Aplicación de metodologías proteómicas al estudio de la estructura, modificaciones postraduccionales y diferenciación genética de la proteína faseolina en semilla de la judía común (Phaseolus vulgaris L.)

Depa amen o de Gené ica
Aplicación de me odologías p o eómicas al es udio de la
es uc u a, modi icaciones pos aduccionales y di e enciación
gené ica de la p o eína aseolina en semilla de la judía común
(Phaseolus ulga is L.)
Memo ia p esen ada po :
Ma ía Dolo es López Ped ouso
pa a op a al G ado de Doc o a en Biología
San iago de Compos ela, 2015
Depa amen o de Gené ica
José Ca los Zapa a Babío, Ca ed á ico del Depa amen o de Gené ica de la
Uni e sidad de San iago de Compos ela
In o ma:
Que el abajo i ulado “Aplicación de me odologías p o eómicas al
es udio de la es uc u a, modi icaciones pos aduccionales y di e enciación
gené ica de la p o eína aseolina en semilla de la judía común (Phaseolus
ulga is L.)” que p esen a Ma ía Dolo es López Ped ouso pa a la ob ención del
G ado de Doc o a ha sido ealizado bajo su di ección, que lo conside an concluido y
au o izan su p esen ación al ibunal cali icado .
Y pa a que así cons e, se i ma el p esen e in o me en San iago de
Compos ela a 7 Sep iemb e 2015.
Fdo.: José Ca los Zapa a Babío
Ag adecimien os
A mi di ec o de esis, Ca los Zapa a, pues ue el p incipal mo o de es e
abajo de in es igación. Una esis doc o al es siemp e u o de ideas, p oyec os y
es ue zos p e ios que co esponden a un in es igado y que dis u a
compa iéndolas y desa ollándolas con el doc o ando. En mi caso, ue un place
pode compa i odo es e iempo y dedicación de mi di ec o de esis.
A Daniel, po que sin su mo i ación hab ía sido imposible. Su apoyo aunque
de o ma indi ec a ue decisi o pa a sal a odo ipo de obs áculos, an o den o
como ue a del labo a o io.
A mis hijas, Helena y Ma a. Ellas son las me impulsan a lucha po
consegui mejo as en lo p o esional y en lo pe sonal, y en ningún caso cons i uye on
un impedimen o.
Al es o de compañe os de labo a o io que con ibuye on a man ene un
buen ambien e de abajo. En e b omas y cha las animadas y sin que yo me diese
cuen a, se ue haciendo es a esis.

Ab e ia u as
1-DE: Elec o o esis monodimensional
2-DE: Elec o o esis bidimensional
AC: Andina y cul i ada
AW: Andina y sil es e
C .: Va iedad cul i ada
kDa: kDal on (unidad de masa a ómica)
HF: Ácido luo híd ico
HF-P: Ácido luo híd ico-Pi idina
IEF: Isoelec oen oque o en oque isoeléc ico
IMAC: C oma og a ía de a inidad de iones me álicos inmo ilizados
IPG: G adien e inmobilizado de pH
m/z: Relación masa/ca ga
MALDI: Ionización/deso ción po láse asis ida po ma iz
MC: Mesoame icana y cul i ada
MDS: Escalado mul idimensional no pa amé ico
M : Masa molecula ela i a
MS: Espec ome ía de masas
MS/MS: Espec ome ía de masas en ándem
MW: Mesoame icana y sil es e
NCBI: Cen o Nacional pa a la Bio ecnología y la In o mación
PAGE: Elec o o esis en gel de poliac ilamida
PCA: Análisis de componen es p incipales
pI: Pun o isoeléc ico
PMF: Huella de la masa pep ídica
PNGasa F: N-Glicosidasa F
PR: Tasa de os o ilación
P o-Q DPS: Tinción de os op o eínas P o-Q Diamond (P o-Q Diamond
phosphop o ein s ain)
RE: Re ículo endoplasmá ico
SDS-PAGE: Elec o o esis en gel de poliac ilamida con dodecilsul a o sódico
(sodium dodecyl sul a e polyac ylamide gel elec opho esis)
Ab e ia u as
SNP: Polimo ismo de un solo nucleó ido (single nucleo ide polymo phism)
SRP: Pa ícula econocimien o de señal (signal ecogni ion pa icle)
SSP: P o eínas de ese a de la semilla(seed s o age p o eins)
TCA: T iclo oacé ico
TOF: Tiempo de uelo ( ime o ligh )
Indice
9
INDICE
RESUMEN ..................................................................................................................... 11
SUMMARY .................................................................................................................... 15
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 19
1.1. Impo ancia económica y nu icional de la judía común ................................ 21
1.2. Composición química y alo nu icional de la semilla de la judía común .... 24
1.3. P o eómica de Phaseolus ulga is L. .............................................................. 26
1.4. Faseolina ......................................................................................................... 29
1.4.1. Es uc u a y base gené ica ..................................................................... 29
1.4.2. Biosín esis de la aseolina ..................................................................... 30
1.5. Fos op o eoma ................................................................................................ 33
1.6. Ge minación de la semilla ............................................................................... 34
1.7. O igen y domes icación de la judía común ..................................................... 36
2. OBJETIVOS .............................................................................................................. 41
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 45
3.1. Análisis p o eómico de las semillas de judía común (P. ulga is L.)
basado en la elec o o esis bidimensional (2-DE) .......................................... 47
3.1.1. Op imización del mé odo de ex acción p o eica y de las
condiciones elec o o é icas pa a el p o eoma de P. ulga is L. ........... 47
3.1.2. A ículo o iginal: 2-DE-based p o eomic analysis o common bean
(Phaseolus ulga is L.) seeds ................................................................ 57
3.2. Ca ac e ización de la di e sidad de la p o eína aseolina de la judía
común (P. ulga is L.) basada en la elec o o esis bidimensional y en la
espec ome ía de masas. ................................................................................. 61
3.2.1. Op imización de los pe iles 2-DE de la aseolina ................................ 61
3.2.2. Desc ipción de los pa ones 2-DE de la aseolina ................................. 65
3.2.3. Di e sidad de los pa ones 2-DE de la aseolina ................................... 67

SUMMARY
17
Common bean (Phaseolus ulga is L.) is he mos impo an g ain legume o
human consump ion. The seed s o age p o eins a e he main sou ce o amino acids and
educed ni ogen ha play a undamen al ole du ing he ge mina ion and he ea ly plan
g ow h. Phaseolin is he majo seed s o age p o ein o common bean accoun ing o 40-
60% o he o al seed p o ein. In he pas decades, nume ous s udies ha e con ibu ed o
he eno mous p og ess in ou knowledge abou he s uc u e, gene ic basis, exp ession,
egula ion and e olu ion o he phaseolin.. The e o e, he phaseolin can be conside ed as
he model p o ein o he s udy o seed s o age p o eins. Phaseolin is encoded by a gene
amily loca ed on ch omosome 7. Membe s o he gene amily can be subdi ided in o
wo dis inc gene ypes e med α and β, ha gi e ise o α- and β- glycosyla ed
polypep ides. The s udy o he di e si y o phaseolin in wild and domes ica ed
popula ions o common bean h ough monodimensional elec opho esis led o he
iden i ica ion o wo majo gene pools (mesoame ican and andean), la e con i med by
DNA molecula ma ke s. Howe e , ecen ad ances in he p o eomic me hodologies
p o ide new ools o a be e knowledge o his complex gene amily. In his wo k,
ele an aspec s on he s uc u e, exp ession and gene ic di e en ia ion o phaseolin
we e add essed by applying he cu en bidimensional elec opho esis (2-DE) and mass
spec ome y (MALDI-TOF y MALDI-TOF/TOF MS) oge he wi h o he p o eomic
me hodologies. Op imiza ion o he p o ein ex ac ion p o ocol and 2-DE condi ions
allowed us o ob ain high- esolu ion bidimensional maps o he p o ein phaseolin ha
p o ided a e y ele an in o ma ion. The esul s o his s udy e ealed o he i s ime
he exis ence o di e en ially phospho yla ed phaseolin iso o ms. In addi ion,
phospho yla ion plays an impo an ole in mobiliza ion o he phaseolin because highly
phospho yla ed iso o ms a e p e e en ly deg aded in ge mina ing seeds. I is no ewo hy
ha his would be he i s unc ion assigned o phospho yla ed iso o ms o seed s o age
p o eins. On he o he hand, he analysis o p o eomic dis ances ob ained om 2-DE
pa e ns showed ha he phaseolin is a eliable ma ke o gene ic di e en ia ion and
quali y o seed p o ein in wild and domes ica ed common bean popula ions belonging o
he mesoame ican and andean gene pools. Acco dingly, he phaseolin seems o be a
use ul ma ke o he gene ic imp o emen o common bean popula ions. O e all, he
s udy e eals ha he p o eomic me hodologies a e an impo an ool o achie e a
deepe knowledge o he seed s o age p o eins.
1. INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
21
1.1. Impo ancia económica y nu icional de la judía común
La judía común (Phaseolus ulga is L.) es una plan a anual he bácea
pe enecien e a la amilia Fabaceae (o Leguminoseae) o igina ia de Amé ica cuyas
múl iples a iedades se cul i an en odo el mundo pa a el consumo de las ainas e des
y de los g anos secos. El géne o Phaseolus incluye 35 especies, de las cuales se cul i an
cua o: P. ulga is L.; P. luna us L.; P. coccineus L. y P. acu i olius L. En la p ime a
e apa del desa ollo de la semilla, el sis ema adical es á o mado po la adícula del
emb ión que se con ie e pos e io men e en la aíz p ima ia y a los pocos días su gen
las aíces secunda ias. El allo se o igina a pa i del me is emo apical del emb ión de la
semilla du an e la ge minación y en las p ime as e apas del desa ollo de la plan a. En
es e p oceso se an gene ando los nudos donde se inse an las hojas. La lo es de ipo
papilionácea y su colo puede se blanco, osado o pú pu a (Figu a 1). El u o es una
aina con dos al as, las cuales p o ienen del o a io comp imido. Las ainas pueden
se de di e sos colo es, uni o mes o con ayas, dependiendo de la a iedad (A ias e al.,
2007; CIAT, 2014).
Figu a 1. Plan a y semilla de la judía común
Las leguminosas son uno de los cul i os básicos pa a la alimen ación
humana jun o con el a oz y el maíz. En el año 2012, la p oducción o al de judía en
g ano y en e de ascendió a 23,6 y 20,7 millones de oneladas, espec i amen e. La

INTRODUCCIÓN
22
mayo p oducción a ni el mundial de judía en g ano se ob iene po o den de
impo ancia en países de Asia (46,0%), de Amé ica (30,6%) y Á ica (21,0%) (Figu a
2A); mien as que pa a la judía e de, Asia p oduce el 91,4% (Figu a 2B).
Conside ando la p oducción de judía en g ano y en e de conjun amen e, la mayo pa e
de la p oducción mundial p ocede del con inen e asiá ico (67,2%), seguido del
con inen e ame icano (16,8%) y el a icano (12,9%) (FAOSTAT, 2013; Figu a 2C).
Figu a 2. Po cen aje de la p oducción mundial de judía en g ano (A), judía en e de (B) y o al (C) en los
dis in os con inen es
Los p incipales países p oduc o es son Bi mania, India, B asil, China, Es ados
Unidos y México (FAOSTAT 2013, Tabla 1). Pa a países como Bi mania, el p incipal
p oduc o mundial, la judía ep esen a el 10% del o al de expo aciones. Las á eas
cosechadas en los di e en es países a ían de o ma no able, es ando la p oducción muy
a ec ada po el endimien o que a ía signi ica i amen e desde 407,7 Kg/Ha en la India
A B
C
INTRODUCCIÓN
23
has a los 2116,8 Kg/Ha en países desa ollados como USA. Es e iden e que la mejo a
de la p oduc i idad ag ícola que se es á p oduciendo en Á ica y en los países
sudame icanos en ías de desa ollo pueden supone un mecanismo pa a in e i la
endencia de un inc emen o de la pob eza en esas egiones, po lo que la iden i icación y
pos e io op imización de los ac o es limi an es del endimien o ag onómico son
ac ualmen e una p io idad en la mayo ía de los p og amas de mejo a de la judía.
Tabla 1. P incipales países p oduc o es de judía en g ano (año 2012)
Á ea cosechada (Ha) Rendimien o (Kg/Ha) P oducción ( )
Bi mania 2.750.000 1418,2 3.900.000
India 9.100.000 407,7 3.710.000
B asil 2.709.485 1031,5 2.794.854
China 971.000 1607,3 1.560.698
USA 684.081 2116,8 1.448.095
México 1.558.992 693,3 1.080.857
Sin emba go, se es ima que las es adís icas globales sob e la p oducción de judía
son una in aes ima de la p oducción eal dado que en los países en ías de desa ollo
los cul i os de la judía se mezclan con o os cul i os, c ecen en zonas emo as y/o á eas
donde hay con lic os polí icos o bélicos, e c., lo que di icul a la oma de da os p ecisos.
La judía es conside ada la leguminosa pa a la alimen ación humana de mayo
impo ancia a ni el mundial, ep esen ando la mi ad de las leguminosas de g ano
consumidas mundialmen e. Debido al limi ado acceso a p o eína de o igen animal en los
países en ías de desa ollo, la judía común (P. ulga is L.) es la uen e p o eica de
mayo impo ancia. Así en Ruanda apo a ce ca del 60% y 30% de odas las p o eínas y
calo ías inge idas espec i amen e, siendo el segundo en impo ancia después del maíz
(Fe is e al., 2002). Incluso en B asil, e ce país p oduc o , el 9% de la p o eína
alimen icia p o iene de la judía.
INTRODUCCIÓN
24
1.2. Composición química y alo nu icional de la semilla de la judía
común
La judía común ocupa un luga impo an e en la nu ición mundial y en especial
en muchas poblaciones de Á ica y Amé ica la ina, donde es conside ada un elemen o
básico debido a su alo nu i i o y a su bajo cos e. Po o o lado el consumo en Eu opa
es más bajo que en o as egiones del mundo aunque es á aumen ando de o ma
paula ina en los úl imos años (Schneide , 2002). Los ac o es limi an es del consumo de
judía en países de p ime ni el son el escaso desa ollo de p oduc os leguminosos
adap ados a nues a ida mode na, una limi ada p oducción local y compe encia con
o as impo aciones más ba a as. O os incon enien es son los as o nos gás icos que
p o oca su baja calidad senso ial y que equie e mucho iempo de cocción (K upa,
2008).
Desde el pun o de is a nu icional, la judía es ica en p o eína, ib a,
ca bohid a os, i aminas y mine ales como K, Mg, P, Fe y Zn (Meine s e al., 1976).
Además de su alo nu icional, es á demos ado que el consumo egula de judía, iene
un e ec o bene icioso sob e la salud, pues in luye en la p e ención y a amien o de
en e medades ca dio ascula es, diabe es de ipo II y cánce (Mann y Chisholm, 1999;
Bassano e al., 2001; Ma he s, 2002). También su inges a egula puede con ibui a
disminui el ni el de coles e ol y cons i uyen una de las mejo es uen es de ácido ólico
jun o con guisan es, len ejas y ga banzos (K upa, 2008).
Una des en aja de la p o eína de judía adica en su bajo con enido en
aminoácidos azu ados (me ionina y cis eína), así como en ip ó ano cuando se
compa a con los eque imien os mínimos de aminoácidos ecomendados po la
FAO/WHO (2007). El con enido o al de me ionina y cis eína pa a dis in os cul i a es y
a iedades sil es es a ía en e 8 y 11 mg/g de p o eína (Tabla 2; Mon oya e al.,
2008a), siendo la can idad dia ia ecomendada po la FAO pa a niños en e 2 a 5 años
de 26 mg/g (FAO/WHO, 2007). Además, Mon oya e al. (2008a) encon ó que las
di e encias en el con enido en aminoácidos se co elacionan con el ipo de aseolina en
semillas de a iedades cul i adas y sil es es.
INTRODUCCIÓN
25
Tabla 2. Composición de aminoácidos (mg/g de p o eína) pa a dis in os ipos de semillas de a iedades
cul i adas y sil es es (Mon oya e al., 2008a).
Cul i a ed beans Wild beans
I M6 PA S T T01 Xª SD H2 J1 J3 J4 K L Xª,b SD
ARG 51 54 59 50 53 59 54 4 57 57 51 56 59 57 57 2
HIS 32 36 39 33 35 39 36 3 38 39 35 38 40 37 38 2
ILE 41 44 48 44 44 48 45 3 47 48 44 46 48 45 46 2
LEU 71 76 81 78 74 81 77 4 79 81 74 79 81 77 78 2
LYS 61 66 70 68 65 70 67 3 68 69 63 68 61 67 68 3
MET 8 6 8 8 8 7 8 1 7 7 7 7 7 7 7 1
PHE 57 64 69 58 60 67 63 5 66 67 60 65 68 65 65 2
THR 31 33 36 26 34 34 32 4 34 34 26 73 35 34 34 3
VAL 45 48 49 47 48 49 48 2 50 51 47 49 51 48 49 2
ALA 38 43 44 34 37 42 40 4 44 45 40 43 46 44 44 2
ASP 101 108 119 116 105 116 111 7 111 114 107 112 115 110 111 3
CYS 2 2 2 3 3 2 2 1 2 2 3 2 3 2 3 1
GLU 122 146 157 147 146 157 146 13 151 148 137 148 155 144 148 5
GLY 32 34 38 36 35 36 35 2 37 36 34 36 39 37 36 2
PRO 34 41 45 39 36 44 40 4 43 43 36 41 44 44 43 3
SER 49 55 59 57 52 57 55 4 55 56 55 56 58 56 56 1
TYR 32 36 40 30 29 37 34 4 38 34 28 34 36 45 35 3
To al 806 891 963 874 864 946 891 57 935 936 850 919 959 910 920 31
ª Valo es medios (mg/g de p o eína).
b Valo es medios que incluyen las a iedades M10, M2, M16, M17, M23 y M25 no mos adas en la abla.
La aseolina, lec inas e inhibido es de α-amilasas, son las p incipales p o eínas
de ese a de la semilla de la judía común (Islam e al., 2002; K upa e al., 2008). La
aseolina ep esen a en e un 40-50% del o al de la acción p o eica, siendo po an o
la p o eína mayo i a ia (Emani and Hall, 2008). Po es e mo i o, sus ca ac e ís icas
a ec an en g an medida al alo nu icional de la semilla. Uno de los ac o es que me ma
el alo nu icional de la semilla de P. ulga is eside en la composición química en
aminoácidos de la aseolina dado su bajo con enido en me ionina, cis eína y ip ó ano.
Además del pe il de aminoácidos, exis en o os pa áme os pa a cuan i ica la calidad
de la p o eína como son la diges ibilidad y la disponibilidad de la misma. En el caso de
la aseolina es a o ece una pob e diges ibilidad, in e io a o as p o eínas de o igen
INTRODUCCIÓN
32
Figu a 4. Esquema ep esen a i o de la aseolina mono y diglicosilada
Como se ha señalado an e io men e, la aseolina es un íme o de los es
polipép idos glicosilados de ipo α (411 y 412 aminoácidos) y de ipo β (397
aminoácidos) que comp enden es uc u as simila es con eniendo g an can idad de
hélices al a y una pequeña po ción de láminas be a (Law ence e al., 1990). El íme o
(M ∼ 150 kDa) se asocia en una es uc u a dodecamé ica con un pH in e io a 4,5.
Después de su sín esis y p ocesado, es as p o eínas se anspo an a los llamados
cue pos p o eicos y acuolas, donde se acumulan en g andes can idades. Los cue pos
p o eicos son pequeños (1-10 µm) y ellenan las acuolas pe o den o de es as ambién
se encuen an las lec inas y las hid olasas ácidas. Las p o eínas de ese a son
hid olizadas en el ci oplasma po la acción de las p o easas endógenas en el momen o de
la ge minación pa a se u ilizadas en la sín esis de p o eínas.
N- ace ilglucosamina
Manosa
Xilano
Asn 252
Asn 341
Faseolina diglicosilada
Asn 252
Asn 341
Faseolina monoglicosilada

INTRODUCCIÓN
33
1.5. Fos op o eoma
Las p o eínas pueden da luga a iso o mas di e sas como consecuencia de la
exis encia de dis in as modi icaciones pos - aduccionales (PTMs), ales como la
os o ilación, ace ilación, glicosilación y la ubiqui inización. Las PTMs de las p o eínas
aumen an conside ablemen e la complejidad de los p o eomas debido a que las
p o eínas pueden es a modi icadas en dis in os luga es y po dis in os g upos
uncionales. De en e odas las modi icaciones pos - aduccionales, una de las más
es udiadas es la os o ilación po su e e sibilidad e impo ancia en la egulación de su
ac i idad (Ag awal y Thelen, 2006). Los p ocesos de os o ilación y des os o ilación
es án con olados po las quinasas y os a asas que además p oducen cambios
con o macionales en la p o eína haciendo que la co espondien e enzima se ac i e o se
desac i e. El es udio de es os cambios dinámicos en espues a a señales ambien ales
aumen a nues o conocimien o de los p ocesos celula es. En ege ales se han
encon ado más de 1.000 quinasas dis in as, un núme o que dobla ap oximadamen e al
exis en e en humanos. Sin emba go, se han iden i icado solo unos pocos sus a os (De la
Fuen e an Ben em e al., 2007).
La disciplina de la os op o eómica se ocupa de la iden i icación de las
os op o eínas, de la localización y cuan i icación de los luga es de os o ilación y de la
unión de las p o eínas a sus quinasas especí icas. El análisis espacial y empo al de la
os o ilación de la p o eína es de g an in e és pa a conoce el signi icado biológico ya
que los ensayos in i o no son e lejo de los p ocesos ege ales debido a la
e e sibilidad de la os o ilación, po lo que la expe imen ación iene que i más allá
(Kline-Jonakin e al., 2011). Tampoco la iden i icación de luga es de os o ilación es
su icien e pa a conoce los cambios dinámicos que se es ablecen en espues a a señales
ambien ales. Además, la concen ación de las os op o eínas es baja en muchas
ocasiones lo que inc emen a las di icul ades de su ca ac e ización e in e p e ación. El
desa ollo de las écnicas ac uales hace posible las iden i icaciones masi as de
os op o eínas pe o es necesa io dilucida los códigos de os o ilación que igen los
p ocesos celula es (Laugesen e al., 2006). Debido al conocimien o escaso que
ac ualmen e se iene sob e las implicaciones de la os o ilación en plan as, es necesa io
INTRODUCCIÓN
34
hace un g an es ue zo pa a a anza en el conocimien o de los p ocesos celula es en los
que es án implicados las os op o eínas y los mecanismos que los egulan.
En los sis emas euca io as la os o ilación p o eica se p oduce en los esiduos de
se ina (S), eonina (T) y i osina (Y), siendo más abundan e en los dos p ime os. Así,
en un es udio de os o ilación a g an escala ealizado en A abidopsis se encon ó que las
abundancias ela i as de os o ilación en S, T y Y ue on 85,7%, 10,7% y 4,4%,
espec i amen e (Sugiyama e al., 2008). Se es ima que has a el 30% de odas las
p o eínas en o ganismos mul icelula es pod ían es a os o iladas en cualquie
momen o, aunque sólo algunos de es os luga es de os o ilación ienen impo ancia
biológica (De la Fuen e an Ben em y Hi , 2007).
Uno de los mé odos más u ilizados pa a el análisis del os op o eoma consis e en
lle a a cabo un en iquecimien o de la mues a en os opép idos median e la
c oma og a ía de a inidad po iones me álicos inmo ilizados (IMAC, immobilized
me al-ion a ini y ch oma og aphy) o columnas de dióxido de i anio (TiO2) p e io al
análisis po MS (Nakagami e al., 2010). Un mé odo complemen a io consis e en
combina la écnica de 2-DE con una inción especí ica de os opép idos luo escen e
con la sal denominada P o-Q® Diamond phosphop o ein s ain (P o-Q DPS). Es a
inción exhibe una al a sensibilidad y linealidad y pe mi e ealiza un análisis
cuan i a i o global de los os opép idos de las p o eínas co elacionando la acción de
os a o con el olumen de spo (Ag awal y Thelen, 2005).
1.6. Ge minación de la semilla
La semilla comple a el ciclo ep oduc i o de la plan a que comienza con la
lo ación y la polinización. El desa ollo de la semilla se inicia en la emb iogénesis y
e mina unos días después de la ecundación. La madu ación de la semilla es una e apa
impo an e den o de su desa ollo en la cual el c ecimien o del emb ión se de iene, los
componene es de ese a (acei es, polisacá idos y p o eínas) se acumulan, el egumen o
p o ec o se di e encia y aumen a la ole ancia al es és híd ico, lo que conduce a un
es ado de do mancia. La do mancia es un mecanismo que bloquea la ge minación pa a
INTRODUCCIÓN
35
a o ece la supe i encia de la semilla en condiciones ad e sas. La e apa de do macia
se in e umpe como espues a a una se ie de señales o es ímulos ísicos o químicos
como son la empe a u a, luz y equilib io ho monal (ácido abscísico y gibe elinas). En
es ados emp anos du an e el c ecimien o del emb ión se p oduce la acumulación de
compues os de ese a y en pa icula de las SSP como la aseolina. El p omo o de la
aseolina ep esen a uno de los p omo o es más es udiados especí icos de la semilla de
judía. En o os ejidos ege ales el p omo o es á silenciado, mien as que en la semilla,
du an e la emb iogénesis se po encia la ac i ación del p omo o de la exp esión de ABA
(ácido ábscísico) a a és de un emodelado de la c oma ina (Ng y Hall, 2008). A ni el
molecula la do mancia isiológica es un es ado ac i o con complejas in e acciones que
con inuamen e in eg an las señales ambien ales y sus espues as. La elación dinámica
en e ABA y GA (ácido gibe élico) di ige los mecanismos de do mancia y ge minación
que al e an la sensibilidad de la semilla a las condiciones ambien ales. (Finch-Sa age e
al., 2006). Los e en os de os o ilación/de os o ilación juegan un papel c ucial en la
señalización de ABA lo cual implica la acción de muchas quinasas y os a asas (Ghelis
e al., 2008). Además el ABA es á elacionado con di e sos p ocesos isiológicos como
la ge minación, la madu ación de la semilla así como la adap ación de los ejidos
ege ales a condiciones ambien ales es esan es.
Du an e la ge minación se p oduce la hid ólisis de las p o eínas de ese a
median e las dis in as enzimas p o eolí icas, denominadas p o easas. A medida que
a anza la ge minación las SSP se as o man en pép idos de meno peso molecula ,
siendo po an o una uen e impo an e de ni ógeno. Es os aminoácidos pueden se
u ilizados pa a la sín esis de p o eínas en la plán ula y así pode comenza su ida de
o ma au ó o a.
Es udios a g an escala del os op o eoma en cuan o a su iden i icación y a su
cuan i icación ue on lle ados a cabo en soja (Glycine max), colza (B assica napus) y
A abidopsis (A. haliana) (Ag awal y Thelen, 2006; Meye e al, 2012). Han e al.
(2014) comp oba on en a oz que la os o ilación de p o eínas es á elacionada con la
modi icación de o as p o eínas y con la egulación ansc ipcional, además se p oducen
cambios empo ales en los ni eles de os o ilación de las p o eínas du an e la
ge minación en el caso del a oz. Po es e mo i o se puede pensa que la os o ilación
INTRODUCCIÓN
36
de las p o eínas pa ece que iene una g an implicación en el p oceso de ge minación, sin
emba go el papel uncional de es as p o eínas os o iladas es oda ía desconocido.
1.7. O igen y domes icación de la judía común
La domes icación de las plan as es un p oceso que combina la e olución na u al
jun o con una selección p ac icada po el homb e y median e es e p oceso se ob ienen
los cul i os domes icados a pa i de sus p ogeni o es sil es es. Es de máximo in e és
iden i ica los si ios o iginales de domes icación desde el pun o de is a e olu i o, así
como de g an u ilidad pa a la mejo a gené ica y la conse ación de las especies.
La di e sidad de las poblaciones sil es es y cul i adas de la judía común ha
sido es udiada en base a ca ac e es mo ológicos, ag onómicos, ma cado es bioquímicos
(alozimas y aseolina) y polimó icos del ADN nuclea y de las o gánulos
ci oplasmá icos: mi ocond ias y clo oplas os (mic osa éli es y SNPs). La aseolina ha
sido u ilizada como ma cado molecula pa a el es udio de la di e enciación gené ica y
la e olución de las poblaciones sil es es y cul i adas de P. ulga is.
El géne o Phaseolus comp ende al ededo de 30 especies de las cuales sólo
cinco es án domes icadas (P. acu i olius A. G ay, P. coccineus L., P. luna us L., P.
polyan hus G eenman y P. ulga is L.). Los p ime os es udios sob e el o igen de las
p ime as poblaciones sil es es de P. ulga is es án basados en da os a queológicos,
bo ánicos e his ó icos y si uaban su o igen en Mesoamé ica, conc e amen e en México
desde Jalisco has a Oaxaca. Desde es a zona mesoame icana las o mas sil es es
mig a on hacia Sudamé ica donde se cons i uyó el ace o andino an es de la
domes icación (Bi ochi e al., 2012; Deside io e al., 2013). Es as poblaciones sil es es
expe imen an pos e io men e múl iples domes icaciones en iempo y espacio, de o ma
independien e en es as dos zonas del con inen e ame icano. De es a mane a se o igina el
ace o mesoame icano si uado en México, Amé ica Cen al y Colombia, y ace o
andino en el Su de Pe ú, Boli ia y A gen ina (Figu a 5; Gep s y Debouck, 1991; Singh,
2001). La a iabilidad gené ica se debe p incipalmen e a las múl iples domes icaciones
y en meno medida a los ocasionales c uzamien os en e las o mas cul i adas y las
INTRODUCCIÓN
37
sil es es, de es e modo el ace o mesoame icano es de mayo di e sidad que el andino.
Den o de es os dos ace os como se mues a en la Figu a 5 se pueden dis ingui seis
azas: es azas se o iginadas en Mesoamé ica (Du ango, Jalisco y Mesoamé ica) y
o as es en los Andes (Chile, Nue a G anada y Pe ú) (Singh e al., 1991).
Pos e io men e los dis in os cul i a es de P. ulga is se ue on in oduciendo en Eu opa
a pa i del siglo XVI como consecuencia del descub imien o de Amé ica, lo que
p odujo una di e si icación secunda ia de la especie en el con inen e eu opeo.
Figu a 5. Dis ibución geog á ica de las p incipales azas de
Phaseolus ulga is L. en las zonas mesoame icana y andina
Los es udios median e elec o o esis en geles monodimensionales pe mi ie on
es ablece una asociación en e el ipo de aseolina con el o igen geog á ico de la
semilla. En Amé ica Cen al, los cul i a es se ca ac e izaban p incipalmen e po la
p esencia de aseolina de ipo “S” (Sanilac) y semillas pequeñas. Mien as en la egión
andina, la aseolina mayo i a ia e a de ipo “T” (Tende g een) y las semillas e an más
g andes (Singh e al., 2001). La aseolina T y S ep esen an el 90% den o de los
cul i a es de judía común (Figu a 6). La dis ibución de ambos ipos de aseolinas es
simila an o en los cul i a es como en las o mas sil es es.

INTRODUCCIÓN
38
B own e al., 1981 Gep s e al., 1986
Figu a 6. Pa ones elec o o é icos bidimensionales de la aseolinas S y T
Se han iden i icado o os pa ones de aseolina, como la aseolina “H” (Hue o
de Huanchaco) y “C” (Con ende ) de o igen andino o la aseolina “B” (Boyaca 22) de
o igen mesoame icano (Gep s e al., 1986). Has a la ac ualidad, más de 40 ipos de
aseolina han sido es udiadas u ilizando 1-D SDS-PAGE. Los dis in os pa ones
elec o o é icos monodimensionales mues an las di e encias en e los dis in os ipos de
aseolina en cuan o al núme o de subunidades (2-6 polipép idos) y a los dis in os pesos
molecula es (40-54 kDa) de las dis in as subunidades. Es os polipép idos ambién a ían
en cuan o a su pun o isoeléc ico desde 5,2 a 5,7 (B own e al., 1981b). También se han
ealizado algunos es udios empleando elec o o esis bidimensional con pob es
esul ados desde el pun o de is a de esolución de los spo s. A o unadamen e, hoy en
día se han inco po ado nume osas inno aciones, mejo as y op imizaciones en la
INTRODUCCIÓN
39
écnicas 2-DE, des acando las i as con g adien e de pH inmo ilizado (IPG s ips). Es as
mejo as en la écnica pe mi en mejo a la esolución y además son compa ibles con el
pos e io análisis de las p o eínas po MS.
2. OBJETIVOS
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
48
Figu e 7. Rep esen a i e 2-DE gels o p o eins om bean seed ex ac ed by h ee di e en p o ocols: TCA–ace one, phenol and clean-up.
P o eins we e sepa a ed on a linea pH 4–7 g adien in he i s dimension and isualized using Syp o Ruby® s aining. The app oxima e
posi ions o molecula mass ma ke s (kDa) a e indica ed on he le o he igu e
(Sou ce: De la Fuen e e al., 2011).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
49
Además con el mé odo del enol se edujo el backg ound de los geles,
aumen ando la ni idez de los spo s en compa ación con los o os dos mé odos. Median e
el análisis de imagen con el so wa e PDQues ™ 8.0.1 (Bio-Rad Labo a o ies) se
pudie on de ec a un o al de 571 spo s p o eicos en e los dis in os p o ocolos.
Las di e encias en e los es p o ocolos de ex acción median e un análisis de
componen es p incipales, a pa i de los olúmenes no malizados de los spo s, se
mues a en la Figu a 8. Es e análisis e eló que los dos p ime os componen es
p incipales PC1 y PC2 explican el 27,4% y el 15,0% de la a iación, espec i amen e,
del olumen de los spo s en e p o ocolos. Cabe sub aya que el PC1 sepa a cla amen e
las mues as de enol de los o os dos ipos de mues as (TCA-ace ona y Clean-Up),
mien as que es as dos úl imas son sepa adas po el PC2.
Figu e 8. P incipal componen analysis o no malized olume o spo s. Sco e plo o p incipal
componen s (PCs) one and wo (Sou ce: De la Fuen e e al., 2011)
El mé odo de enol dió luga a un mayo núme o de spo s únicos que los o os
dos mé odos de ex acción: 150 spo s únicos con el mé odo del enol en compa ación
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
50
con los 25 spo s únicos en TCA-ace ona y los 39 en Clean-Up. Cuando las imágenes de
los geles se di idie on en cua o cuad an es (Q1-4), nume ados del 1 al 4 en el sen ido
de las agujas del eloj, se obse ó que la g an mayo ía de spo s únicos queda on
si uados en el cuad an e Q2 co espondien e a las p o eínas de mayo pI y M . Sin
emba go, el mé odo del enol p opo ciona un inc emen o es adís icamen e signi ica i o
del núme o de spo s en el cuad an e Q2 en compa ación con los o os mé odos
(ANOVA: F= 7,27, P= 0,013). Po an o, es un mé odo con una mayo capacidad de
ex acción de p o eínas de pH más basico y de mayo M que los mé odos TCA-ace ona
y Clean-Up. Resul ados simila es ue on encon ados en ex ac os p o eicos ob enidos a
pa i del algodón, manzana, oma e y el euhalophy e S. eu opea (Ca pen ie e al.,
2005; Wang e al., 2007; Xie e al., 2009). Sin emba go, Sa a anan y Rose (2004) no
de ec a on un pa ón di e encial consis en e pa a pI o M en e los mé odos del TCA-
ace ona y enol. También, se lle ó a cabo un análisis es adís ico con el in de de ec a
di e encias cuan i a i as en los olúmenes no malizados de los spo s en e los es
p o ocolos de ex acción. El análisis e eló que 322 de 571 spo s (56,4%) p esen a on
old change supe io es a 2 en e los p o ocolos siendo es as di e encias es adís icamen e
signi ica i as ( es U de Mann-Whi ney, P < 0,05), mien as que los 249 spo s es an es
(43,6%) es aban compa idos en los es p o ocolos de ex acción. En gene al, nues os
esul ados sugie en al mé odo de enol como la p ime a opción pa a la ex acción de
p o eínas en semillas de judía, ya que da luga a los geles 2-DE de más calidad, una
mayo can idad de spo s pa a las p o eínas menos ácidas y de al o peso molecula , y el
mayo núme o de spo s de mayo olumen. Sin emba go, la aplicación de los mé odos
de ex acción TCA-ace ona y Clean-Up unidos al mé odo del enol en iquece el
ex ac oma.
La calidad del ex ac oma in luye en el ni el de éxi o de la iden i icación de los
spo s p o eicos median e las écnicas de MS. Po o a pa e, los ex ac omas ob enidos
median e los di e en es p o ocolos de ex acción pueden mani es a di e encias
cuali a i as y cuan i a i as. En es e es udio, se selecciona on un o al de 50 spo s en
geles 2-DE, di e encialmen e o no di e encialmen e ex aídos po los es p o ocolos de
ex acción ensayados, pa a su análisis median e MS con el in de e alua el ni el
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
51
di e encial de calidad de los es ipos de ex ac omas y sus di e encias en los pe iles
p o eicos. La iden i icación de p o eínas se ealizó a pa i de spo s escidindidos de los
geles 2-DE seguido de la diges ión pep ídica con ipsina e iden i icación de las
p o eínas a pa i de las diges iones íp icas, median e las écnicas de MALDI-TOF MS
y MALDI-TOF/TOF MS, usando el espec óme o de masas 4800 MALDI-TOF/TOF
de Applied Biosys ems. La iden i icación p o eica se ob u o a pa i de la combinación
de los da os de la huella pep ídica (PMF) y de los espec os de agmen ación de
pép idos de cada mues a, con ayuda del so wa e GPS Explo e 3.6 (Applied
Biosys ems) usando el Masco so wa e 2.1. (Ma ix Science), pa a la búsqueda en la
base de da os de p o eínas (NCBIn elease da a 20100526).
Los da os ob enidos en nues o es udio demues an que los es ipos de
ex ac oma (TCA-ace ona, enol y Clean-Up) y su pos e io sepa ación po 2-DE,
conducen a una iden i icación óp ima de p o eínas de semilla de judía median e MS
(Tabla 3). Así, se llega on a iden i ica 35 spo s, el 70% de los spo s seleccionados. De
los 35 spo s se co espondie on con un o al de 40 p o eínas di e en es iden i icadas,
debido a que cua o spo s (26, 66, 83 y 486) die on iden i icaciones múl iples. La mayo
pa e de las p o eínas iden i icadas co espondie on a P. ulga is (67,5%) o a o as
especies de leguminosas (15%): P. acu i olius, L. japonicus, Pisum sa i um, Daucus
ca o a y Vigna unguicula a. La p opo ción de iden i icaciones ob enida en es e es udio
es simila a es udios p o eómicos p e ios lle ados a cabo en o as semillas de especies
de plan as como es el caso de la especie modelo A. haliana. Además las
iden i icaciones poseen un ni el de con ianza ele ado en base al Masco sco e y al
co e age que se mues an en la Tabla 3. A pesa del limi ado núme o de secuencias
disponibles en ese momen o en las bases de da os, debido a que los p oyec os de
secuenciación del genoma de la judía oda ía es aban en ma cha en ese momen o.
Ac ualmen e se dispone de una in o mación más comple a pa a la iden i icación de
p o eínas po MS, debido a que los p oyec os de secuenciación del genoma de P.
ulga is han concluido ecien emen e (Schmu z e al., 2014). Sin emba go a ios
ac o es con ibuye on a aumen a el núme o de iden i icaciones a pesa de no conoce
la secuencia del genoma comple o. En p ime luga un g an núme o de spo s (40%)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
52
ue on iden i icados como aseolinas, lec ina i ohemaglu inina o como lec inas
elacionadas con el inhibido de α-amilasa, odas ellas p o eínas de la judía bien
ca ac e izadas y que con o man ap oximadamen e el 70% de la p o eína o al de la
misma (Ma solais e al., 2010). En segundo luga , la in o mación sob e los genomas de
o as especies de plan as en ese momen o, ue on ambién muy ú iles pa a la
iden i icación de enzimas del me abolismo ya que es án muy conse adas. Finalmen e,
la mayo ía de las iden i icaciones se ealiza on u ilizando espec os de MS/MS.
Table 3. Lis o 2-DE-based iden i ied P. ulga is seed p o eins by MALDI-TOF and MALDI-TOF/TOF.
Sou ce: De la Fuen e e al., 2011.
Spo
No. P o ein iden i y Masco
sco e
Ma ch/
% Co .a
M (kDa) pI
Theo. Exp. Theo. Exp.
S o age p o ein
62 Phaseolin, α- ype (P. ulga is) 563 13/33 49.2 18.3 5.3 4.9
66 Phaseolin - (P. ulga is) 174 9/23 48.4 26.4 5.4 4.6
81 Phaseolin, α ype – (P. ulga is) 556 20/60 49.2 39.4 5.3 5.0
83 Phaseolin – (P. ulga is) 251 15/43 47.5 51.1 5.0 4.9
105 Phaseolin – (P. ulga is) 60 5/14 47.5 19.6 5.4 5.3
110 Phaseolin, chain A - (P. ulga is) 97 9/32 45.0 17.7 5.2 5.0
111 Phaseolin, chain A – (P. ulga is) 420 12/30 45.0 18.5 5.2 5.0
224 Phaseolin - (P. ulga is) 388 12/36 48.4 20.7 5.3 5.7
296 Phaseolin – (P. ulga is ) 444 12/29 47.5 25.3 5.4 6.1
311 Phaseolin – (P. ulga is) 335 12/34 47.5 30.4 5.4 5.9
354 Phaseolin , α- ype – (P. ulga is) 391 16/36 49.2 21.1 5.3 6.3
355 Phaseolin, α ype – (P. ulga is) 302 12/34 49.2 23.8 5.3 6.3
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
53
Spo
No. P o ein iden i y Masco
sco e
Ma ch/
% Co .a
M (kDa) pI
Theo. Exp. Theo. Exp.
356 Phaseolin – (P. ulga is) 509 12/34 47.5 19.9 5.4 6.1
368 Phaseolin, α- ype - (P. ulga is) 348 15/31 49.2 26.0 5.3 6.1
496 Phaseolin – (P. ulga is) 69 5/14 48.8 25.6 5.4 6.5
Ca bohyd a e me abolism
121 α-1,4 glucan phospho ylase L
isozyme, chlo oplas ic/amyloplas ic
— (T i icum aes i um)
81 6/13 52.1 29.7 5.0 5.3
183 Glucose and ibi ol dehyd ogenase –
(Daucus ca o a)
64 3/8 31.7 18.6 6.3 5.6
325 Mala e dehyd ogenase [NADP],
chlo oplas ic– (Zea mays)
162 16/44 35.9 39.8 5.8 6.0
404 Ribulose 1,5-bisphospha e
ca boxylase-oxigenase, la ge subuni
– (Callaeum sep en ionale)
754 25/53 52.1 64.1 6.1 6.2
460 Ribulose 1,5-bisphospha e
ca boxylase-oxigenase, la ge
subuni – (Pip an hus nepalensis)
136 9/24 50.8 60.5 6.3 6.3
472 Ribulose 1,5-bisphospha e
ca boxylase-oxigenase, la ge
subuni – (Dipogon lignosus)
676 22/53 49.9 63.4 6.3 6.1
426 G anule-bound s a ch syn hase I –
(P. ulga is)
316 5/11 67.6 18.6 6.4 6.5
427
G anule-bound s a ch syn hase I –
(P. ulga is)
414 9/19 67.6 18.0 6.4 6.5
457 Phosphoglyce a e kinase -
(A abidopsis haliana)
63 4/13 42.2 43.5 5.5 6.3
De ence
5 α -amylase inhibi o β subuni – (P.
ulga is)
359 6/69 15.4 15.1 4.7 4.4
26 α -amylase inhibi o β subuni – (P.
ulga is)
134 6/68 15.4 27.2 4.7 4.4
83 α -amylase inhibi o like p o ein –
(P. ulga is)
95 3/17 28.9 51.1 4.95 4.9
26 Phy ohemagglu inin - (P. ulga is) 443 11/53 29.7 27.2 4.8 4.4

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
54
Spo
No. P o ein iden i y Masco
sco e
Ma ch/
% Co .a
M (kDa) pI
Theo. Exp. Theo. Exp.
66 Phy ohemaggu inin - (P. ulga is) 104 9/43 29.8 26.4 5.0 4.6
27 Lec in – (P. ulga is) 462 8/42 29.6 26.8 4.8 4.6
66 Lec in - (P. ulga is) 100 4/20 29.6 26.4 4.8 4.6
S ess esponse
360 Hea -shock cogna e – (D. ca o a) 136 4/17 18.5 18.2 10.6 6.1
523 P 42p – (P. ulga is) 105 6/21 41.6 43.1 6.5 6.5
486 Supe oxide dismu ase [Mn] –
(Pisum sa i um)
98 4/20 26.7 25.6 7.2 5.7
554 Dehyd in - (Vigna unguicula a) 92 1/10 26.5 27.3 6.0 6.9
De oxi ica ion
43 Pu a i e glu a hione S- ans e ase –
(Phaseolus. acu i olius)
86 2/13 24.8 38.0 5.6 6.0
486 NAD-dependen o ma e
dehyd ogenase – (O yza sa i a)
87 4/10 41.4 25.6 6.9 6.5
G ow h and de elopmen
441 IAA-p o ein conjuga e – (P.
ulga is)
413 23/53 35.5 36.4 6.2 6.4
P o ein anspo
500 GTP-binding nuclea p o ein
Ran1A – (Lo us japonicus)
260 10/52 24.1 27.4 6.7 6.7
Ni ogen me abolism
524 Glu amine syn he ase β2, cy osolic
– (P. ulga is)
57 3/42 39.3 41.1 6.1 6.4
a % Co .: pe cen age o he p o ein sequence ha co esponds o ma ched pep ides; Theo.: heo e ical alue;
Exp.: expe imen al alue; Spo numbe s exhibi ing s a is ically signi ican quan i a i e di e ences among
he di e en ex ac ion p o ocols assayed.
En las iden i icaciones po MS un núme o de spo s p o eicos mos a on no ables
disc epancias en e los alo es eó icos y expe imen ales en M y/o pI. Además
di e en es spo s ue on iden i icados como la misma p o eína. Esas disc epancias en M
y/o pI pod ían co esponde a dis in as iso o mas p oducidas po modi icaciones pos -
aduccionales, co e y empalme al e na i o y a la p esencia de amilias mul igénicas,
así como a dis in os agmen os de la misma p o eína. Pa a la aseolina y el inhibido de
la α-amilasa se ap ecia que la p o eolisis puede se el ac o p incipal que explique la
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
55
disco dancia en e los alo es eó icos y expe imen ales, de M y pI. La aseolina es á
codi icada po una pequeña amilia génica de 6-10 genes cons i uidas po dos
sub amilias (α y β) que codi ican dos ipos de polipép ido α y β. Es os polipép idos se
esol ie on en 2-DE den o de un ango de M de 52,0-45,0 kDa y pI p óximos a pH 5
(Sligh om e al., 1985; S u m e al., 1987), mien as que en nues o es udio o as quince
aseolinas (spo s 62, 66, 81, 83, 105, 110, 111, 224, 296, 311, 354, 355, 356, 368, 496)
ue on iden i icadas en o as zonas del gel, en el ango de M desde 51,1 has a 17,7 kDa
y en el de pI desde 6,5 a 4.6. Se sabe que cambios sus anciales en la es uc u a
molecula de la aseolina no son de ec ables an es de los 7-10 días siguien es a la
ge minación de la semilla cuando la aseolina se deg ada po la acción de enzimas
p o eolí icas dando luga a agmen os de 27-23 kDa (Boylan y Sussex, 1987). Po el
con a io, nues o es udio sugie e que exis e una deg adación pa cial de la aseolina,
an e io a la ge minación de la semilla. En el caso del inhibido de α-amilasa que se
conside a como una o ma modi icada de la aseolina. Es a se sin e iza a pa i de un
polipép ido p ecu so de ap oximadamen e 40 kDa y pos e io men e se glicosila.
Pos e io men e median e un p oceso p o eolí ico se gene an a ios polipép idos de M
en el ango de 15 a 18 kDa (Ce io i e al., 1989; Nasi e al., 2009). En nues o es udio
se han iden i icado spo s como inhibido de α-amilasa en el ango en e 27,2 y 15,1
kDa, lo que se pod ía co esponde a agmen os de polipép idos de i ados de la
p o eolisis del polipép ido p ecu so . En gene al, la ele ada ep oducibilidad de los
spo s en las epe iciones y p o ocolos de ex acción, jun o con el hecho de que el
mé odo del enol minimiza la p o eolisis du an e la ex acción, hace que es a
agmen ación in i o sea poco p obable.
Las p o eínas iden i icadas po MS ue on clasi icadas en di e en es g upos que
se co esponden a su supues a unción biológica: p o eínas de almacenamien o,
me abolismo de los ca bohid a os, de ensa, espues a al es és, desin oxicación,
c ecimien o y desa ollo, p o eínas de anspo e y me abolismo del ni ógeno. La
mayo ía de las p o eínas iden i icadas co espondían a p o eínas de almacenamien o
(37,5%), me abolismo de hid a os de ca bono (22,5%), de ensa (17,5%) y espues a al
es és (10,0%). Sin emba go, con cada mé odo de ex acción ob u imos un pe il
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
56
di e enciado de la semilla de judía. El p o ocolo TCA-ace ona y Clean-Up ex aje on la
mayo can idad de p o eínas de ese a y de ensa mien as que el mé odo del enol
ex ajo una mayo can idad de p o eínas elacionadas con el me abolismo de los
ca bohid a os. También se de ec a on di e encias no ables en e los p o ocolos cuando
las p o eínas se clasi ica on en glicosiladas ( aseolinas y lec inas) y no-glicosiladas. Así,
la p opo ción de p o eínas glicosiladas / no glicosiladas, pa a cada mé odo de ex acción
ue de 15/3, 1/8 y 13/1 pa a TCA–ace ona, enol y Clean-Up, espec i amen e. Se
deduce que TCA-ace ona y Clean-Up p opo ciona on ex ac os de semillas más icos en
glicop o eínas en compa ación con enol ( es de Fishe , P < 0.001). Po el con a io,
es udios an e io es con oma e y especies de u as mos a on que el mé odo basado en
el enol ex ajo un mayo núme o de glicop o eínas que los mé odos basados en TCA-
ace ona (Sa a anan y Rose, 2004; Zheng e al., 2007). Sin emba go, nues os esul ados
deben se in e p e ados con cau ela po que los alo es expe imen ales de pI y M ue on
gene almen e más bajos pa a p o eínas glicosiladas que pa a las no glicosiladas ( es U
de Mann-Whi ney, P < 0,05 y P < 0,001 pa a el pI y M , espec i amen e) y las
obse aciones an es mencionadas sugie en que el mé odo de enol ue menos e icien e
pa a ex ae las p o eínas ácidas de bajo peso molecula . Po lo an o, di e encias en pI y
la M en e p o eínas glicosiladas y no glicosiladas pueden se subyacen es a los
pa ones de ex acción, es deci dependien e de los p o ocolos. Además, muchas
glicop o eínas iden i icadas (64%) e an en ealidad p oduc os de deg adación de la
aseolina con ni eles desconocidos de glicosilación. En es e sen ido, se conoce que la
aseolina iene es cadenas dis in as de oligosacá idos unidos con enlaces n-
glucosídicos a los esiduos de aspa agina y dos luga es de glicosilación en la posición
252 y uno en la posición 341 (la nume ación empieza con la me ionina N- e minal del
pép ido señal) (S u m e al., 1987). Sin emba go, análisis con MS/MS e ela on que la
mayo ía (64,3%) de los agmen os de aseolina (spo s 105, 224, 296, 311, 354, 355,
356, 368, y 496) iden i icados en nues o es udio se co esponden con la secuencia C-
e minal (posiciones desde 257 has a 421) que no con iene dos posiciones canónicas de
glicosilación. Po an o, los pa ones de ex acción di e encial de las glicop o eínas de
semillas de judía de ec ados en e los p o ocolos pod ían se más apa en es que eales.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
57
3.1.2. A ículo o iginal: 2-DE-based p o eomic analysis o common bean
(Phaseolus ulga is L.) seeds
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
64
Figu e 10. 2-DE phaseolin p o iles o cul i a s ICA Pijao (le ) and Calima (cen e) and bo h cul i a s pooled ( igh ). 1-DE phaseolin
p o iles o hese wo cul i a s a e also shown. Gel egions con aining phaseolin spo s and p o ein bands a e enclosed in ec angles in (a)
and enla ged in (b). 2-DE was pe o med om 50 μg o o al p o ein loaded on 24-cm long IPG s ips, pH=4-7, and 15 % (by mass)
polyac ylamide gels. Sou ce: De la Fuen e e al., 2012.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
65
3.2.2. Desc ipción de los pa ones 2-DE de la aseolina
La Figu a 11 mues a los pa ones de aseolina de al a esolución ob enidos
median e los p o ocolos de 2-DE op imizados pa a un o al de seis a iedades
domes icadas de judía común: S (Sanilac) y B (Boyacá), del ace o mesoame icano; y T
(Tende g een), C (Con ende ), H (Hue o de Huanchaco) y A (Ayacucho), del ace o
andino. Los geles de ele ada esolución con spo s de inidos y muy ep oducibles,
pe mi en la desc ipción p ecisa y de allada de los pa ones de aseolina 2-DE. En p ime
luga , se puede obse a que los pa ones de aseolina se o ganizan como cadenas de
spo s ho izon ales que a ían en unción del pI y de la M . Po o o lado exis e una
disposición e ical de los spo s en pa ejas que se co esponden con iso o mas de
dis in a M . Las pa ejas de iso o mas nume a on consecu i amen e en unción de su pI,
desde posiciones más ácidas a las más alcalinas, de acue do con su ubicación en el gel
más e y después de con as a odos los spo s en los di e en es cul i a es con el
PDQues . Los isospo s de cada pa eja localizados a iba/abajo se denomina on como
1'/1, 2'/2, e c. En segundo luga , se obse a que los pa ones de aseolina pa a los
dis in os cul i a es con ienen un núme o a iable de spo s in ensos (po ejemplo, el spo
20' / 20 en la pa eja del cul i a S) y o os más débiles (po ejemplo, el spo 5' / 5 en la
pa eja del cul i a S). Los spo s in ensos y débiles en la mayo ía de los cul i a es se
denomina on como majo spo s y mino spo s, espec i amen e. Un análisis más
de allado de las imágenes e ela que el pa ón de los majo spo s exhibe cie o g ado de
epe ición den o de cada a iedad. Po ejemplo, los pa es de isospo s 7' / 7, 9' / 9, 11'
/11 'y 12' / 12, así como las pa es 18' / 18, 19' / 19, 21'/ 21 y 23' / 23 pa ecen se
epe iciones de un pa ón p incipal en el cul i a H.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
66
F
igu e 11. 2-DE spo pa e ns o di e en ypes o phaseolin (S, T, H, B, C and A). Spo s we e numbe ed a e ma ching all spo s ac oss
c
ul i a s by PDQues . Up and down isospo s o di e en M and simila pI we e deno ed wi h and wi hou apos ophe, espec i ely. 2-DE
w
as pe o med om 50 μg o o al p o ein loaded on 24-cm long IPG s ips, pH=4.7-5.9, and 10 % (by mass) polyac ylamide gels. Sou ce:
D
e la Fuen e e al., 2012.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
67
En gene al, los pe iles 2-DE de aseolina obse ados en nues o es udio exhiben
g andes di e encias con los de es udios p e ios (Bollini y Vi ale, 1981; B own e al.,
1981a, 1981b; Lioi y Bollini, 1984; Gep s y Bliss, 1986; Gep s e al., 1986; Lioi, 1989).
En pa icula , se ha iden i icado po p ime a ez una impo an e can idad adicional de
mino spo s si uados esencialmen e en las zonas menos básicas de los pa ones 2-DE de
aseolina. Es a nue a y mayo in o mación sob e los pe iles de aseolina obse ada en
nues o es udio se puede a ibui a un núme o di e so de ac o es: como la mejo a en el
p ocedimien o de ex acción p o eica, el uso de i as IPG, así como la mayo ampliación
del ango de pH (4,7–5,9) en compa ación con el usado en abajos an e io es (pH 5,2–
5,7) (Bollini y Vi ale, 1981; Lioi y Bollini, 1984).
3.2.3. Di e sidad de los pa ones 2-DE de la aseolina
La di e enciación de la aseolina en e dis in os cul i a es de judía se puede
de ec a y cuan i ica median e la compa ación de sus mapas de spo s en geles 2-DE de
al a esolución. Un es udio p elimina de la di e sidad de la aseolina basada en es os
pa ones 2-DE se ealizó a pa i de los cul i a es S y B (ace o mesoame icano) y C, T,
H y A (ace o andino). Se han podido iden ica un o al de 51 spo s di e en es en e
es os cul i a es, con una un núme o mayo i a io de ellos (35) ocupando la misma
posición ela i a en el gel más e . El núme o de majo spo s, mino spo s y spo s únicos
de aseolina de ec ados pa a cada cul i a se mues a en la Tabla 4. Se obse a que el
núme o de spo s de ec ado ue ele ado den o de cada cul i a y bas an e a iable en e
los dis in os cul i a es, oscilando en e 18 spo s y 28 spo s. El núme o de spo s
obse ado en nues os pa ones de aseolina es muy supe io al de 6 spo s encon ados
en es udios p e ios (Lioi y Bollini, 1984; B own e al., 1981b).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
68
Table 4. Numbe o majo , mino and unique 2-DE spo s ac oss di e en phaseolin
ypes. Sou ce: De la Fuen e e al., 2012.
Phaseolin
ype Majo spo s Mino spo s Unique spo s
Pe cen age o unique
spo s*
S 6 12 0 0
B 6 12 0 0
C 13 11 0 0
T 11 12 1 2
H 16 12 5 10
A 8 10 8 16
*Re e ed o he o al amoun o spo s de ec ed wi h PDQues so wa e
Po lo an o, la in o mación sob e la can idad de polipép idos que con o man
cada uno de los pa ones de aseolina se inc emen a sus ancialmen e. Así el núme o de
majo spo s en los cul i a es osciló en e 6 y 16, mien as que el de mino spo s sólo
a ió de 10 a 12. El po cen aje de spo s únicos y especí icos de cada cul i a ambién
a ió mucho en e cul i a es (desde 0 has a 16%), siendo los cul i a es H y A los que
mues an los po cen ajes más ele ados de spo s únicos (10 y 16%, espec i amen e).
El g ado de simili ud de los pa ones de aseolina en e dos cul i a es dados se
es imó a pa i del po cen aje de spo s compa idos median e el coe icien e F:
F=2nxy/(nx+ny)
donde nx y ny son el núme o o al de spo s en los cul i a es x e y, espec i amen e, y nxy
es el núme o de spo s compa idos po x e y (Figu a 12a) (Bi on e al., 2006). La
dis ancia p o eómica (D) en e dos pa ones de aseolina se ob u o a pa i de la
exp essión 1-F (Bi on e al., 2006). El es udio de la dis ancia p o eómica en e
cul i a es se ealizó pa a majo spo s y mino spo s, sepa adamen e. A pa i de las
dis ancias p o eómicas, se cons uyó un mapa de las elaciones exis en es en e los
di e en es pa ones de aseolina median e la écnica del escalado mul idimensional no-
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
69
mé ico (MDS, nonme ic mul idimensional scaling) (Manly, 1986) (Figu a 12b). El
análisis MDS se lle ó a cabo median e el p og ama XLSTAT . 1.01 (Addinso ,
Andemach, Alemania). El análisis MDS e eló una cla a di e enciación de los ipos de
aseolina pe enecienes a los ace os mesoame icano y andino pa a los majo spo s y
los mino spo s. Sin emba go, una di e enciación más cla a en e los pa ones de
aseolina de los ace os andino y mesome icano se ob u o a pa i de los majo spo s.
El mapa p oducido po MDS ambién mos ó que el pa ón de la aseolina ipo A e a el
más di e enciado. Se ha plan eado la hipó esis de que la aseolina del ipo C pudie a se
el esul ado de una combinación de los ipos T y S, en base a los pa ones 1-DE y 2-DE,
po que mues a polipép idos comunes a ambos ipos de aseolina (B own e al., 1981b).
Po es e mo i o se pod ía deci que la aseolina C es á en una posición in e media en e
el ace o mesoame icano y el andino. Es e azonamien o con adice o os es udios
pos e io es que si úan el cul i a C den o del ace o andino (Gep s e al., 1986)
basándose en da os del eno ipo de la semilla y de la a qui ec u a de la plan a de es a
a iedad que p esen an ca ac e ís icas cla amen e p esen es en o as a iedades del ipo
andino. Los pa ones 2-DE analizados en es e abajo sugie en que el pa ón de la
aseolina C pe enece al ace o andino y es á es echamen e elacionado con el ipo T
(po cen aje de spo s compa idos supe io al 80%).
Po o a pa e, los pe iles de las aseolinas H y A son los que se di e encian en
mayo g ado del es o, lo que es á de acue do con es udios iniciales de 2-DE (Gep s y
Bliss, 1986).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
70
Figu e 12. Pe cen age o majo (uppe ) and mino (bo om) spo s sha ed be ween phaseolin cul i a s as
measu ed by F-index (a); non-me ical mul idimensional scaling (MDS) om p o eomic dis ance (D=1-F)
be ween phaseolin ypes (b). Sou ce: De la Fuen e e al., 2012.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
71
3.2.4. In e p e ación molecula de los pa ones 2-DE de la aseolina
Los pa ones 2-DE desc i os an e io men e pueden se in e p e ados
molecula men e eniendo en cuen a la in o mación disponible ace ca de la composición
de polipép idos de aseolina y de sus modi icaciones co- y pos - aduccionales. La
p esencia y dis ibución de los dos ipos de polipép idos (α y β) que componen la
aseolina, a lo la go de las ilas de spo s, se de e minó en cul i a es S (ace o
mesoame icano) y T (ace o andino), po MALDI-TOF y MALDI-TOF / TOF MS. Los
22 spo s seleccionados pa a el análisis po MS se iden i ica on inequí ocamen e como
polipép idos α o β a a és de PMF, da os espec ales de MS/MS y de sus ca ac e ís icas
dis in i as en la secuencia de nucleó idos. Los esul ados de las iden i icaciones se
mues an en la Tabla 5.
Los da os ob enidos e ela on a ias ca ac e ís icas des acadas de los pa ones
de aseolina. En p ime luga , cada pa de isospo s indi iduales con enían sólo un ipo
de polipép ido (α o β) de aseolina. En segundo luga , se encon ó que aquellos pa es de
isospo s con mayo M (po ejemplo, el pa 22 '/ 22 en el cul i a S) se co espondían
con polipép idos de ipo α, mien as que los pa es con meno M (po ejemplo, el pa 20'
/ 20 en el cul i a S) e an polipép idos de ipo β. La mayo M en los polipép idos de
ipo α que en los de ipo β es consis en e con la conocida di e gencia gené ica en e sus
egiones codi icado as. Así en los genes α exis en di e en es epe iciones de nucleó idos
di ec as ( epe ición de 15 pb en el cua o exón y epe ición de 27 pb en el sex o exón)
que los hacen se de un mayo amaño que los genes β (Sligh om e al., 1983, 1985;
An hony e al., 1990; Kami y Gep s, 1994; Kami e al., 1995). La obse ación de una
mayo abundancia de polipép idos de ipo α en los pa ones de aseolina (Figu a 11)
ambién es á de acue do con el hecho de que el núme o de sus i uciones de aminoácidos
pa ece se mayo en los polipép idos de ipo α que en polipép idos de ipo β (Sligh om
e al., 1983, 1985).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
72
Table 5. Iden i ica ion o he ype o polypep ide (α o β) in 2-DE phaseolin spo pa e ns (cul i a s S
and T) by MALDI-TOF and MALDI-TOF/TOF MS*. Sou ce: De la Fuen e e al., 2012.
Cul i a S Cul i a T
No. spo Phaseolin polypep ide
iden i y
No. spo Phaseolin polypep ide
iden i y
5’ α 10’ α
5 α 10 α
14’ α 15’ α
14 α 15 α
20’ β 18’ β
20 β 18 β
22’ α 19’ α
22 α 19 α
25’ β 22’ β
25 β 22 β
27’ α
27 α
*
A e ages (±SE) o Masco sco es and pe cen ages o he p o ein sequence o
ma ched pep ides we e 833±24 and 60.3±1.6, espec i ely.
La di e encia de masa molecula en e isospo s de cada uno de los pa es puede
se in e p e ada po el hecho ya conocido de que los polipép idos α o β expe imen an
uno o dos glicosilaciones (Bollini e al., 1983). Con el in de con i ma es e supues o se
p ocedió a incuba ex ac os de p o eínas de los cul i a es es udiados con la enzima
PNGasa F. Los da os ob enidos en la Figu a 13 e ela on que los ex ac os de p o eínas
expe imen aban desglicosilación pa cial y o al con la PNGasa F. Cabe señala que las
glicop o eínas no sólo expe imen an cambios en su M sino ambién en su pI, ya que los
esiduos de aspa agina se con ie en en ácido aspá ico.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
73
a)
S H
T A
b)
S H
T C
Figu e 13. 2-DE spo pa e ns o phaseolin ypes pa ially (a) and o ally (b) deglycosyla ed wi h PNGase
F. 2-DE was pe o med om 50 μg o o al p o ein loaded on 24-cm long IPG s ips, pH=4.7-5.9, and 10
% (by mass) polyac ylamide gels. Sou ce: De la Fuen e e al., 2012.
Se obse ó que los polipép idos de la aseolina ue on en e ec o sensibles a la
diges ión pa cial y o al con la enzima PNGasa F (Figu a 13). En p ime luga , los
pa ones de la aseolina desglicosilada pa cialmen e (Figu a. 13a) mos a on cadenas de
spo s adicionales de una meno M en compa ación con los pa ones de la aseolina no
a ada con la enzima, lo que indica que los polipép idos de la aseolina con ienen
glicosilaciones. En segundo luga , los pa ones de la aseolina desglicosilada o almen e
(Figu a 13b) e ela on la exis encia de sólo dos cadenas de spo s con di e en e M , pe o
de mayo mo ilidad elec o o é ica en compa ación a los pa ones de aseolina no
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
80
Figu e 14. Iden i ica ion o phospho yla ed phaseolin iso o ms in d y ma u e bean seeds o c s. S and T.
(a) 2-DE images o gel sec ions showing e e ence phaseolin pa e ns o c s. S (le ) and T ( igh )
ob ained om un ea ed samples o o al seed p o ein. Gels we e s ained wi h SYPRO Ruby p o ein gel
s ain. (b) Same gels s ained wi h he phosphop o ein-speci ic luo escen dye P o-Q DPS o de ec
phospho yla ed phaseolin polypep ides. A ows show he signal o luo escence o he phosphop o ein
ma ke o albumin. (c) Dephospho yla ed phaseolin pa e ns a e HF-P ea men ollowed by SYPRO
Ruby gel s aining. The dashed and closed ci cles ep esen missing and newly a isen phaseolin spo s a e
dephospho yla ion, espec i ely, as compa ed wi h e e ence pa e ns. Sou ce: López Ped ouso e al.
2014a.
La compa ación de los esul ados ob enidos con los es mé odos de
des os o ilación e lejó que el mé odo de HF-P p opo ciona pe iles 2-DE más

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
81
in o ma i os de la aseolina des os o ilada que los o os mé odos (Figu a 14c). En la
Figu a 14c se mues an los pa ones 2-DE de la p o eína aseolina des os o ilada en los
c s. S y T. Se puede obse a que los spo s al amen e exp esados (o majo spo s) en los
pa ones de e e encia (i.e., los pa es de spo s 13´/13, 15´/15 y 17'/17 del c . S y los
pa es 11'/11, 12'/12 y 14'/14 del c . T) se disponen en las mismas posiciones en los
pa ones des os o ilados que en los de e e encia, pe o con un olumen ela i o más
bajo. De ello se deduce que los majo spo s en los pa ones de aseolina de e e encia
con enían una mezcla de polipép idos os o ilados y no os o ilados. La can idad
ela i a de os opolipép idos en cada majo spo , se e aluó median e el p og ama
PDQues , de e minando la di e encia del olumen de un spo dado en e las mues as
con ol y las a adas con HF-P. La asa de os o ilación ela i a (PR) en cada spo se
cuan i icó median e la ó mula: PR =[(X−Y) / X] × 100, donde X y Y indican el olumen
de un spo dado en las mues as con ol y a adas con HF-P, espec i amen e. Los
alo es medios de PR pa a los majo spo s en las dis in as éplicas del c . S oscila on
en e el 49 y el 81% con un alo p omedio del 63 ± 1,7%; mien as que pa a el c . T,
a ia on en e el 13 y el 82% y la media ue de 46 ± 3,9%. Además, se obse a que los
alo es de PR pa a los majo spo s ienden a aumen a a medida que su pI disminuye.
La elación en e los alo es de pI y PR pa a los majo spo s en los c s. S y T se
mues a g á icamen e en la Figu a 15. Los alo es de pI y PR mues an una elación
nega i a y es adís icamen e signi ica i a median e el es de co elación no-pa amé ica
de Spea man en ambos c s. (c S: s = −0.37, P < 0.05, n = 24; c . T: s = −0.62, P <
0.01, n = 24). Es os esul ados demues an que las semillas de judía en un es ado de
do mancia con ienen una a iedad de iso o mas de la aseolina di e encialmen e
os o iladas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
82
Figu e 15. Plo o ela i e PR agains pI o majo isospo pai s o S- and T-phaseolin pa e ns in d y
ma u e bean seeds. Lines connec mean alues o PR- alues ac oss eplica es o majo isospo pai s.
Sou ce: López Ped ouso e al. 2014a.
La des os o ilación de p o eínas debe ía p o oca cambios p edecibles en el pI y
en la M de los spo s (Zhu e al 2005; I a e al 2006). Así, la des os o ilación a ec a al
pI de las p o eínas po que se sus i uyen los g upos os a o ca gados nega i amen e po
g upos hid oxilo neu os. Como esul ado, la des os o ilación gene almen e induce un
mo imien o de los spo s hacia zonas más básicas de los geles 2-DE y múl iples
des os o ilaciones pueden causa un aumen o signi ica i o del pI. En cuan o a la M , la
pé dida de g upos os a o en esiduos de os ose ina, os o eonina y os o i osina se
aduce en una disminución de la masa de 80 Da o múl iplos de es e alo en el caso de
múl iples des os o ilaciones. En consecuencia, nues as obse aciones mues an que
algunos de los pa es de spo s débilmen e eñidos o mino spo s ubicados en posiciones
más ácidas de los pa ones de e e encia (es deci , spo s 3, 5 ', 5 y 7 en el c S; y spo s
1, 3' y 3 en c . T) llegan a no de ec a se después del a amien o con HF-P (Figu a 15c).
Es os mino spo s ausen es en los pa ones des os o ilados p obablemen e con enían
polipép idos os o ilados de aseolina que cambia on a posiciones más básicas en los
geles después de la des os o ilación. De hecho, se encon a on spo s nue os en los
pa ones des os o ilados (es deci , un spo en el c . S y es spo s en el c . T) que
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
83
ocupaban más básicas en los geles 2-DE. Po o a pa e, se obse a que los pa es de
isospo s pa a el mismo ipo de polipép ido ambién apa ecie on a una M más
homogénea que en las mues as con ol debido a la pé dida de los g upos os a o.
3.2.2. Cambios de os o ilación de la aseolina en semillas en ge minación
Los posibles cambios empo ales en los ni eles de os o ilación de la aseolina
se es udia on en los c s. S y T du an e la ansición de la semilla desde un es ado de
do mancia has a el cua o día de ge minación (Figu a 16 a-c). Se obse ó que los
pa ones de e e encia de la aseolina en geles 2-DE cambia on no ablemen e en ambos
c s. du an e la ansición de la semilla a la ase de ge minación ( éanse Figu a 14a y
16a).
En p ime luga , los olúmenes de los spo s de la aseolina mos a on cla as
di e encias en e los dos es ados de la semilla. El cambio en el olumen de los majo
spo s desde el es ado de do mancia al es ado de ge minación (cua o éplicas) se e aluó
con el p og ama PDQues pa a un o al de 12 majo spo s en c s. S y T. El old change
de cada spo se calculó como la elación en e el olumen p omedio de un spo dado en
las semillas du mien es y en ge minación. En o al, once de los doce majo spo s
analizados mos a on una disminución signi ica i a de olumen del o den de 1,2 eces
o supe io (P < 0.01, n = 12, es de angos de Wilcoxon a una cola). Pa a la mayo ía
(82%) de los majo spo s, los olúmenes dec ecie on signi ica i amen e de acue do con
el es de Mann-Whi ney (P < 0,05). Es os esul ados pueden explica se po la
p o eolisis de la aseolina que se p oduce du an e la ge minación de la semilla. En
segundo luga , un núme o sus ancial de nue os mino spo s (8 nue os mino spo s en
cada a iedad) apa ecie on en las posiciones más ácidas de los pa ones de aseolina de
semillas ge minadas en compa ación con los pe iles de aseolina de semillas
du mien es.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
84
Figu e 16. Deg ada ion and iden i ica ion o phospho yla ed phaseolin iso o ms in ge mina ing bean
seeds o c s. S and T. (a) 2-DE images o gel sec ions showing e e ence phaseolin pa e ns o c s. S
(le ) and T ( igh ) om un ea ed samples o o al seed p o ein. As e isks indica e spo s absen in
e e ence phaseolin pa e ns o do man seeds as shown in Figu e 3. (b) Phospho yla ed phaseolin
pa e ns on 2-DE gels s ained wi h P o-Q DPS. (c) Dephospho yla ed phaseolin pa e ns on 2-DE gels
a e HF-P ea men . A ows show he signal o luo escence o he phosphop o ein ma ke o albumin.
The dashed and closed ci cles ep esen missing and newly a isen spo s a e dephospho yla ion,
espec i ely, as compa ed wi h e e ence pa e ns. Sou ce: López Ped ouso e al. 2014a.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
85
El análisis de los cambios en los ni eles de os o ilación de la aseolina en la
ansición de semilla du mien e a semilla ge minada se lle ó a cabo u ilizando en p ime
luga la inción P o-Q DPS (Figu a 16b). Es des acable que con P o-Q DPS no se
de ec ó aseolina os o ilada en los pa ones 2-DE de semillas en ge minación. Sin
emba go, no puede desca a se la posibilidad de la exis encia de ni eles de os o ilación
po debajo de la capacidad de de ección del P o-Q DPS. De hecho, los pa ones de
aseolina S y T en semilla en ge minación ue on sensibles a la des os o ilación con
HF-P (Figu a 16c), lo que demues a que exis en o mas os o iladas de la aseolina en
es a ase aunque a ni eles más bajos que en semillas no ge minadas. De es os esul ados
se deduce que el a amien o con HF-P puede se más e icaz pa a la de ección de
pequeñas can idades de os opép idos en geles 2-DE que el a amien o con P o-Q DPS.
La Figu a 16c ambién e ela la desapa ición de un núme o conside able de mino spo s
en la zona ácida del pa ón de e e encia (spo s 14 y 13 en c s. S y T, espec i amen e)
después de la des os o ilación con HF-P. De ello se deduce que es os spo s sólo
con enían polipép idos os o ilados. Además, las imágenes de los geles de las mues as
des os o iladas mues an la apa ición de nue os spo s de aseolina en posiciones más
alcalinas de los pa ones, en compa ación con mues as con ol no a adas. Los nue os
spo s se co esponde ían con os opolipép idos que su ie on una des os o ilación y po
an o una de i a hacia un pI más básico. En gene al, las obse aciones sugie en que los
polipép idos de aseolina es án di e encialmen e os o ilados y coexis en con o mas no
os o iladas en semillas de judía en ge minación. Sin emba go, la p opo ción de
iso o mas os o iladas es más baja que en las semillas en ase de do mancia, ya que no
se pudie on de ec a con la inción P o-Q DPS. En consonancia con es as obse aciones,
los alo es de PR de los polipép idos de aseolina disminuye on no ablemen e en las
semillas ge minadas en compa ación con semillas en ase de do mancia. La mayo ía de
los majo spo s (11 de los 12 spo s de c s. S y T) expe imen a on cambios nega i os de
PR desde la ase de do mancia has a la ase de ge minación emp ana (P < 0.05, n = 12,
es de angos de Wilcoxon a una cola; Figu a 17). Es impo an e des aca que en las
semillas en ge minación, algunos mino spo s alcanzan posiciones más ácidas en el gel,
en compa ación a los pa ones de semilla no ge minada, pe o con meno peso molecula
a pesa del hecho de que con ienen polipép idos al amen e os o ilados. Es a

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
86
obse ación sugie e que es as iso o mas de aseolina al amen e os o iladas son
p oduc os de deg adación in e medios, esul ado de la acción de enzimas p o eolí icas.
Figu e 17 Fold change o he ela i e PR o majo phaseolin isospo pai s (c s. S and T) in he ansi ion
om do man o ge mina ion. Gel posi ion o assigned spo s is shown in igu e 8. Sou ce: López
Ped ouso e al. 2014a.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
87
3.2.3. Iden i icación de los os opolipép idos de aseolina median e MS
Un o al de 24 spo s de aseolina de di e en e pI y M en las semillas en ase de
do mancia de los c s. S y T se seleciona on pa a su análisis po MALDI-TOF y
MALDI-TOF/TOF MS. La mayo ía de los spo s seleccionados (23 de los 24 spo s)
ue on iden i icados inequí ocamen e (Tabla 6). Los esul ados ob enidos mues an que
cada pa de isospo s sólo con iene un único ipo polipép ido, α o β. Los pa es de
isospo s con mayo M se co esponden con polipép idos de ipo α, y los de meno M
con polipép idos de ipo β. La di e encia de M en e ambos ipos de polipép idos se
debe a que los genes de ipo α con ienen una epe ición de 15 pb en el cua o exón y 27
pb en el sex o exón (Sligh om e al., 1983, 1985; Kami y Gep s, 1994).
Un es udio p elimina de mapeado de os opép idos en la p o eína aseolina se
lle ó a cabo a pa i de los da os espec ales ob enidos po MALDI-TOF. Pa a la
de ección de posibles os opép idos, se omó en cuen a la os o ilación como una
posible modi icación a iable en el p oceso de búsqueda en la base de da os Swiss-P o .
Como esul ado, se de ec a on un o al de seis di e en es os opép idos en los
polipép idos de ipo α y β de los c s. S y T (Tabla 6).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
88
Table 6 Phospho yla ed pep ides o he p o ein phaseolin in d y ma u e common bean seeds o c s. S and T iden i ied by MALDI-TOF
a Spo code numbe s acco ding o Fig. 1
b Expe imen al pI alues
c Type o phaseolin polypep ide
d T yp ic pep ide expe imen al masses (exp essed in Da) o spo s
e Theo e ical masses (exp essed in Da) esul ing om he da a base sea ch
Phosphopep ide sequence
g Posi ion o he phosphopep ide in he polypep ide sequence
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
89
Cada uno de los os opép idos iden i icados con enía dos o más si ios posibles
de os o ilación. Pa a algunos spo s, se iden i ica on o mas os o iladas y no
os o iladas del mismo pép ido lo que es a ía de acue do con los análisis de
os o ilación basados en 2-DE. Es impo an e sub aya que el os opép ido
TDNSLNVLISSIEMKEGALFVPHYYSK, iden i icado en la posición 257-283 de la
secuencia de la subunidad β, con iene el mo i o de os o ilación X-T-D-X, un mo i o
ecuen emen e ep esen ado en las SSPs (Meye e al., 2012). Así, es udios p e ios
indican que al ededo del 25% de las p o eínas que con enían X-T-D-X en A abidopsis,
colza y soja son SSPs (Meye e al., 2012). Po an o, X-T-D-X pod ía se un mo i o de
os o ilación cla e du an e el c ecimien o de la semilla. En gene al, los es udios
disponibles indican que la os o ilación de SSPs puede juga un papel en la egulación
de ansición de semillas a un es ado de eposo. Sin emba go, se ía necesa io abo da
una ca ac e ización más en p o undidad de los os opép idos y luga es de os o ilación
de las subunidades α y β de la aseolina ecu iendo a es a egias de en iquecimien o de
os opép idos en combinación con me odologías de MS de al a esolución. Es udios
p e ios ealizados en nues o labo a o io, u ilizando columnas de dióxido de i anio y
c oma og a ía de a inidad de iones me álicos inmo ilizados (IMAC) pa a la cap u a
especí ica de os opép idos, no die on los u os espe ados ( esul ados no mos ados).
En es e es udio, po an o, se p esen a la p ime a e idencia de iso o mas de
aseolina os o iladas en semillas de judía común. Más especí icamen e, se encon ó que
o mas os o iladas y no os o iladas de polipép idos del ipo α y β coexis en en semillas
en las ases de ge minación y do mancia de las a iedades S y T. De es e modo, la
aseolina se suma a la c ecien e elación de SSPs os o iladas que ya habían sido
desc i as pa a o as especies de plan as (Schwenke e al., 2000; Ag awal y Thelen, 2006;
I a e al., 2006; Meye e al., 2012). Es os hallazgos ab en nue as pe spec i as pa a la
comp ensión de los mecanismos egulado es implicados en la sín esis y la deg adación
de la p incipal SSP de la judía común. En de ini i a, las obse aciones ob enidas en el
p esen e abajo sugie en que la os o ilación puede juga un papel egulado impo an e
en la sín esis de la aseolina al ni el de la ansc ipción, sino ambíen en su pos e io
deg adación ac uando a un ni el pos - aduccional.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
97
3.4. E aluación de los pe iles 2-DE de la aseolina como ma cado es
de di e enciación gené ica y calidad p o eica en la judía común (P.
ulga is L.).
3.4.1. Di e sidad de pa ones 2-DE de la aseolina
Los pe iles 2-DE de aseolina se analiza on pa a un o al de 18 a iedades de
judía común (P. ulga is L.) an o sil es es como cul i adas de los ace os andino y
mesoame icano. En la Tabla 7 se mues a la in o mación gene al más ele an e sob e
las a iedades es udiadas: código de egis o, nomb e común, ipo de aseolina basado
sob e los pa ones en 1-DE, aza, es a us, o igen, peso y colo de la semilla.
Los pa ones 2-DE de aseolina en las 18 a iedades sil es es y cul i adas de
judía común se mues an en la Figu a 18. Se obse a que los pe iles de aseolina
di ie en signi ica i amen e en e las dis in as a iedades. Así, el núme o o al de spo s a
lo la go de las a iedades a ió en e los 10 de Jalisco y los 28 de Hue o de Huanchaco
(Figu a 18) con un alo medio (± e o es ánda ) de 20,4 ± 1,1. Además, se obse a que
los pa ones de aseolina son mani ies amen e menos complejos en el ace o
mesoame icano (M) que en el Andino (A), siendo la media de spo s pa a es os ace os
de 16,8 ± 1,4 y 23.4 ± 1.0, espec i amen e.
Cabe des aca que la mayo pa e de es as a iaciones se debie on a la
p esencia/ausencia de spo s en la p ime a dimensión (pI). Es as a iaciones en el pI de
los spo s de la aseolina se deben en g an medida a las di e encias exis en es en el g ado
de os o ilación de los polipép idos del ipo α y β (López-Ped ouso e al., 2014a).
López-Ped ouso e al. (2014a) ambién demos a on que la mo ilización de la aseolina
en las semillas ge minadas pa ece ocu i p ecisamen e a a és de la deg adación de
iso o mas al amen e os o iladas. Po an o, la di e sidad de los pa ones obse ada en
el p esen e es udio sugie e que los mecanismos de egulación esponsables de la sín esis
y la pos e io deg adación de aseolina dependien e de la os o ilación pod ían se
di e en es pa a los dis in os ipos de aseolina.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
98
Table 7. In o ma ion on he Di e en Cul i a ed and Wild Bean Accessions Used in This S udya. Sou ce: López Ped ouso e al., 2014b
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
99
Figu e 18. High- esolu ion 2-DE phaseolin p o iles om seeds o 18 cul i a ed and wild accessions o
common bean co esponding o he Mesome ican and Andean gene pools. Posi ion o he spo s acco ding
o hei isoelec ic poin (pI) and molecula mass (M ) a e shown. Sou ce: López Ped ouso e al., 2014b
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
100
3.4.2. Dis ancia P o eómica
Una es imación cuan i a i a de la di e encias en e los pe iles 2-DE de la
aseolina se ob u o a pa i de la ma iz de dis ancias p o eómicas calculadas median e
el es adís ico D = 1 – F, F = nxy / (nx+ny), donde nxy el el núme o de spo s compa idos;
y nx, ny son el núme o o al de spo s de la aseolina del ipo x e y, espec i amen e. Los
alo es de D (en po cen aje) en e odos los posibles pa es de poblaciones de judía
común analizadas se mues an en la Figu a 19. Además se empleó el boo s ap como
écnica de emues eo pa a el cálculo de la es imación de los in e alos de con izanza
(95 y 99%) de las medias de dis ancia p o eómica. Se obse a que las dis ancias
p o eómicas en e a iedades son gene almen e muy he e ogéneas, con alo es de D que
oscilan en e 0% ( es compa aciones M × M) y el 100% (seis compa aciones M × A),
siendo el alo de D p omedio de 59,9 ± 2,4%. La mayo pa e de es a he e ogeneidad
se puede a ibui a las di e encias exis en es en e ace os. De hecho, la dis ancia
p o eómica en e los dos ace os gené icos ue signi ica i amen e más al a que las
dis ancias den o de los ace os (P < 0,01). Den o de cada ace o, las dis ancias
p o eómicas ue on bas an e homogéneas con la excepción de las poblaciones
mesoame icanas cul i adas (MC). Es as a iedades exhibie on de hecho la dis ancia
p o eómica media más baja (11,0 ± 4,9), signi ica i amen e di e en e de las es an es
dis ancias p o eómicas p omedio (P < 0,01). La meno di e sidad obse ada en es e
abajo pa a los ipos de aseolina de las poblaciones mesoame icanas es cong uen e con
es udios p e ios basados en los pa ones 1-DE (Gep s e al., 1986). En conjun o, la
e idencia disponible apoya ía la hipó esis de que un solo suceso de domes icación de la
judía pudo habe ocu ido en México, mien as que múl iples sucesos de domes icación
u ie on luga en los Andes (Gep s e al., 1986). Sin emba go, el enómeno de la
domes icación de la judía común es complejo y sigue siendo un ema ac ualmen e
con o e ido (Rossi e al., 2009).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
101
Figu e 19. Pai wise p o eomic dis ance (D), exp essed as a pe cen age, based on high- esolu ion 2-DE phaseolin pa e ns om seeds o 18
cul i a ed and wild accessions o common bean. Sou ce: López Ped ouso e al., 2014b.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
102
Las elaciones exis en es en el conjun o de las poblaciones de judía común
es udiadas se analiza on aplicando el mé odo de ag uipamien o o clus e UPGMA
(Unweigh ed Pai G oup Me hod wi h A i hme ic Mean) a pa i de la ma iz de las
dis ancias p o eómicas (Figu a 20) Es impo an e des aca a la luz de es e análisis que
las dis ancias p o eómicas basadas sólo en los pe iles 2-DE de aseolina de al a
esolución son capaces de sepa a adecuadamen e las poblaciones de judía común en los
dos g andes g upos (mesoame icano y andino) a los que pe enecen. Sólo la a iedad
sil es e Jalisco se sepa a de es os dos g andes ag upamien os en el dend og ama
UPGMA. Además, el dend og ama UPGMA ambién ue capaz de desen aña la
he e ogeneidad exis en e den o de los dos g andes ace os y, en pa icula , la a iedad
Ayacucho mos ó una cla a di e enciación del es o de las poblaciones pe enecien e al
g upo andino.
Figu e 20. Unweigh ed pai -g oup me hod wi h a i hme ic a e aging (UPGMA) dend og am om he
ma ix o pai wise p o eomic dis ances (
D
) based on high- esolu ion 2-DE phaseolin p o iles om seeds
o 18 cul i a ed and wild accessions o common bean. Sou ce: López Ped ouso e al., 2014b
La ep esen ación de las elaciones en e las poblaciones en un espacio
bidimensional se ob u o median e la écnica de escalado mul idimensional no-mé ico
(MSD, non-me ic mul idimensional scaling) (Figu a 21).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
103
Figu e 21. Mul idimensional scaling (MDS) p ojec ion o he p o eomic dis ance (D) be ween 18
cul i a ed and wild popula ions on o wo-dimensional space based on high- esolu ion 2-DE phaseolin
pa e ns. Sou ce: López Ped ouso e al., 2014b.
El alo de la unción de s ess ue 0,074, lo que indica un buen ajus e de las
dis ancias p oyec adas en el plano con las dis ancias o iginales. El mapa bidimensional
ob enido po MDS e leja esencialmen e el mismo escena io que el ob enido po el
dend og ama UPGMA. Así, la dimensión I e ela las g andes di e encias exis en es
en e los poblaciones de los ace os mesoamé icano y andino mien as que la dimensión
II pe mi ió sepa a cla amen e las a iedades Ayacucho y Jalisco del es o de las
poblaciones.
In es igaciones an e io es apoyan las g andes dis ancias p o eómicas
encon adas en el p esen e abajo pa a las a iedades Ayacucho y Jalisco (Tohme e al.,
1995; Kwak y Gep s, 2009; Kwak e al., 2009; Rossi e al., 2009; Bi occhi e al., 2012;
Deside io e al., 2013). En p ime luga , es impo an e señala que Ayacucho es una
“nuña”, un ipo de cul i a limi ado ac ualmen e a cie as zonas de mon aña de Pe ú y
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
104
Boli ia, que iene la p opiedad pa icula de e en a como palomi as cuando se
exponen al calo . Se conside a que las semillas de “nuña” pueden ep esen a an iguas
a iedades descendien es de las p ime as judías andinas domes icadas (Tohme e al.,
1995; Kwak y Gep s, 2009). Segundo, Jalisco es una posible a iedad sil es e ances al
de P. ulga is. Es udios ecien es usando una a iedad de ma cado es de ADN nuclea y
de clo oplas os sugie en que las o mas sil es es de P. ulga is se o igina on en
Mesoamé ica y el ace o gené ico andino se o iginó a a és de di e en es e en os de
mig ación del cen o de México (Rossi e al., 2009; Bi occhi e al., 2012; Deside io e
al., 2013). También pa ece que las semillas mesoame icanas ue on domes icadas en la
egión de Jalisco (Kwak y Gep s, 2009). Además, el análisis de la di e sidad gené ica
con ma cado es mic osa éli es en un g an núme o de a iedades sil es es y
domes icadas de judía de los ace os mesoame icano y andino han demos ado que la
aza Jalisco cons i uye un g upo sepa ado, jun o con la aza Du ango, del es o de las
poblaciones (Kwak y Gep s, 2009). En consecuencia, el p esen e es udio demues a que
las dis ancias p o eómicas ob enidas a pa i de los pa ones 2-DE de aseolina son un
ma cado iable de di e enciación gené ica en e las poblaciones cul i adas y sil es es
de judía común.
3.4.3. Dis ancia P o eómica y calidad de las p o eínas de las semillas.
La composición en aminoácidos esenciales y no esenciales en p o eína o al de
semilla de judía se analizó a pa i de dos éplicas biológicas de cada una de las 18
a iedades sil es es y domes icadas de los ace os mesoame icano y andino, median e
la écnica de c oma og a ía líquida de al a esolución (HPLC, high-pe o mance liquid
ch oma og aphy). En la Figu a 22 se p opo ciona el con enido medio en me ionina
(mg/g p o eína o al) pa a cada una de las a iedades es udiadas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
105
Figu e 22. Mean me hionine con en (mg/g o al seed p o ein) ac oss 18 cul i a ed and wild popula ions
o common bean. Sou ce: López Ped ouso e al., 2014b.
Se obse a que el con enido de me ionina expe imen a no ables a iaciones
en e las dis in as a iedades pues los alo es medios oscila on en e 4,2 (Con ende )
has a 7,4 (Jalisco) mg/g. A pesa de es as impo an es di e encias, odas las a iedades
alcanza on alo es o ales de me ionina+cis eína in e io es a los ni eles de e e encia de
es os aminoácidos ecomendados po la FAO/WHO pa a la nu ición humana
(FAO/WHO/UNU, 2007). Además, no se encon a on di e encias es adís icamen e
signi ica i as en el con enido de me ionina en e el conjun o de las poblaciones
pe enecien es a los ace os mesoame icano y andino ( es U de Mann-Whi ney p =
0,79). Sin emba go, se de ec ó una débil elación en e la dis ancia p o eómica pa a
pa es de poblaciones y su di e encia en el con enido en me ionina en la p o eína o al de
la semilla. Conc e amen e, se de ec ó una co elación posi i a en e ambas a iables

4. CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
115
1. El es udio compa a i o de los mé odos de ex acción de p o eína o al de semilla de
P. ulga is con enol, TCA-ace ona y el ki Clean-up e eló que el mé odo de
ex acción con enol es el más e icien e en base a la capacidad de sepa ación de las
p o eínas de semilla y el ni el de esolución ob enido en geles bidimensionales (2-
DE) así como en el po cen aje de éxi o en la iden i icación p o eica pos e io
median e espec ome ía de masas (MALDI-TOF y MALDI-TOF/TOF).
2. La op imización del mé odo de ex acción de p o eína o al de semilla y de los
p o ocolos de la 2-DE ha pe mi ido ob ene pa ones bidimensionales de la aseolina
de al a esolución pa a los c s. Sanilac y Tende g een (T) de P. ulga is que mejo an
muy no ablemen e los de es udios p e ios. El análisis de los pa ones 2-DE y la
iden i icación p o eica median e MS (MALDI-TOF y MALDI-TOF/TOF) mues an
que la aseolina engloba un conjun o complejo de iso o mas de los polipép idos α y β
que a ían en su pun o isoelec ico (pI) y masa molecula (M ). Los expe imen os de
desglicosilación pa cial y o al con la enzima PNGasa F mos a on que las
a iaciones en M se explican po una glicosilación di e encial de los polipép idos α y
β de la aseolina.
3. La aplicación de la inción luo escen e especí ica de os op o eínas P o-Q DPS y la
des os o ilación química median e FH-P en combinación con la 2-DE y la MS
pe mi ie on iden i ica po p ime a ez iso o mas os o iladas de la aseolina en los
es ados de do mancia y ge minación de la semilla de los c s. S y T. Iso o mas no
os o iladas y di e encialmen e os o iladas de los polipép idos α y β coexis en en
ambos c s. de P. ulga is.
4. El análisis de los esul ados del es udio de os o ilación/des os o ilación mos ó que
las iso o mas de aseolina con ele ados ni eles de os o ilación pa ecen desempeña
un papel cla e en la mo ilización de la p o eína dado que expe imen an un p oceso
de deg adación p e e en e du an e la ge minación de la semilla. Po an o, es e
CONCLUSIONES
116
es udio pe mi e asigna po p ime a ez un papel uncional a las os o ilaciones que
expe imen an las p o eínas de ese a de semilla..
5. Los pe iles 2-DE de la aseolina de al a esolución son ma cado es iables de
di e enciación gené ica en poblaciones sil es es y cul i adas de los ace os
mesoame icano y andino. El análisis de clus e (UPGMA) basado en las dis ancias
p o eómicas (D) mos ó que los pe iles 2-DE son e icaces en asigna las poblaciones
analizadas al ace o que les co esponde, así como, en la iden i icación de
poblaciones ou lie s dis an emen e elacionadas con el es o de las poblaciones.
6. Las dis ancias p o eómicas basadas en los pe iles 2-DE de la aseolina suminis an
in o mación aliosa sob e la calidad de la semilla al iden i ica poblaciones ou lie s
en el con enido de me ionina, un aminoácido esencial de icien e en la semilla de P.
ulga is. Po an o, los pe iles 2-DE de la aseolina son ma cado es po encialmen e
impo an es pa a acele a el p oceso de selección del ge moplasma en u u os
p og amas de mejo a gené ica de la calidad de la semilla en la judía común.
7. Los esul ados ob enidos en el p esen e abajo demues an que la aplicación de las
me odologías p o eómicas son de g an u ilidad pa a a anza en el conocimien o de
las p o eínas complejas de ese a en las semillas de las plan as.
5. BIBLIOGRAFÍA

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