembrana y un dominio extracelular altamente conservado participando como mediadores del reconocimiento celular, la selección del cargo exosomal y la liberación/internalización de vesículas. Se ha observado además cómo miembros de esta familia participan en la adhesión de la célula tumoral a la MEC participando en la activación de vías pro-tumorales67. En términos de estabilidad, los exosomas proporcionan una cubierta protectora a las moléculas incluidas en su cargo que previene su degradación y permiten, además de una comunicación loco-regional, una comunicación de mayor rango y con capacidad de generar un impacto sistémico. Una vez alcanzan la célula receptora, los exosomas pueden ser internalizados mediante endocitosis, fagocitosis, pinocitosis o simple fusión de membranas68. Figura 6. Origen de las vesículas extracelulares y su distribución. El tráfico intra-celular entre los distintos compartimentos celulares (vesículas de carga) o hacia la membrana plasmática (vesículas de secreción) se caracteriza por un contenido vesicular intraluminal. Las vesículas secretadas se caracterizan por un contenido citoplasmático. Podemos distinguir aquellas vesículas que tienen su origen en la membrana plasmática (microvesículas), origen viral o fragmentos de membrana. Alternativamente, existen vesículas que tienen su origen en compartimentos intra-celulares para ser liberadas al medio extracelular mediante su fusión con la membrana plasmática. Estas vesículas pasarán a denominarse exosomas una vez liberadas. Finalmente, algunos virus son capaces también de valerse de la maquinaria exosomal para su secreción. Adaptado de Théry et al61 y Yáñez-Mó et al63. Diseminación tumoral y metástasis 37 Al margen de los componentes estructurales, los exosomas son portadores de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos de distinta naturaleza constituyendo un complejo dinámico que refleja el tipo y estado de la célula del que procede. En este sentido, se ha identificado, por ejemplo, el antígeno asociado a tumor Mart-1 en exosomas procedentes de melanoma69, la presencia de HER2 en células de cáncer de mama portadoras de la sobreexpresión esta proteína70, o la secreción de TNFα vía exosomas en cardiomiocitos en hipoxia71. Todas estas observaciones conforman un escenario en el que el exosoma representa un perfil específico y dinámico que participa activamente en la progresión tumoral a la vez que constituye una oportunidad para la evaluación, tratamiento y seguimiento del proceso tumoral. 1.4.1. El exosoma y el nicho pre-metastásico La participación del exosoma en la formación del nicho pre-metastásico ha atraído gran interés en los últimos años y ha permitido a su vez el establecimiento de vínculos entre esta población vesicular, la progresión tumoral y el pronóstico clínico72,73. En esta dirección se observado una participación directa de las vesículas extracelulares y el exosoma en la adquisición de características que conforman el nicho pre-metastásico desde sus estadios más iniciales mediante la desestructuración de la MEC y el descenso del seguimiento inmune, hasta una etapa madura a través del reclutamiento de precursores pro-tumo- rales y el establecimiento de una homeoestasis pro-tumorigénica en el tejido huésped72,73. La MEC está formada por dos componentes estructurales principales: la membrana basal y la matriz intersticial. En ambos dominios el colágeno constituye el componente estructural principal y sobre el que se incluyen glicoproteínas -como la laminina y la tenascina- y proteoglicanos que interaccionan con la matriz adyacente y las células residentes de la MEC. Estas células residentes se componen mayoritariamente de fibroblastos y miofibroblastos que se encargan de la producción de los componentes de la MEC y la integración de señales externas constituyendo la MEC un soporte dinámico sensible a factores externos y bajo constante remodelación74. Introducción 38 Durante el pre-acondicionamiento tumoral, los exosomas han demostrado participar activamente en esta dinámica de desestructuración y remodelación de la MEC mediante la inclusión de MMPs o moléculas activadoras dentro de su cargo; o bien mediante las promoción de esta remodelación en células residentes75,76. Son también varios los estudios que han conseguido establecer una asociación entre un perfil fibrótico de la MEC y el tráfico exosomal vía TGFβ77. El reclutamiento de miofibroblastos vía exosomas -procedentes de la diferenciación de fibroblastos o precursores mesenquimales78,79- origina un aumento en la producción y deposición de MEC mediada por TGFβ; el cual altera a su vez la función inmune y estimula la angiogénesis80. Recientemente se ha reportado también la sobreexpresión de fibronectina, un componente fibroso de la MEC, vía exosomas77. La fibronectina es capaz de mediar en la adhesión célula-MEC mediante su interacción con integrinas; las cuales han demostrado un papel clave a la hora de determinar el destino de las lesiones metastásicas81. Sin embargo, la influencia del exosoma tumoral no se limita únicamente a la desestructuración de la MEC, sino que también son capaces de promover una respuesta pro-vasculogénica en el tejido endotelial. Se ha observado como exosomas tumorales son capaces de estimular la angiogénesis mediante la transferencia horizontal de EGFR a células endoteliales82. Grange et al. demostraron que exosomas tumorales son capaces de movilizar las células endoteliales hacia la formación de pseudo-capilares in vitro; además de estimular la expresión de MMP-2, MMP-9 y VEGFR83. Adicionalmente, Peinado y colaboradores han demostrado un incremento de la permeabilidad del endotelio y el reclutamiento de precursores de médula ósea mediado por exosomas en células de melanoma73. Finalmente, se ha reportado también la participación del exosoma tumoral en la modulación del seguimiento inmune. Exosomas procedentes de cáncer de pulmón son capaces inducir la activación de macrófagos participando en la inflamación del nicho84. Además, se ha observado cómo los exosomas tumorales participan en la modulación de la respuesta inmune limitando la actividad de las células T85. Diseminación tumoral y metástasis 39 1.4.2. El exosoma y la Célula Tumoral Diseminada No debemos olvidar sin embargo que la metástasis se trata de un proceso en la que no sólo existe una comunicación tumor–huésped, sino que esta comunicación se produce de manera bidireccional participando el nicho metastásico en la supervivencia de la célula tumoral diseminada. En este sentido se ha observado cómo exosomas procedentes de distintos precursores del nicho pre-metastásico participan en la progresión de la lesión metastásica. La secreción de miRNA-223 vía exosomas por parte de macrófagos activados es capaz de incrementar la invasión y migración de distintas líneas de cáncer de mama86; de manera similar Luga y colaboradores demostraron la capacidad de promover la movilidad y la formación de protusiones en células tumorales de cáncer de mama por medio de exosomas procedentes de fibroblastos. Coherentemente, la inyección conjunta de las células tumorales y fibroblastos incrementó su capacidad metastásica87. Exosomas procedentes de células estromales han demostrado incrementar la resistencia a terapia en cáncer de mama88. Del mismo modo, se ha observado la promoción de dormancia vía exosomas en células de cáncer de mama89. Se ha reportado también la transferencia in vitro de proteínas oncogénicas vía exosomas entre distintas células tumorales participando de este modo en la supervivencia tumoral90. Finalmente, los exosomas no sólo participan en la invasividad y supervivencia tumoral, sino que son también distintos los estudios que han reportado un incremento de la capacidad metastásica mediada por la transferencia de moléculas de adhesión entre las células tumorales y plaquetas91. Todas estas observaciones ponen de relieve la influencia de la comunicación vía exosoma en el devenir de las lesiones metastásicas y la importancia de desarrollar estrategias dirigidas contra la misma. 40 Capítulo 2. La biopsia líquida 2.1. Utilidad clínica de la biopsia líquida A día de hoy la toma de muestras de tejido representa la alternativa principal para la realización de análisis genéticos en la oncología clínica. Tradicionalmente estas biopsias se han venido realizado a través de punciones o aproximaciones quirúrgicas con el fin de extraer una muestra representativa del tejido tumoral. Sin embargo, este abordaje presenta una serie de limitaciones no presentes en la biopsia líquida. La biopsia líquida otorga una serie de posibilidades hasta hace poco no disponibles como son un acceso inmediato y poco invasivo, la posibilidad de la monitorización de la enfermedad o, además, su carácter global permite abordar la evaluación clínica dentro de la heterogeneidad tumoral (Tabla 2). Si bien es cierto que la biopsia líquida ofrece múltiples ventajas, presenta también una serie de limitaciones derivadas de la escasez de moléculas diana en sangre. Además, quedan a día de hoy preguntas de carácter biológico que deben ser abordadas antes de una completa implementación de la biopsia líquida en clínica. Se desconoce por ejemplo si todos los tumores y metástasis producen ctDNA de manera homogénea o hasta qué punto estos niveles de ctDNA en circulación están influenciados por la localización tumoral -acceso a vasos sanguíneos por ejemplo-; del mismo modo se desconoce también qué subpoblaciones de la célula tumoral en circulación participan en la formación de las metástasis92,93. La biopsia líquida 41 2.2. Biomarcadores en circulación La evaluación de biomarcadores tumorales en soporte líquido se ha basado generalmente en la detección de proteínas mayoritarias indicadoras de procesos tumorales. Algunos de estos marcadores se encuentran actualmente completamente implementados en clínica pero en ocasiones carecen de la sensibilidad y especificidad suficiente96–98. Durante los últimos años, un conocimiento más detallado de las bases moleculares del proceso tumoral junto con el desarrollo de nuevas tecnologías ha permitido la detección de alteraciones genéticas en muestras de sangre periférica, abriendo así un amplio abanico de posibilidades para el desarrollo de biomarcadores diagnóstico, pronóstico y predictivos en oncología. Dentro del material genético contenido en la biopsia líquida se pueden distinguir varias fuentes de ácidos nucleicos de origen tumoral siendo las principales la Célula Tumoral Circulante, el ctDNA, los miRNAs y el exosoma94,99. Ventajas de la biopsia líquida Limitaciones de la biopsia de tejido Alta accesibilidad - Mínima invasividad - Alta elegibilidad del paciente - Barato. De rutina. Accesibilidad limitada - Punción /Cirugía - Efectos secundarios adversos - Caro. Necesidad de equipamiento específico Dinámica - Posibilidad de re-evaluación - Evaluación de la respuesta a tratamiento y desarrollo de resistencias - Seguimiento de la secuencia de acumulación de mutaciones Estática - Limitada por la cantidad de tejido disponible - Influida de la celularidad tumoral - Muestreo puntual Sistémica - Evaluación de la heterogeneidad intratumoral - Evaluación de la heterogeneidad intermetástasis Local - No siempre centrada en la parte más agresiva del tumor - Parcial. No considera heterogeneidad intra-tumoral Aplicabilidad alta - Identificación de nuevas dianas terapéuticas - Screening / Diagnosis temprana - Monitorización de la enfermedad Aplicabilidad limitada Adaptado de Buder et al. 94 y Pantel & Alix-Panabières 95 Tabla 2. Ventajas de la biopsia líquida como herramienta clínica Introducción 48 Biológicamente, el origen de estos biomarcadores no está claramente establecido. Inicialmente se ha atribuido a una liberación a la circulación sanguínea como consecuencia de procesos inflamatorios y de daño celular. Sin embargo, la influencia de las vesículas extracelulares en la comunicación celular y la presencia de miRNAs dentro de su cargo ha abierto el debate sobre su origen. Actualmente, son algunos los trabajos que aluden a la comunicación tumoral como origen de una fracción de los miRNAs en circulación. Recientemente, una tercera alternativa, aboga también por una secreción activa vesícula-indepen- diente de estos miRNAs. Si bien los ácidos ribonucleicos libres se caracterizan por su escasa estabilidad, los miRNAs en circulación parecen estar asociados a agregados proteicos que estabilizarían enormemente su estructura145,146. En consonancia, se ha reportado la presencia de miRNAs en sobrenadantes de plasma previamente deplecionados de vesículas147. Son numerosos los miRNA propuestos como potenciales biomarcadores habiéndose establecido una vinculación con la biología tumoral para algunos de ellos148. En cáncer de pulmón se ha identificado la expresión diferencial de varios miembros de la familia let-7 miRNA en plasma y vesículas plasmáticas149,150; implicando a su vez la participación de miembros de esta familia en la regulación de oncogenes como RAS o MYC en cáncer de pulmón151,152. miR200c, un miRNA implicado en la regulación del proceso de EMT36, también ha sido encontrado sobreexpresado en pacientes de NSCLC y cáncer de endometrio de mal pronóstico153,154. La detección de estos miRNAs ha servido a su vez de soporte para el desarrollo de un test diagnóstico en plasma de pacientes de NSCLC de alto riesgo basado en la evaluación de 34 miRNAs distintos155. 2.2.4. Vesículas extracelulares y exosomas Las vesículas extracelulares (EVs) y los exosomas representan la última de las fracciones de la biopsia líquida que ha atraído la atención por su potencial clínico. En los últimos años, las EVs, y los exosomas en concreto, han demostrado ser contenedores de numerosas moléculas con actividad biológica (lípidos, proteínas, mRNAs, RNAs no codificantes, miRNAs, DNAs) demostrando algunas de las cuales una participación clave en la comunicación tumoral. El contenido proteico y ribonucleico de las EVs procedentes del plasma, así como La biopsia líquida 49 su número, se ha demostrado alterado en multitud de tipos tumorales destacando al plasma sanguíneo como vehículo de una población de EVs de origen tumoral73,77,156,157, y abriendo así la posibilidad para su uso como plataforma para el desarrollo de nuevos biomarcadores de utilidad clínica. Actualmente se desconocen grandes aspectos de la biología de las EVs. Tradicionalmente, la purificación de exosomas se ha limitado a un enriquecimiento en vesículas en un rango de tamaño de 50-120 nm por medio de una serie de centrifugaciones diferenciales158. Este procedimiento no es específico y resulta también en la co-precipitación de agregados proteicos y otras vesículas de origen no exosomal159. En los últimos años han aparecido multitud de alternativas destinadas a simplificar y estandarizar la purificación de exosomas aunque a día de hoy las alternativas disponibles presentan una serie de limitaciones que hacen su uso más o menos adecuado en función de los objetivos157,160–163. La ultracentrifugación de exosomas representa el abordaje más sencillo y con mayor rendimiento, pero su vez el menos específico. Para salvaguardar esta limitación es frecuente el uso de protocolos complementarios como la ultracentrifugación en gradiente de sucrosa que, si bien reduce el rendimiento total, permite la obtención de preparaciones de mayor pureza158. El aislamien- to mediante cromatografía de exclusión por tamaño representa también una alternativa para la purificación de exosomas no dependiente de marcadores ni de equipos de ultracentrifugación164. Paralelamente, se han desarrollado abordajes basados en procesos de inmuno-afinidad que permiten un aislamiento específico de los exosomas en función de un determinado marcador proteico -principalmente miembros de la familia de las tetraspaninas o EpCAM-160. Este abordaje presenta como principal ventaja la gran pureza de los aislados pero se encuentra limitado por la ausencia de marcadores exosomales específicos, la pérdida de subpoblaciones exosomales y el bloqueo de proteínas de membrana que pudieran limitar la funcionalidad del exosoma. Es por ello, que este abordaje está especialmente indicado para estudios de caracterización frente a estudios funcionales162. Introducción 50 Clínicamente, los exosomas presentan algunas características afines al ctDNA como es su accesibilidad o su presencia casi ubicua en líquidos biológicos; mientras que, por el contrario, presentan también algunas características compartidas con las CTCs como es la posibilidad de realizar estudios orientados al proteoma o la presencia de una bicapa lipídica que protege el cargo molecular. Atendiendo a sus características, los exosomas resultan especialmente interesantes en la búsqueda de biomarcadores nucleicos por su mayor abundancia en sangre que en el caso de las CTCs y por su mayor estabilidad e integridad que los ácidos nucleicos libres en circulación -habiéndose reportado por ejemplo la mutación de BRCA2 en exosomas de una paciente no operable y cuyo ctDNA no permitió la obtención de material de calidad suficiente como para la identificación de la mutación165-. Además, la mayor estabilidad de los ácidos nucleicos encapsulados permitiría su acumulación y evaluación en estadios más tempranos aumentando así su rango de aplicabilidad165. Biológicamente los exosomas son un reflejo del tumor del que proceden. En un estudio realizado por Taylor y colaboradores se identificó un perfil de miRNAs característico de células de cáncer de ovario a partir de sus exosomas permitiendo su uso como marcador tumoral166. Además, son numerosos los estudios que han reportado un incremento en la expresión de marcadores de exosomas en circulación como consecuencia de la progresión tumoral llegándose incluso a establecer una correlación con el grado de diferenciación, estadio tumoral y supervivencia73,167. Por otro lado, se ha reportado también un enriquecimiento del cargo exosomal en miRNAs168, siendo numerosos los estudios que han vinculado la presencia de miRNAs asociados a microvesículas como indicadores de enfermedad169,170. Alternativamente, son varios los estudios que han demostrado la posibilidad de detectar alteraciones genéticas en el RNA codificante de EVs171-172. Por último, son distintos los autores que han destacado el uso de los exosomas, no sólo como biomarcadores tumorales, sino también una posible aplicabilidad terapéutica de los mismos. Estos exosomas en circulación pueden ser extraídos de un individuo y decorados o cargados con una molécula o fármaco específico para su re-administración proporcionando un vehículo resistente a la degradación, liposoluble y altamente específico173. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 55 Capítulo 3. Hipótesis y objetivos El proceso de metástasis representa un evento determinante en la práctica oncológica. Sin embargo, pese a su relevancia, las terapias dirigidas de manera específica a prevenir la progresión metastásica son limitadas. Biológicamente, la progresión metastásica se compone de una secuencia de etapas en las que el proceso tumoral establece una intensa remodelación del entorno y en el que, de acuerdo a la hipótesis de Payet de Seed & soil, la diseminación de la célula tumoral en circulación ocurrirá de manera preferente en órganos pre-acondi- cionados por este entorno, en lo que se ha denominado la formación del nicho pre-metastásico. El estudio aquí desarrollado parte de esta hipótesis con el objeto de profundizar en el conocimiento de la diseminación y anidamiento metastásico a través de dos de sus participantes: la Célula Tumoral Circulante, como principal responsable de la generación de metástasis a distancia; y el exosoma tumoral incluido en un marco de EMT, como herramienta de comunicación entre la célula tumoral, su entorno y partícipe del condicionamiento del nicho pre-metastásico. Hemos utilizado el cáncer de pulmón NSCLC como modelo de trabajo altamente invasivo y con gran capacidad de diseminación para la caracterización de las CTCs; mientras que, por otro lado, hemos utilizado el cáncer de endometrio como punto de partida para el desarrollo de un modelo de invasividad tumoral guiado por EMT con el fin de realizar su caracterización y evaluar la influencia de este programa transcripcional en la comunicación y anidamiento tumoral. 56 CaracterizacióndelperfilmoleculardelaCélula Tumoral Circulante (CTC) en Cáncer de Pulmón de CélulaNo-Pequeña(NSCLC) • Inmunoaislamiento, enriquecimiento y caracterización de CTCs EpCAM+ en sangre periférica de pacientes de NSCLC avanzado • Análisis de las funciones moleculares y rutas de señalización implicadas en la adquisición del perfil de CTCs en pacientes de NSCLC • Identificación y validación de biomarcadores específicos de CTCs y determinación de su valor clínico en NSCLC Obtencióndelperfilproteicodelalíneadecáncer de endometrio HEC-1A en un marco de EMT • Caracterización por SILAC del contenido proteico del proteoma, secretoma soluble y exosoma de la línea celular de cáncer de endometrio HEC-1A en un marco de EMT inducido por ETV5 Evaluacióndelainfluenciadelexosomatumoral en el anidamiento de la Célula Tumoral Circulante al tejido endotelial • Determinación del efecto del exosoma tumoral sobre el tejido endotelial en un escenario de diseminación y anidamiento tumoral • Evaluación de diferencias funcionales en el exosoma tumoral derivadas de EMT Materiales y Métodos 64 Incubada la reacción (25°C, 5’; 50°C, 2h; 70°C, 15’) las muestras se trataron con RNase H para eliminar los restos de RNA (37°C, 20’; Invitrogen) y se conservaron a -20°C hasta su uso. 4.1.4. Pre-amplificaciónyRT-qPCR Previo a la realización de la RT-qPCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) se sometió el cDNA a una reacción de pre-amplificación (Taqman® PreAmp Master Mix Kit, Applied Biosystems) con el fin de incrementar la sensibilidad de la reacción. Esta reacción permite la amplificación dirigida de fragmentos de cDNA de manera uniforme y sin introducir sesgos. Para ello, se añadieron 4,17 µL de cDNA a una mezcla de 3,28 µL de TE 1x por reacción y 0,07 µL de cada sonda Taqman® a pre-amplificar (M&M 6.4. Tabla 7) hasta completar un volumen de reacción de 12,5 µL. A continuación se añadieron 12,5 µL del preparado Preamp Master Mix (Applied Biosystems) para un volumen final de 25 µL. Esta mezcla se incubó durante 14 ciclos de amplificación (95°C, 10’; (95°C, 15’’; 60°C, 4’) x14) y se diluyó 1:10 en TE 1x antes de proceder a la RT-qPCR. La PCR cuantitativa en tiempo real es una variante de la PCR que permite simultáneamente amplificar y cuantificar de forma absoluta el producto de amplificación mediante la incorporación de un oligonucleótido fluorescente (Taqman®, Applied Biosystems) dirigido de manera específica a una secuencia diana. Este oligonucleótido al ser incorporado libera el fluoróforo acoplado permitiendo medir la tasa de generación de uno o más productos específicos al final de cada ciclo de amplificación. Las reacciones de RT-qPCR se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos para las sondas correspondientes (M&M 6.4. Tabla 7) e incluyendo en todo caso duplicados y controles negativos. Cada reacción de amplificación se constituyó de 9 µL de cDNA diluido 1/4 en H2O libre de nucleasas, 1 µL de la sonda TaqMan® correspondiente y 10 µL de TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems). Cada reacción de RT-qPCR estuvo compuesta por un ciclo de pre-amplificación (50°C, 2’; 95°C, 10’) seguido de 40 ciclos de amplificación (95°C, 15’’; 60°C, 1’). El equipo utilizado fue un termociclador 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Caracterización de CTCs en NSCLC 65 Para su análisis, el nivel de expresión para las distintos genes se representa como 40-Ct siendo 40 el número de ciclos de amplificación total y Ct (Cycle Threshold) el punto de intersección entre la curva de amplificación y el umbral de detección establecido (Ct threshold= 0,1). Para la determinación de la carga de CTCs para cada muestra, los valores medios de expresión de GAPDH -un housekeeping gene indicador de celularidadfueron sustraídos de la señal procedente de PTPRC -un marcador de célula hematopoyéticadel mismo modo al utilizado por Barbazán y colaboradores174. 4.2. PerfildeexpresióndeCTCs EpCAM+ Confirmada la presencia de CTCs en circulación en pacientes NSCLC se procedió a la determinación de su perfil de expresión por Gene Expression Microarray en 10 muestras independientes. El procedimiento empleado para el enriquecimiento de CTCs y extracción de RNA total fue el mismo al especificado en el punto M&M 4.1.2. para después proceder a la amplificación del transcriptoma completo de acuerdo al procedimiento indicado. 4.2.1. AmplificacióndeltranscriptomayGene Expression Microarray La amplificación del transcriptoma completo de las CTCs fue llevada a cabo con el kit Whole Transcriptome Amplification (WTA2, Sigma; St. Louis, MO, USA) de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Se incorporó la máxima cantidad de RNA total para la creación de una librería de cDNA del transcriptoma para cada paciente / control, y a continuación se procedió a su amplificación por PCR (94°C, 2’; (94°C, 30’’; 70°C, 5’) x17). La librería de cDNA resultante fue entonces marcada con el compuesto fluorescente Cy3® e hibridada sobre un microarray de expresión génica según las indicaciones del proveedor (In Situ DNA Microrray 4x44 k, Agilent Technologies; New Castle, DE, USA). La señal bruta fue recogida en un Agilent scanner G2565B (Agilent Technologies) y analizada de acuerdo a los criterios referidos a continuación. Materiales y Métodos 66 4.2.2. Análisisdesignificación El Análisis de Significación de Microarrays (SAM) fue realizado en colaboración con Gómez-Tato A. y Casares-de Cal MA., vinculados ambos a la Facultad de Matemáticas de la Universidad de Santiago de Compostela. Los datos brutos fueron segmentados con el software proporcionado por el fabricante de acuerdo al protocolo GE1-v5_95 (Agilent Feature Extraction Software v9.5, Agilent Technologies). Un procesado inicial de los datos permitió limitar la saturación de la señal y la eliminación de señal de fondo de acuerdo a los criterios indicados175,176. Aquellos genes que no alcanzaron alguno de los criterios de calidad fueron descartados: a) señal no uniforme o replicados dispares b) señal significativamente no diferente al fondo de señal c) señal en el rango de los controles negativos. A continuación se procedió a la normalización por cuantiles de la señal del microarray con el software libre Bioconductor177. Sólo aquellas señales por encima de 211 unidades tras de su normalización fueron consideradas óptimas. Finalmente, aquellas sondas con ausencia de señal en más de un paciente fueron descartadas. Depurada la señal, se procedió a la búsqueda de secuencias significativamente más expresadas en pacientes que en controles de acuerdo al algoritmo de SAM incluido en el paquete de R samr178. 4.2.3. Interpretación biológica de los datos Los datos procesados fueron volcados en el software Ingenuity Pathway Analysis 2.0 (IPA, Ingenuity Systems; Redwood City, CA, USA) para la determinación de rutas y funciones biológicas significativas. El test de Fisher de una cola empleado nos permite estimar la probabilidad de que una asociación establecida para nuestro set de genes se deba al azar. Adicionalmente, los datos fueron contrastados con la herramienta de acceso libre GeneCodis3 para la determinación de las funciones más relevantes en el perfil de las CTCs de acuerdo a un test hipergeométrico corregido179. La significación quedó establecida para un p valor <0,05 en ambos casos. Caracterización de CTCs en NSCLC 67 4.3. Validación y contraste con variables clínicas 4.3.1. Selección y validación de genes candidato El análisis de función destaca la presencia significativa de genes vinculados a la ruta de Notch1 en el perfil de CTCs. De entre los genes vinculados a la ruta de Notch1 por IPA se seleccionaron una serie de candidatos (LGALS3, PTP4A3 e ITGB3) contenidos en el perfil de expresión de CTCs para la validación por RT-qPCR del microarray y de la ruta de señalización de acuerdo a la metodología indicada en los puntos M&M 4.1.3. y M&M 4.1.4. GAPDH fue incorporado como normalizador celular y PTPRC se incluyó como normalizador de aislamiento inespecífico. Finalmente, HES1 fue incorporado como efector down-stream de la ruta de Notch1 con el fin de certificar la activación de la ruta. La significación estadística se determinó de acuerdo a un Mann-Whitney U-test de dos colas. El software utilizado fue el GraphPad Prism 6 (GraphPad Softwares Inc.; San Diego, CA, USA). El análisis de correlación NOTCH1-HES1 se realizó a través del estadístico de Pearson. La significación fue fijada para un p valor <0,05 en todo caso. 4.3.2. Contraste con variables clínicas El contraste clínico de los marcadores validados se llevó a cabo de acuerdo a las recomendaciones REMARK para la búsqueda y evaluación de marcadores180. El análisis de ROC fue establecido para una distribución no paramétrica y un intervalo de confianza del 95%. La Supervivencia libre de progresión (PFS) y Supervivencia global (OS) se analizaron mediante log-rank test y la elaboración de curvas de Kaplan-Meier. La progresión temprana fue definida como aquellas progresiones acaecidas en los 4 meses siguientes al diagnóstico. El estadístico de Cox fue utilizado para la elaboración de los análisis univariantes y multivariantes para los marcadores y las variables clínicas. El software utilizado fue el IBM SPSS Statistics 20.0 (IBM Corp.©; Chicago, IL, USA). Un p valor <0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Materiales y Métodos 68 4.4. Inhibición de Notch in vitro 4.4.1. Cultivo celular: cáncer de pulmón La línea humana inmortalizada de NSCLC A549 fue obtenida de la ATCC (ATCC® CCL-185™). Esta línea fue mantenida en cultivo en medio Dulbecco’s ModifiedEagleMedium(DMEM, Gibco; Grand Island, NY, USA) al 10% de Suero Fetal Bovino (FBS, Gibco), 1% (v/v) de penicilina (100 U/mL) -estreptomicina (100 µg/mL) (PenStrep, Gibco) y una atmósfera adecuada (37°C, 95% HR, 5% CO2). Las células se subcultivaron de monocapas subconfluentes y dilución 1:8. 4.4.2. Proliferación en ausencia de sustrato En la célula somática la ausencia de sustrato es un potente estímulo que favorece la entrada en apoptosis. Una de las características de la célula invasiva es su capacidad para sortear esta señal y proliferar en la ausencia de un sustrato firme. Para su evaluación se procedió al tapizado de la base de cada pocillo de una placa de P96 con 30 µL de agarosa Low Melting Point (V2111, Promega; Madison, WI, USA) al 0,6% (w/v). Una vez gelificado se añadieron 5x103 células de la línea celular A549 contenidas en 100 µL de agarosa LMP al 0,3% (w/v). La agarosa se gelificó en medio DMEM al 2% de FBS. Las células se dejaron asentar durante 16h y a continuación se añadieron los tratamientos correspondientes para un volumen final de 100 µL de medio de cultivo FBS-. La inhibición de Notch1 se realizó mediante el inhibidor químico de γ-secretasa DAPT (CAS 208255-80-5. IC50 115 nM, Santa Cruz Biotechnology; Dallas, TX, USA). Las células se cultivaron durante 4 días hasta su revelado en 50 µL de una dilución 1:10 de Alamar Blue® Cell Viability Reagent (DAL1025, Invitrogen). Finalmente, se midieron los valores de fluorescencia a 590 nm en un lector FLUO Star Optima (BMG Labtech; Ortenberg, AL). Las diferencias en proliferación se determinaron mediante su normalización a un control negativo. 5 replicados intra-experimentales fueron incluidos para cada muestra. La significación estadística se estableció para p <0,05 de acuerdo a un test de Wilcoxon. 69 Capítulo 5. Caracterización del proteoma y fracción secretada de HEC-1A y H-ETV5 5.1. Obtención de exosomas de HEC-1A y H-ETV5 5.1.1. Cultivo celular: cáncer de endometrio La línea de cultivo de cáncer de endometrio utilizada fue la HEC-1A (ATCC® HTB-112™). Esta línea procede de un adenocarcinoma de endometrio aislado en 1968 de una paciente con cáncer endometrial estadio IA. Presenta una morfología epitelial y características de cultivo adherentes. A partir de esta línea celular, Monge y colaboradores generaron la línea celular H-ETV5 modificada para la sobreexpresión de ETV5 (EX-F080000- Lv105; NM_004454, GeneCopoieia; Rockville, MD, USA)46. La sobreexpresión de ETV5 es capaz de inducir un proceso de EMT adoptando estas células un fenotipo pseudo-mesenquimal y altamente invasivo (Introducción 1.2.6.1). La selección del vector de sobreexpresión se mantuvo con G-418 (Geneticina® 500 µg/mL, Gibco). De este modo se constituyó un modelo dicotómico en el que el fenotipo epitelial queda representado por HEC-1A y su contrapartida, con fenotipo mesenquimal y portador de la sobreexpresión de ETV5, H-ETV5. Materiales y Métodos 70 Ambas líneas de cultivo se mantuvieron en medio McCoy‘s 5A (Gibco) suplementado al 10% FBS y 1% (v/v) de PenStrep (Gibco) en una atmósfera adecuada. El subcultivo se realizó por tripsinización y dilución 1:6-1:8. 5.1.2. Purificacióndeexosomasdemedios condicionados Para la obtención de los medios condicionados se establecieron unas rutinas de cultivo fijas para las líneas celulares HEC-1A y H-ETV5. La tasa de proliferación de ambas líneas celulares es equivalente sucediéndose un ciclo de división celular completo cada 22h. Las células fueron crecidas en medio completo hasta un 70% de confluencia, lavadas en PBS y posteriormente mantenidas durante 48h en medio FBS- para su condicionamiento. De cada placa se realizaron dos rondas de condicionamiento procesadas de igual manera. La purificación de exosomas procedentes de medios condicionados se llevó a cabo de acuerdo a las directrices establecidas por Théry et al158. Una vez los medios condicionados se limpiaron de impurezas por centrifugación diferencial se procedió al enriquecimiento de exosomas mediante su ultracentrifugación (100.000 g, 90’, 4°C), lavado en PBS y posterior recuperación (Figura 8). Las centrifugaciones fueron realizadas en un rotor SW32Ti (Beckman Coulter; Brea, CA, USA). Una vez purificados los exosomas, se resuspendieron en la solución y volumen correspondiente y se procedió a su evaluación de rutina por ZetaSizer Nano ZS (M&M 5.2.3.). Las muestras generadas fueron conservadas a 4°C hasta su uso en un plazo inferior a 24h. 5.2. Caracterización de exosomas El trabajo con exosomas es un campo en el que la forma de obtención y manejo de las muestras tiene gran influencia sobre los resultados. Adicionalmente, a día de hoy no existen procedimientos universales que permitan distinguir entre los distintos tipos de vesículas extracelulares siendo a menudo referenciado como exosomas lo que se trata de una suspensión enriquecida de distintos tipos de vesículas extracelulares. Existen sin embargo diversas pautas ampliamente aceptadas y que permiten acotar el trabajo con exosomas162. Caracterización de exosomas por SILAC 71 5.2.1. Montaje de exosomas completos para microscopia electrónica TEM Una vez ultracentrifugado el medio condicionado se procede a la fijación directa de los exosomas completos mediante su resuspensión en 50 µL de PFA 2%. 5 µL de esta suspensión es directamente depositada en varias rejillas de formvar-carbono, secada al aire durante 20-30’ y lavada en PBS (x3). Por último, las muestras son contrastadas con ácido fosfotúngstico (H3PW12O40; 5’, TA, pH 6.8) y observadas al microscopio electrónico de transmisión (JEOL 120KV mod. JEM2010, JEOL Ltd.; Akishima, Tokio, JP) para la observación directa de los aislados de exosomas. 5.2.2. Marcadores de exosomas Actualmente no se conoce la existencia de proteínas exclusivas del exosoma y cuya detección permita confirmar de manera inequívoca la naturaleza de los aislados. Se ha observado sin embargo una serie de proteínas cuya presencia aparece enriquecida en exosomas y que generalmente se utilizan para la certificar su aislamiento162. Dentro de este grupo aparecen proteínas de distinta naturaleza y entre las que destaca la superfamilia de las tetraspaninas Figura 8. Flujo de trabajo empleado para el aislamiento de exosomas a partir de medios condicionados. Se eliminan secuencialmente las células arrastradas y muertas y restos celulares para después precipitar los exosomas por ultracentrifugación. A continuación se realiza un lavado en PBS para eliminar co-precipitados proteicos y se vuelven a recuperar los exosomas. Materiales y Métodos 72 -como CD9, CD63 o CD81- implicadas en procesos de adhesión, reconocimien- to y fusión de vesículas181. Asimismo PDCD6IP -también referida como ALIX- es una proteína de origen citosólico utilizada también como evidencia de un enriquecimiento exosomal. Adicionalmente, la ausencia de marcadores específicos de exosomas hace más relevante si cabe la evaluación de determinadas proteínas “no deseables” en los aislados de exosomas. La detección de estas proteínas evidenciaría una obtención inadecuada de la muestra (la lisis celular por ejemplo liberaría gran cantidad de vesículas no deseables) o un procesamiento deficiente. HSP90B1 -también conocida como GRP94- es una proteína implicada en la estabilización y plegamiento de proteínas de nueva síntesis en el retículo endoplasmático por lo que su presencia se desaconseja en preparaciones de exosomas. Para su evaluación se realizó la detección de esta proteína en preparaciones de exosomas paralelamente a un control positivo constituido por 10 µg de un lisado celular. La presencia de estos marcadores de exosomas fue confirmada / descartada por Western Blot de acuerdo a los protocolos indicados en el apartado M&M 6.3.5.3. y los reactivos correspondientes (M&M 6.4. Tabla 7). La detección de al menos de una de las tetraspaninas, una proteína citosólica y la ausencia de vesículas contaminantes es considerada como suficiente para certificar la naturaleza de los aislados. 5.2.3. Perfildetamañodeexosomas El Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd.; Worcerstershire, UK) es analizador de alto rendimiento que permite evaluar la dispersión de partículas en suspensión bajo el movimiento browniano y la convierte en una distribución de tamaño. En el caso de exosomas, la distribución de tamaño es variable en función del tipo celular, el procesamiento o el procedimiento de adquisición, sin embargo, existe un amplio consenso de que su tamaño oscila entre los 50-120 nm. Caracterización de exosomas por SILAC 73 Para la valoración rutinaria de los purificados de exosomas se procedió a la estimación de la concentración y perfil de tamaño de los aislados de exosomas en una dilución 1:10 en PBS bajo unos parámetros fijos (25°C, ángulo de medida 173°, 5 repeticiones por medida, duración de la repetición 10’’, atenuador fijo en 8). Las medidas fueron realizadas en cubetas de poliestireno ZEN0040 (Malvern Instruments Ltd.). Los perfiles representados representan la media de 3 medidas independientes. La estimación de la concentración de cada muestra se realizó a partir del número medio de cuentas por segundo (kcps) bajo las condiciones antes señaladas y un volumen conocido. Los tratamientos in vitro se realizaron de acuerdo a un ratio de dilución equivalente para los distintos ensayos y replicados. 5.3. Caracterización proteica por SILAC del proteoma, secretoma y exosoma de HEC-1A y H-ETV5 5.3.1. SILAC: Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture El SILAC es una técnica proteómica que permite establecer diferencias en la abundancia relativa de proteínas específicas para una serie de muestras pareadas182. El SILAC se basa en la incorporación por parte células metabólicamente activas de aminoácidos marcados (heavy) frente a otra población crecida en presencia de sus equivalentes sin marcar (light) o de un peso inferior (middle). Este marcaje generalmente implica isotopos estables del hidrógeno (H2), carbono (C13) o nitrógeno (N15) que, si bien químicamente se comportan de manera idéntica, sus diferencias atómicas sí son registrables por espectrometría de masas (MS). En el cultivo celular con estos isótopos, después de un número de divisiones celulares, la proteína marcada desplazará a la proteína sin marcar hasta conseguir un marcaje uniforme de todo el contenido proteico. El SILAC proporciona además una serie de ventajas notables frente a otros abordajes proteómicos: 1) Parejas de péptidos químicamente idénticos, pero de diferente composición isotópica -es decir, procedentes de distintas poblacio- Materiales y Métodos 80 una matriz de α-ciano (4 mg/mL en 70% ACN / 0,1% TFA; 1,2 µL/min). Finalmente se procedió a la adquisición de los espectros de MS y MS/MS de los cromatogramas resultantes en un MALDI-TOF/TOF (4800 ABSciex; Framingham, MA, USA) de acuerdo a las condiciones referidas por Mateos et al187. Se utilizó una intensidad fija de 3.600 kV y 1.500 disparos por fracción. La selección de los precursores para MS/MS se realizó usando un método Job-Wide (hasta 12 precursores por fracción, señal / ruido >80). La fragmentación de los péptidos se llevó a cabo para un voltaje de 4.400 kV y 2.000 disparos por espectro. La identificación y cuantificación de los distintos espectros de masas y fragmentación se realizó de manera separada para cada muestra con el software Protein Pilot 3.0 (ABSciex) y su contraste con la base de datos UniProt_ human. Paralelamente se lanzaron en UniProt_all para la detección de posibles contaminaciones. Los parámetros de búsqueda fueron especificados para SILAC, alquilación con IAA, digestión en tripsina y como factores específicos se incluyeron la identificación basada en gel y denaturalización en urea. El umbral de detección de proteínas fue establecido para 1,3 con una confianza del 95%. La determinación de la modulación viene determinada por la relación entre ambos marcajes -middle y heavy-. Un ratio ≥1,2 (o ≤0,83 en su defecto) fue considerado estadísticamente significativo. Por la metodología utilizada, la modulación positiva puede ser interpretada como la sobreexpresión en una determinada muestra o bien la subexpresión en la muestra pareada. 5.3.4.1. Tinción con nitrato de plata La tinción con nitrato de plata (AgNO3) permite una aproximación altamente sensible capaz de detectar cantidades de proteína del rango de nanogramos. Finalizada la electroforesis (1D- SDS PAGE) se procedió a la fijación de las muestras en una solución de 40% etanol / 10% acético durante 2h. El exceso de fijador fue lavado y el gel sensibilizado en tiosulfato sódico 0,02% (NaTio). A continuación, se tiñó el gel durante 30’ en AgNO3 0,2% y formalina al 0,075%. Durante la tinción los iones Ag se complejarán con la proteína y se reducirán formando un coloide que se depositará sobre las bandas de proteína. Por último, la tinción se reveló en 3% KCO3, 0,025% formalina y 12,5 mg/L NaTio durante 5-10’ y se detuvo el revelado con Tris 3% / Acético 10%. Caracterización de exosomas por SILAC 81 5.3.4.2. Análisis de función para SILAC La evaluación de funciones, rutas e interacciones biológicas significativas procedentes del análisis proteómico por SILAC se realizó a través del software Ingenuity Pathways Analysis 2.0 (IPA, Ingenuity Systems). El estadístico utilizado para la búsqueda de rutas y redes significativamente representadas fue el test de Fisher de una cola. Complementariamente estos datos fueron también contrastados por GeneCodis3 y evaluados por un test hipergeométrico. La significación fue establecida para un p valor <0,05%. Adicionalmente, los datos fueron contrastados en la base de datos ExoCarta (www.exocarta.org) orientada al trabajo con vesículas extracelulares y el software libre asociado FunchRich 2.1.1. (Functional Enrichment Analysis Tool, www.funrich.org)188 para la elaboración de análisis de función y biodistribución. 82 Capítulo 6. Impacto del exosoma tumoral en el anidamiento de la Célula Tumoral Circulante 6.1. Obtención de células endoteliales 6.1.1. Cultivo celular: células endoteliales La línea celular endotelial EA.hy926 (ATCC®CRL-2922™) se empleó para la realización de ensayos de anidamiento tumoral in vitro. Esta línea procede de la hibridación de células somáticas endoteliales de la vena umbilical con células de la línea inmortalizada de cáncer de pulmón A549. EA.hy926 fue mantenida en cultivo en medio DMEM (Gibco) al 10% de FBS, 1% (v/v) de PenStrep (Gibco) y en una atmósfera adecuada. El subcultivo se llevó a cabo en diluciones de 1:8 y tripsinización de monocapas subconfluentes. 6.1.2. Cultivo celular: células primarias de vena umbilical (HUVEC) Para la obtención de células HUVEC se tomaron pedazos de 10-20 cm de cordón umbilical fresco en PBS (4°C) y se dispuso a su inmediato procesamien- to. Brevemente, tras retirar los extremos de cordón y limpiar en abundante PBS los restos de sangre e impurezas, se dispuso a la canulación y lavado de la vena umbilical. Una vez limpia la vena, se procedió al cebado de la misma con Exosoma y anidamiento tumoral 83 colagenasa 22 U/mL (Gibco) e incubación durante 5’ a 37°C. Un suave masajeo favorecerá el desprendimiento de las células endoteliales. Finalizada la incubación, se recuperaron las células endoteliales en medio de cultivo completo y se lavaron con suavidad. Las células obtenidas se decantaron (300 g, 5’, TA) y sembraron en una placa tapizada con gelatina al 0,2% (Gelatin from bovine skin type B G932-100G, Sigma). Se dejaron adherir las células durante 16h y se lavaron con PBS (x3) para eliminar células contaminantes -glóbulos rojos mayoritariamente-. Una vez estabilizado el cultivo, estas células se mezclaron con 2-3 extracciones de HUVEC con el fin de constituir un pool de células. El cultivo de estas células se realizó en Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM®2 CC-3156, Lonza; Walkersville, MD, USA) suplementado con EGM2 SingleQuots® (CC-4176; FBS 10 mL, hidrocortisona 0,2 mL, hFGF-B 2 mL, VEGF 0,5 mL, R3-IGF-1 0,5 mL, ácido ascórbico 0,5 mL, hEGF 0,5 mL, GA-1000 0,5 mL, heparina 0,5 mL, Lonza) para un volumen de 500 mL. Las células se cultivaron a 37°C, 95% HR y 5% CO2. El cultivo establecido no se utilizó durante más de 6 pases y con una dilución máxima de 1:6 en placas de cultivo previamente tratadas con gelatina 0,2% (Sigma). El medio de cultivo fue renovado cada 2 días. 6.2. Depleción de exosomas del suero Alícuotas de 500 mL de FBS (Gibco) fueron descongeladas a 4°C y centrifugadas durante 16h (100.000 g, 4°C, SW28 Beckman Coulter) para la completa depleción de componentes vesiculares. El sobrenadante resultante fue filtrado (ø poro 0,22 µm, Millipore™) y congelado a -20°C en alícuotas de 55 mL hasta su uso. No se observaron diferencias en la viabilidad y proliferación celular en el cultivo bajo depleción de exosomas para las líneas celulares indicadas. Materiales y Métodos 84 6.3. El exosoma en el anidamiento tumoral 6.3.1. Adhesiónaunasuperficiefuncionalizada con exosomas Los exosomas utilizados en estos ensayos fueron extraídos en paralelo para ambas líneas celulares y siguiendo la rutina de aislamiento referida en el apartado M&M 5.1.2. La adhesión de las células tumorales a los distintos exosomas fue precedida por el tapizado de la superficie de una placa con 30 µL de una preparación de exosomas en PBS para cada línea celular. Estos pocillos fueron dejados secar durante 24 h y, una vez fijados los exosomas al fondo de placa, se procedió a la siembra de 1x105 células en un volumen final de 100 µL de medio de cultivo completo. La línea celular tumoral correspondiente fue previamente teñida con el colorante vital fluorescente calceína (Calcein AM C3100MP, Invitrogen) según el protocolo especificado por el fabricante. A efectos de estandarización y normalización se procedió a comprobar la uniformidad de la señal de calceína en todos los pocillos inmediatamente después de la siembra de las células tumorales. Trascurridos 45’ se lavaron en PBS (x3) aquellas células no adheridas y se registró la señal fluorescente de las células remanentes en un lector de placas (485 nm, FLUO Star Optima, BMG Labtech; Ortenberg, AL). La fracción de células adheridas se determinó al normalizar la intensidad de fluorescencia con el valor obtenido a tiempo inicial. Todos los ensayos incluyeron controles negativos para los distintos grupos. 6.3.2. Adhesión a matriz extracelular Se sembraron de 1x105 células de la línea celular tumoral correspondiente teñida con el fluoróforo calceína (Invitrogen) sobre los distintos sustratos de matriz incluidos en el ECM Cell Adhesion Array Kit ECM540 (MilliporeTM). Se incubaron las células tumorales durante 45’ y, tras lavados en PBS (x3), se determinó el número de células adheridas en función de la fluorescencia emitida. Exosoma y anidamiento tumoral 85 6.3.3. Adhesión a monocapas endoteliales Primeramente se procedió al cultivo de una monocapa de células de la línea endotelial inmortalizada EA.hy926 o del cultivo primario de HUVEC. Se sembraron 2x104 células endoteliales por pocillo de P96 y se dejó formar y estabilizar la monocapa durante 16-24h. El tratamiento con exosomas se realizó en presencia de un 2% de FBS deplecionado de exosomas durante 8 horas (FBS Exo-16h, M&M 6.2). Finalizado el tratamiento, se lavaron las monocapas y se añadieron 1x105 células tumorales H-ETV5 teñidas con calceína en medio completo. Se midió la señal de fluorescencia inicial (485 nm., FLUO Star Optima, BMG) y, tras incubar durante 45’ y lavar en PBS (x3), se determinó el porcentaje de células adheridas a la monocapa endotelial. 6.3.4. Activación del endotelio con exosomas tumorales Para la determinación de la activación endotelial como respuesta al tratamiento con exosomas se sembraron 5x104 células HUVEC o EA.hy926 en medio completo 16-24h antes de incorporar los tratamientos. Los exosomas se añadieron resuspendidos en EBM2 sin factores en 2% FBS Exo-16h y se incubaron durante 8h a 37°C y 5% de CO2. Paralelamente al tratamiento con exosomas se incluyeron un control negativo y positivo de activación. El control positivo fue realizado mediante el tratamiento con TNFα 10 ng/mL (Humankine™, recombinant, expressed in hek 293 cells, Sigma). Acabado el tratamiento se lavaron los pocillos en PBS (x3) y se rascaron las células en presencia de una solución de lisis para la extracción de RNA total. Los lisados fueron congelados a -80°C hasta su uso. Materiales y Métodos 86 6.3.4.1. Extracción de RNA total de cultivo celular La extracción rutinaria de RNA total de líneas celulares se realizó con el High Pure RNA Isolation Kit (Roche Applied Science; Indianapolis, IN, USA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Brevemente se procedió a la captura de los ácidos nucleicos en membrana, digestión con DNasa, lavado de proteínas y otros contaminantes; y finalmente solubilización y elución del RNA total. 6.3.4.2. Determinación del rendimiento de RNA total La evaluación rutinaria del RNA total se llevó a cabo a través de la relación de A260/280 en un Nanodrop 2000 (ThermoScientific; Waltham, MA, USA). Los ácidos nucleicos presentan su máximo de absorbancia a 260 nm lo que, a través de la ley de Beer-Lambert, permite vincular la cantidad de luz absorbida de una muestra con su concentración. La relación A260/280 nos permitirá además estimar la pureza de la muestra ya que proteínas, fenoles y otros contaminantes presentan una fuerte absorción a 280 nm. Una relación A260/280≈ 2,0 es considerada como adecuada. 6.3.4.3. Retrotranscripción La transcripción inversa es una reacción que implica la generación de una cadena de DNA complementario (cDNA) a partir de una cadena simple de RNA. Para ello se procedió a la adición de 1 µg de RNA total de acuerdo a la siguiente fórmula para un volumen final de 20 µL. • 1 µL Random Hexamers 50 µM (ThermoFisher. Ref N8080127) • 1 µL MulV 5000 units (ThermoFisher. Ref N8080018) • 1 µL RNAase Inhibitor (ThermoFisher. Ref N8080119) • 2 µL dNTP Mix 10 mM (ThermoFisher. Ref 18427013) • 4 µL MgCl2 solution 25 mM (ThermoFisher. Ref 448224) • 2 µL 10xPCRBufferII (ThermoFisher. Ref 4376212) La reacción se desarrolló durante 45’ a 42°C, seguida de 5’ a 95°C. Para su almacenamiento a medio plazo se conservaron las muestras a -20°C. Exosoma y anidamiento tumoral 87 6.3.4.4. RT-qPCR Las reacciones de RT-qPCR se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos para las sondas correspondientes (M&M 6.4. Tabla 7) incluyendo en todo caso controles negativos de reacción, medidas por duplicado y un housekeeping gene (GAPDH) con el que se normalizaron las distintas medidas. Cada reacción de amplificación se constituyó con 9 µL de cDNA diluido 1:4 en H2O libre de nucleasas, 1 µL de la sonda TaqMan® correspondiente y 10 µL de la TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems). Cada reacción de RT-qPCR se compuso de un ciclo de preamplificación (50°C, 2’; 95°C, 10’) seguido de 40 ciclos de amplificación (95°C, 15’’; 60°C, 1’). El equipo utilizado fue un 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). 6.3.5. Expresión de proteína 6.3.5.1. Extracción de proteína total Para la evaluación de la expresión proteica en células endoteliales se procedió al sembrado de 5x105 células endoteliales y su cultivo durante 16-24h. El tratamiento de exosomas se añadió, previo lavado en PBS, resuspendido en EBM®-2 al 2% de FBS Exo-16h y 1% (v/v) de PenStrep (Gibco). Una vez tratadas las células se procedió a la recogida de la proteína total con ayuda de un scraper en 60 µL de solución RIPA (Tris-HCl 25 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM, 1% NP-40, 1% DOC, 0,1% SDS) y en presencia de inhibidores de fosfatasas (NaF 4 mM, NaSOV4 2 mM, Sigma Protease Inhibitor Cocktail 1x y PMSF 1 mM). El lisado se incubó durante 10’ en hielo en agitación para favorecer la lisis celular y finalmente se eliminaron los restos de membrana mediante su centrifugación (10.000 g, 5’, 4°C). Las muestras se conservaron a -80°C hasta su uso. 6.3.5.2. Cuantificacióndeproteínatotal El método utilizado fue la cuantificación por BCA (Bicinchoninic Acid Solution B9643, Sigma). Esta cuantificación combina la reacción de Biuret (reacción de la proteína con el ion Cu2+ en un medio alcalino para producir Cu+) con la formación de un complejo soluble de color púrpura al interaccionar el Materiales y Métodos 88 BCA con el ion Cu+ resultante. Este complejo exhibe una fuerte absorbancia a 562 nm y su medida correlaciona robustamente con la cantidad de proteína. La extrapolación de esta absorbancia en función de una recta patrón de BSA (Bovine Serum Albimun A9418, Sigma) de concentración conocida nos permitirá la determinación de la cantidad de proteína total de nuestro extracto proteico 6.3.5.3. Western blot El Western Blot es una técnica analítica que permite detectar proteínas específicas dentro de un extracto proteico. Para ello, 20-40 µg de proteína total fueron desnaturalizados (95°C, 5’) en presencia de solución de Laemmli 1X (Sigma) y cargados en un gel de SDS-poliacrilamida al 7-10%. Las muestras se resolvieron durante 1h a 80-120V embebidas en una solución de electroforesis (Tris 25mM, Glicina 192 mM, SDS 0,1% w/v). Una vez resuelto el gel, se transfirieron las proteínas a una membrana de PVDF, previamente activada en metanol, durante 1h 30’ a 300 mA y en una solución de transferencia (Tris 25 mM, Glicina 192 mM, 20% metanol). Se tiñó la membrana con solución de Ponceau S (0,1% w/v en 5% ácido acético, Sigma) y se bloqueó la membrana en leche al 5% en TBS-T (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, Tween 0,05%) durante 1h. A continuación, se procedió a la incubación con el anticuerpo primario correspondiente (M&M 6.4. Tabla 8; 16h, 4°C), lavado en TBS-T (x3, 10’, TA) e incubación con el anticuerpo secundario correspondiente en TBS-T (1h, TA) y conjugado con la HRP (Horseradish Peroxidase) (M&M 6.4. Tabla 8). Una vez finalizada la incubación y lavado el exceso (x4) de anticuerpo se procedió al revelado del mismo mediante la detección de la señal bioluminiscente de la HRP (Immobilon Western Blotting, MF-Millipore™). 6.3.6. Análisis estadísticos La recopilación y procesamiento de los datos brutos se realizó a través de los paquetes de software de MicrosoftOffice2013 para Windows. El análisis estadístico de los datos se realizó a través del software GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Softwares Inc; San Diego, CA, USA). La significación estadística (p<0,05) fue determinada por el test de Wilcoxon. Exosoma y anidamiento tumoral 89 Gen Sonda Taqman® Ref seq Caracterización de CTCs HES1 Hs00172878_m1 NM_005515.1 ITGB3 Hs01001469_m1 NM_000212.2 LGALS3 Hs00173587_m1 NM_001177388.1 NM_002306.3 NOTCH1 Hs01062014_m1 NM_017617.3 PTP4A3 Hs02341135_m1 NM_007079.3 NM_116000.1 Común GAPDH Hs99999905_m1 NM_002046.4 PTPRC Hs00894734_m1 NM_002829.3 Caracterización de exosomas de cáncer de endometrio ESR2 Hs01100353_m1 NM_001040275.1 NM_001214902.1 NM_00124903.1 NM_001271876.1 ETV5 Hs00231790_m1 NM_004454.2 GDF15 Hs00171132_m1 NM_004855.2 ICAM1 Hs00164932_m1 NM_000201.2 SELE Hs00950401_m1 NM_000450.2 SELP Hs00927900_m1 NM_003005.3 SNAI1 Hs00195591_m1 NM_005985.3 TGFB1 Hs00998133_m1 NM_000660.4 VCAM1 Hs01003372_m1 NM_001078.3 NM_001199834.1 NM_080682.2 ZEB1 Hs01566407_m1 NM_001128128.2 NM_001174093.1 NM_001174094.1 NM_001174095.1 NM_001174096.1 NM_030751.5 ZEB2 Hs00207691_m1 NM_001171653.1 NM_014795.3 Tabla 7. Sondas Taqman® empleadas en el estudio 6.4. Materiales suplementarios Antígeno /Epítopo Dilución Proveedor α-actina 1:1000 Abcam; Cambridge, UK ALIX (NB-100-65678) 1:500 Novus Biologics; Littleton, CO, USA CD81 (sc-7637) 1:500 Santa Cruz Biotech.; Dallas, TX, USA CD9 (sc-13118) 1:500 Santa Cruz Biotech.; Dallas, TX, USA HSP90B1 (NBP1-04346) 1:500 Novus Biologics; Littleton, CO, USA VCAM1 (sc-1504) 1:500 Santa Cruz Biotech.; Dallas, TX, USA Anti-Mouse HRP 1:1000 Santa Cruz Biotech.; Dallas, TX, USA Anti-Goat HRP 1:1000 Santa Cruz Biotech.; Dallas, TX, USA Tabla 8. Anticuerpos utilizados para Western blot Resultados 96 mente. La normalización de los datos arrojó 1.810 sondas con una expresión superior a 211 en al menos 8 pacientes y 2 controles; de las cuales 853 sondas resultaron significativamente más detectadas en el grupo de pacientes para un False Discovery Rate=0% y Delta=2,46. Finalmente, sólo aquellas sondas con un log2 ratio superior a 1,5 fueron consideradas resultando 305 secuencias. Aquellas sondas detectadas únicamente en pacientes y con una señal conforme a los criterios de calidad fueron incluidas también en los análisis (Tablas S7 y S8 incluidas en el CD adjunto). Paralelamente, el Análisis de Componentes Principales de los datos cribados nos permite identificar las muestras de pacientes de NSCLC como una población con un perfil de expresión diferente de las muestras de controles sanos (Figura 12). 7.1.3. Biología de las CTCs EpCAM+ en NSCLC avanzado Para la interpretación biológica de los datos del microarray se procedió a su contraste con el sotfware asociado a Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Un análisis funcional de los genes cribados destaca la presencia significativa de funciones vinculadas al movimiento celular, la supervivencia y el desarrollo, el crecimiento y proliferación celulares (Tabla 9). Podemos observar a su vez cómo estas funciones aparecen fundamentalmente orquestadas por las rutas PI3K/AKT, ERK1/2 y NFkB siendo NOTCH1 un componente destacado dentro de esta red funcional (Figura 13). Figura 12. Análisis de Componentes Principales para las muestras incluidas en el microarray. Las muestras procedentes de pacientes de NSCLC (n=10) presentan un perfil de expresión diferente respecto al identificado en controles sanos (n=4). Caracterización de CTCs en NSCLC 97 Figura 13. Red de interacción para las funciones de movimiento, desarrollo, crecimiento y proliferación celulares contenidas en el microarray de expresión de CTCs de NSCLC. NOTCH1 aparece como uno de los genes orquestando esta red de interacción. Paralelamente, un análisis ontológico por GeneCodis3 destaca la presencia de secuencias implicadas en procesos de adhesión celular, desarrollo y la organización de la matriz extracelular además de una activa función de transporte y transducción de señales (Tabla 10). Categoría Función Moléculas p valor Movimiento celular Migración de células tumorales Akt, CCL19, CD3, CDX1, ERK1/2, ITGB3, KRT8, LGALS3, MUC4, NFkB, NOTCH1, P38, MAPK, PI3K, PTP4A3, SENP1, SPHK1 5,90x10 -6 Movimiento de las células tumorales Akt, CCL19, CD3, CDX1, ERK1/2, ITGB3, Jnk, KRT8, LGALS3, MUC4, NFkB, NOTCH1, P38, MAPK, PI3K, PTP4A3, SENP1, SPHK1 3,74x10 -5 Muerte celular y supervivencia Necrosis Akt, APOL1, ATM, CCL19, CD3, CDX1, DIABLO, DNM1, ERK1/2, IgG, Interferón α, ITGB3, Jnk, KRT8, LGALS3, MAP3K10, MUC4, NFkB, NGFRAP1, NOTCH1, P38 MAPK, PI3K, PTAFR, SENP1, SLC6A3, SPHK1 8,24x10 -5 Desarrollo celular, crecimiento y proliferación celular, desarrollo de tejidos Proliferación de células epiteliales Akt, C8orf44-SGK3/SGK3, ERK1/2, ITGB3, NOTCH1, PI3K, PTAFR, SPHK1 9,55x10 -5 Tabla 9. Funciones significativamente representadas en el perfil de expresión de CTCs para NSCLC avanzado Resultados 98 Figura 14. Expresión de NOTCH1 y HES1 en CTCs de NSCLC. A) La expresión de NOTCH1 en pacientes de NSCLC (n=42) se encuentra significativamente incrementada respecto a controles sanos (n=16). B) La expresión de HES1 se encuentra incrementada en pacientes de NSCLC (n=42) frente a controles (n=16). C) HES1 en CTCs correlaciona significativamente con la expresión de NOTCH1 (n=42). Señal normalizada a PTPRC. Función Moléculas p valor Transducción de señales MAP3K10, TNR, CSNK1E, CASKIN1, MAP3K6, MCC, PLEKHG5, SPHK1, ARGHGAP33, P2RX1, CLTCL1, CHRNA4, GPSM1, ATM, CHKA <0,01 Transporte transmembrana HCN2, SLC14A2, SLC26A1, SLC11A1, KCNH3, MFSD10, SLC24A16, SLC6A3, SLC39A5, SFXN5 <0,05 Adhesión celular TNR, COL11A2, PDZD2, CASS4, KIRREL2, SORBS3, GP9, MUC4, PGM5 <0,05 Diferenciación celular MDFI, NHLH2, CATSPERG, NKX2.5, LGALS3, GPSM1, SCXA <0,05 Desarrollo embrionario MDFI, FOXP3, NOTCH1, DLK1 <0,05 Organización de la matriz extracelular TNR, OLFML2A, APBB2, LGALS3 <0,05 Tabla 10. Funciones destacadas en el perfil de expresión de CTCs por GeneCodis3 Finalmente, la activación de NOTCH1 en nuestras muestras enriquecidas en CTCs de pacientes de NSCLC fue confirmada por RT-qPCR (p valor<0,001; Figura 14A). Asimismo, la expresión de HES1, un gen efector down-stream en la ruta de Notch1, resultó significativamente incrementada en pacientes (p valor=0,041; Figura 14B) estableciéndose una correlación positiva con los niveles de expresión de NOTCH1 (p valor=0,003; Figura 14C). Estos resultados confirman la relevancia de NOTCH1 en el perfil de expresión de las CTCs en NSCLC. Caracterización de CTCs en NSCLC 99 7.1.4. Validación del microarray de expresión génica por RT-qPCR Paralelamente a la evaluación de la función biológica de NOTCH1 se procedió a la validación del perfil de expresión génica para CTCs EpCAM+ en pacientes con NSCLC avanzado. Para ello, se determinó la expresión para un número limitado de genes candidato incrementados significativamente en muestras de pacientes de NSCLC y vinculados a la red de NOTCH1 por IPA. Los genes analizados fueron LGALS3 (Lectin Galactoside-Binding Soluble 3), ITGB3 (Integrin beta 3) y PTP4A3 (Protein tyrosine phosphatase type IVA 3). El análisis de la señal por RT-qPCR confirma un incremento de expresión significativo para los genes seleccionados comparado en comparación con las muestras procedentes de controles sanos (Figuras 15A, 15B y 15C). Figura 15. Validación del perfil de expresión génica de CTCs EpCAM+ en NSCLC y función de la ruta de NOTCH1. LGALS3 (p valor <0,001), ITGB3 (p valor<0,05) y PTP4A3 (p valor<0,01) presentan una expresión diferencial en CTCs EpCAM+ de pacientes de NSCLC (n=42) frente a controles sanos (n=16) por RT-qPCR. Resultados 100 7.2. La inhibición de Notch previene la proliferación en ausencia de sustrato Con el fin de confirmar la influencia de la ruta de Notch en la supervivencia y proliferación de las CTCs que darán lugar a las metástasis se procedió a evaluar la capacidad de proliferar en ausencia de sustrato de la línea celular de adenocarcinoma A549 en presencia de un potente inhibidor de la ruta de Notch, el inhibidor de γ-secretasa DAPT. El tratamiento con DAPT fue capaz de reducir de manera significativa la proliferación en ausencia de sustrato in vitro de estas células a distintas concentraciones demostrando la influencia de la ruta de Notch en la colonización celular (p valor=0,031; Figura 16). 7.3. Valor pronóstico de los biomarcadores validados Con el objetivo de profundizar en la utilidad clínica de las CTCs inmunoaisladas en pacientes con NSCLC avanzado, el perfil de expresión de CTCs nos proporcionó de una serie de potenciales marcadores para el diagnóstico y pronóstico clínico. Para ello, definimos un grupo de mal pronóstico para cada biomarcador dentro de nuestra cohorte de pacientes compuesto por el 33% de los pacientes (n=14) con la señal más alta por RT-qPCR para la relación marker-PTPRC. Figura 16. Inhibición de Notch en A549. El tratamiento con el inhibidor de Notch DAPT es capaz de disminuir significativamente la proliferación en ausencia de sustrato de la línea de cáncer de pulmón A549 (n=6). Caracterización de CTCs en NSCLC 101 El análisis de Cox univariante permitió identificar capacidad pronóstico para Supervivencia Libre de Progresión (PFS) en NOTCH1 (p valor=0,034), PTP4A3 (p valor=0,003), LGALS3 (p valor =0,044) e ITGB3 (p valor=0,046); del mismo modo para ITGB3 y Supervivencia Global (OS) (p=0,006) (Tabla 11, panel superior). GAPDH, un marcador indirecto de la carga tumoral, presenta consecuentemente valor clínico en la predicción de PFS (p valor=0,001) y OS (p valor=0,001) (Tabla 11, panel superior). Del mismo modo, el contraste con algunas las variables clínicas más importantes nos permitió identificar la presencia de metástasis óseas como la única variable clínica con valor pronóstico dentro de nuestra corte de pacientes (p valor=0,014). La variable Estado Funcional (del inglés, Performance Status), considerada la variable clínica con mayor potencia pronóstica en cáncer de pulmón, muestra un valor cercano a la significación (p valor=0,055) para OS (Tabla 11, panel inferior). Sup. libre de progresión Supervivencia global Análisis de Cox univariante RR (95% IC) p valor RR (95% IC) p valor GAPDH (mal vs. buen pronóstico) 5,71 (2,4-13,4) <0,001 9,11 (3,5-23,9) <0,001 NOTCH1 (mal vs. buen pronóstico) 2,11 (1,0-4,2) 0,034 1,16 (0,6-2,4) 0,689 PTP4A3 (mal vs. buen pronóstico) 3,10 (1,5-6,5) 0,003 1,45 (0,7-3,0) 0,305 LGALS3 (mal vs. buen pronóstico) 2,03 (1,0-4,0) 0,044 1,60 (0,8-3,2) 0,193 ITGB3 (mal vs. buen pronóstico) 2,02 (1,0-4,0) 0,046 2,74 (1,3-5,6) 0,006 Estado Funcional (PS2-3 vs. PS0-1) 1,67 (0,7-3,9) 0,236 1,56 (0,7-3,6) 0,055 Sexo (hombre vs. mujer) 1,11 (0,5-2,4) 0,792 1,08 (0,4-2,6) 0,863 Histología (escamoso vs. adenocarcinoma) 1,45 (0,7-3,0) 0,319 1,08 (0,5-2,4) 0,847 Estadio patológico (IIIA/IIIB vs. IV) 1,08 (0,4-2,6) 0,859 1,13 (0,4-2,9) 0,803 T (T3/T4 vs. T0/T1/T2) 1,52 (0,8-3,0) 0,234 1,00 (0,5-2,1) 0,990 N (N3 vs. N0/N1/N2) 1,72 (0,9-3,3) 0,101 1,37 (0,7-2,7) 0,364 Nº de metástasis (≥2 vs. <2) 1,37 (0,7-2,6) 0,359 1,78 (0,9-3,7) 0,118 Metástasis óseas (Sí vs. No) 2,39 (1,2-4,8) 0,014 1,82 (0,9-3,7) 0,096 HR: Riesgo Relativo; CI: Intervalo de confianza. Tabla 11. Análisis de Cox univariante para los marcadores de CTCs y parámetros clínico-patológicos Resultados 102 Figura 17. Curvas Kaplan-Meier para los marcadores de CTCs validados (GAPDH, NOTCH1, PTP4A3, LGALS3 e ITGB3) en NSCLC para Supervivencia Libre de Progresión: Grupos de mal pronóstico para cada marcador definidos como el 33% de los pacientes con mayor expresión por RT-qPCR (n=14). Grupo de baja expresión (n=28) compuesto por el 77% de los pacientes restantes para un total de 42 pacientes. Valores de expresión para cada marcador normalizados a la expresión de PTPRC. IC: intervalo de confianza. Asimismo, las curvas Kaplan-Meier confirman el valor pronóstico de NOTCH1, PTP4A3, LGALS3, ITGB3 y GAPDH para PFS (Figura 17); y de GAPDH e ITGB3 para OS (Figura S1. Material Supl. 8.6). Caracterización de CTCs en NSCLC 103 Finalmente, el análisis multivariante del panel de biomarcadores con la presencia de metástasis óseas -como única variable clínica con valor pronóstico en nuestra cohorteotorga un valor pronóstico independiente de PFS para GAPDH, NOTCH1 y PTP4A3; del mismo modo que GAPDH e ITGB3 para OS (Tabla 12). A raíz de estos resultados, se procedió a la realización de un análisis de regresión logística para el panel de biomarcadores con el fin de evaluar su valor clínico para progresión temprana (<4 meses) en NSCLC. La composición en el modelo de GAPDH, PTP4A3 y NOTCH1 presenta el mayor valor pronóstico dentro de nuestra cohorte de pacientes (AUROC= 0,772; Figura 18). Supervivencia libre de progresión Supervivencia global Análisis de Cox multivariante RR (95% IC) p valor RR (95% IC) p valor GAPDH GAPDH (mal vs. buen pronóstico) Metástasis ósea (Sí vs. No) 5,67 (2,1-15,6) 1,16 (0,5-2,7) 0,001 0,727 10,29(3,4-30,7) 0,74 (0,3-1,8) <0,001 0,503 NOTCH1 NOTCH1 (mal vs. buen pronóstico) Metástasis ósea (Sí vs. No) 2,20 (1,1-4,4) 2,48 (1,2-5,0) 0,027 0,011 1,22 (0,6-2,5) 1,86 (0,9-3,7) 0,582 0,087 PTP4A3 PTP4A3 (mal vs. buen pronóstico) Metástasis ósea (Sí vs. No) 3,17 (1,5-6,7) 2,45 (1,2-4,9) 0,002 0,012 1,57 (0,8-3,2) 1,92 (0,9-3,9) 0,222 0,073 LGALS3 LGALS3 (mal vs. buen pronóstico) Metástasis ósea (Sí vs. No) 1,93 (0,9-3,9) 2,29 (1,1-4,6) 0,067 0,021 1,59 (0,8-3,2) 1,81 (0,9-3,7) 0,204 0,101 ITGB3 ITGB3 (mal vs. buen pronóstico) Metástasis ósea (Sí vs. No) 1,72 (0,8-3,5) 2,12 (1,0-4,3) 0,134 0,040 2,72 (1,3-5,6) 1,59 (0,8-3,3) 0,007 0,211 RR: Riesgo relativo; IC: Intervalo de confianza. Tabla 12. Análisis de Cox multivariante para los marcadores de CTCs y presencia de metástasis óseas Figura 18. Modelo de regresión logística para los marcadores de CTCs en NSCLC. La combinación de GAPDH, NOTCH1 y PTP4A3 representa el mejor ajuste al modelo dentro de nuestra cohorte (n=42). Resultados 104 Adicionalmente, la definición de una variable compuesta por incremento de alguno de estos tres biomarcadores de CTCs incluidos en el modelo y con valor pronóstico independiente nos permite determinar su valor pronóstico para PFS y OS por Kaplan-Meier (Figura 19); del mismo modo que un análisis de Cox multivariante en combinación con la presencia de metástasis óseas identifica su valor pronóstico independiente para PFS y OS (Tabla 13). Figura 19. Curvas Kaplan-Meier para PFS y OS y la acumulación de biomarcadores de CTCs incluidos en el modelo de regresión logística. Variable construida en función de la presencia de algún biomarcador en el grupo de mal pronóstico. Grupo de mal pronóstico definido como el 33% de las expresiones más altas para cada biomarcador en la cohorte de 42 pacientes de NSCLC. A) Pacientes con algún marcador pronóstico elevado presentan una SFP significativamente menor. B) OS para aquellos pacientes con alguno de los marcadores de CTCs elevados es significativamente inferior a aquellos que no presentan valores de expresión en el grupo de mal pronóstico para alguno de los biomarcadores. Supervivencia libre de progresión Supervivencia global Análisis de Cox multivariante RR (95% IC) p valor RR (95% IC) p valor Acumulación de biomarcadores* Biomarc. de CTC (1,2 o 3 altos vs. ninguno) Metástasis ósea (Sí vs. No) 3,06 (1,5-6,3) 2,22 (1,1-4,5) 0,002 0,028 2,33 (1,1-4,8) 1,91 (0,9-3,9) 0,022 0,077 *Acumulación para los biomarcadores de CTCs GAPDH, NOTCH1 y PTP4A3 definidos en el modelo de regresión logística y con valor pronóstico independiente. Expresión alta para cada marcador individual cuando incluida en el percentil 33 más alto para la cohorte de 42 pacientes de NSCLC. RR: Riesgo relativo; IC: Intervalo de confianza. Tabla 13. Análisis de Cox multivariante para la acumulación de marcadores de CTCs y presencia de metástasis óseas 105 Capítulo 8. Caracterización de exosomas de HEC-1A y H-ETV5 e influencia en el anidamiento tumoral al endotelio 8.1. Obtención de exosomas de cáncer de endometrio Las vesículas extracelulares y su función han demostrado en los últimos años representar un abordaje prometedor en el estudio y manejo de distintas enfermedades. Actualmente el trabajo con exosomas está condicionado por una serie de limitaciones técnicas y de manejo que dificultan el establecimien- to de una rutina de trabajo estándar. A esta situación se une a menudo una terminología confusa e imprecisa que dificulta la definición de las distintas subpoblaciones de EVs. Existen, sin embargo, unas directrices propuestas por la Sociedad Internacional para las Vesículas Extracelulares (ISEV) ampliamente aceptadas y que pretenden acotar el trabajo con vesículas extracelulares158,162. De acuerdo a estas directrices los exosomas fueron caracterizados desde tres aproximaciones distintas: 1) La observación directa por microscopia electrónica TEM de exosomas enteros. 2) La detección de determinadas proteínas referencia cuya presencia aparece enriquecida / disminuida en las preparaciones de exosomas. 3) La evaluación de rutina de la concentración y distribución de tamaño de los aislados de exosomas de acorde a unos parámetros establecidos. Resultados 112 Figura 28. Proliferación de HEC- 1A y H-ETV5 a concentraciones decrecientes de L-Arginina y L-Lisina. Concentraciones de partida standard para medios de cultivo de rutina L-Arg (84 mg/L) y L-Lys (148 mg/L). Figura 27. Características fenotípicas HEC-1A y H-ETV5 durante el marcaje SILAC. La utilización de reactivos SILAC no afecta a las características microscópicas de las células. La línea célula H-ETV5 mantiene un fenotipo mesenquimal derivado de EMT. 8.4.1. Fase de adaptación La realización de SILAC implica el uso de reactivos específicos en los que se ha realizado la depleción de los aminoácidos naturales L-Lys y L-Arg. Estos aminoácidos esenciales deberán ser añadidos de manera externa. Como refleja la Figura 27 la utilización de los reactivos específicos de SILAC no provocó alteración en las características fenotípicas y de proliferación. Paralelamente, el exceso de L-Lys y L-Arg fue previsto mediante el ajuste de la cantidad disponible de estos aminoácidos. La proliferación de ambas líneas a concentraciones decrecientes de estos aminoácidos determinó las concentraciones de 28 mg/L para L-Arg y 73 mg/L para L-Lys, una dilución 1/3 y ½ de las concentraciones originales, como concentraciones suficientes pero no excesivas para el marcaje de las líneas por SILAC (Figura 28). Caracterización de exosomas por SILAC 113 8.4.2. Fase experimental Una vez establecidas las condiciones de marcaje y acondicionadas las células a estas se procedió a la incorporación del marcaje metabólico mediante su incorporación al medio de cultivo. Se puede observar como ambas líneas proliferan con normalidad independientemente del marcaje incorporado (Figura 29A). Transcurridos 8 ciclos de división se tomó de una muestra del proteoma para la determinación de la eficiencia del marcaje por LC-MS. Los resultados nos permiten confirmar un marcaje aproximado del 98% para ambas líneas celulares (Figura 29B; no mostrado para H-ETV5). Hecho esto, se procedió a la obtención de las distintas fracciones de proteoma, secretoma soluble y exosoma para su análisis por LC-MS de acuerdo a los protocolos referidos. 8.4.3. Análisis de las muestras de proteoma, secretoma y exosoma Extraídas las distintas fracciones se procedió a certificar su estado mediante su tinción con nitrato de plata (Figura 30). A continuación, de procedió a su análisis por LC-MS/MS de acuerdo a los protocolos especificados en el apartado M&M 5.3.4. En el caso de las muestras de exosomas se procedió adicionalmente al análisis conjunto de las fracciones procedentes de HEC-1A heavy / H-ETV5 middle (Figura 30, Gel C). Figura 29. Marcaje para SILAC. A) HEC-1A y H-ETV5 proliferan con normalidad independientemente del marcaje incorporado. B) Transcurridos 8 ciclos de división la eficiencia del marcaje con L-Lys y L-Arg se aproxima a la uniformidad para una muestra de proteoma de HEC-1A. Resultados 114 De acuerdo a lo referido en el apartado de M&M, previo a su lanzamien- to, los secretomas solubles fueron deplecionados completamente de exosomas por ultracentrifugación durante 16h (100.000 g, 4°C) (M&M 5.3.3.3). Paralelamente se realizó una depleción de exosomas menos agresiva (90’) en el caso de que la proteína del secretoma pudiera resultar alterada en una centrifugación tan intensa. En la Figura 30 (Gel B) podemos ver el perfil de proteína para las muestras heavy una vez deplecionados y concentrados los secretomas pudiendo concluir que los secretomas no se ven significativamente alterados durante el proceso de ultracentrifugación. Finalmente se procedió al lanzamiento y análisis de las distintas muestras de acuerdo a los criterios mencionados (M&M 5.3.4.). 8.4.3.1. Proteínas moduladas para el proteoma Un análisis detallado por FunRich de las proteínas identificadas en el proteoma celular de ambas líneas (453 eventos. Tabla S9. Disponible en el CD adjunto) muestra un enriquecimiento en proteínas de localización citoplasmática (>60%) o nuclear (49%; no mostrado). Figura 30. Geles de poliacrilamida teñidos con nitrato de plata para las distintas fracciones de proteoma (A), secretoma soluble (B) y exosoma (C). No se observan diferencias en el perfil proteico de las muestras de secretoma con una depleción de vesículas extracelulares de 90’ y aquellas deplecionadas de vesículas extracelulares durante 16 horas. Caracterización de exosomas por SILAC 115 De entre las proteínas moduladas en el proteoma se encontraron 44 proteínas significativamente up-reguladas en H-ETV5 mientras que 34 resultaron significativamente moduladas en sentido opuesto (M&M 8.6. Tablas S1 y S2). De entre las proteínas significativamente moduladas en H-ETV5 encontramos proteínas vinculadas a procesos de glicolisis / gluconeogénesis además de la modulación positiva de DHRS2 -o Hep27- del mismo modo al identificado por Monge y colaboradores189 con anterioridad. En este sentido, la modulación positiva de DHRS2 ha demostrado una actividad protectora a la apoptosis inducida por estrés mediante la estabilización de p53/TP53. Consecuentemente, encontramos la modulación de distintos genes vinculados a respuesta a estrés (HS90AA1, HS90AB1, HSPA4, HSPD1, HSPA9, HSPA8). Finalmente, somos capaces de identificar también la presencia de distintas citoqueratinas (KRT18, KRT19, KRT7, KRT8) cuya expresión se encuentra incrementada en HEC-1A, algo en consonancia con su fenotipo. 8.4.3.2. Proteínas moduladas para el secretoma El análisis de los secretomas deplecionados de exosomas permitió la identificación de 512 proteínas (Tabla S10. Disponible en el CD adjunto). Del total de identificaciones 166 de ellas fueron localizadas simultáneamente en el proteoma y en el secretoma (Figura 31A). Como es de esperar, de entre las proteínas identificadas exclusivamente en el proteoma y aquellas Figura 31. Perfil proteico del secretoma soluble de HEC-1A y H-ETV5 por SILAC. A) Número de eventos identificados para cada una de las fracciones e identificaciones en común. B) Distribución celular de las proteínas identificadas de manera exclusiva en el proteoma o el secretoma. Resultados 116 exclusivas del secretoma encontramos un enriquecimiento en cuanto su distribución celular cuando analizado por FunRich. Mientras que las proteínas identificadas de manera exclusiva en el proteoma tienen un perfil preferentemente citoplasmático y nuclear, la fracción del secretoma muestra un enriquecimiento en proteínas de localización extracelular (Figura 31B). Se identificaron 35 proteínas moduladas positivamente en H-ETV5 apareciendo únicamente 3 de ellas entre las moduladas en el proteoma (TPI1, TCP1 y AHCY). De entre las moduladas en el secretoma de HEC-1A se identificaron 76 proteínas significativamente up-reguladas en el secretoma, apareciendo únicamente FLNA entre las modulaciones del proteoma (M&M 8.6. Tablas S3 y S4). El análisis de las proteínas moduladas positivamente para H-ETV5 revela la presencia significativa de moléculas vinculadas a la red “Cell death & Survival” (p valor=1,86x10-2 – 2,67x10-6; Figura 32A) en consonancia con las observaciones realizadas en el proteoma. Atendiendo a aquellas proteínas que aparecen moduladas para el secretoma de HEC- 1A (M&M 8.6. Tabla S4), un análisis orientado a la búsqueda de rutas moleculares representadas destaca la señalización y remodelación de uniones adherentes a través de la ruta de ILK (Integrin-linked kinase; Figura 32B). Figura 32. Proteínas moduladas positivamente en el secretoma. A) Red de interacción para la función Cell death & Survival de entre las proteínas moduladas positivamente en el secretoma de H-ETV5 por IPA. 21 moléculas implicadas en la red (28%). B) Funciones destacadas de entre las proteínas moduladas positivamente en el secretoma de HEC-1A por IPA. Caracterización de exosomas por SILAC 117 8.4.3.3. Proteínas moduladas para el exosoma Para el análisis de las proteínas moduladas en el exosoma se procedió adicionalmente a la realización de un switch del marcaje. Se analizaron por tanto 4 muestras: HEC-1A middle, HEC-1A heavy, H-ETV5 middle y H-ETV5 heavy (M&M. 5.3.1.). El total de proteínas identificadas en las muestras de exosomas es de 119. De las cuales 56 de ellas identificadas en ambos marcajes de manera independiente, estando a su vez el 88.9% de ellas identificadas como proteínas de localización exosomal por FunRich. De entre el total de identificaciones (Tabla S11. Disponible en el CD adjunto), 16 proteínas se detectaron de manera conjunta en ambos marcajes de exosomas y ausentes en el secretoma (Tabla 14). Destaca la presencia en este grupo de tres tetraspaninas (CD9, CD63 y CD81) frecuentemente utilizadas como marcadores de membrana para preparaciones de exosomas; y de PCD6IP como marcador citosólico de exosomas. Encontramos también la presencia de EpCAM, el cual ha sido propuesto en ocasiones como marcador de vesículas extracelulares y como proteína a partir de la cual llevar a cabo el enriquecimiento de EVs en medios condicionados y líquidos biológicos de manera similar a como se viene realizando en el trabajo con CTCs. Coherentemente, dentro de estas identificaciones no aparece HSP90B1, el cual se utiliza como control negativo de aislados de exosomas y que sí aparece identificado en el proteoma. Atendiendo a las proteínas encontradas moduladas se identificaron 10 proteínas up-reguladas en el exosoma de H-ETV5; de las cuales CLTC y CCT2 se identificaron también de entre las moduladas en el proteoma. No se identificaron modulaciones coincidentes entre el exosoma de H-ETV5 y su secretoma. Paralelamente se identificaron 21 proteínas como up-reguladas en el exosoma de HEC-1A (M&M 8.6. Tablas S5 y S6) habiendo sido ANXA1 identificada también como modulada en el proteoma . Adicionalmente, 13 de ellas se identificaron también como moduladas para el secretoma de HEC- 1A (TNC, NID2, TINALGL1, LGALS3BP, HSPG2, VCAN, LAMA5, COL18A1, LAMC1, ACTG1, AGRN, TUBA1B y EZR). Resultados 118 Símbolo Nombre Función Detección en exosomas* Observaciones CD63 CD63 antigen Migración. Transp. endosomal CRC, mel, Prost Marcador de exosomas CD81 CD81 antigen Modulación inmune. Proliferación. CRC, Blad, mel, Prost, OV, Asc Marcador de exosomas CD9 CD9 antigen Modulación inmune. Migración. Invasión. CRC, Asc, mel, OV, Prost Marcador de exosomas EPCAM Epithelial cell adhesión molecule Adhesión. Proliferación CRC, Asc, OV, Prost Marcador de exosomas FTH1 Ferritin heavy chain Transporte vesicular post- Golgi. HCC, OV HIST1H2AA Histone H2A Estabilización del DNA - Marcador vesículas apoptóticas ITGA3 Integrin alpha-3 Adhesión. Invasión CRC, Blad, mel, OV, Prost Interacciona con CD9, ITGB1 ITGB1 Integrin beta-1 Adhesión célula-célula y con la matriz extracelular. Migración. Proliferación. CRC, HCC, mel, OV, Prost LYZ Lysozyme C Citólisis. Respuesta inflamatoria. CRC MFGE8 Lactadherin Adhesión. Angiogénesis. Fagocitosis CRC, mel, HCC, Blad, OV, Prost MVP Major vault protein Proliferación. CRC, HCC, mel, OV PCD6IP Programmed cell death 6- interacting protein Crecimiento tumoral CRC, HCC, me, OV, Prost Marcador de exosomas PTGFRN Prostaglandin F2 receptor negative regulator Transporte trans-Golgi CRC, HCC, mel, OV, Prost Vinculada a CD9, CD63 y CD81 RPL6 Ribosomal protein 60S Complejo ribosomal CRC, HCC, mel SDCB1 Syntenin-1 Invasión CRC, mel Secreción de exosomas SLC1A5 Neutral amino acid transporter B (0) Transportador de amino-ácidos CRC, mel, OV, Prost * Moléculas identificadas con anterioridad en exosomas tumorales de distinta naturaleza por ExoCarta. CRC: Cáncer colorrectal; mel: Melanoma; HCC: Carcinoma hepatocelular; Blad: Cáncer de vejiga; OV: Cáncer de ovario; Prost: Cáncer de próstata; Asc: Ascitis. Tabla 14. Proteínas identificadas por SILAC en ambas preparaciones de exosomas y ausentes en el secretoma Caracterización de exosomas por SILAC 119 Un análisis funcional por IPA de las proteínas moduladas positivamente para H-ETV5 identifica las funciones “Cell death & survival” como la función más destacada (p valor= 4,60x10-2 – 9,63x10-5) en consonancia con el perfil obtenido para el proteoma y el secretoma. Finalmente, la búsqueda por IPA de rutas significativamente representadas entre las proteínas up-reguladas en HEC-1A nos remite a la función Tissue & Cell morphology (p valor=1,05x10-10–3,25x10-4) aludiendo a una morfología anormal de la membrana basal y al movimiento e invasión tumoral (Tabla 15). Además, un análisis funcional por GeneCodis3 permite identificar que más de la mitad de las modulaciones positivas para HEC-1A están directamente vinculadas a procesos de adhesión (p valor= 2,82x10-9). De entre las proteínas identificadas como moduladas positivamente para el exosoma de HEC-1A se seleccionaron 7 de ellas para su validación por MRM (Multiple Reaction Monitoring) en plasma en una cohorte de 85 pacientes de cáncer de endometrio. Adicionalmente, las tetraspaninas C9, CD63 y CD81; y EpCAM se incluyeron como marcadores de exosomas y normalizadores internos del contenido exosomal. Categoría Función Moléculas p valor Morfología y desarrollo tisular Morfología anormal de la membrana basal COL18A1, HSPG2, ITGA3, LAMC1, NID1 1,05x10-10 Formación de la membrana basal HSPG2, LAMB1, LAMC1, NID1 7,77x10-9 Movimiento y morfología celular Movimiento de las células tumorales COL18A1, EZR, ITGA3, LAMA5, TNC, VCAN 5,32x10-9 Invasión celular ANXA1, ANXA2, COL18A1, EZR, ITGA3, LAMA5, LAMC1, TNC, VCAN 3,29x10-7 Sprouting AGRN, ANXA2, COL18A1, EZR, HSPG2, ITGA3, TNC 1,44x10-7 Tabla 15. Funciones incluidas en la red Tissue & Cell Morphology por IPA Resultados 120 8.5. Influenciadelexosomaenel anidamiento tumoral 8.5.1. Adhesión de las células tumorales a exosomas El análisis proteico por SILAC de los exosomas diferencia entre un perfil adhesivo en los exosomas procedentes de HEC-1A frente a un perfil orientado a la supervivencia e invasión en los aislados de exosomas de H-ETV5. La funcionalización en placa con exosomas nos permite observar cómo el exosoma es un reflejo del fenotipo de la célula de la que procede. El proceso de EMT en HEC-1A deriva en un fenotipo con una gran movilidad -H-ETV5- pero que por el contrario ve disminuida su capacidad de adhesión significativamente (p valor=0,031; Figura 33A). Asimismo, mientras que la funcionalización de una superficie de cultivo con exosomas de HEC-1A es capaz de favorecer la adhesión celular (p valor=0,031; Figura 33A). La funcionalización con exosomas de H-ETV5 no es capaz de incrementar su propia adhesión (p valor=0,562). Esta observación no es línea-específica, sino que la funcionalización con exosomas de HEC-1A es capaz de favorecer la adhesión de la línea poco adhesiva H-ETV5 (p valor= 0,031; Figura 33B). Por el contrario, la funcionalización con exosomas de H-ETV5 es capaz de disminuir la adhesión de la línea HEC-1A (p valor= 0,031; Figura 33B) . Figura 33. Efecto del exosoma en la adhesión de las células tumorales de CE. A) El proceso de EMT disminuye la capacidad de adhesión de HEC-1A (n=6). El exosoma de HEC-1A incrementa la adhesión de la célula tumoral (n=6). B) El exosoma de HEC-1A es capaz de incrementar la adhesión de la línea mesenquimal H-ETV5 (n=6). El exosoma en el anidamiento tumoral 121 Figura 34. Adhesión de HEC-1A y H-ETV5 a componentes de la matriz. H-ETV5 presenta mayor capacidad de adhesión que HEC-1A a componentes de la matriz extracelular (n=2). Valores de adhesión normalizados a la adhesión de HEC-1A 8.5.2. Adhesión de las células tumorales a matriz extracelular Dada la presencia de numerosas proteínas de matriz identificadas como moduladas positivamente en el exosoma de HEC-1A se procedió a evaluar la capacidad de adhesión de las células tumorales HEC-1A y H-ETV5 a distintos componentes de la matriz extracelular. Los resultados arrojan un incremento en la capacidad de la célula H-ETV5 de adherirse a dichos sustratos (Figura 34). 8.5.3. Adhesión de las células tumorales a endotelio condicionado por exosomas Una vez determinada la influencia de los exosomas en la capacidad de adhesión de las células tumorales a la superficie de cultivo se procedió a evaluar su influencia sobre monocapas de células endoteliales de la línea de cultivo EA.hy926 o células HUVEC de cultivo primario. El condicionamien- to durante 8h de monocapas de células HUVEC con exosomas de HEC-1A produce un incremento significativo en la capacidad de adhesión de la línea célular H-ETV5 en monocapas de HUVEC (p valor=0,031). En el caso de monocapas de Ea.hy926 se observa una tendencia no llegándose a la significación (p valor=0,125; Figuras 35A y 35B). Materiales y Métodos 128 Símbolo* Acceso* % Cob** Nombre N ° Pép*** HEC-1A : H-ETV5 p valor CLTC Q00610 23,4 Clathrin heavy chain 1 14 0,437 0 HIST4H4 P62805 29,1 Histone H4 4 0,446 <0,05 MFGE8 Q08431 46,3 Lactadherin 4 0,507 <0,01 GAPDH P04406 32,5 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 5 0,755 <0,05 HSPA8 P11142 26,2 / 31,2+Heat shock cognate 71 kDa protein 4 / 4+0,806 / 0,771+<0,05 FTH1 P02794 31,2 Ferritin heavy chain 3 0,168 <0,05 RPS5 P46782 25,5 40S ribosomal protein S5 2 0,315 <0,05 NID1 P14543 39,4 Nidogen-1 24 0,320 0 COL4A2 P08572 27,5 Collagen alpha-2(IV) chain 8 0,481 <0,05 CCT2 P78371 31,2 T-complex protein 1 subunit beta 4 0,639 <0,05 *Número de acceso y abreviatura para la base de datos Uniprot; ** Cobertura de secuencia; *** Péptidos identificados con más del 95% de confianza + Identificada en ambos marcajes Tabla S5. Proteínas significativamente moduladas para el exosoma de HEC-1A / H-ETV5 por SILAC Proteínas más expresadas en el exosoma de H-ETV5 respecto a HEC-1A Símbolo* Acceso* % Cob** Nombre N ° Pép*** HEC-1A : H-ETV5 p valor HEXA P06865 38,4 Beta-hexosaminidase subunit alpha 6 1,875 <0,05 PTPRF P10586 39,5 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase F 9 1,865 0 NPEPPS P55786 28,7 Puromycin-sensitive aminopeptidase 5 1,861 <0,05 TARS P26639 21,6 Threonyl-tRNA synthetase, cytoplasmic 2 1,847 <0,01 CTSZ Q9UBR2 46,5 Cathepsin Z 3 1,847 <0,05 HSPA4 P34932 40,7 Heat shock 70 kDa protein 4 10 1,832 <0,01 PPP2R1A P30153 30,9 Serine/threonine-protein phosphatase 2A 65 kDa regulatory subunit A alpha 4 1,830 <0,01 GLB1 P16278 41,8 Beta-galactosidase 12 1,749 <0,05 FDPS P14324 7,6 Farnesyl pyrophosphate synthase 2 1,726 <0,05 ALCAM Q13740 47,3 CD166 antigen 13 1,701 <0,001 PKM P14618 80,6 Pyruvate kinase isozymes M1/M2 46 1,678 0 RNH1 P13489 38,8 Ribonuclease inhibitor 3 1,677 <0,05 GGH Q92820 51,9 Gamma-glutamyl hydrolase 10 1,644 <0,01 LSR Q86X29 34,5 Lipolysis-stimulated lipoprotein receptor 5 1,573 <0,01 VCL P18206 56,1 Vinculin 13 1,531 <0,001 EZR P15311 58,7 Ezrin 12 1,507 <0,01 BCAM P50895 29,3 Basal cell adhesion molecule 4 1,497 <0,05 DSG2 Q14126 44,7 Desmoglein-2 14 1,482 0 NEU1 Q99519 32,5 Sialidase-1 6 1,478 <0,05 LDHA P00338 41 L-lactate dehydrogenase A chain 8 1,445 <0,05 UBA1 P22314 43,8 Ubiquitin-like modifier-activating enzyme 1 13 1,414 <0,01 TIMP1 P01033 61,4 Metalloproteinase inhibitor 1 16 1,373 <0,05 PLOD3 O60568 24,4 Procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5- dioxygenase 3 4 1,358 <0,01 HSP90AB1 P08238 67,3 Heat shock protein HSP 90-beta 30 1,355 <0,05 SPTAN1 Q13813 42 Spectrin alpha chain, brain 19 1,344 <0,05 FUCA2 Q9BTY2 37 Plasma alpha-L-fucosidase 12 1,318 <0,01 TXNRD1 Q16881 48,2 Thioredoxin reductase 1, cytoplasmic 10 1,318 <0,01 *Número de acceso y abreviatura para la base de datos Uniprot; ** Cobertura de secuencia; *** Péptidos identificados con más del 95% de homología Tabla S4 continuación. Proteínas significativamente moduladas para el secretoma de HEC-1A / H-ETV5 por SILAC. Parte 2 de 2. Proteínas más expresadas en el secretoma de HEC-1A respecto a H-ETV5 En negrita proteínas vinculadas a la ruta ILK y/o remodelación de uniones adherentes Materiales suplementarios 129 Símbolo* Acceso* % Cob** Nombre N ° Pép*** HEC-1A : H-ETV5 p valor TNC P24821 20,4 Tenascin 13 32,755 0 LAMC1 P11047 16,8 Laminin subunit gamma-1 6 6,937 <0,01 ANXA1 P04083 37,6 Annexin A1 4 5,723 <0,05 COL18A1 P39060 26,2 / 27,1+Collagen alpha-1(XVIII) chain 15 / 17 5,483 / 1,379+<0,001 LAMA5 O15230 30,1 / 30,9+Laminin subunit alpha-5 36 / 24 4,813 / 1,206+<0,001 LAMB1 P07942 10,0 Laminin subunit beta-1 2 4,691 <0,05 HSPG2 P98160 30,9 Basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan 48 3,773 / 2,380+0 LGALS3BP Q08380 48,2 / 42,9+Galectin-3-binding protein 27 / 19 3,732 / 2,198+0 NID2 Q14112 17,7 Nidogen-2 9 3,424 <0,001 TINAGL1 Q9GZM7 43,3 / 32,1+Tubulointerstitial nephritis antigen-like 9 / 6 3,414 / 3,116+<0,001 ANXA2 P07355 35,1 / 34,2+Annexin A2 4/ 7+3,184 / 1,554+<0,001 VCAN P13611 5,9 Versican core protein 53,133 / 1,859+<0,01 AGRN O00468 38,2 Agrin 32 3,087 <0,01 HIST4H4 P62805 58,3 Histone H4 10 2,075 0 EZR P15311 18,1 Ezrin 2 2,058 <0,05 HIST1H2BC P62807 78,6 Histone H2B type 1-C/E/F/G/I 11 1,935 <0,05 ITGA3 P26006 15,3 Integrin alpha-3 2 1,471 <0,05 TUBA1B P68363 29,9 Tubulin alpha-1B chain 5 1,450 <0,05 TUBB P07437 33,8 Tubulin beta chain 7 1,390 <0,01 ACTG1 P63261 62,9 Actin, cytoplasmic 2 12 1,370 <0,01 NID1 P14543 19,8 Nidogen-1 6 1,222 <0,05 CCT2 P78371 31,2 T-complex protein 1 subunit beta 4 0,639 <0,05 *Número de acceso y abreviatura para la base de datos Uniprot; ** Cobertura de secuencia; *** Péptidos identificados con más del 95% de confianza + Identificada en ambos marcajes Tabla S6. Proteínas significativamente moduladas para el exosoma de HEC-1A / H-ETV5 por SILAC Proteínas más expresadas en el exosoma de HEC-1A respecto a H-ETV5 DISCUSIÓN 133 Capítulo 9. Discusión La aparición de enfermedad diseminada en oncología representa el evento adverso de mayor relevancia en el pronóstico clínico. Mientras que aquellos tumores que son detectados en estadios no diseminados presentan un pronóstico clínico moderadamente favorable y accesible a la resección, son aquellos tumores con una diagnosis tardía los que presentan un peor pronóstico. Es por ello, que la metástasis representa un reto clínico de primera envergadura y un conocimiento detallado de sus mecanismos moleculares y celulares promete abrir una nueva era en la medicina oncológica. La metástasis representa un evento complejo e influido por multitud de factores, y no es sino en los últimos años cuando estamos siendo verdaderamente conscientes de la complejidad del mismo. Paralelamente, el desarrollo de nuevas tecnologías permite un abordaje cada vez más exhaustivo de la diseminación tumoral y abre nuevas ventanas para la intervención terapéutica. Mejoras en las técnicas de imagen permiten la detección de lesiones oligometastásicas mientras que la incorporación de técnicas quirúrgicas y radiológicas asistidas permiten el tratamiento de pacientes otrora no operables -véase VATS Video Assisted Thoracic Surgery o SBRT Stereotactic Body Radio Therapy en el manejo de enfermedad metástasica-190,191. Del mismo modo, un incremento en la especificidad y sensibilidad del equipamiento disponible en el diagnóstico en soporte líquido abre nuevas fronteras en el manejo oncológico95,99. Actualmente, la biopsia de tejido permanece como referencia en la decisión clínica de NSCLC. Sin embargo, estas biopsias pueden resultar incómodas, invasivas y pueden no identificar de manera relevante alteraciones moleculares -debido a una adquisición subóptima o heterogeneidad tumoral-. Las plataformas de diagnóstico líquido tienen el potencial de salvaguardar muchas de estas Discusión 134 limitaciones permitiendo una identificación rápida y precisa de mutaciones -de novo o de recurrencia-, la monitorización en tiempo real de la respuesta a tratamiento o la detección de enfermedad residual o de recurrencia. Complementariamente, la investigación en Células Tumorales Circulantes (CTC) ha incrementado su interés clínico en los últimos años por su implicación directa en la diseminación tumoral. El aislamiento de CTCs a partir de una muestra de sangre periférica de un paciente con enfermedad diseminada no sólo permite una monitorización clínica, sino también una oportunidad para profundizar en la biología de esta población celular y el desarrollo de terapias dirigidas192. La captura de esta subpoblación de células en circulación hace de las CTCs una suerte de “fase líquida” de la progresión tumoral, la cual permite tener acceso a células tumorales sin necesidad de acceder directamente al tejido tumoral193. Adicionalmente, el torrente sanguíneo representa un medio hostil en el que la progresión tumoral sufre un cuello de botella, otorgando así la oportunidad de un impacto global en el devenir de la enfermedad a través del tratamiento de una pequeña subpoblación tumoral. Es por ello que la evaluación y caracterización de las CTCs en pacientes de NSCLC -donde la enfermedad diseminada es frecuente al diagnósticorepresenta una estrategia particularmente atractiva para la comprensión del mecanismo de diseminación tumoral y la monitorización clínica con el fin de guiar la estrategia terapéutica194,195. Las CTCs aparecen en circulación en un número muy bajo por lo que su manejo requiere de métodos altamente sensibles. En la última década se han venido desarrollando distintas tecnologías para el aislamiento de CTCs -no limitadas exclusivamente al inmunoaislamiento128,196- y que han mostrado resultados prometedores en NSCLC; sin embargo la cantidad de información disponible es limitada en comparación con otros tipos tumorales197,198. Distintos estudios con Cell Search® -la única tecnología aceptada por la FDA para la enumeración de CTCsha demostrado la utilidad de la enumeración de CTCs en NSCLC y su asociación con un peor pronóstico clínico122,199,200. Sin embargo, la dependencia del marcador epitelial EpCAM para el inmunoaislamiento de CTCs representa un reto para la aplicabilidad de esta metodología en pacientes de NSCLC. Se ha observado que las CTCs Aproximación a la metástasis 135 de NSCLC presentan una expresión especialmente heterogénea de esta proteína y en ocasiones la detección de este marcador típicamente epitelial puede disminuir como consecuencia de la expresión de un patrón transcripcional pseudo-mesenquimal41. Paralelamente, se ha descrito la expresión de EpCAM frecuentemente incrementada en NSCLC sugiriendo su participación en la carcinogénesis201,202. Es por ello que nos centramos en esta subpoblación de CTCs Ep- CAM+ para la caracterización de su perfil de expresión génica en NSCLC y con el fin de profundizar en el conocimiento de su biología. En este sentido, poco se conoce de la biología de las CTCs EpCAM- en NSCLC y su influencia en la progresión de la lesión metastásica; habiendo tanto estudios que abogan por una participación activa de esta subpoblación en la progresión tumoral137, como estudios en NSCLC en los que inciden en la limitación de esta subpoblación para dictaminar el devenir clínico203. Sin duda, el desarrollo de nuevas tecnologías EpCAM-independientes y un conocimiento más profundo de la biología de las CTCs contribuirán al perfeccionamiento de la evaluación de CTCs en NSCLC como herramienta clínica. En este escenario, distintos estudios previos orientados a la caracterización de la expresión génica de CTCs en NSCLC han abordado el análisis de determinados subgrupos de genes -vinculados principalmente a un perfil epitelial- en muestras enriquecidas en CTCs204,205. En este trabajo, la combinación del inmunoaislamiento de CTCs EpCAM-dependiente seguido de una caracterización global de su perfil de expresión mediante la amplificación del transcriptoma completo e hibridación en microarray de la librería de cDNA resultante perrmite la obtención de un perfil de expresión de CTCs para NSCLC. Este perfil de expresión destaca una vinculación con funciones celulares relacionadas con movimiento, adhesión y diferenciación celulares; además de una activa comunicación célula-célula a través de las rutas PI3K/ AKT, ERK1/2 y NF-kB -descritas con anterioridad en progresión tumoral y metástasis del cáncer de pulmón206,207. Finalmente, identificamos NOTCH1 como un conductor central dentro de esta red de interacciones y cuya expresión en pacientes se asocia a un pronóstico pobre. Discusión 136 La vía de Notch es una ruta de comunicación inter-celular altamente conservada implicada en la regulación del desarrollo y diferenciación celulares208. Notch ha demostrado participar activamente en la homeoestasis y la reparación de daño celular en el pulmón, habiéndose observado su deregulación asociada a la patogénesis de distintas enfermedades pulmonares como enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, fibrosis pulmonar, hipertensión pulmonar, cáncer de pulmón y lesiones pulmonares congénitas209. Además, en un reciente meta-análisis, Yuan et al. consiguieron vincular la sobreexpresión de esta vía con un mayor riesgo de diseminación linfática, mayor estadio tumoral y menor supervivencia en NSCLC210. Complementariamente, la expresión de HES1, un efector subyacente en la ruta de Notch, ha demostrado estar asociado a una menor supervivencia en NSCLC210. En este contexto, y considerando que la expresión de la vía de Notch se encuentra alterada en más del 30% de los NSCLC211, el desarrollo de terapias dirigidas representa un atractivo clínico siendo a su vez los inhibidores de γ-secretasa (GSI) e inhibidores de ADAM las dianas más frecuentes para la regulación de la vía (Figura 37)212,213. Figura 37. La vía de señalicación de Notch e inhibidores de la ruta. La unión a ligando promueve la escisión del dominio extracelular del receptor de Notch por metaloproteasas de la familia ADAM. El fragmento carboxilo terminal anclado a membrana es procesado por el complejo γ-secretasa -constituido por presenilin y nicastrin entre otrospara dar lugar a un dominio intercelular de Notch (NICD) que se translocará al núcleo celular para participar en la regulación de la expresión génica. Los 4 tipos de receptores de Notch son sintetizados como péptidos inmaduros en el retículo endoplasmático y procesados en el aparato de Golgi para su migración y heterodimerización en la superficie de la membrana celular. La inhibición de ADAM o el complejo de la γ-secretasa resultaría en la interrupción de la ruta de señalización de Notch. Adaptado de Fortini et al214. Aproximación a la metástasis 137 Dentro de esta ruta de señalización, la actividad de Notch1 juega un papel crítico en la migración y adhesión tumorales mediada por la pérdida de interacciones célula-célula e inducción de características de célula madre215. La ablación in vivo de Notch1 en modelos murinos de adenocarcinoma ha demostrado reducir dramáticamente la formación y carga tumoral; demostrando así la implicación de Notch1 en la iniciación, proliferación y supervivencia de modelos de NSCLC216. Asimismo, la inhibición de la vía de Notch con GSIs ha demostrado inducir la apoptosis en SCC de manera caspasa-dependiente e independiente217. Complementariamente, la down-re- gulación de Notch1 ha demostrado correlacionar con la up-regulación de miR-34a, implicado en la inhibición de la proliferación e invasión en NSCLC a la vez que estimula la apoptosis218. Son varios los estudios que abogan por una participación de la vía de Notch en la adquisición de características de EMT vinculadas a resistencia a terapia y metástasis219,220; del mismo modo que su silenciamiento con siRNA ha demostrado revertir el proceso de EMT y disminuir la invasión y proliferación en NSCLC221. Finalmente, Notch1 ha demostrado también promover la invasión en cáncer de pulmón mediante la regulación de MMPs y cuya expresión se ve significativamente reducida tras el tratamiento con GSI222. Conforme a estos resultados proporcionamos también una serie de genes validados por RT-qPCR derivados del perfil de las CTCs EpCAM+ en NSCLC avanzado y vinculados a la vía de señalización de Notch1. Galectina-3, una lectina reguladora de la proliferación y adhesión celular es indicadora de una mala prognosis en NSCLC participando de la movilidad, invasión celular y metástasis223–225. De manera similar, la expresión de PTP4A3 en NSCLC se ha encontrado asociada al estadio clínico y la diseminación metastásica mediada por la formación de vasos vasculares y linfáticos226. Coherentemente, la supresión de PTP4A3 in vitro con siRNAs ha demostrado inhibir la migración e invasión de células de cáncer de pulmón227,228. Por último, ITGB3 ha sido descrita recientemente como un mediador de la adhesión focal participando en la regulación de Ras229, y cuya inhibición por miR-98230 o miR let-7c231 previene la proliferación, migración e invasión en NSCLC. Discusión 144 ción celular vía integrinas. En este sentido se ha reportado una importante capacidad de los exosomas68 de interaccionar y remodelar la matriz extracelular participando de este modo en el microambiente tumoral, además, la comunicación vía integrinas ha demostrado una función clave en la determinación de las lesiones metastásicas81. Coherentemente, hemos identificado un descenso significativo en la capacidad de adhesión in vitro de la línea tumoral H-ETV5 asociado a su fenotipo mesenquimal. En cambio, sí que se observa un incremento en la capacidad de estas células de adherirse a distintos sustratos presentes en la MEC. Distintos ensayos realizados por Colás y colaboradores atribuyen este incremento a la capacidad de H-ETV5 de establecer adhesiones focales rápidamente con distintos componentes de la matriz48, lo que a su vez facilitaría las propiedades migratorias e invasivas reportadas para esta línea celular48,251. A raíz de estas observaciones, hemos podido demostrar que la funcionalización de la superficie de una placa con exosomas de HEC-1A es capaz de favorecer de manera significativa la adhesión de la propia célula tumoral; mientras que la funcionalización con exosomas de H-ETV5 no es capaz de producir este efecto. Sin embargo, sí podemos observar que la adhesión de H-ETV5 se ve incrementada in vitro cuando expuesta a una superficie funcionalizada con exosomas procedentes de HEC-1A, algo que concuerda con la composición diferencial del exosoma y que favorecería el establecimiento de puntos de anclaje entre H-ETV5 y los exosomas fijados a la superficie de la placa. Asimismo, el estudio realizado por Colás et al. identificó LLP (Lipoma preferred partner protein) como una molécula implicada en la regulación de ETV5 pero que a su vez participa en la transducción de señales derivadas de las adhesiones focales permitiendo establecer un vínculo entre la formación de adhesiones focales, EMT y la invasividad tumoral dentro de nuestro modelo48. Por último, atendiendo a la diseminación tumoral hematógena, la lámina endotelial constituye la primera barrera física que la Célula Tumoral Circulante debe atravesar en su proceso colonizador. Esta colonización tumoral está a su vez favorecida por una inducción sostenida del estímulo inflamatorio derivado del proceso tumoral252,253. Esta inflamación es capaz de Aproximación a la metástasis 145 alterar la homeostasis vascular favoreciendo un incremento de la permeabilidad celular y la expresión de proteínas de adhesión destinadas a facilitar la extravasación de leucocitos en circulación -diapedesis-254. En este sentido, se ha reportado en distintas ocasiones cómo el tratamiento con exosomas tumorales favorece la activación y permeabilidad del tejido endotelial73,255. Nuestros resultados arrojan un incremento de la adhesión de H-ETV5 a monocapas endoteliales de Ea.hy926 y células HUVEC cuando tratadas previamente con exosomas procedentes de HEC-1A. Este incremento de adhesión responde a la expresión de moléculas de adhesión (SELE, VCAM1 e ICAM1) sobre la superficie del endotelio y que cuya sobreexpresión ha demostrado anteriormente participar en el homing de la célula tumoral256,257. En este sentido, una limitación de la respuesta inflamatoria inhibiría presumiblemente la capacidad de las células tumorales de anidar en el tejido endotelial. Adicionalmente, VCAN, una proteína significativamente modulada para el exosoma de HEC-1A, ha demostrado implicación en el reclutamiento de células linfoides y mieloides que participan en la producción de citoquinas inflamatorias y cuya inhibición se ha sugerido como una posible diana terapéutica orientada a la metástasis258. Todas estas observaciones constituyen un escenario en el que el exosoma participa de manera crucial en la colonización metastásica vía hematógena; destacando a su vez la influencia del exosoma de HEC-1A en el proceso de condicionamiento y adhesión de la Célula Tumoral Circulante. HEC-1A es una célula de fenotipo epitelial e inicialmente no destinada a alcanzar la circulación y anidar en tejidos distantes; sin embargo, podemos observar cómo su influencia va más allá de un simple proveedor de células tumorales, sino que a través de la fracción exosomal participa de manera activa en la diseminación metastásica (Figura 38). Comparativamente, observamos cómo el exosoma de H-ETV5, además de representar una fracción muy minoritaria del total del exosoma tumoral en circulación, carece de algunas de las características que participan en el acondicionamiento del nicho pre-metastásico. Discusión 146 De confirmarse estas observaciones, un abordaje clínico orientado a la metástasis debería considerar la influencia de los exosomas a la vez que enfatizar en la necesidad de intervenir en esta ruta de comunicación tumoral mediante la limitación de la cantidad de exosomas tumorales liberados -ya sea mediante una reducción de la carga tumoral bruta o la disrupción de la capacidad de las células tumorales de liberar estas vesículas- o bien limitando la capacidad de estas vesículas de interaccionar con el tejido huésped -ya sea limitando la funcionalidad de estos exosomas tumorales o favoreciendo una actividad protectora en las células receptoras-. Finalmente, el desarrollo de estrategias orientadas al exosoma epithelial-like permitiría re-evaluar y atraer de nuevo la atención sobre la participación e influencia del tumor primario en el proceso de metástasis. Figura 38. El exosoma tumoral en el anidamiento de la Célula Tumoral Diseminada. En tumor primario está compuesto por una mayoría de células tumorales epiteliales. Envetualmente algunas de las cuales sufrirán un proceso de EMT favoreciendo su movilidad e incorporación al torrente sanguíneo. Algunas de estas células abandonarán el torrente sanguíneo para dar lugar a nuevos núcleos tumorales. Algunas de estas células diseminadas sufrirán un proceso inverso de EMT recuperando así algunas de las propiedades de célula epitelial. El exosoma tumoral procedente del tumor primario participa en el anidamiento tumoral mediante el condicionamiento del nicho tumoral. Este exosoma tumoral procederá de todo el conjunto de células tumorales que constituyen el tumor primario existiendo una representación mayoritaría de exosoma procedente de célula tumoral epitelial. Este exosoma en circulación preserva la capacidad de activar el tejido endotelial además de conservar una capacidad adhesiva ausente en el exosoma derivado de célula tumoral pseudo-mesenquimal. EMT: Transición Epitelio-Mesénquima. TEM: Transición Mesénquima-Epitelio. Fuente propia. CONCLUSIONES 151 Capítulo 10. Conclusiones 1- El inmuno-aislamiento y enriquecimiento de CTCs EpCAM+ permite la obtención de un perfil de expresión génica específico de CTC en NSCLC. 2- El perfil de expresión de CTCs en NSCLC destaca la presencia de funciones vinculadas a la supervivencia, proliferación y movilidad celular. 3- NOTCH1 participa de manera relevante en la biología de la CTCs. La inhibición de la vía de Notch representa una potencial diana terapéutica específica de CTC de interes clínico. 4- La expresión de GAPDH, NOTCH1, LGALS3, ITGB3 y PTP4A3 en muestras enriquecidas de CTCs de NSCLC presentan capacidad pronóstica revelándose como potenciales biomarcadores en circulación. 5- El SILAC representa una alternativa adecuada para la búsqueda de biomarcadores en exosomas. 6- El programa transcripcional de EMT en HEC-1A provoca un descenso en la capacidad de adhesión de la Célula Tumoral Circulante. 7- Proteoma y secretoma de H-ETV5 presentan un perfil de EMT orientado a la supervivencia celular y la evasión de la apoptosis. 8- El exosoma en circulación procedente de la célula tumoral epitelial contiene proteínas de matriz que participan en la adhesión y anidamiento de la Célula Tumoral Circulante. 9- El exosoma tumoral de HEC-1A promueve la activación y expresión de proteínas de adhesión en el tejido endotelial. ANEXO Escenario clínico del cáncer de pulmón y cáncer de endometrio