Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos

Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos Tesis Doctoral Andrea Ramilo Álvarez Santiago de Compostela, 2015 Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos Memoria presentada por: Andrea Ramilo Álvarez para optar al título de Doctora en Biología Codirectores: Elvira Abollo Rodríguez Antonio Villalba García Santiago de Compostela, 2015 Dña. Elvira Abollo Rodríguez, Doctora en Biología e Investigadora del Centro Tecnológico del Mar (Fundación CETMAR) y D. Antonio Villalba García, Doctor en Biología e Investigador del Centro de Investigaciones Marinas de la Consellería de Medio Rural e do Mar (Xunta de Galicia), como Directores de la tesis titulada “ “Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos” Por la presente DECLARAMOS: Que la tesis presentada por Dña. Andrea Ramilo Álvarez para optar al grado de Doctora en Biología por la Universidad de Santiago de Compostela, es idónea para ser presentada, de acuerdo con el artículo 41 del Reglamento de Estudios de Doctorado, por la modalidad de compendio de ARTÍCULOS, en los que la doctoranda tuvo participación en el peso de la investigación y su contribución fue decisiva para llevar a cabo este trabajo. Hallándose concluida, autorizan su presentación a fin de que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Los coautores, tanto doctores como no doctores, de dichos artículos conocen la inclusión de estos artículos en esta tesis doctoral y ninguno de los artículos reunidos en esta tesis será presentado por ninguno de ellos en otra tesis doctoral, lo que firmamos bajo nuestra responsabilidad. Y para que así conste, firman la presente en Vilanova de Arousa, 22 de septiembre de 2015 Fdo.: Dra. Elvira Abollo Rodríguez Fdo.: Dr. Antonio Villalba García D. Carlos Pereira Dopazo, Doctor en Biología y Profesor Titular del Departamento de Microbiología y Parasitología de la Universidad de Santiago de Compostela, INFORMA: Que la presente Memoria titulada “Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos”, presentada por Dña. Andrea Ramilo Álvarez para optar al grado de Doctora en Biología por la Universidad de Santiago de Compostela, ha sido realizada bajo su tutela y que, hallándose concluida, autoriza su presentación a fin de que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente. Y para que así conste, firma la presente en Santiago de Compostela, a 22 de septiembre de 2015 Fdo.: Carlos Pereira Dopazo La presente tesis doctoral se ha desarrollado en el Centro de Inv estigaciones Marinas (CIMA), perteneciente a la Xunta de Galicia y se ha financiado a través de la Consellería do Medio Rural e do Mar mediante los proyectos PGIDITCIMA08/01, PGIDIT-CIMA09/01 y PGIDIT-CIMA 12/03 y por el Ministerio de Ciencia e Innovación con los proyectos AGL2006-11809, AGL2009- 11607 y AGL2011-30449-C02-01. ÍNDICE INTRODUCCIÓN GENERAL……………………………………………………………………………………….. 1 1. Principales moluscos bivalvos producidos en Galicia: importancia socioeconómica..…..1 2. Principales problemas patológicos que afectan a los cultivos de moluscos bivalvos……6 2.1. Bonamiosis 6 2.1.1. Taxonomía ………………………………….…………….…………………………………………...6 2.1.2. Epidemiología ………………………………………………………………..……………….……. 8 2.1.2.1. Distribución geográfica y especies hospedadoras ………………………...8 2.1.2.2. Influencia de algunas características del hospedador en la parasitación……….……………………………………………………………….9 2.1.2.3. Influencia de factores ambientales en la parasitación………………….10 2.1.3. Ciclo de vida y transmisión………………………..…………………………………………..10 2.1.4. Interacción hospedador-parásito ………………………………………………………….12 2.1.5. Estrategias de lucha ……………………………………..………………………………………13 2.2. Perkinsosis 14 2.2.1. Taxonomía ……..………………………………………...………………………………………….14 2.2.2. Epidemiología ………………………………………………….…………………………….…….15 2.2.2.1. Distribución geográfica y especies hospedadoras ………………...…….15 2.2.2.2. Influencia de algunas características del hospedador en la parasitación…………….………………………………………………………..16 2.2.2.3. Influencia de factores ambientales en la parasitación………………….16 2.2.3. Ciclo de vida y transmisión………………..………………………………………………… 17 2.2.4. Interacción hospedador-parásito ………………………………………………………….19 2.2.5. Estrategias de lucha ………………………………..……………………………………………22 2.3. Marteiliosis 23 2.3.1. Taxonomía ……..………………………………………...……………………………………….…23 2.3.2. Epidemiología ………………………………………………….…………………………….….…25 2.3.2.1. Distribución geográfica y especies hospedadoras …………………...….25 2.3.2.2. Influencia de algunas características del hospedador en la parasitación……………………………………………………………………...26 2.3.2.3. Influencia de factores ambientales en la parasitación………………….26 2.3.3. Ciclo de vida y transmisión………………………………..…………………………………..27 2.3.4. Interacción hospedador-parásito ………………………………………………………….29 2.3.5. Estrategias de lucha ………………………………..……………………………………………30 2.4. Mikrocytos 31 2.4.1. Taxonomía ……..………………………………………...………………………………………….31 2.4.2. Epidemiología …………………………………………………….………………………….…….33 2.4.2.1. Distribución geográfica y especies hospedadoras ……………………....33 2.4.2.2. Influencia de algunas características del hospedador y de factores ambientales en la parasitación……...……………………….33 2.4.3. Ciclo de vida y transmisión…………………………..………………………………………34 2.4.4. Interacción hospedador-parásito ………………………………………………………….35 3. Principales técnicas diagnósticas de parásitos de moluscos………………………………..……36 3.1. Técnicas moleculares 38 3.1.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)….……………………………………..…39 3.1.2. PCR-RFLPs (Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción)……40 3.1.3. PCR Multiplex…………………..…………………………………………………………………..40 3.1.4. PCR en tiempo real……………………...………………………………………………………..41 3.1.5. PCR-DGGE (Electroforesis en Gel con Gradiente Desnaturalizante)..…….….42 3.1.6. Hibridación in situ (ISH)………………….………………………………………………….…43 3.1.7. Secuenciación masiva…………………...………………………………………………………44 3.2. Métodos moleculares para el diagnóstico de Bonamia, Perkinsus, Marteilia y Mikrocytos 45 3.2.1. Género Bonamia………………………………...…..………………………………………..……45 3.2.2. Género Perkinsus…………………...……………………………………………………………..46 3.2.3. Género Marteilia……………………………………………………………………………….…..48 3.2.4. Género Mikrocytos……………………...…………………………………………………………50 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS………………….…………………………………….………………………...55 SECCIÓN I: BONAMIOSIS  Species-specific diagnostic assays for Bonamia ostreae and B. exitiosa in European flat oyster Ostrea edulis: conventional, real-time and PCR multiplex…………………………………………………………………………………………………………59  Species-specific oligonucleotide probe for detection of Bonamia exitiosa (Haplosporidia) using in situ hybridization assay……………………………………..…….…73  Oyster parasites Bonamia ostreae and B. exitiosa co-occur in Galicia (NW Spain): spatial distribution and infections dynamics…………………………………85 SECCIÓN II: PERKINSOSIS  Update of information on perkinsosis in NW Mediterranean coast: Identification of the Perkinsus spp. (Protista) in new locations and host……….…….99  Perkinsus olseni and Perkinsus chesapeaki detected in a survey of perkinsosis of various clam species in Galicia (NW Spain) using PCR-DGGE as a screening tool……………………………………………………………………………………….105 SECCIÓN III: ENFERMEDADES EMERGENTES  Cockle Cerastoderma edule fishery collapse in the Ría de Arousa (Galicia, NW Spain) associated with the protistan parasite Marteilia cochillia…………………………………………………………………………………………………….…...135  Infection of Manila clams Ruditapes philippinarum from Galicia (NW Spain) with a Mikrocytos-like parasite…………….……………………………………….161 DISCUSIÓN GENERAL………………………………….………………………………………………………...173 CONCLUSIONES…………………………..………………………………………………………………………...181 BIBLIOGRAFÍA….…………………………………………………………………..……………………………...185 ABREVIATURAS.…………………………………………………………………………………………………...231 ANEXO I: Certificado-Título de patente de invención. Procedimiento para detectar e identificar B. ostreae y B. exitiosa en un único ensayo de reacción en cadena de la polimerasa……………………………………………………………………………………………………………......235 ANEXO II: Listado de publicaciones incluidas y relacionadas con la tesis doctoral…........261 I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N G GE EN NE ER RA AL L Introducción general 1 INTRODUCCIÓN GENERAL 1. Principales moluscos bivalvos producidos en Galicia: importancia socioeconómica Los moluscos constituyen una parte importante de la acuicultura mundial (23%), aumentando su volumen progresivamente, pasando de 6,3 millones de toneladas desembarcadas en 1991 a los 15,2 millones de toneladas en el año 2012. Asimismo, las capturas mundiales de moluscos provenientes de la pesquería alcanzaron en ese año los 6,9 millones de toneladas (FAO, 2015). En el conjunto de la Unión Europea, España es el primer productor, siendo Galicia la región más productiva del país con cerca del 96% de la producción total nacional (http://www.magrama.gob.es). La costa gallega cuenta con un total de 278 arenales y 70 millones de metros cuadrados de zona intermareal, que junto a las características geográficas y biotípicas de las rías, lo convierten en una región óptima para el crecimiento de moluscos bivalvos (Mahou, 2008). Estas condiciones han favorecido el desarrollo de una potente actividad en torno al marisqueo, definido legalmente como una modalidad específica de pesca, que ocupa a unas 8.500 personas, por lo que se considera una actividad socioeconómica de primer orden (http://www.pescadegalicia.com). Su faceta más sencilla y artesanal tiene como objeto la captura de moluscos en la costa arenosa y se hace a pie sin utilizar embarcación, lo que se denomina marisqueo a pie, proporcionando trabajo a casi 4.000 personas, en su mayoría mujeres. El marisqueo a flote tiene lugar en la zona sublitoral y se realiza empleando una embarcación pequeña y artes específicas, como varas, rastros o raños. Está actividad la desarrollan casi exclusivamente hombres. La mayoría de las especies extraídas son moluscos bivalvos, aunque también se incluyen dentro de esta actividad moluscos gasterópodos, equinodermos y crustáceos. En el año 2014, el valor económico de los bivalvos descargados en las lonjas gallegas superó los 53 millones de euros, correspondientes a las cerca de 6.000 t de producción subastada (http://www.pescadegalicia.com). El número de especies marisqueras con interés comercial en Galicia es elevado (21 especies diferentes), sin embargo, las que destacan por su producción e importancia económica son la almeja japonesa Ruditapes philippinarum, el berberecho Cerastoderma edule, la almeja fina Ruditapes decussatus y la almeja babosa Venerupis corrugata (Figuras 1 y 2) (http://www.pescadegalicia.com). La almeja japonesa es una especie foránea procedente de las costas asiáticas e introducida en la costa pacífica de Norteamérica de forma accidental, con semilla de la ostra japonesa Crassostrea gigas. R. philippinarum también fue importada a Europa para paliar los efectos de la sobreexplotación de las especies de almeja autóctonas, principalmente de la almeja fina. Su buena adaptación al medio y su rápido crecimiento (Pérez Camacho y Cuña, 1985) la han convertido en el molusco más cultivado del mundo, alcanzando 3,8 millones de toneladas en el año 2012 con un valor comercial de 3.300 millones de euros (FAO, 2015). Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 2 Figura 1. Producción de moluscos bivalvos en Galicia correspondiente a pesquería en el año 2014. Producción (toneladas) 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 Almeja japonesa BerberechoAlmeja babosa Almeja fina Almeja rubia Navaja Volandeira Vieira Carneiro Ostra plana Otros En Galicia, más de la mitad de almeja japonesa se obtiene del marisqueo y el resto proviene de su cultivo, mediante la introducción de almejas de otros países europeos, principalmente de Italia y en menor medida de Francia, así como de semilla producida en criaderos, posteriormente engordada en parques de cultivo. Entre el marisqueo y el cultivo, en el año 2014 se recogieron más de 2.955 t de almeja japonesa con un valor comercial de aproximadamente 19 millones de euros (http://www.pescadegalicia.com). La distribución geográfica de la almeja fina R. decussatus abarca el Mediterráneo, desde el estrecho de Gibraltar al canal de Suez, el mar Rojo y la costa oriental atlántica, desde Noruega hasta Senegal (Navas, 2008). La almeja babosa también se distribuye en países mediterráneos y desde Noruega hasta Marruecos, incluyendo el mar Báltico (Cerviño, 2011). La producción mundial de ambas especies dista mucho de la producción de almeja japonesa pues, según las estadísticas de la FAO, sólo se producen 4.000 t de almeja fina y 275 t de almeja babosa (FAO, 2015); parece claro que la información recogida en las bases de datos de la FAO no es exacta pues las ventas de almeja babosa en las lonjas gallegas superan ampliamente la producción mundial de esta especie según la FAO. En cualquier caso, el elevado valor de las almejas fina y babosa en el mercado sigue haciendo rentable su captura. Así, en el año 2014 en Galicia se capturaron por marisqueo (la fuente principal de estas especies) 657 t de almeja fina y 1.009 t de almeja babosa, cuyo valor en el mercado fue de 20,58 €/Kg y 13,30 €/Kg, respectivamente, frente a los 6,43 €/kg de almeja japonesa. Por tanto, las almejas fina y babosa aportan al sector mariscador más ingresos que R. philippinarum (Figura 2). Sin embargo en el ámbito de la acuicultura, la producción e ingresos correspondientes a la almeja japonesa superan a los de las almejas fina y babosa (Figuras 3 y 4) (http://www.pescadegalicia.com). Introducción general 3 El berberecho C. edule se distribuye a lo largo de la costa atlántica europea y africana desde el Mar de Barents, al Norte de Noruega, hasta Marruecos. Los principales productores de esta especie, que alcanza las 7.000 t pescadas y las 1.800 t en acuicultura, son Reino Unido y Países Bajos (FAO, 2015). En Galicia, el berberecho tradicionalmente ha sido la especie más importante para el marisqueo en términos de biomasa. En el año 2011 se capturaron 3.314 t de berberechos con un valor en el mercado de 16 millones de euros. Sin embargo, a partir del año 2012 la cantidad de berberecho descendió drásticamente a la mitad, debido a la enfermedad de la marteiliosis que provocó la muerte de más del 90% de ejemplares en la Ría de Arousa, una de las zonas más productivas de Galicia para esta especie. Según los datos aportados por la Xunta de Galicia para el año 2014, sólo se capturaron 1.200 t de berberecho con un valor comercial de 7,8 millones de euros. Existe también un reclutamiento natural de semilla de berberecho para trasladarla a zonas con menor densidad (reparqueo). Sin embargo, la producción de estos moluscos mediante cultivo de semilla supone un porcentaje mínimo con respecto a las capturas por marisqueo (http://www.pescadegalicia.com). A pesar de que la producción de moluscos de bancos naturales tiene gran importancia, la gran demanda de bivalvos está provocando que algunas poblaciones naturales ya se encuentren al límite de su sostenibilidad o que éste ya se haya sobrepasado. Por ese motivo, la acuicultura se presenta como una opción imprescindible para atender la actual demanda de estos productos. En Galicia el cultivo del mejillón Mytilus galloprovincialis es claramente mayoritario, seguido de la almeja japonesa, la ostra plana Ostrea edulis, el berberecho, y la ostra rizada C. gigas (Figura 3). La acuicultura gallega del mejillón convierte a España en el principal país productor de la Unión Europea y el segundo a nivel mundial, después de China, con Figura 2. Valor económico de moluscos bivalvos de Galicia correspondientes a pesquería en el año 2014. Millones de € 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Almeja japonesa BerberechoAlmeja babosa Almeja fina Almeja rubia Navaja Otros Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 10 2.1.2.3. Influencia de factores ambientales en la parasitación La infección por B. ostreae y B. exitiosa se produce a lo largo de todo el año, aunque se han descrito patrones estacionales de prevalencia para cada una de ellas en áreas concretas. En el caso de B. ostreae, los valores de prevalencia mayores se dan en primavera y otoño (Grizel, 1985; Montes, 1990; Van Banning, 1991, Culloty y Mulcahy, 1996; da Silva et al., 2005; Engelsma et al., 2010). En cuanto a B. exitiosa, se encontraron picos de prevalencia entre enero y abril en O. chilensis (Hine, 1991b); una evidente estacionalidad con prevalencias más altas entre mayo y julio en C. ariakensis de EE. UU. (Carnegie et al., 2008) y valores de prevalencia más altos entre marzo y mayo para O. puelchana de Argentina (Kroeck et al., 2008). Todavía no se ha estudiado la dinámica temporal de B. exitiosa en O. edulis ni en O. stentina, por lo que no está claro si hay estacionalidad. Algunos estudios indican que las temperaturas altas favorecen el desarrollo de la enfermedad mientras que las bajas ralentizan su transmisión (Audemard et al., 2008; Carnegie et al., 2008). La salinidad también influye en la dinámica de Bonamia, encontrándose valores más altos de prevalencia cuando la salinidad es mayor de 30 g/l (Bishop et al., 2006; Audemard et al., 2008; Carnegie et al., 2008; Arzul et al., 2009). 2.1.3. Ciclo de vida y transmisión Los estadios del ciclo de vida de B. ostreae y B. exitiosa que se observan habitualmente en las ostras son células uni o binucleadas denominadas microcélulas y, menos frecuentemente, estadios plasmodiales. Las microcélulas uninucleadas tienen un diámetro de 1 a 2,5 µm y presentan un núcleo periférico en el caso de B. ostreae (Figura 6) mientras que en B. exitiosa el diámetro es de 2 a 5 µm con un núcleo central o subcentral (Abollo et al., 2008) (Figura 7). Figura 6. Corte histológico de Ostrea edulis con numerosas células de Bonamia ostreae (flechas) en las que se observa la posición periférica de su núcleo. Introducción general 11 El papel que juega cada estadio en el ciclo de vida de Bonamia no está todavía claro. Las formas uninucleadas de B. ostreae y B. exitiosa se observan al microscopio electrónico como formas densas a los electrones, con un núcleo pequeño y condensado, o bien como formas claras. Algunos estudios sugieren que las formas densas constituyen el estadio infectivo, mientras que las claras aparecerían en infecciones leves (Pichot et al., 1980; Hine, 1991a). Sin embargo, esta hipótesis no se ha confirmado. Las formas binucleadas representan microcélulas en división celular, mientras que la función de los plasmodios multinucleados también es desconocida, aunque algunos autores sugieren que esta fase corresponde a la explosión proliferativa del parásito que conduce a la muerte del hospedador (Brehélin et al., 1982). Se ha constatado la transmisión experimental de B. ostreae por cohabitación de ostras no infectadas con ostras infectadas y por inoculación del parásito a ostras no infectadas (Elston et al., 1987; Mialhe et al., 1988; Hervio et al., 1995; Culloty et al., 1999), lo que evidencia la posibilidad de transmisión directa del parásito de ostras enfermas a ostras sanas en el medio natural. Se cree que B. exitiosa se transmite del mismo modo en bancos de ostra (Hine, 1996; Cranfield et al., 2005; Corbeil et al., 2006a), habiéndose comprobado su transmisión de ostras C. ariakensis infectadas a ostras no infectadas, mediante experimentos de cohabitación (Audemard et al., 2014) en el medio natural. El parásito se introduce en la ostra a través del agua filtrada (Bucke, 1988; Montes et al., 1994), pasando al epitelio branquial donde es fagocitado por los hemocitos (Montes et al., 1994). Dentro de estas células, el parásito se multiplica por fisión binaria y llega a provocar la ruptura del hemocito, de forma que los parásitos liberados pueden ser fagocitados por nuevos hemocitos. Los parásitos, bien libres bien en el interior de los hemocitos, abandonan el hospedador a través de las heces o por diapédesis de los hemocitos infectados (Abollo y Villalba, 2011). Asimismo, Arzul et al. (2011) detectaron B. ostreae y B. exitiosa en larvas, lo que sugiere una hipotética “transmisión vertical” sui generis durante el período de incubación larvaria. Las larvas infectadas, durante su fase planctónica, podrían contribuir también a la dispersión del parásito. Figura 7. Corte histológico de Ostrea edulis con numerosas células de Bonamia exitiosa (flechas) en las que se observa la posición central de su núcleo. Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 12 A pesar de que todo apunta a la transmisión directa de B. ostreae y B. exitiosa, de ostra a ostra, no se puede descartar que haya fases no conocidas en su ciclo de vida, pues se han identificado otros hospedadores posibles (Lynch et al., 2007; Hartikainen et al., 2014a) y, además, el hallazgo de una especie del género Bonamia que produce esporas (B. perspora), permite hipotetizar la existencia de fase esporal en el ciclo de las otras especies del género aunque no se hayan encontrado. Se han realizado numerosos estudios de transmisión con el objetivo de determinar si otros moluscos, como Mytilus edulis, M. galloprovincialis, R. decussatus, R. philippinarum o C. edule, juegan algún papel en el ciclo del parásito (Van Banning, 1987; Figueras y Robledo, 1994; Renault et al., 1995; Culloty et al., 1999). Sin embargo, estos moluscos no se infectaron experimentalmente. En el caso de la ostra japonesa C. gigas, se han encontrado indicios de que puede actuar como reservorio tanto de B. exitiosa como de B. ostreae (Lynch et al., 2010). 2.1.4. Interacción hospedador-parásito La aparición de B. ostreae en Europa a finales de los años 70 provocó mortalidades muy altas en las poblaciones y cultivos de ostra plana en diferentes países europeos (Pichot et al., 1980; Polanco et al., 1984; Hudson y Hill, 1991; van Banning, 1991; Culloty y Mulcahy, 2001). Por este motivo, la producción de O. edulis en el continente descendió drásticamente de 29.595 t en el año 1961 a 5.921 t en el año 2000 (FAO, 2004). B. exitiosa también causó mortalidades masivas en poblaciones de O. chilensis en Nueva Zelanda. En 1985 se confirmó un brote epidémico con mortalidades elevadas de ostra que duraron hasta 1995, provocando incluso el cierre de la pesquería (Doonan et al., 1994; Cranfield et al., 2005). Un segundo brote epidémico se produjo entre los años 2000-2006 con mortalidades que alcanzaron el 72% de la población (Anonymous, 2006). En Galicia, se ha descrito que B. ostreae afecta al crecimiento e índice de condición de las ostras (Montes y Meléndez, 1987; Montes et al., 1991). Los signos macroscópicos de la infección producida por Bonamia son hendiduras en el borde de las láminas branquiales, perforaciones branquiales y, en algunas ocasiones, decoloración amarilla y lesiones en el tejido conjuntivo de branquias, manto y glándula digestiva (Dinamani et al., 1987; Tigé et al., 1980; Grizel et al., 1988; Mc Ardle et al., 1991). Estas lesiones son producidas por una reacción inflamatoria muy intensa, con infiltración hemocitaria del tejido conjuntivo e incluso epitelios de los órganos afectados, que llega a causar la pérdida de la arquitectura normal de estos órganos y la oclusión del sistema circulatorio (Figura 8). Se ha observado que B. ostreae aparece más frecuentemente y se multiplica más eficientemente dentro de los hialinocitos que de los granulocitos (tipos hemocitarios), ya que aquéllos carecen de lisosomas (Cochennec-Laureau et al., 2003b; da Silva et al., 2008). Varios estudios han mostrado que el parásito es capaz de modular la respuesta inmune del hospedador para aumentar el número de hemocitos más susceptibles y disminuir la producción de radicales tóxicos de oxígeno (ROS), que poseen actividad antimicrobiana (Morga et al., 2009; Comesaña et al., 2012), modificar los niveles de determinadas actividades enzimáticas de la hemolinfa (Xue y Renault, 2000; da Silva et al., 2008; Morga et al., 2009) y de otras proteínas (Cao et al., 2009; De la Ballina et al., 2013). Introducción general 13 Recientemente, estudios genómicos han descrito una expresión diferencial de genes implicados en diferentes procesos biológicos entre ostras infectadas y sanas (Martín- Gómez et al., 2012, 2014a; Morga et al., 2011a, b, 2012). Martín-Gómez et al. (2014b) describieron 19 microARNs (ARN con capacidad de regular la expresión de otros genes), específicos de ostras infectadas con Bonamia; también el empleo de microarrays ha mostrado genes implicados en la respuesta inmune frente a Bonamia (Pardo et al., 2013). 2.1.5. Estrategias de lucha Según el Manual Diagnóstico para Animales Acuáticos publicado por la OIE (2012a, b), los mecanismos de prevención y control de la bonamiosis se basan en la selección genética de estirpes de ostra resistentes a la enfermedad y en prácticas generales de manejo del cultivo. Las medidas terapéuticas como la vacunación, inmuno-estimulación o tratamientos químicos no se aplican en acuicultura de moluscos bivalvos que se desarrollan en el medio natural. Cuando la enfermedad se ha establecido en una zona determinada, se deben implementar medidas encaminadas a disminuir la incidencia y la gravedad de la enfermedad, como modificaciones en la gestión de las pesquerías o en los procedimientos de cultivo. Sabiendo que la mortalidad máxima de las ostras en zonas con Bonamia se alcanza en el último verano de engorde, poco antes de que alcancen el tamaño comercial, Montes et al. (2003) propusieron modificaciones en el procedimiento del cultivo, tratando de acelerar el ritmo de crecimiento de las ostras. La producción de estirpes resistentes a la bonamiosis es otra de las medidas llevadas a cabo para mitigar los daños producidos por la enfermedad. En Irlanda, un programa desarrollado por una empresa desde los años 80 del siglo pasado ha conseguido aumentar la supervivencia de las ostras en presencia de la enfermedad de forma significativa y satisfactoria (Culloty et al., 2001, 2004; Lynch et al., 2014), mientras que en Francia (Martin et al., 1993; Baud et al., 1997; Naciri-Graven et al., 1998, 1999; Lallias et al., 2008) y en España, concretamente en Galicia (da Silva et al., 2005; Villalba et al., 2007), se han desarrollado programas experimentales con resultados prometedores. Figura 8. Corte histológico de Ostrea edulis en el que se observa la reacción inflamatoria producida frente Bonamia ostreae en las branquias de la ostra. Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 14 2 2. .2 2. . P Pe er rk ki in ns so os si is s 2.2.1. Taxonomía La posición taxonómica del género Perkinsus es controvertida desde su descubrimiento. La primera especie descrita, P. marinus, se consideró inicialmente un hongo que se denominó Dermocystidium marinum (Mackin et al., 1950). Posteriormente, estudios morfológicos y estructurales incluyeron a P. marinus en diferentes filos como Ascomicetes, Entomoftorales, Saprolegniales, Haplosporidia y finalmente Laberintúlidos (Mackin, 1951; Sprague, 1954; Mackin y Boswell, 1956; Mackin, 1962; Mackin y Ray, 1966). Tras estas clasificaciones, Levine (1978) creó el género Perkinsus y lo incluyó en el filo Apicomplexa, basándose en la ultraestructura de la zoospora de este parásito (Perkins, 1976a). Sin embargo, ya en los años 90 los análisis moleculares basados en la región del ADN que codifica la subunidad pequeña ribosómica y en el gen de la actina sugirieron que el género Perkinsus estaba más próximo a los dinoflagelados que a los Apicomplexa (Fong et al., 1993; Goggin y Barker, 1993; Siddal et al., 1997). Cavalier-Smith y Chao (2004) incluyen el género Perkinsus en el filo Myzozoa, como un linaje muy próximo evolutivamente a los dinoflagelados, y lo clasifican dentro del orden Perkinsida, clase Perkinsea. La reciente caracterización de genes codificantes de diversas proteínas y el estudio de genes implicados en el ciclo celular, apoyan la hipótesis de que este género constituye un clado próximo al linaje de los dinoflagelados (Saldarriaga et al., 2003; Zhang et al., 2011; Bachvaroff et al., 2011, 2014). Adl et al. (2012), en una nueva revisión de los Protistas, proponen la posición taxonómica siguiente: Eukarya: Alveolata: Protoalveolata: Perkinsidae. A pesar de que se han descrito 10 especies de Perkinsus, actualmente solo 7 se consideran válidas: P. marinus (Mackin et al., 1950), P. olseni (= P. atlanticus) (Lester y Davis, 1981), P. qugwadi (Blackbourn et al., 1998), P. chesapeaki (=P. andrewsi) (McLaughlin et al., 2000), P. mediterraneus (Casas et al., 2004), P. honshuensis (Dungan y Reece, 2006) y P. beihaiensis (Moss et al., 2008). La especie P. karlssoni descrita como parásito del pectínido Argopecten irradians de Canadá (McGladdery et al., 1991), no se considera actualmente válida pues se demostró que varios de los estadios descritos correspondían a parásitos diferentes (Goggin et al., 1996). La caracterización de las especies de Perkinsus se llevó a cabo, en un principio, basándose en la morfología del zooesporangio y de la hipnoespora, el rango hospedador y la distribución geográfica. Sin embargo, debido al gran número de hospedadores y a la amplia distribución geográfica que tienen algunas especies de Perkinsus, estos criterios no se consideran suficientes hoy en día para distinguir especies. Actualmente el criterio más importante usado para discriminar entre especies de este género es el análisis de secuencias de ADN de varios loci, principalmente el estudio de diferentes regiones del complejo génico del ADN que codifica el ARN ribosómico (subunidad grande LSU, espaciadores transcritos internos ITS1 e ITS2, espaciador no transcrito NTS) y genes de actina (tipo I y tipo II) (Villalba et al., 2004; Moss et al., 2008). Los siguientes apartados de Introducción general 15 este capítulo se centran en las especies P. olseni, P. mediterraneus y P. chesapeaki, que son las especies objeto del estudio recogido en esta memoria. 2.2.2. Epidemiología 2.2.2.1. Distribución geográfica y especies hospedadoras El rango geográfico de las especies de Perkinsus así como sus especies hospedadoras es muy amplio. P. olseni es la especie más cosmopolita del género, registrándose en diferentes países de Oceanía, América, Europa, Asia y África. P. olseni se encontró en orejas de mar Haliotis ruber y Haliotis laevigata, Haliotis scalaris y Haliotis cyclobates de Australia (Lester y Davis, 1981; O´Donoghue et al., 1991; Goggin y Lester, 1995); en almejas R. decussatus y R. philippinarum de países europeos como Francia, Portugal, España, Italia (Azevedo, 1989; Figueras et al., 1992; Sagristà et al., 1996; De la Herrán et al., 2000; Robledo et al., 2000; Abollo et al., 2006; Elandaloussi et al., 2009; Balseiro et al., 2010; Arzul et al., 2012; Pretto et al., 2014), en almejas finas de Túnez (El Bour et al., 2012) y en almejas japonesas de la costa pacífica de Japón, Corea del Sur y China (Choi y Park, 1997; Hamaguchi et al., 1998; Maeno et al., 1999; Park et al., 1999; Park y Choi, 2001; Choi et al., 2002; Park et al., 2005; Zhang et al., 2005; Wu et al., 2011). También se ha registrado la presencia de P. olseni en otras especies de almejas menos comerciales como Paphia undulata de Tailandia (Leethochavalit et al., 2004), Pitar rostrata de Uruguay (Cremonte et al., 2005), Protothaca jedoensis de Corea (Park et al., 2006a), Tridacna crocea de Vietnam (Sheppard et al., 2008), Austrovenus stutchburyi de Nueva Zelanda (Dungan et al., 2007) o Anadara trapezia de Australia (Dang et al., 2015), así como en las ostras perlíferas Pinctada maxima de Australia (Norton et al., 1993) y Pinctada fucata de la India (Sanil et al., 2010) y de las ostras comestibles Crassostrea ariakensis de Japón y China, Crassostrea hongkongensis de China (Moss et al., 2007) y Crassostrea gasar y Crassostrea rhizophorae de Brasil (da Silva et al., 2014). Desde finales de los 80 se ha detectado P. olseni en Galicia, infectando las almejas R. decussatus, R. philippinarum, V. corrugata y Polititapes rhomboides (Figueras et al., 1992, Casas et al., 2002; Robledo et al., 2000; Villalba et al., 2005; Balseiro et al., 2010). La especie P. chesapeaki es endémica del noreste de América y se ha descrito en las almejas Mya arenaria (McLaughlin et al., 2000; Dungan et al., 2002; Burreson et al., 2005; Reece et al., 2008), Macoma balthica (Coss et al., 2001a; Burreson et al., 2005; Reece et al., 2008), Mercenaria mercenaria (Coss et al., 2001a; Pecher et al., 2008), Macoma mitchelli (Coss et al. 2001a), Tagelus plebeius (Dungan et al., 2002; Bushek et al., 2008; Reece et al., 2008), Mulinia lateralis, Rangia cuneata y Cyrtopleura costata (Reece et al., 2008). A pesar de que P. chesapeaki principalmente infecta almejas, también se ha detectado parasitando las ostras C. virginica de Maine, Massachusetts y las bahías de Chesapeake y Delaware en EE. UU. (Pecher et al., 2008; Reece et al., 2008; Marquis et al., 2015). Sin embargo, el rango geográfico de esta especie es mayor del que se creía hasta hace poco, ya que recientemente se ha detectado la presencia de P. chesapeaki en Europa, concretamente en Francia (Arzul et al., 2012), infectando las almejas R. decussatus y R. philippinarum, y en España, infectando el berberecho C. edule (Carrasco et al., 2014), así como en Australia, infectando la almeja Anadara trapezia (Dang et al., 2015). Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 16 P. mediterraneus presenta una distibución geográfica y rango hospedador mucho más limitado que las especies anteriores. Sólo se ha detectado en el mar Mediterráneo, infectando la ostra plana O. edulis (Casas et al., 2004) y la almeja Chamelea gallina (Moss et al., 2008) y recientemente se ha encontrado en el arca Arca noae y la zamburiña Mimachlamys varia (=Chlamys varia) (Valencia et al., 2014). El esfuerzo investigador en torno a la perkinsosis hace que el número de especies de Perkinsus, su rango geográfico y la lista de especies hospedadoras crezcan, lo que evidencia la necesidad de disponer de técnicas de detección sensibles que permitan un diagnóstico específico a nivel de especie. 2.2.2.2. Influencia de algunas características del hospedador en la parasitación La edad del molusco juega un papel importante a la hora de adquirir la enfermedad de la perkinsosis. Las ostras y almejas adultas presentan niveles mayores de prevalencia de Perkinsus debido a una tasa mayor de filtración y una exposición al parásito más prolongada. Así, se ha detectado una prevalencia mayor de P. olseni en almejas R. decussatus de más de tres años en un banco natural de Galicia, mientras que no se detectó el parásito en las menores de un año (Villalba et al., 2005). Otros factores que favorecen la progresión de Perkinsus son un mal estado nutricional del hospedador o la debilidad del mismo tras la puesta (Hofmann et al., 1995; Powell et al., 1996). 2.2.2.3. Influencia de factores ambientales en la parasitación La dinámica de infección de la perkinsosis está influenciada fundamentalmente por factores ambientales. Los estudios epidemiológicos llevados a cabo hasta el momento se basaron principalmente en P. marinus y, en menor medida, en P. olseni. En el caso de P. olseni se observó un patrón estacional relacionado con la temperatura. Villalba et al. (2005) observaron que la infección por P. olseni en un banco de almeja fina de Galicia mostraba un pico de intensidad cuando la temperatura alcanzaba los 15ºC. La intensidad alta se mantiene desde la primavera hasta final de verano, cuando se alcanzan temperaturas de 19-21ºC y se producen las tasas de mortalidad mayores de las almejas. Con el descenso de temperatura, desciende la intensidad de infección, comenzando un nuevo ciclo en la primavera siguiente. Por tanto, años con invierno e inicio de primavera poco fríos son más proclives a tener una intensidad y prevalencia elevadas de la perkinsosis y a sufrir mortalidades importantes de ostras o almejas (Liang et al., 2008). Estos autores también constataron que la salinidad tiene una gran influencia en la dinámica de infección de la almeja japonesa R. philippinarum por P. olseni. Otros experimentos in vitro han confirmado que la temperatura y la salinidad influyen en la actividad celular y viabilidad de P. marinus y P. olseni (Chu y Greene, 1989; Burreson et al., 1994; Auzoux-Bordenave et al., 1995; O´Farrell et al., 2000; Ahn y Kim, 2001; Casas et al., 2002; La Peyre et al., 2006, 2008). Estos experimentos demostraron que la tasa de proliferación de P. marinus y P. olseni fue mayor a 28ºC que a 15ºC, pero a esta última temperatura la tasa de P. olseni fue mayor a la de P. marinus, lo que concuerda con los resultados obtenidos en el campo. Introducción general 17 Otros factores ambientales que influyen en la dinámica de infección de Perkinsus son factores estresantes como los contaminantes del agua, métodos agresivos de extracción de los moluscos o zonas muy afectadas por la actividad humana (Chu y Hale, 1994; Anderson et al., 1996; Leite et al., 2004). La contaminación, la hipoxia y la infección por P. olseni han sido las responsables de altas mortalidades de almeja fina R. decussatus en el Algarve (Portugal) (Azevedo, 1989; Bebianno, 1995; Sobral y Widdows, 1997). 2.2.3. Ciclo de vida y transmisión El ciclo de vida de Perkinsus no se conoce en su totalidad, pero se sabe que es directo y no necesita hospedadores intermediarios para completarse (Ray, 1954; Goggin y Lester, 1995; Chu, 1996; Blackbourn et al., 1998). Se han descrito tres estadios: trofozoíto, hipnoespora y zooespora. El trofozoíto corresponde a la fase de multiplicación vegetativa que tiene lugar en los tejidos del hospedador (Figura 9). Estas células tienen forma esférica u ovoide, con una gran vacuola que ocupa buena parte de su volumen y un núcleo en posición periférica con un nucleolo patente. El tamaño del trofozoíto varía, según la especie, en un rango de 5-15 µm. Los trofozoítos se multiplican por divisiones binarias sucesivas y las células hijas (de 2 a 64 permanecen durante un tiempo juntas dentro de la pared de la célula madre, formando una estructura con forma de roseta (esquizonte), hasta que la pared se rompe y se liberan las células hijas denominadas trofozoítos inmaduros. Estos trofozoítos inmaduros aumentan de tamaño y desarrollan la gran vacuola, convirtiéndose en trofozoítos maduros (Goggin y Lester, 1995; Perkins, 1996; Blackbourn et al., 1998) que pueden liberarse del molusco vivo a través de las heces o por diapédesis (Scanlon et al., 1997; Bushek et al., 2002; Allam et al., 2013; Park et al., 2013) y también debido a la muerte del hospedador (Ragone-Calvo et al., 2003a). Las especies del género Perkinsus, excepto P. qugwadi, presentan la particularidad de que sus trofozoítos aumentan su tamaño, incluso más de tres veces, y se rodean de una Multiplicación vegetativa Trofozoíto Esquizonte Figura 9. Esquema que muestra los sucesivos pasos de la multiplicación vegetativa de Perkinsus olseni Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 18 pared polisacárida gruesa cuando se incuban en caldo de tioglicolato, en oscuridad y condiciones anaeróbicas, transformándose así en un nuevo estadio denominado hipnoespora. Se ha observado que cuando las hipnoesporas se incuban en agua de mar comienza el proceso de zooesporulación (Figura 10); las hipnoesporas pueden mantenerse vivas en condiciones adversas durante periodos prolongados y entran en zooesporulación cuando las condiciones son favorables, por lo que se cree que las hipnoesporas son la fase de resistencia del ciclo de vida de Perkinsus (Casas et al., 2002). El proceso de zooesporulación supone sucesivas divisiones binarias manteniéndose la gruesa pared intacta, de forma que se forman centenares de zooesporas en el interior del zooesporangio. Las zooesporas (Figura 11) son liberadas del zooesporangio a través de uno o dos tubos de descarga que aparecen en la hipnoespora antes de que comiencen las divisiones celulares (Perkins y Menzel, 1966, 1967; Azevedo, 1989; Auzoux-Bordenave et al., 1995; McLaughlin et al., 2000; Casas et al., 2002, 2004). Casas y La Peyre (2013) mostraron evidencias de que la diferenciación de trofozoítos a hipnoesporas se produce en condiciones asociadas a tejidos en descomposición, pudiendo desarrollarse este estadio en los hospedadores muertos como una forma de resistencia. Se desconoce cuál es el estadio que más frecuentemente inicia la infección en un hospedador Figura 10. Progresión de la zooesporulación. A: zooesporangio unicelular con tubo de descarga (flecha); B: zooesporangio de 2 células; C: zooesporangio de 4 células; D: zooesporangio dividiéndose para pasar de 4 a 8 células; E: zooesporangio de ocho células; F: zooesporangio de 16 células; G: cientos de zooesporas móviles dentro del zooesporangio; H: zoosporas móviles liberadas a través del tubo de descarga. Imágenes obtenidas de Villalba et al., 2011. Introducción general 19 sano en el medio natural, aunque se ha demostrado experimentalmente que tanto trofozoítos, hipnoesporas, zoosporangios y zooesporas son capaces de transmitir la infección (Goggin et al., 1989; Rodríguez et al., 1994; Volety y Chu, 1994; Chu, 1996; Bushek et al., 1997, 2002a; Chintala et al., 2002; Ford et al., 2002). La ruta de entrada de las diferentes células de Perkinsus en el hospedador ocurre a través de las branquias, del manto y del tubo digestivo, dispersándose a otros tejidos por medio de la hemolinfa (Azevedo et al., 1989; Navas et al., 1992; Rodríguez y Navas, 1995; Villalba et al., 2004). Allam et al. (2013) proponen que las células de Perkinsus entran en la cavidad paleal del hospedador, son capturadas por las branquias y transferidas a los palpos branquiales, donde una pequeña parte es ingerida, mientras que el resto de células son transferidas al área de descarga de las pseudoheces. Estudios genéticos también indican que las especies del género Perkinsus podrían tener reproducción sexual, pues se han observado individuos diploides heterocigotos en cultivos clonales del parásito y en ostras infectadas (Robledo et al., 1999; Reece et al., 2001; Thompson, 2010; Thompson et al., 2011, 2014; Pardo et al., 2011; Vilas et al., 2011). 2.2.4. Interacción hospedador-parásito Se han llevado a cabo numerosos estudios acerca de la interacción entre Perkinsus y sus hospedadores, fundamentalmente de la interacción de las especies P. olseni (objeto de estudio de esta tesis) y P. marinus. P. olseni es responsable de grandes mortalidades de almejas y de pérdidas económicas importantes. Este parásito ha causado mortalidades en poblaciones de almeja fina de Galicia, alcanzando mortalidades anuales acumuladas del 41% (Villalba et al., 2005), y del Algarve, registrando mortalidades entre un 50-80% (Ruano y Cachola, 1986). El cultivo de la almeja japonesa también ha sufrido mortalidades por P. olseni que alcanzaron el 90-100% en cultivos de Cataluña y de la Laguna de Venecia (Santmartí et al., 1995; Pretto et al., 2014). En Asia este parásito es el responsable de una dramática reducción de la almeja japonesa en Corea, cayendo su producción a la quinta parte desde 1990 hasta 1997 (Park y Choi, 2001), y de importantes mortalidades en Japón (Choi et al., 2002) y China (Liang et al., 2001). Figura 11. Micrografía electrónica de transmisión de una zoospora de Perkinsus olseni obtenida con un microscopio electrónico de transmisión. Fotografía de Villalba et al., 2011. Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 26 (Villalba et al., 1993c; Figueras et al., 1996) y en el longueirón vello Solen marginatus (López y Darriba, 2006; Ruiz et al., 2015) . 2.3.2.2. Influencia de algunas características del hospedador en la parasitación Tanto en ostras como en mejillones, la prevalencia y la intensidad de infección por M. refringens son generalmente superiores en los individuos de edad igual o superior a 2 años, al igual que la infección de M. sydneyi en ostras S. glomerata (Wolf, 1979; Villalba et al., 1993a; Audemard et al., 2001). 2.3.2.3. Influencia de factores ambientales en la parasitación La dinámica de infección de M. refringens en ostra está relacionada con la temperatura y, por tanto, presenta una marcada estacionalidad. En Europa se han descrito infecciones de ostra con este parásito desde mayo a diciembre, alcanzando picos de prevalencia e intensidad en los meses de verano (Balouet, 1977; Grizel, 1985; Audemard et al., 2001). M. refringens esporula y se transmite entre los meses de verano y otoño, alcanzando tasas de mortalidad del 50-90% (Grizel et al., 1974; Grizel, 1985; OIE 2012c). En invierno, los esporangios primarios no se desarrollan y las infecciones son ligeras, hasta la llegada de la primavera y el aumento de la temperatura del agua, a partir de las cuales, las infecciones progresan hasta alcanzar los picos de prevalencia e intensidad del verano (Alderman, 1979; Balouet et al., 1979; Grizel, 1985; Berthe et al., 1998; Audemard et al., 2004a). Diversos estudios han intentado establecer la dinámica de infección de M. refringens en mejillones, pero los resultados no han sido concluyentes. Villalba et al. (1993a) y Robledo y Figueras (1995) no encontraron un patrón estacional claro de la enfermedad, observando formas maduras del parásito en el sistema digestivo de los mejillones gallegos a lo largo de todo el año, con picos de prevalencia en períodos diferentes. En la Bahía de Alfacs (Tarragona) también se observaron esporangios maduros en mejillones a lo largo de todo el año, sin embargo, se detectaron mayores prevalencias en los meses de julio a septiembre, cuando las temperaturas superaban los 17 ºC (Carrasco et al., 2007). Estudios realizados en Córcega confirman la esporulación del parásito a lo largo de todo el año, pero la intensidad de la esporulación y, por tanto, de la infección y la prevalencia aumentan entre junio y agosto (Arzul et al., 2014). En septiembre, las intensidades y el número de individuos afectados disminuyen considerablemente, lo que sugiere la liberación del parásito al medio y/o una defensa efectiva del hospedador, que logra superar la infección. Por otra parte, en el sureste de Francia solo se detectaron esporangios maduros del parásito en los meses de primavera y otoño (Boyer et al., 2013), lo que podría indicar que el parásito tenga dos ciclos por año y que la enfermedad pueda transmitirse en estos dos períodos. Algunos autores sugieren que los cambios de temperatura repentinos podrían activar al parásito y favorecer su esporulación (Carrasco et al., 2008), lo que explicaría la presencia de formas maduras durante todo el año y, principalmente, en los meses de verano. Para la especie recientemente descrita M. cochillia no se dispone todavía de información epidemiológica. Introducción general 27 2.3.3. Ciclo de vida y transmisión El ciclo de vida completo de las especies del género Martelia aún no se conoce, aunque existen evidencias de que se trata de un ciclo de vida indirecto que necesita hospedadores intermediarios para cerrarse. La infección de M. refringens comienza en el tracto digestivo de las ostras, observándose células esféricas uninucleadas y de tipo plasmodial en el epitelio ciliado del estómago y de los túbulos digestivos (Grizel et al., 1974). Estas células uni y plurinucleadas descritas por Herrbach (1971) y Comps (1970) se consideran los estadios primarios del desarrollo de M. refringens. Posteriormente, se produce una división endógena de los núcleos y del citoplasma que les rodea y se forman las células secundarias, 8 para M. refringens y 4 para M. cochillia (Carrasco et al., 2013). Estas células secundarias darán lugar, cada una de ellas, a las células terciarias que compondrán el esporangio (3-4 para M. refringens, 6 para M. cochillia) (Grizel et al., 1974; Audemard et al., 2001; Aranguren et al., 2011; Carrasco et al., 2013). Cuando la pared de las células primarias alcanza la madurez, se rompe y se desprenden los esporangios (Herrbach, 1971; Grizel, 1985), que son liberados al lumen del tracto digestivo y, a través de las heces de la ostra, pasan al medio externo (Perkins, 1976b; Audemard et al., 2002; Berthe et al., 2004). El mismo proceso de esporulación se observó en M. refringens infectando mejillones, pero en este caso se produce una colonización masiva de todos los túbulos digestivos de forma simultánea (Villalba et al., 1993a; Robledo y Figueras, 1995). Carrasco et al. (2013) también observaron todas las etapas de esporulación de M. cochillia en el epitelio de los divertículos digestivos del berberecho C. edule, encontrando algunas células parasitando la glándula digestiva y esporangios libres en el intestino y en las heces. Existen numerosos estudios que tratan de esclarecer la ruta que siguen las esporas una vez liberadas al medio. Grizel (1985) sugirió que las esporas de M. refringens podrían requerir un tiempo de maduración en el agua del mar o en el sedimento antes de ser infectivas. Se han realizado numerosos estudios en los que se ha intentado, sin éxito, transmitir M. refringens entre individuos de ostra plana, mediante cohabitación e inyección de suspensiones de esporas del parásito (Balouet, 1979; Grizel, 1985; Berthe et al., 1998). Estos resultados han llevado a proponer la hipótesis de que el ciclo de vida pueda ser heteroxeno. En la búsqueda de hospedadores intermediarios, en un primer momento se barajó la posibilidad de que peces filtradores cumplieran esta función, sin embargo los experimentos de infección con M. sydneyi no dieron resultado (Roubal et al., 1989; Wesche et al., 1999). Otras especies estudiadas como posibles hospedadores de Marteilia spp., también dieron resultados negativos, como los poliquetos Polydora spp., Pomatoceros triqueter y Spirorbis spp., el molusco Crepidula fornicata y diferentes especies de crustáceos como los decápodos Crangon crangon, los anfípodos Marinogammarus marinus, los cangrejos Carcinus maenas, la langosta Galathea squamifera o la nécora Liocarcinus puber (Balouet et al., 1979; Van Banning, 1979). La diversidad de especies presentes en bancos naturales de ostras hace complicada la búsqueda de hospedadores intermediarios. Audemard et al. (2001) realizaron un estudio de diversidad de especies en “estanques” naturales de las marismas de la bahía francesa Marennes-Oléron, denominados localmente “claires”, en los que el número de especies reconocidas es menor de 100 (Reymond, 1991) y en donde se encontraba M. refringens infectando la ostra plana con altos valores de prevalencia. Cuando se estudió la presencia/ausencia de M. refringens Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 28 en cada una de las especies reconocidas en esta zona, se detectó, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e hibridación in situ (ISH), que el ovario del copépodo Paracartia grani estaba infectado por este parásito (Audemard et al., 2002). La implicación de P. grani en el ciclo de vida de M. refringens es congruente también con la ecología del copépodo, la epidemiología de la enfermedad y la distribución geográfica de ambos, ya que P. grani coexiste en las mismas zonas que Marteilia y se observa principalmente en primavera y verano, periodo que coincide con el periodo de transmisión de esporas de Marteilia (Audemard et al., 2002; Boyer et al., 2013; Arzul et al., 2014). Experimentos de cohabitación demuestran que los copépodos adquieren la infección cuando están presentes ostras infectadas con M. refringens. Sin embargo, no se ha conseguido demostrar que los copépodos infectados transmiten el parásito a ostras sanas (Audemard et al., 2002; Carrasco et al., 2008). Boyer et al. (2013) detectaron M. refringens en todos los estadios de vida de P. grani, incluidos sus huevos, e infectando no sólo el ovario, sino también su tracto digestivo. Estos autores sugieren que el copépodo ingiere el parásito y dentro de él se multiplica y migra al ovario. Una vez allí, los huevos podrían contribuir a la dispersión de M. refringens, ya que P. grani produce gran cantidad de huevos en septiembre, periodo en el que las esporas de M. refringens se liberan al agua; o podrían actuar de reservorio del parásito en el sedimento durante la fase de diapausa que sufren en invierno (Audemard et al., 2002; Boyer et al., 2013), lo que apoyaría las hipótesis de Grizel (1985) y Wesche et al. (1999) de que las esporas tienen un periodo de vida corto en la columna de agua y necesitan un período de maduración antes de transmitirse a nuevos moluscos. Otra especie del género Paracartia, P. latisetosa, también podría actuar como hospedador intermediario, ya que también se han detectado infecciones por M. refringens en su ovario (Arzul et al., 2014). Los parásitos podrían ser liberados a través de los conductos gonadales o liberados con los huevos durante el desove. Asimismo, se han obtenido resultados positivos por PCR, usando cebadores específicos de Marteilia en otras especies del género Paracartia y en otros copépodos como Oithona sp., Euterpina acutifrons y Evadne sp., aunque la infección no se ha confirmado mediante histología o ISH (Carrasco et al., 2007; Arzul et al., 2014). ¿Cómo se transmiten las esporas de M. refringens de las distintas etapas de desarrollo de los copépodos a los moluscos? 1) La ausencia de transmisión del parásito de copépodos infectados a moluscos, podría indicar la presencia de un tercer hospedador en el ciclo de vida de Marteilia (Audemard et al., 2002); 2) los copépodos infectados (o sus gametos) podrían ser ingeridos por el molusco (Audemard et al., 2002; Carrasco et al., 2008; Arzul et al., 2014). Los mejillones suelen filtrar partículas más pequeñas que los copépodos (entre 4-35 µm) pero algunos autores han demostrado que M. edulis puede filtrar ciliados de hasta 90 µm de tamaño (Trottet et al., 2008) y que huevos y larvas de copépodos son retenidos por M. galloprovincialis (Arzul et al., 2014). Se requieren más estudios para cerrar el ciclo de vida de las especies de Marteilia. En coherencia con la hipótesis de un hospedador intermedio para las especias del género Marteilia, recientemente se ha publicado la presencia de M. sydneyi en poliquetos Nephtys australiensis (Adlard y Nolan, 2015). Introducción general 29 2.3.4. Interacción hospedador-parásito M. refringens es el agente causal de la enfermedad de los Abers que provoca elevadas mortalidades en la ostra plana, O. edulis, en Europa (Grizel et al., 1974; Massó, 1978; Alderman, 1979; van Banning, 1979). Los mejillones M. edulis y M. galloprovincialis son también susceptibles a la enfermedad, aunque existen discrepancias a la hora de valorar el efecto letal de este parásito. Algunos autores describieron a M. refringens como el agente causal de cierta mortalidad de mejillón (Villalba et al., 1993a; Fuentes et al., 1994), mientras que en otros casos estas infecciones no se asociaron a episodios de mortalidad (Comps et al., 1982; Longshaw et al., 2001). Las ostras parasitadas por M. refringens experimentan una disminución o ausencia de crecimiento y muestran decoloración de tono amarillo claro en la masa visceral (Comps, 1970; Berthe et al., 2004; Aranguren et al., 2011). El parásito provoca una disminución en la absorción de materia orgánica en M. galloprovincialis, provocando incluso inanición, lo que conlleva una pérdida de condición importante e incluso la muerte del mejillón (Pérez-Camacho et al., 1997). La infección por M. refringens comienza en las células epiteliales del sistema digestivo y, a medida que el parásito progresa, va limitando la actividad metabólica del hospedador y sus funciones digestivas, e incluso obtura los túbulos digestivos (Comps, 1970; Grizel et al., 1974). Así, M. refringens interfiere en el almacenamiento del glucógeno en la ostra (Robert et al., 1991). Las esporas maduras de M. refringens se liberan al mar a través del lumen de los túbulos digestivos y del intestino, tras la destrucción del epitelio de la gándula digestiva y de los túbulos digestivos secundarios (Alderman, 1979; Robledo y Figueras, 1995). En estadios terminales de la enfermedad, las ostras son incapaces de cerrar las valvas (Aranguren et al., 2011). Las infecciones de M. refringens en mejillones M. edulis y M. galloprovincialis provocan síntomas similares a los de la enfermedad en la ostra. La infección por M. refringens también tiene efectos negativos en la gametogénesis y en el desarrollo gonadal de ostras y mejillones, inhibiendo incluso, en el caso de infecciones severas, el ciclo gametogénico del año siguiente (Robert et al., 1991; Villalba et al., 1993b). La nueva especie descrita, M. cochillia, parasita también los túbulos digestivos del berberecho C. edule, provocando mortalidades elevadas (Carrasco et al., 2011) (Figura 15). Los mecanismos de defensa del hospedador frente a las especies del género Marteilia todavía no se conocen en profundidad. En general, la defensa del hospedador consiste en un aumento significativo de hemocitos circulantes en la hemolinfa (Carballal et al., 1998) y una infiltración hemocitaria en las zonas parasitadas por Marteilia (Alderman, 1979; Figueras et al., 1991; Villalba et al., 1993a; Robledo y Figueras, 1995; Dang et al., 2011). La especie más estudiada en relación a la interacción con su hospedador es M. sydneyi. Se ha demostrado que los hemocitos de S. glomerata, principalmente los granulocitos, están implicados en el control de la infección por M. sydneyi (Newton et al., 2004; Aladaileh et al., 2007; Butt y Raftos, 2008; Kuchel et al., 2010). In vivo, estas células son capaces de fagocitar células de M. sydneyi y, tras la fusión de los pseudópodos forman fagosomas, dentro de los cuales se incluye el parásito. Tras la formación de estos fagosomas, los lisosomas presentes en los hemocitos se fusionan a su membrana, Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 30 liberando los productos que contiene para llevar a cabo la digestión del parásito (Kuchel et al., 2010). Los hemocitos son capaces de fagocitar esporangios maduros de gran tamaño (6-30 µm), mediante la formación de estos fagosomas y posterior melanización de los mismos (Butt y Raftos, 2008). Numerosos estudios han demostrado la existencia de altos niveles de fenoloxidasa y fosfatasa ácida en el interior de los lisosomas de los hemocitos de ostras infectadas por M. sydneyi (Peters y Raftos, 2003; Newton et al., 2004; Bezemer et al., 2006; Butt y Raftos, 2008). La fenoloxidasa está implicada en la ruta de producción de melanina, necesaria para degradar al parásito dentro de las cápsulas hemocitarias. Se ha observado que ostras seleccionadas como resistentes a la enfermedad poseen una mayor actividad fenoloxidasa que ostras no seleccionadas y presentan hemocitos de mayor tamaño (Newton et al., 2004; Butt y Raftos, 2008), lo que confirmaría su papel en la defensa frente al parásito. Peters y Raftos (2003) apuntan a que una de las dianas de M. sydneyi para sobrevivir dentro del hospedador, sería la inhibición de la cascada pro-fenoloxidasa, mediante la síntesis de proteinasas serínicas que interfieren en la activación de esta cascada. De hecho, se ha observado la supresión de la actividad fenoloxidasa en ostras justo antes de la esporulación del parásito (Peters y Raftos, 2003; Butt et al., 2006; Butt y Raftos, 2007). Por el momento el conocimiento sobre proteínas o genes implicados en la respuesta inmune de los moluscos frente a Marteilia spp. es limitado, aunque se han llevado a cabo algunos estudios preliminares que muestran una expresión diferencial de genes que codifican para enzimas antioxidantes en ostras infectadas por M. sydneyi y sanas (Green et al., 2009), así como un aumento de proteínas de este tipo en ostras infectadas por el parásito (Simonian et al., 2009). 2.3.5. Estrategias de lucha La prevención de la marteiliosis es fundamental en acuicultura, ya que M. refringens y M. cochillia han causado grandes mortalidades y pérdidas económicas (Herrbach, 1971; Grizel et al., 1974; Alderman, 1979; Grizel, 1985; Goulletquer y Héral, Figura 15. Corte histológico que muestra Marteilia cochillia parasitando los túbulos digestivos del berberecho Cerastoderma edule. Introducción general 31 1997; Carrasco et al., 2011). Se han probado productos químicos como el azul de metileno, el verde malaquita y el furanace para intentar eliminar a M. refringens en ostras planas infectadas (Grizel, 1979). Con estos tratamientos no se consiguió erradicar el parásito y, en algunos casos, se mostraron tóxicos para las ostras. La propagación epidémica puede evitarse estableciendo programas efectivos de control de movimientos de moluscos de áreas afectadas a áreas libres de la enfermedad. Una vez que el parásito se establece en una zona, las estrategias de lucha deben ir encaminadas a una mejor gestión de su cultivo, en base al conocimiento existente sobre su biología, y a buscar moluscos resistentes a la enfermedad. En áreas endémicas, debería evitarse el inicio del cultivo de semillas y juveniles de ostra plana entre junio y agosto, ya que es el periodo de transmisión de M. refringens (Perkins, 1993). El desarrollo de la marteiliosis podría minimizarse cultivando las ostras en aguas frías, con temperaturas menores a los 17º C, y con salinidades altas (Grizel, 1985; Bower et al., 1994; Berthe et al., 1998; Audemard et al., 2001, 2002). Sin embargo, son necesarios más estudios que permitan evaluar la influencia de los factores bióticos y abióticos en el desarrollo de la enfermedad, así como conocer el ciclo de vida completo del parásito para buscar vías con que minimizar el impacto de esta enfermedad. Es de destacar la estrategia de lucha seguida en Australia frente a M. sydneyi. Tras más de 20 años desarrollando un programa de selección de ostras resistentes a la enfermedad han reducido la mortalidad de las poblaciones de S. glomerata, pasando de un 97% en ostras no seleccionadas a un 28% en ostras seleccionadas, y han reducido las pérdidas económicas que descendieron de un 52% a un 23% (Dove et al., 2013a,b). 2 2. .4 4. . M Mi ik kr ro oc cy yt to os si is s 2.4.1. Taxonomía El género Mikrocytos lo propusieron Farley et al. (1988) para incluir a dos protozoos: M. mackini, causante de la enfermedad denominada “Denman Island Disease”, que afectaba a las ostras japonesas C. gigas en el entorno de la isla Denman (Columbia Británica, Canadá), y M. roughleyi, agente etiológico de la enfermedad “Winter mortality” responsable de elevadas mortalidades en las ostras S. glomerata en Australia. Estos autores incluyeron a ambos parásitos en el mismo género basándose en observaciones microscópicas, en las cuales se evidenciaba que ambos parásitos eran células pequeñas, menores de 5 µm, de tipo esférico y núcleo excéntrico que les daba una apariencia de huevo frito; en la especificidad celular, ya que ambos eran parásitos de hemocitos; y en su mismo modo de transmisión, directamente de ostra a ostra (Carnegie y Cochennec- Laureau, 2004). A las especies del género Mikrocytos, junto a las del género Bonamia, se les denomina microcélulas por su tamaño pequeño y por ser parásitos de hemocitos de ostra. Ambos géneros se diferenciaron en función de los signos macroscópicos de las enfermedades que causaban y de sus especies hospedadoras (Farley et al., 1988). La Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 32 ultraestructura de M. mackini también confirmó que se trataba de un parásito diferente a Bonamia spp., principalmente porque no se observaban mitocondrias u orgánulos equivalentes, ni haplosporosomas, excluyéndolos así de los Haplosporida (Farley et al., 1988; Hine et al., 2001b) (Figura 16). Sin embargo, estudios morfológicos de M. roughleyi demostraron que este parásito mostraba más similitudes con el género Bonamia que con Mikrocytos, por poseer haplosporosomas y mitocondria (Hine et al., 2001b; Cochennec-Laureau et al., 2003a), lo que se confirmó mediante estudios moleculares (Cochennec-Laureau et al., 2003a) y permitió un cambio en su asignación, pasando a llamarse B. roughleyi. Desde entonces, M. mackini ha sido la única especie integrante de este género y su posición filogenética dentro de los eucariotas ha sido una incógnita, ya que la secuencias de su ADN ribosómico obtenidas eran altamente divergentes con las de cualquier otro filo de Protistas (Carnegie et al., 2003b). Adl et al. (2012) incluyeron al género Mikrocytos en el grupo Haplosporida. Sin embargo, el desarrollo de las nuevas tecnologías de secuenciación masiva han permitido secuenciar el transcriptoma de M. mackini y realizar estudios filogenéticos más robustos, usando un mayor número de genes (Burki et al., 2013); estos estudios concluyeron que M. mackini ha de incluirse dentro del grupo Rhizaria y, aunque no aclararon su posición dentro del mismo, sugirieron que este género podría ser un taxón hermano de los Haplosporida (donde se incluye el género Bonamia). Por otra parte, Burki et al. (2013) demostraron que M. mackini no es un organismo amitocondrial, si no que posee “orgánulos mitocondriales reducidos” (MROs), lo que lo convierte en el primer organismo con MROs descrito dentro del grupo Rhizaria. Poco tiempo después, Hartikainen et al. (2014b) confirmaron que este género está incluido dentro de Rhizaria como taxón hermano a los Haplosporida. Además, el descubrimiento de nuevos organismos relacionados molecularmente con Mikrocytos, en nuevos hospedadores y rangos geográficos, permitió agruparlos en una nueva familia Mikrocytiidae, orden Mikrocytida e incluirlos en la clase Ascetospora (Hartikainen et al., 2014b). Entre estos organismos mikrocytidos se describió la nueva especie, M. mimicus, que se detectó como parásito de la ostra japonesa C. gigas; también recientemente se ha descrito la especie nueva M. boweri, que infecta la ostra Ostrea lurida (Abbott et al., 2014). Existen otros parásitos de moluscos descritos como Mikrocytos sp. o tipo Mikrocytos cuya posición taxonómica no se ha establecido debido a la escasez de Figura 16. Micrografía de Mikrocytos mackini (flechas) infectando Crassostrea gigas. En el interior de las células se observa el núcleo con un nucleolo prominente. Fotografía de Bower (2015). Introducción general 33 secuencias disponibles de este género y a los pocos estudios ultraestructurales existentes (Gagné et al., 2008; Wang et al., 2010b; Garcia et al., 2012). Las recientes descripciones de M. mimicus y M. boweri, que aportan un mayor conocimiento ultraestructural y molecular de este género, junto con los avances recientes en el análisis filogenético de Mikrocytos, favorecerán la descripción de nuevas especies y la asignación, si corresponde, de los Mikrocytos sp. a alguna de las especies ya descritas. 2.4.2. Epidemiología 2.4.2.1. Distribución geográfica y especies hospedadoras Durante más de una década, M. mackini ha sido la única especie conocida representante de este género, con registro en un único hospedador, la ostra japonesa C. gigas, y en una sola localización geográfica, la Columbia Británica (Canadá) (Quayle, 1982; Bower, 1988; Farley et al., 1988; Bower et al., 1994; Abbott et al., 2011). En los últimos años, el rango geográfico y hospedador de este género se ha ampliado notablemente. M. mackini también se ha detectado en Washington (EE. UU.) infectando C. gigas (Bower, 2010; Abbott et al., 2011) y en California (EE. UU.) parasitando una nueva especie hospedadora Crassostrea sikamea (Elston et al., 2012). Recientemente, la especie M. boweri también se ha descrito parasitando la ostra japonesa en la costa oeste de EE. UU. y la ostra O. lurida en la Columbia Británica (Canadá) (Abbott et al., 2011; Abbott et al., 2014), mientras que M. mimicus se describió infectando C. gigas en el Reino Unido (Hartikainen et al., 2014b). También existen registros de Mikrocytos sp. infectando la ostra O. lurida de California (EE. UU.) (Friedman et al., 2005), O. edulis en Nueva Escocia (Canadá) (Gagné et al., 2008), C. gigas en China (Wang et al., 2010b) y la almeja Donax trunculus en Francia (Garcia et al., 2012). Abbott y Meyer (2014) apuntan que los parásitos tipo Mikrocytos que parasitan C. gigas de China y O. edulis de Canadá podrían tratarse de la especie M. boweri, ya que sus secuencias de ADN ribosómico son idénticas. Además, se han detectado diferentes secuencias de ADN de microcítidos en muestras ambientales de Reino Unido, entre las que se incluyen secuencias idénticas a las de M. mackini y M. boweri (Hartikainen et al., 2014b). 2.4.2.2. Influencia de algunas características del hospedador y de factores ambientales en la parasitación Se han realizado infecciones experimentales con M. mackini cuyos resultados indicaron que las especies C. virginica, O. edulis y O. lurida son susceptibles a la infección y que individuos jóvenes de ostra japonesa menores de 2 años también desarrollan la enfermedad (Bower et al., 1997; Bower et al., 2005). Este parásito presenta un patrón estacional de infección, detectándose por histología entre los meses de enero y junio y provocando mortalidades entre marzo y mayo (Bower, 1988; Farley et al., 1988; Quayle, 1988). Esta estacionalidad está ligada a la dependencia de Mikrocytos por las bajas temperaturas del agua. Mediante experimentos de laboratorio de observó que ostras expuestas a M. mackini a temperaturas menores de 10 ºC durante tres meses, desarrollaron la enfermedad, mientras que temperaturas de 15 ºC inhibían su desarrollo, Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 34 aunque no eliminaban el parásito. Posteriormente, cuando estas ostras se sometieron de nuevo a temperaturas bajas, se recuperaba la infección (Hervio et al., 1996; Bower et al., 1997). Estos experimentos confirman lo observado en el campo, ya que las diferentes especies de Mikrocytos se han encontrado en latitudes altas, entre los 41ºN de California (M. mackini parasitando C. sikamea) y los 53ºN de Reino Unido (M. mimicus infectando C. gigas), en las cuales las temperaturas en invierno son cercanas o menores a 10ºC (Bower, 1988; Quayle, 1988; Gagné et al., 2008; Wang et al., 2010b; Garcia et al., 2012; Elston et al., 2012; Abbott y Meyer, 2014; Hartikainen et al., 2014b). 2.4.3. Ciclo de vida y transmisión No se conoce el ciclo de vida completo de las especies del género Mikrocytos. Estudios de campo y laboratorio muestran que M. mackini puede transferirse de ostra a ostra directamente (Quayle, 1961; Bower et al., 1997). Las células viables de M. mackini liberadas al morir el hospedador, son adquiridas probablemente por un individuo nuevo a través de los mecanismos de alimentación. Las células de M. mackini que se encuentran en los hemocitos pueden salir al exterior por diapédesis, a través del tracto intestinal y las branquias (OIE, 2012d). Se han identificado tres tipos de células en M. mackini y M. mimicus, en base a sus características ultraestructurales: (1) células quiescentes (QC) localizadas en el tejido conjuntivo vesicular, en hemocitos, extracelularmente y en los miocitos del músculo aductor y del corazón; (2) células vesiculares (VC) observadas sólo en los miocitos o extracelularmente cerca de ellos; (3) células endosomales (EC), que se encuentran en hemocitos, extracelularmente o en el tejido conjuntivo vesicular, pero nunca en miocitos (Hine et al., 2001b; Hartikainen et al., 2014b). Hine et al. (2001b) sugieren un posible ciclo de vida directo dentro de los tejidos del hospedador, en el cual las QC del tejido conjuntivo vesicular viajan a través de los hemocitos al músculo aductor o al corazón. En los miocitos de estos órganos, los QC adquieren ATP de las mitocondrias de las células del hospedador y se transforman en VC, que endocitan ATP y proteínas del miocito. Estas VC salen del miocito transformadas en EC y migran de nuevo, dentro de los hemocitos, al tejido conjuntivo vesicular. Estas EC obtienen energía y proteínas de las mitocondrias hemocitarias y desarrollan un retículo endoplasmático, un complejo de Golgi túbulo-vesicular, hacen la glucolisis y se dividen mediante cariocinesis para dar lugar a células hijas que se convierten en QC, empezando de nuevo el ciclo. Por el momento, no se han encontrado formas esporuladas o de resistencia que permitan al parásito sobrevivir en el medio externo y que indiquen la posibilidad de que el ciclo de vida de las especies del género Mikrocytos sea indirecto. Sin embargo, la reciente detección de diferentes secuencias de microcítidos, entre los que se encuentran M. mackini y M. boweri, en muestras ambientales que incluían copépodos y otros invertebrados, podría indicar que estos organismos actúan como vectores o transportadores de estos parásitos o, tal vez, podrían jugar un papel importante en el ciclo de vida de Mikrocytos como hospedadores intermediarios (Hartikainen et al., 2014b). Introducción general 35 2.4.4. Interacción hospedador-parásito Los signos macroscópicos provocados por M. mackini y M. mimicus en C. gigas incluyen lesiones focales pequeñas como ulceraciones, abscesos o pústulas, generalmente de color verde, de hasta 5 mm de diámetro, observadas principalmente en el manto, músculo aductor y palpos labiales (Figura 17). Adyacentes a los abscesos de la superficie del manto pueden existir cicatrices marrones en la concha. A pesar de estas lesiones, las ostras infectadas suelen estar en buen estado hasta el momento de su muerte, aunque cuando su estado es moribundo o muy débil cierran con lentitud y herméticamente las valvas (OIE, 2012d; Abbott y Meyer, 2014; Hartikainen et al., 2014b). Sin embargo, no se han descrito signos macroscópicos de la enfermedad provocados por M. mackini en C. sikamea, por M. boweri en C. gigas u O. lurida, o en las almejas parasitadas por Mikrocytos sp. A nivel histológico, M. mackini, M. boweri y M. mimicus suelen encontrarse en el citoplasma de las células del tejido conjuntivo vesicular, en las fibras del músculo aductor principalmente, aunque también se han observado en el epitelio de la glándula digestiva, gónada, intestino, corazón y branquias. En estos órganos, provocan infiltraciones hemocitarias focales intensas asociadas con áreas de necrosis en los tejidos conjuntivos vesiculares. También se han encontrado evidencias de que los hemocitos pueden fagocitar estas microcélulas (Hine et al., 2001b; Meyer et al., 2005; Abbott et al., 2014; Hartikainen et al., 2014b). La información proporcionada sobre la detección de Mikrocytos sp. en C. gigas de China y en O. edulis de Nueva Escocia no incluye la descripción de infiltraciones hemocitarias focales en el tejido conjuntivo vesicular, posiblemente porque en el momento de la detección, la infección era subclínica (Gagné et al., 2008; Wang et al., 2010b). En la actualidad no existen estudios a nivel celular o molecular que aclaren las estrategias que siguen los parásitos de este género para desarrollar la infección dentro de sus hospedadores, ni de cómo se defienden éstos para vencerla. La ausencia de verdaderas mitocondrias en Mikrocytos y la proximidad del parásito a las mitocondrias de las células del hospedador, sugiere que éste podría transferir moléculas de ATP y otros materiales de las mitocondrias de las células hospedadoras a su citoplasma (Hine et al., 2001b; Burki et al., 2013). Figura 17. Músculo aductor de Crassostrea gigas mostrando las lesiones características (flechas) provocadas por Mikrocytos mackini en una infección avanzada. Fotografía de Bower (2015). Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 42 que permite incluso detectar polimorfismos o mutaciones puntuales. Además, el empleo de varias sondas con diferentes fluoróforos y dianas hace posible una prueba multiplex. Sin embargo, el uso de sondas encarece notablemente la prueba de PCR y su optimización es mucho más compleja que en el caso del SYBR Green. La principal ventaja que presenta la PCR en tiempo real frente a la PCR convencional es la posibilidad de cuantificar moléculas de ADN, lo que permite estimar intensidades de infección. Las señales fluorescentes de cada ciclo de PCR se convierten en un valor numérico para cada muestra analizada, lo que hace viable cuantificar el ADN molde inicial de una muestra. La cuantificación puede ser absoluta, si es posible realizar una curva estándar en la que se asocien concentraciones conocidas del ADN a analizar con unos determinados valores de fluorescencia, o relativa, cuando se comparan los valores de fluorescencia obtenidos frente a un ADN de referencia. Otras ventajas de la PCR en tiempo real frente a la PCR convencional son su rapidez, ya que no se necesita un análisis posterior de los productos amplificados en geles de agarosa; el menor riesgo de contaminación, ya que toda la prueba se realiza en un sistema cerrado, y la posibilidad de detectar polimorfismos o mutaciones. Estas ventajas, junto a una mayor sensibilidad que las PCR convencionales, como veremos posteriormente, la convierten en una potente herramienta para el diagnóstico de enfermedades de moluscos así como para estudios epidemiológicos en los que se valore el progreso de la infección a lo largo del tiempo o crecimiento del molusco, el seguimiento de la evolución de las infecciones en diferentes órganos, o para contribuir al estudio del ciclo de vida de los parásitos. 3.1.5. PCR-DGGE (Electroforesis en Gel con Gradiente Desnaturalizante) La electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE, “Denaturing Gradient Gel Electrophoresis”) es un tipo de electroforesis que permite la separación de fragmentos de ADN del mismo tamaño pero con diferente secuencia de nucleótidos. Esta electroforesis se lleva a cabo en geles de poliacrilamida a los que se les incorpora un gradiente lineal creciente de agentes químicos desnaturalizantes del ADN (urea y formamida). Durante la electroforesis, los fragmentos de ADN de doble cadena migran por el gel hasta encontrar una determinada concentración desnaturalizante, que hace que se separen las cadenas parcialmente, disminuyendo o deteniendo su migración. La concentración desnaturalizante que separa cada molécula de ADN dependerá de su contenido en dobles o triples puentes de hidrógeno, dependiendo de si son pares de bases adenina-timina o citosina-guanina (Myers et al., 1987). Esto provocará que un producto de PCR que contenga moléculas de ADN del mismo tamaño, pero distinta composición nucleotídica, no migre en una sola posición como en los geles de agarosa, sino que cada molécula diferente tendrá diferentes posiciones en los geles DGGE. Además, para evitar que las moléculas de ADN se desnaturalicen completamente y no queden retenidas en el gel, la amplificación por PCR de los fragmentos a analizar por DGGE requiere la adición de una cola rica en nucleótidos GC denominada clamp. El clamp es una secuencia de 30-50 pares de bases de guanina-citosina, que se añade al extremo 5´ de uno de los cebadores y es amplificada en cada PCR con el fragmento de ADN diana (Myers et al., 1987). Los triples puentes de hidrógeno de esta cola, no permiten que la molécula se desnaturalice en su Introducción general 43 extremo 5´, pero sí lo hará el resto dependiendo de la composición y concentración desnaturalizante, quedando la molécula retenida en el gel. Este método tiene un alto poder de discriminación, detectando hasta variaciones de un nucleótido en una secuencia de ADN (Fisher y Lerman, 1983; Lerman y Beldjord, 1999). 3.1.6. Hibridación in situ (ISH) Las técnicas moleculares basadas en PCR permiten detectar ADN del parásito pero no dan información acerca de la viabilidad del mismo, ni de su localización histológica exacta. Así, resultados positivos por PCR no indican una infección real, ya que el parásito puede no ser viable o puede que su localización no sea en los tejidos del hospedador sino en la superficie externa o en un lumen comunicado con el exterior, sin causar infección (Burreson, 2008). Es importante, por lo tanto, visualizar el parásito en los tejidos del hospedador. La ISH es la técnica más adecuada para esto, ya que ofrece las ventajas de la histología y la especificidad de las técnicas moleculares. Se basa en el uso de una secuencia de ADN complementaria al ADN del parásito a detectar, que se unirá a él de forma específica, y que va marcada con compuestos que permiten una clara visualización del mismo (Figura 19). Estos compuestos suelen ser fluoróforos o una molécula de origen vegetal de la que se disponen anticuerpos específicos denominada digoxigenina. La ISH consume más tiempo que las técnicas de PCR por lo que no es muy útil para el diagnóstico rutinario de un gran número de muestras. Sin embargo, el diagnóstico por técnicas de PCR de especies nuevas de parásitos o de las ya existentes en hospedadores nuevos debería confirmarse mediante ISH, para descartar la posibilidad de que se trate de falsos positivos o de parásitos inviables. Además, la ISH puede dar información sobre: 1) la interacción entre el hospedador y el parásito como por ejemplo qué órganos o tejidos están infectados y el grado y avance de la infección; 2) la presencia/ausencia de varias especies de parásitos causando infecciones mixtas en un mismo hospedador y 3) el ciclo de vida, ya que se puede observar la presencia de diferentes estadios de un parásito y visualizarlo en hospedadores intermediarios. Figura 19. Hibridación in situ de Marteilia refringens (puntos azules) parasitando los túbulos digestivos de Ostrea edulis. Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 44 3.1.7. Secuenciación masiva Los avances tecnológicos de los últimos años han conducido al desarrollo de la secuenciación de nueva generación (next generation sequencing, NGS), también conocida como secuenciación masiva paralela, del inglés massive parallel sequencing (MPS). Este proceso de secuenciación en paralelo produce miles o millones de secuencias a la vez, abaratando enormemente la secuenciación de ADN. Las tecnologías de secuenciación masiva incluyen varias etapas que pueden agruparse en la preparación del “template” o plantilla, secuenciación, sistema de imagen y análisis de datos. La combinación única de protocolos específicos distingue una tecnología de otra y determina la clase de datos producidos en cada plataforma (Harismendy et al., 2009; Metzker, 2010). Un punto común entre todas las tecnologías de NGS es que la plantilla se une o inmoviliza en una superficie sólida o soporte, lo que permite que las moléculas estén separadas espacialmente y se puedan llevar a cabo miles e incluso millones de reacciones de secuenciación simultáneamente. Los métodos existentes para la preparación de la plantilla se clasifican en aquellos en los que es necesario una amplificación previa del ADN (Clonally amplified templates) y los que no necesitan de una PCR previa (Single-molecules templates). Incluidos en el primer grupo se encuentran los dos métodos más comunes de preparación de la plantilla: 1) PCR en emulsión, en la cual se crea una librería de fragmentos a los que se les unen en los extremos una serie de adaptadores universales, lo que permite amplificar todo el ADN con una misma pareja de cebadores. Posteriormente, el ADN de doble cadena se separa en ADN de cadena sencilla y se captura sobre la superficie de unas bolas de agua, de forma que en cada bola haya una sola molécula de ADN. Estas bolas se depositan en pocillos individuales de una placa de muy pequeño volumen en los cuales se realiza la secuenciación, o previamente se pueden inmovilizar en una superficie, como por ejemplo un gel de poliacrilamida; 2) Amplificación en fase sólida, que se basa en la fijación de los cebadores en un soporte de vidrio, lo que permite obtener grupos de fragmentos amplificados separados espacialmente y con extremos libres a los cuales se les pueden unir cebadores universales para realizar la secuenciación. Los métodos que no necesitan amplificación previa del ADN se basan en la inmovilización del ADN molde, DNA polimerasa y/o cebadores sobre un soporte sólido. Las estrategias principales de secuenciación incluyen pirosecuenciación (Ronaghi et al., 1998), la terminación reversible cíclica (Metzker, 2005), la secuenciación por medio de la enzima ADN liasa (Tomkinsosn et al., 2006) y la secuenciación en tiempo real (Eid et al., 2009). La NGS produce una cantidad de datos tan elevada que requiere un análisis computacional para realizar los ligamientos de las lecturas obtenidas en base a una secuencia de referencia o un ensamblaje de novo (Trapnell y Salzberg, 2009). El uso de esta tecnología en bivalvos sirvió para realizar diversos estudios como los encaminados a identificar genes implicados en la respuesta inmune (Moreira et al., 2012; Philipp et al., 2012; Rosa et al., 2012; Leite et al., 2013; McDowell et al., 2014, Menike et al., 2014, Moreira et al., 2014, Pauletto et al., 2014, Zhang et al., 2014; Gómez- Chiarri et al., 2015; He et al., 2015; Meng et al., 2014) o para investigar procesos biológicos como la deposición de la concha o la biomineralización de almejas (Clark et al., 2010; Joubert et al., 2010). La tecnología NGS se ha empleado para realizar un estudio transcriptómico de M. mackini, que permitió obtener gran cantidad de genes, entre los que Introducción general 45 se encuentran genes con gran relevancia taxonómica (Burki et al., 2013). Por el momento la NGS es poco usada en el diagnóstico o identificación de especies patógenas de moluscos bivalvos, aunque ya se ha publicado un estudio en el cual se usó esta tecnología para la detección de la nueva especie y nuevo género Paramikrocytos canceri, parásito mikrocítido del cangrejo Cancer pagurus, y de la especie Haplosporidium littoralis que infecta el hepatopáncreas de Carcinus maenas (Hartikainen et al., 2014b). 3 3. .2 2. . M Mé ét to od do os s m mo ol le ec cu ul la ar re es s p pa ar ra a e el l d di ia ag gn nó ós st ti ic co o d de e B Bo on na am mi ia a, , P Pe er rk ki in ns su us s, , M Ma ar rt te ei il li ia a y y M Mi ik kr ro oc cy yt to os s 3.2.1. Género Bonamia Se han descrito diversos protocolos de PCR para el diagnóstico de Bonamia spp., tres de los cuales están recogidos en el Manual de Test diagnósticos para Animales Acuáticos de la OIE (OIE, 2012 a, b). Estos protocolos de PCR emplean cebadores diseñados en la región SSU de los parásitos de este género: 1) Bo/Boas (Cochennec et al., 2000) que amplifican un producto de PCR de 300 pb, pero que no son específicos de B. ostreae si no que pueden amplificar otros Haplosporida; 2) CF/CR (Carnegie et al., 2000), que dan lugar a un producto de 760 pb y que detectan, al menos, B. ostreae y B. exitiosa, y 3) BoosF03/BoosR03, que amplifican 352 pb y su especificidad se limita a B. ostreae (Engelsma et al., 2010). Para la identificación específica, en la prueba descrita por Cochennec et al. (2000), el producto de PCR obtenido por amplificación con los cebadores Bo/Boas se digiere con la enzima BglI. Esta restrictasa produce dos perfiles de restricción diferentes: una banda de 300 pb para B. exitiosa y dos bandas de 120 pb y 180 pb para B. ostreae (Hine et al., 2001a, Cochennec-Laureau et al., 2003a). Otros protocolos de PCR para Bonamia spp. basados en la región SSU, son los descritos por Marty et al. (2006) empleando una pareja de cebadores denominada BO-1/BO-4, que amplifican 237 pb, y por Abollo et al. (2008) quienes diseñaron los cebadores BOG-F/BOG-R, que dan lugar a un amplificado de aproximadamente 665 pb. Este último protocolo permite la identificación específica de B. exitiosa y B. ostreae si el producto de PCR es digerido con la enzima de restricción SalI, que produce dos perfiles de restricción diferentes para ambas: dos bandas de 319 y 350 pb para B. exitiosa y una única banda de 665 pb para B. ostreae (Abollo et al., 2008). Carnegie et al. (2006) también diseñaron un protocolo de PCR para detectar B. perspora, aunque su especificidad no se evaluó frente a otras especies de Bonamia. Actualmente existen tres protocolos de PCR en tiempo real recomendadas por la OIE para el diagnóstico de la bonamiosis. Los procedimientos descritos por Corbeil et al. (2006b) y Marty et al. (2006) emplean sondas TaqMan y amplifican todas las especies del género. La prueba descrita por Robert et al. (2009) emplea SYBR Green como fluoroforo y permite la detección y cuantificación específica de B. ostreae. Engelsma y Voorbergen- Laarman (2009) basándose en el diseño de Corbeil et al. (2006b), describieron un nuevo protocolo de PCR en tiempo real empleando SYBR Green. Mediante esta nueva PCR, Carrasco et al. (2012a) identificaron, en una única prueba, B. ostreae y B. exitiosa en base a Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 46 los diferentes valores de Tm que presenta cada una de las especies (B. ostreae 78.5 ºC y B. exitiosa 79.8 ºC). Sin embargo, la proximidad de ambos valores hace que este método sólo sea válido para realizar un diagnóstico presuntivo a nivel de especie y que la identificación deba corroborarse mediante otras pruebas más específicas (Carrasco et al., 2012a). Se han desarrollado varios protocolos de ISH para la detección de Bonamia spp. en cortes histológicos. Por un lado, los cebadores Bo/Boas descritos anteriormente se usaron para sintetizar una sonda polinucleotídica que lleva incorporada digoxigenina (Cochennec et al., 2000). Tanto la especificidad como la sensibilidad de esta sonda son más elevadas que las del diagnóstico por histología convencional. Sin embargo, esta sonda muestra reacción cruzada con otras especies de Bonamia y otros Haplosporida. Carnegie et al. (2003a) diseñaron otro protocolo de ISH basado en la región ITS1 de B. ostreae, usando un conjunto de tres oligosondas marcadas con fluoresceína (UME-BO-1, 2, 3), con el objetivo de aumentar la sensibilidad, que mostró ser mayor que la sensibilidad del método histológico. Sin embargo, estas sondas presentan reacción cruzada con B. exitiosa. Otros autores también usaron un conjunto de tres oligosondas (CaBon166, CaBon461, CaBon1704) marcadas con digoxigenina para el clado B. exitiosa- B. roughleyi, pero no evaluaron la especificidad ni la sensibilidad de las mismas (Hill et al., 2010). Carnegie et al. (2006) diseñaron un conjunto de 4 oligosondas con marcaje fluorescente (B. perspora-ISH- 1, 2, 3, 4) para identificar B. perspora en los tejidos de ostra O. stentina y conocer las preferencias celulares y tisulares del parásito. Este protocolo de ISH se probó frente a tejidos de ostra C. ariakensis parasitada por B. exitiosa y sus resultados fueron negativos. Sin embargo, su especificidad frente a B. ostreae y otros haplospóridos es desconocida. 3.2.2. Género Perkinsus La OIE recoge en su Manual de Test Diagnósticos para Animales Acuáticos las técnicas moleculares recomendadas para las dos especies de Perkinsus listadas por esta organización, P. marinus y P. olseni, entre los que se encuentran varios protocolos de PCR. Este organismo recomienda, para la vigilancia del género Perkinsus y de la especie P. marinus, realizar un primer análisis de PCR con los cebadores genéricos PerkITS- 750/PerkITS-85 (Casas et al., 2002), y una segunda prueba con los cebadores PmarITS- 70F/PmarITS600R para identificar P. marinus (Audemard et al., 2004b). En el caso de P. olseni, la OIE recomienda el uso de dos protocolos de PCR cuya diana es la región NTS de esta especie, localizada entre el gen ribosómico 5S y el gen SSU. La primera pareja de cebadores, PA690F/PA690R amplifican un fragmento de 690 pb de dicha región (Robledo et al., 2000) y su especificidad se evaluó frente a P. marinus y P. chesapeaki, pero no frente a otras especies. La sensibilidad analítica de esta técnica muestra que su límite de detección es bajo, aunque no se ha evaluado frente al método de cultivo en caldo tioglicolato (RFTM). La segunda pareja de cebadores, PK1/PK2, amplifica un fragmento de 554 pb de la región NTS de P. olseni, pero su especificidad y sensibilidad no se han estudiado (De la Herrán et al., 2000). Existen otros protocolos de PCR convencional específicos para el género Perkinsus (Robledo et al., 2002; Gauthier et al., 2006) y para P. marinus y P. olseni que no están recogidos por la OIE en su manual (Fong et al., 1993; Marsh et al. 1995; Hamaguchi et al., 1998; Robledo et al., 1998; Park et al., 2002; Pecher et Introducción general 47 al., 2008). También se ha desarrollado un protocolo de PCR para el diagnóstico específico de P. chesapeaki, usando como diana la región NTS del parásito. La especificidad de sus cebadores, NTS6/NTS7, se evaluó frente a P. marinus y P. olseni y su sensibilidad analítica se mostró alta, detectando cantidades de hasta 100 fg de ADN del parásito (Coss et al., 2001b). Moss et al. (2008) desarrollaron un protocolo específico para P. beihaiensis que amplifica un fragmento de su región ITS1-5.8S-ITS2. Los cebadores diseñados, PerkITS- 85/PerkITS-430R, se testaron frente a las restantes especies de Perkinsus, frente a algunos dinoflagelados y haplospóridos, mientras que su sensibilidad analítica no se evaluó. Asimismo, se diseñaron unos cebadores específicos para P. qugwadi, denominados PqguF7TC/PQ3R, que amplifican un fragmento de 281 pb de la región ITS1-5.8S-ITS2 de este parásito (Itoh et al., 2013). Este test no amplifica ADN de ninguna otra especie de Perkinsus, excepto una banda tenue de P. chesapeaki de tamaño mayor (300 pb). Esta prueba muestra unos límites de detección bajos y su sensibilidad es superior a la del diagnóstico por histología. En la actualidad no existen protocolos de PCR para la detección específica de P. mediterraneus, ni para P. honshuensis, lo que facilitaría un diagnóstico más rápido y sensible de estas especies. Se han desarrollado protocolos PCR-RFLPs útiles para la identificación de varias especies de Perkinsus, entre ellos el descrito por Abollo et al. (2006) y recomendado por la OIE. En esta prueba el producto de 703 pb amplificado con los cebadores PerkITS- 750/PerkITS-85 (Casas et al., 2002), es digerido con la enzima RsaI produciendo un patrón de bandas específico para P. marinus, P. chesapeaki y P. olseni/P. mediterraneus. A su vez, P. olseni y P. mediterraneus pueden diferenciarse mediante restricción con la endonucleasa HinfI. Se ha publicado otro protocolo de RFLP diseñado para diferenciar P. olseni de P. honshuensis presentes en la almeja japonesa, usando la enzima de restricción DdeI (Takahashi et al., 2009). Sin embargo, la diana de DdeI se sitúa en una zona polimórfica dentro de la región ITS de P. olseni, y algunas variantes de esta especie no dan el perfil esperado (Ramilo et al., datos no publicados). Penna et al. (2001) diseñaron un procedimiento de PCR multiplex para la detección de P. marinus, Haplosporidium nelsoni y Haplosporidium costale, responsables de las elevadas mortalidades de la ostra C. virginica. Posteriormente, Russell et al. (2004) diseñaron una PCR multiplex mejorada para detectar estas especies parásitas que permite, a su vez, detectar el ADN del hospedador C. virginica, que sirve de control interno de PCR para evitar falsos negativos. También se han descrito varios protocolos de PCR en tiempo real para la cuantificación de parásitos del género Perkinsus. El primero de ellos emplea el fluoróforo SYBR Green y los cebadores PerkITS-750/PerkITS-85, descritos por Casas et al. (2002), mostrando una sensibilidad mayor que la PCR convencional descrita por estos autores (Audemard et al., 2004b). La segunda PCR en tiempo real se trata de una prueba TaqMan en el que se diseñan nuevos cebadores específicos para el género Perkinsus, PERK- F/PERK-R, y una sonda marcada fluorescentemente que hibrida con el fragmento amplificado (Gauthier et al., 2006). Su sensibilidad y especificidad es mayor que la del RFTM, muy usado para el diagnóstico de perkinsosis (Ray, 1966). Además, se ha desarrollado un protocolo de PCR en tiempo real dúplex, capaz de detectar y cuantificar simultáneamente y de forma específica Haplosporidium spp. y Perkinsus spp. Dos parejas Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 48 de cebadores específicos para cada género, junto con sondas de hibridación para cada fragmento amplificado, permiten la detección de estos dos géneros en una única prueba (Xie et al., 2013). La especificidad de esta técnica se evaluó frente a patógenos como M. refringens, Toxoplasma gondii, B. ostreae, Escherichia coli, Cymndinium spp., M. mackini o Vibrio parahaemolyticus y su sensibilidad analítica fue alta (200 copias de ADNr). Para P. marinus se han diseñado varios protocolos de PCR en tiempo real, como los de Audemard et al. (2004b), Gauthier et al. (2006), Ulrich et al. (2007) y De Faveri et al. (2009). También se ha desarrollado un protocolo para cuantificar P. olseni y otro para P. honshuensis (Umeda et al. 2012). No se han descrito protocolos de PCR en tiempo real que permitan cuantificar P. chesapeaki, P. mediterraneus, P. beihaiensis y P. qugwadi. Para el género Perkinsus, la OIE recomienda un protocolo de ISH desarrollado por Elston et al (2004). La oligosonda (Perksp700DIG) de ADN, complementaria a la SSU de Perkinsus spp., lleva un marcaje de digoxigenina en su extremo 5´. La especificidad de este protocolo se evaluó frente a varias especies de Perkinsus y a parásitos haplospóridos y dinoflagelados. Este método es más sensible que la histología, pero no se ha comparado con el RFTM. Se ha descrito otra oligosonda que muestra especificidad a nivel de género, PK-5.8S-DIG, diseñada en la región 5.8S de Perkinsus spp. La especificidad de esta sonda se evaluó frente a otros patógenos de moluscos como Minchinia tapetis, Rickettsias, microsporidios, Nematopsis sp., hemogregarinas y coccidios (Navas, 2008). A nivel de especie se han desarollado protocolos de ISH específicos para P. marinus, P. chesapeaki, P. olseni y P. beihaiensis. El primero de ellos, diseñado para detectar P. marinus, es uno de los métodos recomendados por la OIE para la confirmación de este parásito (Moss et al., 2006). Para la detección de P. olseni también se ha desarrollado un protocolo de ISH específico para la especie, mediante la sonda PK-IGS-DIG que hibrida en la región IGS. La especificidad de esta sonda se demostró frente a P. chesapeaki, P. mediterraneus y P. marinus (de la Herrán, 1998; de la Herrán et al., 2000; Navas, 2008). Otras dos oligosondas con marcaje de digoxigenina y diseñadas en base a la región LSU de P. beihaiensis y P. chesapeaki son PerkBehLSU (Moss et al., 2008) y PchesLSU-485 (Reece et al., 2008), respectivamente. Su especificidad se ha demostrado frente a otras especies de Perkinsus. Basándose en esta región, Reece et al. (2008) también diseñaron un grupo de dos sondas marcadas fluorescentemente específicas para P. chesapeaki (PchesLSU-485 y P. chesLSU- 690) y otro grupo de tres sondas específicas para P. marinus (PmarLSU-181, PmarLSU-420 y PmarLSU-560). El uso de más de una sonda aumenta la sensibilidad de la técnica y el marcaje con distintos fluoróforos permite detectar varias especies en una misma prueba. No se han desarrollado protocolos de ISH específicos para P. mediterraneus, P. honshuensis y P. qugwadi. 3.2.3. Género Marteilia El primer protocolo de PCR descrito para el diagnóstico de la marteiliosis fue el desarrollado por Anderson et al. (1995). Posteriormente, en base a esta secuencia, se diseñaron los denominados LEG1/PRO2, que amplifican un fragmento de 195 pb dentro de la región ITS1 de M. sydneyi (Kleeman y Adlard, 2000). Estos cebadores específicos son los recomendados por la OIE para el diagnóstico de esta especie mediante PCR, aunque el Introducción general 49 protocolo no se ha validado frente a la histopatología. Su especificidad se ha demostrado frente a M. refringens y Marteilioides chungmuensis (Kleeman et al., 2002b) y su sensibilidad es alta (Kleeman y Adlard, 2000). En 1999, se publicó el primer protocolo de PCR para la detección específica de M. refringens (Le Roux et al., 1999). Estos autores diseñaron un grupo de cebadores específicos a nivel de especie y los combinaron entre ellos y con cebadores universales. Entre estas combinaciones las parejas de cebadores SAS2/SS2 y SAS1/SS2, detectaron específicamente M. refringens. La especificidad de estos cebadores también se evaluó frente a M. sydneyi y M. chungmuensis (Kleeman et al., 2002b). Sin embargo, el ADNr de la nueva especie M. cochillia también se amplifica con los cebadores SAS1/SS2, lo que demuestra que no son específicos a nivel de especie (Carrasco et al., 2012b). Berthe et al. (2000) utilizaron otros dos cebadores descritos por Le Roux et al. (1999), CAS2/SS1, para amplificar la región completa SSU del ADNr de M. refringens. La OIE, recomienda el método descrito por Le Roux et al. (2001), considerándolo un protocolo específico para esta especie, ya que la región ITS1 es más fiable para una detección a nivel de especie. Sin embargo, este protocolo (empleando los cebadores Pr3/PR4/Pr5) también amplifica la recientemente descrita M. cochillia (Carrasco et al., 2012b). Además de los protocolos descritos, se han publicado un par de protocolos de PCR anidada para el diagnóstico de M. refringens, los descritos por Pernas et al. (2001) y López-Flores et al. (2004). Este último se diseñó para amplificar un fragmento de la región IGS de M. refringens mediante los cebadores MT1/MT2 para la primera ronda de PCR y MT2B/MT1B para la segunda ronda PCR. Este protocolo es más sensible que las PCR convencionales descritas pero, al igual que en los casos anteriores, estos cebadores también amplifican la IGS de M. cochillia (Carrasco et al., 2012b), lo que pone de manifiesto que las pruebas de PCR descritas para el diagnóstico de Marteilia refringens no son específicas a nivel de especie. Actualmente existen dos protocolos de PCR-RFLPs descritos para discriminar especies de Marteilia. El procedimiento descrito por Le Roux et al. (2001) permite diferenciar entre M. refringens y M. maurini, pero actualmente está en desuso ya que se consideran la misma especie. También se ha descrito un procedimiento de PCR-RFLPs para diferenciar entre M. refringens y M. cochillia. Tras la amplificación con los cebadores MT2B/MT1B (López-Flores et al., 2004), se realiza la prueba de restricción con la enzima BglII. Esta enzima produce un perfil de dos bandas para M. cochillia (192 y 166 pb) y una única banda para M. refringens (358 pb) (Carrasco et al., 2012b). Existen varios protocolos de ISH descritos para M. refringens y M. sydneyi que emplean sondas polinucleotídicas sintetizadas empleando los cebadores ya descritos en el apartado anterior, a los cuales se les incorpora un marcaje con digoxigenina. Una de estas sondas es la denominada Smart 2, elaborada con los cebadores SAS1/SS2 (Le Roux et al., 1999). Este protocolo no detecta sólo M. refringens, sino que probablemente detecte todas las especies de este género y otros (Kleeman et al., 2002b; Carrasco et al., 2011). Este protocolo de ISH es el recomendado por la OIE para M. sydneyi y M. refringens, sin embargo sólo se ha validado frente a la técnica histológica para la segunda especie (OIE, 2012c), mostrando una especificidad del 90% y una sensibilidad del 99% frente a esta técnica (Thébault et al., 2005). La OIE también recoge el protocolo de ISH descrito por López- Flores et al. (2008a,b), cuya especificidad aún está sin evaluar (OIE, 2012c). Otros Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 50 protocolos de ISH diseñados para M. refringens menos utilizados son los desarrollados por Berthe et al. (2000) y por Pernas et al. (2001). Para la especie M. sydneyi, la OIE recomienda, además de la sonda genérica Smart 2 ya descrita, la sonda diseñada con los cebadores PRO2-LEG1 que se unen a su región ITS1 (Kleeman y Adlard, 2000). Esta sonda no muestra reacción cruzada con M. refringens ni M. chungmuensis, por lo que probablemente sea específica de M. sydneyi (Kleeman et al., 2002b). 3.2.4. Género Mikrocytos La falta de secuencias de M. mackini, única especie del género conocida durante años, y la reciente descripción de nuevas especies ha limitado el desarrollo de métodos de diagnóstico moleculares para este género. La primera secuencia de ADN que se obtuvo de M. mackini se generó a partir de su gen 18S (Carnegie et al., 2003b). A partir de esta región de 1.457 pb, se diseñó la única prueba de PCR utilizada durante años para el diagnóstico de este parásito. Los cebadores MIKROCYTOS-F/MIKROCYTOS-R de este protocolo amplifican un fragmento de 544 pb y su sensibilidad frente a la histología es mucho mayor. Recientemente, se ha observado que estos cebadores también amplifican el ADN de las nuevas especies de Mikrocytos descritas (Gagné et al., 2008; Wang et al., 2008; Abbott et al., 2011, 2014), lo que indica que este protocolo no es específico para la especie M. mackini, aunque tampoco amplifica todas las especies del género como es el caso de M. mimicus. Gagné et al. (2008) diseñaron una pareja de cebadores que amplifican ADN de M. mackini y el parásito Mikrocytos sp. descrito infectando O. edulis de Nueva Escocia (Canadá), y otras dos parejas de cebadores que detectan de forma específica cada uno de ellos. Sin embargo, amplifican regiones pequeñas de ADNr y no están testadas frente a otras especies de Mikrocytos. Abbott et al. (2011) aportaron nuevos cebadores que permiten la caracterización molecular del tándem 18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S de M. mackini y M. boweri. Estos cebadores también amplifican Mikrocytos sp. de D. trunculus de Francia (Abbott y Meyer, 2014). Se recomienda el uso de las parejas Mm18SF1/Mm18S1403R, Mm18S_120F/Mm18S1403R o Mm18SF1/Mm18S_1450R para la amplificación de un fragmento superior a 1000 pb del gen 18S ADNr de las especies del género Mikrocytos y la pareja Mm18S_1435F/pro28SR para la amplificación de su región ITS1-5.8S-ITS2-28S (Abbott et al., 2014). Se ha diseñado un protocolo de PCR anidada específico para microcítidos que, junto con una posterior secuenciación, puede ser útil para detectar todas las especies del género Mikrocytos (Hartikainen et al., 2014b). Este protocolo ha permitido la detección de M. mimicus. La reciente caracterización de la región ITS-ADNr de M. mackini ha permitido desarrollar un protocolo de PCR en tiempo real, empleando sondas TaqMan, complementarias a la región 5.8S-ITS2 de esta especie (Polinski et al., 2015). La especificidad de esta prueba se testó frente a M. boweri, P. canceri y otros patógenos de moluscos y su sensibilidad analítica es alta, demostrándose que detecta muchos más casos positivos que la PCR convencional (Carnegie et al., 2003b) y que la histopatología. El primer protocolo de ISH específico para M. mackini consistió en un conjunto de cuatro oligosondas de ISH marcadas con fluorescencia, que hibridaban de forma satisfactoria en la SSU del ADNr de este parásito. Este protocolo de FISH se modificó Introducción general 51 posteriormente para realizarlo usando solamente una sonda de ISH, de las cuatro descritas por Carnegie et al. (2003b), con un marcaje de digoxigenina (Meyer et al., 2005). La especificidad de esta sonda se evaluó frente a otros parásitos de moluscos y su sensibilidad fue mejor que la mostrada por la histología. Sin embargo, la especificidad de estas oligosondas debería de testarse frente a las nuevas especies de Mikrocytos descritas. Se ha diseñado también un protocolo de ISH para Mikrocytos sp. detectado en O. edulis de Canadá (Gagné et al., 2008). En base a la región SSU del ADNr de este parásito, se diseñó una sonda polinucleotídica, mediante PCR e incorporación de digoxigenina a los productos amplificados. Esta sonda también hibrida con M. mackini y debería testarse también frente a otras especies de Mikrocytos. http://www.int-res.com/abstracts/dao/v104/n2/p149-161/ DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS Dis Aquat Org Vol. 104: 149–161, 2013 doi: 10.3354/dao02597 Published May 27 Species-specific diagnostic assays for Bonamia ostreae and B. exitiosa in European flat oyster Ostrea edulis: conventional, real-time and multiplex PCR Andrea Ramilo1, J. Ignacio Navas2, Antonio Villalba1,*, Elvira Abollo3 1 Centro de Investigacións Mariñas, Consellería do Medio Rural e do Mar, Xunta de Galicia, 36620 Vilanova de Arousa, Spain 2 Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera (IFAPA), Centro ‘Agua del Pino’, Junta de Andalucía, 21450 Cartaya, Spain 3 Centro Tecnológico del Mar – Fundación CETMAR, 36208 Vigo, Spain http://www.int-res.com/abstracts/dao/v110/n1-2/p81-91/ DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS Dis Aquat Org Vol. 110: 81–91, 2014 doi: 10.3354/dao02646 Published July 24 Species-specific oligonucleotide probe for detection of Bonamia exitiosa (Haplosporidia) using in situ hybridisation assay Andrea Ramilo 1 , Antonio Villalba 1, *, Elvira Abollo 2 1Centro de Investigacións Mariñas, Consellería do Medio Rural e do Mar, Xunta de Galicia, 36620 Vilanova de Arousa, Spain 2Centro Tecnológico del Mar – Fundación CETMAR, 36208 Vigo, Spain Contribution to DAO Special 7 'Microcell parasites of molluscs' http://www.int-res.com/abstracts/dao/v110/n1-2/p123-133/ DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS Dis Aquat Org Vol. 110: 123–133, 2014 doi: 10.3354/dao02673 Published July 24 Oyster parasites Bonamia ostreae and B. exitiosa co-occur in Galicia (NW Spain): spatial distribution and infection dynamics Andrea Ramilo 1 , Mar González 1 , María J. Carballal 1 , Susana Darriba 2 , Elvira Abollo 3 , Antonio Villalba 1, * 1Centro de Investigacións Mariñas (CIMA), Consellería do Medio Rural e do Mar, Xunta de Galicia, 36620 Vilanova de Arousa, Spain 2Instituto Tecnolóxico para o Control do Medio Mariño de Galicia (INTECMAR), Consellería do Medio Rural e do Mar, Xunta de Galicia, 36611 Vilagarcía de Arousa, Spain 3Centro Tecnológico del Mar — Fundación CETMAR, 36208 Vigo, Spain Contribution to DAO Special 7 ‘Microcell parasites of molluscs’ S SE EC CC CI IÓ ÓN N I II I: : P PE ER RK KI IN NS SO OS SI IS S E Es st ta a s se ec cc ci ió ón n s se e h ha a p pu ub bl li ic ca ad do o e en n l la a r re ev vi is st ta a: : Journal of Invertebrate Pathology 125, 37-41. 2015 Autores: A. Ramilo, N. Carrasco, K. S. Reece, J. M. Valencia, A. Grau, P. Aceituno, M. Rojas, I. Gairín, M. D. Furones, E. Abollo, A. Villalba y y e en nv vi ia ad do o a a: : Journal of Invertebrate Pathology. 2015 Autores: A. Ramilo, J. Pintado, A. Villalba, E. Abollo (En revisión) http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022201114001864 Short Communication Update of information on perkinsosis in NW Mediterranean coast: Identification of Perkinsus spp. (Protista) in new locations and hosts Andrea Ramilo a , Noelia Carrasco b , Kimberly S. Reece c , José M. Valencia d , Amalia Grau d , Patricia Aceituno b , Mauricio Rojas b , Ignasi Gairin b , M. Dolores Furones b , Elvira Abollo e , Antonio Villalba a, ⇑ a Centro de Investigacións Mariñas (CIMA), Consellería do Medio Rural e do Mar, Xunta de Galicia, Aptdo 13, 36620 Vilanova de Arousa, Spain b IRTA-Sant Carles de la Ràpita and Catalonia’s Aquaculture R&D and Innovation Reference Network (XRAq), Ctra. Poblenou Km 5, 43540 Sant Carles de la Ràpita, Spain c Virginia Institute of Marine Science, The College of William and Mary, Gloucester Point, VA 23062, USA d Laboratori d’Investigacions Marines i Aqüicultura (LIMIA), D.G. Medi Rural i Marí, Govern Balear, Port d’Andratx, 07158 Mallorca, Spain e Centro Tecnológico del Mar-Fundación CETMAR, Eduardo Cabello s/n, 36208 Vigo, Spain Journal of Invertebrate Pathology 125 (2015) 37–41 Contents lists available at ScienceDirect Journal of Invertebrate Pathology journal homepage: www.elsevier.com/locate/jip Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 110 ethidium bromide for 15 min and rinsed for 20 min in distilled water. PCR products derived from in vitro cultured cells of P. olseni, P. chesapeaki, P. marinus and P. mediterraneus were included in all gels as reference of each species. DGGE gels were scanned in a GelDoc XR documentation system (BioRad). To confirm the specific identity, different patterns of bands were cut out with a sterile scalpel. All bands were washed with 200 µl of sterile water and DNA was eluted in 50 µl of the same solution at 4 ºC for 5 days. After this, 5 µl of each band were re-amplified using the primer PerkLSU-R/PerkLSU-F without the GC clamp, using the same conditions described above, and then processed for sequencing. 2.4.2. Characterisation of ITS region of P. chesapeaki-like parasite The positive samples for P. chesapeaki-like parasite obtained by PCR-DGGE, were negative for this parasite by PCR-RFLPs because the product of PCR assay obtained was insufficient. To know the sequence of the ITS region of this presumptive P. chesapeaki parasite, these PCR products were cloned and sequenced but the results were also negative for P. chesapeaki-like parasite (data not shown). Then, we decided to design new primers (PerkITS2-F/PerkITS2-R) on the 5.8S-ITS2 region of Perkinsus species (Table 2), which amplified a smaller fragment of 375 bp included in the sequence amplified for the genus specific primers PerkITS750/85, used in the PCR-RFLPs assay. PCR assays with new primers were performed following the same conditions described in the PCR-DGGE assay. PCR products were ligated and cloned according to Ramilo et al. (2015) and ten clones were processed for sequencing. 2.4.3. Sequencing and phylogenetic analyses. PCR products were purified for sequencing using ExoSap-It (Usb) for 15 min at 37ºC, followed by inactivation for 15 min at 80 ºC. Sequencing was performed in a specialised service (Secugen, Madrid). Chromatograms were analysed using ChromasPro v.1.41 Technelysium Pty Ltd. All generated sequences were searched for identity using BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) through web servers of the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Multiple aligments based on ITS region and LSU rDNA of the P. chesapeaki-like parasite and of P. olseni were performed using all the sequences obtained in this study and others available from GenBank (Table 3). Aligments were performed using Clustal W (Thompson et al., 1994) included in MEGA6 (Tamura et al., 2013). Maximum-likelihood analysis implemented in MEGA6 software was used to generate phylogenetic trees. Kimura 2-parameter model was found the most appropriate evolutionary model for both analyses. The bootstrap values were calculated from 2,000 replicates. Sección II: Perkinsosis 111 2.4.4. In situ hybridisation (ISH) assay An ISH assay was carried out with sections of the clams previously diagnosed positive for P. chesapeaki, using the species-specific PchesLSU-485 digoxigenin-labelled probe (Reece et al., 2008), to confirm the presence of this parasite in clam R. philippinarum tissues. Serial tissue sections (5 μm thick) were produced so that one section was used for ISH assay and another section was stained with Harris´ haematoxylin and eosin (H&E) (Howard et al., 2004) in order to identify and localise the parasite. ISH assay was performed as described by Ramilo et al. (2014). 3. Results 3.1. Distribution of perkinsosis in locations and clam species Results provided by PCR using PerkITS750/PerkITS85 genus-specific primers gave positive amplification in 144 of the 480 analysed clams. PCR-positive cases for perkinsosis were detected in 9 of the 15 sampled locations (Table 4). The highest percentage of positive cases corresponded to samples of clams R. decussatus and V. corrugata, with ranges from 0% to 73.3% and 0% to 93.3%, respectively (Table 4). Clam R. philippinarum samples showed lower percentages (range 0% - 46%), while no PCR-positive case was detected in clams P. rhomboides (Table 4). 3.2. Screening of Perkinsus spp. by PCR-RFLP RFLPs allowed identifying 91 clams infected by P. olseni according to restriction profiles obtained with RsaI (413, 193 and 74 bp) and Hinf I (363, 160, 150 bp) endonucleases. Amplified DNA from 53 clams was insufficient to allow subsequent RFLP analysis. 3.3. Screening of Perkinsus spp. by PCR-DGGE DNA of all the previous Perkinsus PCR-positive clams (n= 144) and DNA extracted from in vitro Perkinsus spp. cultures yielded amplicons of 269 bp by PCR using PerkLSU- F/PerkLSU-R with CG clamp. Nevertheless, PCR assays produced amplicons with insufficient amount of DNA to allow subsequent DGGE analysis in 34 out of 144 cases (Table 4). Amplified products corresponding to 110 clams were loaded on gels made with different concentration of polyacrylamide and gradient urea-formamide. Gels made with 6% polyacrylamide and the denaturing gradients of 20-80% and 30-70% did not allow establishing a clear pattern of bands specific for each species of Perkinsus included as positive control, because numerous and coincident bands among species were obtained. Gels with 8% polyacrylamide and a denaturing gradient of 20-80% yielded the same results. However, when DGGE assay was performed in 8% polyacrylamide gels with a denaturing gradient of 30-60%, a differential, clear band pattern was obtained for cultured cells of P. marinus, P. chesapeaki, P. mediterraneus and P. olseni (Fig. 2); in all the Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 112 cases, an intense band, which migrated to different position for each species, was identified; moreover other weaker bands completed the differential pattern of each species. Regarding clam DNA samples, all showed an intense band matching that obtained for P. olseni cultured cells (Fig. 2, lanes 5 to 18). However, two Manila clams R. philippinarum from Arcade additionally showed another less intense band matching that of P. chesapeaki cultured cells (Fig. 2, lanes 19 and 20).. 3.4. Sequence and phylogenetic analyses The ITS sequences obtained of the eight random PCR products obtained by generic PCR assay with the primers PerkITS750/85 confirmed the results observed by RFLP assay and shared 99-100% nucleotide identity with other P. olseni sequences deposited in GenBank, with a query coverage of 100% in all of cases. All the bands (weak and intense) of DGGE gels corresponding to cultured cells of Perkinsus species showed identity values of 99-100% with the expected Perkinsus species. LSU sequences obtained from clam DNA samples whose bands matched that of P. olseni in PCR-DGGE assay, shared 99-100% nucleotide identity with LSU sequences of P. olseni deposited in GenBank (100% query coverage). LSU sequences corresponding to the band pattern of P. chesapeaki showed 100% nucleotide identity with P. chesapeaki from France and 98-100% identity with other P. chesapeaki from USA (100% query coverage). Three of the ten clones that were sequenced to know the ITS region of the presumptive P. chesapeaki parasite showed 99% identity to 5.8S-ITS2 sequences of P. chesapeaki from Catalonia (E. Spain) (100% query coverage), 99-100% identity with P. chesapeaki from France (93-95% query coverage) although they displayed 94%-96 % identity with other P. chesapeaki sequences from USA and Australia deposited in GenBank (98%-100% query coverage). The remaining seven clones shared 99-100% with P. olseni sequences, confirming the mixed infection P. olseni-P. chesapeaki in the two Manila clams from Arcade also detected by PCR-DGGE assay. An ITS tree constructed with a total of 242 sites and 67 sequences showed that P. olseni sequences from Galicia grouped in a clade with other P. olseni sequences with bootstrap values of 93%. Furthermore, the P. chesapeaki sequence from Galicia was included in P. chesapeaki clade, with bootstrap values of 99% (Fig. 3). Within this P. chesapeaki clade, two main subclades could be distinguished, one of these subclades corresponded to sequences from North American and Australia and the other one included sequences from Europe (Spain and France), forming one clade with boostrap values 94%, while another clade with sequences from North America had boostrap values of 85% (Fig. 3). A LSU tree was constructed using 159 sites and 28 sequences. Phylogenetic analysis on the LSU showed that P. olseni from Galicia was included in the same clade with other P. olseni sequences with boostrap values 95%. The P. chesapeaki sequence from Galicia grouped in the same clade with other P. chesapeaki sequences with bootstrap values of 92% (Fig. 4). The LSU analysis was uninformative, and all sequences belonging to P. mediterraneus and P. honshuensis formed an unresolved single clade. The sequences of Sección II: Perkinsosis 113 P. chesapeaki from Galicia clustered together with other P. chesapeaki sequences, but all the ingroup sequences formed a single clade. All the Perkinsus sequences reported in this work have been deposited in the GenBank under the accession numbers: KP764676-KP764683 (ITS P. olseni), KP764684- KP764686 (ITS P. chesapeaki), KP764687-KP764689 (LSU P. olseni), and KP764690- KP764691 (LSU P. chesapeaki). 3.5. Visualisation of Perkinsus chesapeaki The PchesLSU-485DIG probe specific for P. chesapeaki was found to hybridise on R. philippinarum sections (Fig. 5A), showing a strong reaction. The hybridisation signal corresponded to Perkinsus-like parasites in the adjacent section stained with H&E; P. chesapeaki appeared encapsulated by haemocytes in the connective tissue of the digestive gland of the host (Fig. 5B). 4. Discussion Results of the survey confirmed that perkinsosis is widely distributed along the Galician coast and suggested higher prevalence in R. decussatus and V. corrugata than in R. philippinarum, while no case was detected in P. rhomboides. Balseiro et al. (2010) found higher prevalence in R. decussatus and R. philippinarum from Galicia than in V. corrugata (referred as Venerupis pullastra), while only one PCR-positive case was detected in P. rhomboides without histological confirmation. Thus, P. rhomboides seems to be less susceptible to perkinsosis than the other studied clam species, although perkinsosis had been detected in clams P. rhomboides from Galicia by RFTM (AV, unpublished results) and from Andalusia (S. Spain) (Navas, 2008). A PCR-DGGE method to discriminate Perkinsus species was designed and successfully applied in this survey. Gast et al. (2006, 2008) applied DGGE to detect the protistan QPX in the hard clam M. mercenaria and they obtained a similar pattern band, with an intense band and weaker bands for one species. The occurrence of multiple bands in the Perkinsus spp. patterns could represent intraspecific variability due to the existence of multiple slightly different copies of the RNA cluster (Dungan et al., 2002; Pecher et al., 2004), multiple infections of different strains from Perkinsus and could be also due to a clonal structure of Perkinsus spp. population with rare but possible genetic recombination between loci of the clones (Tibayrenc et al., 1990; Tibayrenc and Ayala, 2002) or could indicate the existence of sexual reproduction in Perkinsus, with heterozygotic individuals (Reece et al., 1997, 2001; Robledo et al., 1999; Thompson et al., 2011; Vilas et al., 2011). These slight variations in the sequences of DNA could be giving rise to homoduplex molecules, consisting of complementary strands synthesised in the PCR cycle, and to heteroduplex molecules created by the union of strands with little differences in their sequences. Thus, heteroduplex (weaker bands) would show a slower migration in DGGE gel than homoduplex (intense bands), since the mismatch sites of the former are easier denatured than the unions established between the nucleotides of homoduplex (intense Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 114 bands) (Kanagawa, 2003). Despite of this variability, DGGE allowed to establish a clear pattern specific for each species of Perkinsus involved in this study. Moreover, DGGE could easily be extended to the other Perkinsus species not included in this study, as diagnostic tool. Comparison between the well-known PCR-RFLP method and the new PCR-DGGE showed that species identification was possible in more cases with the latter assay. Furthermore, P. chesapeaki was detected with PCR-DGGE co-infecting with P. olseni two clams R. philippinarum, whereas the PCR-RFLP method only detected P. olseni in those two clams. Co-infections with two Perkinsus species in the same host have already been described: P. marinus-P. chesapeaki in various hosts species (Pecher et al., 2008; Reece et al., 2008), P. marinus-Perkinsus sp. in M. mercenaria (Pecher et al., 2008), P. chesapeaki-P. olseni in R. decussatus (Arzul et al., 2012) and P. olseni-P. mediterraneus in Venus verrucosa (Ramilo et al., 2015). Occurrence of more than one Perkinsus species in an area, even in the same species host, is not exceptional; in addition to the above mentioned cases, P. marinus, P.olseni and P. beihaiensis have been found in Crassostrea gasar from Paraiba (Brazil) (Queiroga et al., 2015); P. olseni and P. honsuensis have been reported from Japan (Dungan and Reece, 2006); P. beihaiensis and P. olseni from China (Moss et al. 2008), and from India (Sanil et al. 2010, 2012); P. chesapeaki, P. olseni and P. mediterraneus from Catalonia (Spain) (Ramilo et al. 2015); and P. olseni and P. chesapeaki from Australia (Lester and Davis, 1981; Dang et al., 2015). Results showed that PCR-DGGE method is a useful tool to discriminate among Perkinsus species. Species-specific conventional PCR or real time PCR assays are good tools for routine diagnoses when evaluating the prevalence or the intensity of a particular Perkinsus species expected in a specific area or host. However, when various Perkinsus spp. are expected (or may occur) in an area or in a host species, using these methods would be slow and expensive, because a species-specific PCR assay would be needed for each Perkinsus species. Genus-specific PCR assay followed by cloning and sequencing involves laborious workflow and is more expensive than PCR-DGGE assay for an elevated number of individuals, particularly if there are mixed infections in the same individual. The specific DGGE pattern of bands for each Perkinsus species makes that cloning and sequencing are not needed. Moreover, RFLPs assays need a high quantity of DNA since weak PCR amplification does not allow obtaining the restriction patterns, which is more evident in the case of mixed infections, because one of them can be less represented in the host and being unnoticed (Ramilo et al., 2015). Furthermore, the high power of discrimination of DGGE assays, based in small differences between DNA sequences, could allow the detection of any unknown Perkinsus species. These results agreed with those published by Martynova-VanKley et al. (2008) and Satoh and Nakai (2007) who found that PCR-DGGE is a better method than PCR-RFLP for the discrimination of Eimeria and Cryptosporidium species, respectively. Although numerous molecular techniques such as species-specific PCR assays, multiplex PCR or RAPD-PCR have been developed for both parasite genera, none of them has been able to detect all the species of Eimeria or Cryptosporidium in a single assay, while it was possible with DGGE method. Sección II: Perkinsosis 115 Recently, the high-throughput sequencing (HTS) is replacing the PCR-DGGE method in microbial ecology studies and will be soon considered a standard approach in environmental microbial research (Douterelo et al. 2014; Elizaquível et al,. 2015; Ju and Zhang, 2015; Pochon et al., 2015). HTS has been mainly used to the study of functional genomic in bivalve mollusc (Leite et al., 2013; Gómez-Chiarri et al., 2015; He et al., 2015; Meng et al., 2015). Burki et al. (2013) also employed the HTS to perform a phylogenomic study of Mikrocytos mackini infecting Crassostrea gigas. Hartikainen et al. (2014) using HTS identified a new genus and new species, Paramikrocytos canceri, parasitising the crab Cancer pagurus. However, in epidemiological surveys, in which the number of samples is high and unknown parasite species may occur, a pre-screening method would be practical to determine which populations would be suitable for further analysis by HTS. DGGE is relatively cheaper than HTS and the data comparing parasite populations are visualised immediately by electrophoresis. Species-specific ISH assay confirmed the infection with P. chesapeaki in the two Manila clams, as recommended by Burreson (2008). P. chesapeaki has been found in three host species (R. decussatus, R. philippinarum and C. edule) in Europe (France and Spain). Our phylogenetic results would support a common origin of the parasites P. chesapeaki found in Europe thus far. Arzul et al. (2012) hypothesised that imports of the hard clam M. mercenaria from the Atlantic coast of USA into France could have been the vehicle for the introduction of P. chesapeaki into France. The recent report of P. chesapeaki infecting A. trapezia from Australia raises the hypothesis of that Anadara invaders could had been a vehicle for the introduction of the parasite into Europe, because the allochtonous species Anadara kagoshimensis, native in Pacific coasts including Australia, has been reported as an invader species in Europe, including France and Spain (Catalonia and Galicia) (Bañón et al., 2015). However, the phylogenetic analysis placed ITS sequences of P. chesapeaki from Australia in a different clade from the European ones. The very low number of positive cases for P. chesapeaki in this study suggests an accidental or punctual introduction of this parasite or a bad adaptation of this species to the new host and marine environment. Acknowledgements We are grateful for technical assistance to: Patricia Ruiz from IIM-CSIC and Mar González, Maribel Meléndez and Elena Penas from CIMA. Dr. Susana Darriba provided mollusc samples and Sergio Fernández provided in vitro cultured cells of Perkinsus species. This study was funded by the Ministerio de Economía y Competitividad of the Government of Spain, through the project AGL2011-30449-C02-01. Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 116 References Abollo, E., Casas, S.M., Ceschia, G., Villalba, A., 2006. Differential diagnosis of Perkinsus species by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism assay. Mol. Cell. Probes 20, 323-329. Arzul, I., Chollet, B., Michel, J., Robert, M., García, C., Yoly, J.P., François, C., Miossec, L., 2012. One Perkinsus species may hide another: characterization of Perkinsus species present in clam production areas of France. Parasitology 139, 1757-1771. Audemard, C., Reece, K.S., Burreson, E.M., 2004. Real-Time PCR for detection and quantification of the protistan parasite Perkinsus marinus in environmental waters. Appl. 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Note that in 53 cases (out of 144 positive cases by the genus-specific PCR assay), the PCR product was insufficient to allow subsequent RFLP analysis for Perkinsus species identification Host species Sampling site Sample size Genus-specific PCR RFLP DGGE R. decussatus Ortigueira 30 30.0% (9) P. olseni (6) P. olseni (8) O Barqueiro 30 43,3% (13) P. olseni (12) P. olseni (10) Viveiro 30 0 - - Foz 30 0 - - Lourizán 30 66,7% (20) P. olseni (13) P. olseni (14) A Toxa 30 73,3% (22) P. olseni (16) P. olseni (21) R. philippinarum Pontedeume 30 46,7% % (14) P. olseni (2) P. olseni (13) Camariñas 30 0 - - Carril 30 0 - - Arcade 30 20.0% (6) P. olseni (1) P. olseni (4) P. chesapeaki (2) V. corrugata Ferrol 30 93,3% (28) P. olseni (17) P. olseni (19) A Coruña 30 66,7% (20) P. olseni (13) P. olseni (10) Vilanova de Arousa 30 40.0% (12) P. olseni (11) P. olseni (11) Illa de Arousa 30 0 - - Cangas 30 0 - - P. rhomboides Illa de Arousa 30 0 - - Sección II: Perkinsosis 127 Fig.1. Maps showing the location of the sampled beds along the Galician coast. 1: Foz. 2. Viveiro. 3: O Barqueiro. 4: Ortigueira. 5: Ferrol. 6: Pontedeume. 7: A Coruña. 8: Camariñas. 9: Carril. 10: Vilanova de Arousa. 11: Illa de Arousa. 12: Illa da Toxa; 13: Lourizan. 14: Cangas do Morrazo. 15: Arcade. Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 128 Fig.2. DGGE profiles of Perkinsus species in a 8% w/v polyacrilamide gel. Lanes 1 to 4: LSUPCR products obtained from in vitro cultured cells of P. marinus, P. chesapeaki, P. mediterraneus and P. olseni, respectively. Lanes 5 to 12 and 14 to 18: LSU-PCR products amplified from clam samples, indicating infection with P. olseni. Lanes 19 and 20: LSU-PCR products amplified from clam samples, indicating infection with P. olseni and P. chesapeaki. Sección II: Perkinsosis 129 KP764676* AF473840 KP764677* KP764683* KP764678* AF441211 KP764679* KP764682* KP764680* AF140295 KP764681* KJ701596 KJ608210 AF369969 KJ701597 AF441213 U07697 AF369967 Perkinsus olseni AY295194 AY295189 AF150987 Perkinsus marinus EU068096 EU068098 DQ370482 AY487839 Perkinsus mediterraneus DQ516700 DQ516699 DQ516696 DQ516697 DQ516698 DQ516701 Perkinsus honshuensis KP764684* JQ669646 KP764685* JQ669649 KP764686* JQ669648 KF314812 JQ669647 Europe AF091541 EU919470 AY305326 AY876306 AF252288 AF440468 AF440464 North America KM983419 EU919484 AY876302 AY876303 AF102171 AY876305 AF440466 AY876307 KM983409 AY876304 KM983418 KM983414 KM983416 KM983417 KM983413 KM983411 North America/Australia Perkinsus chesapeaki EU068095 EU068080 EF204015 EF204050 Perkinsus beihaiensis Perkinsus qugwadi AF151528 88 85 76 73 94 36 71 99 27 43 63 27 15 99 22 85 94 19 99 99 64 92 93 93 Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 130 Fig.3. Maximum-likelihood analysis showing the taxonomic position of the Perkinsus chesapeaki and P. olseni ITS sequences obtained in this study. Numbers at branch nodes indicate bootstrap confidence values in percent. (*) Sequences obtained in this study. DQ516680 EF204098 DQ516682 EF204100 DQ516684 EF204096 Perkinsus honshuensis/Perkinsus mediterraneus AY876319 AY876322 AY876329 Perkinsus marinus AY876330 KP764689* AY876331 KP764688* AY876332 KP764687* Perkinsus olseni AY876345 AY876349 JQ669652 KP764690* AY876348 KP764691* AY876344 AY876346 AY876347 JQ669651 Perkinsus chesapeaki EF526448 EF526451 Perkinsus beihaiensis Prorocentrum micans X16108 97 94 33 99 14 14 14 13 13 13 10 10 9 8 6 93 73 4 95 45 32 92 92 1 2 Fig.4. Maximum-likelihood analysis showing the taxonomic position of the Perkinsus chesapeaki and P. olseni LSU sequences obtained in this study. Numbers at branch nodes indicate bootstrap confidence values in percent. (*) Sequences obtained in this study. Sección II: Perkinsosis 131 Fig.5. Micrographs of two serial histological sections through the digestive gland of a clam Ruditapes philippinarum infected with Perkinsus chesapeaki. A: In situ hybridization with PchesLSU-485DIG probe showing blue deposits of hybridization. B: Section satined with Harris’ haematoxylin and eosin showing parasites (arrows). S SE EC CC CI IÓ ÓN N I II II I: : E EN NF FE ER RM ME ED DA AD DE ES S E EM ME ER RG GE EN NT TE ES S E Es st ta a s se ec cc ci ió ón n s se e h ha a p pu ub bl li ic ca ad do o e en n l la as s r re ev vi is st ta as s: : Diseases of Aquatic Organisms 109: 55-80. 2014 Autores: A. Villalba, D. Iglesisas, A. Ramilo, S. Darriba, J. M. Parada,E. No, E. Abollo, J. Molares, M. J. Carballal (Andrea Ramilo fue responsable de la caracterización molecular y PCR diagnóstica de Marteilia cochillia) Diseases of Aquatic Organisms 110: 71-79. 2014 Autores: A. Ramilo, D. Iglesias, E. Abollo, M. González, S. Darriba, A. Villalba http://www.int-res.com/abstracts/dao/v109/n1/p55-80/ DISEASES OF AQUATIC ORGANISMS Dis Aquat Org Vol. 109: 55–80, 2014 doi: 10.3354/dao02723 Published April 23 Cockle Cerastoderma edule fishery collapse in the Ría de Arousa (Galicia, NW Spain) associated with the protistan parasite Marteilia cochillia Antonio Villalba 1, *, David Iglesias 1 , Andrea Ramilo 1 , Susana Darriba 2 , José M. Parada 1 , Edgar No 1 , Elvira Abollo 3 , José Molares 1 , María J. Carballal 1 1Centro de Investigacións Mariñas (CIMA), Consellería do Medio Rural e do Mar, Xunta de Galicia, 36620 Vilanova de Arousa, Spain 2Instituto Tecnolóxico para o Control do Medio Mariño de Galicia (INTECMAR), Consellería do Medio Rural e do Mar, Xunta de Galicia, 36611 Vilagarcía de Arousa, Spain 3Centro Tecnológico del Mar - Fundación CETMAR, 36208 Vigo, Spain Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 174 la acuicultura, y han desplazado a los métodos tradicionales de identificación de patógenos como son el cultivo de microorganismos, la propagación de virus en líneas celulares o la histología. Estas técnicas aportan la capacidad de caracterizar rápidamente y sin ambigüedades organismos sospechosos de causar un brote de la enfermedad, lo que es primordial para poder modular los esfuerzos dirigidos hacia el control de las enfermedades. Un ejemplo de su éxito se refleja en el hecho de que desde 1977 hasta 2011 se han publicado más de 2.000 artículos de investigación que describen métodos basados en el ADN para la detección, identificación y/o cuantificación de parásitos y ectoparásitos (Hunt, 2011). En esta Memoria se presentan resultados que suponen un avance en el desarrollo de protocolos moleculares específicos y sensibles para la identificación y el diagnóstico de las principales enfermedades que afectan al cultivo de moluscos bivalvos tanto en Galicia como en sus áreas de distribución a nivel mundial. Actualmente siguen existiendo lagunas en el conocimiento de estas enfermedades y su impacto, siendo la identificación y caracterización del agente patógeno fundamental para la investigación, la comprensión de la epidemiología de las mismas y de las posibles intervenciones que se puedan desarrollar para minimizar su efecto. Cuando se desarrollan nuevos métodos de diagnóstico, un tema crítico y que supone siempre un desafío es la validación de los mismos, con el fin de establecer la sensibilidad y especificidad de las nuevas técnicas. De este hecho depende el éxito y fiabilidad del control sanitario que se ejerza, ya que los métodos de diagnóstico que se apliquen deberían siempre cumplir con los requisitos de alta sensibilidad, especificidad, reproducibilidad, repetibilidad, exactitud e idoneidad. Tras detectar en 2008 la coexistencia de dos especies de Bonamia altamente patogénicas infectando a la ostra plana en Galicia, nos propusimos desarrollar un método diagnóstico que nos permitiese evaluar epidemiológicamente ambas especies. Los ensayos diseñados en este estudio para el diagnóstico de la bonamiosis han mostrado tener una mayor sensibilidad y especificidad, que las propias técnicas recomendadas actualmente por la OIE. Este hecho no pasó desapercibido al Laboratorio Europeo de Referencia de Enfermedades de Moluscos (EURL), que en 2013 realizó una evaluación de los ensayos presentados en esta memoria con el fin de determinar las técnicas diagnósticas más adecuadas para la enfermedad. El EURL realizó una prueba en anillo en la que 17 laboratorios, entre los que se encontraban Laboratorios Nacionales de Referencia de diferentes países, probaron diferentes protocolos de PCR para la detección y caracterización de las especies de Bonamia (http://forms.ifremer.fr/lgpmm/registration-form-for-the-2013-ilc-01-test-and- comparison-study-of-bonamia-pcr-techniques/). Entre estos protocolos se encontraban: las PCR genéricas recomendadas por la OIE, descritas por Carnegie et al. (2000) y Cochennec et al. (2000), las TaqMan PCR genéricas descritas por Corbeil et al. (2006b) y Marty et al. (2006), la PCR específica para B. ostreae diseñada por Robert et al. (2009) y los protocolos de PCR convencional y PCR en tiempo real descritos en este estudio. Además, se incluyeron dos nuevas PCR específicas desarrolladas por Longshaw et al. (2013) posteriores a las diseñadas en este estudio: una para B. exitiosa y otra para B. ostreae. De estos 17 laboratorios 6 de ellos compararon la PCR Bo-Boas (Cochennec et al., 2000), seguida por una prueba RFLP (Cochennec-Laureau et al., 2003a), con la PCR en tiempo real descrita en esta memoria. Los resultados mostraron que la PCR en tiempo real es ligeramente más específica y mucho más sensible que la PCR Bo/Boas y destaca que es Discusión general 175 una técnica recomendable para realizar programas de vigilancia, ya que su alta sensibilidad minimiza el riesgo de obtener resultados falsos negativos. Además, se demostró que su reproducibilidad es alta y mayor que la de la PCR Bo-Bas, ya que con la PCR en tiempo real se encontraron menores diferencias entre los resultados de los 6 laboratorios. EL EURL concluyó que la PCR en tiempo real específica para B. exitiosa y B. ostreae, descrita en este estudio, puede ser incluida en el Manual Diagnóstico de la OIE como método recomendado (European Reference Laboratory for Molluscan Diseases, 2014). A pesar de que las otras PCR diagnósticas citadas no fueron probadas por el número de laboratorios participantes en la prueba en anillo planeado inicialmente, los resultados obtenidos indican que las PCR convencionales específicas para B. exitiosa y B. ostreae desarrolladas en este estudio, ofrecen unos resultados mucho mejores en términos de fiabilidad que las PCR convencionales específicas descritas por Longshaw et al. (2013). La PCR convencional específica para B. exitiosa, así como la PCR multiplex para el diagnóstico de B. exitiosa y B. ostreae, han permitido detectar por primera vez B. exitiosa en Portugal, infectando la ostra plana O. edulis. La presencia de esta especie pasó desapercibida mediante el ensayo de PCR Bo-Boas recomendado por la OIE (Batista et al., 2015). El procedimiento de PCR multiplex es la primera técnica descrita capaz de detectar B. ostreae y B. exitiosa en un único ensayo. El Centro de Investigaciones Marinas (CIMA) de la Xunta de Galicia y el Centro Tecnológico del Mar solicitó su patentabilidad en septiembre de 2011, presentando la documentación correspondiente ante la Oficina Española de Patentes y Marcas. En marzo de 2014 el Boletín Oficial de la Propiedad Industrial (BOPI) publicó la concesión de la patente que lleva por título “Procedimiento para detectar e identificar Bonamia ostreae y Bonamia exitiosa en un único ensayo de reacción en cadena de la polimerasa”, con el número de concesión P 201131549 (ver anexo I). Existe un registro de kits diagnósticos para diversas enfermedades validados y certificados por la OIE, entre los que se incluyen kits basados en la tecnología de PCR como el denominado “IQ 2000TM WSSV Detection and Prevention System” para el diagnóstico de la enfermedad de las manchas blancas (WSSV) producida por un virus que provoca elevadas mortalidades en varias especies de camarones, o el kit “Check&Trace Salmonella” basado en PCR multiplex para el serotipado molecular de esta bacteria (OIE, 2015). La comercialización en forma de kit diagnóstico de la PCR multiplex para B. exitiosa y B. ostreae y su validación y certificación por la OIE podría ser una herramienta de gran ayuda para el control de la bonamiosis. El estudio epidemiológico de B. exitiosa y B. ostreae permitió la detección temprana de ambas especies en semilla de pequeña talla y evidenció que B. exitiosa está ampliamente distribuída a lo largo del litoral gallego y perfectamente adaptada a este ecosistema. Estos datos junto con la detección de B. exitiosa infectando O. edulis en Cataluña y en otros países europeos como Italia, Francia, Reino Unido y Portugal (Narcisi et al., 2010; Arzul et al., 2011; Carrasco et al., 2012a; Longshaw et al., 2013; Batista et al., 2015) indican que esta especie debería ser eliminada de la lista de enfermedades exóticas del Reglamento Europeo de Sanidad Animal y debería incluirse en la lista de enfermedades no-exóticas (Anonymous, 2006). Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 176 Para mejorar el diagnóstico molecular de B. exitiosa, también se diseñó un protocolo de ISH específico, que mostró valores de sensibilidad superiores a los de la técnica histológica. Otra ventaja de la técnica molecular es que permite realizar una identificación inequívoca y no sujeta a un criterio subjetivo, mientras que el diagnóstico histológico se ve fuertemente influido por la experiencia del analizador, principalmente en la áreas geográficas de coexistencia de ambas especies. Evaluando objetivamente la ISH, la laboriosidad, el tiempo requerido y el coste económico hacen que no sea una herramienta molecular enfocada a diagnósticos rutinarios, sin embargo, es una técnica muy recomendable para confirmar nuevos casos positivos de B. exitiosa en áreas y hospedadores que se creían libres de esta especie, tanto si el diagnóstico se realiza por técnicas de PCR como histológicas. Aunque las técnicas de PCR son muy sensibles, no ofrecen información sobre la viabilidad del parásito ni sobre el estado de la infección, siendo necesario realizar una confirmación visual empleando técnicas microscópicas altamente sensibles como puede ser la ISH (Burreson, 2008). La ISH específica para B. exitiosa ofrece la misma información que la histología pero con la especificidad y sensibilidad de los métodos moleculares, por lo que es una prueba imprescindible tanto confirmatoria como en la búsqueda de posibles hospedadores reservorios o transportadores de la enfermedad. La viabilidad de la aplicación de las herramientas moleculares para el diagnóstico específico de las especies de Bonamia va ineludiblemente ligada al propósito que se persigue, al coste económico que suponen su aplicación y a la dificultad técnica intrínseca a las mismas. A pesar de que la dificultad técnica no es asumible por el sector primario, sería muy fácil su implementación en centros especializados, como pueden ser los laboratorios de referencia nacionales e internacionales, laboratorios de investigación o centros analíticos públicos y privados. El coste de la aplicación de estos métodos de forma rutinaria varía en función de la técnica a aplicar. En este estudio también se han diseñado dos procedimientos moleculares para el estudio de la perkinsosis. Como ya se ha señalado, el esfuerzo investigador en torno a la perkinsosis es muy elevado lo que origina que el número de especies del género Perkinsus, su rango geográfico y la lista de especies hospedadoras crezca y evolucione continuamente, siendo éste el gupo de protozoos parásitos de moluscos con un rango de distribución geográfica mayor (Fernández-Robledo et al., 2014). Este hecho junto al elevado movimiento comercial de especies de moluscos que existe en Galicia, hizo que se plantease como objetivo de esta tesis doctoral realizar un cribado molecular de otras posibles especies de Perkinsus que pudiesen infectar diferentes especies de almejas en Galicia. El planteamiento clásico de realizar una PCR genérica seguida de clonación y posterior PCR-RFLPs o PCR-secuenciacion se estimó como muy laboriosa y costosa para abordar un cribado poblacional. Otras técnicas como el “Next Generation Sequencing” (NGS) recibieron la misma evaluación. Finalmente se emprendió el desarrollo de un nuevo ensayo de PCR-DGGE, que tuviese poder de discriminación para detectar de forma simultánea diferentes especies de Perkinsus, incluso cuando alguna de ellas cursase la infección de forma leve. Los resultados obtenidos muestran que esta técnica, a pesar de su escaso desarrollo en el campo de la patología de moluscos y su incipiente entrada en desuso, ha proporcionado resultados importantes en la identificación de especies de Discusión general 177 Perkinsus, así como en la detección de infecciones multiespecíficas. A ello se suma su coste moderado y fácil análisis. P. chesapeaki es una especie descrita originalmente en la costa noreste de EE. UU., pero su posterior detección en Europa y Australia (Arzul et al., 2012; Carrasco et al., 2014; Dang et al., 2015) muestra que es una especie que se adapta bien a diferentes condiciones macro- (distribución geográfica amplia) como micro-ambientales (diferentes especies hospedadoras), lo que da evidencias de su capacidad colonizadora. Disponer del registro de P. chesapeaki en el ecosistema gallego, permitirá realizar una monitorización de esta especie para poder evaluar su evolución y su potencial impacto en las poblaciones de moluscos bivalvos. El estudio epidemiológico iniciado en Galicia se extendió al Mar Mediterráneo, ya que es un área geográfica en la que se ha realizado un esfuerzo menor en el estudio de la enfermedad. Además del diagnóstico molecular de la perkinsosis se diseñó un ensayo de ISH específico para la detección de P. mediterraneus. Este ensayo permitió confirmar las infecciones, detectadas por PCR, de P. mediterraneus en nuevos hospedadores. En esta tesis doctoral se ha abordado la identificación y caracterización molecular de dos parásitos nuevos responsables de causar elevadas mortalidades de almeja japonesa y berberecho en Galicia. La detección de Mikrocytos sp. en almeja japonesa tiene gran importancia debido a que R. philippinarum es una especie cosmopolita, cultivada en muchos países y con abundantes importaciones. El gran desconocimiento de la biología del género Mikrocytos, incluyendo distribución geográfica, rango hospedador, posición filogenética, interacción hospedador-parásito-medioambiente y ciclo de vida, no permite hacer una valoración de la introducción de esta especie en aguas gallegas y los factores que originaron el brote epidémico, aunque las condiciones ambientales y la co-infección con el agente de la enfermedad de anillo marrón (BRD) que presentaban las almejas japonesas pudieron favorecer la multiplicación y transmisión del parásito. Mikrocytos sp. no se ha detectado en Galicia desde el año 2009 (datos aportados por el INTECMAR), pero la ausencia de conocimiento hace que sea necesario realizar una vigilancia sanitaria rigurosa para poder controlar nuevos brotes epidémicos, así como su propagación a otras áreas. El parásito Paramyxido, causante de drásticas mortalidades de berberecho de la Ría de Arousa desde el año 2012 se identificó por técnicas moleculares como M. cochillia. Actualmente, las poblaciones de berberecho en la Ría de Arousa se encuentran totalmente diezmadas por la enfermedad. La adaptación a un nuevo ambiente de parásitos monoxénicos introducidos, ej. B. exitiosa, es siempre más sencilla que la de parásitos con ciclo de vida indirecto (Dobson y May, 1986; Bauer, 1991; Torchin y Mitchell, 2004). En este último grupo se encontraría probablemente M. cochillia, de la cual aún se desconoce su ciclo de vida, pero hay evidencias de que en otras especies del género, como M. refringens y M. sydneyi, diferentes especies de copépodos y poliquetos, respectivamente, actúan como hospedadores intermediarios en el ciclo biológico. Por tanto, es probable que existan hospedadores intermediarios relacionados con la introducción e invasión de M. cochillia en Galicia y que puedan actuar como reservorios de la enfermedad. La caracterización molecular de Mikrocytos sp. y M. cochillia ha permitido realizar un diagnóstico inequívoco de estas especies parasitas responsables de la mortalidades Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 178 masivas de almejas y berberechos. Esta caracterización puede ser la base para el diseño de nuevos test diagnósticos que permitan profundizar en la epidemiología y ciclo de vida de estas especies, con el fin de poder esclarecer su introducción en Galicia y realizar un control sanitario efectivo de ambas enfermedades que evite su dispersión a nuevas áreas y hospedadores. De hecho, la utilización de estos procedimientos de diagnóstico parece imprescindible en la búsqueda del hospedador intermediario de M. cochillia en aguas gallegas, paso crucial para poder arbitrar medidas de gestión de la marteiliosis del berberecho en Galicia. En el futuro, la secuenciación de todo el genoma de los parásitos y la definición de una amplia gama de marcadores genéticos para su uso en herramientas de diagnóstico específicos y sensibles pueden ofrecer oportunidades únicas para abordar cuestiones relativas a la compleja red de factores biológicos y ecológicos que intervienen en las interacciones entre los parásitos, sus hospedadores y el medio ambiente. El uso integrado de herramientas moleculares (ómicas) y bioinformáticas avanzadas puede ser crucial para apuntalar la investigación de la biología de las enfermedades, en una escala antes imposible, y podría proporcionar perspectivas sin precedentes para el diseño de métodos de diagnóstico y de intervención totalmente nuevos para frenar el desarrollo de las enfermedades. C CO ON NC CL LU US SI IO ON NE ES S Conclusiones 181 CONCLUSIONES 1. Se han diseñado las primeras PCR diagnósticas específicas para B. exitiosa: PCR convencional, PCR en tiempo real y PCR multiplex. 2. La alta especificidad y, en especial, la alta sensibilidad de los ensayos de PCR convencional, PCR en tiempo real y PCR multiplex específicos para B. exitiosa y B. ostreae, los convierten en protocolos idóneos para ser incluidos en el Manual Diagnóstico de la OIE como métodos recomendados para el diagnóstico de ambos parásitos. 3. La PCR multiplex diseñada para la detección simultánea de B. exitosa y B. ostreae permite un diagnóstico rápido y económico de ostras parasitadas. Esta técnica se ha patentado y su comercialización en forma de kit de detección de ambas especies podría ser muy útil para el control sanitario de ostras frente a la bonamiosis. 4. Las PCR convencional y PCR en tiempo real para B. ostreae y B. exitiosa son ensayos que permiten realizar una detección de ambos patógenos en etapas muy tempranas de crecimiento. Esto permitirá a los ostricultores realizar una selección previa de semilla libre de patógenos, para importar lotes de alta calidad sanitaria para estas enfermedades, garantizando una mayor supervivencia en los lotes destinados a engorde. 5. El protozoo B. exitiosa es un parásito perfectamente adaptado al ecosistema marino gallego y debería ser eliminado de la lista de enfermedades exóticas de la Directiva europea 2006/88/EC e incluido en su lista de enfermedades de no exóticas. 6. Se han diseñado por primera vez ensayos de ISH específicos para B. exitiosa y P. mediterraneus, herramientas muy útiles para confirmar infecciones de estos parásitos en nuevos hospedadores y áreas libres de la enfermedad. 7. Se ha ampliado el rango geográfico y hospedador de P. olseni, P. mediterraneus y P. chesapeaki . 8. El ensayo PCR-DGGE es una herramienta útil para realizar estudios de control y vigilancia de las especies de Perkinsus presentes en un área geográfica. 9. Se ha identificado por primera vez un parásito del tipo Mikrocytos en la almeja R. philippinarum, en varias zonas de Galicia y en asociación con mortalidad alta de almeja. 10. Se ha identificado el parásito M. cochillia como causante del colapso de la pesquería del berberecho en la ría de Arousa. Se ha diseñado un ensayo de PCR convencional para el diagnóstico específico de este parásito. B BI IB BL LI IO OG GR RA AF FÍ ÍA A Diagnóstico molecular y epidemiología de enfermedades relevantes de moluscos bivalvos 190 Bezemer, B., Butt, D., Nell, J., Adlard, R., Raftos, D., 2006. Breeding for QX disease resistance negatively selects one form of the defensive enzyme, phenoloxidase, in Sydney rock oysters. Fish and Shellfish Immunology 20, 627-36. Bishop, M., Carnegie, R., Stokes, N., Peterson, C., Burreson, E., 2006. Complications of a nonnative oyster introduction: facilitation of a local parasite. Marine Ecology Progress Series 325, 145–152. Blackbourn, J., Bower, S. M., Meyer, G. 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