Seguridad alimentaria: monitorización integrada de antibiorresistencias (RAM)

FACULTAD DE CIENCIAS GRADO EN BIOQUÍMICA D. Pablo Gallego Arias SEGURIDAD)ALIMENTARIA:)MONITORIZACIÓN) INTEGRADA)DE)ANTIBIORRESISTENCIAS)(RAM) Trabajo Fin de Grado Junio 2024 Pablo Gallego Arias 2 Licencia Excepto donde se haga constar explícitamente, esta obra pertenece a Pablo Gallego Arias y está bajo una licencia de “Creative Commons Reconocimiento 4.0 Internacional”. Financiación La parte experimental del presente Trabajo de Fin de Grado ha sido realizada en el marco del proyecto de I+D+i/PID2022-143041OB-100, financiado por MICIU/AEI/10.13039/501100011033/ y por FEDER Una manera de hacer Europa; junto con la ayuda ED431C 2021/11 de la Consellería de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria (Xunta de Galicia) y FEDER. El autor, Pablo Gallego Arias, agradece al Campus Terra su Ayuda de Iniciación a la Investigación 2023-2024 convocada por la “Resolución reitoral 01 de febreiro 2024, da Universidade de Santiago de Compostela, pola que se establecen as bases reguladoras e se convocan bolsas para a iniciación á investigación no marco do Convenio de Colaboración entre a USC e a Consellería de Cultura, Educación, Formación Profesional e Universidades polo que se regula o Campus de Especialización Campus Terra”. Pablo Gallego Arias 3 ÍNDICE RESUMEN ...................................................................................................................... 5 RESUMO ......................................................................................................................... 6 ABSTRACT .................................................................................................................... 7 RESUMEN GRÁFICO .................................................................................................. 8 ÍNDICE DE ABREVIATURAS ..................................................................................... 9 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 11 1.1. La resistencia a los antimicrobianos (RAM) ............................................... 11 1.1.1. Principales familias de antibióticos y mecanismos de resistencia .......... 13 1.1.1.1. Categorización de antimicrobianos .................................................... 14 1.1.1.2. Betalactamasas ................................................................................... 15 1.2. Papel de los alimentos en la transmisión de RAM ..................................... 16 1.2.1. Controles en carne de caza ..................................................................... 17 1.3. Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae .................................................... 18 1.3.1. E. coli ...................................................................................................... 18 1.3.2. K. pneumoniae ........................................................................................ 20 2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 22 3. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................. 23 3.1. Procesado de las carnes ................................................................................ 23 3.1.1. Recuento de E. coli ................................................................................. 23 3.1.2. Pre-enriquecimiento y enriquecimiento .................................................. 23 3.2. Aislamiento e identificación de enterobacterias ........................................ 24 3.2.1. Medio ML ............................................................................................... 24 3.2.2. Medio SCAi ............................................................................................ 25 3.2.3. Medio ESBL ........................................................................................... 25 3.2.4. Medio CARBA ....................................................................................... 26 3.2.5. Galerías multipruebas API® 20 ETM ....................................................... 26 Pablo Gallego Arias 4 3.2.6. Espectrometría de masas MALDI-TOF ................................................. 27 3.3. Caracterización fenotípica de RAM ........................................................... 28 3.3.1. Preparación del inóculo .......................................................................... 28 3.3.2. Inoculación de las placas ........................................................................ 28 3.3.3. Dispensación de los discos ..................................................................... 28 3.3.4. Lectura e interpretación de resultados .................................................... 29 3.4. Caracterización genotípica de las cepas y RAM ........................................ 30 3.4.1. PCR convencional .................................................................................. 30 3.4.1.1. Extracción del ADN ............................................................................ 30 3.4.1.2. Mezcla de reacción ............................................................................. 31 3.4.1.3. Amplificación del ADN ....................................................................... 31 3.4.1.4. Revelado de los resultados ................................................................. 31 3.5. Análisis estadístico de los datos ................................................................... 34 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................... 35 4.1. Recuperación e identificación de Enterobacteriaceae ............................... 35 4.1.1. Recuperación de Enterobacteriaceae ...................................................... 35 4.1.2. Recuperación de cepas potencialmente zoonósicas ................................ 37 4.2. Determinación genotípica y fenotípica de RAM ........................................ 38 4.2.1. Determinación genotípica de RAM ........................................................ 38 4.2.2. Determinación fenotípica de RAM ......................................................... 38 4.3. Caracterización de aislamientos .................................................................. 40 4.4. Valoración del riesgo microbiológico del consumidor ............................... 42 5. CONCLUSIONES ................................................................................................ 43 6. ANEXOS ................................................................................................................ 44 6.1. Compilación general de primers ...................................................................... 44 7. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 48 Pablo Gallego Arias 5 RESUMEN Seguridad alimentaria: monitorización integrada de antibiorresistencias (RAM) En un mundo en el cual la revolución de la inteligencia artificial parece que va a cambiarlo todo, la pandemia silenciosa de la resistencia a los antimicrobianos constituye, junto con el cambio climático, una de las mayores amenazas para la humanidad. De hecho, los retos de la lucha contra el calentamiento global y la RAM están estrechamente ligados. Por eso, la Organización Mundial de la Salud (OMS) establece que prioridades como estas o la seguridad alimentaria deben ser abordadas bajo un enfoque One Health para mantener el equilibrio de los ecosistemas. Esta perspectiva se basa en que la salud humana, animal y ambiental están totalmente interrelacionadas. Los animales son reservorios de microorganismos zoonósicos y/o resistentes a los antimicrobianos, y los alimentos actúan como vehículos transmisores de los mismos.!En este sentido, el jabalí (Sus scrofa) es una especie centinela ideal debido a su creciente abundancia, distribución y relevancia epidemiológica, por su cercanía a medios urbanos y rurales. Además, constituye una fuente de carne de caza, un hábito gastronómico cada vez más popular, cuya calidad microbiológica, en base a los resultados del presente trabajo, fue insatisfactoria en el 20 % de los alimentos. En este estudio se analizaron 29 muestras de carne de jabalí. Dos de ellas (6,9 %) resultaron portadoras de sendos patotipos de Escherichia coli potencialmente patógenos, EPEC y ExPEC, apuntando a un posible origen humano en la manipulación. Además, un 27,6 % fueron positivas para la recuperación de Klebsiella pneumoniae. El estudio de resistencia mediante PCR y el método de difusión disco-placa también determinó que un 20,7 % de los alimentos portaban E. coli multirresistentes (MDR) y que el 10,3 % eran positivos para E. coli productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEE). En conclusión, la carne de jabalí puede ser fuente de enterobacterias de riesgo para el consumidor, como E. coli productoras de BLEE y K. pneumoniae. Así pues, deberían incluirse las carnes de caza en los programas de control de bacterias resistentes, informando sobre su correcta manipulación para garantizar la seguridad alimentaria. Palabras clave: Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Una Sola Salud, Sus scrofa, caza, seguridad alimentaria, RAM, BLEE, EPEC. Pablo Gallego Arias 6 RESUMO Seguridade alimentaria: monitorización integrada de antibiorresistencias (RAM) Nun mundo no cal a revolución da intelixencia artificial parece que vai mudalo todo, a pandemia silenciosa da resistencia aos antimicrobianos constitúe, xunto co cambio climático, unha das maiores ameazas para a humanidade. De feito, os retos da loita contra o quecemento global e a RAM están estreitamente vencellados. Por iso, a Organización Mundial da Saúde (OMS) establece que prioridades como estas ou a seguridade alimentaria deben ser abordadas baixo un enfoque One Health para manter o equilibrio dos ecosistemas. Esta perspectiva baséase en que a saúde humana, animal e ambiental están totalmente interrelacionadas. Os animais son reservorios de microorganismos zoonósicos e/ou resistentes aos antimicrobianos, e os alimentos actúan como vehículos transmisores dos mesmos. Neste sentido, o xabaril (Sus scrofa) é unha especie sentinela ideal debido á súa crecente abundancia, distribución e relevancia epidemiolóxica, pola súa proximidade a medios urbanos e rurais. Ademais, constitúe unha fonte de carne de caza, un hábito gastronómico cada vez máis popular, cuxa calidade microbiolóxica, en base aos resultados do presente traballo, foi insatisfactoria no 20 % dos alimentos. Neste estudo analizáronse 29 mostras de carne de xabaril. Dúas delas (6,9 %) resultaron portadoras de senllos patotipos de Escherichia coli potencialmente patóxenos, EPEC e ExPEC, apuntando a unha posible orixe humana na manipulación. Ademais, un 27,6 % foron positivas para a recuperación de Klebsiella pneumoniae. O estudo de resistencia mediante PCR e o método de difusión disco-placa tamén determinou que un 20,7 % dos alimentos portaban E. coli multirresistentes (MDR), e que o 10,3 % eran positivos para E. coli produtoras de betalactamasas de espectro estendido (BLEE). En conclusión, a carne de xabaril pode ser fonte de enterobacterias de risco para o consumidor, como E. coli produtoras de BLEE e K. pneumoniae. Así pois, deberían incluírse as carnes de caza nos programas de control de bacterias resistentes, informando sobre a súa correcta manipulación para garantir a seguridade alimentaria. Palabras clave: Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Unha Soa Saúde, Sus scrofa, caza, seguridade alimentaria, RAM, BLEE, EPEC. Pablo Gallego Arias 7 ABSTRACT Food safety: integrated monitoring of antimicrobial resistance (AMR) In a world where the artificial intelligence revolution looks set to change everything, the silent pandemic of antimicrobial resistance is, along with climate change, one of the greatest threats to humanity. In fact, the challenges of combating global warming and AMR are closely linked. This is why the World Health Organisation (WHO) states that priorities such as these or food security must be addressed under a One Health approach to maintain the ecosystems balance. This perspective is based on the fact that human, animal and environmental health are totally interrelated. Animals are reservoirs of zoonotic and/or antimicrobial resistant microorganisms, and food acts as a vehicle for their transmission. In this respect, wild boar (Sus scrofa) is an ideal sentinel species due to its increasing abundance, distribution and epidemiological relevance, because of its proximity to urban and rural environments. Moreover, it is a source of game meat, an increasingly popular gastronomic habit, whose microbiological quality, based on the results of the present work, was unsatisfactory in 20 % of the foodstuffs. In this study, 29 samples of wild boar meat were analysed. Two of them (6,9 %) were found to carry both potentially pathogenic Escherichia coli pathotypes, EPEC and ExPEC, pointing to a possible human origin in the handling. In addition, 27,6 % were positive for Klebsiella pneumoniae recovery. The resistance study by PCR and the discplate diffusion method also determined that 20,7 % of the food carried multidrug-resistant (MDR) E. coli, and that 10,3 % were positive for extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing E. coli. In conclusion, wild boar meat may be a source of dangerous enterobacteria for the consumer, such as ESBL-producing E. coli and K. pneumoniae. Therefore, game meats should be included in control programmes for resistant bacteria and information on proper handling should be provided to ensure food safety. Keywords: Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, One Health, Sus scrofa, hunting, food safety, AMR, ESBL, EPEC. Pablo Gallego Arias 8 RESUMEN GRÁFICO Figura 1. Resumen gráfico de “Seguridad alimentaria: monitorización integrada de antibiorresistencias (RAM)” (Creado con BioRender.com). Pablo Gallego Arias 9 ÍNDICE DE ABREVIATURAS ADN: Ácido desoxirribonucleico AEMPS: Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios APT: Agua de peptona tamponada BHE: Barrera hematoencefálica BLEE: Betalactamasa de Espectro Extendido CCAA: Comunidades Autónomas CDC (Centers for Disease Control and Prevention): Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades CGE (Center for Genomic Epidemiology): Centro de Epidemiología Genómica CH: Clonotipado CLSI (Clinical & Laboratory Standards Institute): Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio CMI: Concentración mínima inhibitoria ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control): Centro Europeo para la Prevención y el Control de Enfermedades EFSA (European Food Safety Agency): Agencia Europea de Seguridad Alimentaria EMA (European Medicines Agency): Agencia Europea del Medicamento ESCMID (European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases): Sociedad Europea de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing): Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations): Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura GF: Grupo filogenético IA: inteligencia artificial IREC: Instituto de Investigación en Recursos Cinegéticos Pablo Gallego Arias 16 antimicrobiano. La mayoría de las betalactamasas son de naturaleza plasmídica, aunque hay microorganismos que producen betalactamasas cromosómicas (Cantón et al., 2002). Por su parte, las AmpC o cefalosporinasas, son serina-betalactamasas. No son inhibidas por los inhibidores clásicos de betalactamasas y actúan sobre penicilinas, y cefalosporinas de primera, segunda y tercera generación. No responden, sin embargo, ante cefalosporinas de cuarta generación ni carbapenemes. En cuanto a las carbapenemasas, estas son enzimas muy versátiles que hidrolizan, además de a los carbapenémicos, a prácticamente todos los betalactámicos. Cabe destacar que los carbapenemes son considerados antibióticos de última línea terapéutica, utilizados para tratar infecciones insensibles frente a otros antibióticos, por lo que la vigilancia de cepas de enterobacterias productoras de estas enzimas es fundamental (Del Valle Martínez Rojas, 2009). Figura 2. Modo de acción de las betalactamasas (Licencia Creative Commons). 1.2. Papel de los alimentos en la transmisión de RAM Las enfermedades zoonósicas son aquellas causadas por infecciones que se propagan entre animales y humanos. Algunas se transmiten a través alimentos y/o agua contaminados con bacterias, virus o parásitos que colonizan el tracto gastrointestinal pudiendo desencadenar graves patologías. (EFSA, 2023). Muchos de estos microorganismos forman parte de la microbiota intestinal de animales destinados al consumo humano, pero también pueden ser el resultado de contaminaciones producidas en distintos puntos de la cadena alimentaria (en las granjas, durante el transporte, el procesado, la preparación…), o propagados a través del medio ambiente debido a una contaminación fecal del agua, los piensos o los fertilizantes (Koutsoumanis et al., 2021). No obstante, el peligro no está solamente ocasionado por bacterias patógenas y/o multirresistentes causantes de infecciones alimentarias, sino también por la posibilidad Pablo Gallego Arias 17 de que éstas transfieran genes de resistencia a las bacterias comensales de la microbiota del hospedador al entrar en contacto con ellas (CDC, 2024). Pero si la RAM es una amenaza importante para la salud pública global, entender su relación con la seguridad alimentaria es fundamental para poder abordar el problema en toda su dimensión. A factores como el de la disminución en el descubrimiento de nuevos antibióticos, o el de su utilización incorrecta y excesiva, hay que añadir otros como el modelo de producción intensiva que puede favorecer la diseminación bacteriana; y los cambios en los hábitos de consumo (demanda creciente de comida rápida o precocinada), que conllevan riesgos debido a una conservación incorrecta, tiempos de cocinado inadecuados o la aparición de contaminaciones cruzadas (Díaz Jiménez, 2021). Además, el hecho de que haya un mercado global de productos agrícolas o cárnicos procedentes de zonas de menor seguridad alimentaria, favorece también la dispersión de cepas resistentes (Campos et al., 2018). 1.2.1. Controles en carne de caza Uno de los objetivos principales del enfoque One Health es el de establecer un sistema de vigilancia de RAM tanto en humanos, como en animales salvajes y de granjas, además de en el medio ambiente. Esto es especialmente relevante en el escenario actual, marcado por la creciente fragmentación de los hábitats naturales por la acción del hombre. Prácticas como la deforestación y la urbanización provocan que la fauna silvestre esté en contacto de forma cada vez más estrecha con las personas y su ganado, incrementando la probabilidad de transmisión de RAM entre unas poblaciones y otras (Torres et al., 2020). En España, la detección de RAM en carnes comercializadas en supermercados está monitorizada por el Plan Nacional de Control Oficial de la Cadena Alimentaria (PNCOCA 2021-2025), que incluye mataderos, salas de manipulación de caza y salas de tratamiento de reses de lidia (AESAN, 2022). No obstante, no ocurre lo mismo con carnes de especies cinegéticas como el corzo, el jabalí o la liebre destinadas al autoconsumo, lo cual es habitual en muchas regiones españolas. Precisamente, el jabalí (Sus scrofa), mamífero de la familia de los suidos, se postula como una centinela ideal en la monitorización de RAM, puesto que hasta el momento no se han analizado en profundidad los posibles riesgos que entraña su consumo ni su potencial en la transmisión de RAM. Del mismo modo, el hecho de que se trate de una especie silvestre en creciente expansión en toda Europa, que se mueve entre entornos Pablo Gallego Arias 18 urbanos y rurales, y que no debería estar sometida a tratamiento con antibióticos, la convierte en el vínculo perfecto entre los tres compartimentos que encierra One Health: el medio ambiente, los humanos y los animales (Torres et al., 2020). Buena prueba de esto es el hecho de que algunas publicaciones muestran que apenas existen diferencias en la prevalencia de cepas RAM entre carnes de especies domésticas y salvajes como cerdos y jabalíes (Rega et al., 2022). Como se indica en el párrafo anterior, las poblaciones de este mamífero están aumentando en todo el continente, siendo este incremento especialmente notable en España, donde ya hay más de un millón, cifra que podría duplicarse en 2025 según los expertos. Buena prueba de esto es la reciente declaración de la emergencia cinegética en 248 ayuntamientos gallegos por parte de la Xunta de Galicia para la temporada 2023/2024, estableciendo la caza sin límites del jabalí con el objetivo de evitar daños en los cultivos, accidentes de tráfico o la transmisión de enfermedades como la peste porcina africana, que son algunos de los principales perjuicios que causa su sobrepoblación (Resolución de 6 de septiembre de 2023, de la Jefatura Territorial de Lugo, por la que se declara la emergencia cinegética temporal por los daños ocasionados por el jabalí en las comarcas de Os Ancares, Chantada, Lugo, A Mariña Central, A Mariña Occidental, A Mariña Oriental, Sarria, Terra Chá y Terra de Lemos). 1.3. Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae Tanto E. coli como K. pneumoniae son especies de bacterias Gram-negativas y anaerobias facultativas con forma de bacilo, pertenecientes a la familia de las enterobacterias. Ambas se pueden encontrar en la microbiota del tracto gastrointestinal de organismos sanos. No obstante, en ocasiones se pueden producir alteraciones y desequilibrios conocidos como disbiosis, así como infecciones en otras zonas del cuerpo. Muchas de ellas son difíciles de tratar por la elevada cantidad de RAM, tanto intrínsecas como adquiridas, que podemos encontrar en estas especies. 1.3.1. E. coli E. coli fue descrita por primera vez en 1885 por el pediatra alemán Theodor Von Escherich, a quien debe su nombre. Sus células pueden ser mótiles o no, dependiendo de la producción de flagelos. El hecho de que se encuentre en el tracto gastrointestinal de vertebrados, donde interviene en la síntesis de vitamina K o en la activación del sistema inmune, hace que su presencia en aguas o alimentos se utilice como un indicativo de Pablo Gallego Arias 19 contaminación fecal. La clasificación de las cepas de E. coli se ha realizado clásicamente en función de serogrupos basados en el antígeno O (lipopolisacárido, LPS) y/o serotipos definidos por una misma combinación del antígeno O junto con el H (flagelo), y en ocasiones el K (cápsula) (Kaper et al., 2004). Aunque hay muchas combinaciones posibles de los antígenos O:K:H, la mayoría corresponden a cepas de E. coli inocuas e incluso beneficiosas y solo algunas se asocian con determinados tipos patógenos de E. coli, los cuales se pueden dividir en dos grandes grupos: E. coli patógeno intestinal (InPEC) y E. coli patógeno extraintestinal (ExPEC), dependiendo de si causan infecciones dentro o fuera del intestino, respectivamente. Dentro de cada uno de esos grupos de establecen diferentes patotipos (Tabla 2), es decir, grupos de E. coli asociados a un cuadro patógeno definidos por factores de virulencia específicos. Dentro de los intestinales o diarreagénicos tenemos: E. coli verotoxigénico (VTEC), E. coli enteropatogénico (EPEC), E. coli enterotoxigénico (ETEC), E. coli enteroinvasivo (EIEC), E. coli enteroagregativo (EAEC), E. coli de adherencia difusa (DAEC) y E. coli adherente-invasivo (AIEC). Con respecto a los extraintestinales, estos se dividen en E. coli uropatogénicos (UPEC), E. coli asociado con meningitis o sepsis (MNEC/SPEC) y E. coli patogénico aviar (APEC). Muchas de las cepas patógenas de E. coli han desarrollado resistencias a los antimicrobianos. Algunas, como es el caso de las pertenecientes al clon pandémico ST131, incluso son responsables de la dispersión de BLEE. Este clon fue identificado en 2008 y hoy se considera el predominante entre las infecciones hospitalarias extraintestinales multirresistentes a nivel mundial (García-Meniño et al., 2024). En cualquier caso, más allá de las variantes patogénicas de esta bacteria, su papel de comensal en el tracto gastrointestinal de la mayoría de los vertebrados de sangre caliente, muchos de los cuales están destinados a la producción, la convierte en un muy buen indicador para la vigilancia de RAM, asociado además al ámbito de la seguridad alimentaria. De esta forma, al permitir monitorizar los genes de resistencia existentes, los cuales pueden ser transferidos a bacterias patógenas, se puede establecer un sistema de detección fundamental para la salud pública y para la salud animal (EFSA, 2014). Pablo Gallego Arias 20 Grupo Patotipo Características Enfermedad InPEC VTEC Producción de la citotoxina conocida como shigatoxina o verotoxina Síndrome urémico hemolítico (SUH) y colitis hemorrágica EPEC Lesiones de adherencia y borrado de microvellosidades en células del epitelio intestinal Diarrea infantil ETEC Producción de enterotoxinas lábiles o estables al calor Diarrea del viajero EIEC Cepas con capacidad de invasión de las células intestinales Diarrea acuosa y disentería EAEC Formación de biofilm y adhesión agregativa en enterocitos Diarrea persistente en niños y adultos DAEC Adhesión difusa con formación de proyecciones celulares alrededor de la bacteria Diarrea aguda y persistente en niños AIEC Adhesión e invasión de células del epitelio intestinal Asociación con enfermedad de Crohn ExPEC UPEC Colonización del epitelio de la vejiga desde áreas periuretrales Infecciones del tracto urinario (ITU) APEC Sintomatología respiratoria en aves salvajes y domésticas. Potencial zoonósico en humanos Colibacilosis aviar MNEC / SPEC Propagación a través de la sangre hasta el SNC cruzando la BHE Meningitis neonatal y sepsis Tabla 2. Patotipos de E. coli. Adaptada de (Kaper et al., 2004) (SNC: Sistema nervioso central; BHE: barrera hematoencefálica). 1.3.2. K. pneumoniae K. pneumoniae fue nombrada así en honor al microbiólogo alemán del siglo XIX Edwin Klebs. En humanos está presente de forma natural en el tracto gastrointestinal o en la nasofaringe, pero también puede detectarse en el medio ambiente, en agua o en suelos (Tártara, 2013). Por otro lado, es uno de los patógenos oportunistas más habituales en el ámbito hospitalario, y es causante de infecciones nosocomiales y comunitarias tales como neumonías, septicemias, infecciones del tracto urinario (ITU) o infecciones quirúrgicas Pablo Gallego Arias 21 que representan un problema creciente en todo el mundo, especialmente en los países asiáticos (Rodrigues et al., 2022). Además, en relación con la creciente preocupación por la RAM, cabe destacar que esta especie puede estar también presente en los alimentos. Y es que hay estudios recientes que muestran que carnes de pollo, pavo o cerdo contaminadas con K. pneumoniae pueden actuar como potenciales transmisoras de bacterias portadoras de genes de resistencia, convirtiéndose en un riesgo importante para la salud pública (Riley, 2020; Silva-Bea et al., 2024) Con respecto, por ejemplo, a la producción de BLEE, esta es una de las principales enterobacterias productora de estas enzimas. Asimismo, la utilización incorrecta de antibióticos como los carbapenémicos ha hecho que la resistencia de K. pneumoniae a tratamientos de último recurso como este se esté generalizando a varios países. Es por eso por lo que la OMS incluye a las K. pneumoniae resistentes a cefalosporinas de tercera generación y carbapenemasas entre los patógenos de prioridad crítica para los cuales es necesario el desarrollo de nuevos antimicrobianos (WHO, 2024). A todo lo anterior hay que añadir que, si bien, tradicionalmente se habían clasificado los patotipos de K. pneumoniae en tres grupos mayoritarios -el clon multirresistente (MDR) y el clon hipervirulento (hv), además del patotipo clásico oportunista- en la actualidad han evolucionado de forma convergente hasta la emergencia de cepas que son simultáneamente resistentes a múltiples antibióticos e hipervirulentas (Dong et al., 2022). Estas variantes estarían relacionadas con un fenotipo hipermucoviscoso (HMV), caracterizado por la sobreproducción de polisacáridos de la cápsula bacteriana, que, junto con la formación de biopelículas, constituye uno de los principales factores de virulencia de Klebsiella spp. (Russo et al., 2011; Silva-Bea et al., 2024). Pablo Gallego Arias 22 2. OBJETIVOS El presente trabajo de fin de grado se ha realizado en el marco del Proyecto Nacional PID2022-143041OB-100 financiado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ y por FEDER “Una manera de hacer Europa”; titulado “Seguridad alimentaria: monitorización integrada de antibiorresistencias y dianas de intervención del medio ambiente, a la granja y a la mesa”. En él se incluye el muestreo del jabalí abatido en los programas oficiales de control, y el de la carne de caza de jabalí como centinela del flujo de RAM. La motivación general del presente estudio fue evaluar la calidad microbiológica de la carne de jabalí procedentes de la zona de la comarca de Oviedo (Asturias); así como la caracterización fenotípica y genotípica de las enterobacterias presentes y de su resistoma. Los objetivos específicos de este proyecto fueron: 1. Recuperación e identificación de Enterobacteriaceae en muestras de carne usando medios selectivos específicos y técnicas de biología molecular.! ! 2. Caracterización de aislamientos.! ! 3. Determinación genotípica y fenotípica de antibiorresistencias.! ! 4. Valoración del riesgo microbiológico del consumidor por consumo de carne de caza.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Pablo Gallego Arias 23 3. MATERIAL Y MÉTODOS 3.1. Procesado de las carnes Se analizaron un total de 29 muestras de carne de jabalí procedentes de 29 animales abatidos en el ámbito de la actividad cinegética autorizada en la comarca de Oviedo, en la temporada 2023-2024. Las muestras recogidas tras la abatida de los animales y el despiezado in situ, se conservaron congeladas a -20 ºC hasta su llegada al Laboratorio de Referencia de E. coli (LREC-USC), donde se descongelaron a temperatura de refrigeración (entre 2 y 8 ºC), 24 h antes del procesamiento. Para minimizar cualquier riesgo de contaminación se realizó el procesado en una cabina de bioseguridad previamente sometida a tratamiento germicida con luz UV durante 30 min, junto con todo el material estéril necesario. Con cada una de las muestras se repitió el mismo procedimiento. En primer lugar, se pesaron 25 g de carne cortada, en condiciones estériles, de toda la superficie de la pieza a analizar. Cuando estaba presente, se incluyó también el jugo de las carnes procedente del proceso de descongelación. Se introdujo la cantidad pesada en una bolsa de doble filtro para Stomacher®, a la que posteriormente se añadieron 225 mL de agua de peptona tamponada (APT; ApplyChem Panreac), realizando una dilución 1:10. Cada una de las bolsas fue agitada durante 1 min 30 s en el homogeneizador Stomacher®. 3.1.1. Recuento de E. coli Inmediatamente después de la dilución 1:10 en APT, se inoculó 1 mL de homogeneizado en una placa 3M PetrifilmTM. Los Petrifilm contienen nutrientes de Bilis Rojo-Violeta, un indicador de actividad de la glucuronidasa y otro indicador que facilita la enumeración de las colonias. El 97 % de los E. coli producen beta-glucuronidasa, la cual produce un precipitado azul asociado con cada colonia. La lectura de los Petrifilm y el recuento de E. coli para establecer la calidad microbiológica de las carnes se realizaron tras 24 h de incubación a 44 ºC en condiciones de humedad. 3.1.2. Pre-enriquecimiento y enriquecimiento Tras el pre-enriquecimiento de las muestras de APT durante 6 h a 37 ºC, se inoculó 1 mL de cada una de ellas en tubos de vidrio con 9 mL de Caldo MacConkey (Oxoid). Pablo Gallego Arias 24 Estos permanecieron a 37 ºC durante un mínimo de 18 h, completando así el enriquecimiento. 3.2. Aislamiento e identificación de enterobacterias Para el aislamiento de Enterobacteriaceae de las muestras de carne se establecieron cuatro protocolos, correspondientes cada uno de ellos a un medio de cultivo distinto. En todos se utilizó la siembra por agotamiento en estría. El protocolo I utiliza medio MacConkey Lactosa (ML), el protocolo II emplea el medio citrato-inositol (SCAi), el protocolo III consiste en la utilización del CHROMID® ESBL, mientras que en el protocolo IV el medio empleado es CHROMID® CARBA SMART (Figura 3). Figura 3. Flujo de trabajo para la recuperación de enterobacterias en carne de jabalí (APT: Agua de peptona tamponada; ML: MacConkey Lactosa; RAM: Resistencia antimicrobiana; TSA: Agar triptona de soja). 3.2.1. Medio ML El agar ML (Oxoid) es un medio utilizado para el aislamiento de Enterobacteriaceae y otros bacilos Gram-negativos. Se trata de un medio selectivo ya que inhibe el crecimiento de bacterias Gram-positivas gracias a su composición de sales biliares y cristal violeta. Además, es un medio de cultivo diferencial, al permitir establecer una distinción entre microorganismos fermentadores de lactosa, lactosa positivos; y no fermentadores de lactosa, lactosa negativos. Todo ello se produce gracias a un indicador de pH rojo neutro, que se vuelve rosa ante descensos de pH provocados por los metabolitos ácidos producidos por las bacterias que fermentan este azúcar. Aquellas bacterias que no fermentan la lactosa, por el contrario, se vuelven incoloras al utilizar Pablo Gallego Arias 25 peptona en su lugar, formando amoníaco y aumentando así el pH del medio, que pasa a adquirir una coloración amarillenta. Tras incubación a 37 ºC durante 18-24 h, la morfología típica de los E. coli que crecen en este medio es la de colonias redondeadas de color rosa o rojo que pueden presentar un halo de precipitación de bilis alrededor. K. pneumoniae, por su parte, se caracteriza por crecer en forma de colonias grandes con un aspecto mucoide de color rojo o rosa (Condalab, 2022). 3.2.2. Medio SCAi El agar citrato de Simmons con mio-inositol al 1% (SCAi; Oxoid) es un medio selectivo y diferencial que se utiliza de forma específica para el aislamiento de cepas de K. pneumoniae procedentes de alimentos. A diferencia de otros medios, en SCAi el tiempo de incubación adecuado para discriminar correctamente las colonias es de 48 h a 44 ºC de temperatura. Sin embargo, en ocasiones ya durante las primeras 24 h se pueden observar colonias típicas de Klebsiella spp., amarillas, mucoides y con forma de cúpula, debido a que fermentan el inositol y producen metabolitos ácidos que reducen el pH y hacen que el indicador vire de azul a amarillo. E. coli, por su parte, no utiliza el inositol y forma colonias blancas. Existe un pequeño porcentaje de K. pneumoniae que pueden verse azules debido a que no metabolizan el inositol, pero sí el citrato. Además, también es posible que si hay muchas bacterias fermentadoras de inositol, el medio en su conjunto se torne amarillo, haciendo difícil la discriminación de cepas. En este caso sería recomendable diluir y reaislar en otra placa (Rodrigues et al., 2020; 2022). 3.2.3. Medio ESBL CHROMID® ESBL (bioMérieux) es un medio selectivo cromogénico utilizado para la detección de enterobacterias productoras de BLEE. Este agar contiene una mezcla de antibióticos como la cefpodoxima, una cefalosporina de tercera generación insensible frente a las bacterias productoras de estas enzimas. Los medios de cultivo cromogénicos como este contienen sustratos incoloros que, al ser hidrolizados por las bacterias de interés, producen una coloración característica en cada una de ellas. En este caso se incluyen dos sustratos cromogénicos y un sustrato natural que permiten la identificación directa de los microorganismos productores de BLEE más frecuentes: Pablo Gallego Arias 32 En cada pocillo se cargaron 10 µL de muestra amplificada, incluyendo los controles negativos y positivos correspondientes. Se emplearon fuentes y cubetas Bio- Rad, aplicando un voltaje de 120 V durante 25-40 min, dependiendo del tamaño del gel y del gen amplificado. Por último, se visualizaron los resultados con luz ultravioleta en un lector Gel Doc XR de Bio-Rad. De acuerdo con este procedimiento se realizaron PCR para: - Confirmación de E. coli a través de la detección del gen uidA, que codifica para una beta-glucuronidasa específica de esta especie. - Confirmación de K. pneumoniae mediante amplificación del gen kp50233, marcador específico de la especie, que codifica para una aciltransferasa. - Determinación del antígeno O25b asociado al serotipo O25b, al cual pertenece el clon pandémico ST131, por medio de la detección del gen rfbO25b. - Identificación de las verotoxinas 1 y 2 (genes stx1/stx2) asociadas al patotipo VTEC. - Identificación del gen de la intimina eae y el del pili sexual bfp, asociados al patotipo EPEC. - Detección de los genes de virulencia iutA, kpsM II y papAH codificantes para un sideróforo, una cápsula, y una subunidad de una fimbria adhesiva, respectivamente, asociados al grupo de ExPEC. - Detección mediante PCR múltiple de los genes mcr 1-5 asociados con la resistencia a colistina mediada por plásmidos. - Determinación y tipificación de los genes de resistencia blaBLEE (CIT, SHV, CTX-M), para ver el tipo de BLEE. - Establecimiento del grupo filogenético (GF) de E. coli (A, B1, B2, C, D, E, F) mediante PCR cuádruple (arpA, chuA, yjaA y TSpE.4.C2). 3.4.2. Secuenciación Sanger Los genes amplificados que fueron enviados a la Plataforma de Secuenciación y Genómica Funcional (Departamento de Genética de la Facultad de Veterinaria, Campus Terra) para secuenciación Sanger se obtuvieron realizando una PCR con un volumen final de 50 μL (49 μL de mezcla de reacción y 1 μL de ADN). En este caso se emplean 500 μL de agua MiliQ para la extracción del material genético de cada cepa, se utilizan puntas con filtro, y la mezcla de reacción se prepara de manera diferente. Se añaden por Pablo Gallego Arias 33 separado 0,2 μL de enzima MyTaqTM DNA polymerase (Bioline) y 10 μL de 5x My Taq™ Reaction Buffer (Bioline), el cual ya incluye los dNTPs y el MgCl2. No obstante, estas mezclas son incoloras por lo que, una vez finalice la PCR convencional y antes de proceder a cargar las muestras en el gel de agarosa, se deben añadir en una placa de 96 pocillos 2 μL de un tampón de carga a 5 μL de muestra amplificada para poder visualizar los fragmentos, mezclándolos bien en una de las celdillas antes de cargar los 7 μL en el gel. Una vez que se comprueba que las muestras y el control negativo se visualizan correctamente (Figura 4), estas son enviadas a la Plataforma de Secuenciación y Genómica Funcional, donde se realizará una secuenciación Sanger. Este procedimiento consiste en la adición de didesoxinucleótidos (ddNTPs) terminadores de la cadena de ADN que está siendo replicada por la polimerasa, de un modo semejante a lo que ocurre en la PCR. Cada ddNTP está marcado con un pigmento diferente en función de la base nitrogenada que contenga, y esta es detectada gracias a un láser que ilumina los fragmentos obtenidos al pasar a través del gel en una electroforesis capilar, dando como resultado un cromatograma con los picos de la secuencia de ADN completa (Crossley et al., 2020). Siguiendo este procedimiento se secuenciaron en la Plataforma de Secuenciación y Genómica Funcional los genes blaCTX-M (realizando una PCR previa de discriminación entre grupo 1 y grupo 9) y los genes fimH y fumC para determinación del clonotipo (CH). A las secuencias proporcionadas se les realizó un análisis in silico en el Center for Genomic Epidemiology (CGE) utilizando las herramientas ResFinder 4.5, KmerResistance 2.2, FimTyper 1.0 y CHTyper 1.0 (http://www.genomicepidemiology.org/services/). Figura 4. Gel de electroforesis para PCR previa a secuenciación de los genes fimH, izquierda, y fumC, derecha (Pb: Pares de bases). Pablo Gallego Arias 34 3.5. Análisis estadístico de los datos Para establecer una significación estadística a la hora de comparar la prevalencia de RAM y otros indicadores entre diferentes estudios se aplicó el test exacto de Fisher de dos colas para determinar el grado de asociación estadística entre las variables, considerándose como significativos valores inferiores a 0,05 (P < 0,05). Pablo Gallego Arias 35 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El estudio de las RAM, tanto en la carne como en las heces de Sus scrofa, no ha sido analizado en profundidad hasta el momento. Y es que, pese a que el número de publicaciones sobre el tema ha aumentado notablemente en los últimos años, estas se han centrado más en E. coli que en K. pneumoniae (Torres et al., 2020). En el LREC-USC, no obstante, se ha llevado a cabo, paralelamente a este trabajo, otro estudio sobre “El jabalí como centinela en la perspectiva de una salud única (One Health)”, centrado en el análisis de la microbiota en heces de jabalíes procedentes de la misma zona de Asturias, por lo que se establecerán comparaciones entre ambos en la discusión de los resultados. 4.1. Recuperación e identificación de Enterobacteriaceae 4.1.1. Recuperación de Enterobacteriaceae En primer lugar, se llevó a cabo una identificación fenotípica basada en la morfología de las colonias que crecieron en los medios de cultivo, que permiten además el aislamiento de los microorganismos desde las muestras enriquecidas en el caldo MacConkey. Las colonias compatibles con E. coli en ML presentan, en su mayoría, una coloración rojiza propia de bacterias lactosa positivas. En este estudio hubo crecimiento compatible con E. coli en ML en todas las muestras analizadas. Con respecto al medio SCAi, en 8 de las 29 carnes se detectó K. pneumoniae, siendo así la prevalencia de Klebsiella spp. del 27,6 %. La coloración amarilla de las colonias en este agar (Figura 5, dcha.) es, presuntivamente, indicativa de este género de Enterobacteriaceae causante de infecciones nosocomiales. Tres de las 29 carnes presentaron crecimiento en el medio cromogénico CHROMID® ESBL, detectándose colonias con una coloración compatible con E. coli (Figura 5 izda.). Este hallazgo es indicativo de una prevalencia de enterobacterias productoras de BLEE del 10,3 % sobre el total, si bien, con relación a este dato no hubo diferencias estadísticamente significativas (P > 0,05) con respecto al 2,5 % que se observó en el estudio de heces de jabalí (2 animales portadores de E. coli BLEE sobre un total de 81). En este sentido, algunas publicaciones muestran que tampoco existen diferencias significativas en la prevalencia de cepas RAM entre carnes de especies domésticas como los cerdos y salvajes como los jabalíes (Rega et al., 2022). Pablo Gallego Arias 36 Por el contrario, en lo que se refiere al otro agar cromogénico, CHROMID® CARBA, no se obtuvo crecimiento compatible en ninguna de las placas, por lo que no se detectaron cepas de enterobacterias productoras de carbapenemasas en estas carnes. Figura 5. Placa CHROMID® ESBL con colonias rojas compatibles con E. coli productoras de BLEE (izquierda) y placa con medio SCAi y colonias amarillas compatibles con K. pneumoniae (derecha). Seguidamente, basándonos en técnicas de biología molecular, concretamente en la PCR, se realizó la identificación de las colonias presuntivas de E. coli aisladas de ML y de CHROMID® ESBL mediante la amplificación del gen uidA, con resultado positivo en todas las colonias excepto en 3. Este marcador, el cual codifica para una betaglucuronidasa, se detecta hasta en un 94 % de las cepas de E. coli, por lo que es altamente específico de esta especie (Feng et al., 1991). Las 3 colonias cuya morfología era compatible con E. coli pero que mostraron un resultado negativo en la PCR de uidA, fueron sometidas a una identificación bioquímica por medio de las galerías API 20 E. La especie se confirmó en 2 de ellas, aunque en una el resultado no fue concluyente y se envió al LASAPAGA para establecer una determinación proteómica de acuerdo con el sistema MALDI-TOF, que confirmó finalmente la especie como E. coli. Por su parte, las 8 colonias aisladas del medio SCAi cuya morfología fue compatible con Klebsiella spp. fueron sometidas a otra PCR, en este caso del gen kp50233, codificante para una aciltransferasa también específica de K. pneumoniae (Bialek-Davenet et al., 2014). En este caso, todas las colonias fueron positivas para dicho marcador. Para validar tanto el medio SCAi para la recuperación de esta especie, como la especificidad de la PCR del gen kp50233, las 8 colonias fueron también analizadas mediante MALDI-TOF, confirmándose la identidad de todas ellas como K. pneumoniae. Pablo Gallego Arias 37 4.1.2. Recuperación de cepas potencialmente zoonósicas% Tras la realización de PCR en los confluentes de las placas de ML para los genes asociados a patotipos VTEC, EPEC, ExPEC y O25b, se obtuvieron resultados positivos para los genes eae y bfp en una de las 29 carnes analizadas (3,4 %) y para O25b, papAH y kpsMII en otra de ellas (3,4 %). Para encontrar las colonias individuales que presentasen dichos genes se realizaron PCR de colonias aisladas (hasta un máximo de 10) recuperándose 2 cepas, cada una de ellas con los genes mencionados, que fueron posteriormente analizadas para filogrupo y clonotipo (CH). Los genes eae y bfp (codificadores de la intimina y el pili de unión a células, respectivamente) se asocian con el patotipo de E. coli intestinal EPEC típico, causante de diarrea infantil. Este se caracteriza por la adhesión a los enterocitos del intestino delgado por medio de esta intimina, que es un tipo de adhesina. El hecho de que también contenga la fimbria tipo IV codificada por el gen bfp (bundle-forming pilus), que contribuye del mismo modo a la unión a las células intestinales del hospedador (Kaper, 2005), hace que sean considerados EPEC típicos. Si se tratara de una cepa positiva solo para eae, sin bfp, sería una EPEC atípica. Estas últimas son más habituales en mamíferos como el jabalí, de hecho, en un estudio llevado a cabo en la Toscana (Italia) se han encontrado en un 3,4% (Bertelloni et al., 2020). Por otra parte, papAH (fimbria adhesiva) y kpsM II (cápsula) son factores de virulencia asociados con patotipos de E. coli extraintestinales (ExPEC), entre los cuales se encuentran los UPEC causantes de ITU o los NMEC, responsables de sepsis y meningitis neonatal (Johnson et al., 2003). Estos, al igual que los anteriores, favorecen la invasión, colonización y multiplicación de la bacteria en el organismo infectado. Además, el hecho de que esta cepa también haya ofrecido un resultado de PCR positivo para el gen rfbO25b, codificante para el antígeno O25b, hace que lo podamos asociar con el clon pandémico ST131. Contrariamente, ninguna de las muestras presentó los factores de virulencia VT1/VT2, verotoxinas asociadas al patotipo VTEC, ni los genes de resistencia mcr-1 a mcr-5 asociados con la resistencia a colistina mediada por plásmidos. Cabe destacar que en otro trabajo sobre fauna silvestre sí se identificaron y caracterizaron cepas de E. coli ST131 y ExPEC en animales como zorros y jabalíes, si bien, no se encontraron cepas EPEC (Viso González, 2017). Pablo Gallego Arias 38 4.2. Determinación genotípica y fenotípica de RAM Una vez identificadas las cepas y establecida la colección se procedió al estudio del perfil de RAM, de forma fenotípica y genotípica. La importancia de realizar ambas determinaciones reside en el hecho de que, en ocasiones, las características genéticas de un microorganismo no se corresponden con rasgos observables debido a la interacción con componentes ambientales como el pH y la temperatura, a fenómenos epigenéticos como la metilación del ADN o a eventos mutacionales (Pierce, 2016). 4.2.1. Determinación genotípica de RAM El screening por PCR de los genes blaBLEE (CIT, SHV, CTX-M) realizado a las 3 colonias (10,3 % de las muestras) recuperadas del medio cromogénico CHROMID® ESBL, confirmó que todas ellas presentaban el gen blaBLEE CTX-M (2 del grupo 1 y 1 del grupo 9). Para determinar el tipo de CTX-M se envió a secuenciar y, por medio de las herramientas ResFinder 4.5 y KmerResistance 2.2 del CGE, se tipificaron 2 de ellas como blaCTX-M-15 y 1 como blaCTX-M-27 (33,33 %). Mediante esta herramienta bioinformática podemos subir nuestras secuencias forward y reverse en formato “. fasta” y tipificar el gen bla concreto de interés. Cabe destacar que tanto blaCTX-M-15 como blaCTX-M-27, son genes frecuentemente reportados en bacterias implicadas en infecciones humanas (Cave et al., 2023). La enzima CTX-M-15 sí se había detectado previamente en un estudio en porcino, aunque podría haber sido debido a una contaminación humana, mientras que CTX-M-27 solo se tipificó en carne de pollo (Silva et al., 2023). Con respecto a esta última enzima, sí se confirmó su presencia en especies silvestres como zorros, aunque no en jabalíes (Viso González, 2017). En este sentido, las rutas de transmisión de ambos genes deberían de ser analizadas de un modo más exhaustivo y completo para comprobar el posible origen de los mismos. 4.2.2. Determinación fenotípica de RAM La realización de antibiogramas conforme al procedimiento de disco-placa (Figura 6) se llevó a cabo para 29 cepas de E. coli (para las 2 cepas potencialmente zoonósicas, para las 3 que portaban genes BLEE y para 1 cepa representativa de los 24 animales restantes) obteniendo así un perfil de resistencia fenotípica individual de las 29 piezas de carne analizadas. Pablo Gallego Arias 39 Figura 6. Antibiograma realizado mediante el método de difusión disco-placa en medio MH. Cada disco indica el antibiótico que contiene y la cantidad de este en µg (AMC: amoxicilina-ácido clavulánico; CAZ: ceftazidima; AM: ampicilina; CXM: cefuroxima; TGC: tigeciclina; ATM: aztreonam). De las 29 cepas sometidas al estudio de sensibilidad, 7 presentaron resistencia a algún antibiótico (24,1 %), aunque ninguna de ellas estaba entre las potencialmente zoonósicas EPEC y ExPEC. Más allá de esto, todas fueron sensibles a ertapenem, cefoxitina, amikacina, colistina, fosfomicina y nitrofurantoína. Por el contrario, ampicilina, doxiciclina y clotrimoxazol son los antimicrobianos frente a los cuales un mayor porcentaje de cepas (> 20 %) se mostró resistente (Figura 7). Asimismo, un 20,7 % de las cepas de E. coli analizadas fueron MDR, es decir, no presentaron sensibilidad frente a al menos un agente antimicrobiano en tres o más categorías distintas (Magiorakos et al., 2012). Se observaron diferencias estadísticamente significativas (P < 0,05) entre este porcentaje y el 3,7 % de cepas MDR (3 animales sobre un total de 81) detectadas en el estudio de la microbiota fecal del jabalí llevado a cabo en el mismo grupo de investigación del LREC. En todos los antibiogramas de cepas productoras de BLEE se observó un halo de sinergia (Figura 6) formado entre la ceftazidima, el aztreonam y la amoxicilina-ácido clavulánico. Esto se debe al efecto inhibidor de betalactamasas que ejerce el ácido clavulánico, dando lugar a una ampliación del halo de inhibición de la ceftazidima y del aztreonam en la dirección del propio clavulánico. Fenotípicamente este efecto se observa con una característica forma de cerradura o de corcho (Drieux et al., 2008). Pablo Gallego Arias 40 Por tanto, el mayor número de resistencias observado en la colección estudiada es frente a los antibióticos de la categoría D de la EMA para uso en veterinaria. En este grupo se incluyen antibióticos de primera línea como penicilinas o tetraciclinas, pero que han de usarse con prudencia, evitando su uso innecesario o en tratamientos largos (EMA, 2020). De entre los pertenecientes a la categoría A (uso no autorizado) destaca la resistencia al monobactámico aztreonam (13,8 %). Figura 7. Porcentaje de las cepas analizadas que se mostraron resistentes a cada antibiótico conforme a los criterios del EUCAST-2024 (ATM: Aztreonam; AMC: Amoxicilina-Ácido clavulánico; CAZ: Ceftazidima; AMP: Ampicilina; CXM: Cefuroxima; TGC: Tigeciclina; CTX: Cefotaxima; ETP: Ertapenem; FOX: Cefoxitina; AMK: Amikacina; GEN: Gentamicina; TOB: Tobramicina; CST: Colistina; DOX: Doxiciclina; FOF: Fosfomicina; CHL: Cloranfenicol; NIT: Nitrofurantoína; CIP: Ciprofloxacina; SXT: Clotrimoxazol; NAL: Ácido nalidíxico). 4.3. Caracterización.de.aislamientos. En vista de los resultados, se consideran como cepas potencialmente zoonósicas y/o de riesgo potencial para los humanos, las detectadas en 5 de las 29 muestras (17,2 %): la ExPEC, la EPEC típica y las 3 productoras de BLEE. Un patógeno zoonósico es aquel capaz de pasar de animales a humanos produciendo una enfermedad, por lo que todas ellas encajarían dentro de esta definición. Las ExPEC pueden causar septicemia e ITU, las EPEC dan lugar a diarrea infantil y las BLEE podrían pasar sus genes de resistencia a bacterias de la microbiota normal, en caso de que estos estuvieran codificados en plásmidos, o incluso fijarse en la propia microbiota. 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% ATM AMC CAZ AMP CXM TGC CTX ETP FOX AMK GEN TOB CST DOX FOF CHL NIT CIP SXT NAL Pablo Gallego Arias 41 Para confirmar este tipo de cuestiones habría que realizar una caracterización genómica más en profundidad, ya que en el presente trabajo solo se han determinado el GF y el CH de esas cepas (Tabla 5). En cuanto a las dos cepas ExPEC y EPEC, ambas pertenecen al filogrupo B2, el cual se asocia mayoritariamente con infecciones extraintestinales (Clermont et al., 2013). Gracias a los recursos FimTyper 1.0 y CHTyper 1.0 del CGE se ha podido establecer también el clonotipo in silico una vez secuenciados los genes fimH y fumC. En este caso, ofrecen combinaciones CH 67-57 (EPEC) y CH 40-22 (ExPEC). Este último clonotipo se corresponde con el complejo clonal ST131, y se había tipificado previamente en el LREC en mamíferos silvestres como los jabalíes, pero también en aves como las palomas (Viso González, 2017). Con respecto a las tres cepas productoras de BLEE, todas ellas ofrecen una combinación CH 11-54, la cual podría estar circulando bidireccionalmente entre seres humanos y animales, ya que se ha detectado tanto en animales silvestres y aves como en humanos (Viso González, 2017). Asimismo, son pertenecientes al filogrupo A (Clermont et al., 2013, 2019), asociado con el patotipo InPEC. Además, como se comentó anteriormente, los tipos de enzimas BLEE determinadas, se han identificado en cepas causantes de infecciones humanas (Cave et al., 2023). En las 29 muestras de carne analizadas en el presente trabajo no se han caracterizado patotipos híbridos, pese a que en algunos estudios sí se han encontrado un tipo de clones híbridos VTEC-ETEC altamente virulentos en aislados de jabalíes (Perrat et al., 2022). Código cepa Genes de virulencia BLEE GF CH CJ3c kpsM II papAH O25b B2 40-22 CJ13c blaCTX-M-27 A 11-54 CJ17b blaCTX-M-15 A 11-54 CJ21d blaCTX-M-15 A 11-54 CJ26c eae bfp B2 67-57 Tabla 5. Caracterización de las cepas EPEC, O25b y BLEE (CJ: Carne de jabalí; BLEE: Betalactamasa de espectro extendido; GF: Grupo filogenético; CH: Clonotipo). Pablo Gallego Arias 48 7. BIBLIOGRAFÍA Agencia Española de Seguridad Alimentaria (AESAN). (2022). 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