Aplicación de metodologías proteómicas al estudio de la estructura, modificaciones postraduccionales y diferenciación genética de la proteína faseolina en semilla de la judía común (Phaseolus vulgaris L.)

Departamento de Genética Aplicación de metodologías proteómicas al estudio de la estructura, modificaciones postraduccionales y diferenciación genética de la proteína faseolina en semilla de la judía común (Phaseolus vulgaris L.) Memoria presentada por: María Dolores López Pedrouso para optar al Grado de Doctora en Biología Santiago de Compostela, 2015 Departamento de Genética José Carlos Zapata Babío, Catedrático del Departamento de Genética de la Universidad de Santiago de Compostela Informa: Que el trabajo titulado “Aplicación de metodologías proteómicas al estudio de la estructura, modificaciones postraduccionales y diferenciación genética de la proteína faseolina en semilla de la judía común (Phaseolus vulgaris L.)” que presenta María Dolores López Pedrouso para la obtención del Grado de Doctora ha sido realizado bajo su dirección, que lo consideran concluido y autorizan su presentación al tribunal calificador. Y para que así conste, se firma el presente informe en Santiago de Compostela a 7 Septiembre 2015. Fdo.: José Carlos Zapata Babío Agradecimientos A mi director de tesis, Carlos Zapata, pues fue el principal motor de este trabajo de investigación. Una tesis doctoral es siempre fruto de ideas, proyectos y esfuerzos previos que corresponden a un investigador y que disfruta compartiéndolas y desarrollándolas con el doctorando. En mi caso, fue un placer poder compartir todo este tiempo y dedicación de mi director de tesis. A Daniel, porque sin su motivación habría sido imposible. Su apoyo aunque de forma indirecta fue decisivo para salvar todo tipo de obstáculos, tanto dentro como fuera del laboratorio. A mis hijas, Helena y Marta. Ellas son las me impulsan a luchar por conseguir mejoras en lo profesional y en lo personal, y en ningún caso constituyeron un impedimento. Al resto de compañeros de laboratorio que contribuyeron a mantener un buen ambiente de trabajo. Entre bromas y charlas animadas y sin que yo me diese cuenta, se fue haciendo esta tesis. Abreviaturas 1-DE: Electroforesis monodimensional 2-DE: Electroforesis bidimensional AC: Andina y cultivada AW: Andina y silvestre Cv.: Variedad cultivada kDa: kDalton (unidad de masa atómica) HF: Ácido fluorhídrico HF-P: Ácido fluorhídrico-Piridina IEF: Isoelectroenfoque o enfoque isoeléctrico IMAC: Cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados IPG: Gradiente inmobilizado de pH m/z: Relación masa/carga MALDI: Ionización/desorción por láser asistida por matriz MC: Mesoamericana y cultivada MDS: Escalado multidimensional no paramétrico Mr: Masa molecular relativa MS: Espectrometría de masas MS/MS: Espectrometría de masas en tándem MW: Mesoamericana y silvestre NCBI: Centro Nacional para la Biotecnología y la Información PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida PCA: Análisis de componentes principales pI: Punto isoeléctrico PMF: Huella de la masa peptídica PNGasa F: N-Glicosidasa F PR: Tasa de fosforilación Pro-Q DPS: Tinción de fosfoproteínas Pro-Q Diamond (Pro-Q Diamond phosphoprotein stain) RE: Retículo endoplasmático SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) Abreviaturas SNP: Polimorfismo de un solo nucleótido (single nucleotide polymorphism) SRP: Partícula reconocimiento de señal (signal recognition particle) SSP: Proteínas de reserva de la semilla(seed storage proteins) TCA: Tricloroacético TOF: Tiempo de vuelo (time of flight) Indice 9 INDICE RESUMEN ..................................................................................................................... 11 SUMMARY .................................................................................................................... 15 1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 19 1.1. Importancia económica y nutricional de la judía común ................................ 21 1.2. Composición química y valor nutricional de la semilla de la judía común .... 24 1.3. Proteómica de Phaseolus vulgaris L. .............................................................. 26 1.4. Faseolina ......................................................................................................... 29 1.4.1. Estructura y base genética ..................................................................... 29 1.4.2. Biosíntesis de la faseolina ..................................................................... 30 1.5. Fosfoproteoma ................................................................................................ 33 1.6. Germinación de la semilla ............................................................................... 34 1.7. Origen y domesticación de la judía común ..................................................... 36 2. OBJETIVOS .............................................................................................................. 41 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 45 3.1. Análisis proteómico de las semillas de judía común (P. vulgaris L.) basado en la electroforesis bidimensional (2-DE) .......................................... 47 3.1.1. Optimización del método de extracción proteica y de las condiciones electroforéticas para el proteoma de P. vulgaris L. ........... 47 3.1.2. Artículo original: 2-DE-based proteomic analysis of common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds ................................................................ 57 3.2. Caracterización de la diversidad de la proteína faseolina de la judía común (P. vulgaris L.) basada en la electroforesis bidimensional y en la espectrometría de masas. ................................................................................. 61 3.2.1. Optimización de los perfiles 2-DE de la faseolina ................................ 61 3.2.2. Descripción de los patrones 2-DE de la faseolina ................................. 65 3.2.3. Diversidad de los patrones 2-DE de la faseolina ................................... 67 SUMMARY 17 Common bean (Phaseolus vulgaris L.) is the most important grain legume for human consumption. The seed storage proteins are the main source of amino acids and reduced nitrogen that play a fundamental role during the germination and the early plant growth. Phaseolin is the major seed storage protein of common bean accounting for 40- 60% of the total seed protein. In the past decades, numerous studies have contributed to the enormous progress in our knowledge about the structure, genetic basis, expression, regulation and evolution of the phaseolin.. Therefore, the phaseolin can be considered as the model protein to the study of seed storage proteins. Phaseolin is encoded by a gene family located on chromosome 7. Members of the gene family can be subdivided into two distinct gene types termed α and β, that give rise to α- and βglycosylated polypeptides. The study of the diversity of phaseolin in wild and domesticated populations of common bean through monodimensional electrophoresis led to the identification of two major gene pools (mesoamerican and andean), later confirmed by DNA molecular markers. However, recent advances in the proteomic methodologies provide new tools for a better knowledge of this complex gene family. In this work, relevant aspects on the structure, expression and genetic differentiation of phaseolin were addressed by applying the current bidimensional electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry (MALDI-TOF y MALDI-TOF/TOF MS) together with other proteomic methodologies. Optimization of the protein extraction protocol and 2-DE conditions allowed us to obtain high-resolution bidimensional maps of the protein phaseolin that provided a very relevant information. The results of this study revealed for the first time the existence of differentially phosphorylated phaseolin isoforms. In addition, phosphorylation plays an important role in mobilization of the phaseolin because highly phosphorylated isoforms are preferently degraded in germinating seeds. It is noteworthy that this would be the first function assigned to phosphorylated isoforms of seed storage proteins. On the other hand, the analysis of proteomic distances obtained from 2-DE patterns showed that the phaseolin is a reliable marker of genetic differentiation and quality of seed protein in wild and domesticated common bean populations belonging to the mesoamerican and andean gene pools. Accordingly, the phaseolin seems to be a useful marker for the genetic improvement of common bean populations. Overall, the study reveals that the proteomic methodologies are an important tool to achieve a deeper knowledge of the seed storage proteins. 1. INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN 21 1.1. Importancia económica y nutricional de la judía común La judía común (Phaseolus vulgaris L.) es una planta anual herbácea perteneciente a la familia Fabaceae (o Leguminoseae) originaria de América cuyas múltiples variedades se cultivan en todo el mundo para el consumo de las vainas verdes y de los granos secos. El género Phaseolus incluye 35 especies, de las cuales se cultivan cuatro: P. vulgaris L.; P. lunatus L.; P. coccineus L. y P. acutifolius L. En la primera etapa del desarrollo de la semilla, el sistema radical está formado por la radícula del embrión que se convierte posteriormente en la raíz primaria y a los pocos días surgen las raíces secundarias. El tallo se origina a partir del meristemo apical del embrión de la semilla durante la germinación y en las primeras etapas del desarrollo de la planta. En este proceso se van generando los nudos donde se insertan las hojas. La flor es de tipo papilionácea y su color puede ser blanco, rosado o púrpura (Figura 1). El fruto es una vaina con dos valvas, las cuales provienen del ovario comprimido. Las vainas pueden ser de diversos colores, uniformes o con rayas, dependiendo de la variedad (Arias et al., 2007; CIAT, 2014). Figura 1. Planta y semilla de la judía común Las leguminosas son uno de los cultivos básicos para la alimentación humana junto con el arroz y el maíz. En el año 2012, la producción total de judía en grano y en verde ascendió a 23,6 y 20,7 millones de toneladas, respectivamente. La INTRODUCCIÓN 22 mayor producción a nivel mundial de judía en grano se obtiene por orden de importancia en países de Asia (46,0%), de América (30,6%) y África (21,0%) (Figura 2A); mientras que para la judía verde, Asia produce el 91,4% (Figura 2B). Considerando la producción de judía en grano y en verde conjuntamente, la mayor parte de la producción mundial procede del continente asiático (67,2%), seguido del continente americano (16,8%) y el africano (12,9%) (FAOSTAT, 2013; Figura 2C). Figura 2. Porcentaje de la producción mundial de judía en grano (A), judía en verde (B) y total (C) en los distintos continentes Los principales países productores son Birmania, India, Brasil, China, Estados Unidos y México (FAOSTAT 2013, Tabla 1). Para países como Birmania, el principal productor mundial, la judía representa el 10% del total de exportaciones. Las áreas cosechadas en los diferentes países varían de forma notable, estando la producción muy afectada por el rendimiento que varía significativamente desde 407,7 Kg/Ha en la India A B C INTRODUCCIÓN 23 hasta los 2116,8 Kg/Ha en países desarrollados como USA. Es evidente que la mejora de la productividad agrícola que se está produciendo en África y en los países sudamericanos en vías de desarrollo pueden suponer un mecanismo para invertir la tendencia de un incremento de la pobreza en esas regiones, por lo que la identificación y posterior optimización de los factores limitantes del rendimiento agronómico son actualmente una prioridad en la mayoría de los programas de mejora de la judía. Tabla 1. Principales países productores de judía en grano (año 2012) Área cosechada (Ha) Rendimiento (Kg/Ha) Producción (t) Birmania 2.750.000 1418,2 3.900.000 India 9.100.000 407,7 3.710.000 Brasil 2.709.485 1031,5 2.794.854 China 971.000 1607,3 1.560.698 USA 684.081 2116,8 1.448.095 México 1.558.992 693,3 1.080.857 Sin embargo, se estima que las estadísticas globales sobre la producción de judía son una infraestima de la producción real dado que en los países en vías de desarrollo los cultivos de la judía se mezclan con otros cultivos, crecen en zonas remotas y/o áreas donde hay conflictos políticos o bélicos, etc., lo que dificulta la toma de datos precisos. La judía es considerada la leguminosa para la alimentación humana de mayor importancia a nivel mundial, representando la mitad de las leguminosas de grano consumidas mundialmente. Debido al limitado acceso a proteína de origen animal en los países en vías de desarrollo, la judía común (P. vulgaris L.) es la fuente proteica de mayor importancia. Así en Ruanda aporta cerca del 60% y 30% de todas las proteínas y calorías ingeridas respectivamente, siendo el segundo en importancia después del maíz (Ferris et al., 2002). Incluso en Brasil, tercer país productor, el 9% de la proteína alimenticia proviene de la judía. INTRODUCCIÓN 24 1.2. Composición química y valor nutricional de la semilla de la judía común La judía común ocupa un lugar importante en la nutrición mundial y en especial en muchas poblaciones de África y América latina, donde es considerada un elemento básico debido a su valor nutritivo y a su bajo coste. Por otro lado el consumo en Europa es más bajo que en otras regiones del mundo aunque está aumentando de forma paulatina en los últimos años (Schneider, 2002). Los factores limitantes del consumo de judía en países de primer nivel son el escaso desarrollo de productos leguminosos adaptados a nuestra vida moderna, una limitada producción local y competencia con otras importaciones más baratas. Otros inconvenientes son los trastornos gástricos que provoca su baja calidad sensorial y que requiere mucho tiempo de cocción (Krupa, 2008). Desde el punto de vista nutricional, la judía es rica en proteína, fibra, carbohidratos, vitaminas y minerales como K, Mg, P, Fe y Zn (Meiners et al., 1976). Además de su valor nutricional, está demostrado que el consumo regular de judía, tiene un efecto beneficioso sobre la salud, pues influye en la prevención y tratamiento de enfermedades cardiovasculares, diabetes de tipo II y cáncer (Mann y Chisholm, 1999; Bassano et al., 2001; Mathers, 2002). También su ingesta regular puede contribuir a disminuir el nivel de colesterol y constituyen una de las mejores fuentes de ácido fólico junto con guisantes, lentejas y garbanzos (Krupa, 2008). Una desventaja de la proteína de judía radica en su bajo contenido en aminoácidos azufrados (metionina y cisteína), así como en triptófano cuando se compara con los requerimientos mínimos de aminoácidos recomendados por la FAO/WHO (2007). El contenido total de metionina y cisteína para distintos cultivares y variedades silvestres varía entre 8 y 11 mg/g de proteína (Tabla 2; Montoya et al., 2008a), siendo la cantidad diaria recomendada por la FAO para niños entre 2 a 5 años de 26 mg/g (FAO/WHO, 2007). Además, Montoya et al. (2008a) encontró que las diferencias en el contenido en aminoácidos se correlacionan con el tipo de faseolina en semillas de variedades cultivadas y silvestres. INTRODUCCIÓN 25 Tabla 2. Composición de aminoácidos (mg/g de proteína) para distintos tipos de semillas de variedades cultivadas y silvestres (Montoya et al., 2008a). Cultivated beans Wild beans I M6 PA S T T01 Xª SD H2 J1 J3 J4 K L Xª,b SD ARG 51 54 59 50 53 59 54 4 57 57 51 56 59 57 57 2 HIS 32 36 39 33 35 39 36 3 38 39 35 38 40 37 38 2 ILE 41 44 48 44 44 48 45 3 47 48 44 46 48 45 46 2 LEU 71 76 81 78 74 81 77 4 79 81 74 79 81 77 78 2 LYS 61 66 70 68 65 70 67 3 68 69 63 68 61 67 68 3 MET 8 6 8 8 8 7 8 1 7 7 7 7 7 7 7 1 PHE 57 64 69 58 60 67 63 5 66 67 60 65 68 65 65 2 THR 31 33 36 26 34 34 32 4 34 34 26 73 35 34 34 3 VAL 45 48 49 47 48 49 48 2 50 51 47 49 51 48 49 2 ALA 38 43 44 34 37 42 40 4 44 45 40 43 46 44 44 2 ASP 101 108 119 116 105 116 111 7 111 114 107 112 115 110 111 3 CYS 2 2 2 3 3 2 2 1 2 2 3 2 3 2 3 1 GLU 122 146 157 147 146 157 146 13 151 148 137 148 155 144 148 5 GLY 32 34 38 36 35 36 35 2 37 36 34 36 39 37 36 2 PRO 34 41 45 39 36 44 40 4 43 43 36 41 44 44 43 3 SER 49 55 59 57 52 57 55 4 55 56 55 56 58 56 56 1 TYR 32 36 40 30 29 37 34 4 38 34 28 34 36 45 35 3 Total 806 891 963 874 864 946 891 57 935 936 850 919 959 910 920 31 ª Valores medios (mg/g de proteína). b Valores medios que incluyen las variedades M10, M2, M16, M17, M23 y M25 no mostradas en la tabla. La faseolina, lectinas e inhibidores de α-amilasas, son las principales proteínas de reserva de la semilla de la judía común (Islam et al., 2002; Krupa et al., 2008). La faseolina representa entre un 40-50% del total de la fracción proteica, siendo por tanto la proteína mayoritaria (Emani and Hall, 2008). Por este motivo, sus características afectan en gran medida al valor nutricional de la semilla. Uno de los factores que merma el valor nutricional de la semilla de P. vulgaris reside en la composición química en aminoácidos de la faseolina dado su bajo contenido en metionina, cisteína y triptófano. Además del perfil de aminoácidos, existen otros parámetros para cuantificar la calidad de la proteína como son la digestibilidad y la disponibilidad de la misma. En el caso de la faseolina esta ofrece una pobre digestibilidad, inferior a otras proteínas de origen INTRODUCCIÓN 32 Figura 4. Esquema representativo de la faseolina mono y diglicosilada Como se ha señalado anteriormente, la faseolina es un trímero de los tres polipéptidos glicosilados de tipo α (411 y 412 aminoácidos) y de tipo β (397 aminoácidos) que comprenden estructuras similares conteniendo gran cantidad de hélices alfa y una pequeña porción de láminas beta (Lawrence et al., 1990). El trímero (Mr ∼ 150 kDa) se asocia en una estructura dodecamérica con un pH inferior a 4,5. Después de su síntesis y procesado, estas proteínas se transportan a los llamados cuerpos proteicos y vacuolas, donde se acumulan en grandes cantidades. Los cuerpos proteicos son pequeños (1-10 µm) y rellenan las vacuolas pero dentro de estas también se encuentran las lectinas y las hidrolasas ácidas. Las proteínas de reserva son hidrolizadas en el citoplasma por la acción de las proteasas endógenas en el momento de la germinación para ser utilizadas en la síntesis de proteínas. N- acetilglucosamina Manosa Xilano Asn 252 Asn 341 Faseolina diglicosilada Asn 252 Asn 341 Faseolina monoglicosilada INTRODUCCIÓN 33 1.5. Fosfoproteoma Las proteínas pueden dar lugar a isoformas diversas como consecuencia de la existencia de distintas modificaciones post-traduccionales (PTMs), tales como la fosforilación, acetilación, glicosilación y la ubiquitinización. Las PTMs de las proteínas aumentan considerablemente la complejidad de los proteomas debido a que las proteínas pueden estar modificadas en distintos lugares y por distintos grupos funcionales. De entre todas las modificaciones post-traduccionales, una de las más estudiadas es la fosforilación por su reversibilidad e importancia en la regulación de su actividad (Agrawal y Thelen, 2006). Los procesos de fosforilación y desfosforilación están controlados por las quinasas y fosfatasas que además producen cambios conformacionales en la proteína haciendo que la correspondiente enzima se active o se desactive. El estudio de estos cambios dinámicos en respuesta a señales ambientales aumenta nuestro conocimiento de los procesos celulares. En vegetales se han encontrado más de 1.000 quinasas distintas, un número que dobla aproximadamente al existente en humanos. Sin embargo, se han identificado solo unos pocos sustratos (De la Fuente van Bentem et al., 2007). La disciplina de la fosfoproteómica se ocupa de la identificación de las fosfoproteínas, de la localización y cuantificación de los lugares de fosforilación y de la unión de las proteínas a sus quinasas específicas. El análisis espacial y temporal de la fosforilación de la proteína es de gran interés para conocer el significado biológico ya que los ensayos in vitro no son reflejo de los procesos vegetales debido a la reversibilidad de la fosforilación, por lo que la experimentación tiene que ir más allá (Kline-Jonakin et al., 2011). Tampoco la identificación de lugares de fosforilación es suficiente para conocer los cambios dinámicos que se establecen en respuesta a señales ambientales. Además, la concentración de las fosfoproteínas es baja en muchas ocasiones lo que incrementa las dificultades de su caracterización e interpretación. El desarrollo de las técnicas actuales hace posible las identificaciones masivas de fosfoproteínas pero es necesario dilucidar los códigos de fosforilación que rigen los procesos celulares (Laugesen et al., 2006). Debido al conocimiento escaso que actualmente se tiene sobre las implicaciones de la fosforilación en plantas, es necesario INTRODUCCIÓN 34 hacer un gran esfuerzo para avanzar en el conocimiento de los procesos celulares en los que están implicados las fosfoproteínas y los mecanismos que los regulan. En los sistemas eucariotas la fosforilación proteica se produce en los residuos de serina (S), treonina (T) y tirosina (Y), siendo más abundante en los dos primeros. Así, en un estudio de fosforilación a gran escala realizado en Arabidopsis se encontró que las abundancias relativas de fosforilación en S, T y Y fueron 85,7%, 10,7% y 4,4%, respectivamente (Sugiyama et al., 2008). Se estima que hasta el 30% de todas las proteínas en organismos multicelulares podrían estar fosforiladas en cualquier momento, aunque sólo algunos de estos lugares de fosforilación tienen importancia biológica (De la Fuente van Bentem y Hirt, 2007). Uno de los métodos más utilizados para el análisis del fosfoproteoma consiste en llevar a cabo un enriquecimiento de la muestra en fosfopéptidos mediante la cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC, immobilized metal-ion affinity chromatography) o columnas de dióxido de titanio (TiO2) previo al análisis por MS (Nakagami et al., 2010). Un método complementario consiste en combinar la técnica de 2-DE con una tinción específica de fosfopéptidos fluorescente con la sal denominada Pro-Q® Diamond phosphoprotein stain (Pro-Q DPS). Esta tinción exhibe una alta sensibilidad y linealidad y permite realizar un análisis cuantitativo global de los fosfopéptidos de las proteínas correlacionando la fracción de fosfato con el volumen de spot (Agrawal y Thelen, 2005). 1.6. Germinación de la semilla La semilla completa el ciclo reproductivo de la planta que comienza con la floración y la polinización. El desarrollo de la semilla se inicia en la embriogénesis y termina unos días después de la fecundación. La maduración de la semilla es una etapa importante dentro de su desarrollo en la cual el crecimiento del embrión se detiene, los componenetes de reserva (aceites, polisacáridos y proteínas) se acumulan, el tegumento protector se diferencia y aumenta la tolerancia al estrés hídrico, lo que conduce a un estado de dormancia. La dormancia es un mecanismo que bloquea la germinación para INTRODUCCIÓN 35 favorecer la supervivencia de la semilla en condiciones adversas. La etapa de dormacia se interrumpe como respuesta a una serie de señales o estímulos físicos o químicos como son la temperatura, luz y equilibrio hormonal (ácido abscísico y giberelinas). En estados tempranos durante el crecimiento del embrión se produce la acumulación de compuestos de reserva y en particular de las SSP como la faseolina. El promotor de la faseolina representa uno de los promotores más estudiados específicos de la semilla de judía. En otros tejidos vegetales el promotor está silenciado, mientras que en la semilla, durante la embriogénesis se potencia la activación del promotor de la expresión de ABA (ácido ábscísico) a través de un remodelado de la cromatina (Ng y Hall, 2008). A nivel molecular la dormancia fisiológica es un estado activo con complejas interacciones que continuamente integran las señales ambientales y sus respuestas. La relación dinámica entre ABA y GA (ácido giberélico) dirige los mecanismos de dormancia y germinación que alteran la sensibilidad de la semilla a las condiciones ambientales. (Finch-Savage et al., 2006). Los eventos de fosforilación/defosforilación juegan un papel crucial en la señalización de ABA lo cual implica la acción de muchas quinasas y fosfatasas (Ghelis et al., 2008). Además el ABA está relacionado con diversos procesos fisiológicos como la germinación, la maduración de la semilla así como la adaptación de los tejidos vegetales a condiciones ambientales estresantes. Durante la germinación se produce la hidrólisis de las proteínas de reserva mediante las distintas enzimas proteolíticas, denominadas proteasas. A medida que avanza la germinación las SSP se trasforman en péptidos de menor peso molecular, siendo por tanto una fuente importante de nitrógeno. Estos aminoácidos pueden ser utilizados para la síntesis de proteínas en la plántula y así poder comenzar su vida de forma autótrofa. Estudios a gran escala del fosfoproteoma en cuanto a su identificación y a su cuantificación fueron llevados a cabo en soja (Glycine max), colza (Brassica napus) y Arabidopsis (A. thaliana) (Agrawal y Thelen, 2006; Meyer et al, 2012). Han et al. (2014) comprobaron en arroz que la fosforilación de proteínas está relacionada con la modificación de otras proteínas y con la regulación transcripcional, además se producen cambios temporales en los niveles de fosforilación de las proteínas durante la germinación en el caso del arroz. Por este motivo se puede pensar que la fosforilación INTRODUCCIÓN 36 de las proteínas parece que tiene una gran implicación en el proceso de germinación, sin embargo el papel funcional de estas proteínas fosforiladas es todavía desconocido. 1.7. Origen y domesticación de la judía común La domesticación de las plantas es un proceso que combina la evolución natural junto con una selección practicada por el hombre y mediante este proceso se obtienen los cultivos domesticados a partir de sus progenitores silvestres. Es de máximo interés identificar los sitios originales de domesticación desde el punto de vista evolutivo, así como de gran utilidad para la mejora genética y la conservación de las especies. La diversidad de las poblaciones silvestres y cultivadas de la judía común ha sido estudiada en base a caracteres morfológicos, agronómicos, marcadores bioquímicos (alozimas y faseolina) y polimórficos del ADN nuclear y de las orgánulos citoplasmáticos: mitocondrias y cloroplastos (microsatélites y SNPs). La faseolina ha sido utilizada como marcador molecular para el estudio de la diferenciación genética y la evolución de las poblaciones silvestres y cultivadas de P. vulgaris. El género Phaseolus comprende alrededor de 30 especies de las cuales sólo cinco están domesticadas (P. acutifolius A. Gray, P. coccineus L., P. lunatus L., P. polyanthus Greenman y P. vulgaris L.). Los primeros estudios sobre el origen de las primeras poblaciones silvestres de P. vulgaris están basados en datos arqueológicos, botánicos e históricos y situaban su origen en Mesoamérica, concretamente en México desde Jalisco hasta Oaxaca. Desde esta zona mesoamericana las formas silvestres migraron hacia Sudamérica donde se constituyó el acervo andino antes de la domesticación (Bitochi et al., 2012; Desiderio et al., 2013). Estas poblaciones silvestres experimentan posteriormente múltiples domesticaciones en tiempo y espacio, de forma independiente en estas dos zonas del continente americano. De esta manera se origina el acervo mesoamericano situado en México, América Central y Colombia, y acervo andino en el Sur de Perú, Bolivia y Argentina (Figura 5; Gepts y Debouck, 1991; Singh, 2001). La variabilidad genética se debe principalmente a las múltiples domesticaciones y en menor medida a los ocasionales cruzamientos entre las formas cultivadas y las INTRODUCCIÓN 37 silvestres, de este modo el acervo mesoamericano es de mayor diversidad que el andino. Dentro de estos dos acervos como se muestra en la Figura 5 se pueden distinguir seis razas: tres razas se originadas en Mesoamérica (Durango, Jalisco y Mesoamérica) y otras tres en los Andes (Chile, Nueva Granada y Perú) (Singh et al., 1991). Posteriormente los distintos cultivares de P. vulgaris se fueron introduciendo en Europa a partir del siglo XVI como consecuencia del descubrimiento de América, lo que produjo una diversificación secundaria de la especie en el continente europeo. Figura 5. Distribución geográfica de las principales razas de Phaseolus vulgaris L. en las zonas mesoamericana y andina Los estudios mediante electroforesis en geles monodimensionales permitieron establecer una asociación entre el tipo de faseolina con el origen geográfico de la semilla. En América Central, los cultivares se caracterizaban principalmente por la presencia de faseolina de tipo “S” (Sanilac) y semillas pequeñas. Mientras en la región andina, la faseolina mayoritaria era de tipo “T” (Tendergreen) y las semillas eran más grandes (Singh et al., 2001). La faseolina T y S representan el 90% dentro de los cultivares de judía común (Figura 6). La distribución de ambos tipos de faseolinas es similar tanto en los cultivares como en las formas silvestres. INTRODUCCIÓN 38 Brown et al., 1981 Gepts et al., 1986 Figura 6. Patrones electroforéticos bidimensionales de la faseolinas S y T Se han identificado otros patrones de faseolina, como la faseolina “H” (Huevo de Huanchaco) y “C” (Contender) de origen andino o la faseolina “B” (Boyaca 22) de origen mesoamericano (Gepts et al., 1986). Hasta la actualidad, más de 40 tipos de faseolina han sido estudiadas utilizando 1-D SDS-PAGE. Los distintos patrones electroforéticos monodimensionales muestran las diferencias entre los distintos tipos de faseolina en cuanto al número de subunidades (2-6 polipéptidos) y a los distintos pesos moleculares (40-54 kDa) de las distintas subunidades. Estos polipéptidos también varían en cuanto a su punto isoeléctrico desde 5,2 a 5,7 (Brown et al., 1981b). También se han realizado algunos estudios empleando electroforesis bidimensional con pobres resultados desde el punto de vista de resolución de los spots. Afortunadamente, hoy en día se han incorporado numerosas innovaciones, mejoras y optimizaciones en la INTRODUCCIÓN 39 técnicas 2-DE, destacando las tiras con gradiente de pH inmovilizado (IPG strips). Estas mejoras en la técnica permiten mejorar la resolución y además son compatibles con el posterior análisis de las proteínas por MS. 2. OBJETIVOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN 48 Figure 7. Representative 2-DE gels of proteins from bean seed extracted by three different protocols: TCA–acetone, phenol and clean-up. Proteins were separated on a linear pH 4–7 gradient in the first dimension and visualized using Sypro Ruby® staining. The approximate positions of molecular mass markers (kDa) are indicated on the left of the figure (Source: De la Fuente et al., 2011). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 49 Además con el método del fenol se redujo el background de los geles, aumentando la nitidez de los spots en comparación con los otros dos métodos. Mediante el análisis de imagen con el software PDQuest™ v8.0.1 (Bio-Rad Laboratories) se pudieron detectar un total de 571 spots proteicos entre los distintos protocolos. Las diferencias entre los tres protocolos de extracción mediante un análisis de componentes principales, a partir de los volúmenes normalizados de los spots, se muestra en la Figura 8. Este análisis reveló que los dos primeros componentes principales PC1 y PC2 explican el 27,4% y el 15,0% de la variación, respectivamente, del volumen de los spots entre protocolos. Cabe subrayar que el PC1 separa claramente las muestras de fenol de los otros dos tipos de muestras (TCA-acetona y Clean-Up), mientras que estas dos últimas son separadas por el PC2. Figure 8. Principal component analysis for normalized volume of spots. Score plot for principal components (PCs) one and two (Source: De la Fuente et al., 2011) El método de fenol dió lugar a un mayor número de spots únicos que los otros dos métodos de extracción: 150 spots únicos con el método del fenol en comparación RESULTADOS Y DISCUSIÓN 50 con los 25 spots únicos en TCA-acetona y los 39 en Clean-Up. Cuando las imágenes de los geles se dividieron en cuatro cuadrantes (Q1-4), numerados del 1 al 4 en el sentido de las agujas del reloj, se observó que la gran mayoría de spots únicos quedaron situados en el cuadrante Q2 correspondiente a las proteínas de mayor pI y Mr. Sin embargo, el método del fenol proporciona un incremento estadísticamente significativo del número de spots en el cuadrante Q2 en comparación con los otros métodos (ANOVA: F= 7,27, P= 0,013). Por tanto, es un método con una mayor capacidad de extracción de proteínas de pH más basico y de mayor Mr que los métodos TCA-acetona y Clean-Up. Resultados similares fueron encontrados en extractos proteicos obtenidos a partir del algodón, manzana, tomate y el euhalophyte S. europea (Carpentier et al., 2005; Wang et al., 2007; Xie et al., 2009). Sin embargo, Saravanan y Rose (2004) no detectaron un patrón diferencial consistente para pI o Mr entre los métodos del TCA- acetona y fenol. También, se llevó a cabo un análisis estadístico con el fin de detectar diferencias cuantitativas en los volúmenes normalizados de los spots entre los tres protocolos de extracción. El análisis reveló que 322 de 571 spots (56,4%) presentaron fold change superiores a 2 entre los protocolos siendo estas diferencias estadísticamente significativas (test U de Mann-Whitney, P < 0,05), mientras que los 249 spots restantes (43,6%) estaban compartidos en los tres protocolos de extracción. En general, nuestros resultados sugieren al método de fenol como la primera opción para la extracción de proteínas en semillas de judía, ya que da lugar a los geles 2-DE de más calidad, una mayor cantidad de spots para las proteínas menos ácidas y de alto peso molecular, y el mayor número de spots de mayor volumen. Sin embargo, la aplicación de los métodos de extracción TCA-acetona y Clean-Up unidos al método del fenol enriquece el extractoma. La calidad del extractoma influye en el nivel de éxito de la identificación de los spots proteicos mediante las técnicas de MS. Por otra parte, los extractomas obtenidos mediante los diferentes protocolos de extracción pueden manifestar diferencias cualitativas y cuantitativas. En este estudio, se seleccionaron un total de 50 spots en geles 2-DE, diferencialmente o no diferencialmente extraídos por los tres protocolos de extracción ensayados, para su análisis mediante MS con el fin de evaluar el nivel RESULTADOS Y DISCUSIÓN 51 diferencial de calidad de los tres tipos de extractomas y sus diferencias en los perfiles proteicos. La identificación de proteínas se realizó a partir de spots escidindidos de los geles 2-DE seguido de la digestión peptídica con tripsina e identificación de las proteínas a partir de las digestiones trípticas, mediante las técnicas de MALDI-TOF MS y MALDI-TOF/TOF MS, usando el espectrómetro de masas 4800 MALDI-TOF/TOF de Applied Biosystems. La identificación proteica se obtuvo a partir de la combinación de los datos de la huella peptídica (PMF) y de los espectros de fragmentación de péptidos de cada muestra, con ayuda del software GPS Explorer v3.6 (Applied Biosystems) usando el Mascot software v2.1. (Matrix Science), para la búsqueda en la base de datos de proteínas (NCBInr release data 20100526). Los datos obtenidos en nuestro estudio demuestran que los tres tipos de extractoma (TCA-acetona, fenol y Clean-Up) y su posterior separación por 2-DE, conducen a una identificación óptima de proteínas de semilla de judía mediante MS (Tabla 3). Así, se llegaron a identificar 35 spots, el 70% de los spots seleccionados. De los 35 spots se correspondieron con un total de 40 proteínas diferentes identificadas, debido a que cuatro spots (26, 66, 83 y 486) dieron identificaciones múltiples. La mayor parte de las proteínas identificadas correspondieron a P. vulgaris (67,5%) o a otras especies de leguminosas (15%): P. acutifolius, L. japonicus, Pisum sativum, Daucus carota y Vigna unguiculata. La proporción de identificaciones obtenida en este estudio es similar a estudios proteómicos previos llevados a cabo en otras semillas de especies de plantas como es el caso de la especie modelo A. thaliana. Además las identificaciones poseen un nivel de confianza elevado en base al Mascot score y al coverage que se muestran en la Tabla 3. A pesar del limitado número de secuencias disponibles en ese momento en las bases de datos, debido a que los proyectos de secuenciación del genoma de la judía todavía estaban en marcha en ese momento. Actualmente se dispone de una información más completa para la identificación de proteínas por MS, debido a que los proyectos de secuenciación del genoma de P. vulgaris han concluido recientemente (Schmutz et al., 2014). Sin embargo varios factores contribuyeron a aumentar el número de identificaciones a pesar de no conocer la secuencia del genoma completo. En primer lugar un gran número de spots (40%) RESULTADOS Y DISCUSIÓN 52 fueron identificados como faseolinas, lectina fitohemaglutinina o como lectinas relacionadas con el inhibidor de α-amilasa, todas ellas proteínas de la judía bien caracterizadas y que conforman aproximadamente el 70% de la proteína total de la misma (Marsolais et al., 2010). En segundo lugar, la información sobre los genomas de otras especies de plantas en ese momento, fueron también muy útiles para la identificación de enzimas del metabolismo ya que están muy conservadas. Finalmente, la mayoría de las identificaciones se realizaron utilizando espectros de MS/MS. Table 3. List of 2-DE-based identified P. vulgaris seed proteins by MALDI-TOF and MALDI-TOF/TOF. Source: De la Fuente et al., 2011. Spot No. Protein identity Mascot score Match/ % Cov.a Mr (kDa) pI Theo. Exp. Theo. Exp. Storage protein 62 Phaseolin, α-type (P. vulgaris) 563 13/33 49.2 18.3 5.3 4.9 66 Phaseolin - (P. vulgaris) 174 9/23 48.4 26.4 5.4 4.6 81 Phaseolin, α type – (P. vulgaris) 556 20/60 49.2 39.4 5.3 5.0 83 Phaseolin – (P. vulgaris) 251 15/43 47.5 51.1 5.0 4.9 105 Phaseolin – (P. vulgaris) 60 5/14 47.5 19.6 5.4 5.3 110 Phaseolin, chain A - (P. vulgaris) 97 9/32 45.0 17.7 5.2 5.0 111 Phaseolin, chain A – (P. vulgaris) 420 12/30 45.0 18.5 5.2 5.0 224 Phaseolin - (P. vulgaris) 388 12/36 48.4 20.7 5.3 5.7 296 Phaseolin – (P. vulgaris ) 444 12/29 47.5 25.3 5.4 6.1 311 Phaseolin – (P. vulgaris) 335 12/34 47.5 30.4 5.4 5.9 354 Phaseolin , α-type – (P. vulgaris) 391 16/36 49.2 21.1 5.3 6.3 355 Phaseolin, α type – (P. vulgaris) 302 12/34 49.2 23.8 5.3 6.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 53 Spot No. Protein identity Mascot score Match/ % Cov.a Mr (kDa) pI Theo. Exp. Theo. Exp. 356 Phaseolin – (P. vulgaris) 509 12/34 47.5 19.9 5.4 6.1 368 Phaseolin, α-type - (P. vulgaris) 348 15/31 49.2 26.0 5.3 6.1 496 Phaseolin – (P. vulgaris) 69 5/14 48.8 25.6 5.4 6.5 Carbohydrate metabolism 121 α-1,4 glucan phosphorylase L isozyme, chloroplastic/amyloplastic — (Triticum aestivum) 81 6/13 52.1 29.7 5.0 5.3 183 Glucose and ribitol dehydrogenase – (Daucus carota) 64 3/8 31.7 18.6 6.3 5.6 325 Malate dehydrogenase [NADP], chloroplastic– (Zea mays) 162 16/44 35.9 39.8 5.8 6.0 404 Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase-oxigenase, large subunit – (Callaeum septentrionale) 754 25/53 52.1 64.1 6.1 6.2 460 Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase-oxigenase, large subunit – (Piptanthus nepalensis) 136 9/24 50.8 60.5 6.3 6.3 472 Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase-oxigenase, large subunit – (Dipogon lignosus) 676 22/53 49.9 63.4 6.3 6.1 426 Granule-bound starch synthase I – (P. vulgaris) 316 5/11 67.6 18.6 6.4 6.5 427 Granule-bound starch synthase I – (P. vulgaris) 414 9/19 67.6 18.0 6.4 6.5 457 Phosphoglycerate kinase - (Arabidopsis thaliana) 63 4/13 42.2 43.5 5.5 6.3 Defence 5 α -amylase inhibitor β subunit – (P. vulgaris) 359 6/69 15.4 15.1 4.7 4.4 26 α -amylase inhibitor β subunit – (P. vulgaris) 134 6/68 15.4 27.2 4.7 4.4 83 α -amylase inhibitor like protein – (P. vulgaris) 95 3/17 28.9 51.1 4.95 4.9 26 Phytohemagglutinin - (P. vulgaris) 443 11/53 29.7 27.2 4.8 4.4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 54 Spot No. Protein identity Mascot score Match/ % Cov.a Mr (kDa) pI Theo. Exp. Theo. Exp. 66 Phytohemaggutinin - (P. vulgaris) 104 9/43 29.8 26.4 5.0 4.6 27 Lectin – (P. vulgaris) 462 8/42 29.6 26.8 4.8 4.6 66 Lectin - (P. vulgaris) 100 4/20 29.6 26.4 4.8 4.6 Stress response 360 Heat-shock cognate – (D. carota) 136 4/17 18.5 18.2 10.6 6.1 523 Pv42p – (P. vulgaris) 105 6/21 41.6 43.1 6.5 6.5 486 Superoxide dismutase [Mn] – (Pisum sativum) 98 4/20 26.7 25.6 7.2 5.7 554 Dehydrin - (Vigna unguiculata) 92 1/10 26.5 27.3 6.0 6.9 Detoxification 43 Putative glutathione S-transferase – (Phaseolus. acutifolius) 86 2/13 24.8 38.0 5.6 6.0 486 NAD-dependent formate dehydrogenase – (Oryza sativa) 87 4/10 41.4 25.6 6.9 6.5 Growth and development 441 IAA-protein conjugate – (P. vulgaris) 413 23/53 35.5 36.4 6.2 6.4 Protein transport 500 GTP-binding nuclear protein Ran1A – (Lotus japonicus) 260 10/52 24.1 27.4 6.7 6.7 Nitrogen metabolism 524 Glutamine synthetase β2, cytosolic – (P. vulgaris) 57 3/42 39.3 41.1 6.1 6.4 a % Cov.: percentage of the protein sequence that corresponds to matched peptides; Theo.: theoretical value; Exp.: experimental value; Spot numbers exhibiting statistically significant quantitative differences among the different extraction protocols assayed. En las identificaciones por MS un número de spots proteicos mostraron notables discrepancias entre los valores teóricos y experimentales en Mr y/o pI. Además diferentes spots fueron identificados como la misma proteína. Esas discrepancias en Mr y/o pI podrían corresponder a distintas isoformas producidas por modificaciones posttraduccionales, corte y empalme alternativo y a la presencia de familias multigénicas, así como a distintos fragmentos de la misma proteína. Para la faseolina y el inhibidor de la α-amilasa se aprecia que la proteolisis puede ser el factor principal que explique la RESULTADOS Y DISCUSIÓN 55 discordancia entre los valores teóricos y experimentales, de Mr y pI. La faseolina está codificada por una pequeña familia génica de 6-10 genes constituidas por dos subfamilias (α y β) que codifican dos tipos de polipéptido α y β. Estos polipéptidos se resolvieron en 2-DE dentro de un rango de Mr de 52,0-45,0 kDa y pI próximos a pH 5 (Slightom et al., 1985; Sturm et al., 1987), mientras que en nuestro estudio otras quince faseolinas (spots 62, 66, 81, 83, 105, 110, 111, 224, 296, 311, 354, 355, 356, 368, 496) fueron identificadas en otras zonas del gel, en el rango de Mr desde 51,1 hasta 17,7 kDa y en el de pI desde 6,5 a 4.6. Se sabe que cambios sustanciales en la estructura molecular de la faseolina no son detectables antes de los 7-10 días siguientes a la germinación de la semilla cuando la faseolina se degrada por la acción de enzimas proteolíticas dando lugar a fragmentos de 27-23 kDa (Boylan y Sussex, 1987). Por el contrario, nuestro estudio sugiere que existe una degradación parcial de la faseolina, anterior a la germinación de la semilla. En el caso del inhibidor de α-amilasa que se considera como una forma modificada de la faseolina. Esta se sintetiza a partir de un polipéptido precursor de aproximadamente 40 kDa y posteriormente se glicosila. Posteriormente mediante un proceso proteolítico se generan varios polipéptidos de Mr en el rango de 15 a 18 kDa (Ceriotti et al., 1989; Nasi et al., 2009). En nuestro estudio se han identificado spots como inhibidor de α-amilasa en el rango entre 27,2 y 15,1 kDa, lo que se podría corresponder a fragmentos de polipéptidos derivados de la proteolisis del polipéptido precursor. En general, la elevada reproducibilidad de los spots en las repeticiones y protocolos de extracción, junto con el hecho de que el método del fenol minimiza la proteolisis durante la extracción, hace que esta fragmentación in vitro sea poco probable. Las proteínas identificadas por MS fueron clasificadas en diferentes grupos que se corresponden a su supuesta función biológica: proteínas de almacenamiento, metabolismo de los carbohidratos, defensa, respuesta al estrés, desintoxicación, crecimiento y desarrollo, proteínas de transporte y metabolismo del nitrógeno. La mayoría de las proteínas identificadas correspondían a proteínas de almacenamiento (37,5%), metabolismo de hidratos de carbono (22,5%), defensa (17,5%) y respuesta al estrés (10,0%). Sin embargo, con cada método de extracción obtuvimos un perfil RESULTADOS Y DISCUSIÓN 56 diferenciado de la semilla de judía. El protocolo TCA-acetona y Clean-Up extrajeron la mayor cantidad de proteínas de reserva y defensa mientras que el método del fenol extrajo una mayor cantidad de proteínas relacionadas con el metabolismo de los carbohidratos. También se detectaron diferencias notables entre los protocolos cuando las proteínas se clasificaron en glicosiladas (faseolinas y lectinas) y no-glicosiladas. Así, la proporción de proteínas glicosiladas / no glicosiladas, para cada método de extracción fue de 15/3, 1/8 y 13/1 para TCA–acetona, fenol y Clean-Up, respectivamente. Se deduce que TCA-acetona y Clean-Up proporcionaron extractos de semillas más ricos en glicoproteínas en comparación con fenol (test de Fisher, P < 0.001). Por el contrario, estudios anteriores con tomate y especies de frutas mostraron que el método basado en el fenol extrajo un mayor número de glicoproteínas que los métodos basados en TCA- acetona (Saravanan y Rose, 2004; Zheng et al., 2007). Sin embargo, nuestros resultados deben ser interpretados con cautela porque los valores experimentales de pI y Mr fueron generalmente más bajos para proteínas glicosiladas que para las no glicosiladas (test U de Mann-Whitney, P < 0,05 y P < 0,001 para el pI y Mr, respectivamente) y las observaciones antes mencionadas sugieren que el método de fenol fue menos eficiente para extraer las proteínas ácidas de bajo peso molecular. Por lo tanto, diferencias en pI y la Mr entre proteínas glicosiladas y no glicosiladas pueden ser subyacentes a los patrones de extracción, es decir dependiente de los protocolos. Además, muchas glicoproteínas identificadas (64%) eran en realidad productos de degradación de la faseolina con niveles desconocidos de glicosilación. En este sentido, se conoce que la faseolina tiene tres cadenas distintas de oligosacáridos unidos con enlaces nglucosídicos a los residuos de asparagina y dos lugares de glicosilación en la posición 252 y uno en la posición 341 (la numeración empieza con la metionina N-terminal del péptido señal) (Sturm et al., 1987). Sin embargo, análisis con MS/MS revelaron que la mayoría (64,3%) de los fragmentos de faseolina (spots 105, 224, 296, 311, 354, 355, 356, 368, y 496) identificados en nuestro estudio se corresponden con la secuencia C- terminal (posiciones desde 257 hasta 421) que no contiene dos posiciones canónicas de glicosilación. Por tanto, los patrones de extracción diferencial de las glicoproteínas de semillas de judía detectados entre los protocolos podrían ser más aparentes que reales. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 57 3.1.2. Artículo original: 2-DE-based proteomic analysis of common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds RESULTADOS Y DISCUSIÓN 64 Figure 10. 2-DE phaseolin profiles of cultivars ICA Pijao (left) and Calima (centre) and both cultivars pooled (right). 1-DE phaseolin profiles of these two cultivars are also shown. Gel regions containing phaseolin spots and protein bands are enclosed in rectangles in (a) and enlarged in (b). 2-DE was performed from 50 μg of total protein loaded on 24-cm long IPG strips, pH=4-7, and 15 % (by mass) polyacrylamide gels. Source: De la Fuente et al., 2012. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 65 3.2.2. Descripción de los patrones 2-DE de la faseolina La Figura 11 muestra los patrones de faseolina de alta resolución obtenidos mediante los protocolos de 2-DE optimizados para un total de seis variedades domesticadas de judía común: S (Sanilac) y B (Boyacá), del acervo mesoamericano; y T (Tendergreen), C (Contender), H (Huevo de Huanchaco) y A (Ayacucho), del acervo andino. Los geles de elevada resolución con spots definidos y muy reproducibles, permiten la descripción precisa y detallada de los patrones de faseolina 2-DE. En primer lugar, se puede observar que los patrones de faseolina se organizan como cadenas de spots horizontales que varían en función del pI y de la Mr. Por otro lado existe una disposición vertical de los spots en parejas que se corresponden con isoformas de distinta Mr. Las parejas de isoformas numeraron consecutivamente en función de su pI, desde posiciones más ácidas a las más alcalinas, de acuerdo con su ubicación en el gel máster y después de contrastar todos los spots en los diferentes cultivares con el PDQuest. Los isospots de cada pareja localizados arriba/abajo se denominaron como 1'/1, 2'/2, etc. En segundo lugar, se observa que los patrones de faseolina para los distintos cultivares contienen un número variable de spots intensos (por ejemplo, el spot 20' / 20 en la pareja del cultivar S) y otros más débiles (por ejemplo, el spot 5' / 5 en la pareja del cultivar S). Los spots intensos y débiles en la mayoría de los cultivares se denominaron como major spots y minor spots, respectivamente. Un análisis más detallado de las imágenes revela que el patrón de los major spots exhibe cierto grado de repetición dentro de cada variedad. Por ejemplo, los pares de isospots 7' / 7, 9' / 9, 11' /11 'y 12' / 12, así como las pares 18' / 18, 19' / 19, 21'/ 21 y 23' / 23 parecen ser repeticiones de un patrón principal en el cultivar H. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 66 F igure 11. 2-DE spot patterns of different types of phaseolin (S, T, H, B, C and A). Spots were numbered after matching all spots across c ultivars by PDQuest. Up and down isospots of different Mr and similar pI were denoted with and without apostrophe, respectively. 2-DE w as performed from 50 μg of total protein loaded on 24-cm long IPG strips, pH=4.7-5.9, and 10 % (by mass) polyacrylamide gels. Source: D e la Fuente et al., 2012. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 67 En general, los perfiles 2-DE de faseolina observados en nuestro estudio exhiben grandes diferencias con los de estudios previos (Bollini y Vitale, 1981; Brown et al., 1981a, 1981b; Lioi y Bollini, 1984; Gepts y Bliss, 1986; Gepts et al., 1986; Lioi, 1989). En particular, se ha identificado por primera vez una importante cantidad adicional de minor spots situados esencialmente en las zonas menos básicas de los patrones 2-DE de faseolina. Esta nueva y mayor información sobre los perfiles de faseolina observada en nuestro estudio se puede atribuir a un número diverso de factores: como la mejora en el procedimiento de extracción proteica, el uso de tiras IPG, así como la mayor ampliación del rango de pH (4,7–5,9) en comparación con el usado en trabajos anteriores (pH 5,2– 5,7) (Bollini y Vitale, 1981; Lioi y Bollini, 1984). 3.2.3. Diversidad de los patrones 2-DE de la faseolina La diferenciación de la faseolina entre distintos cultivares de judía se puede detectar y cuantificar mediante la comparación de sus mapas de spots en geles 2-DE de alta resolución. Un estudio preliminar de la diversidad de la faseolina basada en estos patrones 2-DE se realizó a partir de los cultivares S y B (acervo mesoamericano) y C, T, H y A (acervo andino). Se han podido identicar un total de 51 spots diferentes entre estos cultivares, con una un número mayoritario de ellos (35) ocupando la misma posición relativa en el gel máster. El número de major spots, minor spots y spots únicos de faseolina detectados para cada cultivar se muestra en la Tabla 4. Se observa que el número de spots detectado fue elevado dentro de cada cultivar y bastante variable entre los distintos cultivares, oscilando entre 18 spots y 28 spots. El número de spots observado en nuestros patrones de faseolina es muy superior al de 6 spots encontrados en estudios previos (Lioi y Bollini, 1984; Brown et al., 1981b). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 68 Table 4. Number of major, minor and unique 2-DE spots across different phaseolin types. Source: De la Fuente et al., 2012. Phaseolin type Major spots Minor spots Unique spots Percentage of unique spots* S 6 12 0 0 B 6 12 0 0 C 13 11 0 0 T 11 12 1 2 H 16 12 5 10 A 8 10 8 16 *Referred to the total amount of spots detected with PDQuest software Por lo tanto, la información sobre la cantidad de polipéptidos que conforman cada uno de los patrones de faseolina se incrementa sustancialmente. Así el número de major spots en los cultivares osciló entre 6 y 16, mientras que el de minor spots sólo varió de 10 a 12. El porcentaje de spots únicos y específicos de cada cultivar también varió mucho entre cultivares (desde 0 hasta 16%), siendo los cultivares H y A los que muestran los porcentajes más elevados de spots únicos (10 y 16%, respectivamente). El grado de similitud de los patrones de faseolina entre dos cultivares dados se estimó a partir del porcentaje de spots compartidos mediante el coeficiente F: F=2nxy/(nx+ny) donde nx y ny son el número total de spots en los cultivares x e y, respectivamente, y nxy es el número de spots compartidos por x e y (Figura 12a) (Biron et al., 2006). La distancia proteómica (D) entre dos patrones de faseolina se obtuvo a partir de la expressión 1-F (Biron et al., 2006). El estudio de la distancia proteómica entre cultivares se realizó para major spots y minor spots, separadamente. A partir de las distancias proteómicas, se construyó un mapa de las relaciones existentes entre los diferentes patrones de faseolina mediante la técnica del escalado multidimensional no- RESULTADOS Y DISCUSIÓN 69 métrico (MDS, nonmetric multidimensional scaling) (Manly, 1986) (Figura 12b). El análisis MDS se llevó a cabo mediante el programa XLSTAT v. 1.01 (Addinsoft, Andemach, Alemania). El análisis MDS reveló una clara diferenciación de los tipos de faseolina pertenecienes a los acervos mesoamericano y andino para los major spots y los minor spots. Sin embargo, una diferenciación más clara entre los patrones de faseolina de los acervos andino y mesomericano se obtuvo a partir de los major spots. El mapa producido por MDS también mostró que el patrón de la faseolina tipo A era el más diferenciado. Se ha planteado la hipótesis de que la faseolina del tipo C pudiera ser el resultado de una combinación de los tipos T y S, en base a los patrones 1-DE y 2-DE, porque muestra polipéptidos comunes a ambos tipos de faseolina (Brown et al., 1981b). Por este motivo se podría decir que la faseolina C está en una posición intermedia entre el acervo mesoamericano y el andino. Este razonamiento contradice otros estudios posteriores que sitúan el cultivar C dentro del acervo andino (Gepts et al., 1986) basándose en datos del fenotipo de la semilla y de la arquitectura de la planta de esta variedad que presentan características claramente presentes en otras variedades del tipo andino. Los patrones 2-DE analizados en este trabajo sugieren que el patrón de la faseolina C pertenece al acervo andino y está estrechamente relacionado con el tipo T (porcentaje de spots compartidos superior al 80%). Por otra parte, los perfiles de las faseolinas H y A son los que se diferencian en mayor grado del resto, lo que está de acuerdo con estudios iniciales de 2-DE (Gepts y Bliss, 1986). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 70 Figure 12. Percentage of major (upper) and minor (bottom) spots shared between phaseolin cultivars as measured by F-index (a); non-metrical multidimensional scaling (MDS) from proteomic distance (D=1-F) between phaseolin types (b). Source: De la Fuente et al., 2012. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 71 3.2.4. Interpretación molecular de los patrones 2-DE de la faseolina Los patrones 2-DE descritos anteriormente pueden ser interpretados molecularmente teniendo en cuenta la información disponible acerca de la composición de polipéptidos de faseolina y de sus modificaciones co- y post-traduccionales. La presencia y distribución de los dos tipos de polipéptidos (α y β) que componen la faseolina, a lo largo de las filas de spots, se determinó en cultivares S (acervo mesoamericano) y T (acervo andino), por MALDI-TOF y MALDI-TOF / TOF MS. Los 22 spots seleccionados para el análisis por MS se identificaron inequívocamente como polipéptidos α o β a través de PMF, datos espectrales de MS/MS y de sus características distintivas en la secuencia de nucleótidos. Los resultados de las identificaciones se muestran en la Tabla 5. Los datos obtenidos revelaron varias características destacadas de los patrones de faseolina. En primer lugar, cada par de isospots individuales contenían sólo un tipo de polipéptido (α o β) de faseolina. En segundo lugar, se encontró que aquellos pares de isospots con mayor Mr (por ejemplo, el par 22 '/ 22 en el cultivar S) se correspondían con polipéptidos de tipo α, mientras que los pares con menor Mr (por ejemplo, el par 20' / 20 en el cultivar S) eran polipéptidos de tipo β. La mayor Mr en los polipéptidos de tipo α que en los de tipo β es consistente con la conocida divergencia genética entre sus regiones codificadoras. Así en los genes α existen diferentes repeticiones de nucleótidos directas (repetición de 15 pb en el cuarto exón y repetición de 27 pb en el sexto exón) que los hacen ser de un mayor tamaño que los genes β (Slightom et al., 1983, 1985; Anthony et al., 1990; Kami y Gepts, 1994; Kami et al., 1995). La observación de una mayor abundancia de polipéptidos de tipo α en los patrones de faseolina (Figura 11) también está de acuerdo con el hecho de que el número de sustituciones de aminoácidos parece ser mayor en los polipéptidos de tipo α que en polipéptidos de tipo β (Slightom et al., 1983, 1985). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 72 Table 5. Identification of the type of polypeptide (α or β) in 2-DE phaseolin spot patterns (cultivars S and T) by MALDI-TOF and MALDI-TOF/TOF MS*. Source: De la Fuente et al., 2012. Cultivar S Cultivar T No. spot Phaseolin polypeptide identity No. spot Phaseolin polypeptide identity 5’ α 10’ α 5 α 10 α 14’ α 15’ α 14 α 15 α 20’ β 18’ β 20 β 18 β 22’ α 19’ α 22 α 19 α 25’ β 22’ β 25 β 22 β 27’ α 27 α * Averages (±SE) of Mascot scores and percentages of the protein sequence for matched peptides were 833±24 and 60.3±1.6, respectively. La diferencia de masa molecular entre isospots de cada uno de los pares puede ser interpretada por el hecho ya conocido de que los polipéptidos α o β experimentan uno o dos glicosilaciones (Bollini et al., 1983). Con el fin de confirmar este supuesto se procedió a incubar extractos de proteínas de los cultivares estudiados con la enzima PNGasa F. Los datos obtenidos en la Figura 13 revelaron que los extractos de proteínas experimentaban desglicosilación parcial y total con la PNGasa F. Cabe señalar que las glicoproteínas no sólo experimentan cambios en su Mr sino también en su pI, ya que los residuos de asparagina se convierten en ácido aspártico. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 73 a) S H T A b) S H T C Figure 13. 2-DE spot patterns of phaseolin types partially (a) and totally (b) deglycosylated with PNGase F. 2-DE was performed from 50 μg of total protein loaded on 24-cm long IPG strips, pH=4.7-5.9, and 10 % (by mass) polyacrylamide gels. Source: De la Fuente et al., 2012. Se observó que los polipéptidos de la faseolina fueron en efecto sensibles a la digestión parcial y total con la enzima PNGasa F (Figura 13). En primer lugar, los patrones de la faseolina desglicosilada parcialmente (Figura. 13a) mostraron cadenas de spots adicionales de una menor Mr en comparación con los patrones de la faseolina no tratada con la enzima, lo que indica que los polipéptidos de la faseolina contienen glicosilaciones. En segundo lugar, los patrones de la faseolina desglicosilada totalmente (Figura 13b) revelaron la existencia de sólo dos cadenas de spots con diferente Mr, pero de mayor movilidad electroforética en comparación a los patrones de faseolina no RESULTADOS Y DISCUSIÓN 80 Figure 14. Identification of phosphorylated phaseolin isoforms in dry mature bean seeds of cvs. S and T. (a) 2-DE images of gel sections showing reference phaseolin patterns of cvs. S (left) and T (right) obtained from untreated samples of total seed protein. Gels were stained with SYPRO Ruby protein gel stain. (b) Same gels stained with the phosphoprotein-specific fluorescent dye Pro-Q DPS to detect phosphorylated phaseolin polypeptides. Arrows show the signal of fluorescence of the phosphoprotein marker ovalbumin. (c) Dephosphorylated phaseolin patterns after HF-P treatment followed by SYPRO Ruby gel staining. The dashed and closed circles represent missing and newly arisen phaseolin spots after dephosphorylation, respectively, as compared with reference patterns. Source: López Pedrouso et al. 2014a. La comparación de los resultados obtenidos con los tres métodos de desfosforilación reflejó que el método de HF-P proporciona perfiles 2-DE más RESULTADOS Y DISCUSIÓN 81 informativos de la faseolina desfosforilada que los otros métodos (Figura 14c). En la Figura 14c se muestran los patrones 2-DE de la proteína faseolina desfosforilada en los cvs. S y T. Se puede observar que los spots altamente expresados (o major spots) en los patrones de referencia (i.e., los pares de spots 13´/13, 15´/15 y 17'/17 del cv. S y los pares 11'/11, 12'/12 y 14'/14 del cv. T) se disponen en las mismas posiciones en los patrones desfosforilados que en los de referencia, pero con un volumen relativo más bajo. De ello se deduce que los major spots en los patrones de faseolina de referencia contenían una mezcla de polipéptidos fosforilados y no fosforilados. La cantidad relativa de fosfopolipéptidos en cada major spot, se evaluó mediante el programa PDQuest, determinando la diferencia del volumen de un spot dado entre las muestras control y las tratadas con HF-P. La tasa de fosforilación relativa (PR) en cada spot se cuantificó mediante la fórmula: PR =[(X−Y) / X] × 100, donde X y Y indican el volumen de un spot dado en las muestras control y tratadas con HF-P, respectivamente. Los valores medios de PR para los major spots en las distintas réplicas del cv. S oscilaron entre el 49 y el 81% con un valor promedio del 63 ± 1,7%; mientras que para el cv. T, variaron entre el 13 y el 82% y la media fue de 46 ± 3,9%. Además, se observa que los valores de PR para los major spots tienden a aumentar a medida que su pI disminuye. La relación entre los valores de pI y PR para los major spots en los cvs. S y T se muestra gráficamente en la Figura 15. Los valores de pI y PR muestran una relación negativa y estadísticamente significativa mediante el test de correlación no-paramétrica de Spearman en ambos cvs. (cv S: rs = −0.37, P < 0.05, n = 24; cv. T: rs = −0.62, P < 0.01, n = 24). Estos resultados demuestran que las semillas de judía en un estado de dormancia contienen una variedad de isoformas de la faseolina diferencialmente fosforiladas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 82 Figure 15. Plot of relative PR against pI for major isospot pairs of S- and T-phaseolin patterns in dry mature bean seeds. Lines connect mean values of PR-values across replicates for major isospot pairs. Source: López Pedrouso et al. 2014a. La desfosforilación de proteínas debería provocar cambios predecibles en el pI y en la Mr de los spots (Zhu et al 2005; Irar et al 2006). Así, la desfosforilación afecta al pI de las proteínas porque se sustituyen los grupos fosfato cargados negativamente por grupos hidroxilo neutros. Como resultado, la desfosforilación generalmente induce un movimiento de los spots hacia zonas más básicas de los geles 2-DE y múltiples desfosforilaciones pueden causar un aumento significativo del pI. En cuanto a la Mr, la pérdida de grupos fosfato en residuos de fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina se traduce en una disminución de la masa de 80 Da o múltiplos de este valor en el caso de múltiples desfosforilaciones. En consecuencia, nuestras observaciones muesran que algunos de los pares de spots débilmente teñidos o minor spots ubicados en posiciones más ácidas de los patrones de referencia (es decir, spots 3, 5 ', 5 y 7 en el cv S; y spots 1, 3' y 3 en cv. T) llegan a no detectarse después del tratamiento con HF-P (Figura 15c). Estos minor spots ausentes en los patrones desfosforilados probablemente contenían polipéptidos fosforilados de faseolina que cambiaron a posiciones más básicas en los geles después de la desfosforilación. De hecho, se encontraron spots nuevos en los patrones desfosforilados (es decir, un spot en el cv. S y tres spots en el cv. T) que RESULTADOS Y DISCUSIÓN 83 ocupaban más básicas en los geles 2-DE. Por otra parte, se observa que los pares de isospots para el mismo tipo de polipéptido también aparecieron a una Mr más homogénea que en las muestras control debido a la pérdida de los grupos fosfato. 3.2.2. Cambios de fosforilación de la faseolina en semillas en germinación Los posibles cambios temporales en los niveles de fosforilación de la faseolina se estudiaron en los cvs. S y T durante la transición de la semilla desde un estado de dormancia hasta el cuarto día de germinación (Figura 16 a-c). Se observó que los patrones de referencia de la faseolina en geles 2-DE cambiaron notablemente en ambos cvs. durante la transición de la semilla a la fase de germinación (véanse Figura 14a y 16a). En primer lugar, los volúmenes de los spots de la faseolina mostraron claras diferencias entre los dos estados de la semilla. El cambio en el volumen de los major spots desde el estado de dormancia al estado de germinación (cuatro réplicas) se evaluó con el programa PDQuest para un total de 12 major spots en cvs. S y T. El fold change de cada spot se calculó como la relación entre el volumen promedio de un spot dado en las semillas durmientes y en germinación. En total, once de los doce major spots analizados mostraron una disminución significativa de volumen del orden de 1,2 veces o superior (P < 0.01, n = 12, test de rangos de Wilcoxon a una cola). Para la mayoría (82%) de los major spots, los volúmenes decrecieron significativamente de acuerdo con el test de Mann-Whitney (P < 0,05). Estos resultados pueden explicarse por la proteolisis de la faseolina que se produce durante la germinación de la semilla. En segundo lugar, un número sustancial de nuevos minor spots (8 nuevos minor spots en cada variedad) aparecieron en las posiciones más ácidas de los patrones de faseolina de semillas germinadas en comparación con los perfiles de faseolina de semillas durmientes. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 84 Figure 16. Degradation and identification of phosphorylated phaseolin isoforms in germinating bean seeds of cvs. S and T. (a) 2-DE images of gel sections showing reference phaseolin patterns of cvs. S (left) and T (right) from untreated samples of total seed protein. Asterisks indicate spots absent in reference phaseolin patterns of dormant seeds as shown in Figure 3. (b) Phosphorylated phaseolin patterns on 2-DE gels stained with Pro-Q DPS. (c) Dephosphorylated phaseolin patterns on 2-DE gels after HF-P treatment. Arrows show the signal of fluorescence of the phosphoprotein marker ovalbumin. The dashed and closed circles represent missing and newly arisen spots after dephosphorylation, respectively, as compared with reference patterns. Source: López Pedrouso et al. 2014a. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 85 El análisis de los cambios en los niveles de fosforilación de la faseolina en la transición de semilla durmiente a semilla germinada se llevó a cabo utilizando en primer lugar la tinción Pro-Q DPS (Figura 16b). Es destacable que con Pro-Q DPS no se detectó faseolina fosforilada en los patrones 2-DE de semillas en germinación. Sin embargo, no puede descartarse la posibilidad de la existencia de niveles de fosforilación por debajo de la capacidad de detección del Pro-Q DPS. De hecho, los patrones de faseolina S y T en semilla en germinación fueron sensibles a la desfosforilación con HF-P (Figura 16c), lo que demuestra que existen formas fosforiladas de la faseolina en esta fase aunque a niveles más bajos que en semillas no germinadas. De estos resultados se deduce que el tratamiento con HF-P puede ser más eficaz para la detección de pequeñas cantidades de fosfopéptidos en geles 2-DE que el tratamiento con Pro-Q DPS. La Figura 16c también revela la desaparición de un número considerable de minor spots en la zona ácida del patrón de referencia (spots 14 y 13 en cvs. S y T, respectivamente) después de la desfosforilación con HF-P. De ello se deduce que estos spots sólo contenían polipéptidos fosforilados. Además, las imágenes de los geles de las muestras desfosforiladas muestran la aparición de nuevos spots de faseolina en posiciones más alcalinas de los patrones, en comparación con muestras control no tratadas. Los nuevos spots se corresponderían con fosfopolipéptidos que sufrieron una desfosforilación y por tanto una deriva hacia un pI más básico. En general, las observaciones sugieren que los polipéptidos de faseolina están diferencialmente fosforilados y coexisten con formas no fosforiladas en semillas de judía en germinación. Sin embargo, la proporción de isoformas fosforiladas es más baja que en las semillas en fase de dormancia, ya que no se pudieron detectar con la tinción Pro-Q DPS. En consonancia con estas observaciones, los valores de PR de los polipéptidos de faseolina disminuyeron notablemente en las semillas germinadas en comparación con semillas en fase de dormancia. La mayoría de los major spots (11 de los 12 spots de cvs. S y T) experimentaron cambios negativos de PR desde la fase de dormancia hasta la fase de germinación temprana (P < 0.05, n = 12, test de rangos de Wilcoxon a una cola; Figura 17). Es importante destacar que en las semillas en germinación, algunos minor spots alcanzan posiciones más ácidas en el gel, en comparación a los patrones de semilla no germinada, pero con menor peso molecular a pesar del hecho de que contienen polipéptidos altamente fosforilados. Esta RESULTADOS Y DISCUSIÓN 86 observación sugiere que estas isoformas de faseolina altamente fosforiladas son productos de degradación intermedios, resultado de la acción de enzimas proteolíticas. Figure 17 Fold change of the relative PR for major phaseolin isospot pairs (cvs. S and T) in the transition from dormant to germination. Gel position of assigned spots is shown in figure 8. Source: López Pedrouso et al. 2014a. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 87 3.2.3. Identificación de los fosfopolipéptidos de faseolina mediante MS Un total de 24 spots de faseolina de diferente pI y Mr en las semillas en fase de dormancia de los cvs. S y T se selecionaron para su análisis por MALDI-TOF y MALDI-TOF/TOF MS. La mayoría de los spots seleccionados (23 de los 24 spots) fueron identificados inequívocamente (Tabla 6). Los resultados obtenidos muestran que cada par de isospots sólo contiene un único tipo polipéptido, α o β. Los pares de isospots con mayor Mr se corresponden con polipéptidos de tipo α, y los de menor Mr con polipéptidos de tipo β. La diferencia de Mr entre ambos tipos de polipéptidos se debe a que los genes de tipo α contienen una repetición de 15 pb en el cuarto exón y 27 pb en el sexto exón (Slightom et al., 1983, 1985; Kami y Gepts, 1994). Un estudio preliminar de mapeado de fosfopéptidos en la proteína faseolina se llevó a cabo a partir de los datos espectrales obtenidos por MALDI-TOF. Para la detección de posibles fosfopéptidos, se tomó en cuenta la fosforilación como una posible modificación variable en el proceso de búsqueda en la base de datos Swiss-Prot. Como resultado, se detectaron un total de seis diferentes fosfopéptidos en los polipéptidos de tipo α y β de los cvs. S y T (Tabla 6). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 88 Table 6 Phosphorylated peptides of the protein phaseolin in dry mature common bean seeds of cvs. S and T identified by MALDI-TOF a Spot code numbers according to Fig. 1 b Experimental pI values c Type of phaseolin polypeptide d Tryptic peptide experimental masses (expressed in Da) of spots e Theoretical masses (expressed in Da) resulting from the data base search f Phosphopeptide sequence g Position of the phosphopeptide in the polypeptide sequence RESULTADOS Y DISCUSIÓN 89 Cada uno de los fosfopéptidos identificados contenía dos o más sitios posibles de fosforilación. Para algunos spots, se identificaron formas fosforiladas y no fosforiladas del mismo péptido lo que estaría de acuerdo con los análisis de fosforilación basados en 2-DE. Es importante subrayar que el fosfopéptido TDNSLNVLISSIEMKEGALFVPHYYSK, identificado en la posición 257-283 de la secuencia de la subunidad β, contiene el motivo de fosforilación X-T-D-X, un motivo frecuentemente representado en las SSPs (Meyer et al., 2012). Así, estudios previos indican que alrededor del 25% de las proteínas que contenían X-T-D-X en Arabidopsis, colza y soja son SSPs (Meyer et al., 2012). Por tanto, X-T-D-X podría ser un motivo de fosforilación clave durante el crecimiento de la semilla. En general, los estudios disponibles indican que la fosforilación de SSPs puede jugar un papel en la regulación de transición de semillas a un estado de reposo. Sin embargo, sería necesario abordar una caracterización más en profundidad de los fosfopéptidos y lugares de fosforilación de las subunidades α y β de la faseolina recurriendo a estrategias de enriquecimiento de fosfopéptidos en combinación con metodologías de MS de alta resolución. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio, utilizando columnas de dióxido de titanio y cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para la captura específica de fosfopéptidos, no dieron los frutos esperados (resultados no mostrados). En este estudio, por tanto, se presenta la primera evidencia de isoformas de faseolina fosforiladas en semillas de judía común. Más específicamente, se encontró que formas fosforiladas y no fosforiladas de polipéptidos del tipo α y β coexisten en semillas en las fases de germinación y dormancia de las variedades S y T. De este modo, la faseolina se suma a la creciente relación de SSPs fosforiladas que ya habían sido descritas para otras especies de plantas (Schwenke et al., 2000; Agrawal y Thelen, 2006; Irar et al., 2006; Meyer et al., 2012). Estos hallazgos abren nuevas perspectivas para la comprensión de los mecanismos reguladores implicados en la síntesis y la degradación de la principal SSP de la judía común. En definitiva, las observaciones obtenidas en el presente trabajo sugieren que la fosforilación puede jugar un papel regulador importante en la síntesis de la faseolina al nivel de la transcripción, sino tambíen en su posterior degradación actuando a un nivel post-traduccional. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 97 3.4. Evaluación de los perfiles 2-DE de la faseolina como marcadores de diferenciación genética y calidad proteica en la judía común (P. vulgaris L.). 3.4.1. Diversidad de patrones 2-DE de la faseolina Los perfiles 2-DE de faseolina se analizaron para un total de 18 variedades de judía común (P. vulgaris L.) tanto silvestres como cultivadas de los acervos andino y mesoamericano. En la Tabla 7 se muestra la información general más relevante sobre las variedades estudiadas: código de registro, nombre común, tipo de faseolina basado sobre los patrones en 1-DE, raza, estatus, origen, peso y color de la semilla. Los patrones 2-DE de faseolina en las 18 variedades silvestres y cultivadas de judía común se muestran en la Figura 18. Se observa que los perfiles de faseolina difieren significativamente entre las distintas variedades. Así, el número total de spots a lo largo de las variedades varió entre los 10 de Jalisco y los 28 de Huevo de Huanchaco (Figura 18) con un valor medio (± error estándar) de 20,4 ± 1,1. Además, se observa que los patrones de faseolina son manifiestamente menos complejos en el acervo mesoamericano (M) que en el Andino (A), siendo la media de spots para estos acervos de 16,8 ± 1,4 y 23.4 ± 1.0, respectivamente. Cabe destacar que la mayor parte de estas variaciones se debieron a la presencia/ausencia de spots en la primera dimensión (pI). Estas variaciones en el pI de los spots de la faseolina se deben en gran medida a las diferencias existentes en el grado de fosforilación de los polipéptidos del tipo α y β (López-Pedrouso et al., 2014a). López-Pedrouso et al. (2014a) también demostraron que la movilización de la faseolina en las semillas germinadas parece ocurrir precisamente a través de la degradación de isoformas altamente fosforiladas. Por tanto, la diversidad de los patrones observada en el presente estudio sugiere que los mecanismos de regulación responsables de la síntesis y la posterior degradación de faseolina dependiente de la fosforilación podrían ser diferentes para los distintos tipos de faseolina. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 98 Table 7. Information on the Different Cultivated and Wild Bean Accessions Used in This Studya. Source: López Pedrouso et al., 2014b RESULTADOS Y DISCUSIÓN 99 Figure 18. High-resolution 2-DE phaseolin profiles from seeds of 18 cultivated and wild accessions of common bean corresponding to the Mesomerican and Andean gene pools. Position of the spots according to their isoelectric point (pI) and molecular mass (Mr) are shown. Source: López Pedrouso et al., 2014b RESULTADOS Y DISCUSIÓN 100 3.4.2. Distancia Proteómica Una estimación cuantitativa de la diferencias entre los perfiles 2-DE de la faseolina se obtuvo a partir de la matriz de distancias proteómicas calculadas mediante el estadístico D = 1 – F, F = nxy / (nx+ny), donde nxy el el número de spots compartidos; y nx, ny son el número total de spots de la faseolina del tipo x e y, respectivamente. Los valores de D (en porcentaje) entre todos los posibles pares de poblaciones de judía común analizadas se muestran en la Figura 19. Además se empleó el bootstrap como técnica de remuestreo para el cálculo de la estimación de los intervalos de confizanza (95 y 99%) de las medias de distancia proteómica. Se observa que las distancias proteómicas entre variedades son generalmente muy heterogéneas, con valores de D que oscilan entre 0% (tres comparaciones M × M) y el 100% (seis comparaciones M × A), siendo el valor de D promedio de 59,9 ± 2,4%. La mayor parte de esta heterogeneidad se puede atribuir a las diferencias existentes entre acervos. De hecho, la distancia proteómica entre los dos acervos genéticos fue significativamente más alta que las distancias dentro de los acervos (P < 0,01). Dentro de cada acervo, las distancias proteómicas fueron bastante homogéneas con la excepción de las poblaciones mesoamericanas cultivadas (MC). Estas variedades exhibieron de hecho la distancia proteómica media más baja (11,0 ± 4,9), significativamente diferente de las restantes distancias proteómicas promedio (P < 0,01). La menor diversidad observada en este trabajo para los tipos de faseolina de las poblaciones mesoamericanas es congruente con estudios previos basados en los patrones 1-DE (Gepts et al., 1986). En conjunto, la evidencia disponible apoyaría la hipótesis de que un solo suceso de domesticación de la judía pudo haber ocurrido en México, mientras que múltiples sucesos de domesticación tuvieron lugar en los Andes (Gepts et al., 1986). Sin embargo, el fenómeno de la domesticación de la judía común es complejo y sigue siendo un tema actualmente controvertido (Rossi et al., 2009). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 101 Figure 19. Pairwise proteomic distance (D), expressed as a percentage, based on high-resolution 2-DE phaseolin patterns from seeds of 18 cultivated and wild accessions of common bean. Source: López Pedrouso et al., 2014b. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 102 Las relaciones existentes en el conjunto de las poblaciones de judía común estudiadas se analizaron aplicando el método de agruipamiento o cluster UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) a partir de la matriz de las distancias proteómicas (Figura 20) Es importante destacar a la luz de este análisis que las distancias proteómicas basadas sólo en los perfiles 2-DE de faseolina de alta resolución son capaces de separar adecuadamente las poblaciones de judía común en los dos grandes grupos (mesoamericano y andino) a los que pertenecen. Sólo la variedad silvestre Jalisco se separa de estos dos grandes agrupamientos en el dendrograma UPGMA. Además, el dendrograma UPGMA también fue capaz de desentrañar la heterogeneidad existente dentro de los dos grandes acervos y, en particular, la variedad Ayacucho mostró una clara diferenciación del resto de las poblaciones perteneciente al grupo andino. Figure 20. Unweighted pair-group method with arithmetic averaging (UPGMA) dendrogram from the matrix of pairwise proteomic distances ( D ) based on high-resolution 2-DE phaseolin profiles from seeds of 18 cultivated and wild accessions of common bean. Source: López Pedrouso et al., 2014b La representación de las relaciones entre las poblaciones en un espacio bidimensional se obtuvo mediante la técnica de escalado multidimensional no-métrico (MSD, non-metric multidimensional scaling) (Figura 21). RESULTADOS Y DISCUSIÓN 103 Figure 21. Multidimensional scaling (MDS) projection of the proteomic distance (D) between 18 cultivated and wild populations onto two-dimensional space based on high-resolution 2-DE phaseolin patterns. Source: López Pedrouso et al., 2014b. El valor de la función de stress fue 0,074, lo que indica un buen ajuste de las distancias proyectadas en el plano con las distancias originales. El mapa bidimensional obtenido por MDS refleja esencialmente el mismo escenario que el obtenido por el dendrograma UPGMA. Así, la dimensión I revela las grandes diferencias existentes entre los poblaciones de los acervos mesoaméricano y andino mientras que la dimensión II permitió separar claramente las variedades Ayacucho y Jalisco del resto de las poblaciones. Investigaciones anteriores apoyan las grandes distancias proteómicas encontradas en el presente trabajo para las variedades Ayacucho y Jalisco (Tohme et al., 1995; Kwak y Gepts, 2009; Kwak et al., 2009; Rossi et al., 2009; Bitocchi et al., 2012; Desiderio et al., 2013). En primer lugar, es importante señalar que Ayacucho es una “nuña”, un tipo de cultivar limitado actualmente a ciertas zonas de montaña de Perú y RESULTADOS Y DISCUSIÓN 104 Bolivia, que tiene la propiedad particular de reventar como palomitas cuando se exponen al calor. Se considera que las semillas de “nuña” pueden representar antiguas variedades descendientes de las primeras judías andinas domesticadas (Tohme et al., 1995; Kwak y Gepts, 2009). Segundo, Jalisco es una posible variedad silvestre ancestral de P. vulgaris. Estudios recientes usando una variedad de marcadores de ADN nuclear y de cloroplastos sugieren que las formas silvestres de P. vulgaris se originaron en Mesoamérica y el acervo genético andino se originó a través de diferentes eventos de migración del centro de México (Rossi et al., 2009; Bitocchi et al., 2012; Desiderio et al., 2013). También parece que las semillas mesoamericanas fueron domesticadas en la región de Jalisco (Kwak y Gepts, 2009). Además, el análisis de la diversidad genética con marcadores microsatélites en un gran número de variedades silvestres y domesticadas de judía de los acervos mesoamericano y andino han demostrado que la raza Jalisco constituye un grupo separado, junto con la raza Durango, del resto de las poblaciones (Kwak y Gepts, 2009). En consecuencia, el presente estudio demuestra que las distancias proteómicas obtenidas a partir de los patrones 2-DE de faseolina son un marcador fiable de diferenciación genética entre las poblaciones cultivadas y silvestres de judía común. 3.4.3. Distancia Proteómica y calidad de las proteínas de las semillas. La composición en aminoácidos esenciales y no esenciales en proteína total de semilla de judía se analizó a partir de dos réplicas biológicas de cada una de las 18 variedades silvestres y domesticadas de los acervos mesoamericano y andino, mediante la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, high-performance liquid chromatography). En la Figura 22 se proporciona el contenido medio en metionina (mg/g proteína total) para cada una de las variedades estudiadas. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 105 Figure 22. Mean methionine content (mg/g total seed protein) across 18 cultivated and wild populations of common bean. Source: López Pedrouso et al., 2014b. Se observa que el contenido de metionina experimenta notables variaciones entre las distintas variedades pues los valores medios oscilaron entre 4,2 (Contender) hasta 7,4 (Jalisco) mg/g. A pesar de estas importantes diferencias, todas las variedades alcanzaron valores totales de metionina+cisteína inferiores a los niveles de referencia de estos aminoácidos recomendados por la FAO/WHO para la nutrición humana (FAO/WHO/UNU, 2007). Además, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en el contenido de metionina entre el conjunto de las poblaciones pertenecientes a los acervos mesoamericano y andino (test U de Mann-Whitney p = 0,79). Sin embargo, se detectó una débil relación entre la distancia proteómica para pares de poblaciones y su diferencia en el contenido en metionina en la proteína total de la semilla. Concretamente, se detectó una correlación positiva entre ambas variables 4. CONCLUSIONES CONCLUSIONES 115 1. El estudio comparativo de los métodos de extracción de proteína total de semilla de P. vulgaris con fenol, TCA-acetona y el kit Clean-up reveló que el método de extracción con fenol es el más eficiente en base a la capacidad de separación de las proteínas de semilla y el nivel de resolución obtenido en geles bidimensionales (2- DE) así como en el porcentaje de éxito en la identificación proteica posterior mediante espectrometría de masas (MALDI-TOF y MALDI-TOF/TOF). 2. La optimización del método de extracción de proteína total de semilla y de los protocolos de la 2-DE ha permitido obtener patrones bidimensionales de la faseolina de alta resolución para los cvs. Sanilac y Tendergreen (T) de P. vulgaris que mejoran muy notablemente los de estudios previos. El análisis de los patrones 2-DE y la identificación proteica mediante MS (MALDI-TOF y MALDI-TOF/TOF) muestran que la faseolina engloba un conjunto complejo de isoformas de los polipéptidos α y β que varían en su punto isoelectrico (pI) y masa molecular (Mr). Los experimentos de desglicosilación parcial y total con la enzima PNGasa F mostraron que las variaciones en Mr se explican por una glicosilación diferencial de los polipéptidos α y β de la faseolina. 3. La aplicación de la tinción fluorescente específica de fosfoproteínas Pro-Q DPS y la desfosforilación química mediante FH-P en combinación con la 2-DE y la MS permitieron identificar por primera vez isoformas fosforiladas de la faseolina en los estados de dormancia y germinación de la semilla de los cvs. S y T. Isoformas no fosforiladas y diferencialmente fosforiladas de los polipéptidos α y β coexisten en ambos cvs. de P. vulgaris. 4. El análisis de los resultados del estudio de fosforilación/desfosforilación mostró que las isoformas de faseolina con elevados niveles de fosforilación parecen desempeñar un papel clave en la movilización de la proteína dado que experimentan un proceso de degradación preferente durante la germinación de la semilla. Por tanto, este CONCLUSIONES 116 estudio permite asignar por primera vez un papel funcional a las fosforilaciones que experimentan las proteínas de reserva de semilla.. 5. Los perfiles 2-DE de la faseolina de alta resolución son marcadores fiables de diferenciación genética en poblaciones silvestres y cultivadas de los acervos mesoamericano y andino. El análisis de cluster (UPGMA) basado en las distancias proteómicas (D) mostró que los perfiles 2-DE son eficaces en asignar las poblaciones analizadas al acervo que les corresponde, así como, en la identificación de poblaciones outliers distantemente relacionadas con el resto de las poblaciones. 6. Las distancias proteómicas basadas en los perfiles 2-DE de la faseolina suministran información valiosa sobre la calidad de la semilla al identificar poblaciones outliers en el contenido de metionina, un aminoácido esencial deficiente en la semilla de P. vulgaris. Por tanto, los perfiles 2-DE de la faseolina son marcadores potencialmente importantes para acelerar el proceso de selección del germoplasma en futuros programas de mejora genética de la calidad de la semilla en la judía común. 7. Los resultados obtenidos en el presente trabajo demuestran que la aplicación de las metodologías proteómicas son de gran utilidad para avanzar en el conocimiento de las proteínas complejas de reserva en las semillas de las plantas. 5. BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA 119 Agrawal, G.K., Thelen, J.J. (2005). Development of a simplified, economical polyacrylamide gel staining protocol for phosphoproteins. Proteomics 5: 4684– 4688. Agrawal, G.K., Thelen, J.J. (2006). Large-scale identification and quantitative profiling of phosphoproteins expressed during seed filling in oilseed rape. Mol. Cell. Proteomics 5: 2044–2059. Anthony, J.L., Vonder Haar, R.A., Hall, T.C. (1990). Nucleotide sequence of an aphaseolin gene from Phaseolus vulgaris. Nucleic Acids Res. 18: 3396. Arias, J.H., Jaramillo, M., Rengifo, T. (2007). Manual: Buenas Prácticas Agrícolas, en la Producción de Fríjol Voluble, 1-168. Bassano, L.A., Jiang, H., Ogden, L.G., Loria, C., Vupputuri, S., Myers, L., Whelton, P.K. (2001). 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