Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos

Diagnós ico molecula y
epidemiología de en e medades
ele an es de moluscos bi al os
Tesis Doc o al
And ea Ramilo Ál a ez
San iago de Compos ela, 2015
Diagnós ico molecula y
epidemiología de en e medades
ele an es de moluscos bi al os
Memo ia p esen ada po :
And ea Ramilo Ál a ez
pa a op a al í ulo de Doc o a en Biología
Codi ec o es:
El i a Abollo Rod íguez
An onio Villalba Ga cía
San iago de Compos ela, 2015
Dña. El i a Abollo Rod íguez, Doc o a en Biología e In es igado a del Cen o Tecnológico
del Ma (Fundación CETMAR) y D. An onio Villalba Ga cía, Doc o en Biología e
In es igado del Cen o de In es igaciones Ma inas de la Conselle ía de Medio Ru al e do
Ma (Xun a de Galicia), como Di ec o es de la esis i ulada “
“Diagnós ico molecula y
epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os”
Po la p esen e DECLARAMOS:
Que la esis p esen ada po Dña. And ea Ramilo Ál a ez pa a op a al g ado de Doc o a en
Biología po la Uni e sidad de San iago de Compos ela, es idónea pa a se p esen ada, de
acue do con el a ículo 41 del Reglamen o de Es udios de Doc o ado, po la modalidad de
compendio de ARTÍCULOS, en los que la doc o anda u o pa icipación en el peso de la
in es igación y su con ibución ue decisi a pa a lle a a cabo es e abajo. Hallándose
concluida, au o izan su p esen ación a in de que pueda se juzgada po el ibunal
co espondien e.
Los coau o es, an o doc o es como no doc o es, de dichos a ículos conocen la inclusión
de es os a ículos en es a esis doc o al y ninguno de los a ículos eunidos en es a esis
se á p esen ado po ninguno de ellos en o a esis doc o al, lo que i mamos bajo nues a
esponsabilidad.
Y pa a que así cons e, i man la p esen e en Vilano a de A ousa, 22 de sep iemb e de 2015
Fdo.: D a. El i a Abollo Rod íguez Fdo.: D . An onio Villalba Ga cía

D. Ca los Pe ei a Dopazo, Doc o en Biología y P o eso Ti ula del Depa amen o de
Mic obiología y Pa asi ología de la Uni e sidad de San iago de Compos ela,
INFORMA:
Que la p esen e Memo ia i ulada “Diagnós ico molecula y epidemiología de
en e medades ele an es de moluscos bi al os”, p esen ada po Dña. And ea Ramilo
Ál a ez pa a op a al g ado de Doc o a en Biología po la Uni e sidad de San iago de
Compos ela, ha sido ealizada bajo su u ela y que, hallándose concluida, au o iza su
p esen ación a in de que pueda se juzgada po el ibunal co espondien e.
Y pa a que así cons e, i ma la p esen e en San iago de Compos ela, a 22 de sep iemb e de
2015
Fdo.: Ca los Pe ei a Dopazo
La p esen e esis doc o al se ha desa ollado en el
Cen o de In
es igaciones Ma inas (CIMA),
pe enecien e a la Xun a de Galicia y se ha
inanciado a a és de la Conselle ía do Medio
Ru al e do Ma median e los p oyec os PGIDIT-
CIMA08/01, PGIDIT-CIMA09/01 y PGIDIT-CIMA
12/03 y po el Minis e io de Ciencia e Inno ación
con los p oyec os AGL2006-11809, AGL2009-
11607 y AGL2011-30449-C02-01.

ÍNDICE
INTRODUCCIÓN GENERAL……………………………………………………………………………………….. 1
1. P incipales moluscos bi al os p oducidos en Galicia: impo ancia socioeconómica..…..1
2. P incipales p oblemas pa ológicos que a ec an a los cul i os de moluscos bi al os……6
2.1. Bonamiosis 6
2.1.1. Taxonomía ………………………………….…………….…………………………………………...6
2.1.2. Epidemiología ………………………………………………………………..……………….……. 8
2.1.2.1. Dis ibución geog á ica y especies hospedado as ………………………...8
2.1.2.2. In luencia de algunas ca ac e ís icas del hospedado
en la pa asi ación……….……………………………………………………………….9
2.1.2.3. In luencia de ac o es ambien ales en la pa asi ación………………….10
2.1.3. Ciclo de ida y ansmisión………………………..…………………………………………..10
2.1.4. In e acción hospedado -pa ási o ………………………………………………………….12
2.1.5. Es a egias de lucha ……………………………………..………………………………………13
2.2. Pe kinsosis 14
2.2.1. Taxonomía ……..………………………………………...………………………………………….14
2.2.2. Epidemiología ………………………………………………….…………………………….…….15
2.2.2.1. Dis ibución geog á ica y especies hospedado as ………………...…….15
2.2.2.2. In luencia de algunas ca ac e ís icas del hospedado
en la pa asi ación…………….………………………………………………………..16
2.2.2.3. In luencia de ac o es ambien ales en la pa asi ación………………….16
2.2.3. Ciclo de ida y ansmisión………………..………………………………………………… 17
2.2.4. In e acción hospedado -pa ási o ………………………………………………………….19
2.2.5. Es a egias de lucha ………………………………..……………………………………………22
2.3. Ma eiliosis 23
2.3.1. Taxonomía ……..………………………………………...……………………………………….…23
2.3.2. Epidemiología ………………………………………………….…………………………….….…25
2.3.2.1. Dis ibución geog á ica y especies hospedado as …………………...….25
2.3.2.2. In luencia de algunas ca ac e ís icas del hospedado
en la pa asi ación……………………………………………………………………...26
2.3.2.3. In luencia de ac o es ambien ales en la pa asi ación………………….26
2.3.3. Ciclo de ida y ansmisión………………………………..…………………………………..27
2.3.4. In e acción hospedado -pa ási o ………………………………………………………….29
2.3.5. Es a egias de lucha ………………………………..……………………………………………30
2.4. Mik ocy os 31
2.4.1. Taxonomía ……..………………………………………...………………………………………….31
2.4.2. Epidemiología …………………………………………………….………………………….…….33
2.4.2.1. Dis ibución geog á ica y especies hospedado as ……………………....33
2.4.2.2. In luencia de algunas ca ac e ís icas del hospedado
y de ac o es ambien ales en la pa asi ación……...……………………….33
2.4.3. Ciclo de ida y ansmisión…………………………..………………………………………34
2.4.4. In e acción hospedado -pa ási o ………………………………………………………….35
3. P incipales écnicas diagnós icas de pa ási os de moluscos………………………………..……36
3.1. Técnicas molecula es 38
3.1.1. Reacción en cadena de la polime asa (PCR)….……………………………………..…39
3.1.2. PCR-RFLPs (Polimo ismos de longi ud de agmen os de es icción)……40
3.1.3. PCR Mul iplex…………………..…………………………………………………………………..40
3.1.4. PCR en iempo eal……………………...………………………………………………………..41
3.1.5. PCR-DGGE (Elec o o esis en Gel con G adien e Desna u alizan e)..…….….42
3.1.6. Hib idación in si u (ISH)………………….………………………………………………….…43
3.1.7. Secuenciación masi a…………………...………………………………………………………44
3.2. Mé odos molecula es pa a el diagnós ico de Bonamia, Pe kinsus, Ma eilia y
Mik ocy os 45
3.2.1. Géne o Bonamia………………………………...…..………………………………………..……45
3.2.2. Géne o Pe kinsus…………………...……………………………………………………………..46
3.2.3. Géne o Ma eilia……………………………………………………………………………….…..48
3.2.4. Géne o Mik ocy os……………………...…………………………………………………………50
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS………………….…………………………………….………………………...55
SECCIÓN I: BONAMIOSIS
 Species-speci ic diagnos ic assays o Bonamia os eae and B. exi iosa
in Eu opean la oys e Os ea edulis: con en ional, eal- ime and PCR
mul iplex…………………………………………………………………………………………………………59
 Species-speci ic oligonucleo ide p obe o de ec ion o Bonamia exi iosa
(Haplospo idia) using in si u hyb idiza ion assay……………………………………..…….…73
 Oys e pa asi es Bonamia os eae and B. exi iosa co-occu in Galicia
(NW Spain): spa ial dis ibu ion and in ec ions dynamics…………………………………85
SECCIÓN II: PERKINSOSIS
 Upda e o in o ma ion on pe kinsosis in NW Medi e anean coas :
Iden i ica ion o he Pe kinsus spp. (P o is a) in new loca ions and hos ……….…….99
 Pe kinsus olseni and Pe kinsus chesapeaki de ec ed in a su ey o
pe kinsosis o a ious clam species in Galicia (NW Spain) using PCR-DGGE
as a sc eening ool……………………………………………………………………………………….105
SECCIÓN III: ENFERMEDADES EMERGENTES
 Cockle Ce as ode ma edule ishe y collapse in he Ría de A ousa
(Galicia, NW Spain) associa ed wi h he p o is an pa asi e Ma eilia
cochillia…………………………………………………………………………………………………….…...135
 In ec ion o Manila clams Rudi apes philippina um om Galicia
(NW Spain) wi h a Mik ocy os-like pa asi e…………….……………………………………….161
DISCUSIÓN GENERAL………………………………….………………………………………………………...173
CONCLUSIONES…………………………..………………………………………………………………………...181
BIBLIOGRAFÍA….…………………………………………………………………..……………………………...185
ABREVIATURAS.…………………………………………………………………………………………………...231
ANEXO I: Ce i icado-Tí ulo de pa en e de in ención. P ocedimien o pa a de ec a e
iden i ica B. os eae y B. exi iosa en un único ensayo de eacción en cadena de la
polime asa……………………………………………………………………………………………………………......235
ANEXO II: Lis ado de publicaciones incluidas y elacionadas con la esis doc o al…........261
I
IN
NT
TR
RO
OD
DU
UC
CC
CI
IÓ
ÓN
N
G
GE
EN
NE
ER
RA
AL
L

In oducción gene al
1
INTRODUCCIÓN GENERAL
1. P incipales moluscos bi al os p oducidos en Galicia:
impo ancia socioeconómica
Los moluscos cons i uyen una pa e impo an e de la acuicul u a mundial (23%),
aumen ando su olumen p og esi amen e, pasando de 6,3 millones de oneladas
desemba cadas en 1991 a los 15,2 millones de oneladas en el año 2012. Asimismo, las
cap u as mundiales de moluscos p o enien es de la pesque ía alcanza on en ese año los
6,9 millones de oneladas (FAO, 2015). En el conjun o de la Unión Eu opea, España es el
p ime p oduc o , siendo Galicia la egión más p oduc i a del país con ce ca del 96% de la
p oducción o al nacional (h p://www.mag ama.gob.es).
La cos a gallega cuen a con un o al de 278 a enales y 70 millones de me os
cuad ados de zona in e ma eal, que jun o a las ca ac e ís icas geog á icas y bio ípicas de
las ías, lo con ie en en una egión óp ima pa a el c ecimien o de moluscos bi al os
(Mahou, 2008). Es as condiciones han a o ecido el desa ollo de una po en e ac i idad en
o no al ma isqueo, de inido legalmen e como una modalidad especí ica de pesca, que
ocupa a unas 8.500 pe sonas, po lo que se conside a una ac i idad socioeconómica de
p ime o den (h p://www.pescadegalicia.com). Su ace a más sencilla y a esanal iene
como obje o la cap u a de moluscos en la cos a a enosa y se hace a pie sin u iliza
emba cación, lo que se denomina ma isqueo a pie, p opo cionando abajo a casi 4.000
pe sonas, en su mayo ía muje es. El ma isqueo a lo e iene luga en la zona subli o al y se
ealiza empleando una emba cación pequeña y a es especí icas, como a as, as os o
años. Es á ac i idad la desa ollan casi exclusi amen e homb es. La mayo ía de las
especies ex aídas son moluscos bi al os, aunque ambién se incluyen den o de es a
ac i idad moluscos gas e ópodos, equinode mos y c us áceos. En el año 2014, el alo
económico de los bi al os desca gados en las lonjas gallegas supe ó los 53 millones de
eu os, co espondien es a las ce ca de 6.000 de p oducción subas ada
(h p://www.pescadegalicia.com). El núme o de especies ma isque as con in e és
come cial en Galicia es ele ado (21 especies di e en es), sin emba go, las que des acan po
su p oducción e impo ancia económica son la almeja japonesa Rudi apes philippina um, el
be be echo Ce as ode ma edule, la almeja ina Rudi apes decussa us y la almeja babosa
Vene upis co uga a (Figu as 1 y 2) (h p://www.pescadegalicia.com).
La almeja japonesa es una especie o ánea p oceden e de las cos as asiá icas e
in oducida en la cos a pací ica de No eamé ica de o ma acciden al, con semilla de la
os a japonesa C assos ea gigas. R. philippina um ambién ue impo ada a Eu opa pa a
palia los e ec os de la sob eexplo ación de las especies de almeja au óc onas,
p incipalmen e de la almeja ina. Su buena adap ación al medio y su ápido c ecimien o
(Pé ez Camacho y Cuña, 1985) la han con e ido en el molusco más cul i ado del mundo,
alcanzando 3,8 millones de oneladas en el año 2012 con un alo come cial de 3.300
millones de eu os (FAO, 2015).
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
2
Figu a 1. P oducción de moluscos bi al os en Galicia co espondien e a pesque ía en el año 2014.
P oducción ( oneladas)
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
Almeja
japonesa
Be be echoAlmeja
babosa
Almeja
ina
Almeja
ubia
Na aja Volandei a Viei a Ca nei o Os a
plana
O os
En Galicia, más de la mi ad de almeja japonesa se ob iene del ma isqueo y el es o
p o iene de su cul i o, median e la in oducción de almejas de o os países eu opeos,
p incipalmen e de I alia y en meno medida de F ancia, así como de semilla p oducida en
c iade os, pos e io men e engo dada en pa ques de cul i o. En e el ma isqueo y el
cul i o, en el año 2014 se ecogie on más de 2.955 de almeja japonesa con un alo
come cial de ap oximadamen e 19 millones de eu os (h p://www.pescadegalicia.com).
La dis ibución geog á ica de la almeja ina R. decussa us aba ca el Medi e áneo, desde el
es echo de Gib al a al canal de Suez, el ma Rojo y la cos a o ien al a lán ica, desde
No uega has a Senegal (Na as, 2008). La almeja babosa ambién se dis ibuye en países
medi e áneos y desde No uega has a Ma uecos, incluyendo el ma Bál ico (Ce iño,
2011). La p oducción mundial de ambas especies dis a mucho de la p oducción de almeja
japonesa pues, según las es adís icas de la FAO, sólo se p oducen 4.000 de almeja ina y
275 de almeja babosa (FAO, 2015); pa ece cla o que la in o mación ecogida en las bases
de da os de la FAO no es exac a pues las en as de almeja babosa en las lonjas gallegas
supe an ampliamen e la p oducción mundial de es a especie según la FAO. En cualquie
caso, el ele ado alo de las almejas ina y babosa en el me cado sigue haciendo en able
su cap u a. Así, en el año 2014 en Galicia se cap u a on po ma isqueo (la uen e p incipal
de es as especies) 657 de almeja ina y 1.009 de almeja babosa, cuyo alo en el
me cado ue de 20,58 €/Kg y 13,30 €/Kg, espec i amen e, en e a los 6,43 €/kg de
almeja japonesa. Po an o, las almejas ina y babosa apo an al sec o ma iscado más
ing esos que R. philippina um (Figu a 2). Sin emba go en el ámbi o de la acuicul u a, la
p oducción e ing esos co espondien es a la almeja japonesa supe an a los de las almejas
ina y babosa (Figu as 3 y 4) (h p://www.pescadegalicia.com).
In oducción gene al
3
El be be echo C. edule se dis ibuye a lo la go de la cos a a lán ica eu opea y
a icana desde el Ma de Ba en s, al No e de No uega, has a Ma uecos. Los p incipales
p oduc o es de es a especie, que alcanza las 7.000 pescadas y las 1.800 en acuicul u a,
son Reino Unido y Países Bajos (FAO, 2015). En Galicia, el be be echo adicionalmen e ha
sido la especie más impo an e pa a el ma isqueo en é minos de biomasa. En el año 2011
se cap u a on 3.314 de be be echos con un alo en el me cado de 16 millones de eu os.
Sin emba go, a pa i del año 2012 la can idad de be be echo descendió d ás icamen e a la
mi ad, debido a la en e medad de la ma eiliosis que p o ocó la mue e de más del 90% de
ejempla es en la Ría de A ousa, una de las zonas más p oduc i as de Galicia pa a es a
especie. Según los da os apo ados po la Xun a de Galicia pa a el año 2014, sólo se
cap u a on 1.200 de be be echo con un alo come cial de 7,8 millones de eu os. Exis e
ambién un eclu amien o na u al de semilla de be be echo pa a aslada la a zonas con
meno densidad ( epa queo). Sin emba go, la p oducción de es os moluscos median e
cul i o de semilla supone un po cen aje mínimo con espec o a las cap u as po ma isqueo
(h p://www.pescadegalicia.com).
A pesa de que la p oducción de moluscos de bancos na u ales iene g an
impo ancia, la g an demanda de bi al os es á p o ocando que algunas poblaciones
na u ales ya se encuen en al lími e de su sos enibilidad o que és e ya se haya
sob epasado. Po ese mo i o, la acuicul u a se p esen a como una opción imp escindible
pa a a ende la ac ual demanda de es os p oduc os. En Galicia el cul i o del mejillón
My ilus gallop o incialis es cla amen e mayo i a io, seguido de la almeja japonesa, la os a
plana Os ea edulis, el be be echo, y la os a izada C. gigas (Figu a 3).
La acuicul u a gallega del mejillón con ie e a España en el p incipal país
p oduc o de la Unión Eu opea y el segundo a ni el mundial, después de China, con
Figu a 2. Valo económico de moluscos bi al os de Galicia co espondien es a pesque ía en el año
2014.
Millones de €
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Almeja
japonesa
Be be echoAlmeja
babosa
Almeja
ina
Almeja
ubia
Na aja O os
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
10
2.1.2.3. In luencia de ac o es ambien ales en la pa asi ación
La in ección po B. os eae y B. exi iosa se p oduce a lo la go de odo el año, aunque
se han desc i o pa ones es acionales de p e alencia pa a cada una de ellas en á eas
conc e as. En el caso de B. os eae, los alo es de p e alencia mayo es se dan en p ima e a
y o oño (G izel, 1985; Mon es, 1990; Van Banning, 1991, Cullo y y Mulcahy, 1996; da Sil a
e al., 2005; Engelsma e al., 2010). En cuan o a B. exi iosa, se encon a on picos de
p e alencia en e ene o y ab il en O. chilensis (Hine, 1991b); una e iden e es acionalidad
con p e alencias más al as en e mayo y julio en C. a iakensis de EE. UU. (Ca negie e al.,
2008) y alo es de p e alencia más al os en e ma zo y mayo pa a O. puelchana de
A gen ina (K oeck e al., 2008). Toda ía no se ha es udiado la dinámica empo al de B.
exi iosa en O. edulis ni en O. s en ina, po lo que no es á cla o si hay es acionalidad. Algunos
es udios indican que las empe a u as al as a o ecen el desa ollo de la en e medad
mien as que las bajas alen izan su ansmisión (Audema d e al., 2008; Ca negie e al.,
2008). La salinidad ambién in luye en la dinámica de Bonamia, encon ándose alo es
más al os de p e alencia cuando la salinidad es mayo de 30 g/l (Bishop e al., 2006;
Audema d e al., 2008; Ca negie e al., 2008; A zul e al., 2009).
2.1.3. Ciclo de ida y ansmisión
Los es adios del ciclo de ida de B. os eae y B. exi iosa que se obse an
habi ualmen e en las os as son células uni o binucleadas denominadas mic océlulas y,
menos ecuen emen e, es adios plasmodiales. Las mic océlulas uninucleadas ienen un
diáme o de 1 a 2,5 µm y p esen an un núcleo pe i é ico en el caso de B. os eae (Figu a 6)
mien as que en B. exi iosa el diáme o es de 2 a 5 µm con un núcleo cen al o subcen al
(Abollo e al., 2008) (Figu a 7).
Figu a 6. Co e his ológico de
Os ea edulis con nume osas
células de Bonamia os eae
( lechas)
en las que se
obse a la posición pe i é ica
de su núcleo.

In oducción gene al
11
El papel que juega cada es adio en el ciclo de ida de Bonamia no es á oda ía
cla o. Las o mas uninucleadas de B. os eae y B. exi iosa se obse an al mic oscopio
elec ónico como o mas densas a los elec ones, con un núcleo pequeño y condensado, o
bien como o mas cla as. Algunos es udios sugie en que las o mas densas cons i uyen el
es adio in ec i o, mien as que las cla as apa ece ían en in ecciones le es (Picho e al.,
1980; Hine, 1991a). Sin emba go, es a hipó esis no se ha con i mado. Las o mas
binucleadas ep esen an mic océlulas en di isión celula , mien as que la unción de los
plasmodios mul inucleados ambién es desconocida, aunque algunos au o es sugie en que
es a ase co esponde a la explosión p oli e a i a del pa ási o que conduce a la mue e del
hospedado (B ehélin e al., 1982). Se ha cons a ado la ansmisión expe imen al de B.
os eae po cohabi ación de os as no in ec adas con os as in ec adas y po inoculación
del pa ási o a os as no in ec adas (Els on e al., 1987; Mialhe e al., 1988; He io e al.,
1995; Cullo y e al., 1999), lo que e idencia la posibilidad de ansmisión di ec a del
pa ási o de os as en e mas a os as sanas en el medio na u al. Se c ee que B. exi iosa se
ansmi e del mismo modo en bancos de os a (Hine, 1996; C an ield e al., 2005; Co beil
e al., 2006a), habiéndose comp obado su ansmisión de os as C. a iakensis in ec adas a
os as no in ec adas, median e expe imen os de cohabi ación (Audema d e al., 2014) en el
medio na u al. El pa ási o se in oduce en la os a a a és del agua il ada (Bucke, 1988;
Mon es e al., 1994), pasando al epi elio b anquial donde es agoci ado po los hemoci os
(Mon es e al., 1994). Den o de es as células, el pa ási o se mul iplica po isión bina ia y
llega a p o oca la up u a del hemoci o, de o ma que los pa ási os libe ados pueden se
agoci ados po nue os hemoci os. Los pa ási os, bien lib es bien en el in e io de los
hemoci os, abandonan el hospedado a a és de las heces o po diapédesis de los
hemoci os in ec ados (Abollo y Villalba, 2011). Asimismo, A zul e al. (2011) de ec a on B.
os eae y B. exi iosa en la as, lo que sugie e una hipo é ica “ ansmisión e ical” sui
gene is du an e el pe íodo de incubación la a ia. Las la as in ec adas, du an e su ase
planc ónica, pod ían con ibui ambién a la dispe sión del pa ási o.
Figu a 7. Co e his ológico de
Os ea edulis con nume osas
células de Bonamia exi iosa
( lechas)
en las que se
obse a la posición cen al de
su núcleo.
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
12
A pesa de que odo apun a a la ansmisión di ec a de B. os eae y B. exi iosa, de
os a a os a, no se puede desca a que haya ases no conocidas en su ciclo de ida, pues
se han iden i icado o os hospedado es posibles (Lynch e al., 2007; Ha ikainen e al.,
2014a) y, además, el hallazgo de una especie del géne o Bonamia que p oduce espo as (B.
pe spo a), pe mi e hipo e iza la exis encia de ase espo al en el ciclo de las o as especies
del géne o aunque no se hayan encon ado. Se han ealizado nume osos es udios de
ansmisión con el obje i o de de e mina si o os moluscos, como My ilus edulis, M.
gallop o incialis, R. decussa us, R. philippina um o C. edule, juegan algún papel en el ciclo
del pa ási o (Van Banning, 1987; Figue as y Robledo, 1994; Renaul e al., 1995; Cullo y e
al., 1999). Sin emba go, es os moluscos no se in ec a on expe imen almen e. En el caso de
la os a japonesa C. gigas, se han encon ado indicios de que puede ac ua como ese o io
an o de B. exi iosa como de B. os eae (Lynch e al., 2010).
2.1.4. In e acción hospedado -pa ási o
La apa ición de B. os eae en Eu opa a inales de los años 70 p o ocó mo alidades
muy al as en las poblaciones y cul i os de os a plana en di e en es países eu opeos
(Picho e al., 1980; Polanco e al., 1984; Hudson y Hill, 1991; an Banning, 1991; Cullo y y
Mulcahy, 2001). Po es e mo i o, la p oducción de O. edulis en el con inen e descendió
d ás icamen e de 29.595 en el año 1961 a 5.921 en el año 2000 (FAO, 2004). B. exi iosa
ambién causó mo alidades masi as en poblaciones de O. chilensis en Nue a Zelanda. En
1985 se con i mó un b o e epidémico con mo alidades ele adas de os a que du a on
has a 1995, p o ocando incluso el cie e de la pesque ía (Doonan e al., 1994; C an ield e
al., 2005). Un segundo b o e epidémico se p odujo en e los años 2000-2006 con
mo alidades que alcanza on el 72% de la población (Anonymous, 2006).
En Galicia, se ha desc i o que B. os eae a ec a al c ecimien o e índice de condición
de las os as (Mon es y Meléndez, 1987; Mon es e al., 1991). Los signos mac oscópicos de
la in ección p oducida po Bonamia son hendidu as en el bo de de las láminas
b anquiales, pe o aciones b anquiales y, en algunas ocasiones, decolo ación ama illa y
lesiones en el ejido conjun i o de b anquias, man o y glándula diges i a (Dinamani e al.,
1987; Tigé e al., 1980; G izel e al., 1988; Mc A dle e al., 1991). Es as lesiones son
p oducidas po una eacción in lama o ia muy in ensa, con in il ación hemoci a ia del
ejido conjun i o e incluso epi elios de los ó ganos a ec ados, que llega a causa la pé dida
de la a qui ec u a no mal de es os ó ganos y la oclusión del sis ema ci cula o io (Figu a
8).
Se ha obse ado que B. os eae apa ece más ecuen emen e y se mul iplica más
e icien emen e den o de los hialinoci os que de los g anuloci os ( ipos hemoci a ios), ya
que aquéllos ca ecen de lisosomas (Cochennec-Lau eau e al., 2003b; da Sil a e al., 2008).
Va ios es udios han mos ado que el pa ási o es capaz de modula la espues a inmune del
hospedado pa a aumen a el núme o de hemoci os más suscep ibles y disminui la
p oducción de adicales óxicos de oxígeno (ROS), que poseen ac i idad an imic obiana
(Mo ga e al., 2009; Comesaña e al., 2012), modi ica los ni eles de de e minadas
ac i idades enzimá icas de la hemolin a (Xue y Renaul , 2000; da Sil a e al., 2008; Mo ga
e al., 2009) y de o as p o eínas (Cao e al., 2009; De la Ballina e al., 2013).
In oducción gene al
13
Recien emen e, es udios genómicos han desc i o una exp esión di e encial de genes
implicados en di e en es p ocesos biológicos en e os as in ec adas y sanas (Ma ín-
Gómez e al., 2012, 2014a; Mo ga e al., 2011a, b, 2012). Ma ín-Gómez e al. (2014b)
desc ibie on 19 mic oARNs (ARN con capacidad de egula la exp esión de o os genes),
especí icos de os as in ec adas con Bonamia; ambién el empleo de mic oa ays ha
mos ado genes implicados en la espues a inmune en e a Bonamia (Pa do e al., 2013).
2.1.5. Es a egias de lucha
Según el Manual Diagnós ico pa a Animales Acuá icos publicado po la OIE (2012a,
b), los mecanismos de p e ención y con ol de la bonamiosis se basan en la selección
gené ica de es i pes de os a esis en es a la en e medad y en p ác icas gene ales de
manejo del cul i o. Las medidas e apéu icas como la acunación, inmuno-es imulación o
a amien os químicos no se aplican en acuicul u a de moluscos bi al os que se
desa ollan en el medio na u al. Cuando la en e medad se ha es ablecido en una zona
de e minada, se deben implemen a medidas encaminadas a disminui la incidencia y la
g a edad de la en e medad, como modi icaciones en la ges ión de las pesque ías o en los
p ocedimien os de cul i o. Sabiendo que la mo alidad máxima de las os as en zonas con
Bonamia se alcanza en el úl imo e ano de engo de, poco an es de que alcancen el amaño
come cial, Mon es e al. (2003) p opusie on modi icaciones en el p ocedimien o del
cul i o, a ando de acele a el i mo de c ecimien o de las os as. La p oducción de
es i pes esis en es a la bonamiosis es o a de las medidas lle adas a cabo pa a mi iga los
daños p oducidos po la en e medad. En I landa, un p og ama desa ollado po una
emp esa desde los años 80 del siglo pasado ha conseguido aumen a la supe i encia de
las os as en p esencia de la en e medad de o ma signi ica i a y sa is ac o ia (Cullo y e
al., 2001, 2004; Lynch e al., 2014), mien as que en F ancia (Ma in e al., 1993; Baud e
al., 1997; Naci i-G a en e al., 1998, 1999; Lallias e al., 2008) y en España, conc e amen e
en Galicia (da Sil a e al., 2005; Villalba e al., 2007), se han desa ollado p og amas
expe imen ales con esul ados p ome edo es.
Figu a 8.
Co e his ológico de
Os ea edulis en el que se obse a
la eacción in lama o ia p oducida
en e Bonamia os eae
en las
b anquias de la os a.
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
14
2
2.
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2.
.
P
Pe
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2.2.1. Taxonomía
La posición axonómica del géne o Pe kinsus es con o e ida desde su
descub imien o. La p ime a especie desc i a, P. ma inus, se conside ó inicialmen e un
hongo que se denominó De mocys idium ma inum (Mackin e al., 1950). Pos e io men e,
es udios mo ológicos y es uc u ales incluye on a P. ma inus en di e en es ilos como
Ascomice es, En omo o ales, Sap olegniales, Haplospo idia y inalmen e Labe in úlidos
(Mackin, 1951; Sp ague, 1954; Mackin y Boswell, 1956; Mackin, 1962; Mackin y Ray,
1966). T as es as clasi icaciones, Le ine (1978) c eó el géne o Pe kinsus y lo incluyó en el
ilo Apicomplexa, basándose en la ul aes uc u a de la zoospo a de es e pa ási o (Pe kins,
1976a). Sin emba go, ya en los años 90 los análisis molecula es basados en la egión del
ADN que codi ica la subunidad pequeña ibosómica y en el gen de la ac ina sugi ie on que
el géne o Pe kinsus es aba más p óximo a los dino lagelados que a los Apicomplexa (Fong
e al., 1993; Goggin y Ba ke , 1993; Siddal e al., 1997). Ca alie -Smi h y Chao (2004)
incluyen el géne o Pe kinsus en el ilo Myzozoa, como un linaje muy p óximo
e olu i amen e a los dino lagelados, y lo clasi ican den o del o den Pe kinsida, clase
Pe kinsea. La ecien e ca ac e ización de genes codi ican es de di e sas p o eínas y el
es udio de genes implicados en el ciclo celula , apoyan la hipó esis de que es e géne o
cons i uye un clado p óximo al linaje de los dino lagelados (Salda iaga e al., 2003; Zhang
e al., 2011; Bach a o e al., 2011, 2014). Adl e al. (2012), en una nue a e isión de los
P o is as, p oponen la posición axonómica siguien e: Euka ya: Al eola a: P o oal eola a:
Pe kinsidae.
A pesa de que se han desc i o 10 especies de Pe kinsus, ac ualmen e solo 7 se
conside an álidas: P. ma inus (Mackin e al., 1950), P. olseni (= P. a lan icus) (Les e y
Da is, 1981), P. qugwadi (Blackbou n e al., 1998), P. chesapeaki (=P. and ewsi)
(McLaughlin e al., 2000), P. medi e aneus (Casas e al., 2004), P. honshuensis (Dungan y
Reece, 2006) y P. beihaiensis (Moss e al., 2008). La especie P. ka lssoni desc i a como
pa ási o del pec ínido A gopec en i adians de Canadá (McGladde y e al., 1991), no se
conside a ac ualmen e álida pues se demos ó que a ios de los es adios desc i os
co espondían a pa ási os di e en es (Goggin e al., 1996).
La ca ac e ización de las especies de Pe kinsus se lle ó a cabo, en un p incipio,
basándose en la mo ología del zooespo angio y de la hipnoespo a, el ango hospedado y
la dis ibución geog á ica. Sin emba go, debido al g an núme o de hospedado es y a la
amplia dis ibución geog á ica que ienen algunas especies de Pe kinsus, es os c i e ios no
se conside an su icien es hoy en día pa a dis ingui especies. Ac ualmen e el c i e io más
impo an e usado pa a disc imina en e especies de es e géne o es el análisis de
secuencias de ADN de a ios loci, p incipalmen e el es udio de di e en es egiones del
complejo génico del ADN que codi ica el ARN ibosómico (subunidad g ande LSU,
espaciado es ansc i os in e nos ITS1 e ITS2, espaciado no ansc i o NTS) y genes de
ac ina ( ipo I y ipo II) (Villalba e al., 2004; Moss e al., 2008). Los siguien es apa ados de
In oducción gene al
15
es e capí ulo se cen an en las especies P. olseni, P. medi e aneus y P. chesapeaki, que son
las especies obje o del es udio ecogido en es a memo ia.
2.2.2. Epidemiología
2.2.2.1. Dis ibución geog á ica y especies hospedado as
El ango geog á ico de las especies de Pe kinsus así como sus especies
hospedado as es muy amplio. P. olseni es la especie más cosmopoli a del géne o,
egis ándose en di e en es países de Oceanía, Amé ica, Eu opa, Asia y Á ica. P. olseni se
encon ó en o ejas de ma Halio is ube y Halio is lae iga a, Halio is scala is y Halio is
cycloba es de Aus alia (Les e y Da is, 1981; O´Donoghue e al., 1991; Goggin y Les e ,
1995); en almejas R. decussa us y R. philippina um de países eu opeos como F ancia,
Po ugal, España, I alia (Aze edo, 1989; Figue as e al., 1992; Sag is à e al., 1996; De la
He án e al., 2000; Robledo e al., 2000; Abollo e al., 2006; Elandaloussi e al., 2009;
Balsei o e al., 2010; A zul e al., 2012; P e o e al., 2014), en almejas inas de Túnez (El
Bou e al., 2012) y en almejas japonesas de la cos a pací ica de Japón, Co ea del Su y
China (Choi y Pa k, 1997; Hamaguchi e al., 1998; Maeno e al., 1999; Pa k e al., 1999;
Pa k y Choi, 2001; Choi e al., 2002; Pa k e al., 2005; Zhang e al., 2005; Wu e al., 2011).
También se ha egis ado la p esencia de P. olseni en o as especies de almejas menos
come ciales como Paphia undula a de Tailandia (Lee hocha ali e al., 2004), Pi a os a a
de U uguay (C emon e e al., 2005), P o o haca jedoensis de Co ea (Pa k e al., 2006a),
T idacna c ocea de Vie nam (Sheppa d e al., 2008), Aus o enus s u chbu yi de Nue a
Zelanda (Dungan e al., 2007) o Anada a apezia de Aus alia (Dang e al., 2015), así como
en las os as pe lí e as Pinc ada maxima de Aus alia (No on e al., 1993) y Pinc ada
uca a de la India (Sanil e al., 2010) y de las os as comes ibles C assos ea a iakensis de
Japón y China, C assos ea hongkongensis de China (Moss e al., 2007) y C assos ea gasa
y C assos ea hizopho ae de B asil (da Sil a e al., 2014). Desde inales de los 80 se ha
de ec ado P. olseni en Galicia, in ec ando las almejas R. decussa us, R. philippina um, V.
co uga a y Poli i apes homboides (Figue as e al., 1992, Casas e al., 2002; Robledo e al.,
2000; Villalba e al., 2005; Balsei o e al., 2010).
La especie P. chesapeaki es endémica del no es e de Amé ica y se ha desc i o en
las almejas Mya a ena ia (McLaughlin e al., 2000; Dungan e al., 2002; Bu eson e al.,
2005; Reece e al., 2008), Macoma bal hica (Coss e al., 2001a; Bu eson e al., 2005; Reece
e al., 2008), Me cena ia me cena ia (Coss e al., 2001a; Peche e al., 2008), Macoma
mi chelli (Coss e al. 2001a), Tagelus plebeius (Dungan e al., 2002; Bushek e al., 2008;
Reece e al., 2008), Mulinia la e alis, Rangia cunea a y Cy opleu a cos a a (Reece e al.,
2008). A pesa de que P. chesapeaki p incipalmen e in ec a almejas, ambién se ha
de ec ado pa asi ando las os as C. i ginica de Maine, Massachuse s y las bahías de
Chesapeake y Delawa e en EE. UU. (Peche e al., 2008; Reece e al., 2008; Ma quis e al.,
2015). Sin emba go, el ango geog á ico de es a especie es mayo del que se c eía has a
hace poco, ya que ecien emen e se ha de ec ado la p esencia de P. chesapeaki en Eu opa,
conc e amen e en F ancia (A zul e al., 2012), in ec ando las almejas R. decussa us y R.
philippina um, y en España, in ec ando el be be echo C. edule (Ca asco e al., 2014), así
como en Aus alia, in ec ando la almeja Anada a apezia (Dang e al., 2015).

Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
16
P. medi e aneus p esen a una dis ibución geog á ica y ango hospedado mucho
más limi ado que las especies an e io es. Sólo se ha de ec ado en el ma Medi e áneo,
in ec ando la os a plana O. edulis (Casas e al., 2004) y la almeja Chamelea gallina (Moss e
al., 2008) y ecien emen e se ha encon ado en el a ca A ca noae y la zambu iña
Mimachlamys a ia (=Chlamys a ia) (Valencia e al., 2014). El es ue zo in es igado en
o no a la pe kinsosis hace que el núme o de especies de Pe kinsus, su ango geog á ico y
la lis a de especies hospedado as c ezcan, lo que e idencia la necesidad de dispone de
écnicas de de ección sensibles que pe mi an un diagnós ico especí ico a ni el de especie.
2.2.2.2. In luencia de algunas ca ac e ís icas del hospedado en la pa asi ación
La edad del molusco juega un papel impo an e a la ho a de adqui i la en e medad
de la pe kinsosis. Las os as y almejas adul as p esen an ni eles mayo es de p e alencia
de Pe kinsus debido a una asa mayo de il ación y una exposición al pa ási o más
p olongada. Así, se ha de ec ado una p e alencia mayo de P. olseni en almejas R.
decussa us de más de es años en un banco na u al de Galicia, mien as que no se de ec ó
el pa ási o en las meno es de un año (Villalba e al., 2005). O os ac o es que a o ecen la
p og esión de Pe kinsus son un mal es ado nu icional del hospedado o la debilidad del
mismo as la pues a (Ho mann e al., 1995; Powell e al., 1996).
2.2.2.3. In luencia de ac o es ambien ales en la pa asi ación
La dinámica de in ección de la pe kinsosis es á in luenciada undamen almen e po
ac o es ambien ales. Los es udios epidemiológicos lle ados a cabo has a el momen o se
basa on p incipalmen e en P. ma inus y, en meno medida, en P. olseni. En el caso de P.
olseni se obse ó un pa ón es acional elacionado con la empe a u a. Villalba e al.
(2005) obse a on que la in ección po P. olseni en un banco de almeja ina de Galicia
mos aba un pico de in ensidad cuando la empe a u a alcanzaba los 15ºC. La in ensidad
al a se man iene desde la p ima e a has a inal de e ano, cuando se alcanzan
empe a u as de 19-21ºC y se p oducen las asas de mo alidad mayo es de las almejas.
Con el descenso de empe a u a, desciende la in ensidad de in ección, comenzando un
nue o ciclo en la p ima e a siguien e. Po an o, años con in ie no e inicio de p ima e a
poco íos son más p ocli es a ene una in ensidad y p e alencia ele adas de la
pe kinsosis y a su i mo alidades impo an es de os as o almejas (Liang e al., 2008).
Es os au o es ambién cons a a on que la salinidad iene una g an in luencia en la
dinámica de in ección de la almeja japonesa R. philippina um po P. olseni. O os
expe imen os in i o han con i mado que la empe a u a y la salinidad in luyen en la
ac i idad celula y iabilidad de P. ma inus y P. olseni (Chu y G eene, 1989; Bu eson e al.,
1994; Auzoux-Bo dena e e al., 1995; O´Fa ell e al., 2000; Ahn y Kim, 2001; Casas e al.,
2002; La Pey e e al., 2006, 2008). Es os expe imen os demos a on que la asa de
p oli e ación de P. ma inus y P. olseni ue mayo a 28ºC que a 15ºC, pe o a es a úl ima
empe a u a la asa de P. olseni ue mayo a la de P. ma inus, lo que concue da con los
esul ados ob enidos en el campo.
In oducción gene al
17
O os ac o es ambien ales que in luyen en la dinámica de in ección de Pe kinsus
son ac o es es esan es como los con aminan es del agua, mé odos ag esi os de
ex acción de los moluscos o zonas muy a ec adas po la ac i idad humana (Chu y Hale,
1994; Ande son e al., 1996; Lei e e al., 2004). La con aminación, la hipoxia y la in ección
po P. olseni han sido las esponsables de al as mo alidades de almeja ina R. decussa us
en el Alga e (Po ugal) (Aze edo, 1989; Bebianno, 1995; Sob al y Widdows, 1997).
2.2.3. Ciclo de ida y ansmisión
El ciclo de ida de Pe kinsus no se conoce en su o alidad, pe o se sabe que es
di ec o y no necesi a hospedado es in e media ios pa a comple a se (Ray, 1954; Goggin y
Les e , 1995; Chu, 1996; Blackbou n e al., 1998). Se han desc i o es es adios: o ozoí o,
hipnoespo a y zooespo a. El o ozoí o co esponde a la ase de mul iplicación ege a i a
que iene luga en los ejidos del hospedado (Figu a 9).
Es as células ienen o ma es é ica u o oide, con una g an acuola que ocupa
buena pa e de su olumen y un núcleo en posición pe i é ica con un nucleolo pa en e. El
amaño del o ozoí o a ía, según la especie, en un ango de 5-15 µm. Los o ozoí os se
mul iplican po di isiones bina ias sucesi as y las células hijas (de 2 a 64 pe manecen
du an e un iempo jun as den o de la pa ed de la célula mad e, o mando una es uc u a
con o ma de ose a (esquizon e), has a que la pa ed se ompe y se libe an las células hijas
denominadas o ozoí os inmadu os.
Es os o ozoí os inmadu os aumen an de amaño y desa ollan la g an acuola,
con i iéndose en o ozoí os madu os (Goggin y Les e , 1995; Pe kins, 1996; Blackbou n
e al., 1998) que pueden libe a se del molusco i o a a és de las heces o po diapédesis
(Scanlon e al., 1997; Bushek e al., 2002; Allam e al., 2013; Pa k e al., 2013) y ambién
debido a la mue e del hospedado (Ragone-Cal o e al., 2003a).
Las especies del géne o Pe kinsus, excep o P. qugwadi, p esen an la pa icula idad
de que sus o ozoí os aumen an su amaño, incluso más de es eces, y se odean de una
Mul iplicación ege a i a
T o ozoí o
Esquizon e
Figu a 9. Esquema que
mues a los sucesi os
pasos de la mul iplicación
ege a i a de Pe kinsus
olseni
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
18
pa ed polisacá ida g uesa cuando se incuban en caldo de ioglicola o, en oscu idad y
condiciones anae óbicas, ans o mándose así en un nue o es adio denominado
hipnoespo a. Se ha obse ado que cuando las hipnoespo as se incuban en agua de ma
comienza el p oceso de zooespo ulación (Figu a 10); las hipnoespo as pueden
man ene se i as en condiciones ad e sas du an e pe iodos p olongados y en an en
zooespo ulación cuando las condiciones son a o ables, po lo que se c ee que las
hipnoespo as son la ase de esis encia del ciclo de ida de Pe kinsus (Casas e al., 2002).
El p oceso de zooespo ulación supone sucesi as di isiones bina ias
man eniéndose la g uesa pa ed in ac a, de o ma que se o man cen ena es de zooespo as
en el in e io del zooespo angio. Las zooespo as (Figu a 11) son libe adas del
zooespo angio a a és de uno o dos ubos de desca ga que apa ecen en la hipnoespo a
an es de que comiencen las di isiones celula es (Pe kins y Menzel, 1966, 1967; Aze edo,
1989; Auzoux-Bo dena e e al., 1995; McLaughlin e al., 2000; Casas e al., 2002, 2004).
Casas y La Pey e (2013) mos a on e idencias de que la di e enciación de o ozoí os a
hipnoespo as se p oduce en condiciones asociadas a ejidos en descomposición, pudiendo
desa olla se es e es adio en los hospedado es mue os como una o ma de esis encia. Se
desconoce cuál es el es adio que más ecuen emen e inicia la in ección en un hospedado
Figu a 10. P og esión de la zooespo ulación. A: zooespo angio unicelula con ubo de
desca ga ( lecha); B: zooespo angio de 2 células; C: zooespo angio de 4 células; D:
zooespo angio di idiéndose pa a pasa de 4 a 8 células; E: zooespo angio de ocho células;
F: zooespo angio de 16 células; G: cien os de zooespo as mó iles den o del zooespo angio;
H: zoospo as mó iles libe adas a a és del ubo de desca ga. Imágenes ob enidas de
Villalba e al., 2011.
In oducción gene al
19
sano en el medio na u al, aunque se ha demos ado expe imen almen e que an o
o ozoí os, hipnoespo as, zoospo angios y zooespo as son capaces de ansmi i la
in ección (Goggin e al., 1989; Rod íguez e al., 1994; Vole y y Chu, 1994; Chu, 1996;
Bushek e al., 1997, 2002a; Chin ala e al., 2002; Fo d e al., 2002).
La u a de en ada de las di e en es células de Pe kinsus en el hospedado ocu e a
a és de las b anquias, del man o y del ubo diges i o, dispe sándose a o os ejidos po
medio de la hemolin a (Aze edo e al., 1989; Na as e al., 1992; Rod íguez y Na as, 1995;
Villalba e al., 2004). Allam e al. (2013) p oponen que las células de Pe kinsus en an en la
ca idad paleal del hospedado , son cap u adas po las b anquias y ans e idas a los
palpos b anquiales, donde una pequeña pa e es inge ida, mien as que el es o de células
son ans e idas al á ea de desca ga de las pseudoheces. Es udios gené icos ambién
indican que las especies del géne o Pe kinsus pod ían ene ep oducción sexual, pues se
han obse ado indi iduos diploides he e ocigo os en cul i os clonales del pa ási o y en
os as in ec adas (Robledo e al., 1999; Reece e al., 2001; Thompson, 2010; Thompson e
al., 2011, 2014; Pa do e al., 2011; Vilas e al., 2011).
2.2.4. In e acción hospedado -pa ási o
Se han lle ado a cabo nume osos es udios ace ca de la in e acción en e Pe kinsus
y sus hospedado es, undamen almen e de la in e acción de las especies P. olseni (obje o
de es udio de es a esis) y P. ma inus. P. olseni es esponsable de g andes mo alidades de
almejas y de pé didas económicas impo an es. Es e pa ási o ha causado mo alidades en
poblaciones de almeja ina de Galicia, alcanzando mo alidades anuales acumuladas del
41% (Villalba e al., 2005), y del Alga e, egis ando mo alidades en e un 50-80%
(Ruano y Cachola, 1986). El cul i o de la almeja japonesa ambién ha su ido mo alidades
po P. olseni que alcanza on el 90-100% en cul i os de Ca aluña y de la Laguna de Venecia
(San ma í e al., 1995; P e o e al., 2014). En Asia es e pa ási o es el esponsable de una
d amá ica educción de la almeja japonesa en Co ea, cayendo su p oducción a la quin a
pa e desde 1990 has a 1997 (Pa k y Choi, 2001), y de impo an es mo alidades en Japón
(Choi e al., 2002) y China (Liang e al., 2001).
Figu a 11. Mic og a ía elec ónica de ansmisión de una
zoospo a de Pe kinsus olseni
ob enida con un
mic oscopio elec ónico de ansmisión. Fo og a ía de
Villalba e al., 2011.
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
26
(Villalba e al., 1993c; Figue as e al., 1996) y en el longuei ón ello Solen ma gina us
(López y Da iba, 2006; Ruiz e al., 2015) .
2.3.2.2. In luencia de algunas ca ac e ís icas del hospedado en la pa asi ación
Tan o en os as como en mejillones, la p e alencia y la in ensidad de in ección po
M. e ingens son gene almen e supe io es en los indi iduos de edad igual o supe io a 2
años, al igual que la in ección de M. sydneyi en os as S. glome a a (Wol , 1979; Villalba e
al., 1993a; Audema d e al., 2001).
2.3.2.3. In luencia de ac o es ambien ales en la pa asi ación
La dinámica de in ección de M. e ingens en os a es á elacionada con la
empe a u a y, po an o, p esen a una ma cada es acionalidad. En Eu opa se han desc i o
in ecciones de os a con es e pa ási o desde mayo a diciemb e, alcanzando picos de
p e alencia e in ensidad en los meses de e ano (Baloue , 1977; G izel, 1985; Audema d
e al., 2001). M. e ingens espo ula y se ansmi e en e los meses de e ano y o oño,
alcanzando asas de mo alidad del 50-90% (G izel e al., 1974; G izel, 1985; OIE 2012c).
En in ie no, los espo angios p ima ios no se desa ollan y las in ecciones son lige as,
has a la llegada de la p ima e a y el aumen o de la empe a u a del agua, a pa i de las
cuales, las in ecciones p og esan has a alcanza los picos de p e alencia e in ensidad del
e ano (Alde man, 1979; Baloue e al., 1979; G izel, 1985; Be he e al., 1998; Audema d
e al., 2004a). Di e sos es udios han in en ado es ablece la dinámica de in ección de M.
e ingens en mejillones, pe o los esul ados no han sido concluyen es. Villalba e al.
(1993a) y Robledo y Figue as (1995) no encon a on un pa ón es acional cla o de la
en e medad, obse ando o mas madu as del pa ási o en el sis ema diges i o de los
mejillones gallegos a lo la go de odo el año, con picos de p e alencia en pe íodos
di e en es. En la Bahía de Al acs (Ta agona) ambién se obse a on espo angios madu os
en mejillones a lo la go de odo el año, sin emba go, se de ec a on mayo es p e alencias
en los meses de julio a sep iemb e, cuando las empe a u as supe aban los 17 ºC
(Ca asco e al., 2007). Es udios ealizados en Có cega con i man la espo ulación del
pa ási o a lo la go de odo el año, pe o la in ensidad de la espo ulación y, po an o, de la
in ección y la p e alencia aumen an en e junio y agos o (A zul e al., 2014). En
sep iemb e, las in ensidades y el núme o de indi iduos a ec ados disminuyen
conside ablemen e, lo que sugie e la libe ación del pa ási o al medio y/o una de ensa
e ec i a del hospedado , que log a supe a la in ección. Po o a pa e, en el su es e de
F ancia solo se de ec a on espo angios madu os del pa ási o en los meses de p ima e a y
o oño (Boye e al., 2013), lo que pod ía indica que el pa ási o enga dos ciclos po año y
que la en e medad pueda ansmi i se en es os dos pe íodos. Algunos au o es sugie en
que los cambios de empe a u a epen inos pod ían ac i a al pa ási o y a o ece su
espo ulación (Ca asco e al., 2008), lo que explica ía la p esencia de o mas madu as
du an e odo el año y, p incipalmen e, en los meses de e ano.
Pa a la especie ecien emen e desc i a M. cochillia no se dispone oda ía de
in o mación epidemiológica.

In oducción gene al
27
2.3.3. Ciclo de ida y ansmisión
El ciclo de ida comple o de las especies del géne o Ma elia aún no se conoce,
aunque exis en e idencias de que se a a de un ciclo de ida indi ec o que necesi a
hospedado es in e media ios pa a ce a se. La in ección de M. e ingens comienza en el
ac o diges i o de las os as, obse ándose células es é icas uninucleadas y de ipo
plasmodial en el epi elio ciliado del es ómago y de los úbulos diges i os (G izel e al.,
1974). Es as células uni y plu inucleadas desc i as po He bach (1971) y Comps (1970)
se conside an los es adios p ima ios del desa ollo de M. e ingens. Pos e io men e, se
p oduce una di isión endógena de los núcleos y del ci oplasma que les odea y se o man
las células secunda ias, 8 pa a M. e ingens y 4 pa a M. cochillia (Ca asco e al., 2013).
Es as células secunda ias da án luga , cada una de ellas, a las células e cia ias que
compond án el espo angio (3-4 pa a M. e ingens, 6 pa a M. cochillia) (G izel e al., 1974;
Audema d e al., 2001; A angu en e al., 2011; Ca asco e al., 2013). Cuando la pa ed de
las células p ima ias alcanza la madu ez, se ompe y se desp enden los espo angios
(He bach, 1971; G izel, 1985), que son libe ados al lumen del ac o diges i o y, a a és
de las heces de la os a, pasan al medio ex e no (Pe kins, 1976b; Audema d e al., 2002;
Be he e al., 2004). El mismo p oceso de espo ulación se obse ó en M. e ingens
in ec ando mejillones, pe o en es e caso se p oduce una colonización masi a de odos los
úbulos diges i os de o ma simul ánea (Villalba e al., 1993a; Robledo y Figue as, 1995).
Ca asco e al. (2013) ambién obse a on odas las e apas de espo ulación de M. cochillia
en el epi elio de los di e ículos diges i os del be be echo C. edule, encon ando algunas
células pa asi ando la glándula diges i a y espo angios lib es en el in es ino y en las heces.
Exis en nume osos es udios que a an de escla ece la u a que siguen las espo as
una ez libe adas al medio. G izel (1985) sugi ió que las espo as de M. e ingens pod ían
eque i un iempo de madu ación en el agua del ma o en el sedimen o an es de se
in ec i as. Se han ealizado nume osos es udios en los que se ha in en ado, sin éxi o,
ansmi i M. e ingens en e indi iduos de os a plana, median e cohabi ación e
inyección de suspensiones de espo as del pa ási o (Baloue , 1979; G izel, 1985; Be he e
al., 1998). Es os esul ados han lle ado a p opone la hipó esis de que el ciclo de ida
pueda se he e oxeno. En la búsqueda de hospedado es in e media ios, en un p ime
momen o se ba ajó la posibilidad de que peces il ado es cumplie an es a unción, sin
emba go los expe imen os de in ección con M. sydneyi no die on esul ado (Roubal e al.,
1989; Wesche e al., 1999). O as especies es udiadas como posibles hospedado es de
Ma eilia spp., ambién die on esul ados nega i os, como los polique os Polydo a spp.,
Poma oce os ique e y Spi o bis spp., el molusco C epidula o nica a y di e en es especies
de c us áceos como los decápodos C angon c angon, los an ípodos Ma inogamma us
ma inus, los cang ejos Ca cinus maenas, la langos a Gala hea squami e a o la néco a
Lioca cinus pube (Baloue e al., 1979; Van Banning, 1979). La di e sidad de especies
p esen es en bancos na u ales de os as hace complicada la búsqueda de hospedado es
in e media ios. Audema d e al. (2001) ealiza on un es udio de di e sidad de especies en
“es anques” na u ales de las ma ismas de la bahía ancesa Ma ennes-Olé on,
denominados localmen e “clai es”, en los que el núme o de especies econocidas es meno
de 100 (Reymond, 1991) y en donde se encon aba M. e ingens in ec ando la os a plana
con al os alo es de p e alencia. Cuando se es udió la p esencia/ausencia de M. e ingens
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
28
en cada una de las especies econocidas en es a zona, se de ec ó, median e eacción en
cadena de la polime asa (PCR) e hib idación in si u (ISH), que el o a io del copépodo
Pa aca ia g ani es aba in ec ado po es e pa ási o (Audema d e al., 2002). La implicación
de P. g ani en el ciclo de ida de M. e ingens es cong uen e ambién con la ecología del
copépodo, la epidemiología de la en e medad y la dis ibución geog á ica de ambos, ya que
P. g ani coexis e en las mismas zonas que Ma eilia y se obse a p incipalmen e en
p ima e a y e ano, pe iodo que coincide con el pe iodo de ansmisión de espo as de
Ma eilia (Audema d e al., 2002; Boye e al., 2013; A zul e al., 2014). Expe imen os de
cohabi ación demues an que los copépodos adquie en la in ección cuando es án
p esen es os as in ec adas con M. e ingens. Sin emba go, no se ha conseguido demos a
que los copépodos in ec ados ansmi en el pa ási o a os as sanas (Audema d e al., 2002;
Ca asco e al., 2008). Boye e al. (2013) de ec a on M. e ingens en odos los es adios de
ida de P. g ani, incluidos sus hue os, e in ec ando no sólo el o a io, sino ambién su ac o
diges i o. Es os au o es sugie en que el copépodo ingie e el pa ási o y den o de él se
mul iplica y mig a al o a io. Una ez allí, los hue os pod ían con ibui a la dispe sión de
M. e ingens, ya que P. g ani p oduce g an can idad de hue os en sep iemb e, pe iodo en
el que las espo as de M. e ingens se libe an al agua; o pod ían ac ua de ese o io del
pa ási o en el sedimen o du an e la ase de diapausa que su en en in ie no (Audema d e
al., 2002; Boye e al., 2013), lo que apoya ía las hipó esis de G izel (1985) y Wesche e al.
(1999) de que las espo as ienen un pe iodo de ida co o en la columna de agua y
necesi an un pe íodo de madu ación an es de ansmi i se a nue os moluscos.
O a especie del géne o Pa aca ia, P. la ise osa, ambién pod ía ac ua como
hospedado in e media io, ya que ambién se han de ec ado in ecciones po M. e ingens
en su o a io (A zul e al., 2014). Los pa ási os pod ían se libe ados a a és de los
conduc os gonadales o libe ados con los hue os du an e el deso e. Asimismo, se han
ob enido esul ados posi i os po PCR, usando cebado es especí icos de Ma eilia en o as
especies del géne o Pa aca ia y en o os copépodos como Oi hona sp., Eu e pina
acu i ons y E adne sp., aunque la in ección no se ha con i mado median e his ología o ISH
(Ca asco e al., 2007; A zul e al., 2014).
¿Cómo se ansmi en las espo as de M. e ingens de las dis in as e apas de
desa ollo de los copépodos a los moluscos? 1) La ausencia de ansmisión del pa ási o de
copépodos in ec ados a moluscos, pod ía indica la p esencia de un e ce hospedado en
el ciclo de ida de Ma eilia (Audema d e al., 2002); 2) los copépodos in ec ados (o sus
game os) pod ían se inge idos po el molusco (Audema d e al., 2002; Ca asco e al.,
2008; A zul e al., 2014). Los mejillones suelen il a pa ículas más pequeñas que los
copépodos (en e 4-35 µm) pe o algunos au o es han demos ado que M. edulis puede
il a ciliados de has a 90 µm de amaño (T o e e al., 2008) y que hue os y la as de
copépodos son e enidos po M. gallop o incialis (A zul e al., 2014). Se equie en más
es udios pa a ce a el ciclo de ida de las especies de Ma eilia.
En cohe encia con la hipó esis de un hospedado in e medio pa a las especias del
géne o Ma eilia, ecien emen e se ha publicado la p esencia de M. sydneyi en polique os
Neph ys aus aliensis (Adla d y Nolan, 2015).
In oducción gene al
29
2.3.4. In e acción hospedado -pa ási o
M. e ingens es el agen e causal de la en e medad de los Abe s que p o oca
ele adas mo alidades en la os a plana, O. edulis, en Eu opa (G izel e al., 1974; Massó,
1978; Alde man, 1979; an Banning, 1979). Los mejillones M. edulis y M. gallop o incialis
son ambién suscep ibles a la en e medad, aunque exis en disc epancias a la ho a de
alo a el e ec o le al de es e pa ási o. Algunos au o es desc ibie on a M. e ingens como
el agen e causal de cie a mo alidad de mejillón (Villalba e al., 1993a; Fuen es e al.,
1994), mien as que en o os casos es as in ecciones no se asocia on a episodios de
mo alidad (Comps e al., 1982; Longshaw e al., 2001).
Las os as pa asi adas po M. e ingens expe imen an una disminución o ausencia
de c ecimien o y mues an decolo ación de ono ama illo cla o en la masa isce al
(Comps, 1970; Be he e al., 2004; A angu en e al., 2011). El pa ási o p o oca una
disminución en la abso ción de ma e ia o gánica en M. gallop o incialis, p o ocando
incluso inanición, lo que conlle a una pé dida de condición impo an e e incluso la mue e
del mejillón (Pé ez-Camacho e al., 1997). La in ección po M. e ingens comienza en las
células epi eliales del sis ema diges i o y, a medida que el pa ási o p og esa, a limi ando
la ac i idad me abólica del hospedado y sus unciones diges i as, e incluso ob u a los
úbulos diges i os (Comps, 1970; G izel e al., 1974). Así, M. e ingens in e ie e en el
almacenamien o del glucógeno en la os a (Robe e al., 1991). Las espo as madu as de M.
e ingens se libe an al ma a a és del lumen de los úbulos diges i os y del in es ino,
as la des ucción del epi elio de la gándula diges i a y de los úbulos diges i os
secunda ios (Alde man, 1979; Robledo y Figue as, 1995). En es adios e minales de la
en e medad, las os as son incapaces de ce a las al as (A angu en e al., 2011). Las
in ecciones de M. e ingens en mejillones M. edulis y M. gallop o incialis p o ocan
sín omas simila es a los de la en e medad en la os a. La in ección po M. e ingens
ambién iene e ec os nega i os en la game ogénesis y en el desa ollo gonadal de os as y
mejillones, inhibiendo incluso, en el caso de in ecciones se e as, el ciclo game ogénico del
año siguien e (Robe e al., 1991; Villalba e al., 1993b).
La nue a especie desc i a, M. cochillia, pa asi a ambién los úbulos diges i os del
be be echo C. edule, p o ocando mo alidades ele adas (Ca asco e al., 2011) (Figu a 15).
Los mecanismos de de ensa del hospedado en e a las especies del géne o
Ma eilia oda ía no se conocen en p o undidad. En gene al, la de ensa del hospedado
consis e en un aumen o signi ica i o de hemoci os ci culan es en la hemolin a (Ca ballal e
al., 1998) y una in il ación hemoci a ia en las zonas pa asi adas po Ma eilia (Alde man,
1979; Figue as e al., 1991; Villalba e al., 1993a; Robledo y Figue as, 1995; Dang e al.,
2011).
La especie más es udiada en elación a la in e acción con su hospedado es M.
sydneyi. Se ha demos ado que los hemoci os de S. glome a a, p incipalmen e los
g anuloci os, es án implicados en el con ol de la in ección po M. sydneyi (New on e al.,
2004; Aladaileh e al., 2007; Bu y Ra os, 2008; Kuchel e al., 2010). In i o, es as células
son capaces de agoci a células de M. sydneyi y, as la usión de los pseudópodos o man
agosomas, den o de los cuales se incluye el pa ási o. T as la o mación de es os
agosomas, los lisosomas p esen es en los hemoci os se usionan a su memb ana,
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
30
libe ando los p oduc os que con iene pa a lle a a cabo la diges ión del pa ási o (Kuchel e
al., 2010). Los hemoci os son capaces de agoci a espo angios madu os de g an amaño
(6-30 µm), median e la o mación de es os agosomas y pos e io melanización de los
mismos (Bu y Ra os, 2008).
Nume osos es udios han demos ado la exis encia de al os ni eles de enoloxidasa
y os a asa ácida en el in e io de los lisosomas de los hemoci os de os as in ec adas po
M. sydneyi (Pe e s y Ra os, 2003; New on e al., 2004; Bezeme e al., 2006; Bu y Ra os,
2008). La enoloxidasa es á implicada en la u a de p oducción de melanina, necesa ia
pa a deg ada al pa ási o den o de las cápsulas hemoci a ias. Se ha obse ado que os as
seleccionadas como esis en es a la en e medad poseen una mayo ac i idad enoloxidasa
que os as no seleccionadas y p esen an hemoci os de mayo amaño (New on e al., 2004;
Bu y Ra os, 2008), lo que con i ma ía su papel en la de ensa en e al pa ási o. Pe e s y
Ra os (2003) apun an a que una de las dianas de M. sydneyi pa a sob e i i den o del
hospedado , se ía la inhibición de la cascada p o- enoloxidasa, median e la sín esis de
p o einasas se ínicas que in e ie en en la ac i ación de es a cascada. De hecho, se ha
obse ado la sup esión de la ac i idad enoloxidasa en os as jus o an es de la
espo ulación del pa ási o (Pe e s y Ra os, 2003; Bu e al., 2006; Bu y Ra os, 2007). Po
el momen o el conocimien o sob e p o eínas o genes implicados en la espues a inmune
de los moluscos en e a Ma eilia spp. es limi ado, aunque se han lle ado a cabo algunos
es udios p elimina es que mues an una exp esión di e encial de genes que codi ican pa a
enzimas an ioxidan es en os as in ec adas po M. sydneyi y sanas (G een e al., 2009), así
como un aumen o de p o eínas de es e ipo en os as in ec adas po el pa ási o (Simonian
e al., 2009).
2.3.5. Es a egias de lucha
La p e ención de la ma eiliosis es undamen al en acuicul u a, ya que M.
e ingens y M. cochillia han causado g andes mo alidades y pé didas económicas
(He bach, 1971; G izel e al., 1974; Alde man, 1979; G izel, 1985; Goulle que y Hé al,
Figu a 15. Co e his ológico
que mues a Ma eilia
cochillia
pa asi ando los
úbulos diges i os del
be be echo Ce as ode ma
edule.
In oducción gene al
31
1997; Ca asco e al., 2011). Se han p obado p oduc os químicos como el azul de
me ileno, el e de malaqui a y el u anace pa a in en a elimina a M. e ingens en os as
planas in ec adas (G izel, 1979). Con es os a amien os no se consiguió e adica el
pa ási o y, en algunos casos, se mos a on óxicos pa a las os as.
La p opagación epidémica puede e i a se es ableciendo p og amas e ec i os de
con ol de mo imien os de moluscos de á eas a ec adas a á eas lib es de la en e medad.
Una ez que el pa ási o se es ablece en una zona, las es a egias de lucha deben i
encaminadas a una mejo ges ión de su cul i o, en base al conocimien o exis en e sob e su
biología, y a busca moluscos esis en es a la en e medad. En á eas endémicas, debe ía
e i a se el inicio del cul i o de semillas y ju eniles de os a plana en e junio y agos o, ya
que es el pe iodo de ansmisión de M. e ingens (Pe kins, 1993). El desa ollo de la
ma eiliosis pod ía minimiza se cul i ando las os as en aguas ías, con empe a u as
meno es a los 17º C, y con salinidades al as (G izel, 1985; Bowe e al., 1994; Be he e al.,
1998; Audema d e al., 2001, 2002). Sin emba go, son necesa ios más es udios que
pe mi an e alua la in luencia de los ac o es bió icos y abió icos en el desa ollo de la
en e medad, así como conoce el ciclo de ida comple o del pa ási o pa a busca ías con
que minimiza el impac o de es a en e medad. Es de des aca la es a egia de lucha
seguida en Aus alia en e a M. sydneyi. T as más de 20 años desa ollando un p og ama
de selección de os as esis en es a la en e medad han educido la mo alidad de las
poblaciones de S. glome a a, pasando de un 97% en os as no seleccionadas a un 28% en
os as seleccionadas, y han educido las pé didas económicas que descendie on de un
52% a un 23% (Do e e al., 2013a,b).
2
2.
.4
4.
.
M
Mi
ik
k
o
oc
cy
y
o
os
si
is
s
2.4.1. Taxonomía
El géne o Mik ocy os lo p opusie on Fa ley e al. (1988) pa a inclui a dos
p o ozoos: M. mackini, causan e de la en e medad denominada “Denman Island Disease”,
que a ec aba a las os as japonesas C. gigas en el en o no de la isla Denman (Columbia
B i ánica, Canadá), y M. oughleyi, agen e e iológico de la en e medad “Win e mo ali y”
esponsable de ele adas mo alidades en las os as S. glome a a en Aus alia. Es os
au o es incluye on a ambos pa ási os en el mismo géne o basándose en obse aciones
mic oscópicas, en las cuales se e idenciaba que ambos pa ási os e an células pequeñas,
meno es de 5 µm, de ipo es é ico y núcleo excén ico que les daba una apa iencia de
hue o i o; en la especi icidad celula , ya que ambos e an pa ási os de hemoci os; y en su
mismo modo de ansmisión, di ec amen e de os a a os a (Ca negie y Cochennec-
Lau eau, 2004).
A las especies del géne o Mik ocy os, jun o a las del géne o Bonamia, se les
denomina mic océlulas po su amaño pequeño y po se pa ási os de hemoci os de os a.
Ambos géne os se di e encia on en unción de los signos mac oscópicos de las
en e medades que causaban y de sus especies hospedado as (Fa ley e al., 1988). La

Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
32
ul aes uc u a de M. mackini ambién con i mó que se a aba de un pa ási o di e en e a
Bonamia spp., p incipalmen e po que no se obse aban mi ocond ias u o gánulos
equi alen es, ni haplospo osomas, excluyéndolos así de los Haplospo ida (Fa ley e al.,
1988; Hine e al., 2001b) (Figu a 16).
Sin emba go, es udios mo ológicos de M. oughleyi demos a on que es e pa ási o
mos aba más simili udes con el géne o Bonamia que con Mik ocy os, po posee
haplospo osomas y mi ocond ia (Hine e al., 2001b; Cochennec-Lau eau e al., 2003a), lo
que se con i mó median e es udios molecula es (Cochennec-Lau eau e al., 2003a) y
pe mi ió un cambio en su asignación, pasando a llama se B. oughleyi. Desde en onces, M.
mackini ha sido la única especie in eg an e de es e géne o y su posición ilogené ica den o
de los euca io as ha sido una incógni a, ya que la secuencias de su ADN ibosómico
ob enidas e an al amen e di e gen es con las de cualquie o o ilo de P o is as (Ca negie
e al., 2003b).
Adl e al. (2012) incluye on al géne o Mik ocy os en el g upo Haplospo ida. Sin
emba go, el desa ollo de las nue as ecnologías de secuenciación masi a han pe mi ido
secuencia el ansc ip oma de M. mackini y ealiza es udios ilogené icos más obus os,
usando un mayo núme o de genes (Bu ki e al., 2013); es os es udios concluye on que M.
mackini ha de inclui se den o del g upo Rhiza ia y, aunque no acla a on su posición
den o del mismo, sugi ie on que es e géne o pod ía se un axón he mano de los
Haplospo ida (donde se incluye el géne o Bonamia). Po o a pa e, Bu ki e al. (2013)
demos a on que M. mackini no es un o ganismo ami ocond ial, si no que posee
“o gánulos mi ocond iales educidos” (MROs), lo que lo con ie e en el p ime o ganismo
con MROs desc i o den o del g upo Rhiza ia. Poco iempo después, Ha ikainen e al.
(2014b) con i ma on que es e géne o es á incluido den o de Rhiza ia como axón
he mano a los Haplospo ida. Además, el descub imien o de nue os o ganismos
elacionados molecula men e con Mik ocy os, en nue os hospedado es y angos
geog á icos, pe mi ió ag upa los en una nue a amilia Mik ocy iidae, o den Mik ocy ida e
inclui los en la clase Asce ospo a (Ha ikainen e al., 2014b). En e es os o ganismos
mik ocy idos se desc ibió la nue a especie, M. mimicus, que se de ec ó como pa ási o de la
os a japonesa C. gigas; ambién ecien emen e se ha desc i o la especie nue a M. bowe i,
que in ec a la os a Os ea lu ida (Abbo e al., 2014).
Exis en o os pa ási os de moluscos desc i os como Mik ocy os sp. o ipo
Mik ocy os cuya posición axonómica no se ha es ablecido debido a la escasez de
Figu a 16. Mic og a ía de Mik ocy os mackini ( lechas)
in ec ando C assos ea gigas. En el in e io de las
células se obse a el núcleo con un nucleolo
p ominen e. Fo og a ía de Bowe (2015).
In oducción gene al
33
secuencias disponibles de es e géne o y a los pocos es udios ul aes uc u ales exis en es
(Gagné e al., 2008; Wang e al., 2010b; Ga cia e al., 2012). Las ecien es desc ipciones de
M. mimicus y M. bowe i, que apo an un mayo conocimien o ul aes uc u al y molecula
de es e géne o, jun o con los a ances ecien es en el análisis ilogené ico de Mik ocy os,
a o ece án la desc ipción de nue as especies y la asignación, si co esponde, de los
Mik ocy os sp. a alguna de las especies ya desc i as.
2.4.2. Epidemiología
2.4.2.1. Dis ibución geog á ica y especies hospedado as
Du an e más de una década, M. mackini ha sido la única especie conocida
ep esen an e de es e géne o, con egis o en un único hospedado , la os a japonesa C.
gigas, y en una sola localización geog á ica, la Columbia B i ánica (Canadá) (Quayle, 1982;
Bowe , 1988; Fa ley e al., 1988; Bowe e al., 1994; Abbo e al., 2011). En los úl imos
años, el ango geog á ico y hospedado de es e géne o se ha ampliado no ablemen e. M.
mackini ambién se ha de ec ado en Washing on (EE. UU.) in ec ando C. gigas (Bowe ,
2010; Abbo e al., 2011) y en Cali o nia (EE. UU.) pa asi ando una nue a especie
hospedado a C assos ea sikamea (Els on e al., 2012). Recien emen e, la especie M. bowe i
ambién se ha desc i o pa asi ando la os a japonesa en la cos a oes e de EE. UU. y la os a
O. lu ida en la Columbia B i ánica (Canadá) (Abbo e al., 2011; Abbo e al., 2014),
mien as que M. mimicus se desc ibió in ec ando C. gigas en el Reino Unido (Ha ikainen e
al., 2014b). También exis en egis os de Mik ocy os sp. in ec ando la os a O. lu ida de
Cali o nia (EE. UU.) (F iedman e al., 2005), O. edulis en Nue a Escocia (Canadá) (Gagné e
al., 2008), C. gigas en China (Wang e al., 2010b) y la almeja Donax unculus en F ancia
(Ga cia e al., 2012). Abbo y Meye (2014) apun an que los pa ási os ipo Mik ocy os que
pa asi an C. gigas de China y O. edulis de Canadá pod ían a a se de la especie M. bowe i,
ya que sus secuencias de ADN ibosómico son idén icas. Además, se han de ec ado
di e en es secuencias de ADN de mic ocí idos en mues as ambien ales de Reino Unido,
en e las que se incluyen secuencias idén icas a las de M. mackini y M. bowe i (Ha ikainen
e al., 2014b).
2.4.2.2. In luencia de algunas ca ac e ís icas del hospedado y de ac o es
ambien ales en la pa asi ación
Se han ealizado in ecciones expe imen ales con M. mackini cuyos esul ados
indica on que las especies C. i ginica, O. edulis y O. lu ida son suscep ibles a la in ección y
que indi iduos jó enes de os a japonesa meno es de 2 años ambién desa ollan la
en e medad (Bowe e al., 1997; Bowe e al., 2005). Es e pa ási o p esen a un pa ón
es acional de in ección, de ec ándose po his ología en e los meses de ene o y junio y
p o ocando mo alidades en e ma zo y mayo (Bowe , 1988; Fa ley e al., 1988; Quayle,
1988). Es a es acionalidad es á ligada a la dependencia de Mik ocy os po las bajas
empe a u as del agua. Median e expe imen os de labo a o io de obse ó que os as
expues as a M. mackini a empe a u as meno es de 10 ºC du an e es meses,
desa olla on la en e medad, mien as que empe a u as de 15 ºC inhibían su desa ollo,
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
34
aunque no eliminaban el pa ási o. Pos e io men e, cuando es as os as se some ie on de
nue o a empe a u as bajas, se ecupe aba la in ección (He io e al., 1996; Bowe e al.,
1997). Es os expe imen os con i man lo obse ado en el campo, ya que las di e en es
especies de Mik ocy os se han encon ado en la i udes al as, en e los 41ºN de Cali o nia
(M. mackini pa asi ando C. sikamea) y los 53ºN de Reino Unido (M. mimicus in ec ando C.
gigas), en las cuales las empe a u as en in ie no son ce canas o meno es a 10ºC (Bowe ,
1988; Quayle, 1988; Gagné e al., 2008; Wang e al., 2010b; Ga cia e al., 2012; Els on e al.,
2012; Abbo y Meye , 2014; Ha ikainen e al., 2014b).
2.4.3. Ciclo de ida y ansmisión
No se conoce el ciclo de ida comple o de las especies del géne o Mik ocy os.
Es udios de campo y labo a o io mues an que M. mackini puede ans e i se de os a a
os a di ec amen e (Quayle, 1961; Bowe e al., 1997). Las células iables de M. mackini
libe adas al mo i el hospedado , son adqui idas p obablemen e po un indi iduo nue o a
a és de los mecanismos de alimen ación. Las células de M. mackini que se encuen an en
los hemoci os pueden sali al ex e io po diapédesis, a a és del ac o in es inal y las
b anquias (OIE, 2012d). Se han iden i icado es ipos de células en M. mackini y M.
mimicus, en base a sus ca ac e ís icas ul aes uc u ales: (1) células quiescen es (QC)
localizadas en el ejido conjun i o esicula , en hemoci os, ex acelula men e y en los
mioci os del músculo aduc o y del co azón; (2) células esicula es (VC) obse adas sólo
en los mioci os o ex acelula men e ce ca de ellos; (3) células endosomales (EC), que se
encuen an en hemoci os, ex acelula men e o en el ejido conjun i o esicula , pe o
nunca en mioci os (Hine e al., 2001b; Ha ikainen e al., 2014b). Hine e al. (2001b)
sugie en un posible ciclo de ida di ec o den o de los ejidos del hospedado , en el cual
las QC del ejido conjun i o esicula iajan a a és de los hemoci os al músculo aduc o o
al co azón. En los mioci os de es os ó ganos, los QC adquie en ATP de las mi ocond ias de
las células del hospedado y se ans o man en VC, que endoci an ATP y p o eínas del
mioci o. Es as VC salen del mioci o ans o madas en EC y mig an de nue o, den o de los
hemoci os, al ejido conjun i o esicula . Es as EC ob ienen ene gía y p o eínas de las
mi ocond ias hemoci a ias y desa ollan un e ículo endoplasmá ico, un complejo de Golgi
úbulo- esicula , hacen la glucolisis y se di iden median e ca iocinesis pa a da luga a
células hijas que se con ie en en QC, empezando de nue o el ciclo. Po el momen o, no se
han encon ado o mas espo uladas o de esis encia que pe mi an al pa ási o sob e i i
en el medio ex e no y que indiquen la posibilidad de que el ciclo de ida de las especies del
géne o Mik ocy os sea indi ec o. Sin emba go, la ecien e de ección de di e en es
secuencias de mic ocí idos, en e los que se encuen an M. mackini y M. bowe i, en
mues as ambien ales que incluían copépodos y o os in e eb ados, pod ía indica que
es os o ganismos ac úan como ec o es o anspo ado es de es os pa ási os o, al ez,
pod ían juga un papel impo an e en el ciclo de ida de Mik ocy os como hospedado es
in e media ios (Ha ikainen e al., 2014b).
In oducción gene al
35
2.4.4. In e acción hospedado -pa ási o
Los signos mac oscópicos p o ocados po M. mackini y M. mimicus en C. gigas
incluyen lesiones ocales pequeñas como ulce aciones, abscesos o pús ulas, gene almen e
de colo e de, de has a 5 mm de diáme o, obse adas p incipalmen e en el man o,
músculo aduc o y palpos labiales (Figu a 17). Adyacen es a los abscesos de la supe icie
del man o pueden exis i cica ices ma ones en la concha. A pesa de es as lesiones, las
os as in ec adas suelen es a en buen es ado has a el momen o de su mue e, aunque
cuando su es ado es mo ibundo o muy débil cie an con len i ud y he mé icamen e las
al as (OIE, 2012d; Abbo y Meye , 2014; Ha ikainen e al., 2014b). Sin emba go, no se
han desc i o signos mac oscópicos de la en e medad p o ocados po M. mackini en C.
sikamea, po M. bowe i en C. gigas u O. lu ida, o en las almejas pa asi adas po Mik ocy os
sp.
A ni el his ológico, M. mackini, M. bowe i y M. mimicus suelen encon a se en el
ci oplasma de las células del ejido conjun i o esicula , en las ib as del músculo aduc o
p incipalmen e, aunque ambién se han obse ado en el epi elio de la glándula diges i a,
gónada, in es ino, co azón y b anquias.
En es os ó ganos, p o ocan in il aciones hemoci a ias ocales in ensas asociadas
con á eas de nec osis en los ejidos conjun i os esicula es. También se han encon ado
e idencias de que los hemoci os pueden agoci a es as mic océlulas (Hine e al., 2001b;
Meye e al., 2005; Abbo e al., 2014; Ha ikainen e al., 2014b). La in o mación
p opo cionada sob e la de ección de Mik ocy os sp. en C. gigas de China y en O. edulis de
Nue a Escocia no incluye la desc ipción de in il aciones hemoci a ias ocales en el ejido
conjun i o esicula , posiblemen e po que en el momen o de la de ección, la in ección e a
subclínica (Gagné e al., 2008; Wang e al., 2010b). En la ac ualidad no exis en es udios a
ni el celula o molecula que acla en las es a egias que siguen los pa ási os de es e
géne o pa a desa olla la in ección den o de sus hospedado es, ni de cómo se de ienden
és os pa a ence la. La ausencia de e dade as mi ocond ias en Mik ocy os y la
p oximidad del pa ási o a las mi ocond ias de las células del hospedado , sugie e que és e
pod ía ans e i moléculas de ATP y o os ma e iales de las mi ocond ias de las células
hospedado as a su ci oplasma (Hine e al., 2001b; Bu ki e al., 2013).
Figu a 17. Músculo aduc o de C assos ea gigas
mos ando las lesiones ca ac e ís icas ( lechas)
p o ocadas po Mik ocy os mackini
en una
in ección a anzada. Fo og a ía de Bowe (2015).
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
42
que pe mi e incluso de ec a polimo ismos o mu aciones pun uales. Además, el empleo
de a ias sondas con di e en es luo ó o os y dianas hace posible una p ueba mul iplex.
Sin emba go, el uso de sondas enca ece no ablemen e la p ueba de PCR y su op imización
es mucho más compleja que en el caso del SYBR G een.
La p incipal en aja que p esen a la PCR en iempo eal en e a la PCR
con encional es la posibilidad de cuan i ica moléculas de ADN, lo que pe mi e es ima
in ensidades de in ección. Las señales luo escen es de cada ciclo de PCR se con ie en en
un alo numé ico pa a cada mues a analizada, lo que hace iable cuan i ica el ADN
molde inicial de una mues a. La cuan i icación puede se absolu a, si es posible ealiza
una cu a es ánda en la que se asocien concen aciones conocidas del ADN a analiza con
unos de e minados alo es de luo escencia, o ela i a, cuando se compa an los alo es de
luo escencia ob enidos en e a un ADN de e e encia. O as en ajas de la PCR en iempo
eal en e a la PCR con encional son su apidez, ya que no se necesi a un análisis
pos e io de los p oduc os ampli icados en geles de aga osa; el meno iesgo de
con aminación, ya que oda la p ueba se ealiza en un sis ema ce ado, y la posibilidad de
de ec a polimo ismos o mu aciones. Es as en ajas, jun o a una mayo sensibilidad que
las PCR con encionales, como e emos pos e io men e, la con ie en en una po en e
he amien a pa a el diagnós ico de en e medades de moluscos así como pa a es udios
epidemiológicos en los que se alo e el p og eso de la in ección a lo la go del iempo o
c ecimien o del molusco, el seguimien o de la e olución de las in ecciones en di e en es
ó ganos, o pa a con ibui al es udio del ciclo de ida de los pa ási os.
3.1.5. PCR-DGGE (Elec o o esis en Gel con G adien e Desna u alizan e)
La elec o o esis en gel con g adien e desna u alizan e (DGGE, “Dena u ing
G adien Gel Elec opho esis”) es un ipo de elec o o esis que pe mi e la sepa ación de
agmen os de ADN del mismo amaño pe o con di e en e secuencia de nucleó idos. Es a
elec o o esis se lle a a cabo en geles de poliac ilamida a los que se les inco po a un
g adien e lineal c ecien e de agen es químicos desna u alizan es del ADN (u ea y
o mamida). Du an e la elec o o esis, los agmen os de ADN de doble cadena mig an po
el gel has a encon a una de e minada concen ación desna u alizan e, que hace que se
sepa en las cadenas pa cialmen e, disminuyendo o de eniendo su mig ación. La
concen ación desna u alizan e que sepa a cada molécula de ADN depende á de su
con enido en dobles o iples puen es de hid ógeno, dependiendo de si son pa es de bases
adenina- imina o ci osina-guanina (Mye s e al., 1987). Es o p o oca á que un p oduc o de
PCR que con enga moléculas de ADN del mismo amaño, pe o dis in a composición
nucleo ídica, no mig e en una sola posición como en los geles de aga osa, sino que cada
molécula di e en e end á di e en es posiciones en los geles DGGE. Además, pa a e i a
que las moléculas de ADN se desna u alicen comple amen e y no queden e enidas en el
gel, la ampli icación po PCR de los agmen os a analiza po DGGE equie e la adición de
una cola ica en nucleó idos GC denominada clamp. El clamp es una secuencia de 30-50
pa es de bases de guanina-ci osina, que se añade al ex emo 5´ de uno de los cebado es y
es ampli icada en cada PCR con el agmen o de ADN diana (Mye s e al., 1987). Los iples
puen es de hid ógeno de es a cola, no pe mi en que la molécula se desna u alice en su

In oducción gene al
43
ex emo 5´, pe o sí lo ha á el es o dependiendo de la composición y concen ación
desna u alizan e, quedando la molécula e enida en el gel.
Es e mé odo iene un al o pode de disc iminación, de ec ando has a a iaciones
de un nucleó ido en una secuencia de ADN (Fishe y Le man, 1983; Le man y Beldjo d,
1999).
3.1.6. Hib idación in si u (ISH)
Las écnicas molecula es basadas en PCR pe mi en de ec a ADN del pa ási o pe o
no dan in o mación ace ca de la iabilidad del mismo, ni de su localización his ológica
exac a. Así, esul ados posi i os po PCR no indican una in ección eal, ya que el pa ási o
puede no se iable o puede que su localización no sea en los ejidos del hospedado sino
en la supe icie ex e na o en un lumen comunicado con el ex e io , sin causa in ección
(Bu eson, 2008). Es impo an e, po lo an o, isualiza el pa ási o en los ejidos del
hospedado . La ISH es la écnica más adecuada pa a es o, ya que o ece las en ajas de la
his ología y la especi icidad de las écnicas molecula es. Se basa en el uso de una secuencia
de ADN complemen a ia al ADN del pa ási o a de ec a , que se uni á a él de o ma
especí ica, y que a ma cada con compues os que pe mi en una cla a isualización del
mismo (Figu a 19). Es os compues os suelen se luo ó o os o una molécula de o igen
ege al de la que se disponen an icue pos especí icos denominada digoxigenina.
La ISH consume más iempo que las écnicas de PCR po lo que no es muy ú il pa a
el diagnós ico u ina io de un g an núme o de mues as. Sin emba go, el diagnós ico po
écnicas de PCR de especies nue as de pa ási os o de las ya exis en es en hospedado es
nue os debe ía con i ma se median e ISH, pa a desca a la posibilidad de que se a e de
alsos posi i os o de pa ási os in iables. Además, la ISH puede da in o mación sob e: 1) la
in e acción en e el hospedado y el pa ási o como po ejemplo qué ó ganos o ejidos
es án in ec ados y el g ado y a ance de la in ección; 2) la p esencia/ausencia de a ias
especies de pa ási os causando in ecciones mix as en un mismo hospedado y 3) el ciclo
de ida, ya que se puede obse a la p esencia de di e en es es adios de un pa ási o y
isualiza lo en hospedado es in e media ios.
Figu a 19. Hib idación in si u de
Ma eilia e ingens
(pun os azules)
pa asi ando los úbulos diges i os de
Os ea edulis.
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
44
3.1.7. Secuenciación masi a
Los a ances ecnológicos de los úl imos años han conducido al desa ollo de la
secuenciación de nue a gene ación (nex gene a ion sequencing, NGS), ambién conocida
como secuenciación masi a pa alela, del inglés massi e pa allel sequencing (MPS). Es e
p oceso de secuenciación en pa alelo p oduce miles o millones de secuencias a la ez,
aba a ando eno memen e la secuenciación de ADN. Las ecnologías de secuenciación
masi a incluyen a ias e apas que pueden ag upa se en la p epa ación del “ empla e” o
plan illa, secuenciación, sis ema de imagen y análisis de da os. La combinación única de
p o ocolos especí icos dis ingue una ecnología de o a y de e mina la clase de da os
p oducidos en cada pla a o ma (Ha ismendy e al., 2009; Me zke , 2010). Un pun o común
en e odas las ecnologías de NGS es que la plan illa se une o inmo iliza en una supe icie
sólida o sopo e, lo que pe mi e que las moléculas es én sepa adas espacialmen e y se
puedan lle a a cabo miles e incluso millones de eacciones de secuenciación
simul áneamen e. Los mé odos exis en es pa a la p epa ación de la plan illa se clasi ican
en aquellos en los que es necesa io una ampli icación p e ia del ADN (Clonally ampli ied
empla es) y los que no necesi an de una PCR p e ia (Single-molecules empla es).
Incluidos en el p ime g upo se encuen an los dos mé odos más comunes de p epa ación
de la plan illa: 1) PCR en emulsión, en la cual se c ea una lib e ía de agmen os a los que
se les unen en los ex emos una se ie de adap ado es uni e sales, lo que pe mi e
ampli ica odo el ADN con una misma pa eja de cebado es. Pos e io men e, el ADN de
doble cadena se sepa a en ADN de cadena sencilla y se cap u a sob e la supe icie de unas
bolas de agua, de o ma que en cada bola haya una sola molécula de ADN. Es as bolas se
deposi an en pocillos indi iduales de una placa de muy pequeño olumen en los cuales se
ealiza la secuenciación, o p e iamen e se pueden inmo iliza en una supe icie, como po
ejemplo un gel de poliac ilamida; 2) Ampli icación en ase sólida, que se basa en la ijación
de los cebado es en un sopo e de id io, lo que pe mi e ob ene g upos de agmen os
ampli icados sepa ados espacialmen e y con ex emos lib es a los cuales se les pueden
uni cebado es uni e sales pa a ealiza la secuenciación. Los mé odos que no necesi an
ampli icación p e ia del ADN se basan en la inmo ilización del ADN molde, DNA
polime asa y/o cebado es sob e un sopo e sólido.
Las es a egias p incipales de secuenciación incluyen pi osecuenciación (Ronaghi
e al., 1998), la e minación e e sible cíclica (Me zke , 2005), la secuenciación po medio
de la enzima ADN liasa (Tomkinsosn e al., 2006) y la secuenciación en iempo eal (Eid e
al., 2009). La NGS p oduce una can idad de da os an ele ada que equie e un análisis
compu acional pa a ealiza los ligamien os de las lec u as ob enidas en base a una
secuencia de e e encia o un ensamblaje de no o (T apnell y Salzbe g, 2009).
El uso de es a ecnología en bi al os si ió pa a ealiza di e sos es udios como
los encaminados a iden i ica genes implicados en la espues a inmune (Mo ei a e al.,
2012; Philipp e al., 2012; Rosa e al., 2012; Lei e e al., 2013; McDowell e al., 2014,
Menike e al., 2014, Mo ei a e al., 2014, Paule o e al., 2014, Zhang e al., 2014; Gómez-
Chia i e al., 2015; He e al., 2015; Meng e al., 2014) o pa a in es iga p ocesos biológicos
como la deposición de la concha o la biomine alización de almejas (Cla k e al., 2010;
Joube e al., 2010). La ecnología NGS se ha empleado pa a ealiza un es udio
ansc ip ómico de M. mackini, que pe mi ió ob ene g an can idad de genes, en e los que
In oducción gene al
45
se encuen an genes con g an ele ancia axonómica (Bu ki e al., 2013). Po el momen o
la NGS es poco usada en el diagnós ico o iden i icación de especies pa ógenas de moluscos
bi al os, aunque ya se ha publicado un es udio en el cual se usó es a ecnología pa a la
de ección de la nue a especie y nue o géne o Pa amik ocy os cance i, pa ási o mik ocí ido
del cang ejo Cance pagu us, y de la especie Haplospo idium li o alis que in ec a el
hepa opánc eas de Ca cinus maenas (Ha ikainen e al., 2014b).
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3.2.1. Géne o Bonamia
Se han desc i o di e sos p o ocolos de PCR pa a el diagnós ico de Bonamia spp.,
es de los cuales es án ecogidos en el Manual de Tes diagnós icos pa a Animales
Acuá icos de la OIE (OIE, 2012 a, b). Es os p o ocolos de PCR emplean cebado es
diseñados en la egión SSU de los pa ási os de es e géne o: 1) Bo/Boas (Cochennec e al.,
2000) que ampli ican un p oduc o de PCR de 300 pb, pe o que no son especí icos de B.
os eae si no que pueden ampli ica o os Haplospo ida; 2) CF/CR (Ca negie e al., 2000),
que dan luga a un p oduc o de 760 pb y que de ec an, al menos, B. os eae y B. exi iosa, y
3) BoosF03/BoosR03, que ampli ican 352 pb y su especi icidad se limi a a B. os eae
(Engelsma e al., 2010). Pa a la iden i icación especí ica, en la p ueba desc i a po
Cochennec e al. (2000), el p oduc o de PCR ob enido po ampli icación con los cebado es
Bo/Boas se digie e con la enzima BglI. Es a es ic asa p oduce dos pe iles de es icción
di e en es: una banda de 300 pb pa a B. exi iosa y dos bandas de 120 pb y 180 pb pa a B.
os eae (Hine e al., 2001a, Cochennec-Lau eau e al., 2003a). O os p o ocolos de PCR
pa a Bonamia spp. basados en la egión SSU, son los desc i os po Ma y e al. (2006)
empleando una pa eja de cebado es denominada BO-1/BO-4, que ampli ican 237 pb, y po
Abollo e al. (2008) quienes diseña on los cebado es BOG-F/BOG-R, que dan luga a un
ampli icado de ap oximadamen e 665 pb. Es e úl imo p o ocolo pe mi e la iden i icación
especí ica de B. exi iosa y B. os eae si el p oduc o de PCR es dige ido con la enzima de
es icción SalI, que p oduce dos pe iles de es icción di e en es pa a ambas: dos bandas
de 319 y 350 pb pa a B. exi iosa y una única banda de 665 pb pa a B. os eae (Abollo e al.,
2008). Ca negie e al. (2006) ambién diseña on un p o ocolo de PCR pa a de ec a B.
pe spo a, aunque su especi icidad no se e aluó en e a o as especies de Bonamia.
Ac ualmen e exis en es p o ocolos de PCR en iempo eal ecomendadas po la
OIE pa a el diagnós ico de la bonamiosis. Los p ocedimien os desc i os po Co beil e al.
(2006b) y Ma y e al. (2006) emplean sondas TaqMan y ampli ican odas las especies del
géne o. La p ueba desc i a po Robe e al. (2009) emplea SYBR G een como luo o o o y
pe mi e la de ección y cuan i icación especí ica de B. os eae. Engelsma y Voo be gen-
Laa man (2009) basándose en el diseño de Co beil e al. (2006b), desc ibie on un nue o
p o ocolo de PCR en iempo eal empleando SYBR G een. Median e es a nue a PCR,
Ca asco e al. (2012a) iden i ica on, en una única p ueba, B. os eae y B. exi iosa en base a
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
46
los di e en es alo es de Tm que p esen a cada una de las especies (B. os eae 78.5 ºC y B.
exi iosa 79.8 ºC). Sin emba go, la p oximidad de ambos alo es hace que es e mé odo sólo
sea álido pa a ealiza un diagnós ico p esun i o a ni el de especie y que la iden i icación
deba co obo a se median e o as p uebas más especí icas (Ca asco e al., 2012a).
Se han desa ollado a ios p o ocolos de ISH pa a la de ección de Bonamia spp. en
co es his ológicos. Po un lado, los cebado es Bo/Boas desc i os an e io men e se usa on
pa a sin e iza una sonda polinucleo ídica que lle a inco po ada digoxigenina (Cochennec
e al., 2000). Tan o la especi icidad como la sensibilidad de es a sonda son más ele adas
que las del diagnós ico po his ología con encional. Sin emba go, es a sonda mues a
eacción c uzada con o as especies de Bonamia y o os Haplospo ida. Ca negie e al.
(2003a) diseña on o o p o ocolo de ISH basado en la egión ITS1 de B. os eae, usando un
conjun o de es oligosondas ma cadas con luo esceína (UME-BO-1, 2, 3), con el obje i o
de aumen a la sensibilidad, que mos ó se mayo que la sensibilidad del mé odo
his ológico. Sin emba go, es as sondas p esen an eacción c uzada con B. exi iosa. O os
au o es ambién usa on un conjun o de es oligosondas (CaBon166, CaBon461,
CaBon1704) ma cadas con digoxigenina pa a el clado B. exi iosa- B. oughleyi, pe o no
e alua on la especi icidad ni la sensibilidad de las mismas (Hill e al., 2010). Ca negie e al.
(2006) diseña on un conjun o de 4 oligosondas con ma caje luo escen e (B. pe spo a-ISH-
1, 2, 3, 4) pa a iden i ica B. pe spo a en los ejidos de os a O. s en ina y conoce las
p e e encias celula es y isula es del pa ási o. Es e p o ocolo de ISH se p obó en e a
ejidos de os a C. a iakensis pa asi ada po B. exi iosa y sus esul ados ue on nega i os.
Sin emba go, su especi icidad en e a B. os eae y o os haplospó idos es desconocida.
3.2.2. Géne o Pe kinsus
La OIE ecoge en su Manual de Tes Diagnós icos pa a Animales Acuá icos las
écnicas molecula es ecomendadas pa a las dos especies de Pe kinsus lis adas po es a
o ganización, P. ma inus y P. olseni, en e los que se encuen an a ios p o ocolos de PCR.
Es e o ganismo ecomienda, pa a la igilancia del géne o Pe kinsus y de la especie P.
ma inus, ealiza un p ime análisis de PCR con los cebado es gené icos Pe kITS-
750/Pe kITS-85 (Casas e al., 2002), y una segunda p ueba con los cebado es Pma ITS-
70F/Pma ITS600R pa a iden i ica P. ma inus (Audema d e al., 2004b). En el caso de P.
olseni, la OIE ecomienda el uso de dos p o ocolos de PCR cuya diana es la egión NTS de
es a especie, localizada en e el gen ibosómico 5S y el gen SSU. La p ime a pa eja de
cebado es, PA690F/PA690R ampli ican un agmen o de 690 pb de dicha egión (Robledo
e al., 2000) y su especi icidad se e aluó en e a P. ma inus y P. chesapeaki, pe o no en e
a o as especies. La sensibilidad analí ica de es a écnica mues a que su lími e de
de ección es bajo, aunque no se ha e aluado en e al mé odo de cul i o en caldo
ioglicola o (RFTM). La segunda pa eja de cebado es, PK1/PK2, ampli ica un agmen o de
554 pb de la egión NTS de P. olseni, pe o su especi icidad y sensibilidad no se han
es udiado (De la He án e al., 2000). Exis en o os p o ocolos de PCR con encional
especí icos pa a el géne o Pe kinsus (Robledo e al., 2002; Gau hie e al., 2006) y pa a P.
ma inus y P. olseni que no es án ecogidos po la OIE en su manual (Fong e al., 1993;
Ma sh e al. 1995; Hamaguchi e al., 1998; Robledo e al., 1998; Pa k e al., 2002; Peche e
In oducción gene al
47
al., 2008). También se ha desa ollado un p o ocolo de PCR pa a el diagnós ico especí ico
de P. chesapeaki, usando como diana la egión NTS del pa ási o. La especi icidad de sus
cebado es, NTS6/NTS7, se e aluó en e a P. ma inus y P. olseni y su sensibilidad analí ica
se mos ó al a, de ec ando can idades de has a 100 g de ADN del pa ási o (Coss e al.,
2001b). Moss e al. (2008) desa olla on un p o ocolo especí ico pa a P. beihaiensis que
ampli ica un agmen o de su egión ITS1-5.8S-ITS2. Los cebado es diseñados, Pe kITS-
85/Pe kITS-430R, se es a on en e a las es an es especies de Pe kinsus, en e a algunos
dino lagelados y haplospó idos, mien as que su sensibilidad analí ica no se e aluó.
Asimismo, se diseña on unos cebado es especí icos pa a P. qugwadi, denominados
PqguF7TC/PQ3R, que ampli ican un agmen o de 281 pb de la egión ITS1-5.8S-ITS2 de
es e pa ási o (I oh e al., 2013). Es e es no ampli ica ADN de ninguna o a especie de
Pe kinsus, excep o una banda enue de P. chesapeaki de amaño mayo (300 pb). Es a
p ueba mues a unos lími es de de ección bajos y su sensibilidad es supe io a la del
diagnós ico po his ología. En la ac ualidad no exis en p o ocolos de PCR pa a la de ección
especí ica de P. medi e aneus, ni pa a P. honshuensis, lo que acili a ía un diagnós ico más
ápido y sensible de es as especies.
Se han desa ollado p o ocolos PCR-RFLPs ú iles pa a la iden i icación de a ias
especies de Pe kinsus, en e ellos el desc i o po Abollo e al. (2006) y ecomendado po la
OIE. En es a p ueba el p oduc o de 703 pb ampli icado con los cebado es Pe kITS-
750/Pe kITS-85 (Casas e al., 2002), es dige ido con la enzima RsaI p oduciendo un pa ón
de bandas especí ico pa a P. ma inus, P. chesapeaki y P. olseni/P. medi e aneus. A su ez, P.
olseni y P. medi e aneus pueden di e encia se median e es icción con la endonucleasa
Hin I. Se ha publicado o o p o ocolo de RFLP diseñado pa a di e encia P. olseni de P.
honshuensis p esen es en la almeja japonesa, usando la enzima de es icción DdeI
(Takahashi e al., 2009). Sin emba go, la diana de DdeI se si úa en una zona polimó ica
den o de la egión ITS de P. olseni, y algunas a ian es de es a especie no dan el pe il
espe ado (Ramilo e al., da os no publicados).
Penna e al. (2001) diseña on un p ocedimien o de PCR mul iplex pa a la
de ección de P. ma inus, Haplospo idium nelsoni y Haplospo idium cos ale, esponsables de
las ele adas mo alidades de la os a C. i ginica. Pos e io men e, Russell e al. (2004)
diseña on una PCR mul iplex mejo ada pa a de ec a es as especies pa ási as que pe mi e,
a su ez, de ec a el ADN del hospedado C. i ginica, que si e de con ol in e no de PCR
pa a e i a alsos nega i os.
También se han desc i o a ios p o ocolos de PCR en iempo eal pa a la
cuan i icación de pa ási os del géne o Pe kinsus. El p ime o de ellos emplea el luo ó o o
SYBR G een y los cebado es Pe kITS-750/Pe kITS-85, desc i os po Casas e al. (2002),
mos ando una sensibilidad mayo que la PCR con encional desc i a po es os au o es
(Audema d e al., 2004b). La segunda PCR en iempo eal se a a de una p ueba TaqMan
en el que se diseñan nue os cebado es especí icos pa a el géne o Pe kinsus, PERK-
F/PERK-R, y una sonda ma cada luo escen emen e que hib ida con el agmen o
ampli icado (Gau hie e al., 2006). Su sensibilidad y especi icidad es mayo que la del
RFTM, muy usado pa a el diagnós ico de pe kinsosis (Ray, 1966). Además, se ha
desa ollado un p o ocolo de PCR en iempo eal dúplex, capaz de de ec a y cuan i ica
simul áneamen e y de o ma especí ica Haplospo idium spp. y Pe kinsus spp. Dos pa ejas

Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
48
de cebado es especí icos pa a cada géne o, jun o con sondas de hib idación pa a cada
agmen o ampli icado, pe mi en la de ección de es os dos géne os en una única p ueba
(Xie e al., 2013). La especi icidad de es a écnica se e aluó en e a pa ógenos como M.
e ingens, Toxoplasma gondii, B. os eae, Esche ichia coli, Cymndinium spp., M. mackini o
Vib io pa ahaemoly icus y su sensibilidad analí ica ue al a (200 copias de ADN ). Pa a P.
ma inus se han diseñado a ios p o ocolos de PCR en iempo eal, como los de Audema d
e al. (2004b), Gau hie e al. (2006), Ul ich e al. (2007) y De Fa e i e al. (2009). También
se ha desa ollado un p o ocolo pa a cuan i ica P. olseni y o o pa a P. honshuensis
(Umeda e al. 2012). No se han desc i o p o ocolos de PCR en iempo eal que pe mi an
cuan i ica P. chesapeaki, P. medi e aneus, P. beihaiensis y P. qugwadi.
Pa a el géne o Pe kinsus, la OIE ecomienda un p o ocolo de ISH desa ollado po
Els on e al (2004). La oligosonda (Pe ksp700DIG) de ADN, complemen a ia a la SSU de
Pe kinsus spp., lle a un ma caje de digoxigenina en su ex emo 5´. La especi icidad de es e
p o ocolo se e aluó en e a a ias especies de Pe kinsus y a pa ási os haplospó idos y
dino lagelados. Es e mé odo es más sensible que la his ología, pe o no se ha compa ado
con el RFTM. Se ha desc i o o a oligosonda que mues a especi icidad a ni el de géne o,
PK-5.8S-DIG, diseñada en la egión 5.8S de Pe kinsus spp. La especi icidad de es a sonda
se e aluó en e a o os pa ógenos de moluscos como Minchinia ape is, Ricke sias,
mic ospo idios, Nema opsis sp., hemog ega inas y coccidios (Na as, 2008). A ni el de
especie se han desa ollado p o ocolos de ISH especí icos pa a P. ma inus, P. chesapeaki, P.
olseni y P. beihaiensis. El p ime o de ellos, diseñado pa a de ec a P. ma inus, es uno de los
mé odos ecomendados po la OIE pa a la con i mación de es e pa ási o (Moss e al.,
2006). Pa a la de ección de P. olseni ambién se ha desa ollado un p o ocolo de ISH
especí ico pa a la especie, median e la sonda PK-IGS-DIG que hib ida en la egión IGS. La
especi icidad de es a sonda se demos ó en e a P. chesapeaki, P. medi e aneus y P.
ma inus (de la He án, 1998; de la He án e al., 2000; Na as, 2008). O as dos oligosondas
con ma caje de digoxigenina y diseñadas en base a la egión LSU de P. beihaiensis y P.
chesapeaki son Pe kBehLSU (Moss e al., 2008) y PchesLSU-485 (Reece e al., 2008),
espec i amen e. Su especi icidad se ha demos ado en e a o as especies de Pe kinsus.
Basándose en es a egión, Reece e al. (2008) ambién diseña on un g upo de dos sondas
ma cadas luo escen emen e especí icas pa a P. chesapeaki (PchesLSU-485 y P. chesLSU-
690) y o o g upo de es sondas especí icas pa a P. ma inus (Pma LSU-181, Pma LSU-420
y Pma LSU-560). El uso de más de una sonda aumen a la sensibilidad de la écnica y el
ma caje con dis in os luo ó o os pe mi e de ec a a ias especies en una misma p ueba.
No se han desa ollado p o ocolos de ISH especí icos pa a P. medi e aneus, P. honshuensis
y P. qugwadi.
3.2.3. Géne o Ma eilia
El p ime p o ocolo de PCR desc i o pa a el diagnós ico de la ma eiliosis ue el
desa ollado po Ande son e al. (1995). Pos e io men e, en base a es a secuencia, se
diseña on los denominados LEG1/PRO2, que ampli ican un agmen o de 195 pb den o
de la egión ITS1 de M. sydneyi (Kleeman y Adla d, 2000). Es os cebado es especí icos son
los ecomendados po la OIE pa a el diagnós ico de es a especie median e PCR, aunque el
In oducción gene al
49
p o ocolo no se ha alidado en e a la his opa ología. Su especi icidad se ha demos ado
en e a M. e ingens y Ma eilioides chungmuensis (Kleeman e al., 2002b) y su
sensibilidad es al a (Kleeman y Adla d, 2000).
En 1999, se publicó el p ime p o ocolo de PCR pa a la de ección especí ica de M.
e ingens (Le Roux e al., 1999). Es os au o es diseña on un g upo de cebado es
especí icos a ni el de especie y los combina on en e ellos y con cebado es uni e sales.
En e es as combinaciones las pa ejas de cebado es SAS2/SS2 y SAS1/SS2, de ec a on
especí icamen e M. e ingens. La especi icidad de es os cebado es ambién se e aluó
en e a M. sydneyi y M. chungmuensis (Kleeman e al., 2002b). Sin emba go, el ADN de la
nue a especie M. cochillia ambién se ampli ica con los cebado es SAS1/SS2, lo que
demues a que no son especí icos a ni el de especie (Ca asco e al., 2012b). Be he e al.
(2000) u iliza on o os dos cebado es desc i os po Le Roux e al. (1999), CAS2/SS1, pa a
ampli ica la egión comple a SSU del ADN de M. e ingens. La OIE, ecomienda el mé odo
desc i o po Le Roux e al. (2001), conside ándolo un p o ocolo especí ico pa a es a
especie, ya que la egión ITS1 es más iable pa a una de ección a ni el de especie. Sin
emba go, es e p o ocolo (empleando los cebado es P 3/PR4/P 5) ambién ampli ica la
ecien emen e desc i a M. cochillia (Ca asco e al., 2012b). Además de los p o ocolos
desc i os, se han publicado un pa de p o ocolos de PCR anidada pa a el diagnós ico de M.
e ingens, los desc i os po Pe nas e al. (2001) y López-Flo es e al. (2004). Es e úl imo
se diseñó pa a ampli ica un agmen o de la egión IGS de M. e ingens median e los
cebado es MT1/MT2 pa a la p ime a onda de PCR y MT2B/MT1B pa a la segunda onda
PCR. Es e p o ocolo es más sensible que las PCR con encionales desc i as pe o, al igual
que en los casos an e io es, es os cebado es ambién ampli ican la IGS de M. cochillia
(Ca asco e al., 2012b), lo que pone de mani ies o que las p uebas de PCR desc i as pa a
el diagnós ico de Ma eilia e ingens no son especí icas a ni el de especie.
Ac ualmen e exis en dos p o ocolos de PCR-RFLPs desc i os pa a disc imina
especies de Ma eilia. El p ocedimien o desc i o po Le Roux e al. (2001) pe mi e
di e encia en e M. e ingens y M. mau ini, pe o ac ualmen e es á en desuso ya que se
conside an la misma especie. También se ha desc i o un p ocedimien o de PCR-RFLPs
pa a di e encia en e M. e ingens y M. cochillia. T as la ampli icación con los cebado es
MT2B/MT1B (López-Flo es e al., 2004), se ealiza la p ueba de es icción con la enzima
BglII. Es a enzima p oduce un pe il de dos bandas pa a M. cochillia (192 y 166 pb) y una
única banda pa a M. e ingens (358 pb) (Ca asco e al., 2012b).
Exis en a ios p o ocolos de ISH desc i os pa a M. e ingens y M. sydneyi que
emplean sondas polinucleo ídicas sin e izadas empleando los cebado es ya desc i os en el
apa ado an e io , a los cuales se les inco po a un ma caje con digoxigenina. Una de es as
sondas es la denominada Sma 2, elabo ada con los cebado es SAS1/SS2 (Le Roux e al.,
1999). Es e p o ocolo no de ec a sólo M. e ingens, sino que p obablemen e de ec e odas
las especies de es e géne o y o os (Kleeman e al., 2002b; Ca asco e al., 2011). Es e
p o ocolo de ISH es el ecomendado po la OIE pa a M. sydneyi y M. e ingens, sin emba go
sólo se ha alidado en e a la écnica his ológica pa a la segunda especie (OIE, 2012c),
mos ando una especi icidad del 90% y una sensibilidad del 99% en e a es a écnica
(Thébaul e al., 2005). La OIE ambién ecoge el p o ocolo de ISH desc i o po López-
Flo es e al. (2008a,b), cuya especi icidad aún es á sin e alua (OIE, 2012c). O os
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
50
p o ocolos de ISH diseñados pa a M. e ingens menos u ilizados son los desa ollados po
Be he e al. (2000) y po Pe nas e al. (2001). Pa a la especie M. sydneyi, la OIE
ecomienda, además de la sonda gené ica Sma 2 ya desc i a, la sonda diseñada con los
cebado es PRO2-LEG1 que se unen a su egión ITS1 (Kleeman y Adla d, 2000). Es a sonda
no mues a eacción c uzada con M. e ingens ni M. chungmuensis, po lo que
p obablemen e sea especí ica de M. sydneyi (Kleeman e al., 2002b).
3.2.4. Géne o Mik ocy os
La al a de secuencias de M. mackini, única especie del géne o conocida du an e
años, y la ecien e desc ipción de nue as especies ha limi ado el desa ollo de mé odos de
diagnós ico molecula es pa a es e géne o. La p ime a secuencia de ADN que se ob u o de
M. mackini se gene ó a pa i de su gen 18S (Ca negie e al., 2003b). A pa i de es a egión
de 1.457 pb, se diseñó la única p ueba de PCR u ilizada du an e años pa a el diagnós ico
de es e pa ási o. Los cebado es MIKROCYTOS-F/MIKROCYTOS-R de es e p o ocolo
ampli ican un agmen o de 544 pb y su sensibilidad en e a la his ología es mucho mayo .
Recien emen e, se ha obse ado que es os cebado es ambién ampli ican el ADN de las
nue as especies de Mik ocy os desc i as (Gagné e al., 2008; Wang e al., 2008; Abbo e
al., 2011, 2014), lo que indica que es e p o ocolo no es especí ico pa a la especie M.
mackini, aunque ampoco ampli ica odas las especies del géne o como es el caso de M.
mimicus. Gagné e al. (2008) diseña on una pa eja de cebado es que ampli ican ADN de M.
mackini y el pa ási o Mik ocy os sp. desc i o in ec ando O. edulis de Nue a Escocia
(Canadá), y o as dos pa ejas de cebado es que de ec an de o ma especí ica cada uno de
ellos. Sin emba go, ampli ican egiones pequeñas de ADN y no es án es adas en e a
o as especies de Mik ocy os. Abbo e al. (2011) apo a on nue os cebado es que
pe mi en la ca ac e ización molecula del ándem 18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S de M. mackini y
M. bowe i. Es os cebado es ambién ampli ican Mik ocy os sp. de D. unculus de F ancia
(Abbo y Meye , 2014). Se ecomienda el uso de las pa ejas Mm18SF1/Mm18S1403R,
Mm18S_120F/Mm18S1403R o Mm18SF1/Mm18S_1450R pa a la ampli icación de un
agmen o supe io a 1000 pb del gen 18S ADN de las especies del géne o Mik ocy os y la
pa eja Mm18S_1435F/p o28SR pa a la ampli icación de su egión ITS1-5.8S-ITS2-28S
(Abbo e al., 2014). Se ha diseñado un p o ocolo de PCR anidada especí ico pa a
mic ocí idos que, jun o con una pos e io secuenciación, puede se ú il pa a de ec a odas
las especies del géne o Mik ocy os (Ha ikainen e al., 2014b). Es e p o ocolo ha pe mi ido
la de ección de M. mimicus.
La ecien e ca ac e ización de la egión ITS-ADN de M. mackini ha pe mi ido
desa olla un p o ocolo de PCR en iempo eal, empleando sondas TaqMan,
complemen a ias a la egión 5.8S-ITS2 de es a especie (Polinski e al., 2015). La
especi icidad de es a p ueba se es ó en e a M. bowe i, P. cance i y o os pa ógenos de
moluscos y su sensibilidad analí ica es al a, demos ándose que de ec a muchos más casos
posi i os que la PCR con encional (Ca negie e al., 2003b) y que la his opa ología.
El p ime p o ocolo de ISH especí ico pa a M. mackini consis ió en un conjun o de
cua o oligosondas de ISH ma cadas con luo escencia, que hib idaban de o ma
sa is ac o ia en la SSU del ADN de es e pa ási o. Es e p o ocolo de FISH se modi icó
In oducción gene al
51
pos e io men e pa a ealiza lo usando solamen e una sonda de ISH, de las cua o
desc i as po Ca negie e al. (2003b), con un ma caje de digoxigenina (Meye e al., 2005).
La especi icidad de es a sonda se e aluó en e a o os pa ási os de moluscos y su
sensibilidad ue mejo que la mos ada po la his ología. Sin emba go, la especi icidad de
es as oligosondas debe ía de es a se en e a las nue as especies de Mik ocy os desc i as.
Se ha diseñado ambién un p o ocolo de ISH pa a Mik ocy os sp. de ec ado en O. edulis de
Canadá (Gagné e al., 2008). En base a la egión SSU del ADN de es e pa ási o, se diseñó
una sonda polinucleo ídica, median e PCR e inco po ación de digoxigenina a los p oduc os
ampli icados. Es a sonda ambién hib ida con M. mackini y debe ía es a se ambién en e
a o as especies de Mik ocy os.

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DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS
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Species-speci ic diagnos ic assays o Bonamia
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DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS
Dis Aqua O g
Vol. 110: 81–91, 2014
doi: 10.3354/dao02646 Published July 24
Species-speci ic oligonucleo ide p obe o
de ec ion o Bonamia exi iosa (Haplospo idia)
using in si u hyb idisa ion assay
And ea Ramilo
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, An onio Villalba
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1Cen o de In es igacións Ma iñas, Conselle ía do Medio Ru al e do Ma , Xun a de Galicia, 36620 Vilano a de A ousa, Spain
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Con ibu ion o DAO Special 7 'Mic ocell pa asi es o molluscs'
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DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS
Dis Aqua O g
Vol. 110: 123–133, 2014
doi: 10.3354/dao02673 Published July 24
Oys e pa asi es Bonamia os eae and B. exi iosa
co-occu in Galicia (NW Spain): spa ial dis ibu ion
and in ec ion dynamics
And ea Ramilo
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, Ma González
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, Ma ía J. Ca ballal
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, Susana Da iba
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, An onio Villalba
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1Cen o de In es igacións Ma iñas (CIMA), Conselle ía do Medio Ru al e do Ma , Xun a de Galicia,
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2Ins i u o Tecnolóxico pa a o Con ol do Medio Ma iño de Galicia (INTECMAR), Conselle ía do Medio Ru al e do Ma ,
Xun a de Galicia, 36611 Vilaga cía de A ousa, Spain
3Cen o Tecnológico del Ma — Fundación CETMAR, 36208 Vigo, Spain
Con ibu ion o DAO Special 7 ‘Mic ocell pa asi es o molluscs’

S
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Jou nal o In e eb a e Pa hology 125, 37-41. 2015
Au o es: A. Ramilo, N. Ca asco, K. S. Reece,
J. M. Valencia, A. G au, P. Acei uno, M. Rojas, I.
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(En e isión)
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Sho Communica ion
Upda e o in o ma ion on pe kinsosis in NW Medi e anean coas :
Iden ifica ion o Pe kinsus spp. (P o is a) in new loca ions and hos s
And ea Ramilo
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, Noelia Ca asco
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, Kimbe ly S. Reece
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, José M. Valencia
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, Amalia G au
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Pa icia Acei uno
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, Mau icio Rojas
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IRTA-San Ca les de la Ràpi a and Ca alonia’s Aquacul u e R&D and Inno a ion Re e ence Ne wo k (XRAq), C a. Poblenou Km 5, 43540 San Ca les de la Ràpi a, Spain
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Vi ginia Ins i u e o Ma ine Science, The College o William and Ma y, Glouces e Poin , VA 23062, USA
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Labo a o i d’In es igacions Ma ines i Aqüicul u a (LIMIA), D.G. Medi Ru al i Ma í, Go e n Balea , Po d’And a x, 07158 Mallo ca, Spain
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Cen o Tecnológico del Ma -Fundación CETMAR, Edua do Cabello s/n, 36208 Vigo, Spain
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Con en s lis s a ailable a ScienceDi ec
Jou nal o In e eb a e Pa hology
jou nal homepage: www.else ie .com/loca e/jip
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
110
e hidium b omide o 15 min and insed o 20 min in dis illed wa e . PCR p oduc s
de i ed om in i o cul u ed cells o P. olseni, P. chesapeaki, P. ma inus and P.
medi e aneus we e included in all gels as e e ence o each species. DGGE gels we e
scanned in a GelDoc XR documen a ion sys em (BioRad). To con i m he speci ic iden i y,
di e en pa e ns o bands we e cu ou wi h a s e ile scalpel. All bands we e washed wi h
200 µl o s e ile wa e and DNA was elu ed in 50 µl o he same solu ion a 4 ºC o 5 days.
A e his, 5 µl o each band we e e-ampli ied using he p ime Pe kLSU-R/Pe kLSU-F
wi hou he GC clamp, using he same condi ions desc ibed abo e, and hen p ocessed o
sequencing.
2.4.2. Cha ac e isa ion o ITS egion o P. chesapeaki-like pa asi e
The posi i e samples o P. chesapeaki-like pa asi e ob ained by PCR-DGGE, we e
nega i e o his pa asi e by PCR-RFLPs because he p oduc o PCR assay ob ained was
insu icien . To know he sequence o he ITS egion o his p esump i e P. chesapeaki
pa asi e, hese PCR p oduc s we e cloned and sequenced bu he esul s we e also
nega i e o P. chesapeaki-like pa asi e (da a no shown). Then, we decided o design new
p ime s (Pe kITS2-F/Pe kITS2-R) on he 5.8S-ITS2 egion o Pe kinsus species (Table 2),
which ampli ied a smalle agmen o 375 bp included in he sequence ampli ied o he
genus speci ic p ime s Pe kITS750/85, used in he PCR-RFLPs assay. PCR assays wi h new
p ime s we e pe o med ollowing he same condi ions desc ibed in he PCR-DGGE assay.
PCR p oduc s we e liga ed and cloned acco ding o Ramilo e al. (2015) and en clones
we e p ocessed o sequencing.
2.4.3. Sequencing and phylogene ic analyses.
PCR p oduc s we e pu i ied o sequencing using ExoSap-I (Usb) o 15 min a
37ºC, ollowed by inac i a ion o 15 min a 80 ºC. Sequencing was pe o med in a
specialised se ice (Secugen, Mad id). Ch oma og ams we e analysed using Ch omasP o
.1.41 Technelysium P y L d. All gene a ed sequences we e sea ched o iden i y using
BLAST (Basic Local Alignmen Sea ch Tool) h ough web se e s o he Na ional Cen e o
Bio echnology In o ma ion (h p://www.ncbi.nlm.nih.go /). Mul iple aligmen s based on
ITS egion and LSU DNA o he P. chesapeaki-like pa asi e and o P. olseni we e pe o med
using all he sequences ob ained in his s udy and o he s a ailable om GenBank (Table
3). Aligmen s we e pe o med using Clus al W (Thompson e al., 1994) included in MEGA6
(Tamu a e al., 2013). Maximum-likelihood analysis implemen ed in MEGA6 so wa e was
used o gene a e phylogene ic ees. Kimu a 2-pa ame e model was ound he mos
app op ia e e olu iona y model o bo h analyses. The boo s ap alues we e calcula ed
om 2,000 eplica es.

Sección II: Pe kinsosis
111
2.4.4. In si u hyb idisa ion (ISH) assay
An ISH assay was ca ied ou wi h sec ions o he clams p e iously diagnosed
posi i e o P. chesapeaki, using he species-speci ic PchesLSU-485 digoxigenin-labelled
p obe (Reece e al., 2008), o con i m he p esence o his pa asi e in clam R. philippina um
issues. Se ial issue sec ions (5 μm hick) we e p oduced so ha one sec ion was used o
ISH assay and ano he sec ion was s ained wi h Ha is´ haema oxylin and eosin (H&E)
(Howa d e al., 2004) in o de o iden i y and localise he pa asi e. ISH assay was
pe o med as desc ibed by Ramilo e al. (2014).
3. Resul s
3.1. Dis ibu ion o pe kinsosis in loca ions and clam species
Resul s p o ided by PCR using Pe kITS750/Pe kITS85 genus-speci ic p ime s ga e
posi i e ampli ica ion in 144 o he 480 analysed clams. PCR-posi i e cases o pe kinsosis
we e de ec ed in 9 o he 15 sampled loca ions (Table 4). The highes pe cen age o
posi i e cases co esponded o samples o clams R. decussa us and V. co uga a, wi h
anges om 0% o 73.3% and 0% o 93.3%, espec i ely (Table 4). Clam R. philippina um
samples showed lowe pe cen ages ( ange 0% - 46%), while no PCR-posi i e case was
de ec ed in clams P. homboides (Table 4).
3.2. Sc eening o Pe kinsus spp. by PCR-RFLP
RFLPs allowed iden i ying 91 clams in ec ed by P. olseni acco ding o es ic ion p o iles
ob ained wi h RsaI (413, 193 and 74 bp) and Hin I (363, 160, 150 bp) endonucleases.
Ampli ied DNA om 53 clams was insu icien o allow subsequen RFLP analysis.
3.3. Sc eening o Pe kinsus spp. by PCR-DGGE
DNA o all he p e ious Pe kinsus PCR-posi i e clams (n= 144) and DNA ex ac ed
om in i o Pe kinsus spp. cul u es yielded amplicons o 269 bp by PCR using Pe kLSU-
F/Pe kLSU-R wi h CG clamp. Ne e heless, PCR assays p oduced amplicons wi h
insu icien amoun o DNA o allow subsequen DGGE analysis in 34 ou o 144 cases
(Table 4). Ampli ied p oduc s co esponding o 110 clams we e loaded on gels made wi h
di e en concen a ion o polyac ylamide and g adien u ea- o mamide. Gels made wi h
6% polyac ylamide and he dena u ing g adien s o 20-80% and 30-70% did no allow
es ablishing a clea pa e n o bands speci ic o each species o Pe kinsus included as
posi i e con ol, because nume ous and coinciden bands among species we e ob ained.
Gels wi h 8% polyac ylamide and a dena u ing g adien o 20-80% yielded he same
esul s. Howe e , when DGGE assay was pe o med in 8% polyac ylamide gels wi h a
dena u ing g adien o 30-60%, a di e en ial, clea band pa e n was ob ained o
cul u ed cells o P. ma inus, P. chesapeaki, P. medi e aneus and P. olseni (Fig. 2); in all he
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
112
cases, an in ense band, which mig a ed o di e en posi ion o each species, was
iden i ied; mo eo e o he weake bands comple ed he di e en ial pa e n o each
species. Rega ding clam DNA samples, all showed an in ense band ma ching ha ob ained
o P. olseni cul u ed cells (Fig. 2, lanes 5 o 18). Howe e , wo Manila clams R.
philippina um om A cade addi ionally showed ano he less in ense band ma ching ha
o P. chesapeaki cul u ed cells (Fig. 2, lanes 19 and 20)..
3.4. Sequence and phylogene ic analyses
The ITS sequences ob ained o he eigh andom PCR p oduc s ob ained by gene ic
PCR assay wi h he p ime s Pe kITS750/85 con i med he esul s obse ed by RFLP assay
and sha ed 99-100% nucleo ide iden i y wi h o he P. olseni sequences deposi ed in
GenBank, wi h a que y co e age o 100% in all o cases.
All he bands (weak and in ense) o DGGE gels co esponding o cul u ed cells o
Pe kinsus species showed iden i y alues o 99-100% wi h he expec ed Pe kinsus species.
LSU sequences ob ained om clam DNA samples whose bands ma ched ha o P. olseni in
PCR-DGGE assay, sha ed 99-100% nucleo ide iden i y wi h LSU sequences o P. olseni
deposi ed in GenBank (100% que y co e age). LSU sequences co esponding o he band
pa e n o P. chesapeaki showed 100% nucleo ide iden i y wi h P. chesapeaki om F ance
and 98-100% iden i y wi h o he P. chesapeaki om USA (100% que y co e age).
Th ee o he en clones ha we e sequenced o know he ITS egion o he
p esump i e P. chesapeaki pa asi e showed 99% iden i y o 5.8S-ITS2 sequences o P.
chesapeaki om Ca alonia (E. Spain) (100% que y co e age), 99-100% iden i y wi h P.
chesapeaki om F ance (93-95% que y co e age) al hough hey displayed 94%-96 %
iden i y wi h o he P. chesapeaki sequences om USA and Aus alia deposi ed in GenBank
(98%-100% que y co e age). The emaining se en clones sha ed 99-100% wi h P. olseni
sequences, con i ming he mixed in ec ion P. olseni-P. chesapeaki in he wo Manila clams
om A cade also de ec ed by PCR-DGGE assay.
An ITS ee cons uc ed wi h a o al o 242 si es and 67 sequences showed ha P.
olseni sequences om Galicia g ouped in a clade wi h o he P. olseni sequences wi h
boo s ap alues o 93%. Fu he mo e, he P. chesapeaki sequence om Galicia was
included in P. chesapeaki clade, wi h boo s ap alues o 99% (Fig. 3). Wi hin his P.
chesapeaki clade, wo main subclades could be dis inguished, one o hese subclades
co esponded o sequences om No h Ame ican and Aus alia and he o he one
included sequences om Eu ope (Spain and F ance), o ming one clade wi h boos ap
alues 94%, while ano he clade wi h sequences om No h Ame ica had boos ap alues
o 85% (Fig. 3).
A LSU ee was cons uc ed using 159 si es and 28 sequences. Phylogene ic
analysis on he LSU showed ha P. olseni om Galicia was included in he same clade wi h
o he P. olseni sequences wi h boos ap alues 95%. The P. chesapeaki sequence om
Galicia g ouped in he same clade wi h o he P. chesapeaki sequences wi h boo s ap
alues o 92% (Fig. 4). The LSU analysis was unin o ma i e, and all sequences belonging o
P. medi e aneus and P. honshuensis o med an un esol ed single clade. The sequences o
Sección II: Pe kinsosis
113
P. chesapeaki om Galicia clus e ed oge he wi h o he P. chesapeaki sequences, bu all
he ing oup sequences o med a single clade.
All he Pe kinsus sequences epo ed in his wo k ha e been deposi ed in he
GenBank unde he accession numbe s: KP764676-KP764683 (ITS P. olseni), KP764684-
KP764686 (ITS P. chesapeaki), KP764687-KP764689 (LSU P. olseni), and KP764690-
KP764691 (LSU P. chesapeaki).
3.5. Visualisa ion o Pe kinsus chesapeaki
The PchesLSU-485DIG p obe speci ic o P. chesapeaki was ound o hyb idise on R.
philippina um sec ions (Fig. 5A), showing a s ong eac ion. The hyb idisa ion signal
co esponded o Pe kinsus-like pa asi es in he adjacen sec ion s ained wi h H&E; P.
chesapeaki appea ed encapsula ed by haemocy es in he connec i e issue o he diges i e
gland o he hos (Fig. 5B).
4. Discussion
Resul s o he su ey con i med ha pe kinsosis is widely dis ibu ed along he
Galician coas and sugges ed highe p e alence in R. decussa us and V. co uga a han in R.
philippina um, while no case was de ec ed in P. homboides. Balsei o e al. (2010) ound
highe p e alence in R. decussa us and R. philippina um om Galicia han in V. co uga a
( e e ed as Vene upis pullas a), while only one PCR-posi i e case was de ec ed in P.
homboides wi hou his ological con i ma ion. Thus, P. homboides seems o be less
suscep ible o pe kinsosis han he o he s udied clam species, al hough pe kinsosis had
been de ec ed in clams P. homboides om Galicia by RFTM (AV, unpublished esul s) and
om Andalusia (S. Spain) (Na as, 2008).
A PCR-DGGE me hod o disc imina e Pe kinsus species was designed and
success ully applied in his su ey. Gas e al. (2006, 2008) applied DGGE o de ec he
p o is an QPX in he ha d clam M. me cena ia and hey ob ained a simila pa e n band,
wi h an in ense band and weake bands o one species. The occu ence o mul iple bands
in he Pe kinsus spp. pa e ns could ep esen in aspeci ic a iabili y due o he exis ence
o mul iple sligh ly di e en copies o he RNA clus e (Dungan e al., 2002; Peche e al.,
2004), mul iple in ec ions o di e en s ains om Pe kinsus and could be also due o a
clonal s uc u e o Pe kinsus spp. popula ion wi h a e bu possible gene ic ecombina ion
be ween loci o he clones (Tibay enc e al., 1990; Tibay enc and Ayala, 2002) o could
indica e he exis ence o sexual ep oduc ion in Pe kinsus, wi h he e ozygo ic indi iduals
(Reece e al., 1997, 2001; Robledo e al., 1999; Thompson e al., 2011; Vilas e al., 2011).
These sligh a ia ions in he sequences o DNA could be gi ing ise o homoduplex
molecules, consis ing o complemen a y s ands syn hesised in he PCR cycle, and o
he e oduplex molecules c ea ed by he union o s ands wi h li le di e ences in hei
sequences. Thus, he e oduplex (weake bands) would show a slowe mig a ion in DGGE
gel han homoduplex (in ense bands), since he misma ch si es o he o me a e easie
dena u ed han he unions es ablished be ween he nucleo ides o homoduplex (in ense
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
114
bands) (Kanagawa, 2003). Despi e o his a iabili y, DGGE allowed o es ablish a clea
pa e n speci ic o each species o Pe kinsus in ol ed in his s udy. Mo eo e , DGGE could
easily be ex ended o he o he Pe kinsus species no included in his s udy, as diagnos ic
ool.
Compa ison be ween he well-known PCR-RFLP me hod and he new PCR-DGGE
showed ha species iden i ica ion was possible in mo e cases wi h he la e assay.
Fu he mo e, P. chesapeaki was de ec ed wi h PCR-DGGE co-in ec ing wi h P. olseni wo
clams R. philippina um, whe eas he PCR-RFLP me hod only de ec ed P. olseni in hose wo
clams. Co-in ec ions wi h wo Pe kinsus species in he same hos ha e al eady been
desc ibed: P. ma inus-P. chesapeaki in a ious hos s species (Peche e al., 2008; Reece e
al., 2008), P. ma inus-Pe kinsus sp. in M. me cena ia (Peche e al., 2008), P. chesapeaki-P.
olseni in R. decussa us (A zul e al., 2012) and P. olseni-P. medi e aneus in Venus e ucosa
(Ramilo e al., 2015).
Occu ence o mo e han one Pe kinsus species in an a ea, e en in he same species
hos , is no excep ional; in addi ion o he abo e men ioned cases, P. ma inus, P.olseni and
P. beihaiensis ha e been ound in C assos ea gasa om Pa aiba (B azil) (Quei oga e al.,
2015); P. olseni and P. honsuensis ha e been epo ed om Japan (Dungan and Reece,
2006); P. beihaiensis and P. olseni om China (Moss e al. 2008), and om India (Sanil e al.
2010, 2012); P. chesapeaki, P. olseni and P. medi e aneus om Ca alonia (Spain) (Ramilo
e al. 2015); and P. olseni and P. chesapeaki om Aus alia (Les e and Da is, 1981; Dang e
al., 2015). Resul s showed ha PCR-DGGE me hod is a use ul ool o disc imina e among
Pe kinsus species. Species-speci ic con en ional PCR o eal ime PCR assays a e good
ools o ou ine diagnoses when e alua ing he p e alence o he in ensi y o a pa icula
Pe kinsus species expec ed in a speci ic a ea o hos . Howe e , when a ious Pe kinsus
spp. a e expec ed (o may occu ) in an a ea o in a hos species, using hese me hods
would be slow and expensi e, because a species-speci ic PCR assay would be needed o
each Pe kinsus species. Genus-speci ic PCR assay ollowed by cloning and sequencing
in ol es labo ious wo k low and is mo e expensi e han PCR-DGGE assay o an ele a ed
numbe o indi iduals, pa icula ly i he e a e mixed in ec ions in he same indi idual.
The speci ic DGGE pa e n o bands o each Pe kinsus species makes ha cloning and
sequencing a e no needed. Mo eo e , RFLPs assays need a high quan i y o DNA since
weak PCR ampli ica ion does no allow ob aining he es ic ion pa e ns, which is mo e
e iden in he case o mixed in ec ions, because one o hem can be less ep esen ed in he
hos and being unno iced (Ramilo e al., 2015). Fu he mo e, he high powe o
disc imina ion o DGGE assays, based in small di e ences be ween DNA sequences, could
allow he de ec ion o any unknown Pe kinsus species. These esul s ag eed wi h hose
published by Ma yno a-VanKley e al. (2008) and Sa oh and Nakai (2007) who ound ha
PCR-DGGE is a be e me hod han PCR-RFLP o he disc imina ion o Eime ia and
C yp ospo idium species, espec i ely. Al hough nume ous molecula echniques such as
species-speci ic PCR assays, mul iplex PCR o RAPD-PCR ha e been de eloped o bo h
pa asi e gene a, none o hem has been able o de ec all he species o Eime ia o
C yp ospo idium in a single assay, while i was possible wi h DGGE me hod.
Sección II: Pe kinsosis
115
Recen ly, he high- h oughpu sequencing (HTS) is eplacing he PCR-DGGE
me hod in mic obial ecology s udies and will be soon conside ed a s anda d app oach in
en i onmen al mic obial esea ch (Dou e elo e al. 2014; Elizaquí el e al,. 2015; Ju and
Zhang, 2015; Pochon e al., 2015). HTS has been mainly used o he s udy o unc ional
genomic in bi al e mollusc (Lei e e al., 2013; Gómez-Chia i e al., 2015; He e al., 2015;
Meng e al., 2015). Bu ki e al. (2013) also employed he HTS o pe o m a phylogenomic
s udy o Mik ocy os mackini in ec ing C assos ea gigas. Ha ikainen e al. (2014) using
HTS iden i ied a new genus and new species, Pa amik ocy os cance i, pa asi ising he c ab
Cance pagu us. Howe e , in epidemiological su eys, in which he numbe o samples is
high and unknown pa asi e species may occu , a p e-sc eening me hod would be p ac ical
o de e mine which popula ions would be sui able o u he analysis by HTS. DGGE is
ela i ely cheape han HTS and he da a compa ing pa asi e popula ions a e isualised
immedia ely by elec opho esis.
Species-speci ic ISH assay con i med he in ec ion wi h P. chesapeaki in he wo
Manila clams, as ecommended by Bu eson (2008). P. chesapeaki has been ound in h ee
hos species (R. decussa us, R. philippina um and C. edule) in Eu ope (F ance and Spain).
Ou phylogene ic esul s would suppo a common o igin o he pa asi es P. chesapeaki
ound in Eu ope hus a . A zul e al. (2012) hypo hesised ha impo s o he ha d clam M.
me cena ia om he A lan ic coas o USA in o F ance could ha e been he ehicle o he
in oduc ion o P. chesapeaki in o F ance. The ecen epo o P. chesapeaki in ec ing A.
apezia om Aus alia aises he hypo hesis o ha Anada a in ade s could had been a
ehicle o he in oduc ion o he pa asi e in o Eu ope, because he alloch onous species
Anada a kagoshimensis, na i e in Paci ic coas s including Aus alia, has been epo ed as
an in ade species in Eu ope, including F ance and Spain (Ca alonia and Galicia) (Bañón e
al., 2015). Howe e , he phylogene ic analysis placed ITS sequences o P. chesapeaki om
Aus alia in a di e en clade om he Eu opean ones. The e y low numbe o posi i e
cases o P. chesapeaki in his s udy sugges s an acciden al o punc ual in oduc ion o his
pa asi e o a bad adap a ion o his species o he new hos and ma ine en i onmen .
Acknowledgemen s
We a e g a e ul o echnical assis ance o: Pa icia Ruiz om IIM-CSIC and Ma
González, Ma ibel Meléndez and Elena Penas om CIMA. D . Susana Da iba p o ided
mollusc samples and Se gio Fe nández p o ided in i o cul u ed cells o Pe kinsus
species. This s udy was unded by he Minis e io de Economía y Compe i i idad o he
Go e nmen o Spain, h ough he p ojec AGL2011-30449-C02-01.

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Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
126
Table 4. Pe cen age o pe kinsosis PCR-posi i e cases de ec ed wi h he genus-speci ic PCR assay in each
loca ion and clam species and iden i ica ion o he Pe kinsus species by wo diagnos ic me hods, RFLP and
DGGE. The numbe o posi i e cases appea s wi hin b acke s. No e ha in 53 cases (ou o 144 posi i e
cases by he genus-speci ic PCR assay), he PCR p oduc was insu icien o allow subsequen RFLP analysis
o Pe kinsus species iden i ica ion
Hos species
Sampling si e
Sample
size
Genus-speci ic PCR
RFLP
DGGE
R. decussa us
O iguei a
30
30.0% (9)
P. olseni (6)
P. olseni (8)
O Ba quei o
30
43,3% (13)
P. olseni (12)
P. olseni (10)
Vi ei o
30
0
-
-
Foz
30
0
-
-
Lou izán
30
66,7% (20)
P. olseni (13)
P. olseni (14)
A Toxa
30
73,3% (22)
P. olseni (16)
P. olseni (21)
R. philippina um
Pon edeume
30
46,7% % (14)
P. olseni (2)
P. olseni (13)
Cama iñas
30
0
-
-
Ca il
30
0
-
-
A cade
30
20.0% (6)
P. olseni (1)
P. olseni (4) P. chesapeaki (2)
V. co uga a
Fe ol
30
93,3% (28)
P. olseni (17)
P. olseni (19)
A Co uña
30
66,7% (20)
P. olseni (13)
P. olseni (10)
Vilano a de A ousa
30
40.0% (12)
P. olseni (11)
P. olseni (11)
Illa de A ousa
30
0
-
-
Cangas
30
0
-
-
P. homboides
Illa de A ousa
30
0
-
-

Sección II: Pe kinsosis
127
Fig.1. Maps showing he loca ion o he sampled beds along he Galician coas . 1: Foz. 2.
Vi ei o. 3: O Ba quei o. 4: O iguei a. 5: Fe ol. 6: Pon edeume. 7: A Co uña. 8: Cama iñas. 9:
Ca il. 10: Vilano a de A ousa. 11: Illa de A ousa. 12: Illa da Toxa; 13: Lou izan. 14: Cangas
do Mo azo. 15: A cade.
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
128
Fig.2. DGGE p o iles o Pe kinsus species in a 8% w/ polyac ilamide gel. Lanes 1 o 4: LSU-
PCR p oduc s ob ained om in i o cul u ed cells o P. ma inus, P. chesapeaki, P.
medi e aneus and P. olseni, espec i ely. Lanes 5 o 12 and 14 o 18: LSU-PCR p oduc s
ampli ied om clam samples, indica ing in ec ion wi h P. olseni. Lanes 19 and 20: LSU-PCR
p oduc s ampli ied om clam samples, indica ing in ec ion wi h P. olseni and P. chesapeaki.
Sección II: Pe kinsosis
129
KP764676*
AF473840
KP764677*
KP764683*
KP764678*
AF441211
KP764679*
KP764682*
KP764680*
AF140295
KP764681*
KJ701596
KJ608210
AF369969
KJ701597
AF441213
U07697
AF369967
Pe kinsus olseni
AY295194
AY295189
AF150987
Pe kinsus ma inus
EU068096
EU068098
DQ370482
AY487839
Pe kinsus medi e aneus
DQ516700
DQ516699
DQ516696
DQ516697
DQ516698
DQ516701
Pe kinsus honshuensis
KP764684*
JQ669646
KP764685*
JQ669649
KP764686*
JQ669648
KF314812
JQ669647
Eu ope
AF091541
EU919470
AY305326
AY876306
AF252288
AF440468
AF440464
No h Ame ica
KM983419
EU919484
AY876302
AY876303
AF102171
AY876305
AF440466
AY876307
KM983409
AY876304
KM983418
KM983414
KM983416
KM983417
KM983413
KM983411
No h Ame ica/Aus alia
Pe kinsus chesapeaki
EU068095
EU068080
EF204015
EF204050
Pe kinsus beihaiensis
Pe kinsus qugwadi
AF151528
88
85
76
73
94
36
71
99
27
43
63
27
15
99
22
85
94
19
99
99
64
92
93
93
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
130
Fig.3. Maximum-likelihood analysis showing he axonomic posi ion o he Pe kinsus
chesapeaki and P. olseni ITS sequences ob ained in his s udy. Numbe s a b anch nodes
indica e boo s ap con idence alues in pe cen . (*) Sequences ob ained in his s udy.
DQ516680
EF204098
DQ516682
EF204100
DQ516684
EF204096
Pe kinsus honshuensis/Pe kinsus medi e aneus
AY876319
AY876322
AY876329
Pe kinsus ma inus
AY876330
KP764689*
AY876331
KP764688*
AY876332
KP764687*
Pe kinsus olseni
AY876345
AY876349
JQ669652
KP764690*
AY876348
KP764691*
AY876344
AY876346
AY876347
JQ669651
Pe kinsus chesapeaki
EF526448
EF526451
Pe kinsus beihaiensis
P o ocen um micans
X16108
97
94
33
99
14
14
14
13
13
13
10
10
9
8
6
93
73
4
95
45
32
92
92
1
2
Fig.4. Maximum-likelihood analysis showing he axonomic posi ion o he Pe kinsus
chesapeaki and P. olseni LSU sequences ob ained in his s udy. Numbe s a b anch nodes
indica e boo s ap con idence alues in pe cen . (*) Sequences ob ained in his s udy.
Sección II: Pe kinsosis
131
Fig.5. Mic og aphs o wo se ial his ological sec ions h ough he diges i e gland o a clam
Rudi apes philippina um in ec ed wi h Pe kinsus chesapeaki. A: In si u hyb idiza ion wi h
PchesLSU-485DIG p obe showing blue deposi s o hyb idiza ion. B: Sec ion sa ined wi h
Ha is’ haema oxylin and eosin showing pa asi es (a ows).

S
SE
EC
CC
CI
IÓ
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N
I
II
II
I:
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bl
li
ic
ca
ad
do
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, Susana Da iba
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,
José M. Pa ada
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, Edga No
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, El i a Abollo
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, José Mola es
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, Ma ía J. Ca ballal
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1Cen o de In es igacións Ma iñas (CIMA), Conselle ía do Medio Ru al e do Ma , Xun a de Galicia,
36620 Vilano a de A ousa, Spain
2Ins i u o Tecnolóxico pa a o Con ol do Medio Ma iño de Galicia (INTECMAR), Conselle ía do Medio Ru al e do Ma ,
Xun a de Galicia, 36611 Vilaga cía de A ousa, Spain
3Cen o Tecnológico del Ma - Fundación CETMAR, 36208 Vigo, Spain
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
174
la acuicul u a, y han desplazado a los mé odos adicionales de iden i icación de pa ógenos
como son el cul i o de mic oo ganismos, la p opagación de i us en líneas celula es o la
his ología. Es as écnicas apo an la capacidad de ca ac e iza ápidamen e y sin
ambigüedades o ganismos sospechosos de causa un b o e de la en e medad, lo que es
p imo dial pa a pode modula los es ue zos di igidos hacia el con ol de las
en e medades. Un ejemplo de su éxi o se e leja en el hecho de que desde 1977 has a 2011
se han publicado más de 2.000 a ículos de in es igación que desc iben mé odos basados
en el ADN pa a la de ección, iden i icación y/o cuan i icación de pa ási os y ec opa ási os
(Hun , 2011).
En es a Memo ia se p esen an esul ados que suponen un a ance en el desa ollo
de p o ocolos molecula es especí icos y sensibles pa a la iden i icación y el diagnós ico de
las p incipales en e medades que a ec an al cul i o de moluscos bi al os an o en Galicia
como en sus á eas de dis ibución a ni el mundial. Ac ualmen e siguen exis iendo lagunas
en el conocimien o de es as en e medades y su impac o, siendo la iden i icación y
ca ac e ización del agen e pa ógeno undamen al pa a la in es igación, la comp ensión de
la epidemiología de las mismas y de las posibles in e enciones que se puedan desa olla
pa a minimiza su e ec o. Cuando se desa ollan nue os mé odos de diagnós ico, un ema
c í ico y que supone siemp e un desa ío es la alidación de los mismos, con el in de
es ablece la sensibilidad y especi icidad de las nue as écnicas. De es e hecho depende el
éxi o y iabilidad del con ol sani a io que se eje za, ya que los mé odos de diagnós ico que
se apliquen debe ían siemp e cumpli con los equisi os de al a sensibilidad, especi icidad,
ep oducibilidad, epe ibilidad, exac i ud e idoneidad. T as de ec a en 2008 la
coexis encia de dos especies de Bonamia al amen e pa ogénicas in ec ando a la os a plana
en Galicia, nos p opusimos desa olla un mé odo diagnós ico que nos pe mi iese e alua
epidemiológicamen e ambas especies. Los ensayos diseñados en es e es udio pa a el
diagnós ico de la bonamiosis han mos ado ene una mayo sensibilidad y especi icidad,
que las p opias écnicas ecomendadas ac ualmen e po la OIE. Es e hecho no pasó
desape cibido al Labo a o io Eu opeo de Re e encia de En e medades de Moluscos
(EURL), que en 2013 ealizó una e aluación de los ensayos p esen ados en es a memo ia
con el in de de e mina las écnicas diagnós icas más adecuadas pa a la en e medad. El
EURL ealizó una p ueba en anillo en la que 17 labo a o ios, en e los que se encon aban
Labo a o ios Nacionales de Re e encia de di e en es países, p oba on di e en es
p o ocolos de PCR pa a la de ección y ca ac e ización de las especies de Bonamia
(h p:// o ms.i eme . /lgpmm/ egis a ion- o m- o - he-2013-ilc-01- es -and-
compa ison-s udy-o -bonamia-pc - echniques/). En e es os p o ocolos se encon aban:
las PCR gené icas ecomendadas po la OIE, desc i as po Ca negie e al. (2000) y
Cochennec e al. (2000), las TaqMan PCR gené icas desc i as po Co beil e al. (2006b) y
Ma y e al. (2006), la PCR especí ica pa a B. os eae diseñada po Robe e al. (2009) y los
p o ocolos de PCR con encional y PCR en iempo eal desc i os en es e es udio. Además,
se incluye on dos nue as PCR especí icas desa olladas po Longshaw e al. (2013)
pos e io es a las diseñadas en es e es udio: una pa a B. exi iosa y o a pa a B. os eae. De
es os 17 labo a o ios 6 de ellos compa a on la PCR Bo-Boas (Cochennec e al., 2000),
seguida po una p ueba RFLP (Cochennec-Lau eau e al., 2003a), con la PCR en iempo
eal desc i a en es a memo ia. Los esul ados mos a on que la PCR en iempo eal es
lige amen e más especí ica y mucho más sensible que la PCR Bo/Boas y des aca que es

Discusión gene al
175
una écnica ecomendable pa a ealiza p og amas de igilancia, ya que su al a
sensibilidad minimiza el iesgo de ob ene esul ados alsos nega i os. Además, se
demos ó que su ep oducibilidad es al a y mayo que la de la PCR Bo-Bas, ya que con la
PCR en iempo eal se encon a on meno es di e encias en e los esul ados de los 6
labo a o ios. EL EURL concluyó que la PCR en iempo eal especí ica pa a B. exi iosa y B.
os eae, desc i a en es e es udio, puede se incluida en el Manual Diagnós ico de la OIE
como mé odo ecomendado (Eu opean Re e ence Labo a o y o Molluscan Diseases,
2014). A pesa de que las o as PCR diagnós icas ci adas no ue on p obadas po el
núme o de labo a o ios pa icipan es en la p ueba en anillo planeado inicialmen e, los
esul ados ob enidos indican que las PCR con encionales especí icas pa a B. exi iosa y B.
os eae desa olladas en es e es udio, o ecen unos esul ados mucho mejo es en é minos
de iabilidad que las PCR con encionales especí icas desc i as po Longshaw e al. (2013).
La PCR con encional especí ica pa a B. exi iosa, así como la PCR mul iplex pa a el
diagnós ico de B. exi iosa y B. os eae, han pe mi ido de ec a po p ime a ez B. exi iosa
en Po ugal, in ec ando la os a plana O. edulis. La p esencia de es a especie pasó
desape cibida median e el ensayo de PCR Bo-Boas ecomendado po la OIE (Ba is a e al.,
2015).
El p ocedimien o de PCR mul iplex es la p ime a écnica desc i a capaz de de ec a
B. os eae y B. exi iosa en un único ensayo. El Cen o de In es igaciones Ma inas (CIMA) de
la Xun a de Galicia y el Cen o Tecnológico del Ma solici ó su pa en abilidad en
sep iemb e de 2011, p esen ando la documen ación co espondien e an e la O icina
Española de Pa en es y Ma cas. En ma zo de 2014 el Bole ín O icial de la P opiedad
Indus ial (BOPI) publicó la concesión de la pa en e que lle a po í ulo “P ocedimien o
pa a de ec a e iden i ica Bonamia os eae y Bonamia exi iosa en un único ensayo de
eacción en cadena de la polime asa”, con el núme o de concesión P 201131549 ( e
anexo I). Exis e un egis o de ki s diagnós icos pa a di e sas en e medades alidados y
ce i icados po la OIE, en e los que se incluyen ki s basados en la ecnología de PCR como
el denominado “IQ 2000TM WSSV De ec ion and P e en ion Sys em” pa a el diagnós ico de
la en e medad de las manchas blancas (WSSV) p oducida po un i us que p o oca
ele adas mo alidades en a ias especies de cama ones, o el ki “Check&T ace
Salmonella” basado en PCR mul iplex pa a el se o ipado molecula de es a bac e ia (OIE,
2015). La come cialización en o ma de ki diagnós ico de la PCR mul iplex pa a B. exi iosa
y B. os eae y su alidación y ce i icación po la OIE pod ía se una he amien a de g an
ayuda pa a el con ol de la bonamiosis.
El es udio epidemiológico de B. exi iosa y B. os eae pe mi ió la de ección emp ana
de ambas especies en semilla de pequeña alla y e idenció que B. exi iosa es á
ampliamen e dis ibuída a lo la go del li o al gallego y pe ec amen e adap ada a es e
ecosis ema. Es os da os jun o con la de ección de B. exi iosa in ec ando O. edulis en
Ca aluña y en o os países eu opeos como I alia, F ancia, Reino Unido y Po ugal (Na cisi
e al., 2010; A zul e al., 2011; Ca asco e al., 2012a; Longshaw e al., 2013; Ba is a e al.,
2015) indican que es a especie debe ía se eliminada de la lis a de en e medades exó icas
del Reglamen o Eu opeo de Sanidad Animal y debe ía inclui se en la lis a de en e medades
no-exó icas (Anonymous, 2006).
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
176
Pa a mejo a el diagnós ico molecula de B. exi iosa, ambién se diseñó un
p o ocolo de ISH especí ico, que mos ó alo es de sensibilidad supe io es a los de la
écnica his ológica. O a en aja de la écnica molecula es que pe mi e ealiza una
iden i icación inequí oca y no suje a a un c i e io subje i o, mien as que el diagnós ico
his ológico se e ue emen e in luido po la expe iencia del analizado , p incipalmen e en
la á eas geog á icas de coexis encia de ambas especies. E aluando obje i amen e la ISH, la
labo iosidad, el iempo eque ido y el cos e económico hacen que no sea una he amien a
molecula en ocada a diagnós icos u ina ios, sin emba go, es una écnica muy
ecomendable pa a con i ma nue os casos posi i os de B. exi iosa en á eas y
hospedado es que se c eían lib es de es a especie, an o si el diagnós ico se ealiza po
écnicas de PCR como his ológicas. Aunque las écnicas de PCR son muy sensibles, no
o ecen in o mación sob e la iabilidad del pa ási o ni sob e el es ado de la in ección,
siendo necesa io ealiza una con i mación isual empleando écnicas mic oscópicas
al amen e sensibles como puede se la ISH (Bu eson, 2008). La ISH especí ica pa a B.
exi iosa o ece la misma in o mación que la his ología pe o con la especi icidad y
sensibilidad de los mé odos molecula es, po lo que es una p ueba imp escindible an o
con i ma o ia como en la búsqueda de posibles hospedado es ese o ios o
anspo ado es de la en e medad.
La iabilidad de la aplicación de las he amien as molecula es pa a el diagnós ico
especí ico de las especies de Bonamia a ineludiblemen e ligada al p opósi o que se
pe sigue, al cos e económico que suponen su aplicación y a la di icul ad écnica in ínseca
a las mismas. A pesa de que la di icul ad écnica no es asumible po el sec o p ima io,
se ía muy ácil su implemen ación en cen os especializados, como pueden se los
labo a o ios de e e encia nacionales e in e nacionales, labo a o ios de in es igación o
cen os analí icos públicos y p i ados. El cos e de la aplicación de es os mé odos de o ma
u ina ia a ía en unción de la écnica a aplica .
En es e es udio ambién se han diseñado dos p ocedimien os molecula es pa a el
es udio de la pe kinsosis. Como ya se ha señalado, el es ue zo in es igado en o no a la
pe kinsosis es muy ele ado lo que o igina que el núme o de especies del géne o Pe kinsus,
su ango geog á ico y la lis a de especies hospedado as c ezca y e olucione
con inuamen e, siendo és e el gupo de p o ozoos pa ási os de moluscos con un ango de
dis ibución geog á ica mayo (Fe nández-Robledo e al., 2014). Es e hecho jun o al
ele ado mo imien o come cial de especies de moluscos que exis e en Galicia, hizo que se
plan ease como obje i o de es a esis doc o al ealiza un c ibado molecula de o as
posibles especies de Pe kinsus que pudiesen in ec a di e en es especies de almejas en
Galicia. El plan eamien o clásico de ealiza una PCR gené ica seguida de clonación y
pos e io PCR-RFLPs o PCR-secuenciacion se es imó como muy labo iosa y cos osa pa a
abo da un c ibado poblacional. O as écnicas como el “Nex Gene a ion Sequencing”
(NGS) ecibie on la misma e aluación. Finalmen e se emp endió el desa ollo de un nue o
ensayo de PCR-DGGE, que u iese pode de disc iminación pa a de ec a de o ma
simul ánea di e en es especies de Pe kinsus, incluso cuando alguna de ellas cu sase la
in ección de o ma le e. Los esul ados ob enidos mues an que es a écnica, a pesa de su
escaso desa ollo en el campo de la pa ología de moluscos y su incipien e en ada en
desuso, ha p opo cionado esul ados impo an es en la iden i icación de especies de
Discusión gene al
177
Pe kinsus, así como en la de ección de in ecciones mul iespecí icas. A ello se suma su cos e
mode ado y ácil análisis. P. chesapeaki es una especie desc i a o iginalmen e en la cos a
no es e de EE. UU., pe o su pos e io de ección en Eu opa y Aus alia (A zul e al., 2012;
Ca asco e al., 2014; Dang e al., 2015) mues a que es una especie que se adap a bien a
di e en es condiciones mac o- (dis ibución geog á ica amplia) como mic o-ambien ales
(di e en es especies hospedado as), lo que da e idencias de su capacidad colonizado a.
Dispone del egis o de P. chesapeaki en el ecosis ema gallego, pe mi i á ealiza una
moni o ización de es a especie pa a pode e alua su e olución y su po encial impac o en
las poblaciones de moluscos bi al os. El es udio epidemiológico iniciado en Galicia se
ex endió al Ma Medi e áneo, ya que es un á ea geog á ica en la que se ha ealizado un
es ue zo meno en el es udio de la en e medad. Además del diagnós ico molecula de la
pe kinsosis se diseñó un ensayo de ISH especí ico pa a la de ección de P. medi e aneus.
Es e ensayo pe mi ió con i ma las in ecciones, de ec adas po PCR, de P. medi e aneus en
nue os hospedado es.
En es a esis doc o al se ha abo dado la iden i icación y ca ac e ización molecula
de dos pa ási os nue os esponsables de causa ele adas mo alidades de almeja japonesa
y be be echo en Galicia. La de ección de Mik ocy os sp. en almeja japonesa iene g an
impo ancia debido a que R. philippina um es una especie cosmopoli a, cul i ada en
muchos países y con abundan es impo aciones. El g an desconocimien o de la biología
del géne o Mik ocy os, incluyendo dis ibución geog á ica, ango hospedado , posición
ilogené ica, in e acción hospedado -pa ási o-medioambien e y ciclo de ida, no pe mi e
hace una alo ación de la in oducción de es a especie en aguas gallegas y los ac o es
que o igina on el b o e epidémico, aunque las condiciones ambien ales y la co-in ección
con el agen e de la en e medad de anillo ma ón (BRD) que p esen aban las almejas
japonesas pudie on a o ece la mul iplicación y ansmisión del pa ási o. Mik ocy os sp.
no se ha de ec ado en Galicia desde el año 2009 (da os apo ados po el INTECMAR), pe o
la ausencia de conocimien o hace que sea necesa io ealiza una igilancia sani a ia
igu osa pa a pode con ola nue os b o es epidémicos, así como su p opagación a o as
á eas.
El pa ási o Pa amyxido, causan e de d ás icas mo alidades de be be echo de la
Ría de A ousa desde el año 2012 se iden i icó po écnicas molecula es como M. cochillia.
Ac ualmen e, las poblaciones de be be echo en la Ría de A ousa se encuen an o almen e
diezmadas po la en e medad. La adap ación a un nue o ambien e de pa ási os
monoxénicos in oducidos, ej. B. exi iosa, es siemp e más sencilla que la de pa ási os con
ciclo de ida indi ec o (Dobson y May, 1986; Baue , 1991; To chin y Mi chell, 2004). En
es e úl imo g upo se encon a ía p obablemen e M. cochillia, de la cual aún se desconoce
su ciclo de ida, pe o hay e idencias de que en o as especies del géne o, como M.
e ingens y M. sydneyi, di e en es especies de copépodos y polique os, espec i amen e,
ac úan como hospedado es in e media ios en el ciclo biológico. Po an o, es p obable que
exis an hospedado es in e media ios elacionados con la in oducción e in asión de M.
cochillia en Galicia y que puedan ac ua como ese o ios de la en e medad.
La ca ac e ización molecula de Mik ocy os sp. y M. cochillia ha pe mi ido ealiza
un diagnós ico inequí oco de es as especies pa asi as esponsables de la mo alidades
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
178
masi as de almejas y be be echos. Es a ca ac e ización puede se la base pa a el diseño de
nue os es diagnós icos que pe mi an p o undiza en la epidemiología y ciclo de ida de
es as especies, con el in de pode escla ece su in oducción en Galicia y ealiza un
con ol sani a io e ec i o de ambas en e medades que e i e su dispe sión a nue as á eas y
hospedado es. De hecho, la u ilización de es os p ocedimien os de diagnós ico pa ece
imp escindible en la búsqueda del hospedado in e media io de M. cochillia en aguas
gallegas, paso c ucial pa a pode a bi a medidas de ges ión de la ma eiliosis del
be be echo en Galicia.
En el u u o, la secuenciación de odo el genoma de los pa ási os y la de inición de
una amplia gama de ma cado es gené icos pa a su uso en he amien as de diagnós ico
especí icos y sensibles pueden o ece opo unidades únicas pa a abo da cues iones
ela i as a la compleja ed de ac o es biológicos y ecológicos que in e ienen en las
in e acciones en e los pa ási os, sus hospedado es y el medio ambien e. El uso in eg ado
de he amien as molecula es (ómicas) y bioin o má icas a anzadas puede se c ucial pa a
apun ala la in es igación de la biología de las en e medades, en una escala an es
imposible, y pod ía p opo ciona pe spec i as sin p eceden es pa a el diseño de mé odos
de diagnós ico y de in e ención o almen e nue os pa a ena el desa ollo de las
en e medades.
C
CO
ON
NC
CL
LU
US
SI
IO
ON
NE
ES
S

Conclusiones
181
CONCLUSIONES
1. Se han diseñado las p ime as PCR diagnós icas especí icas pa a B. exi iosa: PCR
con encional, PCR en iempo eal y PCR mul iplex.
2. La al a especi icidad y, en especial, la al a sensibilidad de los ensayos de PCR
con encional, PCR en iempo eal y PCR mul iplex especí icos pa a B. exi iosa y B.
os eae, los con ie en en p o ocolos idóneos pa a se incluidos en el Manual
Diagnós ico de la OIE como mé odos ecomendados pa a el diagnós ico de ambos
pa ási os.
3. La PCR mul iplex diseñada pa a la de ección simul ánea de B. exi osa y B. os eae
pe mi e un diagnós ico ápido y económico de os as pa asi adas. Es a écnica se ha
pa en ado y su come cialización en o ma de ki de de ección de ambas especies
pod ía se muy ú il pa a el con ol sani a io de os as en e a la bonamiosis.
4. Las PCR con encional y PCR en iempo eal pa a B. os eae y B. exi iosa son ensayos
que pe mi en ealiza una de ección de ambos pa ógenos en e apas muy emp anas
de c ecimien o. Es o pe mi i á a los os icul o es ealiza una selección p e ia de
semilla lib e de pa ógenos, pa a impo a lo es de al a calidad sani a ia pa a es as
en e medades, ga an izando una mayo supe i encia en los lo es des inados a
engo de.
5. El p o ozoo B. exi iosa es un pa ási o pe ec amen e adap ado al ecosis ema ma ino
gallego y debe ía se eliminado de la lis a de en e medades exó icas de la Di ec i a
eu opea 2006/88/EC e incluido en su lis a de en e medades de no exó icas.
6. Se han diseñado po p ime a ez ensayos de ISH especí icos pa a B. exi iosa y P.
medi e aneus, he amien as muy ú iles pa a con i ma in ecciones de es os pa ási os
en nue os hospedado es y á eas lib es de la en e medad.
7. Se ha ampliado el ango geog á ico y hospedado de P. olseni, P. medi e aneus y P.
chesapeaki .
8. El ensayo PCR-DGGE es una he amien a ú il pa a ealiza es udios de con ol y
igilancia de las especies de Pe kinsus p esen es en un á ea geog á ica.
9. Se ha iden i icado po p ime a ez un pa ási o del ipo Mik ocy os en la almeja R.
philippina um, en a ias zonas de Galicia y en asociación con mo alidad al a de
almeja.
10. Se ha iden i icado el pa ási o M. cochillia como causan e del colapso de la pesque ía
del be be echo en la ía de A ousa. Se ha diseñado un ensayo de PCR con encional
pa a el diagnós ico especí ico de es e pa ási o.
B
BI
IB
BL
LI
IO
OG
GR
RA
AF
FÍ
ÍA
A
Diagnós ico molecula y epidemiología de en e medades ele an es de moluscos bi al os
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