FACULTAD DE CIENCIAS
GRADO EN BIOQUÍMICA
D. Pablo Gallego A ias
SEGURIDAD)ALIMENTARIA:)MONITORIZACIÓN)
INTEGRADA)DE)ANTIBIORRESISTENCIAS)(RAM)
T abajo Fin de G ado
Junio 2024
Pablo Gallego A ias
2
Licencia
Excep o donde se haga cons a explíci amen e, es a ob a pe enece a Pablo Gallego A ias
y es á bajo una licencia de “C ea i e Commons Reconocimien o 4.0 In e nacional”.
Financiación
La pa e expe imen al del p esen e T abajo de Fin de G ado ha sido ealizada en el ma co
del p oyec o de I+D+i/PID2022-143041OB-100, inanciado po
MICIU/AEI/10.13039/501100011033/ y po FEDER Una mane a de hace Eu opa; jun o
con la ayuda ED431C 2021/11 de la Conselle ía de Cul u a, Educación e O denación
Uni e si a ia (Xun a de Galicia) y FEDER.
El au o , Pablo Gallego A ias, ag adece al Campus Te a su Ayuda de Iniciación a la
In es igación 2023-2024 con ocada po la “Resolución ei o al 01 de eb ei o 2024, da
Uni e sidade de San iago de Compos ela, pola que se es ablecen as bases egulado as e
se con ocan bolsas pa a a iniciación á in es igación no ma co do Con enio de
Colabo ación en e a USC e a Conselle ía de Cul u a, Educación, Fo mación
P o esional e Uni e sidades polo que se egula o Campus de Especialización Campus
Te a”.
Pablo Gallego A ias
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ÍNDICE
RESUMEN ...................................................................................................................... 5
RESUMO ......................................................................................................................... 6
ABSTRACT .................................................................................................................... 7
RESUMEN GRÁFICO .................................................................................................. 8
ÍNDICE DE ABREVIATURAS ..................................................................................... 9
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 11
1.1. La esis encia a los an imic obianos (RAM) ............................................... 11
1.1.1. P incipales amilias de an ibió icos y mecanismos de esis encia .......... 13
1.1.1.1. Ca ego ización de an imic obianos .................................................... 14
1.1.1.2. Be alac amasas ................................................................................... 15
1.2. Papel de los alimen os en la ansmisión de RAM ..................................... 16
1.2.1. Con oles en ca ne de caza ..................................................................... 17
1.3. Esche ichia coli y Klebsiella pneumoniae .................................................... 18
1.3.1. E. coli ...................................................................................................... 18
1.3.2. K. pneumoniae ........................................................................................ 20
2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 22
3. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................. 23
3.1. P ocesado de las ca nes ................................................................................ 23
3.1.1. Recuen o de E. coli ................................................................................. 23
3.1.2. P e-en iquecimien o y en iquecimien o .................................................. 23
3.2. Aislamien o e iden i icación de en e obac e ias ........................................ 24
3.2.1. Medio ML ............................................................................................... 24
3.2.2. Medio SCAi ............................................................................................ 25
3.2.3. Medio ESBL ........................................................................................... 25
3.2.4. Medio CARBA ....................................................................................... 26
3.2.5. Gale ías mul ip uebas API® 20 ETM ....................................................... 26
Pablo Gallego A ias
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3.2.6. Espec ome ía de masas MALDI-TOF ................................................. 27
3.3. Ca ac e ización eno ípica de RAM ........................................................... 28
3.3.1. P epa ación del inóculo .......................................................................... 28
3.3.2. Inoculación de las placas ........................................................................ 28
3.3.3. Dispensación de los discos ..................................................................... 28
3.3.4. Lec u a e in e p e ación de esul ados .................................................... 29
3.4. Ca ac e ización geno ípica de las cepas y RAM ........................................ 30
3.4.1. PCR con encional .................................................................................. 30
3.4.1.1. Ex acción del ADN ............................................................................ 30
3.4.1.2. Mezcla de eacción ............................................................................. 31
3.4.1.3. Ampli icación del ADN ....................................................................... 31
3.4.1.4. Re elado de los esul ados ................................................................. 31
3.5. Análisis es adís ico de los da os ................................................................... 34
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................... 35
4.1. Recupe ación e iden i icación de En e obac e iaceae ............................... 35
4.1.1. Recupe ación de En e obac e iaceae ...................................................... 35
4.1.2. Recupe ación de cepas po encialmen e zoonósicas ................................ 37
4.2. De e minación geno ípica y eno ípica de RAM ........................................ 38
4.2.1. De e minación geno ípica de RAM ........................................................ 38
4.2.2. De e minación eno ípica de RAM ......................................................... 38
4.3. Ca ac e ización de aislamien os .................................................................. 40
4.4. Valo ación del iesgo mic obiológico del consumido ............................... 42
5. CONCLUSIONES ................................................................................................ 43
6. ANEXOS ................................................................................................................ 44
6.1. Compilación gene al de p ime s ...................................................................... 44
7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 48
Pablo Gallego A ias
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RESUMEN
Segu idad alimen a ia: moni o ización in eg ada de an ibio esis encias (RAM)
En un mundo en el cual la e olución de la in eligencia a i icial pa ece que a a
cambia lo odo, la pandemia silenciosa de la esis encia a los an imic obianos cons i uye,
jun o con el cambio climá ico, una de las mayo es amenazas pa a la humanidad.
De hecho, los e os de la lucha con a el calen amien o global y la RAM es án
es echamen e ligados. Po eso, la O ganización Mundial de la Salud (OMS) es ablece
que p io idades como es as o la segu idad alimen a ia deben se abo dadas bajo un
en oque One Heal h pa a man ene el equilib io de los ecosis emas. Es a pe spec i a se
basa en que la salud humana, animal y ambien al es án o almen e in e elacionadas.
Los animales son ese o ios de mic oo ganismos zoonósicos y/o esis en es a los
an imic obianos, y los alimen os ac úan como ehículos ansmiso es de los mismos.!En
es e sen ido, el jabalí (Sus sc o a) es una especie cen inela ideal debido a su c ecien e
abundancia, dis ibución y ele ancia epidemiológica, po su ce canía a medios u banos
y u ales. Además, cons i uye una uen e de ca ne de caza, un hábi o gas onómico cada
ez más popula , cuya calidad mic obiológica, en base a los esul ados del p esen e
abajo, ue insa is ac o ia en el 20 % de los alimen os.
En es e es udio se analiza on 29 mues as de ca ne de jabalí. Dos de ellas (6,9 %)
esul a on po ado as de sendos pa o ipos de Esche ichia coli po encialmen e pa ógenos,
EPEC y ExPEC, apun ando a un posible o igen humano en la manipulación. Además, un
27,6 % ue on posi i as pa a la ecupe ación de Klebsiella pneumoniae. El es udio de
esis encia median e PCR y el mé odo de di usión disco-placa ambién de e minó que un
20,7 % de los alimen os po aban E. coli mul i esis en es (MDR) y que el 10,3 % e an
posi i os pa a E. coli p oduc o as de be alac amasas de espec o ex endido (BLEE).
En conclusión, la ca ne de jabalí puede se uen e de en e obac e ias de iesgo pa a
el consumido , como E. coli p oduc o as de BLEE y K. pneumoniae. Así pues, debe ían
inclui se las ca nes de caza en los p og amas de con ol de bac e ias esis en es,
in o mando sob e su co ec a manipulación pa a ga an iza la segu idad alimen a ia.
Palab as cla e: En e obac e iaceae, Esche ichia coli, Klebsiella pneumoniae, Una Sola
Salud, Sus sc o a, caza, segu idad alimen a ia, RAM, BLEE, EPEC.
Pablo Gallego A ias
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RESUMO
Segu idade alimen a ia: moni o ización in eg ada de an ibio esis encias (RAM)
Nun mundo no cal a e olución da in elixencia a i icial pa ece que ai mudalo
odo, a pandemia silenciosa da esis encia aos an imic obianos cons i úe, xun o co cambio
climá ico, unha das maio es ameazas pa a a humanidade.
De ei o, os e os da loi a con a o quecemen o global e a RAM es án es ei amen e
encellados. Po iso, a O ganización Mundial da Saúde (OMS) es ablece que p io idades
como es as ou a segu idade alimen a ia deben se abo dadas baixo un en oque One Heal h
pa a man e o equilib io dos ecosis emas. Es a pe spec i a baséase en que a saúde
humana, animal e ambien al es án o almen e in e elacionadas.
Os animais son ese o ios de mic oo ganismos zoonósicos e/ou esis en es aos
an imic obianos, e os alimen os ac úan como ehículos ansmiso es dos mesmos. Nes e
sen ido, o xaba il (Sus sc o a) é unha especie sen inela ideal debido á súa c ecen e
abundancia, dis ibución e ele ancia epidemiolóxica, pola súa p oximidade a medios
u banos e u ais. Ademais, cons i úe unha on e de ca ne de caza, un hábi o gas onómico
cada ez máis popula , cuxa calidade mic obiolóxica, en base aos esul ados do p esen e
aballo, oi insa is ac o ia no 20 % dos alimen os.
Nes e es udo analizá onse 29 mos as de ca ne de xaba il. Dúas delas (6,9 %)
esul a on po ado as de senllos pa o ipos de Esche ichia coli po encialmen e pa óxenos,
EPEC e ExPEC, apun ando a unha posible o ixe humana na manipulación. Ademais, un
27,6 % o on posi i as pa a a ecupe ación de Klebsiella pneumoniae. O es udo de
esis encia median e PCR e o mé odo de di usión disco-placa amén de e minou que un
20,7 % dos alimen os po aban E. coli mul i esis en es (MDR), e que o 10,3 % e an
posi i os pa a E. coli p odu o as de be alac amasas de espec o es endido (BLEE).
En conclusión, a ca ne de xaba il pode se on e de en e obac e ias de isco pa a
o consumido , como E. coli p odu o as de BLEE e K. pneumoniae. Así pois, debe ían
incluí se as ca nes de caza nos p og amas de con ol de bac e ias esis en es, in o mando
sob e a súa co ec a manipulación pa a ga an i a segu idade alimen a ia.
Palab as cla e: En e obac e iaceae, Esche ichia coli, Klebsiella pneumoniae, Unha Soa
Saúde, Sus sc o a, caza, segu idade alimen a ia, RAM, BLEE, EPEC.
Pablo Gallego A ias
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ABSTRACT
Food sa e y: in eg a ed moni o ing o an imic obial esis ance (AMR)
In a wo ld whe e he a i icial in elligence e olu ion looks se o change
e e y hing, he silen pandemic o an imic obial esis ance is, along wi h clima e change,
one o he g ea es h ea s o humani y.
In ac , he challenges o comba ing global wa ming and AMR a e closely linked.
This is why he Wo ld Heal h O ganisa ion (WHO) s a es ha p io i ies such as hese o
ood secu i y mus be add essed unde a One Heal h app oach o main ain he ecosys ems
balance. This pe spec i e is based on he ac ha human, animal and en i onmen al
heal h a e o ally in e ela ed.
Animals a e ese oi s o zoono ic and/o an imic obial esis an mic oo ganisms,
and ood ac s as a ehicle o hei ansmission. In his espec , wild boa (Sus sc o a) is
an ideal sen inel species due o i s inc easing abundance, dis ibu ion and epidemiological
ele ance, because o i s p oximi y o u ban and u al en i onmen s. Mo eo e , i is a
sou ce o game mea , an inc easingly popula gas onomic habi , whose mic obiological
quali y, based on he esul s o he p esen wo k, was unsa is ac o y in 20 % o he
oods u s.
In his s udy, 29 samples o wild boa mea we e analysed. Two o hem (6,9 %)
we e ound o ca y bo h po en ially pa hogenic Esche ichia coli pa ho ypes, EPEC and
ExPEC, poin ing o a possible human o igin in he handling. In addi ion, 27,6 % we e
posi i e o Klebsiella pneumoniae eco e y. The esis ance s udy by PCR and he disc-
pla e di usion me hod also de e mined ha 20,7 % o he ood ca ied mul id ug- esis an
(MDR) E. coli, and ha 10,3 % we e posi i e o ex ended-spec um be a-lac amase
(ESBL)-p oducing E. coli.
In conclusion, wild boa mea may be a sou ce o dange ous en e obac e ia o he
consume , such as ESBL-p oducing E. coli and K. pneumoniae. The e o e, game mea s
should be included in con ol p og ammes o esis an bac e ia and in o ma ion on p ope
handling should be p o ided o ensu e ood sa e y.
Keywo ds: En e obac e iaceae, Esche ichia coli, Klebsiella pneumoniae, One Heal h,
Sus sc o a, hun ing, ood sa e y, AMR, ESBL, EPEC.
Pablo Gallego A ias
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RESUMEN GRÁFICO
Figu a 1. Resumen g á ico de “Segu idad alimen a ia: moni o ización in eg ada de an ibio esis encias
(RAM)” (C eado con BioRende .com).
Pablo Gallego A ias
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ÍNDICE DE ABREVIATURAS
ADN: Ácido desoxi ibonucleico
AEMPS: Agencia Española de Medicamen os y P oduc os Sani a ios
APT: Agua de pep ona amponada
BHE: Ba e a hema oence álica
BLEE: Be alac amasa de Espec o Ex endido
CCAA: Comunidades Au ónomas
CDC (Cen e s o Disease Con ol and P e en ion): Cen o pa a el Con ol y la
P e ención de En e medades
CGE (Cen e o Genomic Epidemiology): Cen o de Epidemiología Genómica
CH: Clono ipado
CLSI (Clinical & Labo a o y S anda ds Ins i u e): Ins i u o de Es ánda es Clínicos y de
Labo a o io
CMI: Concen ación mínima inhibi o ia
ECDC (Eu opean Cen e o Disease P e en ion and Con ol): Cen o Eu opeo pa a la
P e ención y el Con ol de En e medades
EFSA (Eu opean Food Sa e y Agency): Agencia Eu opea de Segu idad Alimen a ia
EMA (Eu opean Medicines Agency): Agencia Eu opea del Medicamen o
ESCMID (Eu opean Socie y o Clinical Mic obiology and In ec ious Diseases):
Sociedad Eu opea de Mic obiología Clínica y En e medades In ecciosas
EUCAST (Eu opean Commi ee on An imic obial Suscep ibili y Tes ing): Comi é
Eu opeo de P uebas de Suscep ibilidad An imic obiana
FAO (Food and Ag icul u e O ganiza ion o he Uni ed Na ions): O ganización de las
Naciones Unidas pa a la Alimen ación y la Ag icul u a
GF: G upo ilogené ico
IA: in eligencia a i icial
IREC: Ins i u o de In es igación en Recu sos Cinegé icos
Pablo Gallego A ias
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an imic obiano. La mayo ía de las be alac amasas son de na u aleza plasmídica, aunque
hay mic oo ganismos que p oducen be alac amasas c omosómicas (Can ón e al., 2002).
Po su pa e, las AmpC o ce alospo inasas, son se ina-be alac amasas. No son
inhibidas po los inhibido es clásicos de be alac amasas y ac úan sob e penicilinas, y
ce alospo inas de p ime a, segunda y e ce a gene ación. No esponden, sin emba go, an e
ce alospo inas de cua a gene ación ni ca bapenemes.
En cuan o a las ca bapenemasas, es as son enzimas muy e sá iles que
hid olizan, además de a los ca bapenémicos, a p ác icamen e odos los be alac ámicos.
Cabe des aca que los ca bapenemes son conside ados an ibió icos de úl ima línea
e apéu ica, u ilizados pa a a a in ecciones insensibles en e a o os an ibió icos, po
lo que la igilancia de cepas de en e obac e ias p oduc o as de es as enzimas es
undamen al (Del Valle Ma ínez Rojas, 2009).
Figu a 2. Modo de acción de las be alac amasas (Licencia C ea i e Commons).
1.2. Papel de los alimen os en la ansmisión de RAM
Las en e medades zoonósicas son aquellas causadas po in ecciones que se
p opagan en e animales y humanos. Algunas se ansmi en a a és alimen os y/o agua
con aminados con bac e ias, i us o pa ási os que colonizan el ac o gas oin es inal
pudiendo desencadena g a es pa ologías. (EFSA, 2023).
Muchos de es os mic oo ganismos o man pa e de la mic obio a in es inal de
animales des inados al consumo humano, pe o ambién pueden se el esul ado de
con aminaciones p oducidas en dis in os pun os de la cadena alimen a ia (en las g anjas,
du an e el anspo e, el p ocesado, la p epa ación…), o p opagados a a és del medio
ambien e debido a una con aminación ecal del agua, los piensos o los e ilizan es
(Kou soumanis e al., 2021).
No obs an e, el pelig o no es á solamen e ocasionado po bac e ias pa ógenas y/o
mul i esis en es causan es de in ecciones alimen a ias, sino ambién po la posibilidad
Pablo Gallego A ias
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de que és as ans ie an genes de esis encia a las bac e ias comensales de la mic obio a
del hospedado al en a en con ac o con ellas (CDC, 2024).
Pe o si la RAM es una amenaza impo an e pa a la salud pública global, en ende
su elación con la segu idad alimen a ia es undamen al pa a pode abo da el p oblema
en oda su dimensión. A ac o es como el de la disminución en el descub imien o de
nue os an ibió icos, o el de su u ilización inco ec a y excesi a, hay que añadi o os
como el modelo de p oducción in ensi a que puede a o ece la diseminación bac e iana;
y los cambios en los hábi os de consumo (demanda c ecien e de comida ápida o
p ecocinada), que conlle an iesgos debido a una conse ación inco ec a, iempos de
cocinado inadecuados o la apa ición de con aminaciones c uzadas (Díaz Jiménez, 2021).
Además, el hecho de que haya un me cado global de p oduc os ag ícolas o
cá nicos p oceden es de zonas de meno segu idad alimen a ia, a o ece ambién la
dispe sión de cepas esis en es (Campos e al., 2018).
1.2.1. Con oles en ca ne de caza
Uno de los obje i os p incipales del en oque One Heal h es el de es ablece un
sis ema de igilancia de RAM an o en humanos, como en animales sal ajes y de g anjas,
además de en el medio ambien e. Es o es especialmen e ele an e en el escena io ac ual,
ma cado po la c ecien e agmen ación de los hábi a s na u ales po la acción del homb e.
P ác icas como la de o es ación y la u banización p o ocan que la auna sil es e es é en
con ac o de o ma cada ez más es echa con las pe sonas y su ganado, inc emen ando la
p obabilidad de ansmisión de RAM en e unas poblaciones y o as (To es e al., 2020).
En España, la de ección de RAM en ca nes come cializadas en supe me cados
es á moni o izada po el Plan Nacional de Con ol O icial de la Cadena Alimen a ia
(PNCOCA 2021-2025), que incluye ma ade os, salas de manipulación de caza y salas de
a amien o de eses de lidia (AESAN, 2022). No obs an e, no ocu e lo mismo con ca nes
de especies cinegé icas como el co zo, el jabalí o la lieb e des inadas al au oconsumo, lo
cual es habi ual en muchas egiones españolas.
P ecisamen e, el jabalí (Sus sc o a), mamí e o de la amilia de los suidos, se
pos ula como una cen inela ideal en la moni o ización de RAM, pues o que has a el
momen o no se han analizado en p o undidad los posibles iesgos que en aña su consumo
ni su po encial en la ansmisión de RAM. Del mismo modo, el hecho de que se a e de
una especie sil es e en c ecien e expansión en oda Eu opa, que se mue e en e en o nos
Pablo Gallego A ias
18
u banos y u ales, y que no debe ía es a some ida a a amien o con an ibió icos, la
con ie e en el ínculo pe ec o en e los es compa imen os que encie a One Heal h:
el medio ambien e, los humanos y los animales (To es e al., 2020). Buena p ueba de
es o es el hecho de que algunas publicaciones mues an que apenas exis en di e encias en
la p e alencia de cepas RAM en e ca nes de especies domés icas y sal ajes como ce dos
y jabalíes (Rega e al., 2022).
Como se indica en el pá a o an e io , las poblaciones de es e mamí e o es án
aumen ando en odo el con inen e, siendo es e inc emen o especialmen e no able en
España, donde ya hay más de un millón, ci a que pod ía duplica se en 2025 según los
expe os. Buena p ueba de es o es la ecien e decla ación de la eme gencia cinegé ica en
248 ayun amien os gallegos po pa e de la Xun a de Galicia pa a la empo ada
2023/2024, es ableciendo la caza sin lími es del jabalí con el obje i o de e i a daños en
los cul i os, acciden es de á ico o la ansmisión de en e medades como la pes e po cina
a icana, que son algunos de los p incipales pe juicios que causa su sob epoblación
(Resolución de 6 de sep iemb e de 2023, de la Je a u a Te i o ial de Lugo, po la que se
decla a la eme gencia cinegé ica empo al po los daños ocasionados po el jabalí en las
coma cas de Os Anca es, Chan ada, Lugo, A Ma iña Cen al, A Ma iña Occiden al, A
Ma iña O ien al, Sa ia, Te a Chá y Te a de Lemos).
1.3. Esche ichia coli y Klebsiella pneumoniae
Tan o E. coli como K. pneumoniae son especies de bac e ias G am-nega i as y
anae obias acul a i as con o ma de bacilo, pe enecien es a la amilia de las
en e obac e ias. Ambas se pueden encon a en la mic obio a del ac o gas oin es inal
de o ganismos sanos. No obs an e, en ocasiones se pueden p oduci al e aciones y
desequilib ios conocidos como disbiosis, así como in ecciones en o as zonas del cue po.
Muchas de ellas son di íciles de a a po la ele ada can idad de RAM, an o in ínsecas
como adqui idas, que podemos encon a en es as especies.
1.3.1. E. coli
E. coli ue desc i a po p ime a ez en 1885 po el pedia a alemán Theodo Von
Esche ich, a quien debe su nomb e. Sus células pueden se mó iles o no, dependiendo de
la p oducción de lagelos. El hecho de que se encuen e en el ac o gas oin es inal de
e eb ados, donde in e iene en la sín esis de i amina K o en la ac i ación del sis ema
inmune, hace que su p esencia en aguas o alimen os se u ilice como un indica i o de
Pablo Gallego A ias
19
con aminación ecal. La clasi icación de las cepas de E. coli se ha ealizado clásicamen e
en unción de se og upos basados en el an ígeno O (lipopolisacá ido, LPS) y/o se o ipos
de inidos po una misma combinación del an ígeno O jun o con el H ( lagelo), y en
ocasiones el K (cápsula) (Kape e al., 2004).
Aunque hay muchas combinaciones posibles de los an ígenos O:K:H, la mayo ía
co esponden a cepas de E. coli inocuas e incluso bene iciosas y solo algunas se asocian
con de e minados ipos pa ógenos de E. coli, los cuales se pueden di idi en dos g andes
g upos: E. coli pa ógeno in es inal (InPEC) y E. coli pa ógeno ex ain es inal
(ExPEC), dependiendo de si causan in ecciones den o o ue a del in es ino,
espec i amen e.
Den o de cada uno de esos g upos de es ablecen di e en es pa o ipos (Tabla 2),
es deci , g upos de E. coli asociados a un cuad o pa ógeno de inidos po ac o es de
i ulencia especí icos.
Den o de los in es inales o dia eagénicos enemos: E. coli e o oxigénico
(VTEC), E. coli en e opa ogénico (EPEC), E. coli en e o oxigénico (ETEC), E. coli
en e oin asi o (EIEC), E. coli en e oag ega i o (EAEC), E. coli de adhe encia di usa
(DAEC) y E. coli adhe en e-in asi o (AIEC).
Con espec o a los ex ain es inales, es os se di iden en E. coli u opa ogénicos
(UPEC), E. coli asociado con meningi is o sepsis (MNEC/SPEC) y E. coli pa ogénico
a ia (APEC).
Muchas de las cepas pa ógenas de E. coli han desa ollado esis encias a los
an imic obianos. Algunas, como es el caso de las pe enecien es al clon pandémico
ST131, incluso son esponsables de la dispe sión de BLEE. Es e clon ue iden i icado en
2008 y hoy se conside a el p edominan e en e las in ecciones hospi ala ias
ex ain es inales mul i esis en es a ni el mundial (Ga cía-Meniño e al., 2024).
En cualquie caso, más allá de las a ian es pa ogénicas de es a bac e ia, su papel
de comensal en el ac o gas oin es inal de la mayo ía de los e eb ados de sang e
calien e, muchos de los cuales es án des inados a la p oducción, la con ie e en un muy
buen indicado pa a la igilancia de RAM, asociado además al ámbi o de la segu idad
alimen a ia. De es a o ma, al pe mi i moni o iza los genes de esis encia exis en es, los
cuales pueden se ans e idos a bac e ias pa ógenas, se puede es ablece un sis ema de
de ección undamen al pa a la salud pública y pa a la salud animal (EFSA, 2014).
Pablo Gallego A ias
20
G upo
Pa o ipo
Ca ac e ís icas
En e medad
InPEC
VTEC
P oducción de la ci o oxina
conocida como shiga oxina o
e o oxina
Sínd ome u émico
hemolí ico (SUH) y
coli is hemo ágica
EPEC
Lesiones de adhe encia y bo ado
de mic o ellosidades en células
del epi elio in es inal
Dia ea in an il
ETEC
P oducción de en e o oxinas
lábiles o es ables al calo
Dia ea del iaje o
EIEC
Cepas con capacidad de in asión
de las células in es inales
Dia ea acuosa y
disen e ía
EAEC
Fo mación de bio ilm y adhesión
ag ega i a en en e oci os
Dia ea pe sis en e
en niños y adul os
DAEC
Adhesión di usa con o mación de
p oyecciones celula es al ededo
de la bac e ia
Dia ea aguda y
pe sis en e en niños
AIEC
Adhesión e in asión de células
del epi elio in es inal
Asociación con
en e medad de
C ohn
ExPEC
UPEC
Colonización del epi elio de la
ejiga desde á eas pe iu e ales
In ecciones del ac o
u ina io (ITU)
APEC
Sin oma ología espi a o ia en
a es sal ajes y domés icas.
Po encial zoonósico en humanos
Colibacilosis a ia
MNEC / SPEC
P opagación a a és de la
sang e has a el SNC c uzando la
BHE
Meningi is neona al y
sepsis
Tabla 2. Pa o ipos de E. coli. Adap ada de (Kape e al., 2004) (SNC: Sis ema ne ioso cen al; BHE:
ba e a hema oence álica).
1.3.2. K. pneumoniae
K. pneumoniae ue nomb ada así en hono al mic obiólogo alemán del siglo XIX
Edwin Klebs. En humanos es á p esen e de o ma na u al en el ac o gas oin es inal o
en la naso a inge, pe o ambién puede de ec a se en el medio ambien e, en agua o en
suelos (Tá a a, 2013).
Po o o lado, es uno de los pa ógenos opo unis as más habi uales en el ámbi o
hospi ala io, y es causan e de in ecciones nosocomiales y comuni a ias ales como
neumonías, sep icemias, in ecciones del ac o u ina io (ITU) o in ecciones qui ú gicas
Pablo Gallego A ias
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que ep esen an un p oblema c ecien e en odo el mundo, especialmen e en los países
asiá icos (Rod igues e al., 2022).
Además, en elación con la c ecien e p eocupación po la RAM, cabe des aca que
es a especie puede es a ambién p esen e en los alimen os. Y es que hay es udios ecien es
que mues an que ca nes de pollo, pa o o ce do con aminadas con K. pneumoniae pueden
ac ua como po enciales ansmiso as de bac e ias po ado as de genes de esis encia,
con i iéndose en un iesgo impo an e pa a la salud pública (Riley, 2020; Sil a-Bea e
al., 2024)
Con espec o, po ejemplo, a la p oducción de BLEE, es a es una de las p incipales
en e obac e ias p oduc o a de es as enzimas. Asimismo, la u ilización inco ec a de
an ibió icos como los ca bapenémicos ha hecho que la esis encia de K. pneumoniae a
a amien os de úl imo ecu so como es e se es é gene alizando a a ios países. Es po eso
po lo que la OMS incluye a las K. pneumoniae esis en es a ce alospo inas de e ce a
gene ación y ca bapenemasas en e los pa ógenos de p io idad c í ica pa a los cuales es
necesa io el desa ollo de nue os an imic obianos (WHO, 2024).
A odo lo an e io hay que añadi que, si bien, adicionalmen e se habían
clasi icado los pa o ipos de K. pneumoniae en es g upos mayo i a ios -el clon
mul i esis en e (MDR) y el clon hipe i ulen o (h ), además del pa o ipo clásico
opo unis a- en la ac ualidad han e olucionado de o ma con e gen e has a la eme gencia
de cepas que son simul áneamen e esis en es a múl iples an ibió icos e hipe i ulen as
(Dong e al., 2022). Es as a ian es es a ían elacionadas con un eno ipo
hipe muco iscoso (HMV), ca ac e izado po la sob ep oducción de polisacá idos de la
cápsula bac e iana, que, jun o con la o mación de biopelículas, cons i uye uno de los
p incipales ac o es de i ulencia de Klebsiella spp. (Russo e al., 2011; Sil a-Bea e al.,
2024).
Pablo Gallego A ias
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2. OBJETIVOS
El p esen e abajo de in de g ado se ha ealizado en el ma co del P oyec o
Nacional PID2022-143041OB-100 inanciado po MCIN/AEI/10.13039/501100011033/
y po FEDER “Una mane a de hace Eu opa”; i ulado “Segu idad alimen a ia:
moni o ización in eg ada de an ibio esis encias y dianas de in e ención del medio
ambien e, a la g anja y a la mesa”. En él se incluye el mues eo del jabalí aba ido en los
p og amas o iciales de con ol, y el de la ca ne de caza de jabalí como cen inela del lujo
de RAM.
La mo i ación gene al del p esen e es udio ue e alua la calidad mic obiológica
de la ca ne de jabalí p oceden es de la zona de la coma ca de O iedo (As u ias); así como
la ca ac e ización eno ípica y geno ípica de las en e obac e ias p esen es y de su
esis oma.
Los obje i os especí icos de es e p oyec o ue on:
1. Recupe ación e iden i icación de En e obac e iaceae en mues as de ca ne usando
medios selec i os especí icos y écnicas de biología molecula .!
!
2. Ca ac e ización de aislamien os.!
!
3. De e minación geno ípica y eno ípica de an ibio esis encias.!
!
4. Valo ación del iesgo mic obiológico del consumido po consumo de ca ne de
caza.!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
!
Pablo Gallego A ias
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3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. P ocesado de las ca nes
Se analiza on un o al de 29 mues as de ca ne de jabalí p oceden es de 29
animales aba idos en el ámbi o de la ac i idad cinegé ica au o izada en la coma ca de
O iedo, en la empo ada 2023-2024. Las mues as ecogidas as la aba ida de los
animales y el despiezado in si u, se conse a on congeladas a -20 ºC has a su llegada al
Labo a o io de Re e encia de E. coli (LREC-USC), donde se descongela on a empe a u a
de e ige ación (en e 2 y 8 ºC), 24 h an es del p ocesamien o.
Pa a minimiza cualquie iesgo de con aminación se ealizó el p ocesado en una
cabina de biosegu idad p e iamen e some ida a a amien o ge micida con luz UV du an e
30 min, jun o con odo el ma e ial es é il necesa io.
Con cada una de las mues as se epi ió el mismo p ocedimien o. En p ime luga ,
se pesa on 25 g de ca ne co ada, en condiciones es é iles, de oda la supe icie de la pieza
a analiza . Cuando es aba p esen e, se incluyó ambién el jugo de las ca nes p oceden e
del p oceso de descongelación. Se in odujo la can idad pesada en una bolsa de doble
il o pa a S omache ®, a la que pos e io men e se añadie on 225 mL de agua de pep ona
amponada (APT; ApplyChem Pan eac), ealizando una dilución 1:10. Cada una de las
bolsas ue agi ada du an e 1 min 30 s en el homogeneizado S omache ®.
3.1.1. Recuen o de E. coli
Inmedia amen e después de la dilución 1:10 en APT, se inoculó 1 mL de
homogeneizado en una placa 3M Pe i ilmTM. Los Pe i ilm con ienen nu ien es de Bilis
Rojo-Viole a, un indicado de ac i idad de la glucu onidasa y o o indicado que acili a
la enume ación de las colonias. El 97 % de los E. coli p oducen be a-glucu onidasa, la
cual p oduce un p ecipi ado azul asociado con cada colonia. La lec u a de los Pe i ilm y
el ecuen o de E. coli pa a es ablece la calidad mic obiológica de las ca nes se ealiza on
as 24 h de incubación a 44 ºC en condiciones de humedad.
3.1.2. P e-en iquecimien o y en iquecimien o
T as el p e-en iquecimien o de las mues as de APT du an e 6 h a 37 ºC, se inoculó
1 mL de cada una de ellas en ubos de id io con 9 mL de Caldo MacConkey (Oxoid).
Pablo Gallego A ias
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Es os pe manecie on a 37 ºC du an e un mínimo de 18 h, comple ando así el
en iquecimien o.
3.2. Aislamien o e iden i icación de en e obac e ias
Pa a el aislamien o de En e obac e iaceae de las mues as de ca ne se
es ablecie on cua o p o ocolos, co espondien es cada uno de ellos a un medio de cul i o
dis in o. En odos se u ilizó la siemb a po ago amien o en es ía. El p o ocolo I u iliza
medio MacConkey Lac osa (ML), el p o ocolo II emplea el medio ci a o-inosi ol (SCAi),
el p o ocolo III consis e en la u ilización del CHROMID® ESBL, mien as que en el
p o ocolo IV el medio empleado es CHROMID® CARBA SMART (Figu a 3).
Figu a 3. Flujo de abajo pa a la ecupe ación de en e obac e ias en ca ne de jabalí (APT: Agua de pep ona
amponada; ML: MacConkey Lac osa; RAM: Resis encia an imic obiana; TSA: Aga ip ona de soja).
3.2.1. Medio ML
El aga ML (Oxoid) es un medio u ilizado pa a el aislamien o de
En e obac e iaceae y o os bacilos G am-nega i os. Se a a de un medio selec i o ya que
inhibe el c ecimien o de bac e ias G am-posi i as g acias a su composición de sales
bilia es y c is al iole a. Además, es un medio de cul i o di e encial, al pe mi i es ablece
una dis inción en e mic oo ganismos e men ado es de lac osa, lac osa posi i os; y no
e men ado es de lac osa, lac osa nega i os. Todo ello se p oduce g acias a un indicado
de pH ojo neu o, que se uel e osa an e descensos de pH p o ocados po los
me aboli os ácidos p oducidos po las bac e ias que e men an es e azúca . Aquellas
bac e ias que no e men an la lac osa, po el con a io, se uel en incolo as al u iliza
Pablo Gallego A ias
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pep ona en su luga , o mando amoníaco y aumen ando así el pH del medio, que pasa a
adqui i una colo ación ama illen a.
T as incubación a 37 ºC du an e 18-24 h, la mo ología ípica de los E. coli que
c ecen en es e medio es la de colonias edondeadas de colo osa o ojo que pueden
p esen a un halo de p ecipi ación de bilis al ededo . K. pneumoniae, po su pa e, se
ca ac e iza po c ece en o ma de colonias g andes con un aspec o mucoide de colo ojo
o osa (Condalab, 2022).
3.2.2. Medio SCAi
El aga ci a o de Simmons con mio-inosi ol al 1% (SCAi; Oxoid) es un medio
selec i o y di e encial que se u iliza de o ma especí ica pa a el aislamien o de cepas de
K. pneumoniae p oceden es de alimen os. A di e encia de o os medios, en SCAi el
iempo de incubación adecuado pa a disc imina co ec amen e las colonias es de 48 h a
44 ºC de empe a u a. Sin emba go, en ocasiones ya du an e las p ime as 24 h se pueden
obse a colonias ípicas de Klebsiella spp., ama illas, mucoides y con o ma de cúpula,
debido a que e men an el inosi ol y p oducen me aboli os ácidos que educen el pH y
hacen que el indicado i e de azul a ama illo. E. coli, po su pa e, no u iliza el inosi ol
y o ma colonias blancas. Exis e un pequeño po cen aje de K. pneumoniae que pueden
e se azules debido a que no me abolizan el inosi ol, pe o sí el ci a o. Además, ambién
es posible que si hay muchas bac e ias e men ado as de inosi ol, el medio en su conjun o
se o ne ama illo, haciendo di ícil la disc iminación de cepas. En es e caso se ía
ecomendable dilui y eaisla en o a placa (Rod igues e al., 2020; 2022).
3.2.3. Medio ESBL
CHROMID® ESBL (bioMé ieux) es un medio selec i o c omogénico u ilizado
pa a la de ección de en e obac e ias p oduc o as de BLEE. Es e aga con iene una mezcla
de an ibió icos como la ce podoxima, una ce alospo ina de e ce a gene ación insensible
en e a las bac e ias p oduc o as de es as enzimas.
Los medios de cul i o c omogénicos como es e con ienen sus a os incolo os que,
al se hid olizados po las bac e ias de in e és, p oducen una colo ación ca ac e ís ica en
cada una de ellas. En es e caso se incluyen dos sus a os c omogénicos y un sus a o
na u al que pe mi en la iden i icación di ec a de los mic oo ganismos p oduc o es de
BLEE más ecuen es:
Pablo Gallego A ias
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En cada pocillo se ca ga on 10 µL de mues a ampli icada, incluyendo los
con oles nega i os y posi i os co espondien es. Se emplea on uen es y cube as Bio-
Rad, aplicando un ol aje de 120 V du an e 25-40 min, dependiendo del amaño del gel
y del gen ampli icado. Po úl imo, se isualiza on los esul ados con luz ul a iole a en
un lec o Gel Doc XR de Bio-Rad.
De acue do con es e p ocedimien o se ealiza on PCR pa a:
- Con i mación de E. coli a a és de la de ección del gen uidA, que codi ica pa a una
be a-glucu onidasa especí ica de es a especie.
- Con i mación de K. pneumoniae median e ampli icación del gen kp50233, ma cado
especí ico de la especie, que codi ica pa a una acil ans e asa.
- De e minación del an ígeno O25b asociado al se o ipo O25b, al cual pe enece el clon
pandémico ST131, po medio de la de ección del gen bO25b.
- Iden i icación de las e o oxinas 1 y 2 (genes s x1/s x2) asociadas al pa o ipo VTEC.
- Iden i icación del gen de la in imina eae y el del pili sexual b p, asociados al pa o ipo
EPEC.
- De ección de los genes de i ulencia iu A, kpsM II y papAH codi ican es pa a un
side ó o o, una cápsula, y una subunidad de una imb ia adhesi a, espec i amen e,
asociados al g upo de ExPEC.
- De ección median e PCR múl iple de los genes mc 1-5 asociados con la esis encia
a colis ina mediada po plásmidos.
- De e minación y ipi icación de los genes de esis encia blaBLEE (CIT, SHV, CTX-M),
pa a e el ipo de BLEE.
- Es ablecimien o del g upo ilogené ico (GF) de E. coli (A, B1, B2, C, D, E, F)
median e PCR cuád uple (a pA, chuA, yjaA y TSpE.4.C2).
3.4.2. Secuenciación Sange
Los genes ampli icados que ue on en iados a la Pla a o ma de Secuenciación y
Genómica Funcional (Depa amen o de Gené ica de la Facul ad de Ve e ina ia, Campus
Te a) pa a secuenciación Sange se ob u ie on ealizando una PCR con un olumen
inal de 50 μL (49 μL de mezcla de eacción y 1 μL de ADN). En es e caso se emplean
500 μL de agua MiliQ pa a la ex acción del ma e ial gené ico de cada cepa, se u ilizan
pun as con il o, y la mezcla de eacción se p epa a de mane a di e en e. Se añaden po
Pablo Gallego A ias
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sepa ado 0,2 μL de enzima MyTaqTM DNA polyme ase (Bioline) y 10 μL de 5x My Taq™
Reac ion Bu e (Bioline), el cual ya incluye los dNTPs y el MgCl2.
No obs an e, es as mezclas son incolo as po lo que, una ez inalice la PCR
con encional y an es de p ocede a ca ga las mues as en el gel de aga osa, se deben
añadi en una placa de 96 pocillos 2 μL de un ampón de ca ga a 5 μL de mues a
ampli icada pa a pode isualiza los agmen os, mezclándolos bien en una de las
celdillas an es de ca ga los 7 μL en el gel.
Una ez que se comp ueba que las mues as y el con ol nega i o se isualizan
co ec amen e (Figu a 4), es as son en iadas a la Pla a o ma de Secuenciación y
Genómica Funcional, donde se ealiza á una secuenciación Sange . Es e p ocedimien o
consis e en la adición de didesoxinucleó idos (ddNTPs) e minado es de la cadena de
ADN que es á siendo eplicada po la polime asa, de un modo semejan e a lo que ocu e
en la PCR. Cada ddNTP es á ma cado con un pigmen o di e en e en unción de la base
ni ogenada que con enga, y es a es de ec ada g acias a un láse que ilumina los
agmen os ob enidos al pasa a a és del gel en una elec o o esis capila , dando como
esul ado un c oma og ama con los picos de la secuencia de ADN comple a (C ossley e
al., 2020).
Siguiendo es e p ocedimien o se secuencia on en la Pla a o ma de Secuenciación
y Genómica Funcional los genes blaCTX-M ( ealizando una PCR p e ia de disc iminación
en e g upo 1 y g upo 9) y los genes imH y umC pa a de e minación del clono ipo (CH).
A las secuencias p opo cionadas se les ealizó un análisis in silico en el Cen e o
Genomic Epidemiology (CGE) u ilizando las he amien as ResFinde 4.5,
Kme Resis ance 2.2, FimType 1.0 y CHType 1.0
(h p://www.genomicepidemiology.o g/se ices/).
Figu a 4. Gel de elec o o esis pa a PCR p e ia a secuenciación de los genes imH, izquie da, y umC,
de echa (Pb: Pa es de bases).
Pablo Gallego A ias
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3.5. Análisis es adís ico de los da os
Pa a es ablece una signi icación es adís ica a la ho a de compa a la p e alencia
de RAM y o os indicado es en e di e en es es udios se aplicó el es exac o de Fishe
de dos colas pa a de e mina el g ado de asociación es adís ica en e las a iables,
conside ándose como signi ica i os alo es in e io es a 0,05 (P < 0,05).
Pablo Gallego A ias
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4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El es udio de las RAM, an o en la ca ne como en las heces de Sus sc o a, no ha
sido analizado en p o undidad has a el momen o. Y es que, pese a que el núme o de
publicaciones sob e el ema ha aumen ado no ablemen e en los úl imos años, es as se han
cen ado más en E. coli que en K. pneumoniae (To es e al., 2020). En el LREC-USC,
no obs an e, se ha lle ado a cabo, pa alelamen e a es e abajo, o o es udio sob e “El
jabalí como cen inela en la pe spec i a de una salud única (One Heal h)”, cen ado en el
análisis de la mic obio a en heces de jabalíes p oceden es de la misma zona de As u ias,
po lo que se es ablece án compa aciones en e ambos en la discusión de los esul ados.
4.1. Recupe ación e iden i icación de En e obac e iaceae
4.1.1. Recupe ación de En e obac e iaceae
En p ime luga , se lle ó a cabo una iden i icación eno ípica basada en la
mo ología de las colonias que c ecie on en los medios de cul i o, que pe mi en además
el aislamien o de los mic oo ganismos desde las mues as en iquecidas en el caldo
MacConkey. Las colonias compa ibles con E. coli en ML p esen an, en su mayo ía, una
colo ación ojiza p opia de bac e ias lac osa posi i as. En es e es udio hubo c ecimien o
compa ible con E. coli en ML en odas las mues as analizadas.
Con espec o al medio SCAi, en 8 de las 29 ca nes se de ec ó K. pneumoniae,
siendo así la p e alencia de Klebsiella spp. del 27,6 %. La colo ación ama illa de las
colonias en es e aga (Figu a 5, dcha.) es, p esun i amen e, indica i a de es e géne o de
En e obac e iaceae causan e de in ecciones nosocomiales.
T es de las 29 ca nes p esen a on c ecimien o en el medio c omogénico
CHROMID® ESBL, de ec ándose colonias con una colo ación compa ible con E. coli
(Figu a 5 izda.). Es e hallazgo es indica i o de una p e alencia de en e obac e ias
p oduc o as de BLEE del 10,3 % sob e el o al, si bien, con elación a es e da o no hubo
di e encias es adís icamen e signi ica i as (P > 0,05) con espec o al 2,5 % que se obse ó
en el es udio de heces de jabalí (2 animales po ado es de E. coli BLEE sob e un o al de
81). En es e sen ido, algunas publicaciones mues an que ampoco exis en di e encias
signi ica i as en la p e alencia de cepas RAM en e ca nes de especies domés icas como
los ce dos y sal ajes como los jabalíes (Rega e al., 2022).
Pablo Gallego A ias
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Po el con a io, en lo que se e ie e al o o aga c omogénico, CHROMID®
CARBA, no se ob u o c ecimien o compa ible en ninguna de las placas, po lo que no se
de ec a on cepas de en e obac e ias p oduc o as de ca bapenemasas en es as ca nes.
Figu a 5. Placa CHROMID® ESBL con colonias ojas compa ibles con E. coli p oduc o as de BLEE
(izquie da) y placa con medio SCAi y colonias ama illas compa ibles con K. pneumoniae (de echa).
Seguidamen e, basándonos en écnicas de biología molecula , conc e amen e en
la PCR, se ealizó la iden i icación de las colonias p esun i as de E. coli aisladas de ML
y de CHROMID® ESBL median e la ampli icación del gen uidA, con esul ado posi i o
en odas las colonias excep o en 3. Es e ma cado , el cual codi ica pa a una be a-
glucu onidasa, se de ec a has a en un 94 % de las cepas de E. coli, po lo que es al amen e
especí ico de es a especie (Feng e al., 1991). Las 3 colonias cuya mo ología e a
compa ible con E. coli pe o que mos a on un esul ado nega i o en la PCR de uidA,
ue on some idas a una iden i icación bioquímica po medio de las gale ías API 20 E. La
especie se con i mó en 2 de ellas, aunque en una el esul ado no ue concluyen e y se
en ió al LASAPAGA pa a es ablece una de e minación p o eómica de acue do con el
sis ema MALDI-TOF, que con i mó inalmen e la especie como E. coli.
Po su pa e, las 8 colonias aisladas del medio SCAi cuya mo ología ue
compa ible con Klebsiella spp. ue on some idas a o a PCR, en es e caso del gen
kp50233, codi ican e pa a una acil ans e asa ambién especí ica de K. pneumoniae
(Bialek-Da ene e al., 2014). En es e caso, odas las colonias ue on posi i as pa a dicho
ma cado . Pa a alida an o el medio SCAi pa a la ecupe ación de es a especie, como la
especi icidad de la PCR del gen kp50233, las 8 colonias ue on ambién analizadas
median e MALDI-TOF, con i mándose la iden idad de odas ellas como K. pneumoniae.
Pablo Gallego A ias
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4.1.2. Recupe ación de cepas po encialmen e zoonósicas%
T as la ealización de PCR en los con luen es de las placas de ML pa a los genes
asociados a pa o ipos VTEC, EPEC, ExPEC y O25b, se ob u ie on esul ados posi i os
pa a los genes eae y b p en una de las 29 ca nes analizadas (3,4 %) y pa a O25b, papAH
y kpsMII en o a de ellas (3,4 %). Pa a encon a las colonias indi iduales que p esen asen
dichos genes se ealiza on PCR de colonias aisladas (has a un máximo de 10)
ecupe ándose 2 cepas, cada una de ellas con los genes mencionados, que ue on
pos e io men e analizadas pa a ilog upo y clono ipo (CH).
Los genes eae y b p (codi icado es de la in imina y el pili de unión a células,
espec i amen e) se asocian con el pa o ipo de E. coli in es inal EPEC ípico, causan e de
dia ea in an il. Es e se ca ac e iza po la adhesión a los en e oci os del in es ino delgado
po medio de es a in imina, que es un ipo de adhesina. El hecho de que ambién con enga
la imb ia ipo IV codi icada po el gen b p (bundle- o ming pilus), que con ibuye del
mismo modo a la unión a las células in es inales del hospedado (Kape , 2005), hace que
sean conside ados EPEC ípicos. Si se a a a de una cepa posi i a solo pa a eae, sin b p,
se ía una EPEC a ípica. Es as úl imas son más habi uales en mamí e os como el jabalí,
de hecho, en un es udio lle ado a cabo en la Toscana (I alia) se han encon ado en un
3,4% (Be elloni e al., 2020).
Po o a pa e, papAH ( imb ia adhesi a) y kpsM II (cápsula) son ac o es de
i ulencia asociados con pa o ipos de E. coli ex ain es inales (ExPEC), en e los cuales
se encuen an los UPEC causan es de ITU o los NMEC, esponsables de sepsis y
meningi is neona al (Johnson e al., 2003). Es os, al igual que los an e io es, a o ecen la
in asión, colonización y mul iplicación de la bac e ia en el o ganismo in ec ado. Además,
el hecho de que es a cepa ambién haya o ecido un esul ado de PCR posi i o pa a el gen
bO25b, codi ican e pa a el an ígeno O25b, hace que lo podamos asocia con el clon
pandémico ST131.
Con a iamen e, ninguna de las mues as p esen ó los ac o es de i ulencia
VT1/VT2, e o oxinas asociadas al pa o ipo VTEC, ni los genes de esis encia mc -1 a
mc -5 asociados con la esis encia a colis ina mediada po plásmidos.
Cabe des aca que en o o abajo sob e auna sil es e sí se iden i ica on y
ca ac e iza on cepas de E. coli ST131 y ExPEC en animales como zo os y jabalíes, si
bien, no se encon a on cepas EPEC (Viso González, 2017).
Pablo Gallego A ias
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4.2. De e minación geno ípica y eno ípica de RAM
Una ez iden i icadas las cepas y es ablecida la colección se p ocedió al es udio
del pe il de RAM, de o ma eno ípica y geno ípica. La impo ancia de ealiza ambas
de e minaciones eside en el hecho de que, en ocasiones, las ca ac e ís icas gené icas de
un mic oo ganismo no se co esponden con asgos obse ables debido a la in e acción
con componen es ambien ales como el pH y la empe a u a, a enómenos epigené icos
como la me ilación del ADN o a e en os mu acionales (Pie ce, 2016).
4.2.1. De e minación geno ípica de RAM
El sc eening po PCR de los genes blaBLEE (CIT, SHV, CTX-M) ealizado a las 3
colonias (10,3 % de las mues as) ecupe adas del medio c omogénico CHROMID®
ESBL, con i mó que odas ellas p esen aban el gen blaBLEE CTX-M (2 del g upo 1 y 1
del g upo 9). Pa a de e mina el ipo de CTX-M se en ió a secuencia y, po medio de las
he amien as ResFinde 4.5 y Kme Resis ance 2.2 del CGE, se ipi ica on 2 de ellas como
blaCTX-M-15 y 1 como blaCTX-M-27 (33,33 %). Median e es a he amien a bioin o má ica
podemos subi nues as secuencias o wa d y e e se en o ma o “. as a” y ipi ica el
gen bla conc e o de in e és.
Cabe des aca que an o blaCTX-M-15 como blaCTX-M-27, son genes ecuen emen e
epo ados en bac e ias implicadas en in ecciones humanas (Ca e e al., 2023). La enzima
CTX-M-15 sí se había de ec ado p e iamen e en un es udio en po cino, aunque pod ía
habe sido debido a una con aminación humana, mien as que CTX-M-27 solo se ipi icó
en ca ne de pollo (Sil a e al., 2023). Con espec o a es a úl ima enzima, sí se con i mó
su p esencia en especies sil es es como zo os, aunque no en jabalíes (Viso González,
2017). En es e sen ido, las u as de ansmisión de ambos genes debe ían de se analizadas
de un modo más exhaus i o y comple o pa a comp oba el posible o igen de los mismos.
4.2.2. De e minación eno ípica de RAM
La ealización de an ibiog amas con o me al p ocedimien o de disco-placa
(Figu a 6) se lle ó a cabo pa a 29 cepas de E. coli (pa a las 2 cepas po encialmen e
zoonósicas, pa a las 3 que po aban genes BLEE y pa a 1 cepa ep esen a i a de los 24
animales es an es) ob eniendo así un pe il de esis encia eno ípica indi idual de las 29
piezas de ca ne analizadas.
Pablo Gallego A ias
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Figu a 6. An ibiog ama ealizado median e el mé odo de di usión disco-placa en medio MH. Cada disco
indica el an ibió ico que con iene y la can idad de es e en µg (AMC: amoxicilina-ácido cla ulánico; CAZ:
ce azidima; AM: ampicilina; CXM: ce u oxima; TGC: igeciclina; ATM: az eonam).
De las 29 cepas some idas al es udio de sensibilidad, 7 p esen a on esis encia a
algún an ibió ico (24,1 %), aunque ninguna de ellas es aba en e las po encialmen e
zoonósicas EPEC y ExPEC. Más allá de es o, odas ue on sensibles a e apenem,
ce oxi ina, amikacina, colis ina, os omicina y ni o u an oína. Po el con a io,
ampicilina, doxiciclina y clo imoxazol son los an imic obianos en e a los cuales un
mayo po cen aje de cepas (> 20 %) se mos ó esis en e (Figu a 7).
Asimismo, un 20,7 % de las cepas de E. coli analizadas ue on MDR, es deci , no
p esen a on sensibilidad en e a al menos un agen e an imic obiano en es o más
ca ego ías dis in as (Magio akos e al., 2012). Se obse a on di e encias es adís icamen e
signi ica i as (P < 0,05) en e es e po cen aje y el 3,7 % de cepas MDR (3 animales sob e
un o al de 81) de ec adas en el es udio de la mic obio a ecal del jabalí lle ado a cabo en
el mismo g upo de in es igación del LREC.
En odos los an ibiog amas de cepas p oduc o as de BLEE se obse ó un halo de
sine gia (Figu a 6) o mado en e la ce azidima, el az eonam y la amoxicilina-ácido
cla ulánico. Es o se debe al e ec o inhibido de be alac amasas que eje ce el ácido
cla ulánico, dando luga a una ampliación del halo de inhibición de la ce azidima y del
az eonam en la di ección del p opio cla ulánico. Feno ípicamen e es e e ec o se obse a
con una ca ac e ís ica o ma de ce adu a o de co cho (D ieux e al., 2008).
Pablo Gallego A ias
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Po an o, el mayo núme o de esis encias obse ado en la colección es udiada es
en e a los an ibió icos de la ca ego ía D de la EMA pa a uso en e e ina ia. En es e g upo
se incluyen an ibió icos de p ime a línea como penicilinas o e aciclinas, pe o que han
de usa se con p udencia, e i ando su uso innecesa io o en a amien os la gos (EMA,
2020). De en e los pe enecien es a la ca ego ía A (uso no au o izado) des aca la
esis encia al monobac ámico az eonam (13,8 %).
Figu a 7. Po cen aje de las cepas analizadas que se mos a on esis en es a cada an ibió ico con o me a los
c i e ios del EUCAST-2024 (ATM: Az eonam; AMC: Amoxicilina-Ácido cla ulánico; CAZ: Ce azidima;
AMP: Ampicilina; CXM: Ce u oxima; TGC: Tigeciclina; CTX: Ce o axima; ETP: E apenem; FOX:
Ce oxi ina; AMK: Amikacina; GEN: Gen amicina; TOB: Tob amicina; CST: Colis ina; DOX: Doxiciclina;
FOF: Fos omicina; CHL: Clo an enicol; NIT: Ni o u an oína; CIP: Cip o loxacina; SXT: Clo imoxazol;
NAL: Ácido nalidíxico).
4.3. Ca ac e ización.de.aislamien os.
En is a de los esul ados, se conside an como cepas po encialmen e zoonósicas
y/o de iesgo po encial pa a los humanos, las de ec adas en 5 de las 29 mues as (17,2 %):
la ExPEC, la EPEC ípica y las 3 p oduc o as de BLEE.
Un pa ógeno zoonósico es aquel capaz de pasa de animales a humanos
p oduciendo una en e medad, po lo que odas ellas encaja ían den o de es a de inición.
Las ExPEC pueden causa sep icemia e ITU, las EPEC dan luga a dia ea in an il y las
BLEE pod ían pasa sus genes de esis encia a bac e ias de la mic obio a no mal, en caso
de que es os es u ie an codi icados en plásmidos, o incluso ija se en la p opia
mic obio a.
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
ATM
AMC
CAZ
AMP
CXM
TGC
CTX
ETP
FOX
AMK
GEN
TOB
CST
DOX
FOF
CHL
NIT
CIP
SXT
NAL
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Pa a con i ma es e ipo de cues iones hab ía que ealiza una ca ac e ización
genómica más en p o undidad, ya que en el p esen e abajo solo se han de e minado el
GF y el CH de esas cepas (Tabla 5).
En cuan o a las dos cepas ExPEC y EPEC, ambas pe enecen al ilog upo B2, el
cual se asocia mayo i a iamen e con in ecciones ex ain es inales (Cle mon e al., 2013).
G acias a los ecu sos FimType 1.0 y CHType 1.0 del CGE se ha podido es ablece
ambién el clono ipo in silico una ez secuenciados los genes imH y umC. En es e caso,
o ecen combinaciones CH 67-57 (EPEC) y CH 40-22 (ExPEC). Es e úl imo clono ipo
se co esponde con el complejo clonal ST131, y se había ipi icado p e iamen e en el
LREC en mamí e os sil es es como los jabalíes, pe o ambién en a es como las palomas
(Viso González, 2017).
Con espec o a las es cepas p oduc o as de BLEE, odas ellas o ecen una
combinación CH 11-54, la cual pod ía es a ci culando bidi eccionalmen e en e se es
humanos y animales, ya que se ha de ec ado an o en animales sil es es y a es como en
humanos (Viso González, 2017). Asimismo, son pe enecien es al ilog upo A (Cle mon
e al., 2013, 2019), asociado con el pa o ipo InPEC. Además, como se comen ó
an e io men e, los ipos de enzimas BLEE de e minadas, se han iden i icado en cepas
causan es de in ecciones humanas (Ca e e al., 2023).
En las 29 mues as de ca ne analizadas en el p esen e abajo no se han
ca ac e izado pa o ipos híb idos, pese a que en algunos es udios sí se han encon ado un
ipo de clones híb idos VTEC-ETEC al amen e i ulen os en aislados de jabalíes (Pe a
e al., 2022).
Código cepa
Genes de i ulencia
BLEE
GF
CH
CJ3c
kpsM II papAH O25b
B2
40-22
CJ13c
blaCTX-M-27
A
11-54
CJ17b
blaCTX-M-15
A
11-54
CJ21d
blaCTX-M-15
A
11-54
CJ26c
eae b p
B2
67-57
Tabla 5. Ca ac e ización de las cepas EPEC, O25b y BLEE (CJ: Ca ne de jabalí; BLEE: Be alac amasa
de espec o ex endido; GF: G upo ilogené ico; CH: Clono ipo).
Pablo Gallego A ias
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