Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico

Tesis doc o al
E ec os cen ales de MCH
sob e el me abolismo
pe i é ico
Mónica Imbe nón Pied a
San iago de Compos ela
-2016-
Depa amen o de Fisiología
— CIMUS —
P og ama de doc o ado en Endoc inología
Po ada y con apo ada: Co e sagi al del onco encé alo de a a; se mues a una
inmunohis oquímica de c-Fos sob e el núcleo do sal del ne io ago, as una semana de
adminis ación c ónica cen al de MCH. Mic o o og a ía ealizada po la P o eso a Rosalía
Gallego.
E ec os cen ales de MCH sob e
el me abolismo pe i é ico
Mónica Imbe nón Pied a
Depa amen o de Fisiología
— CIMUS —
P og ama de doc o ado en Endoc inología
San iago de Compos ela 2016
Tesis doc o al

D . Rubén Noguei as Pozo, P o eso Ti ula del Depa amen o de Fisiología de la
Uni e sidad de San iago de Compos ela.
D . Ca los Diéguez González, Ca ed á ico del Depa amen o de Fisiología de la
Uni e sidad de San iago de Compos ela.
Ce i ican que la esis: “E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico”
elabo ada po Mónica Imbe nón Pied a ha sido ealizada bajo su di ección en el
labo a o io de “Me abolismo Molecula ” del Cen o de In es igaciones en Medicina
Molecula y En e medades C ónicas (CIMUS) de la Uni e sidad de San iago de
Compos ela, es imando que se encuen a concluida y en condiciones de se
p esen ada pa a op a al g ado de Doc o .
Y pa a que así cons e, i man la p esen e au o ización:
Fdo. Rubén Noguei as Pozo Fdo. Ca los Diéguez González
"Cuando alguien busca, suele ocu i que sus ojos sólo en aquello que anda buscando,
y ya no log a encon a nada ni se uel e ecep i o a nada po que sólo piensa en lo que
busca, po que iene un obje i o y se halla poseído po él. Busca signi ica ene un
obje i o, pe o encon a signi ica se lib e, es a abie o, ca ece de obje i os..."
He man Hesse; Siddha a, 1975
2.8 Feno ipado me abólico ................................................................................ 85
2.9 Pe usión in aca diaca ................................................................................ 87
Técnicas expe imen ales in i o ......................................................................... 87
3.
3.1 Análisis de RNA mensaje o po PCR en iempo eal .................................... 87
3.2 Análisis de p o eína po wes e n blo .......................................................... 92
97
3.3 Análisis his ológico de ejido cen al y pe i é ico ........................................ 98
3.4 Inmunohis oquímica .................................................................................... 99
3.5 Análisis de me aboli os .............................................................................. 102
3.6 Ac i idad enzimá ica .................................................................................. 102
Análisis es adís ico ............................................................................................. 104
4.
4.1 Tes pa amé icos ....................................................................................... 104
Diseño expe imen al.......................................................................................... 106
5.
5.1 Adminis ación c ónica ICV de MCH .......................................................... 106
5.2 Adminis ación c ónica ICV de MCH en modelos de a ón modi icados
gené icamen e ....................................................................................................... 106
5.3 Adminis ación pe i é ica de MCH ............................................................. 107
5.4 Es imulación de lipólisis po isop o enol ................................................... 108
5.5 Bloqueo a macológico del ER-s ess ......................................................... 109
5.6 Bloqueo gené ico del ER-s ess hepá ico ................................................... 109
5.7 E ec o de la ago omía sob e la acción cen al de MCH ........................... 110
5.8 Sob e-exp esión génica en núcleos hipo alámicos .................................... 111
5.9 Adminis ación c ónica de MCH en núcleos hipo alámicos. ..................... 112
5.10 Silenciamien o gené ico de MCH-R1 en el hipo álamo la e al (LHA) ........ 113
5.11 Silenciamien o gené ico de KOR en el hipo álamo la e al (LHA) ............... 114
RESULTADOS ................................................................................................................. 119
MCH cen al modula el me abolismo lipídico pe i é ico .................................. 119
1.
1.1 La adminis ación cen al de MCH con ola la adiposidad
independien emen e de la inges a. ...................................................................... 119
1.2 La adminis ación cen al de MCH egula el me abolismo lipídico del ejido
adiposo blanco ...................................................................................................... 121
1.3 La adminis ación cen al de MCH egula el me abolismo lipídico del hígado
median e el ER-s ess y JNK1. ............................................................................... 123

1.4 La adminis ación cen al de MCH inc emen a la abso ción lipídica de la
die a 130
La adminis ación pe i é ica de MCH no a ec a al p og ama lipogénico de g asa
2.
e hígado ..................................................................................................................... 130
MCH cen al ealiza su e ec o pe i é ico median e el sis ema ne ioso
3.
au ónomo ................................................................................................................. 131
3.1 El sis ema ne ioso simpá ico modula los e ec os cen ales de MCH sob e el
ejido adiposo blanco ............................................................................................ 131
3.2 EL sis ema ne ioso pa asimpá ico modula los e ec os cen ales de MCH
sob e el hígado ...................................................................................................... 133
Los e ec os pe i é icos de MCH en el CNS se modulan desde el núcleo a cua o y
4.
núcleo la e al del hipo álamo ................................................................................... 135
4.1 La acción de MCH y su ecep o en el ARC, modulan el me abolismo lipídico
del ejido adiposo .................................................................................................. 135
4.2 La acción de MCH y su ecep o en el LHA, modulan el me abolismo lipídico
del hígado .............................................................................................................. 137
4.3 La inhibición gené ica del MCH-R1 en el LHA, educe la es ea ohepa i is
inducida po die a de icien e el colina-me ionina, a a és del ne io ago ........ 140
El sis ema opioide, median e el ecep o kappa, media las acciones cen ales de
5.
MCH sob e el me abolismo lipídico del hígado ........................................................ 143
5.1 El MCH-R1 y el KOR co-localizan en el LHA, y MCH induce la p oducción de
p odino ina ........................................................................................................... 143
5.2 Los a ones KO pa a KOR son esis en es a los e ec os cen ales de MCH
sob e el ER-s ess y el me abolismo lipídico del hígado ....................................... 144
5.3 El silenciamien o gené ico de KOR en el LHA p o ege en e al e ec o
adipogénico y ER-s ess hepá ico inducido po MCH median e el ANS ............... 145
5.4 La inhibición génica de KOR en el LHA, educe la es ea ohepa i is inducida
po la die a MCD .................................................................................................... 148
5.5 La sob e-exp esión de KOR en el LHA p oduce adiposidad hepá ica inducido
po la ac i ación de ER-s ess ................................................................................ 150
DISCUSIÓN .................................................................................................................... 155
CONCLUSIONES ............................................................................................................. 165
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................... 169
AGRADECIMIENTOS ...................................................................................................... 195
ACRÓNIMOS Y ABREVIATURAS
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
17
ACRÓNIMOS Y ABREVIATURAS
AAV: adeno i us adeno-asociado
ACC: ace il-CoA ca boxilasa
ACTH: ho mona ad enoco ico opa (ad enoco ico opic ho mone)
Ad: adeno i us
AGL: ácido g aso lib e
AgRP: pép ido simila a agu í (agou i ela ed p o ein)
ALT: alanina amino ans e asa
AMPK: p o eína kinasa ac i ada po AMP (5' adenosine monophospha e-ac i a ed
p o ein kinase)
ANOVA: análisis de la a ianza
ANS: sis ema ne ioso au ónomo (au onomic ne ous sys em)
AP: an e o-pos e io
ARC: a cua o
ASK1: kinasa señalizado a de apop osis 1
AST: aspa a o amino ans e asa
ATF α/β: ac o de ansc ipción ac i ado α/β (ac i a ed ansc ip ion ac o )
ATP: adenosín i os a o
BAT: ejido adiposo ma ón (b own adipose issue)
BSA: se o-albúmina bo ina
CAMKK: kinasa ac i ada po calcio calmodulina (calcium/calmodulin-dependen
p o ein kinase kinase)
CART: ansc i o elacionado a cocaína-an e amina (cocaine-amphe amine ela ed
ansc ip )
CCK: colecis oquinina

Ac ónimos y ab e ia u as
18
CHOP: p o eína homóloga C/EBP (C/EBP homologous p o ein)
ChREBP: p o eína de unión en espues a a ca bohid a os (ca bohyd a e- esponsi e
elemen -binding p o ein)
CIDEA: e ec o A induc o de mue e celula po agmen ación de DNA (cell dea h–
inducing DNA agmen a ion ac o -α-like e ec o A)
CNS: sis ema ne ioso cen al (cen al ne ous sys em)
CPT1: ca ni ina palmi oil ans e asa 1
CVO: ó gano ci cun en icula (ci cum en icula o gan)
DAB: diaminobencidino
DEPC: die ilpi oca bona o
DMH: núcleo do somedial del hipo álamo (do somedial hypo halamus)
DMV: núcleo do sal del ne io ago
DNA: ácido desoxi ibonucleico (deoxy ibonucleic acid)
DOR: ecep o opioide del a (del a opioid ecep o )
DV: do so en al
EE: gas o ene gé ico (ene gy expendi u e)
eI 2α: ac o de iniciación euca io a 2 (euka yo ic ini ia ion ac o 2)
ER: e ículo endoplasmá ico (endoplasma ic e iculum)
ER-s ess: es és del e ículo endoplasmá ico (endoplasma ic e iculum s ess)
FQ: ood quo ien
FXR: ecep o X a nesoide (Fa nesoid X ecep o )
GABA: ácido γ-aminobu í ico (Gamma-Aminobu y ic acid)
GFP: p o eína e de luo escen e (g een luo escen p o ein)
GHSR-1a: ecep o 1a de gh elina (g ow h ho mone sec e agogue ecep o )
GIP: polipép ido inhibido gás ico (gas ic inhibi o y polypep ide)
GLP-1: pép ido simila al glucagón 1 (glucagon-like pep ide-1)
GnRH: ho mona libe ado a de gonado opina (gonado opin- eleasing ho mone)
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
19
GPCR: ecep o 7 ansmemb ana asociado a p o eína G (G p o ein–coupled ecep o s)
GPR78/BIP: p o eína egulada po glucosa 78/chape ona de unión a inmunoglobulina
(G p o ein-coupled ecep o 78/binding immunoglobulin p o ein)
GTT: es de ole ancia a glucosa (glucose ole ance es )
H&E: hema oxilina y eosina
HSL: ho mona sensible a lipasa
ICV: in a-ce eb o en icula
IKK-β: inhibido de ac o nuclea kinasa β (inhibi o o nuclea ac o kappa-β kinase
subuni be a)
IL: in e leukina
IP: in ape i oneal
IR: ecep o de insulina (insulin ecep o )
IRE1α: p o eína eque ida de inosi ol 1 α (inosi ol- equi ing enzyme 1 α)
JNK: c-Jun N- e minal kinasa
KO: knock ou
KOR: ecep o opioide kappa (kappa opioid ecep o )
L: la e al
LDLR: ecep o de lipop o eína de baja densidad (low densi y lipop o ein ecep o )
LHA: hipo álamo la e al (la e al hypo halamus)
LPL: lipop o eína lipasa
LPS: endo oxina lipopolisacá ido (lipopolysaccha ides endo oxin)
LRH1: ecep o de hígado homólogo 1 (li e ecep o homolog-1)
MC3/4R: ecep o de melanoco ina 3/4 (melanoco in 3/4 ecep o )
MCD: die a de icien e en me ionina y colina (me ionin and choline de icien die )
MCH: ho mona concen ado a de melanina (melanin concen a ing ho mone)
MCH-R1/2: ecep o la de la ho mona concen ado a de melanina 1/2 (melanin
concen a ing ho mone ecep o 1/2)
Ac ónimos y ab e ia u as
20
MOR: ecep o opioide mu (mu opioid ecep o )
MTP: mic osomal iglyce ide ans e p o ein
Nac: núcleo accumbens
NAFLD: en e medad de hígado g aso no alcohólico (non alcoholic a y li e disease)
NASH: es ea ohepa i is no alcohólica (non alcoholic s ea ohepa i is)
NEFAs: ácidos g asos lib es no es e i icados (non-es e i ied a y acids)
NEI: neu opép ido E-I
NFKβ: ac o nuclea kβ (nuclea ac o kappa-ligh -chain-enhance o ac i a ed B cells)
NGE: neu opép ido G-E
NPY: neu opép ido Y
NPYR: ecep o del neu opép ido Y (NPY ecep o )
NTS: núcleo del ac o soli a io
Ob-R: ecep o de lep ina (obese ecep o )
OGTT: es o al de ole ancia a glucosa (o al glucose ole ance es )
OXR1/2: ecep o de o exina 1/2 (o exin ecep o )
OXY: oxi omodulina
PBS: ampón os a o salino (phospha e bu e saline)
PCG-1α: pe oxisome p oli e a o -ac i a ed ecep o -gamma coac i a o 1α
PCR: eacción en cadena de la polime asa (polime ase chain eac ion)
RT-PCR: eacción en cadena de la polime asa en iempo eal ( eal ime polime ase
chain eac ion)
PEPCK: os oenol pi u a o ca boxikinasa (phosphoenolpy u a e ca boxykinase)
PERK: kinasa del ac o de ansc ipción panc eá ico del e ículo endoplásmico
iniciado de la aducción euca io a (p o ein kinase R (PKR)-like endoplasmic e iculum
kinase)
PI3K: os oinosi ol 3 kinasa (phospha idylinosi ide 3-kinases)
PK: pi u a o kinasa
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
21
PKA: p o eína kinasa A
POMC: p opiomelanoco ina
PPAR-γ: ecep o del pe oxisoma-p oli e ado ac i ado gamma (pe oxisome
p oli e a o -ac i a ed ecep o gamma)
PSNS: sis ema ne ioso pa asimpá ico (pa asympa he ic ne ous sys em)
PUFAs: ácidos g asos poli-insa u ados (polyunsa u a ed a y acids)
PVH: núcleo pa a en icula (pa a en icula hypo halamus)
PYY: pép ido YY
RNA: ácido ibonucleico ( ibonuclei acid)
ROS: especies eac i as de oxígeno
RQ: asa de espi ación me abólica ( espi a o y quo ien )
SC: subcu áneo
SCARB1: sca enge ecep o class B membe 1
SCD-1: es eo il-CoA desa u asa
SDS-PAGE: elec o o esis en gel de poliac ilamida con dodecilsul a o sódico.
SF1: ac o es e oidogénico 1
shRNA: sho hai p ibonuclei acid
SNA: ac i idad ne iosa del simpá ico (sympa he ic ne ous ac i i y)
SNS: sis ema ne ioso simpá ico (sympa he ic ne ous sys em)
SOCS3: sup eso de la señalización de la ci okina 3 (supp esso o cy okine signaling 3)
SREBP1: p o eína de unión egulado a de es e ol ipo 1-c (s e ol egula o y elemen -
binding ansc ip ion ac o 1)
STAT: ansduc o de señal ac i ado de la ansc ipción (signal ansduce and
ac i a o o ansc ip ion)
TG: iglicé idos
TKO: iple knock ou
TLR-4: ecep o kinasa ipo Toll 4 ( oll like ecep o 4)
In oducción
28
1.2 Gas o ene gé ico
Como p e iamen e se ha mencionado, el gas o ene gé ico o al comp ende la
ac i idad espon ánea, el me abolismo basal y la e mogénesis que ealiza el indi iduo.
1.2.1 Ac i idad ísica
La ac i idad espon ánea o ísica aba ca en e un 8-15% del gas o ene gé ico o al en
humanos (9). Engloba an o la ac i idad ísica in olun a ia como olun a ia de cada
o ganismo, siendo es e úl imo un ac o muy a iable si además le incluimos la
ac i idad depo i a. El p incipal combus ible que se u iliza pa a la con acción
muscula es la glucosa, pues o que el músculo puede almacena la limi adamen e en
o ma de glucógeno. Sin emba go en ayuno o si el es ue zo es conside ado cuando se
ago a el glucógeno almacenado, el músculo comienza a consumi ácidos g asos
p o enien es del ejido adiposo blanco.
1.2.2 Me abolismo basal
Es la ene gía empleada pa a el sus en o básico del o ganismo en un es ado de
eposo: me abolismo celula y man enimien o isiológico de las unciones o gánicas.
Du an e un día la asa me abólica basal a ía, siendo mayo du an e el día que du an e
la noche. Du an e el día ambién se de ec an a iaciones, aumen ado as la comida
debido a un p oceso denominado acción dinámica de la comida ( e mogénesis
inducida po la die a) (2). Es e p oceso es á bajo con ol ho mona; de hecho, hace más
de un siglo que se conoce la in luencia de las ho monas i oideas en la modulación del
me abolismo basal; la des egulación del eje i oideo conlle a impo an es al e aciones
en el balance ene gé ico (10,11)
1.2.3 Te mogénesis
Si bien se pod ía conside a la e mogénesis como pa e del me abolismo basal, la
impo ancia de es e p oceso en el man enimien o de la empe a u a en o ganismos
homeo e mos, me ece un es udio
apa e po la ina egulación del
p oceso, la can idad de ene gía que se
u iliza y su in luencia sob e la a iación
del balance ene gé ico. El ejido
adiposo ma ón es el enca gado de
lle a a cabo el p oceso de disipación
de la ene gía en o ma de calo . El
desacoplamien o de la espi ación
mi ocond ial, a o ece que el g adien e
de p o ones asociado a la os o ilación
oxida i a a pase po la p o eína
Imagen 3. Uso de los combus ibles en ejido
adiposo ma ón. T as la oxidación del
combus ible, se a o ece el desacoplamien o de
la espi ación mi ocond ial, gene ando calo (12)

E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
29
desacoplan e 1 (UCP1), ans o mando la ene gía del g adien e en calo en ez de en
ATP (12) (Imagen 3). La capacidad e mogénica del ejido adiposo ma ón es
undamen al pa a la e mo egulación co po al, p oducción de calo en neona os,
mamí e os hibe nado es y p obablemen e ayuda a quema el exceso de ene gía an e
die as hipe caló icas (13).
1.3 Pa ición nu icional
Es muy impo an e conoce cómo se egula el uso de combus ibles que de i a án
en el gas o o en el almacenamien o de la ene gía. Como se ha mencionado con
an e io idad, los p incipales combus ibles son el azúca y los lípidos, que se án
u ilizados po cada ejido en di e en es es ados nu icionales con di e en es
inalidades.
Po lo an o, si la glucosa es la p ime a uen e de ene gía pa a los ejidos as una
inges a y iene un almacenamien o limi ado, sólo la g asa a a de e mina la can idad
de ene gía almacenada en el cue po; el balance ene gé ico depende á di ec amen e
de es e ac o . La g asa puede pa icipa di ec amen e en p ocesos oxida i os de
músculo, ejido adiposo ma ón, o o ma pa e del almacenamien o ene gé ico en el
ejido adiposo blanco. La nu ición pa icional es ablece la unción me abólica de la
g asa en los di e en es es ados ene gé icos de un o ganismo (14) (Imagen 4).
El hígado juega un impo an e papel en la pa ición nu icional pues o que es el
p incipal p oduc o de combus ibles. T as la inges a y en espues a a la insulina, el
hígado adquie e y almacena la glucosa en o ma de glucógeno y usa la glucosa como
combus ible median e la glucólisis. T as la glucólisis las concen aciones de ace il-CoA
aumen an y g acias a la acción de la insulina se a o ece la o mación de la ace il-CoA-
ca boxilasa (ACC) pa a p oduci malonil-CoA a pa i de ace il-CoA (15). El malonil-CoA
es la molécula p ecu so a de los ácidos g asos y señaliza la disponibilidad de
nu ien es. An e la abundancia de combus ibles, la malonil-CoA se acumula e inhibe la
ca ni ina palmi oil ans e asa 1 A (CPT1-A), impidiendo el anspo e de los ácidos
g asos a la mi ocond ia pa a su β oxidación (16). Los ácidos g asos gene ados se
empaque an en lipop o eínas de muy baja densidad (VLDL) que se án anspo ados
po la sang e has a el ejido adiposo. Po o o lado, los lípidos adqui idos de la die a se
empaque an en quilomic ones (lipop o eínas) que los aspo an hacia los ejidos
Imagen 4. La pa ición nu icional es ablece la unción de la g asa en los di e en es es ados
ene gé icos, pudiendo se almacenada u oxidada, modulando el balance ene gé ico (14).
In oducción
30
pe i é icos. En el ejido adiposo, la lipop o eína lipasa (LPL) inco po a a los adipoci os
los TG de las VLDL y quilomic ones, almacenado los lípidos en un p oceso dependien e
de insulina (2).
Conside ando que la can idad de g asa que se puede almacena en ejido adiposo
es casi ilimi ada, la glucosa sólo se puede almacena en o ma de glucógeno en
can idades ela i amen e pequeñas en el hígado y en el músculo. La consecuencia es
que en condiciones de ayuno, la glucosa se gua da á pa a los ó ganos que son
dependien es de la misma como el ce eb o. T as ago a las ese as de glucógeno, el
hígado sin e iza glucosa median e la gluconeogénesis a pa i de me aboli os
esiduales del me abolismo del músculo (lac a o y alanina) y del glice ol, p oceden e
de la lipólisis del ejido adiposo g aso. Es a lipólisis de los TG almacenados en los
adipoci os, libe a á ácidos g asos al plasma que se án adqui idos po los ejidos
pe i é icos pa a su oxidación, p incipalmen e músculo esquelé ico, co azón e hígado
(17).
inges a
ayuno
A
B
Imagen 5. Rep esen ación del me abolismo in e media io y la pa ición nu icional as la inges a
(A) y en ayuno (B) en los di e en es es ados ene gé icos. Adap ado de (2) y (17).
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
31
Regulación de la homeos asis ene gé ica
2.
La homeos asis ene gé ica equie e de una ina egulación en e consumo,
almacenamien o y gas o de ene gía. La inges a, la pa ición nu icional, el uso de los
combus ibles y el almacenamien o ene gé ico, es án con olados po ci cui os
neu oendoc inos que se localizan en di e en es á eas del sis ema ne ioso cen al
(CNS) ales como el hipo álamo o el onco ence álico. Es e modelo se basa en un
cons an e lujo de in o mación desde los ó ganos pe i é icos con ac i idad me abólica
( ac o gas oin es inal, ejido adiposo, pánc eas, hígado, e c.) hacia el CNS. A
con inuación, se gene a una espues a que se asmi i á a los ó ganos pe i é icos
implicados.
2.1 Señales del ac o gas oin es inal al CNS
Uno de los p incipales ejes pa a la
egulación de la homeos asis ene gé ica es el
ci cui o CNS- ac o gas oin es inal. Es a
comunicación se consigue po la in e acción
neu onal y ho monal en e ambos sis emas
(18,19). En cada amo del ac o, di e en es
es uc u as sec e an ho monas que i án o
di ec amen e al ce eb o pasando la ba e a
hema oence álica o ac i a án neu onas
a e en es del sis ema ne ioso au ónomo
(ANS) que ansmi e la señal al CNS y/o
di ec amen e egula an el me abolismo de los
ó ganos pe i é icos po el oco ence álico
(Imagen 6)
2.1.1 Gh elina
Se descub ió como ligando del ecep o de los sec e agogos de la ho mona de
c ecimien o (GHSR-1a) (20,21). Se a a de un pép ido de 28 aminoácidos
ca ac e izado po p esen a un g upo O-n-oc anoico en el esiduo 3 de se ina, que es
p oducido y sec e ado po las células pa ie ales del es ómago (22). Sus ni eles
ci culan es aumen an an es de la inges a, disminuyendo a alo es iniciales as la
comida en p opo ción a las calo ías inge idas (23). La exp esión y sec eción de la
gh elina a ían según el es ado ene gé ico; aumen a en ayuno, en pé dida de peso y
en la hipoglicemia inducida po la insulina (24-26). La adminis ación cen al o
pe i é ica de gh elina es imula la inges a y la adiposidad (27); po lo que se conside a a
la gh elina una señal en é ica modulado a de la homeos asis ene gé ica. La gh elina es
la única ho mona pep ídica que es imula el ape i o (o exigénica) en luga de ac ua
Imagen 6. Ho monas de i adas del ac o
gas oin es inal modulado as de la
homeos asis ene gé ica (19).
In oducción
32
como una señal de saciedad (ano exigénica) (28). En el CNS, la gh elina a a iesa la
ba e a hema oence álica en un p oceso aún sin de ini y eje ce su acción sob e su
ecep o GHRS-1A hipo alámico. Es e ecep o se exp esa p edominan emen e en las
neu onas que co-exp esan el pép ido simila a Agu í y neu opép ido Y (AgRP/NPY) en
el núcleo a cua o del hipo álamo y en neu onas del núcleo en omedial (VMH). En
es as neu onas, la gh elina ac i a una u a en la que pa icipan SIRT1/AMPK/p53 y los
ácidos g asos (29,30) que induce la exp esión de ambos AgRP y NPY, los cuales mediad
los e ec os de gh elina sob e el me abolismo lipídico (31,32). A ni el pe i é ico, el
e ec o adipogénico sob e el ejido adiposo blanco es independien e del e ec o
o exigénico de la gh elina a a és de los ecep o es de melanoco inas del
hipo álamo; ansmi iendo la señal a la g asa
a a és del sis ema ne ioso simpá ico
(Imagen 7) (33-36). Se ha desc i o que el
e ec o o exigénico de la gh elina no sólo es
modulado po las neu onas AgRP/NPY sino
que ambién se egula en el onco-encé alo a
a és de su e ec o ho monal (37) o a a és
de las señales a e en es del ne io ago
ac i adas po la sec eción de gh elina en el
es ómago (38).
2.1.2 Insulina
Ho mona sec e ada po las células be a de los islo es de Lange hans panc eá icos
en espues a a al as concen aciones de glucosa en sang e. Ac úa po medio del
ecep o de insulina i osin-kinasa (IR) ac i ando la ía PI3K/AKT en ejidos pe i é icos
como músculo esquelé ico, g asa e hígado pa a educi los ni eles de glucosa
ci culan es. La insulina es la ho mona de mayo po encial anabólico, a o eciendo la
sín esis y almacenamien o de ca bohid a os, lípidos y p o eínas (Imagen 8). A su ez,
inhibe la deg adación y libe ación de ácidos g asos y glucosa al o en e sanguíneo
inhibiendo la exp esión de enzimas que a o ece la deg adación de los combus ibles,
a o eciendo, po an o, el almacenamien o ene gé ico en los ejidos pe i é icos. (39).
Imagen 7. Sín esis y acciones de gh elina. La mayo
pa e de la gh elina ci culan e se sin e iza en el
es ómago, modulando inges a y peso co po al
median e la ac i ación de neu onas AgRP/NPY en el
núcleo a cua o del hipo álamo (36).
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
33
El descub imien o de que la insulina modula la exp esión de neu opép idos en el
hipo álamo y egula el me abolismo ene gé ico, ha pues o de mani ies o que el
ce eb o es un ó gano sensible a la insulina. A ni el cen al, la insulina eje ce una
unción egulado a del balance ene gé ico, la ep oducción y la supe i encia neu onal
(40-42). La exp esión del IR en el ce eb o es muy dispe sa con ele adas
concen aciones en el bulbo ol a o io, co eza ce eb al, hipo álamo, ce ebelo e
hipocampo (43,44). La insulina, cuya sec eción es dependien e de los ni eles de
glucosa en sang e y p opo cional a la can idad de g asa (45), a a iesa la ba e a
hema oence álica en p opo ción a las concen aciones plasmá icas en un p oceso de
anspo e sa u able mediado po un aspo ado (46-48). En el ARC, la insulina ac úa
sob e las neu onas AgRP/NPY y POMC/CART. La insulina, disminuye la p oducción y
exp esión de NPY, a o eciendo la de POMC; y po an o ac i a la u a de las
melanoco inas p oduciendo una educción de la inges a (49,50). Además del e ec o
ano exigénico, la acción hipo alámica de la insulina modula ambién el me abolismo
de la glucosa, inc emen ando la sensibilidad a la insulina en ejidos pe i é icos y
educiendo la gluconeogénesis hepá ica (51). Po úl imo, a a és del CNS, la insulina
ambién puede egula la can idad de g asa de mane a independien e a su e ec o
ano exigénico, ya que la insulina cen al disminuye la lipólisis en el ejido adiposo
blanco (42).
2.1.3 Glucagón
Ho mona sec e ada po las células al a de los islo es de Lange hans panc eá icos
de i ado del gen p e-p o-glucagón, en espues a a bajos ni eles de glucosa plasmá ica
(52). Es a ho mona con a es a la hipoglucemia y se opone a las acciones de la
Imagen 8. Regulación del me abolismo po la insulina. La insulina es imula la cap ación de glucosa,
aminoácidos y ácidos g asos en las células, y aumen a la exp esión o ac i idad de las enzimas que
ca alizan glucógeno, lípidos y la sín esis de p o eínas, mien as que inhibe la ac i idad o exp esión
de los que ca aliza la deg adación. (39)

In oducción
34
insulina median e la ac i ación de la sín esis y mo ilización de la glucosa hepá ica (53).
Sin emba go, además de su implicación en el me abolismo de la glucosa, se ha desc i o
que el glucagón ambién es á in oluc ado en la egulación del me abolismo lipídico y
gas o ene gé ico. Nume osos es udios han desc i o que el e ec o del glucagón sob e el
me abolismo lipídico se aduce en una educción de la sín esis y sec eción de
componen es implicados en el almacenamien o ene gé ico ( iglicé idos, VLDL,
coles e ol) y en una mo ilización lipídica (54,55). A ni el cen al, el ecep o de
glucagón se dis ibuye en di e sas egiones como el álamo, bulbo ol a o io e
hipo álamo (56). Se ha desc i o que la adminis ación pe i é ica de glucagón educe la
inges a pe o es e e ec o es más acusado cuando la adminis ación es cen al (57); la
acción ano exigénica del glucagón implican la ía PKA/CAMKK/AMPK en el ARC (58).
2.1.4 Ho monas in es inales
En el in es ino delgado, la diges ión y abso ción de nu ien es de i a en la
sec eción de señales in es inales de saciedad como la colecis oquinina (CCK), pép ido
YY (PYY) y como las inc e inas polipép ido inhibido gás ico (GIP), pép ido simila al
glucagón 1 (GLP-1) y la oxi omodulina (OXY) (59).
 CCK: pép ido sin e izado en el yeyuno y duodeno en espues a a la p esencia
de nu ien es. Tiene una ida media de en e 1-2 minu os, siendo su p incipal acción
educi el ape i o ac i ando a e encias del ne io ago. Tiene unciones locales como
el e aso del aciado gás ico, es imulación de la sec eción de enzimas panc eá icas y
con acción de la esícula bilia (59).
 PYY: es e pép ido se localiza a lo la go del in es ino con una mayo
concen ación en el colón y en el ec o. Aunque exis e alguna con o e sia al espec o,
la o ma 1-36 es o exigénica mien as que PYY 3-36 eje ce un e ec o ano exigénico.
Sus e ec os pos -pand iales incluyen e aso del aciado gás ico y educción de la
sec eción gás ica. Se han de ec ado acciones sob e el me abolismo de la glucosa pe o
con un componen e de dimo ismo sexual, que puede se asociado a las di e encias de
géne o sob e el eje hipo álamo-hipo isa io (60).
 GIP: es un pép ido inc e ina (ho mona que ac i a la sec eción de insulina en el
pánc eas as la adminis ación o al de glucosa) sin e izado en las células K del
duodeno y yeyuno, ac i ado po la p esencia de glucosa y g asa. No se ha desc i o que
enga un impo an e e ec o ano exigénico, pe o sí que p omue e el almacenamien o
ene gé ico, ac uando di ec amen e sob e el ejido adiposo, e inc emen ando su
adiposidad. Además, ecien emen e se ha demos ado que la asociación de GIP, GLP-1
y glucagón en una quime a gene a un po en e iagonis a con una po en e acción an i
obesidad (61).
 GLP-1: es una inc e ina de i ada del p ocesamien o pos - ansc ipcional del
gen p e-p o-glucagón en las células L del in es ino y en el CNS (62). Las acciones de
GLP-1 aba can di e sos ejidos, es imulando la sec eción de insulina en el pánc eas,
e asando el aciado gás ico e inc emen ando la p esión sanguínea en el co azón. En
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
35
el ce eb o, GLP-1 eje ce su acción me abólica en e o as zonas, en el hipo álamo,
ac uando como una ho mona de saciedad y en el me abolismo de la glucosa. La
ac i ación cen al de GLP-1 es imula la inco po ación de glucosa en el músculo y
a o ece la o mación de glucógeno en el hígado (63). Las acciones cen ales de GLP-1
ambién in oluc an al me abolismo lipídico en el ejido adiposo g aso educiendo el
almacenamien o de TG independien emen e de la inges a (64). El ejido adiposo
ma ón es á ambién egulado po los e ec os cen ales de GLP-1 inc emen ado el
p og ama e mogénico, a o eciendo ambién la ans o mación de los adipoci os del
ejido adiposo blanco a un eno ipo de adipoci o ma ón (b owning) (65,66).
 OXM: pép ido que, como GLP-1, es el esul ado del p ocesamien o pos -
ansc ipcional del gen p e-p o-glucagón que se libe a as la inges a. Eje ce su acción
median e el ecep o de GLP-1 pe o con mucha menos a inidad. OXM educe la
sec eción de ácido po el es ómago y educe inges a.
2.2 Señales del ejido adiposo blanco al CNS
El ejido adiposo no es un ó gano que solamen e acumula y libe a lípidos, es un
impo an e ó gano endoc ino que sec e a una g an a iedad de sus ancias incluyendo
ho monas es e oideas, ci oquinas y ac o es de c ecimien o, egulado es del
me abolismo lipídico, e c (67,68). Es os ac o es se denominan adipokinas, y uncionan
como pa e de un complejo conjun o
de sis emas de con ol isiológicos
que egulan el ejido local y la
isiología del o ganismo comple o
(Imagen 9). Po an o, las adipokinas
con ibuyen a la egulación de
di e sos p ocesos biológicos
incluyendo in lamación y unción
inmune, biología ascula ,
hema opoyesis, p oli e ación celula
y angiogénesis (69). En es e caso,
des acamos las adipokinas más
di ec amen e in oluc adas en la
egulación del balance ene gé ico y
el me abolismo.
2.2.1 Lep ina
El é mino lep ina p o iene del g iego (lep os: delgado). Es una ho mona sec e ada
po el ejido adiposo blanco descubie a as la ca ac e ización del e ec o de la
ausencia del gen de la lep ina y de su ecep o en a ones (ob/ob y db/db
Imagen 9. P incipales adipokinas y me aboli os
sin e izados y sec e ados po el ejido adiposo blanco
(67).
In oducción
36
espec i amen e). Es as mu aciones ecesi as del gen obeso (ob) y del gen diabe es
(db) p oducen en esos a ones obesidad y diabe es ipo 2, gene ando un sínd ome
pa ecido a la obesidad mó bida en humanos (70,71). Los a ones ob/ob y db/db ienen
idén icos eno ipos, pesando es eces más que los a ones no males, mos ando un
aumen o de has a en cinco eces del con enido de g asa co po al. Son hipe ágicos,
apenas ienen ac i idad locomo o a y son sexualmen e inac i os debido a su
hipogonadismo. La lep ina unciona den o de un sis ema de egulación a la go plazo,
modulando la can idad de alimen os consumidos en elación con la can idad de
ene gía gas ada (72). Se conside a la p incipal ho mona modulado a de ene gía,
pues o que posee una unción de e oalimen ación nega i a que man iene cons an e
la masa del ejido adiposo. La lep ina se sec e a po los adipoci os ya sea como pép ido
de 16 KDa como ligada a una o ma soluble de su ecep o (Ob-R). La can idad de
lep ina sec e ada se co elaciona posi i amen e con la can idad de masa g asa,
sugi iendo que su egulación es á ligada a un mecanismo sensible a los lípidos (73). Un
aumen o de los ni eles plasmá icos gene a un balance ene gé ico nega i o, mien as
que la educción de los ni eles de lep ina ci culan e p oduce un balance ene gé ico
posi i o (inges a > gas o ene gé ico). La lep ina llega al CNS median e el ó gano
ci cun en icula (CVO) a a esando la ba ea a hema oence álica en un p oceso
dependien e de anici os (células de la glía especializadas), que anslocan la lep ina de
la sang e al e ce en ículo, y de ahí accede a los núcleos hipo alámicos (Imagen 10)
(74,75). En el hipo álamo, la lep ina eje ce su acción sob e neu onas que exp esen su
ecep o median e una u a de señalización dependien e de STAT3 (76,77). Ya en el
ARC, la lep ina despola iza las neu onas POMC, cuya espues a ano exigénica p oduce
un descenso de la inges a y una aumen o del gas o ene gé ico (78). Po o o lado y de
o ma simul ánea, la lep ina inhibe en el núcleo a cua o a las neu onas de e ec o
o exigénico AgRP/NPY, po enciando el e ec o sacian e de la ho mona (79).
Imagen 10. Lep ina y la egulación de la masa g asa. Se sec e a po el ejido adiposo en p opo ción
a la can idad o al de masa g asa, el amaño de los adipoci os y su con enido en iglicé idos. La
lep ina ac úa p incipalmen e en el hipo álamo, p oduciendo un e ec o ano éxigénico (71).
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
37
2.2.2 Adiponec ina
Es una p o eína sec e ada y p oducida exclusi amen e po los adipoci os, siendo
una de las p o eínas plasmá icas más abundan es en el o en e sanguíneo (80). Se
conside a un ac o an i-in lama o io, p esen ando una co elación nega i a en su
concen ación plasmá ica espec o a la can idad de ejido adiposo (81). Po ello, la
p oducción de adiponec ina es inhibida po ac o es p o-in lama o ios como el ac o
de nec osis umo al al a (TNFα) e in e leukina 6, así como el es és y la hipoxia (82).
Nume osos es udios clínicos mues an una elación en e la adiponec ina y obesidad:
la adiponec ina es á educida en pacien es obesos, siendo la ele ada concen ación de
es a p o eína en el plasma un ac o p o ec o en e a la diabe es. A ni el me abólico
la adiponec ina inc emen a la oxidación de ácidos g asos en el músculo y educe
ni eles plasmá icos de glucosa, ácidos g asos lib es y iglicé idos median e la u a de
la AMP kinasa (AMPK) (83).
2.2.3 Resis ina
La esis ina es una adipokina pe enecien e a un g upo de p o eínas asociadas a
p ocesos in lama o ios. A pesa de se una adipokina, se ha desc i o que es a p o eína
ambién es p oducida po o os ejidos como el ejido adiposo ma ón, es ómago,
in es ino y músculo (84). Su nomb e p o iene de su e ec o sob e la esis encia a la
insulina que p oduce en a ones (85); a ones knock-ou pa a la esis ina ienen
meno es ni eles de glucosa pos -pand ial y meno gluconeogénesis hepá ica que los
no males (86). La habilidad de la esis ina pa a modula la esis encia a la insulina, es á
asociada con la ac i ación del sup eso de la señalización de la ci okina 3 (SOCS3),
inhibido de la señalización de la insulina en adipoci os (87). En oedo es, la esis ina es
egulada po el es a us me abólico y nu icional, disminuyendo en el ayuno y es ando
inc emen ado en es ados de obesidad y diabe es ipo 2 (88). Al igual que la lep ina, los
p incipales e ec os de la esis ina sob e el me abolismo ene gé ico son mediados po
el hipo álamo; la adminis ación cen al de esis ina educe la inges a y egula el
me abolismo lipídico de ejidos pe i é icos (89,90).
In oducción
44
3.3 Ho mona concen ado a de melanina (MCH)
Es a ho mona de i a su nomb e de la capacidad
pa a ag ega g ánulos llenos de melanina en la piel
de los peces eleós eos, localizando la pigmen ación
en un á ea conc e a cla eando el colo del es o del
pez (142,143). La al e ación del colo de la piel de
es os peces pe mi e al animal que se con unda con el
ondo, haciéndolo menos isibles an e un
dep edado (144).
T as el aislamien o inicial del MCH en la hipó isis
del salmón (145), se iden i icó una secuencia de 17
aminoácidos (146) con un puen e de cis eína en e
las posiciones 5 y 14 o mando una es uc u a anilla ,
imp escindible pa a su unción biológica (147).
Pos e io men e, MCH ue iden i icado en el hipo álamo de a a como un pép ido
cíclico de 19 aminoácidos con una ele ada homología con la del salmón (Imagen 13).
Los análisis del mRNA e ela on que el ansc i o ( an o en humanos, a a y a ón)
p oduce una p ep oho mona de 165 aminoácidos. De es a p ep oho mona se pueden
p oduci dos pép idos además del MCH, neu opép ido E-I (NEI) y neu opép ido G-E
(NGE) (148). MCH es aducido como una p oho mona; p ocesamien os p o eolí icos
en dos esiduos de a ginina gene a el pép ido MCH madu o gene ando una es uc u a
p ima ia se man iene conse ada en los mamí e os (Imagen 15). De igual modo se
conse a la es uc u a de NEI, pe o sin emba go, hay a iaciones en la es uc u a de
NGE. El papel de los o os dos pép idos codi icados del gen P omch se desconocen; la
adminis ación de pép idos sin é icos de NEI y NGE sólo o en combinación con MCH,
no p oduce ningún e ec o en inges a (149). Sin emba go, se ha desc i o que NEI
inc emen a la ac i idad locomo o a, induce la sec eción de la ho mona lu einizan e y
es á in oluc ado en la sec eción de la ho mona adenoco ico opa inducida po es és
(150-152). Po o o lado se ha desc i o que MCH, NEI y NGE in e ac úan en modelos
células median e mecanismos pa ac inos y au oc inos (153,154).
Imagen 14. Secuencia de
aminoácidos de la ho mona MCH
de mamí e os. Los aminoácidos
en e de son esiduos
conse ados en e mamí e os y
el salmón; los na anjas son
di ie en espec o al salmón
(153).
Imagen 15. Esquema ep esen a i o de la
es uc u a del gen P omch. El gen MCH humano se
localiza en el b azo la go del c omosoma 12 (12q23-
24). EL gen con iene dos in ones y es exones. Los
pép idos NGE, NEI y MCH se codi ican de los exones
2 y 3 (153).

E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
45
3.3.1 Neu onas MCH
En el sis ema ne ioso cen al, la exp esión de MCH se limi a a las células
magnocelula es en el hipo álamo la e al y en la denominada zona ince a (ZI) (141). Las
neu onas MCH en el LHA, juegan un papel in eg ado en e señales de la pe i e ia,
(ac uando ía las neu onas de p ime o den en el ARC y señales desde á eas ex a-
hipo alámicas), modulando inges a, bebida, y compo amien os de búsqueda de
alimen os y sis ema hedónico. Neu onas del ARC de ec an a iaciones en los
pa áme os homeos á icos y ansmi en la in o mación a o as á eas incluyendo el
núcleo la e al. Las neu onas MCH de segundo o den del LH, ealizan múl iples
p oyecciones a lo la go del ce eb o, modulando y coo dinando el compo amien o
alimen a io (155). El egis o de la ac i idad de las neu onas MCH, mues an un bajo
ni el de ac i idad compa ado con neu onas o exinas o GABAé gicas (156,157). Po
an o, la ac i idad de la neu onas MCH depende de su ac i ación po
neu omodulado es elacionados con señales de hamb e-saciedad p o enien es de la
pe i e ia o de o as zonas hipo alámicas in oluc adas en la modulación de la inges a,
p incipalmen e en condiciones de dep i ación ene gé ica (4,158). Las neu onas MCH
esponden a di e sos ac o es y neu omodulado es como glucosa, neu o ansmiso es
como glu ama o y GABA; neu opép idos exci a o ios como se o onina, dopamina,
no ad enalina y canabinoides; y pép idos hipo alámicos como NPY, α-MSH (155). Sin
emba go, la acción de ho monas como lep ina, gh elina e insulina sob e MCH, es
con o e ida y se piensa que sus e ec os son p incipalmen e indi ec os. En el LHA, las
neu onas MCH co-exis en con o a población simila , las neu onas o exinas; con
ca ac e ís icas simila es pe o no coinciden es. Sin emba go, una ca ac e ís ica común a
ambas poblaciones, es su conexión monosináp ica con o as á eas del encé alo. Las
neu onas MCH p oyec an a múl iples á eas como el có ex p e on al, eminencia
media, núcleo accumbens (Nac), núcleo es iado do sal y en al, có ex pi i o me y en
onco encé alo (141,159). Sin emba go, es impo an e ene en cuen a, que la
exp esión y p oyección de neu onas MCH a ía en e a a y a ón (160).
3.3.2 MCH-R y su dis ibución ence álica
MCH ac i a a su ecep o MCH-R1 (161), una p o eína G ansmemb ana, con una
secuencia muy conse ada en e a as, a ones y humanos (162). En líneas celula es
ecombinan es, se ha desc i o que MCH se une a su ecep o MCH-R1, con una
a inidad de ap oximadamen e 1 nM (163). Una ez unido el MCH a su ecep o MCH-
R1 ipo 7 ansmemb ana GPCR Gi/Gq, se ac i an múl iples u as de señalización. La
ac i ación del MCH-R1 inc emen a la concen ación del Ca2+ in acelula lib e, se
inhibe la adenila o ciclasa y se es imula el me abolismo del os a idilinosi ol y la u a
de ERK1/2 (164). Los RNA mensaje os del ecep o MCH-R1 p esen an en el ce eb o
una dis ibución simila a las p oyecciones de la neu onas MCH-inmuno eac i as, como
1) có ex pi i o me y el bulbo ol a i o, 2) Nac y el VTA, y 3) odos los núcleos
hipo alámicos; es deci luga es que señalan la implicación del MCH sob e el
In oducción
46
compo amien o, sis ema de ecompensa y me abolismo ene gé ico (165-167)
(Imagen 16). T as la iden i icación del MCH-R1 se iden i icó un segundo ecep o pa a
MCH; MCH-R2 de ec ado en humanos y p ima es, pe o no p esen e en oedo es, con
un 38% de homología con el MCH-R1 (168-170). La dis ibución del MCH-R2 en el
ce eb o de los p ima es casi se supe pone a la del MCH-R1, mos ando es e úl imo una
exp esión más ele ada y una dis ibución más amplia (171). EL MCH-R2 se exp esa en
di e sas zonas del ce eb o incluyendo la amígdala y el hipocampo.(170,172).
La dis ibución ana ómica de neu onas que exp esan en MCH-R1 se ha ealizado
median e la de ección de su mRNA median e écnicas de hib idación in si u, debido a
la di icul ad po encon a un an icue po adecuado pa a los análisis ana ómicos. Es o
limi a el es udio sob e las ca ac e ís icas de las neu onas que con engan el MCH-R1,
como la co-exp esión con neu o ansmiso es o la ca ac e ización del ipo neu onal en
el que se exp esa. En un ecien e es udio, Chee a al. (173), gene a on un modelo en el
que las neu onas que exp esan el MCH-R1 se iden i ican po la co-exp esión de una
p o eína luo escen e dependien e de la exp esión de c e- ecombinasa ( a ón Mch 1-
c e/ dToma o). Las neu onas MCH-R1 en el hipo álamo cons i uyen una población muy
he e ogénea y co-exp esan múl iples neu opép idos implicados en la homeos asis
ene gé ica. En el hipo álamo pa a en icula , las neu onas MCH-R1 se exp esan en las
poblaciones que exp esan dino ina, enke alina, ac o libe ado de co ico opina y
ac o libe ado de i o opina. En el núcleo a cua o, el MCH-R1 co-exp esa con el 35%
de las neu onas NPY sensibles a lep ina y más del 70% de neu onas POMC sensibles a
lep ina (165,166).
Imagen 16. Es uc u a (de echa) y dis ibución (izquie da) de MCH y MCH-R1 en el ce eb o de a a.
Los pun os neg os indican localización de los cue pos neu onales p oduc o es de MCH, y las líneas
las p oyecciones de dichas neu onas. Los pun os blancos indican las zonas del ce eb o donde se
de ec ó exp esión del ARNm de MCH-R1 (166).
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
47
3.3.3 MCH, compo amien o y sis ema de ecompensa
Como se ha mencionado an e io men e, las neu onas MCH p oyec an a di e en es
á eas del compo amien o. Ra ones de icien es en MCH p esen an anomalías en el
compo amien o ol a i o, los machos p esen an más ag esi idad y las hemb as ienen
de iciencias en la sinc onización del ciclo ho monal e ins in o ma e nal (174). Po o o
lado, MCH es á ambién in oluc ado en el sueño, siendo la sec eción de MCH mucho
más ele ada en las ases p o undas de sueño, y apenas de ec adas en igilia,
in oluc ando su acción en deso denes de sueño (175). T as su adminis ación en la
amígdala e hipocampo, se ha obse ado que MCH ambién es á in oluc ado en la
memo ia cogni i a en a as (176). Median e el uso de un modelo de a ones con
dep esión inducido po es és, se ha obse ado que exis e un inc emen o de la
exp esión de MCH-R en el hipocampo. Es e hecho es coinciden e con el eno ipo
ansiolí ica gene ado po el dé ici de MCH-R, sin emba go el e ec o an i-dep esi o de
es a ablación sólo e a de ec ada en hemb as. Es e es udio mues a la po encial acción
de an agonis as de MCH pa a el a amien o de desó denes del compo amien o y
dep esión (177,178).
Además de los núcleos hipo alámicos, el Nac es impo an e en la egulación de la
inges a. El Nac con iene ele adas concen aciones de MCH-R1 (173) y las neu onas
MCH que p oyec an hacia el VTA es án in oluc adas en la egulación hedónica del
ape i o (179). La ausencia del gen P omch disminuye la ape encia po la die a al a en
g asa y el azúca (149,180). Regis os in i o demues an que MCH educe la ac i idad
neu onal del Nac en animales en mo imien o (181); en conco dancia con o os
es udios a macológicos y elec o isiológicos, la educción de la exci ación neu onal del
Nac inc emen a la inges a (182,183). A su ez, el Nac p oyec a ecíp ocamen e hacia el
LHA modulando su ac i idad neu al (184). Los ci cui os gene ados po las conexiones
de neu onas O exina-VTA y la conexión de las neu onas MCH-NAc gene an
impo an es es uc u as ana ómicas que conec an las acciones homeos á icas del
hipo álamo con los ci cui os límbicos de ecompensa.
3.3.4 MCH y el me abolismo ene gé ico
En el hipo álamo, los MCH-R1 se exp esan en el ARC, VMH, PVH y en el LH,
mos ando la ele ancia de la MCH sob e la egulación de la inges a y el me abolismo
ene gé ico (165). Los ni eles cen ales del RNA mensaje o de MCH son ele ados en
modelos de icien es de lep ina (ob/ob) en compa ación con los con oles delgados
du an e el ayuno (185). Es a idea p elimina del MCH como pép ido o exigénico se
con i mó cuando se obse ó un ápido inc emen o de la inges a en a as as la
adminis ación in ace eb o- en icula (ICV) de MCH (185,186). Desde el LH, las
neu onas MCH p oyec an al núcleo ago do sal (DMV) en el NTS del onco encé alo
(187), y pa a de e mina los e ec os de MCH sob e el NTS se adminis ó MCH en el
cua o en ículo (187). No se obse a on e ec os en la inges a, pe o sí una
disminución en la empe a u a co po al y una endencia a la disminución de la
In oducción
48
ac i idad ísica, sugi iendo que el MCH ac úa ambién sob e el onco-encé alo en línea
con su acción hipo alámica de conse ación de la ene gía. Po o o lado, la
adminis ación de ICV de MCH inc emen a la inges a de agua independien emen e de
la inges a de pienso (188). Po o o lado, la adminis ación ICV de MCH, aumen a la
inges a de alcohol y saca osa, pe o es os e ec os deben es a asociados a la elación de
MCH con el sis ema de ecompensa (189). Se han gene ado múl iples modelos de
animales modi icados gené icamen e pa a explo a las unciones de MCH en el
me abolismo ene gé ico y demás unciones sob e el compo amien o. Los modelos
mu inos de icien es en algún gen (KO) incluyen múl iples cons uc os que p e ienen la
sín esis de MCH o del MCH-R, modelos ansgénicos incluyen la sob e-exp esión del
gen P omch. Los es udios esul an es de es os modelos mues an que la pé dida de la
uncionalidad de MCH p oduce eno ipos delgados y esis en es a la obesidad (190)
(Tabla 1).
3.3.5 Modelos gené icos de MCH
 Ra ones KO pa a MCH
La eliminación del gen P omch en a ones con una cepa mix a de C57BL/6 X
129S J, gene a un a ón hipo ágico y con un aumen o del gas o ene gé ico (191).
Pesan en e un 25-30% menos que los con oles, jun o con una educción de los
ni eles de lep ina y del con enido en g asa co po al. Es a disminución de la lep ina se
aduce en una disminución cen al de POMC, pe o no en un aumen o de AgRP o NPY.
Cuando a ones de icien es en MCH, an o de la cepa C57BL/6 X 129S J y la C57BL/6 X
129/S E (menos suscep ible al engo de po die a al a en g asa) se exponen a die a
al a en g asa, p esen an una esis encia a la obesidad, g acias a su ele ado gas o
ene gé ico (191,192). La alimen ación de a ones P omch-/- C57BL/6 con HFD du an e
15 semanas, pone de mani ies o no sólo una esis encia a la acumulación lipídica, sino
una mejo a en la in lamación y adiposidad hepá ica así como una mejo a en la
sensibilidad a la insulina (193). La e aluación de la ausencia del gen P omch en cepas
pu as con i ma su inc emen o en el gas o ene gé ico, y a o ece una mayo ca e a
sob e ueda de oedo (192,194).
Una de las ca ac e ís icas del en ejecimien o es la acumulación lipídica en el ejido
adiposo isce al que con ibuye a un aumen o en la esis encia a la insulina asociada al
en ejecimien o (195). Los a ones KO pa a el gen P omch, pe sis en con su eno ipo
delgado a los 19 meses de edad, siendo los machos un 30% y las hemb as un 25% más
delgados que sus con oles, e ec o debido a una disminución de la masa g asa (196).
Es os a ones, mejo an el es a la ole ancia a la glucosa o al (OGTT) po una mayo
sensibilidad a la insulina, cuyos ni eles plasmá icos son meno es que los con oles de
eno ipo sal aje. Además la disminución en la ac i idad locomo o a asociada al
en ejecimien o se e ie e en es os a ones.
Pa a e i a los e ec os compensa o ios en el desa ollo neu onal en los a ones
P omch-/- que puedan in e e i en el eno ipo desa ollado en adul os, se gene ó o o
a ón que p esen a a en su desa ollo emb iona io neu onas MCH ac i as. Usando la
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
49
cepa de a ón FVB/n, se gene ó modelo gené ico inducible median e el uso de la
oxina a axin-3, eliminándose las neu onas MCH en a ones con 4 semanas de edad.
Es os a ones mues an un eno ipo p ác icamen e simila a los a ones P omch-/-
(delgados, hipo ágicos y con un inc emen o del gas o ene gé ico), pe o con ac i idad
locomo o a no mal (197). Debido a los al os ni eles de MCH de ec ados en a ones
ob/ob, se gene ó un a ón con doble deleción de lep ina y MCH, en espe a de esol e
el eno ipo obeso de los ob/ob (198). En é minos de inges a no se obse an
di e encias en e los ob/ob y los P omch-/- ob/ob. pe o es os úl imos son más delgados
debido a un aumen o de has a 3 eces en la ac i idad locomo o a y un 25% más de
gas o ene gé ico. Al c uza an o el modelo inducible P omch-/- a axin-3, como los
P omch-/- con los ob/ob, se obse ó una mejo a de la diabe es, la es ea osis y la
obesidad inducido po la ausencia de lep ina (197,198). Los e ec os de la MCH sob e el
me abolismo no sólo se limi an a la modulación de la inges a y el gas o ene gé ico,
in luye ambién en la modulación del me abolismo pe i é ico, a ones de icien es en el
gen P omch expues os a una die a al a en g asa, es án p o egidos an e la
hepa oes ea osis (acumulación lipídica en el hígado) inducida po die a (193).
 Ra ones ansgénicos pa a MCH
El eno ipo p oducido po a ones ansgénicos que sob e-exp esan MCH, ambién
con i ma el papel endógeno de MCH en la homeos asis ene gé ica. U ilizando la cepa
FVB, se gene ó un a ón que sob e-exp esaba el gen P omch en el hipo álamo la e al
dos eces más que un a ón no mal (199). Es e a ón ansgénico come un 10% más de
la die a al a en g asa y es un 12% más pesado que los WT. Los ni eles de glucosa e an
más ele ados espec o a los con oles an o en es ado pos pand ial, como du an e el
es de ole ancia a la glucosa (GTT), siendo esis en es a la insulina. Los P omch
ansgénicos he e ocigo os de la cepa C57BL/6, son hipe ágicos con die a no mal, más
pesados y esis en es a insulina; sin emba go, no p esen an a iación en los ni eles de
glucosa (199).
 Ra ones KO pa a el MCH-R
Es udios con a ones KO Mch 1, acla a y con i ma el papel de MCH en el
me abolismo ene gé ico. Usando una cepa mix a de C57BL/6 X 129S J, la ausencia del
gen Mch 1 en a ones ambién p oduce un eno ipo delgado p esen ado esis encia a
la adminis ación exógena de MCH (200). Sin emba go son hipe ágicos compa ados
con el con ol. Cuando se exponen a die a al a en g asa, ganan menos peso que los
con oles a pesa de la hipe agia; es e hecho se puede explica po el ele ado ono
simpá ico (aumen o de la lipólisis) y su hipe ac i idad (200). Casi simul áneamen e,
o o g upo gene ó el mismo a ón, obse ando los mismos esul ados en e a la die a
al a en g asa ( esis en es a la ganancia de peso inducida po la die a) (201). De ec a on
que los ni eles de insulina y lep ina e an meno es que en los con oles, pe o no
obse a on di e encias en los ni eles de glucosa. El modelo he e ocigo o no
p esen aba di e encias de ningún ipo espec o del con ol (201). Es udios pos e io es

In oducción
50
mos a on que los a ones Mch 1-/- p esen an un 250% más ac i idad locomo o a en la
ueda acompañado de hipe agia (202); mayo asa me abólica, hipe ac i idad y mayo
ac i idad ca diaca sin cambios en la p esión a e ial (203). El modelo de Mch 1-/- con
un ondo gené ico de C57BL/6 mues a meno es ni eles de insulina y mayo
empe a u a co po al (204,205). Ra ones de icien es de lep ina ob/ob, la ausencia de
Mch 1, educe la adiposidad (aunque no el peso co po al), mejo a la espues a al
OGTT, inc emen a la ac i idad locomo o a espon ánea y mejo a la e mo egulación
as la exposición a ío, mos ando de nue o que MCH es un impo an e mediado de
la espues a al dé ici de lep ina (205).
Recien emen e, pa a es udia los e ec os del MCH-R2 ca ac e ís ico de humanos,
se ha gene ado un modelo de a ón especí ico pa a su es udio en el que se co-
exp esaban ambos ecep o es, de e minado que la exp esión del MCH-R2 iene un
e ec o p o ec o en e a la obesidad inducida po die a al a en g asa, ab iendo nue as
posibilidades a nue os agonis as sob e el MCH-R2 pa a el a amien o de la obesidad
(206). Se ha desc i o que el MCH-R1 se exp esa ambién en ejido pe i é icos como el
ejido adiposo, p ós a a e in es ino (168). En elación a es e pun o, en a ones KO pa a
el gen de P omch a los que se le indujo químicamen e coli is, p esen an meno es
ni eles de in lamación que el eno ipo sal aje, sugi iendo el papel de MCH en la
espues a inmune in es inal (207). De hecho, es os a ones de icien es de MCH son
más suscep ibles a la mo bilidad cuando se in ec an con Salmonella, p esen ando una
in lamación más se e a y más mo alidad (208). Po o o lado MCH y su ecep o es án
p esen es en la piel de humanos (209); además, en el cul i o p ima io de melanoci os
humanos, MCH pa ece bloquea las acciones melanogénicas de α-MSH (209). De es a
p opiedad de MCH ha su gido la idea del uso de an icue pos an i MCH-R1 pa a el
a amien o del i íligo, en e medad de la piel ca ac e izada po la pé dida de
pigmen ación (210).
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
51
Geno ipo
Feno ipo
Re e encia
P omch -/- C57BL/6 x 129S J
Hipo agia, adiposidad educida, inc emen o de la asa
me abólica y bajo peso
Shimada e al., 1998
(191)
P omch -/- C57BL/6
No mo agia, adiposidad educida, inc emen o de
ac i idad y asa me abólica, y bajo peso
Zhou e al., 2005
Kokko ou e al., 2005
(194-192)
P omch -/- C57BL/6
Ancianos, adiposidad educida, glucosa educida,
sensibilidad a la insulina
Jeon e al., 2006 (196)
P omch -/- C57BL/6
Alimen ados con HFD, esis en es a hepa oes ea osis
inducida po die a, mejo a sensibilidad a glucosa
Wang e al., 2010 (193)
P omch -/- C57BL/6 x 129S E
Hipe agia, adiposidad educida, inc emen o de la
asa me abólica y bajo peso
Kokko ou e al., 2005
(194)
P omch; a axin-3 FVB/n
Hipo agia, adiposidad educida, inc emen o asa
me abólica y bajo peso
Alon y F iedman ., 2006
(197)
P omch; a axin-3; ob/ob
(FVB/n x C57BL/6)
Hipe agia, adiposidad educida, glucosa educida,
es ea osis educida y bajo peso
Alon y F iedman ., 2006
(197)
P omch -/-; ob/ob C57BL/6
Adiposidad educida, glucosa educida, inc emen o
de ac i idad y asa me abólica, y bajo peso
Segal-Liebe man e al.,
2003 (198)
P omch g/ g FVB
Sob epeso, hipe agia en HFD, inc emen o de glucosa
y esis encia a insulina
Ludwig e al., 2001 (199)
P omch g/+ C57BL/6
Sob epeso, hipe ágico con es ánda , no mo-glucosa
y esis en e a insulina
Ludwig e al., 2001 (199)
Mch 1-/- C57BL/6 x 129S J
Adiposidad educida, hipe agia, hipe ac i idad, bajo
peso, inc emen o de ac i idad y asa me abólica, y
esis encia a insulina
Ma sh e al., 2002 Chen
e al.,2002 As and e
al., 2004 Zhou e al.,
2005 (200, 203, 318)
Mch 1-/+ C57BL/6 x 129S J
Sin di e encias en e al con ol
Chen e al.,2002 (104)
Mch 1-/- C57BL/6
Hipoinsulinemia, mejo a al OGTT y ele ada
empe a u a co po al
Bju sell e al., 2006
Ahnaou e al., 2011
(205, 204)
Mch 1-/-; ob/ob C57BL/6
Adiposidad educida, hipoinsulinemia, mejo a al
OGTT e inc emen o de ac i idad
Bju sell e al., 2006
(205)
O igen: Adap ado de MacNeil e al., 2013
3.3.6 Es udios a macológicos de MCH
La ho mona concen ado a de melanina, y en ocasiones de i ados de MCH, se han
u ilizado pa a e alua la acción de MCH en la homeos asis ene gé ica. La
adminis ación aguda en el en ículo la e al (ICV) de MCH (5-30 µg) en a as Long
E ans inc emen a inges a (185), e ec o que ambién se p oduce en a as Sp ague-
Dawley (185,211), con un e ec o máximo a las 2 ho as de su adminis ación (211).
Tabla 1|Modelos gené icos de a ón que mues an la ele ancia de MCH en la homeos asis ene gé ica.
In oducción
52
U ilizando una solución en iquecida con saca osa, la adminis ación ICV de MCH
inc emen a su bebida (212); ambién ocu e u ilizando bebida con glucosa pe o no con
saca ina, indicando que la acción dipsogénica de MCH es á más elacionada con el
con enido caló ico que con el sabo (213). En una compa ación en pa alelo, MCH es el
pép ido con meno in ensidad o exigénica espec o a AgRP y NPY (214). Respec o a la
acción núcleo especí ica de MCH, su adminis ación en el núcleo pa a en icula del
hipo álamo y en el Nac inc emen a inges a en las 4 ho as pos e io es a su
adminis ación; sin emba go, la adminis ación di ec a sob e el ARC inc emen a
inges a as una ho a después de su in usión(215,216).
La adminis ación c ónica de MCH en oedo es no sólo inc emen a inges a, sino
que a o ece la obesidad (211,217,218). La adminis ación c ónica de MCH du an e 12
días inc emen a peso en a as (211). El uso c ónico de análogos de MCH, ambién
inc emen a el peso e inges a as su adminis ación c ónica ICV en compa ación con
los con oles (219). En a ones, la adminis ación c ónica du an e 14 días no se
inc emen a inges a en die a es ánda , pe o sí lo hace con una die a mode adamen e
al a en g asa; no obs an e, con ambas die as, la acción c ónica ICV de MCH inc emen a
el peso de los a ones sin a iación en la ac i idad locomo o a (217,218). Es e e ec o
p oduce en los a ones un inc emen o en los depósi os g asos, lep ina, TG hepá icos,
glucosa plasmá ica e insulina (217). Es e e ec o sob e el me abolismo de la glucosa,
ambién se ha obse ado en a ones as la adminis ación ICV de MCH du an e 4 días
(220). Aunque la inges a no e minó de p oduci un inc emen o signi ica i o, la
adminis ación ICV de MCH p odujo esis encia a la insulina y un inc emen o de la
glucosa plasmá ica en ayuno.
3.3.7 Es udios a macológicos sob e el MCH-R1
El es udio de análogos de MCH, dejó al descubie o los aminoácidos cla e pa a la
ac i ación del MCH-R1, po lo que se comenza on a p oduci pép idos an agonis as
pa a el ecep o , como el Ac-(A a9-10, A a14-15)-MCH (6-16)-NH2 (221-223). Su
adminis ación ICV aguda bloquea las 2 ho as iniciales de hipe agia inducida po MCH
(219,224), mien as que su adminis ación c ónica du an e 14 días educe inges a y
peso (219). En a ones C57BL/6 alimen ados con die a mode adamen e al a en g asa,
la adminis ación ICV del pép ido du an e 28 días educe peso, inges a, glucosa en
plasma, coles e ol, y los depósi os g asos y el peso del hígado (224). Es e pép ido no
eje cía su acción en a ones Mch 1-/-, co obo ando su especi icidad. Ra ones obesos
alimen ados du an e un año con die a al a en g asa (peso co po al de
ap oximadamen e 60 g), se a a on ICV du an e 4 semanas con el pép ido an agonis a
del MCH-R1(225). Los a ones pe die on peso y se eduje on los ni eles de lep ina e
insulina. EL hígado de es os a ones pe die on un 50% de peso y disminuye on los
ma cado es hepá icos en sue o. Con inuado con el es udio sob e la es ea osis hepá ica
y MCH, se a a on ICV a ones alimen ados con die a de icien e en colina y me ionina
que p oduce es ea ohepa i is (226). El a amien o edujo d ás icamen e la
acumulación de iglicé idos en el hígado. La habilidad del an agonis a del MCH-R1 de
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
53
mejo a la es ea osis hepá ica, se comp obó en un modelo de hemb as
o a iec omizadas alimen adas con die a es ánda . T ein a semanas después de la
o a iec omía, p esen an un inc emen o de peso espec o a los con oles. T as el
a amien o de las mismas con el an agonis a de MCH-R1 du an e 4 semanas, se
obse ó senda disminución de peso y TG hepá icos (227).
Es os modelos gené icos y a macológicos, e idencian la ele ancia de MCH como
señal modulado a de los es ados isiológicos con balance ene gé ico nega i o. Exis en
e idencias que mues an que las neu onas MCH esponden a señales me abólicas
pe i é icas en el hipo álamo. Di e en es es ados isiológicos ales como la es icción
de alimen os, el ayuno y el dé ici génico de lep ina, p o ocan aumen os signi ica i os
del mRNA de MCH (185,228); la adminis ación ICV de lep ina educe los ni eles mRNA
de MCH (229). Además de la lep ina, la glucosa es un nu ien e que ac i a o inhibe la
ac i idad neu onal en los núcleos hipo alámicos (230). La modulación de los
concen aciones plasmá icas de la glucosa, se ealiza median e la sec eción de insulina
po el pánc eas, pe o el ce eb o ambién es á in oluc ado en dicha modulación (231-
233). Las neu onas MCH, esponden a las concen aciones isiológicas de glucosa
median e una despola ización de la memb ana, que p oduce su ac i ación en un
mecanismo dependien e de canales de K+ dependien es de ATP y UCP2 (234,235). La
exci ación de las neu onas MCH inducido po glucosa, iene un e ec o en la
modulación del me abolismo pe i é ico sob e el man enimien o del es ado
euglicémico; sugi iendo que las neu onas MCH con olan el me abolismo de la glucosa
a o eciendo su sín esis po el hígado y/o inc emen ando la inco po ación de glucosa
al músculo o la g asa (235). Sin emba go, los mecanismos isiológicos bajo los cuales se
modula la exp esión de MCH en el LH con de alle, es án aún po elucida .
3.3.8 MCH y el eje hipo álamo-hipo isa io
Además de los amplios es udios sob e la elación de MCH en la homeos asis
ene gé ica, ambién se ha desc i o una elación en e MCH y la libe ación de la
ho mona libe ado a de gonado opina (GnRH) en el hipo álamo, y po an o con el eje
hipo álamo-hipo isa io. La adminis ación de MCH en la eminencia media y el á ea
p eóp ica (zonas donde se localizan las neu onas GnRH) en modelos o a iec omizados,
ad enalec omizados y p i ados de es os e ona, p oduce la libe ación de la ho mona
lu einizan e (LH), no siendo así cuando MCH se adminis a en o as á eas
hipo alámicas como el VMH. Es e es udio ue el p ime o que elacionó MCH con el eje
hipo álamo-hipo isa io (236). Pos e io men e, es udios neu oana ómicos mos a on
que en ap oximadamen e el 50-55% de las neu onas GnRH p esen an el MCH-R1, y
que las neu onas MCH ealizan sinapsis con el 85% de las neu onas GnRH (237). Es a
libe ación de GnRH apa en emen e inducida po MCH, coincide con la disminución
signi ica i a de los ni eles del mRNA de MCH du an e la p eñez y lac ancia; el
inc emen o de p olac ina disminuye los ni eles de MCH, pues o que puede es a
modulando an o la sec eción de GnRH y de la ho mona co ico opa (ACTH) du an e
In oducción
60
Pa ologías hepá icas asociadas a la homeos asis ene gé ica
4.
Dependiendo del apo e nu icional, el hígado puede cambia desde almacena
glucosa en o ma de glucógeno a ab ica la y libe a la al o en e sanguíneo, siendo
po an o el á bi o del consumo de ene gía del es o de ejidos dependien es de
glucosa. También es el cen o enca gado del me abolismo de los aminoácidos y de la
de oxi icación amónica, siendo el único capaz de gene a un compues o soluble, la
u ea, pa a la libe ación del amonio de i ado del me abolismo p o eico. Es impo an e
des aca ambién su papel en el me abolismo lipídico, sin e iza y deg ada lipop o eínas
y con ie e el exceso de ca bohid a os en ácidos g asos pa a su almacenamien o,
además de ab ica cue pos ce ónicos, sus a o que consume el ce eb o an e la
ausencia de glucosa en es ados de inanición. O as muchas y i ales unciones además
de las enume adas, hacen que el hígado cons i uya el p incipal in eg ado pe i é ico
del me abolismo in e media io. El hígado es esencial pa a man ene el equilib io
me abólico a a és del almacenamien o o libe ación de g andes can idades de ene gía
según el es ado nu icional del o ganismo. La unción p incipal del hígado es la del
man enimien o de la concen ación de glucosa sanguínea cons an e a pesa del es ado
nu icional, y de ges iona el almacenamien o ene gé ico. En un es ado pos -pand ial
el hígado cen a su ac i idad en el almacenamien o ene gé ico, en o ma de glucógeno
y iglicé idos, en un p oceso dependien e de insulina y del sis ema ne ioso
pa asimpá ico (15,283).
Hay es mane as po las que los iglicé idos pueden o ma pa e de las ese as
hepá icas: lipogénesis de no o, ácidos g asos lib es p o enien es p incipalmen e del
ejido adiposo y iglicé idos de lipop o eínas emanen es (Imagen 20) (285). De odas
ellas, la lipogénesis de
no o con ibuye a una
pequeña pa e de los TG
cons i uyen es de las VLDL
hepá icas (286,287). Los
lípidos que p o ienen de la
die a se empaque an en el
in es ino en lipopo eínas
denominadas
quilomic ones, que los
anspo an a a és de la
lin a hacia el hígado,
donde se inco po an al
mismo po la acción de la
LPL Du an e la ase pos -
pand ial, es os lípidos son
almacenados en el
Imagen 20. Ru as me abólicas de ácidos g asos lib es y TG
in oluc adas en la oxidación, almacenamien o y sec eción de las
VLDL en el hígado (284).

E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
61
hígado, donde se án acoplados a la apop o eína Apo B100 pa a o ma lipop o eínas
de muy baja densidad (VLDL), que se án sec e adas y dis ibuidas po el ejido adiposo.
La con ibución de TG po pa e de lipop o eínas emanen es es impo an e. En el caso
de los emanen es de quilomic ones, exis e una ápida eliminación de la sang e po
pa e del hígado, sob e odo en es ado pos -pand ial (288,289). En a ones neona ales,
la sob eexp esión de la LPL hepá ica aumen a la sec eción de las VLDL con TG
p o enien es de lipop o eínas emanen es (290); además, es udios in i o han
de e minado que los TG apo ados po los emanen es con ibuyen en la u a
sec e o a de los mismos (291). Sin emba go, en ci cuns ancias no males, los ácidos
g asos lib es no es e i icados (NEFAs) son los que con ibuyen en su mayo ía al
ese o io hepá ico de iglicé idos (292).
La elas icidad hepá ica en elación con su capacidad de almacenamien o de
iglicé idos, le pe mi e acomoda se a las concen aciones plasmá icas de NEFAs, que,
cuando se acumulan en exceso, pueden se oxidados y/o empaque ados en VLDL po
el hígado. Es a lexibilidad en el almacenaje lipídico, pe mi e neu aliza la oxicidad
gene ada po los NEFAs p o enien es de la lipólisis del ejido adiposo blanco (293).
4.1 En e medad del hígado g aso no alcohólico (NAFLD)
NAFLD es el é mino clínico-pa ológico que aba ca un espec o de en e medades
hepá icas que an desde la simple acumulación de iglicé idos en los hepa oci os
(es ea osis hepá ica), a la es ea osis in lama o ia (es ea o-hepa i is), ib osis y ci osis
(285). La en e medad ue desc i a po p ime a ez en 1980 (294) y es á di idida en
di e en es ca ego ías his ológicas; 1) es ea osis hepá ica con o sin una lige a
in lamación y 2) es ea o-hepa i is no alcohólica (NASH) que se di e encia de la an e io
po la p esencia de un impo an e daño en los hepa oci os con o sin ib osis pudiendo
de i a en hepa o-ca cinoma (Imagen 21) (295). La p esencia de ib osis hepá ica, es
uno de los signos más impo an es en la de e minación de un p onós ico hacia el
desa ollo de ci osis. Dado que la mayo ía de pacien es que p og esan a es ados
a anzados de ib osis enían en o igen es ea o-hepa i is (296), la mo bilidad hepá ica
a ibuida a pacien es con NASH que desa olla an inalmen e ci osos es de un 20%
(296). Sin emba go, la es ea osis no alcohólica iene un cu so más benigno, con un
es imado iesgo de p og esión a ci osis de menos del 4%, siendo aun así, los que
p esen an una lige a in lamación, aquellos con un mayo iesgo (296-298).
In oducción
62
4.1.1 Epidemiología
La p e alencia del NAFLD en la población gene al se es ima que es al ededo de
en e un 14 y 24 % (15,299-301). No malmen e se ha a ado como una en e medad
especí ica de adul os, pe o la p e alencia de la en e medad ha aumen ado
in ensamen e en odas los segmen os de la población incluidos los niños. EL
inc emen o de la p e alencia de la obesidad y la diabe es ipo 2 en la población es
segu amen e el esponsable del lo ecien e núme o de indi iduos con es ea osis
hepá ica (302).
Imagen 21. A g andes asgos, la en e medad de hígado g aso no alcohólico se di ide en e las que
no desa ollan in lamación (NAFLD) (paneles A-B) y las que p esen an di e sos g ados de
in lamación (NASH) (panel C); pudiendo llega incluso a ib osis hepá ica (panel D), donde se
obse a que el colágeno in ade los sinusoides hepá icos. Si la en e medad con inúa se acaba
desa ollando ci osis hepá ica (panel E) donde el colágeno ya empieza a o ma nódulos (pun a de
lecha) (294).
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
63
4.1.2 Fisiopa ología de la es ea osis hepá ica
El desa ollo de la es ea osis es á modulado po di e sos mecanismos
me abólicos, gené icos, ambien ales e incluso dependien es de la mic obio a in es inal
(303). La sob e-nu ición y la obesidad obse ada en pacien es con NAFLD es á
acompañado de hipe iglice idemia y esis encia a la insulina, de hecho se ha
conside ado la NAFLD como pa e del sínd ome me abólico, siendo la esis encia a la
insulina un equisi o pa a su desa ollo (304,305); la p e alencia de es ea osis en
pacien es con obesidad es al ededo del 75% (15).
Los mecanismos po los que el hígado acumula lípidos y gene a un desequilib io
en el almacenamien o g aso e lejado en g andes go as lipídicas pueden se 1)
inc emen o de inco po ación de lípidos, 2) aumen o en la biosín esis de no o de ácidos
g asos, 3) desajus e en la sín esis o sec eción de lipop o eínas y 4) una educción de la
oxidación de los ácidos g asos (306). La sob e-nu ición implica un mayo
almacenamien o lipídico de i ado de las lipop o eínas, así como un aumen o de la
biosín esis de no o inducido po insulina de i ado del exceso de ca bohid a os y g asas
con enidos en las die as de al as calo ías (Imagen 22).
En pacien es con NAFLD, los iglicé idos in a-hepá icos p o ienen en su mayo ía
de NEFAs ci culan es an o de o igen exógeno como endógeno (lipólisis) (307). Los
pacien es con diabe es ipo 2 inco po an al hígado ácidos g asos lib es p o enien es de
la die a un 50% más ápido que los con oles (308). Es os pacien es p esen an
ele ados ni eles de ácidos g asos ci culan es, debido a que la esis encia a la insulina
impide la inhibición de la lipólisis en el ejido adiposo (309). Sin emba go ambién se ha
desc i o que exis e una mayo a io de biosín esis de no o de lípidos en pacien es con
Imagen 22. Al e aciones me abólicas hepá icas de i adas de la acumulación de iglicé idos en
es ados de esis encia a la insulina (15).
In oducción
64
NAFLD y esis encia a insulina (307,310). En un es ado de hipe -insulinemia e hipe -
glicemia la insulina y la glucosa induce la exp esión hepá ica de los ac o es de
ansc ipción denominados p o eína de unión egulado a de es e ol ipo 1-c (SREBP1-
c) y la p o eína de unión en espues a a ca bohid a os (ChREBP) espec i amen e,
ac i ado es de enzimas implicadas en la biosín esis de no o de lípidos (311).
So p enden emen e, incluso bajo un impo an e es ado de esis encia a la insulina,
és a es capaz de con inua es imulando la SREBP-1c, ac i ando la biosín esis lipídica de
no o con ibuyendo a la o mación de un hígado g aso (312).
La composición de los ácidos g asos del hígado ambién in luye en la can idad de
iglicé idos que se acumulan median e la al e ación de la ac i idad de AMPK. La
deleción gené ica de la es e oil CoA desa u asa (SCD-1), una enzima esponsable de la
sín esis de ácidos g asos monoinsa u ados, p o ege con a el desa ollo de hígado
g aso y la esis encia a la insulina en a ones (313,314). En ausencia de SCD-1, la AMPK
se ac i a (315), lo que esul a en la os o ilación y la inhibición de ACC (316) y ChREBP
(317), así como una educción en los ni eles de exp esión de SREBP-1c (318). El
á maco an idiabé ico me o mina ambién ac i a la AMPK hepá ica
(318). El a amien o de a ones ob/ob con me o mina educe no ablemen e la
es ea osis hepá ica (319), y su adminis ación a se es humanos con es ea o-hepa i is
mejo a la uncionabilidad hepá ica y la disminución de amaño del hígado (305).
Una segunda clase de á macos an idiabé icos, las iazolidinedionas (TZDs), se
econocen p incipalmen e como á macos que ac i an el ecep o del pe oxisoma-
p oli e ado ac i ado gamma (PPAR-γ). Sin emba go, exis en es udios que sugie en que
ambién pueden ac i a AMPK (320,321). Los es udios pilo o en humanos u ilizando la
piogli azona (322,323) y la osigli azona (324) han demos ado la e icacia de es os
agen es en la educción de la g asa hepá ica, p esumiblemen e como consecuencia de
los acon ecimien os molecula es que esumidos en la imagen 23.
Imagen 23. Consecuencias de la
ac i ación de AMPK en el hígado. LA
me o mina y los TZDs, ac i an AMPK,
educiendo la lipogénesis po es
mecanismos di e enciados. Como
esul ado disminuye la concen ación de
malonil-CoA, ac i ándose la CPT1A,
inc emen ando, po an o, la oxidación
de los ácidos g asos lib es. (15).
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
65
En conjun o, es os es udios sugie en que el aumen o de la lipogénesis hepá ica es
una impo an e al e ación me abólica subyacen e en la pa ogénesis de la es ea osis en
hígados esis en es a la insulina. Es e aumen o de la lipogénesis, en ealidad puede
gene a al e aciones me abólicas que conducen a un mayo con enido de iglicé idos
hepá icos. La p ime a la al e ación es di ec a, a a és del aumen o de la sín esis de
iglicé idos. El segundo es una al e ación indi ec a, a a és de una mayo p oducción
de malonil-CoA, que al inhibi el CPT-1A impide la en ada de los ácidos g asos a la
mi ocond ia, y po an o, educe la β-oxidación (Imagen 22).
En el desa ollo de la es ea osis, además de la in luencia del ejido adiposo como
ue e de ácidos g asos, el in es ino delgado ambién puede in e eni . Es udios
ealizados en a ones lib es de gé menes demues an el papel de la mic obio a
in es inal en la abso ción y almacenamien o ene gé ico de i ado de la inges a de
alimen os. El asplan e de la mic obio a in es inal de a ones no males a aquellos lib e
de gé menes (p oceso conocido como con encionalización) da luga a un aumen o de
peso, de masa g asa y esis encia a la insulina (325); lo que sugie e que la mic obio a
in es inal in luye en la abso ción de ene gía adiposidad, in lamación y esis encia a la
insulina. La endo oxina lipopolisacá ido (LPS) es un cons i uyen e p incipal de muchas
de las bac e ias cons i uyen es de la mic obio a. La manipulación de la mic obio a
in es inal, incluso median e el uso de de e minados ing edien es en la alimen ación,
puede a ec a al me abolismo de los LPS inc emen ando sus ni eles ci culan es. Una
die a al a en g asa o en ca bohid a os en humanos, inc emen a los ni eles ci culan e
de LPS en an sólo es días (326). La endo oxemia po LPS empeo a la obesidad en si
misma pe o no gene a p ocesos in lama o ios. En a ones con endo oxemia inducida el
aumen o de ejido adiposo y la es ea osis esis encia hepá ica a la insulina se
desa olló de igual mane a que as la inges a de una die a al a en g asa (327). Es os
es udios mues an que la endo oxinemia induce acumulación lipídica en el hígado pe o
no es ea o-hepa i is.

In oducción
66
4.2 Es ea o-hepa i is no alcohólica (NASH)
A pesa de la al a p e alencia del hígado g aso no alcohólico y su po encialidad
pa a deja g a es secuelas, los ac o es e iológicos subyacen es que de e minan la
p og esión de la en e medad a es ea ohep a i is, ib osis e incluso ci osis siguen
siendo poco conocidos. Exis en limi aciones pa a es udia los cambios molecula es y
isiológicos que a o ecen la ansición de es ea osis a NASH po a ios ac o es. En
p ime luga no hay modelos animales que inco po an odas las ca ac e ís icas del
NASH humano; en segundo luga , las écnicas no in asi as disponibles pa a es udia el
me abolismo hepá ico en humanos es limi ado. Po lo an o, nues a comp esión
ac ual de los mecanismos po los que la es ea osis hepá ica p og esa a NASH se basa
exclusi amen e en los da os ela i os modelos animales. La p og esión de es ea osis a
es ea o-hepa i is se asocia a una lipo oxicidad que gene a una dis unción mi ocond ial,
es és del e ículo endoplasmá ico (ER-s ess), o mación de especies eac i as al
oxígeno (ROS) y ac i ación de u as in lama o ias; es deci c-Jun N- e minal kinasa
(JNK), el inhibido de ac o nuclea kβ (IKK-β) y ecep o kinasa ipo Toll 4 (TLR-4)
(Figu a 24) (328,329).
La β-oxidación mi ocond ial es la p incipal u a de deg adación de los ácidos
g asos bajo condiciones isiológicas no males, pe o ambién puede se la mayo uen e
de ROS (330). En pacien es con NAFLD se han de ec ado ano malidades en la
ul aes uc u a mi ocond ial hepá ica (331), lo que explica la educida asa de
espi ación mi ocond ial de los mismos (332). Una de las azones de esa dis unción
es á en la lipo oxicidad, gene ada po la acumulación de lípidos sa u ados como el
palmi a o en la es ea osis. Su oxidación gene a la acumulación de me aboli os óxicos
Imagen 24. Rep esen ación esquemá ica de la isiopa ología de la es ea o-hepa i is no alcohólica
(327).
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
67
de i ados de los mismos, p oduciendo la dis unción mi ocond ial y lipo oxicidad
(328,329). La dis unción y la educción en asa de espi ación mi ocond ial dan luga a
la gene ación de ROS (Imagen 25). Si la capacidad oxida i a de las mi ocond ias se
educe, los ácidos g asos ci osólicos se acumulan y se ac i an ías al e na i as de
oxidación en pe oxisomas y mic osomas, esul ando en una mayo acumulación de
ROS debido a que dichas oxidaciones son menos e ec i as (333,334). La acumulación
de ROS y de ácidos g asos mi ocond iales p oduci á la pe oxidación lipídica (335),
debido a la eacción en e los ROS y los ácidos g asos poli-insa u ados (PUFAs),
gene ando aldehídos de PUFAs con un ida media más longe a que los ROS
ampli icando los e ec os del es és oxida i o. Adicionalmen e, la pe oxidación de los
PUFAs ampli ica la p o eólisis de la ApoB en el e ículo endoplasmá ico, educiendo la
sec eción de VLDL en oedo es (336), con ibuyendo a una mayo acumulación lipídica
en el hígado. En es e con ex o de lipo oxicidad y es és oxida i o se gene an
impo an es daños en la homeos asis del hepa oci o, a ec ando de o ma nega i a en
la sín esis de nucleó idos y p o eínas; se ago a el glu a ión como an i-oxidan e y
aumen a la p oducción de la ci okina p o-in lama o ia TNF-α acili ando la en ada de
células in lama o ias al hígado y ac i ando las células Kup e a células es elladas,
p omo iendo el depósi o de colágeno, ib osis y pe pe uación de la espues a
in lama o ia (15).
Imagen 25. Mecanismos de gene ación de ROS en hepa oci os de i ados del me abolismo lipídico en
NAFLD (16).
In oducción
68
4.2.1 Acción del ejido adiposo blanco sob e el desa ollo de NASH
La hipe o ia del ejido adiposo en o ganismos obesos, ambién con ibuye a la
gene ación del NASH. Exis e una es echa elación en e los adipoci os hipe ó icos
esis en es a la insulina, la inmunidad des egulada an o en la g asa como en el hígado
y la es ea o-hepa i is inducida po lipo oxicidad. Los adipoci os y la acción ascula
del ejido g aso (es oma) seg egan una se ie de ho monas, ac o es del complemen o,
ci okinas (TNF-α, in e leukinas), quimiocinas y adipokinas uncionando como un ejido
endoc ino. Como se ha mencionado con an e io idad, la adiponec ina es una de es as
adipokinas, cuya educida sec eción de la misma en obesidad al e a el me abolismo de
lípidos y la sensibilidad de la insulina en el hígado; la adminis ación de adiponec ina
en a ones obesos alimen ados con die a al a en g asa ali ia espec acula men e la
hepa omegalia, es ea osis e in lamación (337). En la es ea ohep a i is, la disminución
de la sec eción de adiponec ina po los adipoci os dis uncionales con ibuye a la
o mación de NASH (338).
Los mac ó agos del ejido adiposo son una impo a e acción del es oma
(339,340). La ac i ación de los mac ó agos del ejido adiposo, juegan un impo an e
papel en la dis unción de la g asa gene ando esis encia a la insulina, libe ación de
ácidos g asos lib es al o en e sanguíneo y la deposición g asa ec ópica en el hígado
(328). En el es oma hay dos ipos de mac ó agos: 1) los mac ó agos M1 o mac ó agos
de ac i ación clásica que juegan un papel cla e en la inmunidad humo al y en la
espues a a pa ógenos; sec e an g andes can idades de ci okinas p o-in lama o ias
(TNF-α, IL-6, IL-12...) y bajos ni eles de ci okinas an i-in lama o ias (IL-10); y 2)
mac ó agos M2 o de ac i ación al e na i a con unción an i-in lama o ia (341). Un
aumen o de mac ó agos M1 espec o a M2 es ca ac e ís ico de oedo es alimen ados
con die a al a en g asa (341,342) y humanos obesos (343). Las células Kup e son el
equi alen e a los mac ó agos del ejido adiposo. En p ime luga son p omoci os y
monoblas os de la médula ósea que se di e encian en monoci os en la sang e
pe i é ica, localizándose en las sinusoides hepá icas como mac ó agos especializados
del sis ema e ículo-endo elial del hígado. Como se obse a en la imagen 24, las
células Kup e (células es elladas al ac i a se) son la mayo uen e de ci okinas
in lama o ias y su in e acción con las células B y T p oduce una unción simila a los
mac ó agos M1 en el desa ollo de esis encia a la insulina, in lamación y apop osis
hepá ica (344,345). La ac i ación de los mac ó agos del ejido adiposo p ecede a la
ac i ación de las células Kup e . En a ones alimen ados con die a al a en g asa, la
ac i ación de mac ó agos y la exp esión de ci okinas in lama o ias en el ejido adiposo
sucede ápidamen e y e en ualmen e gene an es ea o-hepa i is (346,347). Sin
emba go, la in il ación de mac ó agos M1 y la es ea o-hepa i is ocu e semanas
después de la des egulación del ejido adiposo. Teniendo en cuen a es os es udios, el
desequilib io en e mac ó agos M1/M2 y la libe ación de ac o es in lama o ios po las
células Kup e son impo an es ac o es pa a el desa ollo de NASH (Imagen 26).
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
69
4.2.2 E ec o del es és del e ículo endoplasmá ico en NASH
El desequilib io c ónico del balance ene gé ico en e la o e a y la demanda de
nu ien es, como se obse a en la obesidad, expone a las células a sucesos lipo óxicos
que, como consecuencia, ac i an ías de es és celula . Nume osos es udios han
señalado la es echa elación en e el me abolismo lipídico y el es ás del e ículo
endoplasmá ico (Es és-RE) en el desa ollo de NASH (348-352). El ER-s ess es una
consecuencia de la acumulación de p o eínas mal desplegadas en el lumen del e ículo
endoplasmá ico p oducidas po es ímulos biológicos, isiológicos o pa ológicos (353).
El e ículo endoplasmá ico es exquisi amen e sensible a las al e aciones en la
homeos asis celula de ec ado po la chape ona de unión a inmunoglobulina/p o eína
egulada po glucosa 78 (BIP/GRP78) (353). La acumulación de las p o eínas
desplegadas en el lumen del e ículo secues a GPR78 apa ándolo del dominio que
cons i uye GPR78 con los es senso es, cuya consecuencia es la ac i ación de los
mismos. La ac i ación de los es senso es de es és po la disociación de GPR78 an e
la acumulación de p o eínas de ec uosas en el lumen del e ículo desencadena la
denominada “ espues a an e p o eínas mal plegadas” (UPR) pa a es au a el co ec o
uncionamien o de e ículo endoplasmá ico. El desencadenan e de la UPR po GPR78
ac i a 3 de ías de ansducción de señales di e en es; 1) p o eína eque ida de inosi ol
(IRE) 1α, 2) kinasa del ac o de ansc ipción panc eá ico del e ículo endoplásmico
Imagen 26. En el ejido adiposo, la acción ascula es omal incluye células inmuni a ias. En la
obesidad, la ac i ación de los mac ó agos con ibuye al desa ollo de adipoci os dis uncionales
esis en es a la insulina; és os libe an can idades excesi as de ácidos g asos lib es, gene ando
esis encia a la insulina y lipoapop osis en ejidos pe i é icos como el hígado. La acumulación de
me aboli os óxicos de i ados de los lípidos, ac i a las ías in lama o ias de los hepa oci os y
células Kup e que de i a en daño hepá ico (327).

MATERIAL Y MÉTODOS
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
79
MATERIAL Y MÉTODOS
Animales de expe imen ación
1.
Todos los expe imen os con animales ue on e isados y ap obados po el comi é
é ico de la uni e sidad de San iago de Compos ela (p ocedimien os del P o . Rubén
Noguei as Pozo; 1500AE/12/FUN01/FIS02/RNP2 y 15005AE/12/FUN01/FIS02/RNP1) de
acue do con la no ma i a eu opea y española pa a el uso de animales de
expe imen ación animal; ealizado, po an o, en cumplimien o de la di ec i a
2010/63/UE del Pa lamen o y Consejo Eu opeo del 22 de sep iemb e de 2010 ela i a
a la p o ección de los animales u ilizados pa a ines cien í icos; eal dec e o de España
1201/2005, del 10 de Oc ub e, sob e p o ección de los animales u ilizados pa a
expe imen ación y o os ines cien í icos y bajo el eal dec e o de España 296/2008 del
30 de diciemb e, de p o ección de los animales u ilizados pa a expe imen ación y o os
ines cien í icos, incluida la docencia.
En is a de las conside aciones é icas asociadas con el uso de animales, los diseños
expe imen ales se ealiza on eniendo en cuen a el p incipio de las es R ( eemplazo,
educción y e inamien o). En base a es os p incipios, du an e la ealización de es a
esis doc o al, se asegu ó que los p ocedimien os ealizados ue an aquellos que:
implica an el uso mínimo de animales pa a alcanza los obje i os; a ec a a lo mínimo a
la capacidad de sen i dolo , su imien o, angus ia o daño du ade o; y, po an o,
u ie an mayo es p obabilidades de p oduci esul ados sa is ac o ios.
Debido a la na u aleza in ínseca de la esis (obje i os y pe spec i a isiológica del
es udio) se limi ó se iamen e la posibilidad de eemplaza el uso de animales. La
homeos asis ene gé ica implica la comunicación de los ejidos pe i é icos (hígado,
ac o gas oin es inal, ejido adiposo) con el CNS a a és de señales que llegan al
ce eb o po el o en e sanguíneo; po ello, la sus i ución de los modelos animales po
modelos celula es o ejidos aislados no se conside ó ac ible. Sin emba go, sí se
ealiza on es ue zos con el in de educi lo máximo posible el núme o de oedo es
u ilizados en los p ocedimien os. Con es e obje i o, se es udia on las di e en es
a iables a e alua en cada expe imen o y se coo dinó su diseño. La me odología
empleada pe mi ió la ecolección de múl iples mues as de ejidos y la ealización de
dis in os análisis sob e los mismos animales siemp e que ue a posible. La expe iencia
adqui ida pe mi ió e ina los p ocedimien os expe imen ales a in de elimina o
educi al mínimo cualquie posible dolo , su imien o, angus ia o daño du ade o como
se ha mencionado p e iamen e.
En odos los p ocedimien os expe imen ales se usa on a as (cepa Sp ague-
Dawley) o a ones (cepas C57-BL6 o Swiss) macho de en e 8 a 10 semanas de edad,
con pesos comp endidos en e 200-250 g en a as y en e 25-30 g en a ones. Los
animales se es abula on bajo condiciones con oladas de luz (12 ho as luz/ 12 ho as
Ma e ial y mé odos
80
oscu idad) y empe a u a, con un pe iodo de adap ación, p e io a los p ocedimien os
expe imen ales, de en e 5 a 7 días. Los animales se man u ie on con acceso lib e a
comida y agua, excep o en los p ocedimien os expe imen ales que equie an un
con ol de inges a.
Con el in de educi el es és causado po el p ocedimien o expe imen al y pa a
acos umb a los al manejo po el pe sonal del labo a o io, du an e el pe iodo de
adap ación se moni o izó pe iódicamen e la inges a y el peso. Cuando se eque ía de
una ci ugía que implica a un p ocedimien o in asi o o po encialmen e dolo oso, los
animales deben encon a se bajo los e ec os de una anes esia gene al. Pa a ello, se
adminis ó in ape i onealmen e (IP) una solución anes ésica disuel a en sue o
isiológico, consis en e en 80 mg/kg de ke amina (Imalgene 1000, Me ial) y 8 mg/kg de
xilacina (Rompun, Baye Heal hCa e) pa a a a, y 100 mg/kg de ke amina, 20 mg/kg de
xilacina pa a a ón. T as la in e ención se adminis ó subcu áneamen e (SC) sue o
isiológico pa a e i a la deshid a ación causada po la anes esia, y ke op o eno
(O udis 100 mg, Sano i A en is) a una dosis de 2,5 mg/kg como analgésico pa a a a y
a ón. T as la ci ugía, con el in de ealiza un seguimien o exhaus i o de la inges a y el
peso co po al, los animales se es abula on indi idualmen e. Las die as u ilizadas se
de allan en los diseños expe imen ales. Se u ilizó die a es ánda y die a de icien e en
me ionina y colina (MCD).
Al inal de los p ocedimien os, cuando se eque ía la colección de
mues as/ ejidos, los animales ue on sac i ica on po decapi ación. Las mues as de
ejido ob enidas po disección, se exponían a ápida congelación en anhíd ido
ca bónico sólido (nie e ca bónica) y pos e io men e almacenadas a – 80 oC (análisis de
RNA, p o eína, alo es sé icos); pa a análisis his ológicos se les in oducía en
pa a o maldehído 10% pa a su pos e io inclusión en pa a ina. Pa a es udios a ni el
cen al, las a as se anes esiaban y se p ocedía a su pe usión in aca diaca con sue o
salino pa a elimina oda la sang e del o en e y pos e io men e con
pa a o maldehído 10%.
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
81
Técnicas expe imen ales in i o.
2.
2.1 Canulación in a ce eb o en icula (ICV)
Es a in e ención se ealiza pa a ene acceso al en ículo la e al del ce eb o de
a a o a ón. La inyección de di e sas sus ancias en dicho en ículo, pe mi e el acceso
de las mismas al hipo álamo.
Pa a ello se u iliza on cánulas ab icadas a pa i de un ubo de polie ileno de 20 y
22 gauges pa a a a o a ón espec i amen e (PE-20 y PE 50, Bec o-Dickinson). El
ex emo de la cánula se ealiza de o ma biselada con un amaño de bisel de 0,5 mm y
una dis ancia desde el ex emo a un ope inco po ado p e iamen e de 4 mm pa a a a
y 2,5 mm pa a a ón. El o o ex emo de la cánula queda sellado has a el día del
expe imen o. El p ocedimien o equie e anes esia gene al. A con inuación se ealiza
un co e en sagi al en la piel que ecub e la cabeza, dejando la pa e supe io del
c áneo al descubie o. Se limpia bien la zona has a que el b egma queda al
descubie o, siendo és e el pun o de o igen pa a la implan ación de la cánula. La
cánula se implan a en el lado de echo o izquie do (asignado alea o iamen e) del
en ículo la e al [desde el b egma: -0,9 mm an e opos e io (AP), ±1,5 mediola e al
(L), -3,50 mm do so en al (DV) en a as; -0,6 mm AP, ±1,2 mm L, 2 mm DV en
a ones]. Una ez implan ada se adhie e al c áneo con cianoc ila o. Una ez se haya
secado, se cie a la abe u a cosiendo con seda qui ú gica o cianoc ila o según
con enga.
2.2 Bombas osmó icas
Pa a la adminis ación c ónica de un compues o en el ce eb o, se u iliza on
bombas osmó icas de 7 días (modelo 2001 pa a a as, 1007D pa a a ones, Alze
Osmo ic Pumps) que libe an de o ma con inua y cons an e la sus ancia. En e 4-8
ho as an es de la in e ención, las bombas deben p epa a se e hid a a se con el
compues o en un baño a 37 oC; de es a o ma se asegu a que la sus ancia ya se es é
libe ando al implan a lo. Se ealiza on do ipos de in usión c ónica: en el en ículo
la e al y núcleo-especí ica.
- In usión en el en ículo la e al: as coloca la cánula ICV como se ha desc i o
p e iamen e, la bomba se une a la cánula median e un ubo de silicona de g ado
médico (Degania) y se sella la unión con cianoc ila o. La bomba se coloca bajo la piel
del animal en la zona e oce ical y se cose con seda qui ú gica.
- In usión núcleo-hipo alámica: en es e caso, se ealiza una adminis ación
bila e al del compues o al núcleo especí ico de la a a, median e dos bombas
osmó icas modelo 1007D. Pa a ello, se implan a on unas cánulas a medida (Plas ic
One) que consis en en un pedes al con dos en adas en di ección pos e io , una pa a
cada bomba, y dos salidas en di ección en al hacia cada núcleo. Pa a el núcleo
a cua o la medida en e las salidas en ales ue de 0,6 mm y una longi ud DV de 10,1

Ma e ial y mé odos
82
mm, implan ándose a -2,8 mm espec o al b egma. Pa a el núcleo la e al, la medida
en e las salidas en ales e a de 4 mm y una longi ud DV de 8 mm, implan ándose a -
2,9 mm espec o el b egma. Las bombas se unen al conec o median e ubo de silicona
y se sella la unión con cianoc ila o. La incisión se su u a con seda qui ú gica.
2.3 Es e eo axia
Tan o pa a la implan ación de bombas núcleo especí icas, como pa a la
adminis ación di ec a de algún compues o, se u iliza un apa a o es e eo áxico. Es e
ins umen o pe mi e localiza idimensionalmen e una zona pa a ealiza una
adminis ación localizada de cualquie sus ancia en el ce eb o.
En es e caso, la adminis ación se ealiza bila e almen e en di e en es núcleos
hipo alámicos. Cada núcleo iene una coo denada conc e a, u ilizando el b egma como
pun o de e e encia pa a la ob ención de las coo denadas es e eo áxicas an e o-
pos e io (AP), la e al (L) y do so- en al (DV), siguiendo las indicaciones del a las
es e eo áxico del ce eb o de a a y de a ón (360,361). El b egma es el pun o c aneal
en el que con luyen las su u as del hueso on al con los dos empo ales. Siguiendo las
indicaciones del a las, las coo denadas de los núcleos hipo alámicos es udiados ue on
las siguien es:
- Núcleo a cua o en a a: -2,8 mm AP; ± 0,3 mm L y 10,2 mm DV.
- Núcleo la e al en a a: -2,85 mm AP; ± 2 mm L; -8,1 mm DV.
- Núcleo en omedial en a a: -2,85 mm AP; ± 0,6 mm L; 10,1 mm DV.
- Núcleo la e al en a ón: -1,3 mm AP; ±1,1 mm L; -5,2 mm DV.
Una ez anes esiado el animal, se coloca en el es e eo áxico y se ija el c áneo en
los planos e ical y ho izon al. Se ealiza una incisión sob e la piel en di ección sagi al.
T as eba i la piel se localiza el b egma, y se de e minan las es coo denadas del
pun o de e e encia (AP, L y DV). A es as coo denadas les se án sumadas o es adas las
coo denadas de cada núcleo hipo alámico a es udio. Una ez localizada la zona se
p ocede á a ealiza el o i icio y la pos e io adminis ación de una sus ancia u ilizado
una je inga Hamil on 7001 KH 25 gauges o implan ando las cánulas núcleo especí icas
pa a la implan ación de bombas de bombas osmó icas explicado an e io men e. T as
ello, se su u a la abe u a con seda qui ú gica.
2.4 Adminis ación i al en la ena de la cola
Pa a pode modula la exp esión génica en el hígado, la adminis ación de ec o es
adeno i ales se ealiza desde la ena de la cola de a ones. La adminis ación po es a
ía asegu a la in ección del i us en el hígado con una ele ada especi icidad (362,363).
Es e p ocedimien o no equie e de anes esia al no se una in e ención in asi a. El
a ón se inmo iliza en un cepo especial que deja la cola lib e. Pa a isualiza la ena
con más cla idad, se empapa con un algodón la zona con alcohol de 96 o. Con una
aguja de 27 gauges, se adminis a el adeno i us a una dosis de 1*108 unidades i ales
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
83
(UV) en un olumen de 100 µL. T as el pinchazo, se p esiona la zona has a que no se
obse e ningún sang ado.
2.5 Canulación in a enosa (IV)
Es a écnica es á indicada pa a pode adminis a di ec amen e al o en e
sanguíneo sus ancias cuyo e ec o se e e lejado en la composición del sue o
sanguíneo; nos pe mi e adminis a y oma mues a sanguínea con el animal en lib e
mo imien o. La canulación se ealiza en la ena yugula como la co ec a ía de acceso
al sis ema ca dio ascula , debido a la p oximidad de la ena a la piel del cuello,
acilidad de disección y g an calib e. Pa a ello se ab ican cánulas de la siguien e o ma:
cánula de polie ileno PE-50 (Clay-Adams, Bec on-Dickinson) y con una longi ud de 8
cm; el ex emo que se á in oducido en la ena, lle a acoplado un ubo de silás ico de
4,5 cm pa a acili a su en ada. Den o de la cánula se inse a una guía de nylon de
calib e 30 y diáme o de 0,32 ajus ándose pe ec amen e al diáme o in e no de la
cánula. Es a guía e i a el sang ado y la ob u ación la de la cánula. El espacio esidual
in e no se ellena con un acei e ege al mine al ine e (Sigma) que, po su iscosidad,
e i a la en ada de sang e en la cánula ya colocada.
T as anes esia la a a, se ija el animal en posición supino y se disecciona la zona
de echa de la piel del cuello y el músculo has a e la ena yugula ex e na. Una ez
descubie a, se anuda con seda la pa e ce ical de la misma pa a e i a el pos e io
sang ado. A con inuación se hace un pequeño co e en la pa ed de la ena con una
mic o- ije a y se in oduce el ex emo de silás ico has a llega a la con luencia de la
ena ca a supe io y la au ícula de echa. Se ija la cánula a la ena y a los músculos
colindan es con seda qui ú gica. Pa a e i a moles ias en la a a y acili a es uso de la
cánula, se hace pasa la misma po un ayec o subcu áneo has a la zona e oce ical.
De es a o ma el ex emo de la cánula ex e na queda lib e pa a la adminis ación de
sus ancias o ex acción de mues a de sang e.
2.6 Vago omía qui ú gica
El p ocedimien o se ealiza en a as p e iamen e anes esiadas. La a a se
inmo iliza en posición supina y se ealiza una incisión abdominal en la línea media. El
hígado se mue e cuidadosamen e a la de echa pa a expone el esó ago. Al ededo del
mismo se localizan las amas do sales y en ales del ne io ago y cuidadosamen e se
diseccionan ambas. Pos e io men e se le ealiza un pun o de su u a al ex emo de
cada ama seccionada pa a e i a sang ados. Una ez inalizada la ago omía, los
músculos abdominales y la piel se su u an con seda. Los músculos abdominales y la
piel se su u an con seda qui ú gica. La e icacia de la ago omía se e aluó una semana
después de la ci ugía po la obse ación de hipe o ia del es ómago en a as pos
mo em. Sólo las a as que mos a on un aumen o e iden e en el amaño del
Ma e ial y mé odos
84
es ómago después de la ago omía se incluye on en el análisis. El g upo con ol de la
ci ugía se ealiza bajo el mismo p ocedimien o, pe o una ez expues o el esó ago con
las amas del ago se su u a la abe u a.
2.7 Regis o de la ac i idad de la ine ación simpá ica del ejido adiposo
blanco (SNA)
1
El egis o de la ac i idad ne iosa del simpá ico (SNA) se ealizó en a ones C57
BK/6J (Jackson Labo a o ies) con una edad comp endida en e las 14 y 16 semanas. Se
les ealizó una canulación ICV y se deja on ecupe a 7 días. T as la ecupe ación, los
a ones se e-anes esia on e inmedia amen e se in uba on po la áquea con un ubo
de polie ileno PE-50 pa a ealiza un in e cambio de lujo de ai e ambien al
en iquecido con O2. A con inuación se ealiza una canulación in a enosa en la ena
yugula de echa y el la a e ia ca ó ida izquie da pa a ealiza la pe usión de -
clo alosa como sedan e (dosis inicial de 12 mg/kg, dosis de man enimien o 6.25
mg/kg/ho a) po la yugula y pa a las mediciones hemodinámicas po la ca ó ida. La
empe a u a se moni o iza median e medición ec al, man eniéndola a 37ºC con
ayuda de una mesa qui ú gica con con ol de empe a u a y una lámpa a de
in a ojos. Con el a ón en la misma posición, se hace una incisión en la zona inguinal
pa a accede al ejido adiposo blanco pe igonadal del lado izquie do. Una ez expues a
la g asa se iden i ica un solo ne io mul i ib oso y se gene a un cha co de acei e
mine al de ele ado peso molecula . A con inuación se p ecede a su aislamien o y
disección lejos de ejido conec i o y de los asos sanguíneos. El ne io ya asilado se
coloca cuidadosamen e en un bipola de calib e 36 con elec odos de hilo de pla ino-
i idio y se sella con gel de silicona (Kwik -Sil; WPI, Sa aso a, FL). La señal de la SNA se
ampli icó has a 105 eces con un p eampli icado G ass P5 y il ado po un co e de
baja (100hz) y al a (1000 Hz) ecuencia espec i amen e. Es as señales ampli icadas y
il adas se di igen: i) un sis ema de al a oces y a un osciloscopio (modelo 54501A,
Hewle -Packa d Co) pa a la obse ación audi i a y isual de la SNA del ejido adiposo
y ii) po un con e ido análogo-digi al de MacLab (modelo 8S, ADIns umen s), dónde
se localizó la señal de uido de ondo, colocando el cu so de medición pa a de ec a el
núme o de picos po segundo po encima de ese umb al (his og ama de ecuencias).
T as odo el p ocedimien o qui ú gico, y la pues a a pun o del egis o del SNA, al
a ón se le deja es abiliza du an e 15-20 minu os. La ac i idad basal del ne io
simpá ico del ejido adiposo se egis ó du an e un pe iodo con ol de 10 minu os
seguido de una inyección ICV del ehículo (solución salina, 2 µl) o MCH (dosis de 5 o 10
µg, 2 µl). La medición de SNA de la g asa se egis ó de o ma con inuada du an e las
1
P ocedimien o ealizado po el D . Donald A. Mo gan y el D . Kammal Rahmouni, en el depa amen o
de a macología del Ca e College o Medicine de la Uni e sidad de Iowa, Ciudad de Iowa, EEUU.
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
85
siguien es 4 ho as. Pa a e alua el e ec o de la adminis ación ICV de MCH (10 µg) en la
ac i idad del ne io e e en e espec o al ne io a e en e, en algunos a ones, los
ne ios se co a on en la pa e dis al y p oximal espec i amen e en el luga de
egis o an es del a amien o. Cualquie ipo de ac i idad de ondo de ec ado en
es os a ones de ne ios seccionados se es a a la SNA del ejido adiposo gonadal.
2.8 Feno ipado me abólico
Pa a el eno ipado me abólico du an e los a amien os, se de e minó la
composición co po al u ilizando un apa a o de esonancia magné ica nuclea pa a
oedo es (NMR, Echo Medical Sys ems) y el gas o ene gé ico, inges a, ac i idad
locomo o a y asa de espi ación me abólica (RQ) u ilizando un sis ema de 12 cajas con
medición simul ánea de calo ime ía indi ec a (LAbMas e TSE Sys ems). El sis ema
pe mi e que se puedan medi los pa áme os de o ma con inua y simul áneamen e en
un máximo de 12 animales.
 Composición co po al.
An es y después de los p ocedimien os expe imen ales, la composición co po al
ue es imada median e el NMR pa a de e mina la a iación de masa g asa y mag a.
 Sis ema de calo ime ía indi ec a
Pa a el es udio de los ac o es que egulan la pa ición nu icional, se u ilizan
sis emas de eno ipado indi ec o o sis emas de calo ime ía indi ec a. Es e ipo de
sis ema nos pe mi e e leja el es ado nu icional del o ganismo en es udio bajo
di e en es condiciones gené icas, a macológicas u usando dis in os ipos de die a. El
calcula de o ma simul ánea la ac i idad locomo o a, la inges a y la asa de espi ación
me abólica. Con es as a iables se puede halla el gas o ene gé ico y es ablece
pa ones de pa ición nu icional en las di e en es condiciones de es udio.
Es e apa a o egis a el gas o ene gé ico, ac i idad locomo o a, inges a y asa de
espi ación. Cada 20 minu os, du an e 48 ho as, el LabMas e oma medidas de
inges a, consumo de O2 ( O2), p oducción de CO2 ( CO2) y ac i idad locomo o a en e
o os. Los animales se adap a on al nue o ipo de ambien e ins alándolos en cajas de
adap ación du an e 48 ho as an es de las mediciones. Con los alo es ob enidos, se
calculó la RQ de cada indi iduo du an e cada medición di idiendo el CO2 en e el O2
( CO2/ O2). El alo de gas o ene gé ico (EE) esul an e (kcal/48h) ue ambién
no malizado con el peso o al del animal o con la masa mag a, medido al inal del
p oceso con NMR (EE/g masa mag a). La ac i idad locomo o a se de ec a u ilizando
unos senso es de luz in a oja que egis an el mo imien o en sen ido ho izon al y
e ical.
- Tasa de espi ación me abólica ( espi a o y quo ien ; RQ)
Nos pe mi e de ec a cuál es el p incipal combus ible oxidado en el o ganismo
es udiado. La RQ es, en é minos de medición, la elación en e el olumen de CO2
Ma e ial y mé odos
92
3.2 Análisis de p o eína po wes e n blo
Pa a de e mina los ni eles de exp esión p o eica de los di e en es expe imen os,
ealizamos la écnica de wes e n blo de la que se ob iene como esul ado una imagen
o og á ica en la que sólo se discie nen aquellas p o eínas con a las que se haya
añadido un an icue po po inmunode ección indi ec a. La imagen se ob iene po la
imp esión en una placa adiog á ica de la quimioluminiscencia p o enien e de una
memb ana en la que se inmo iliza on las p o eínas de una mues a, sepa adas po su
peso molecula median e elec o o esis SDS-PAGE. De es a o ma se puede es udia la
p esencia de la p o eína en el ex ac o y analiza su can idad ela i a espec o a una
p o eína cons i u i a usada como con ol de ca ga p o eica.
3.2.1 Ex acción de p o eína
De las mues as de ejido conse adas a -80 oC, se ob u o una pequeña po ción
pa a su p ocesado. Du an e odo el p oceso las mues as se deben de man ene en
hielo du an e el pa a e i a la deg adación de las p o eínas. El ejido y el ampón de
lisis se colocan jun o con una boli a de ace o en un ubo de polip opileno de 2 ml y se
homogeniza en el Tissue lyse . El ampón de lisis (Tabla 4) acili a, jun o con la
homogenización mecánica, la o u a del ejido y los componen es celula es
disol iéndose las p o eínas del ejido en el mismo.
Tampón de lisis
T is-HCl pH 7,5
50 mM
EGTA
1 mM
EDTA
1 mM
T i ón X-100
1% ol/ ol
O o anada o Sódico
1 mM
Fluo u o Sódico
50 mM
Pi o os a o Sódico
5 mM
Saca osa
0,27 M
Fluo u o de enilme ilsul onilo
1 mM
Cock ail inhibido p o easas
(ROCHE)
1 pas illa/50 mL
T as las homogenización las mues as se cen i ugan a 13200 pm a 4 oC du an e
30 minu os. A con inuación el sob enadan e (ex ac o p o eico) se alicuo ea a un ubo
nue o, desca ando el p ecipi ado (núcleos y a e ac os de ejido) y la posible capa
supe io de g asa. En el caso de las mues as de ejido adiposo e hígado es ea ósico se
deben de ealiza a ias cen i ugaciones sob e el ex ac o inicial pa a desca a la
g asa.
Tabla 4| Componen es del ampón de lisis disuel o en agua des ilada.

E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
93
3.2.2 Cuan i icación de p o eínas
Pa a cuan i ica las p o eínas con enidas en el ex ac o ealizamos un mé odo
colo imé ico con la solución de B ad o d (Bio- ad P o ein Assay Ki ). El mé odo se
basa en el cambio del colo ma ón del colo an e azul comassie G250 en un medio con
ácido os ó ico (abso bancia 466 nm) al azul en p esencia de p o eínas. El colo an e es
de na u aleza hid o óbica y se in oduce en el in e io de las es uc u as p o eicas,
e i ando su con ac o en el ácido os ó ico de la solución omando su o iginal onalidad
azul (595 nm). Pa a la de e minación en nues as mues as ealizamos una cu a
pa ón de se o-albúmina bo ina (BSA), ealizando una cu a de diluciones se iadas a
pa i de la máxima concen ación (1 mg/mL). Realizamos una dilución de las mues as
pa a pode ealiza la cuan i icación de 1:50 pa a el hígado y 1:25 pa a la g asa. Todas
las mues as se miden po duplicado jun o con la ec a pa ón, el pun o 0 y la solución
de B ad o d en un espec o o óme o a 550 nm. P e iamen e la mezcla de las
mues as con el B ad o d se incuba a 37 oC du an e 7 minu os.
3.2.3 P epa ación de las mues as pa a elec o o esis en SDS-PAGE
T as la cuan i icación debemos p epa a las mues as jun o con el ampón de
ca ga ( ampón de Laemmli, abla 5). Es e ampón pe mi e do a a odas las p o eínas
de ca ga nega i a en p opo ción a su amaño g acias al dodecil-sul a o sódico (SDS), y
pe mi e la desna u alización de las p o eínas con el β-me cap oe anol, eliminado los
puen es disul u o. Todas las mues as deben ene la misma concen ación inal pa a
que en el olumen de ca ga en la elec o o esis (16 µl) haya 20 µg de p o eína de
hígado, 30 µg de p o eína de g asa y 12 µg de p o eína de ce eb o. T as añadi el
ampón de ca ga y siemp e p e iamen e a ealiza la elec o o esis, las mues as
deben calen a se a 95 oC du an e 5 minu os pa a su comple a desna u alización. Una
ez u ilizadas se almacenan a -20 oC. El ex ac o o iginal de p o eínas sin ampón de
ca ga se debe almacena a -80 oC.
La elec o o esis SDS-PAGE consis e en la sepa ación de las p o eínas po su peso
molecula . Se incluyen las p o eínas desna u alizadas y de ca ga nega i a en un gel de
ac ilamida-bisac ilaminda. Al aplica le una co ien e eléc ica, las p o eínas mig an a
a és del gel hacia el polo posi i o de la co ien e, sepa ándose po su peso molecula
en g adien e de mayo a meno .
Tampón Laemmli
T is-HCl pH 6,7
250 mM
Glice ol
50% ol/ ol
SDS
10% peso/ ol
β-Me cap oe anol
5% ol/ ol
Azul de b omo enol
0,0005 % peso/ ol
Tabla 5| Composición del ampón de Laemmli
disuel o en agua des ilada.
Ma e ial y mé odos
94
3.2.4 Elec o o esis en SDS-PAGE
La elec o o esis SDS-PAGE consis e en la sepa ación de las p o eínas po su peso
molecula . Se incluyen las p o eínas desna u alizadas y de ca ga nega i a en un gel de
ac ilamida-bisac ilaminda (30% Ac ilamida/Bis 29:1; Bio-Rad). Al aplica le una co ien e
eléc ica, las p o eínas mig an a a és del gel hacia el polo posi i o de la co ien e,
sepa ándose po su peso molecula en g adien e de mayo a meno . La concen ación
de ac ilamida-bisac ilaminda de e mina á el amaño del po o de la malla o mada po
el gel, y po an o el g ado de sepa ación de las p o eínas según su amaño. El gel es á
o mado po dos acciones:
- Gel concen ado : se localiza en la pa e supe io sob e el que se incluye un
peine pa a o ma pocillos y pode in oduci la mues a. Es e gel de 5% pe mi e
homogeniza la en ada de las p o eínas en el gel sepa ado (Tabla 6).
- Gel sepa ado : que pe mi e la sepa ación de las p o eínas po el peso
molecula El po cen aje de ac ilamida-bisac ilamida a ía en unción del amaño de las
p o eínas que que amos es udia . En nues o caso los po cen ajes ondan en e el 8%
y el 12 % (Tabla 7).
Los geles se mon an en la cube a de elec o o esis jun o con el ampón de
elec o o esis (Tabla 8) que pe mi e la asmisión del ol aje. Se añaden las mues as
jun o con un ma cado de p o eínas colo eadas de peso molecula conocido (Bio- ad) y
se conec a a la uen e de alimen ación a un ol aje de en e 80-100 V.
Gel concen ado 5%
H2O des ilada
4,1 mL
30% Ac ilamida/Bis
1 mL
T is-HCl 1 M pH 6.8
0,75 mL
10% SDS
0,06 mL
10% pe sul a o amónico
0,06 mL
TEMED
0,006 mL
Gel sepa ado
8%
10%
12%
H2O des ilada
11,5 mL
9,9 mL
8,2 mL
30% Ac ilamida/Bis
6,7 mL
8,3 mL
10 mL
T is-HCl 1 M pH 6.8
6,3 mL
6,3 mL
6,3 mL
10% SDS
0,25 mL
0,25 mL
0,25 mL
10% pe sul a o amónico
0,25 mL
0,25 mL
0,25 mL
TEMED
0,015 mL
0,01 mL
0,01 mL
Tampón de elec o o esis
T is-HCl
200 mM
Glicina
20 mM
SDS
1% peso/ ol
Tabla 6| Composición del gel SDS-
PAGE concen ado .
Tabla 7| Composición de geles SDS-PAGE sepa ado a
po cen ajes 8, 10 y 12.
Tabla 8| Composición del ampón de
elec o o esis disuel o en agua des ilada.
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
95
3.2.5 T ans e encia semi-húmeda
Una ez que las p o eínas se sepa a on en el SDS-PAGE, las p o eínas con enidas
en el gel se ans ie en a una memb ana de poli luo u o de inilideno (PVDF;
Immobilon-P, Millipo e) pe mi iendo que las p o eínas queden ijadas quedan ijadas e
inmo ilizadas que pe mi e el p oceso de inmunode ección. El p oceso de ans e encia
del gel a la memb ana es de nue o dependien e del ol aje, en es e caso se ealiza en
un sopo e ho izon al donde se ponen ambos en con ac o aco ados po papel
abso ben e empapado de ampón de ans e encia (Tabla 9) que a o ece la
asmisión de la co ien e en el p oceso. Las p o eínas pasan del gel de ac ilamida a la
memb ana de PVDF donde quedan inmo ilizadas. El p oceso se ealiza a ampe aje
cons an e 0,8 mA po cm2 du an e una ho a y 40 minu os.
3.2.6 Inmunode ección
- Bloqueo: en p ime luga , se ealiza el bloqueo de la memb ana ecién
ans e ida. Es e p oceso consis e en incuba la memb ana du an e una ho a a
empe a u a ambien e en agi ación con una solución de BSA al 5% disuel o en ampón
de la ado (TBS-T, Tabla 10). El BSA en disolución se une a odos aquellos luga es de la
memb ana que no es én ocupados po las ans e idas desde el gel. De es a o ma, los
an icue pos sólo pod án uni se a su an ígeno especí ico, educiendo el uido de ondo
y las inespeci icidades. En ocasiones, hay an icue pos que son más inespecí icos y en
es os casos se bloquea con leche en pol o desna ada al 5%.
- An icue po p ima io: as el bloqueo de la memb ana se incuba con el
an icue po especí ico con a la p o eína de es udio (Tabla 11). El an icue po se diluye
según las ins ucciones del ab ican e (1:500/1:1000) en TBS-T al 3% y se deja
incubando en agi ación una ho a a empe a u a ambien e o oda la noche a 4 oC. T as
la incubación se e i a el an icue po y se ealizan 3 la ados de 5 minu os cada uno con
TBS-T.
- An icue po secunda io: pa a de ec a la p esencia de la p o eína y ampli ica la
señal del an icue po p ima io, se incuba la memb ana con un an icue po secunda io
Tampón de ans e encia
T is-HCl
40 mM
Glicina
40 mM
SDS
0,36% peso/ ol
Me anol
20% ol/ ol
Tampón de la ado (TBS-T)
T is-HCl
20 mM
NaCl
146 mM
Tween-20
0,1% ol/ ol
Tabla 9| Composición del ampón de
ans e encia disuel o en agua des ilada.
Tabla 10| Composición del ampón de
la ado de memb anas disuel o en agua
des ilada.
Ma e ial y mé odos
96
asociado a pe oxidasa que econoce la pa e cons an e del p ima io. Se diluye en
solución de incubación a una concen ación de 1:5000. El ipo de secunda io u ilizado
end á de e minado po el ipo de huésped en el que se gene ó el an icue po
p ima io.
- Quimioluminiscencia: pa a de ec a el an icue po secunda io, se incuba la
memb ana con el sus a o de la pe oxidasa y un po enciado de quimioluminiscencia
(Pie ce® ECL wes e n blo subs a e, The mo Scien i ic) a olúmenes iguales (1:1)
incubándose en agi ación 1 minu os en oscu idad. Inmedia amen e después, pa a
de ec a la luz emi ida esul an e de la eacción del sus a o con la pe oxidasa, se
coloca la memb ana en un case e de au o adiog a ía y se expone a una película
o og á ica (Fuji ilm). T as el e elado a dis in os iempos u ilizando líquidos de
e elado y ijado en una sala oscu a, se obse a el esul ado de la in e acción de los
an icue pos con la p o eína de la mues a.
- Análisis de esul ados: pa a analiza los da os, se digi alizan las imágenes de las
placas o og á icas median e un escáne de al a esolución. Pa a de e mina la
can idad ela i a de p o eína en cada mues a, se u iliza el p og ama ImageJ 1.46
(Wayne Rasband, Na ional Ins i u es o Heal h, USA; h p://imagej.nih.go /ij), que
de ec a la can idad de píxeles de la imagen de la p o eína en odas las mues as de una
misma placa adiog á ica. El á ea de medición debe se igual pa a odas las mues as.
Es os alo es se ela i izan espec o al con ol cons i u i o (β-ac ina), que debe se
de ec ada po cada gel de elec o o esis. El alo inal es no malizado y po cen uado
espec o al g upo con ol de cada expe imen o.
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
97
ANTICUERPO
TAMAÑO
DILUCIÓN
CASA COMERCIAL
REFERENCIA
ACC
265 kDa
1:5000
Millipo e
#04-322
os o-ACC (Se 79)
257 kDa
1:1000
Millipo e
#07-303
AMPKa1
63 kDa
1:1000
Millipo e
#07-350
AMPKa2
63 kDa
1:1000
Millipo e
#07-363
os o-AMPKal a (Th 172)(40H9)
63 kDa
1:1000
Cell Signalling
#2535
Lipop o ein-lipasa (LPL)
56 kDa
1:1000
San a c uz bio echnology
sc-32885
HSL (lipe)
90-117 kDa
1:1000
Abcam
ab-45422
os o HSL (se 680)
81-83 kDa
1:1000
Cell Signalling
4126
UCP 1
33 kDa
1:1000
Abcam
ab23841
CPT1M (H-120)
75 kDa
1:1000
San a c uz bio echnology
sc-20670
FAS (H-300)
270 kDa
1:1000
San a c uz bio echnology
sc-20140
PGC-1 (H-300)
90 kDa
1:1000
San a c uz bio echnology
sc-13067
CIDE-A (N-19)-R
26 kDa
1:1000
San a c uz bio echnology
sc-8730-R
JNK1/3 (C-17)
46-54 kDa
1:1000
San a c uz bio echnology
sc-474
os o-SAPK/JNK(Th 183/Ty 185)
46-54 kDa
1:1000
Cell Signalling
#4671
Caspasa-3 (8G10)
17, 19, 35 kDa
1:1000
Cell Signalling
9665
Clea ed Caspasa 3 (ASP 173)
17, 19 kDa
1:1000
Cell Signalling
9664
BIP(GRP78)
78 kDa
1:1000
Cell Signalling
#3183
XBP1
29 kDa
1:1000
San a c uz bio echnology
sc-7160
CHOP (GADD R-20)
26 kDa
1:1000
San a c uz bio echnology
sc-793
IRE 1
110 KDa
1:1000
Abcam
ab-37073
os o-IRE1 (Se 724)
110 kDa
1:1000
No us Biologicals
NB100-2323
el 2 α
36 kDa
1:1000
San a c uz bio echnology
sc-11386
os o-eI 2α
36 kDa
1:500
San a c uz bio echnology
sc-101670
β Ac in
42 kDa
1:5000
Sigma
A 5316
phospho-PERK (Th 981)
125 kDa
1:1000
San a c uz bio echnology
sc-32577
GFP
30 kDa
1:5000
Abcam
ab290
p o-MCH
40-54 kDa
1:1000
San a c uz bio echnology
sc-28931
MCH-R1
45 kDa
1:1000
Abno a
PAB16225
AGRP
14 kDa
1:500
Abcam
ab32882
kappa-opioide Recep o 1
42 kDa
1:1000
Sigma
SAB2501442
P odino ina
35 kDa
1:1000
Abcam
ab11137
c-Fos
50 kDa
1:1000
San a c uz bio echnology
sc-52
an i-DSRed Exp ess
37 kDa
1:5000
Clon ech
#632496
IgG-CY5 cab a
secunda io
1:5000
Jackson labs
705-175-147
IgG-CY3 conejo
secunda io
1:5000
Jackson labs
711-165-152
IgG-HPRT a ón
secunda io
1:5000
Dakocy oma ion
P0260
IgG-HPRT conejo
secunda io
1:5000
Dakocy oma ion
P0448
IgG-HPRT cab a
secunda io
1:5000
Dakocy oma ion
P0449
Tabla 11| Lis a de an icue pos u ilizados pa a la inmunode ección po wes e n blo o
inmunohis oquímica.

Ma e ial y mé odos
98
3.3 Análisis his ológico de ejido cen al y pe i é ico
Pa a de e mina cómo los di e en es a amien os y die as a ec an a la mo ología
y con enido de g asa del hígado y del ejido adiposo blanco, se ealiza on es écnicas
his ológicas: Oil- ed O, hema oxilina-eosina y ic ómico de Masson. Pa a obse a la
dis ibución ana ómica de los g upos neu onales en las secciones de onco encé alo se
ealizó la inción de Nissl. T as las inciones se obse a on y o og a ia on los co es
con un mic oscopio (Zeiss) u ilizando los obje i os de 10, 20 y 40 aumen os.
3.3.1 Tinción Oil- ed O
Es a inción colo ea las go as lipídicas del ejido en un ono ojizo. Pa a ello
secciones congeladas de hígado se co a on en un c ios a o (8 µm) y se coloca on en
po as. Es os po as se sume gie on en inción Oil-Red O du an e 10 minu os. Después
se la a on en H2O des ilada y se con a iñe on con hema oxilina Meye s du an e 3
minu os. Los po as se mon a on en medio de mon aje acuoso. Tinción
hema oxilina/eosina.
Es a écnica iñe las es uc u as celula es mos ando de o ma gene al, la
es uc u a del ejido. La hema oxilina es de na u aleza ca iónica (básica) po lo que
iñe de azul es uc u as basó ilas (de na u aleza ácida) como los núcleos celula es. Po
o o lado, la eosina es de na u aleza ácida iñendo de osa es uc u as de na u aleza
básica (acidó ilas) como el ci oplasma. Pa a la inción, el ejido debe de es a incluido
en pa a ina p e ia pe usión del animal. Los co es de pa a ina son p epa ados con
xilol pa a elimina los excesos de la misma. Después se pasan los co es po un p oceso
de ehid a ación, consis en e en alcoholes de concen ación dec ecien e (100º, 95º y
70º). T as un la ado con H2O des ilada se sume ge en hema oxilina du an e 10
minu os, se la a e inmedia amen e se pasa po un alcohol ácido. T as la a lo se
sume ge 30 segundos en eosina. Pa a deshid a a la mues a se pasan los co es po
mismo los alcoholes en g aduación c ecien e, y an es de mon a se deja sume gido 10
minu os en xilol.
3.3.2 Tinción ic ómica de Masson
En es e caso, la inción es una combinación de es inciones que ema ca los
depósi os de colágeno al mismo iempo que la es uc u a del ejido, en es e caso el
hígado. La es uc u a celula se obse a ojo/ osado, los núcleos de iole a y el
colágeno azul in enso. Pa a la inción, el ejido debe de es a incluido en pa a ina
p e ia pe usión del animal. Los co es del ejido pa a inado (8 μm) se despa a inan
sume giéndolos en xileno en du an e unos 10-15 minu os. Las secciones
pos e io men e se hid a an con la ados se iados en alcoholes de 100o, 96o, 70o, y 50o;
después se la an con agua des ilada. T as el la ado, se sume gen los co es en
hema oxilina du an e 3 minu os, se la a e inmedia amen e y se sume ge en ojo
Masson du an e 5 minu os. Pa a e i a el exceso de ojo, se incuban con ácido
os omolíbdico du an e 6 minu os. T as un la ado en agua des ilada, se iñe con azul
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
99
de anilina du an e 2 minu os. Se uel en a la a los co es, y se p ocede a deshid a a
con alcohol, se acla a con xileno y se mon an los po as con los cub es y acei e
balsámico sin é ico.
3.3.3 Tinción de Nissl
La inción de Nissl del onco encé alo, se ealizó siguiendo el p o ocolo de
Bielschowsky-Plien añadiendo un 0,1% de iole a de c esilo. El colo an e iole a de
c esilo, es una anilina básica (con ca ga posi i a) que se une a las egiones basó ilas de
las células del ejido ne ioso. Es a inción ue elegida po su idoneidad pa a el es udio
de de alles ci ológicos y ci oa qui ec ónicos.
Se ex ae el onco-encé alo si uado en la base del ce eb o de la a a pe undida.
EL ejido queda en o malina 10% du an e 24 ho as. A con inuación se ans ie en a
ampón os a o 0,1 M du an e 1 ho a. Median e el uso de un ib o omo (Vib a ome
Se ies 1000, The Vib a ome Company) se ealizan secciones de 50 µm de g oso y se
ecogen en el ampón os a o 0,1 M.
T as un pa de la ados con agua des ilada, se sume ge ca bona o de li io 5%
du an e 10 minu os. T as es a ios la ados con alcohol 70º, se ealizó o o inal con
agua des ilada. Los co es se incuba on du an e 6 minu os en una solución 0,1% de
iole a de c esilo. T as 3 la ados con alcohol a 96o seguido de o os es la ados con
alcohol 100o, los co es se acla a on con xilol y se mon a on en po as con acei e
balsámico sin é ico.
3.4 Inmunohis oquímica
Con es a écnica se p e ende de ec a en el p opio ejido la p esencia y
localización de de e minadas p o eínas. En ocasiones ambién se equie e de e mina
la co-localización celula de dos p o eínas di e en es. El p oceso depende á no sólo del
ipo de ejido, sino ambién del ipo de mé odo pa a e ela la señal (diaminobenzidina
(DAB), luo escencia), de las ca ac e ís icas del an icue po. En es e abajo se ealizó
inmunohis oquímica en ce eb o e hígado de a a y a ón. Pa a el e elado de la señal
se u ilizó an o DAB como luo escencia. Pa a ealiza las inmunohis oquímicas, el
animal debe de se p e iamen e pe undido con o malina al 10% al y como se ha
desc i o con an e io idad.
3.4.1 De ección de c-Fos en el onco-encé alo
Se ex ae el onco-encé alo si uado en la base del ce eb o de la a a pe undida.
El ejido queda en o malina 10% du an e 24 ho as. A con inuación se ans ie en a
ampón os a o 0,1 M du an e 1 ho a. Median e el uso de un ib o omo (Vib a ome
Se ies 1000, The Vib a ome Company) se ealizan secciones de 50 µm de g oso y se
ecogen en el ampón os a o 0,1 M.
Pa a la de ección inmunohis oquímica de la exp esión de c-Fos, se incuba on
secciones con an icue po p ima io c-Fos en lo ación en dilución 1:1000 du an e oda
Ma e ial y mé odos
100
la noche a 4 oC; al inaliza se hicie on 2 la ados de 10 minu os con ampón os a o 0,1
M. Pa a inhibi la pe oxidasa endógena, y e i a que el sis ema de de ección mues e
alsos posi i os, se incuba on los co es con H2O2 al 3% en agua des ilada du an e 10
min y se hicie on nue amen e 2 la ados con ampón os a o 0,1 M de 10 minu os.
Como sis ema de de ección se u ilizó el ki EnVision policlonal (políme o de
dex ano conjugado con an icue pos an i-conejo y con pe oxidasa; Dako,) du an e 30
minu os. Se p epa a el DAB pa a la de ección po eacción con pe oxidasa según las
ins ucciones del ab ican e (1 go a de DAB en 1 mL del disol en e suminis ado;
Dako). T as el EnVision, se hicie on 2 la ados de 10 minu os y se incubó con DAB
du an e 10 minu os. Al inaliza la eacción, las secciones se ex ienden en po as
xilanizados (His obond, Ma ien ield-Supe io ) has a que es én secos. Pos e io men e
se deshid a a on en e anol, se acla a on en xileno y se mon a on con un medio de
mon aje pe manen e. La eacción ue obse ada y o og a iada bajo un mic oscopio de
luo escencia P o is AX70 (Olympus Co po a ion). P e ia iden i icación del núcleo
do sal del ne io ago en el onco encé alo, iden i icado po la inción de Nissl, se
de e minó median e el uso del p og ama ImageJ, el núme o de células eñidas en cada
sección como núme o ep esen a i o de células con inmuno- eac i idad posi i a a c-
Fos.
3.4.2 De ección de la p o eína e de luo escen e (GFP) en el ce eb o
Los ce eb os pe undidos se sume gen en o malina al 10% du an e 24 ho as y
con inuación se ans ie en a ampón os a o 0,1 M. Se co a on secciones de 50 µm
de g oso en el ib a omo. Pa a la inmuno luo escencia, las secciones se incuba on en
lo ación du an e oda la noche a 4ºC con an i-GFP de conejo diluido 1:1000 en PBS.
T as dos la ados de 5 minu os en ampón os a o 0,1 M las secciones se incuba on 1
ho a a empe a u a ambien e, con an i- agmen o F (ab´)2 AlexaFluo ® 488 (Molecula
P obes) en una dilución 1:200. Las secciones se mon a on en po as y se cub ie on con
medio de mon aje luo escen e. La luo escencia ue obse ada y o og a iada bajo un
mic oscopio de luo escencia P o is AX70 (Olympus Co po a ion).
3.4.3 Inmunohis oquímica en mues as pa a inadas.
Se ex ae el hígado de a ones y el ce eb o de a as p e iamen e pe undidos y se
sume ge en o malina 10% du an e 24 ho as. T as la comple a ijación, se pa a ina el
ejido y se co a en secciones de 8 µm. A con inuación se elimina la pa a ina y se
ehid a a. Pa a inaliza , se p ocede a la exposición o ecupe ación an igénica
some iendo las secciones du an e dos minu os y po dos eces a mic oondas de 800w.
T as un p e a amien o con ci a o 10 mM pa a el análisis de BIP y MCH-R1 y T is-
EDTA 10 mM pa a el GFP, las secciones se incuban consecu i amen e en 1) an i-GRP78
de conejo, an i-MCH-R de conejo o an i-GFP de conejo a la dilución de 1:200 1:300 o
1:1000 espec i amen e oda la noche a 4 oC pa a GRP78 y MCH-R1, y 1 ho a a
empe a u a ambien e pa a GFP; 2) pa a bloquea la pe oxidasa endógena y e i a
alsos posi i os, se incuba pe óxido de hid ógeno al 3% du an e 10 minu os; 3) se
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
101
incuba con el an icue po secunda io du an e 30 minu os (En ision® HRP an i- abbi ,
Dakocy oma ion); 4) se incuba con el sis ema DAB de inmunode ección (3,3´-
diaminobenzidine e ahyd ochlo ide; Dako) du an e 10 minu os. En e cada uno de los
pasos de incubación, las secciones se la an dos eces du an e 10 minu os en ampón
os a o salino (PBS; 100 mM ampón os a o, 0,656 M NaCl) y as el DAB el la ado se
ealiza con agua des ilada. Pa a inaliza , los co es incubados se dehid a an la ando
dos eces con xileno y se cub en con medio DePex Gu ® (VWR). T as las inciones se
obse a on y o og a ia on los co es con un mic oscopio (Zeiss) u ilizando os obje i o
de 10, 20 y 40 aumen os.
3.4.4 Doble Inmunohis oquímica en ce eb o de a ón
2
La doble inmunohis oquímica se ealizó sob e ce eb os p e iamen e pe undidos
de a ones ansgénicos de geno ipo Mch 1-c e/ dToma o
3
. Pa a expone los luga es
an igénicos y educi la unión no especí ica de los eac i os inmunohis oquímicos, las
secciones se a a on con H2O2 al 0,5% disuel o en PBS 0,1 M du an e 10 minu os; y
con unas solución de pepsina (10 mg/ml en solución 0,2 M HCl) du an e 5 minu os a 37
oC. Después, las secciones se bloquea on con BSA al 2% en PBS du an e 30 minu os
pa a e i a la unión inespecí ica de an icue pos. T as el p e a amien o, se incuba on
en una solución con la mezcla del an i-KOR de cab a (2 µg/mL) y an i-DSRed Exp ess de
conejo (1:1000) du an e 24 ho as a 4 oC. T as la incubación con los an icue pos
p ima ios, se incuba os con los espec i os secunda ios an i-cab a IgG CY5-mono
(1:2000) y an i-conejo IgG CY3-mono (1:3000). Los co es se mon a on en po as de
c is al, se cub ie on y isualiza on en un mic oscopio con ocal (Nikon A1R).
2
P ocedimien o ealizado po el D . Im e Kalló y el D . Zsol Liposi s en el labo a o ios de Neu obiología
endoc ina, Ins i u o de Medicina expe imen a, Academia húnga a de ciencia, Budapes , Hung ía.
3
Ra ones gene ados y cedidos po la D a. Melissa J Chee y la D a. Ele he ia Ma a os-Flie del
depa amen o de Endoc inología, Cen o médico Be h Is ael Deaconess, depa amen o de Medicina,
Facul ad de Medicina, Uni e sidad de Ha a d, Bos on, EEUU.
Ma e ial y mé odos
108
G upos expe imen ales IP: G upos expe imen ales IP:
- IV-Salino - IP-Salino
- IV-MCH - IP-MCH
- IV-MCH pai - ed
T as la in e ención IV y du an e la adminis ación IP, los animales se es abula on
en indi idual y se moni o izó dia iamen e la inges a y el peso du an e la adminis ación
de MCH.
5.4 Es imulación de lipólisis po isop o enol
Pa a de e mina si la adminis ación c ónica ICV de MCH mediaba la lipólisis
pe i é ica del ejido adiposo en a a, se adminis ó in ape i onealmen e (IP)
isop o enol (10 mg/kg) (Sigma Ald ich) a a as as 7 días con a amien o c ónico ICV
de MCH (10 µg/día). T as la adminis ación IP de isop o enol, se ex ajo una mues a
de sang e po capila idad de la ena de cola a 0, 30, 60, 90, 120 y 240 minu os. T as
aisla el sue o se de e minó la concen ación de ácidos g asos lib es (AGL).
G upos expe imen ales:
- ICV-Salino ad libi um + isop o enol IP
- ICV-MCH ad libi um + isop o enol IP
- ICV-MCH pai - ed + isop o enol IP
T as la in e ención, los animales se es abula on en indi idual y se moni o izó
dia iamen e la inges a y el peso.
Die a es ánda
Bombas ICV-MCH
Ra a 10 µg/día
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
Día 0
Día 7
Isop o enol IP
Ex acción sang e
0, 30, 60, 90, 120 y 240 min
Die a es ánda
Adminis ación IV MCH
Ra a 10 µg/día
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
Día 0
Día 7
Día -5
Canulación IV

E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
109
5.5 Bloqueo a macológico del ER-s ess
Pa a escla ece el papel del ER-s ess como mediado de los e ec os de MCH en el
me abolismo lipídico del hígado en a a, jun o con la adminis ación c ónica ICV de
MCH (10 µg/día), se co-adminis ó cada 12 ho as IP una chape ona química que
esuel e el ER-s ess, el ácido au oso-deoxicólico (TUDCA). La dosis dia ia de TUDCA
ue de 250 mg/kg, el ehículo del TUDCA es ampón os a o salino (PBS). El TUDCA se
adminis ó du an e 7 días desde la implan ación de las bombas osmó icas ICV.
G upos expe imen ales:
- ICV-Salino + PBS IP
- ICV-MCH + PBS IP
- ICV-Salino + TUDCA IP
- ICV-MCH + TUDCA IP
T as la in e ención los animales se es abula on en indi idual y se moni o izó
dia iamen e la inges a y el peso.
5.6 Bloqueo gené ico del ER-s ess hepá ico
O a ap oximación más exac a pa a la inhibición del ER-s ess el hígado, consis ió
en la adminis ación po la ena de la cola, de un ec o adeno i al que sob e-exp ese
la chape ona GPR78 (1*108 UV/100 µl) (Vi aQues ). Debido a las ca ac e ís icas
biológicas del adeno i us, la in ección y sob e-exp esión del gen que po a es de acción
inmedia a, pe o el e ec o es ansi o io, du ando unos 7 días. El mismo día que la
implan ación de bombas osmó icas ICV pa a la adminis ación c ónica de MCH (2,5
µg/día). La especi icidad de la écnica se demues a po una mayo in ección en el
hígado espec o a o os ó ganos como el bazo o la g asa epididimal (Imagen 31).
Die a es ánda
Bombas ICV-MCH
Ra a 10 µg/día
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
Día 0
Día 7
TUDCA IP (250 mg/kg/día)
WAT
GFP
βac ina
Imagen 31. Exp esión de GFP en ex ac os p o eicos de
hígado, bazo y g asa epididimal de a ones, una semana
después de la adminis ación po la ena de la cola de
adeno i us que sob e-exp esan GFP.
Ma e ial y mé odos
110
G upos expe imen ales:
- ICV-Salino + Ad-GFP
- ICV-Salino + Ad-GRP78
- ICV-MCH + Ad-GFP
- ICV-MCH + Ad-GRP78
T as la in e ención los animales se es abula on en indi idual y se moni o izó
dia iamen e la inges a y el peso.
5.7 E ec o de la ago omía sob e la acción cen al de MCH
Pa a de e mina si el sis ema ne ioso pa asimpá ico modula los e ec os
pe i é icos inducidos po MCH, se secciona el ne io ago en a as (VGX). Al g upo
con ol de la ago omía se le denomina sham, al cual se le ealizó la in e ención
in asi a, pe o sin secciona el ago. Una semana después de la in e ención, se
implan an bombas osmó icas pa a la adminis ación c ónica ICV de MCH du an e una
semana (10 µg/día). La comp obación de la e icacia de la ago omía se comp obó po
la hipe o ia es omacal as su sac i icio, desca ando del expe imen o aquellas cuya
ago omía no se ealizó con éxi o.
G upos expe imen ales:
- Sham + ICV-salino
- Sham + ICV-MCH
- VGX + ICV-salino
- VGX + ICV-MCH
T as la ago omía, los animales se es abula on en indi idual; as la implan ación
de las bombas y moni o izó dia iamen e la inges a y el peso.
Die a es ánda
Bombas ICV-MCH
Ra ón 2,5 µg/día
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
Ad-GRP78 IV cola
Día 0
Día 7
Die a es ánda
Bombas ICV-MCH
Ra a 10 µg/día
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
Día 0
Día 7
Día -5
Vago omía
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
111
5.8 Sob e-exp esión génica en núcleos hipo alámicos
Pa a escla ece qué núcleo hipo alámico e a el enca gado de p oduci los e ec os
pe i é icos debido a la adminis ación cen al ICV de MCH, se adminis ó
es e eo áxicamen e y de o ma bila e al, 1 µl de ec o adeno i al po núcleo (107
UV/mL), que sob e-exp esaba el MCH-R1 du an e 7 días (Signagen, SL100704) en los
núcleos a cua o, la e al y en omedial del hipo álamo de a a.
Pa a es udia la acción del KOR sob e el me abolismo pe o é ico en a a, se
adminis ó es e eo áxicamen e y de o ma bila e al en el LHA, 1 µl de ec o
adeno i al po núcleo (107 UV/mL), que sob e-exp esaba el KOR (Signagen, SL100702)
du an e 7 días.
En el g upo con ol se adminis a de o ma bila e al, 1 µl un adeno i us que sob e-
exp esa GFP en cada uno de los núcleos mencionados (Signagen, SL100708). Con la
de ección de GFP se isualiza el luga de adminis ación, comp obando la e icacia de la
adminis ación (Imagen 32).
Die a es ánda
ARC Ad MCH-R1
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
Día 0
Día 7
Die a es ánda
LH Ad MCH-R1
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
Día 0
Día 7
Die a es ánda
VMH Ad MCH-R1
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
Día 0
Día 7
VMH
Ad GFP
3
em
100 μm
Ad GFP
ARC
3
em
Ad GFP
1 mm
3
em
Die a es ánda
LH Ad KOR
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
Día 0
Día 7
Imagen 32. Exp esión de GFP en di e en es núcleos hipo alámicos as la adminis ación núcleo
especí ica de adeno i us que sob e-exp esan GFP.
LH
Ma e ial y mé odos
112
Pa a de e mina si el e ec o hepá ico de la sob e-exp esión de KOR en el LHA es á
modulado po el ER-s ess en a ón, simul áneamen e a la adminis ación
es e eo áxica bila e al de Ad KOR en el LHA, se adminis ó en la ena de la cola el
adeno i us que sob e-exp esa la chape ona GRP78 y se sac i icó a la semana de
adminis ación de ambos i us.
G upos expe imen ales: G upos expe imen ales:
- ARC Ad GFP - LHA Ad GFP
- ARC Ad MCH-R1 - LHA Ad KOR
- LHA Ad GFP
- LHA Ad MCH-R1 G upos expe imen ales:
- VMH Ad GFP - LHA Ad GFP + IV Ad GFP
- VMH Ad MCH-R1 - LHA Ad GFP + IV Ad GRP78
- LHA Ad GFP + IV Ad GRP78
- LHA Ad GFP + IV Ad GRP78
T as la in e ención los animales se es abula on en indi idual y se moni o izó
dia iamen e la inges a y el peso.
5.9 Adminis ación c ónica de MCH en núcleos hipo alámicos.
Pa a co obo a los e ec os pe i é icos inducidos po la sob e-exp esión del MCH-
R1 en los núcleos ARC y LHA del hipo álamo, median e el uso de cánulas núcleo-
especí icas hechas a medida, se adminis ó MCH de o ma c ónica y bila e al en el
núcleo a cua o y en núcleo la e al del hipo álamo.
Die a es ánda
Bombas ARC-MCH
Ra a 10 µg/día
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
Día 0
Día 7
Die a es ánda
Bombas LHA-MCH
Ra a 10 µg/día
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
Día 0
Día 7
Die a es ánda
LH Ad-KOR
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
IV cola Ad-GRP78
Día 0
Día 7
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
113
G upos expe imen ales:
- ARC-Salino
- ARC-MCH
- LHA-Salino
- LHA-MCH
T as la in e ención los animales se es abula on en indi idual y se moni o izó
dia iamen e la inges a y el peso.
5.10 Silenciamien o gené ico de MCH-R1 en el hipo álamo la e al (LHA)
Pa a de e mina la acción de la inhibición del MCH-R1 sob e el me abolismo
pe i é ico, se adminis ó es e eo áxicamen e y de o ma bila e al en el LHA, 1 µl de
ec o len i i al (1*107 UV/mL) con un shRNA pa a inhibi la aducción del mRNA del
MCH-R1 (Sigma, SHCLNV, TRCN0000028357). Debido a la na u aleza del i us, el e ec o
de la inhibición no apa ece has a 3 semanas después de la in ección, pe o el e ec o es
pe manen e. En el g upo con ol se adminis a de o ma bila e al, 1 µl un len i i us
Tu bo-GFP (Sigma, SHCLNV, SHC003 Tu bo-GFP) en cada uno de los núcleos
mencionados. Con la de ección de GFP se isualiza el luga de adminis ación,
comp obando la e icacia de la adminis ación.
T as la in e ención los animales se es abula on 3 indi iduos po caja y se
moni o izó semanalmen e la inges a y el peso.
G upos expe imen ales:
- LHA Len i i us Tu bo-GFP
- LHA Len i i us shRNA MCH-R1
Pa a de e mina el e ec o de la inhibición del MCH-R1 en el LHA sob e el
me abolismo hepá ico, se alimen ó a las a as con die a de icien e en me ionina y
ARC MCH osmo ic pumpsARC MCH osmo ic pumpsARC MCH osmo ic pumps LHA MCH osmo ic pumpsLHA MCH osmo ic pumps
ARC MCH osmo ic pumpsARC MCH osmo ic pumpsARC MCH osmo ic pumps LHA MCH osmo ic pumpsLHA MCH osmo ic pumps
Die a es ánda
LHA Len i shARN MCH-R1
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
Semana 0
Semana 4
Imagen 33.Ma cas de las guías de las cánulas núcleo especí icas pa a la adminis ación
c ónica de MCH.

Ma e ial y mé odos
114
colina (MCD) du an e es semanas as el inicio del e ec o del len i i us. Al mismo
iempo, pa a de e mina si la in e upción del PSNS mediaba la acción hepá ica del
bloqueo del MCH-R1 en el LHA, se ago omiza on las a as al comienzo del e ec o del
i us y de la acción de la die a. La die a MCD se in e cambió po la es ánda 5 días
después de la ci ugía pa a acili a la ecupe ación de las a as.
G upos expe imen ales:
- Sham + LHA Len i i us Tu bo-GFP
- Sham + LHA Len i i us shRNA MCH-R1
- VGX + LHA Len i i us Tu bo-GFP
- VGX + LHA Len i i us shRNA MCH-R1
T as la adminis ación de los len i i us en el LHA los animales se es abula on 3
a as po caja y se moni o izó semanalmen e la inges a y el peso. T as la ago omía, los
animales se es abula on en indi idual y se moni o izó semanalmen e la inges a y el
peso.
5.11 Silenciamien o gené ico de KOR en el hipo álamo la e al (LHA)
Pa a de e mina si el ecep o KOR en el hipo álamo la e al media las acciones
pe i é icas de MCH, se silenció la exp esión del hipo álamo la e al simul áneamen e a
la adminis ación c ónica ICV de MCH en a as. Pa a el silenciamien o de KOR se u ilizó
un adeno i us adeno-asociado (AAV) de se o ipo 1, que codi ica un shRNA pa a inhibi
la ansc ipción de KOR (245). Se adminis ó es e eo áxicamen e y de o ma bila e al
en el LHA, 1 µl del AAV shRNA KOR
6
(1*109 UV /mL). T es semanas después de la
adminis ación de los AVV ( iempo necesa io pa a ealiza la in ección) se implan a on
bombas osmó icas ICV pa a la in usión c ónica de MCH du an e una semana (10
µg/día). En el g upo con ol se adminis a de o ma bila e al, 1 µl de AAV-GFP en el
LHA. Con la de ección de GFP se isualiza el luga de adminis ación, comp obando la
e icacia de la adminis ación.
6
AAVs (AAV1 shARN KOR y AAV1 GFP) cedidos po el D . Roge A. Adan, Depa amen o de Neu ociencia
y Fa macología, Ins i u o Rudol Magnus, Uni e sidad de U ech , U ech , Holanda.
Die a es ánda
LHA Len i shARN MCH-R1
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
3 Semanas
Día -5
Vago omía
3 Semanas
Die a MCD
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
115
T as la adminis ación del AAV, los animales se es abula on 3 a as po caja y se
moni o izó semanalmen e la inges a y el peso. T as la implan ación de las bombas
osmó icas, se es abula on los animales encajas indi iduales y se moni o izó
dia iamen e peso e inges a.
G upos expe imen ales:
- AAV GFP + ICV-Salino
- AAV GFP + ICV-MCH
- AAV shRNA KOR + ICV-Salino
- AAV shRNA KOR + ICV-MCH
Finalmen e, pa a de e mina si los e ec os del silenciamien o de KOR en el LHA
a ec a al me abolismo hepá ico, se alimen ó a las a as con die a de icien e en
me ionina y colina (MCD) du an e es semanas as el inicio del e ec o del AAV.
G upos expe imen ales:
- AAV GFP + die a MCD
- AAV shRNA KOR + die a MCD
Die a es ánda
LHA AAV shARN KOR
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
3 Semanas
Bombas ICV-MCH
Ra a 10 µg/día
1 Semana
Die a es ánda
LHA AAV shARN KOR
Sac i icio
Pe iodo de adap ación
7 días
Llegada animala io
3 Semanas
3 Semanas
Die a MCD
RESULTADOS
Resul ados
124
La os o ilación de JNK en el hígado es á asociada al desa ollo de es ea ohepa i is
y esis encia a la insulina. Debido a los esul ados obse ados sob e el e ec o
adipogénico de MCH en el hígado, es udiamos el e ec o cen al de MCH en a ones KO
pa a JNK1. La adminis ación cen al de MCH (2,5 µg/día) en a ones KO pa a JNK1 y
sal ajes (WT) du an e una semana, inc emen ó la inges a en ambos geno ipos (Figu a
7A). Sin emba go en los a ones JNK1-KO, MCH no ue capaz de induci el aumen o de
peso espe ado (Figu a 7B) ni de disminui los AGL plasmá icos (Figu a 7C). Sin
emba go, la adminis ación ICV de MCH si ue capaz de modula el me abolismo
lipídico del ejido adiposo g aso en a ones JNK-KO, pues o que hay un inc emen o en
CIDEA (Figu a 7D). A ni el hepá ico MCH es moduló la exp esión p o eica de pAMPK y
pACC en a ones JNK1-KO, pe o no indujo un aumen o en LPL (Figu a 7E).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
pAMPK AMPKα1 AMPKα2 pACC ACCαFAS LPL
Ni eles de p o eína hepá ica (% con ol)
*
*
***
*** *
*
*
*
F
Figu a 6. E ec os de la adminis ación c ónica ICV de MCH en los ni eles de p o eína hepá ica de
pAMPK, AMPKα1, AMPKα2, pACC, FAS y LPL (A), sob e la ac i idad enzimá ica de LPL en el hígado (B)
y sob e los ni eles p o eicos de JNK1 y pJNK1 en el hígado (C-D). La β-ac ina se u ilizó pa a
no maliza los ni eles de p o eína. Los alo es indican la media ± el e o es ánda de un n de 7
animales po g upo. Tes ANOVA de una ía; *P<0,05; **P<0,01 y ***P<0,001 en e al con ol.
AMPKα1
AMPKα2
pACC
pAMPK
Sal MCH MCH-p
FAS
LPL
ACCα
β-ac in
Sal MCH MCHp
β-ac in
JNK1
pJNK1
B
C
D
Salino-ICV
MCH-ICV (10 μg/día)
MCH-ICV pai ed (10 μg/día)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Ac i idad LPL hepá ica (pmol/ml/min)
*
*
0
20
40
60
80
100
120
JNK1
**
**
Ni eles de p o eína hepá ica (% con ol)
*
*
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
pJNK/JNK
Ni eles de p o eína hepá ica (% con ol)
A

E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
125
Pa a co obo a que es os mismos e ec os se ep oducen en a a, se ealizó una
ap oximación a macológica median e una co-adminis ación pe i é ica in ape i oneal
(IP) cada 12 ho as, del inhibido de JNK1 SP-600125 (384) (20 mg/kg/día), al mismo
iempo que las bombas ICV adminis ando MCH a ni el cen al (10µg/día). El inhibido
de JNK1 bloqueó an o el e ec o o exigénico como el inc emen o de peso inducido po
MCH (Figu a 8A-B). El descenso de los AGL sé icos inducido po MCH, ambién se
bloqueó con la co-adminis ación del inhibido de JNK1 (Figu a 8C). En el ejido adiposo
blanco, el á maco ambién inhibió la sob e-exp esión de CIDEA inducida po MCH
(Figu a 8D). En el hígado, la única p o eína cuyo e ec o inducido po MCH ue
bloqueado po la co-adminis ación del á maco es LPL (Figu a 8E).
Como p e iamen e se ha desc i o en la in oducción, la espues a a la p esencia de
p o eínas desplegadas (UPR) en el e ículo endoplasmá ico inducido po el ER-s ess
hepá ico, es á es echamen e elacionado con un desa ollo en la adiposidad hepá ica
y una ac i ación de JNK1 (354,356,357). Po ello se ha es udiado la u a UPR inducida
po ER-s ess en los hígados de a as a los que se les adminis ó MCH-ICV du an e una
semana. MCH cen al, indujo una ac i ación de las p o eínas in oluc adas en el ER-
s ess (pIRE1α, pPERK, peIF2α, XBP1-S, CHOP) y apop osis (caspasa 3 y clea ed caspasa
3) independien emen e de la inges a (Figu a 9A).
0
5
10
15
20
25
30
35
WT JNK1 -/-
Inges a acumulada (g)
**
A
B
C
D
CIDEA
β-ac in
Sal MCH
JNK1 -/-
E
AMPKα1
AMPKα2
Sal MCH
LPL
pAMPK
β-ac in
pACC
JNK1 -/-
ACC
Figu a 7. E ec os de la adminis ación c ónica ICV de MCH (2,5 µg/día) en la inges a (A), peso (B),
ni eles de AGL sé icos (C) y ni eles p o eicos de CIDEA (D) en g asa epididimal de a ones WT y
JNK1-KO. E ec o de la in usión cen al de MCH sob e ni eles p o eicos de pAMPK, pACC, LPL, ACC,
AMPKα1 y AMPKα2 en hígado de a ones JNK1-KO (E). La β-ac ina se u ilizó pa a no maliza los
ni eles de p o eína. Los alo es indican la media ± el e o es ánda de un n 7-6 animales po g upo.
Tes -s uden de una cola; *P<0,05 y **P<0,01 en e al con ol.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
WT JNK -/-
Ganancia de peso (g)
*
0
5
10
15
20
25
30
WT JNK -/-
AGL sue o (mg/dL)
*
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CIDEA
**
Ni eles de p o eína en WAT
(% con ol)
0
20
40
60
80
100
120
140
pAMPK pACC LPL ACCαAMPKα1 AMPKα2
** **
Ni eles de p o eína hepá ica (% con ol)
WT MCH-ICV (2,5μg/día)
WT Salino-ICV
JNK1 -/- Salino-ICV
JNK1 -/- MCH-ICV (2,5μg/día)
Resul ados
126
Figu a 8. E ec os de la adminis ación c ónica ICV de MCH en el en ículo la e al y la
adminis ación IP del inhibido de JNK1 SP600125 sob e la inges a (A), peso co po al (B) y AGL en el
sue o de a as (C), y sob e los ni eles p o eicos de CIDEA en g asa epididimal (D), de pAMPK,
AMPKα1, AMPKα2 y LPL en hígado de a as (E). La β-ac ina se u ilizó pa a no maliza los ni eles de
p o eína. Los alo es indican la media ± el e o es ánda de un n de 7 animales po g upo. Tes
ANOVA de una ía; *P<0,05 y **P<0,01 en e al con ol.
Figu a 9. E ec os de la adminis ación ICV c ónica de MCH en a as (10 µg/día) sob e los ni eles de
p o eínas hepá icas de pIRE1α, pPERK, peIF2α/eIF2α, XBP1-S, CHOP, caspasa 3 y clea ed caspasa 3
(A). La β-ac ina se u ilizó pa a no maliza los ni eles de p o eína. Los alo es indican la media ± el
e o es ánda de un n de 7 animales po g upo. Tes ANOVA de una ía; *P<0,05 y **P<0,01 en e al
con ol.
A
B
C
AMPKα1
AMPKα2
pAMPK
LPL
β-ac in
Sal MCH MCH+SP
75
80
85
90
95
100
105
** ***
Inges a acumulada (g)
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
** *
Ganancia de peso/con ol
0
5
10
15
20
25
30
35
40
AGL sue o (mg/dL)
**
MCH-ICV (10μg/day) + salino IP
Salino-ICV + salino IP
MCH-ICV (10μg/day) + SP 600125 IP
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
CIDEA
Ni eles de p o eína en WAT
(% con ol)
**
D
Sal MCH MCH+SP
CIDEA
β-ac in
0
20
40
60
80
100
120
140
160
pAMPK AMPKα1 AMPKα2 LPL
****
Ni eles de p o eína hepá ica
(% con ol)
E
Clea Casp 3
Caspase 3
XBP1-S
CHOP
β-ac in
SAL MCH
IRE1α
elF2α
peIF2α
pPERK
pIRE1α
MCH-p
Salino-ICV
MCH-ICV (10 μg/day)
MCH-ICV pai - ed (10 μg/day)
A
0
50
100
150
200
250
pIRE1α/IRE1αpPERK peIF2α/eIF2αXBP1-S CHOP Caspase 3 Clea ed
Caspase 3
**
**
*
#
Li e p o ein le els (% con ol)
**
***
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
127
Pa a de e mina la ele ancia del e ec o del ER-s ess sob e los e ec os de MCH en
la acumulación de lípidos en el hígado, simul áneamen e a la adminis ación c ónica
ICV de MCH en a as, se co-adminis ó de mane a in ape i oneal una chape ona
química que esuel e la UPR (351,385), el ácido au oso-deoxicólico (TUDCA). Pa a
de e mina la dosis de TUDCA adecuada, aquella más al a que no induzca cambios en
inges a y peso, se ealizó una dosis espues a median e la adminis ación IP de TUDCA
cada 12 ho as (Figu a 10). T as es e ensayo se de e minó que la dosis adecuada de
TUDCA es de 250 mg/kg/día.
Como se obse a en la Figu a 11, la adminis ación IP de TUDCA du an e una
semana, simul áneamen e a la in usión ICV de MCH, bloqueó la acumulación de lípidos
en el hígado inducido po MCH. La adminis ación cen al de MCH no indujo un
inc emen o en la concen ación de TG hepá icos (Figu a 11A) ni go as lipídicas (Figu a
11B) en a as co-adminis adas con TUDCA.
Figu a 10. E ec os de la
adminis ación c ónica de
TUDCA du an e 4 días
sob e el peso (A) y la
inges a (B) a las dosis de
62,5; 125; 250 y 500
mg/kg/día. Los alo es
indican la media ± el e o
es ánda de un n de 6
animales po g upo. Tes
ANOVA de una ía;
**P<0,01 en e al con ol.
A
B
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Vehículo 62,5
mg/kg 125
mg/kg 250
mg/kg 500
mg/kg
**
Inges a acumulada (g)
Dosis TUDCA
0
5
10
15
20
25
Vehículo 62,5
mg/kg 125
mg/kg 250
mg/kg 500
mg/kg
Ganancia de peso (g)
Dosis TUDCA
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
PBS TUDCA
mg TG /g hígado
*
A
Salino-IP + MCH- ICVPBS-IP + Salino-ICV
Oil Red O
50 µm
TUDCA-IP + Salino-ICV TUDCA-IP + MCH-ICV
50 µm50 µm
PBS-IP + Salino-ICV
PBS-IP + MCH-ICV (10 μg/día)
TUDCA-IP (250 mg/kg/día) + Salino-ICV
TUDCA-IP (250 mg/kg/día) + MCH-ICV (10 μg/día)
B
PBS-IP + Salino-ICV
H&E
50 µm 50 µm
PBS-IP + MCH-ICV
TUDCA-IP + Salino-ICV TUDCA-IP + MCH-ICV
50 µm 50 µm
Figu a 11. E ec os de la adminis ación c ónica ICV de MCH (10 µg/día) y de TUDCA IP (250
mg/kg/día), sob e los iglicé idos hepá icos (A) y sob e la acumulación lipídica is a como go as
ojas en co es his ológicos de hígado con inción de Oil Red O y como acumulación ci oplasmá ica
de g asa en la inción hema oxilina-eosina (H&E) (B). Los alo es indican la media ± el e o es ánda
de un n de 7 animales po g upo. PBS es ampón os a o salino, ehículo de TUDCA. Tes -s uden
de una cola; *P<0,05 en e al con ol.
Resul ados
128
Los e ec os sob e el bloqueo de la adiposidad hepá ica inducido po MCH
median e el uso de TUDCA, se adujo a ni el p o eico en un bloqueo del inc emen o
de los ni eles de LPL y de pJNK (Figu a 12A). Consecuen emen e, TUDCA bloqueó el
inc emen o del ER-s ess hepá ico inducido po MCH (Figu a 12A).
En una segunda ap oximación, se es udió a GRP78, la chape ona del e ículo
endoplasmá ico que acili a en adecuado plegamien o de las p o eínas, ac uando
p e iamen e a la UPR (386-388). U ilizando es a p opiedad, se ealizó una sob e-
exp esión de GRP78 en el hígado. Pa a ello se adminis ó en la ena de la cola de
a ones C57BL/6, adeno i us que con ienen el gen sal aje (WT) de GRP78 o GFP
(p o eína e de luo escen e) (121) al mismo iempo que la adminis ación c ónica ICV
de MCH (2,5µg/día) du an e una semana. La e iciencia de la in ección se co obo ó
median e una inmunohis oquímica de GFP o GRP78 sob e co es de hígado p e ijados
(Figu a 13A). La sob e-exp esión hepá ica de GRP78, no bloqueó los e ec os
o exigénicos ni la ganancia de peso inducida po MCH (Figu a 13B-C), pe o si la
adiposidad hepá ica a o ecida po MCH (Figu a 13D-E). A ni el de p o eína hepá ica,
la sob e-exp esión de GRP78 bloqueó el inc emen o de la exp esión de LPL, pJNK1,
ma cado es de ER-s ess y apop osis en a ones a ados ICV con MCH (Figu a 13F).
0
50
100
150
200
250
300
LPL pJNK1/JNK1 pIRE1α/IRE1αpPERK pelF2α/elF2αXBP1-S CHOP Caspase 3 Clea ed
Caspase 3
Ni eles de p o eína hepá ica
(% con ol)
*
**
*
**
*
A
pJNK1
pIRE1α
LPL
JNK1
PBS
SAL MCH MCH
TUDCA
SAL
β-ac in
IRE1α
pPERK
peIF2α
eIF2α
β-ac in
PBS
SAL MCH MCH
TUDCA
SAL
Caspase 3
CHOP
Clea Casp 3
XBP1-S
PBS
SAL MCH MCH
TUDCA
SAL
β-ac in
PBS-IP + Salino-ICV
PBS-IP + MCH-ICV (10 μg/día)
TUDCA-IP (250 mg/kg/día) + Salino-ICV
TUDCA-IP (250 mg/kg/día) + MCH-ICV (10 μg/día)
Figu a 12. E ec os de la adminis ación c ónica ICV de MCH (10 µg/día) y de TUDCA (250 mg/kg/día)
sob e los ni eles de p o eínas hepá icas de LPL, a io pJNK/JNK, pIRE1α/IRE1α, pPERK,
peIF2α/eIF2α, XBP1-S, CHOP, caspasa 3 y clea ed caspasa 3 (A). La β-ac ina se u ilizó pa a
no maliza los ni eles de p o eína. Los alo es indican la media ± el e o es ánda de un n de 7
animales po g upo. Tes -s uden de una cola; *P<0,05 y **P<0,01 en e al con ol.
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
129
50 µm
GRP78-Ad GRP78
GRP78-Ad GFP
50 µm
Co e de hígado
50 µm
GFP-Ad GRP78
GFP-Ad GFP
100 µm 100 µm
Co e de hígado
A
0
5
10
15
20
25
30
35
Ad GFP Ad GRP78
***
Inges a acumulada (g)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Ad GFP Ad GRP78
** *
Ganancia de peso (g)
Ad GFP + Salino-ICV Ad GFP + MCH-ICV
Oil Red O
50 µm 50 µm
Ad GRP78 + Saline-ICV Ad GRP78 + MCH-ICV
50 µm50 µm
Ad GFP + Saline-ICV Ad GFP + MCH-ICV
H&E
50 µm
50 µm
Ad GRP78 + Saline-ICV Ad GRP78 + MCH-ICV
50 µm
50 µm
0
50
100
150
200
250
LPL pJNK1/JNK1 pIRE1α/IRE1αpPERK pelF2α/elF2αXBP1-S CHOP Caspase 3 Clea ed
Caspase 3
Ni eles de p o eína hepá ica
(% con ol)
*
*
***
**
***
Ad GFP
SAL MCH MCH
Ad GRP78
SAL
JNK1
pJNK1
LPL
pIRE1α
β-ac in
Ad GFP
SAL MCH MCH
Ad GRP78
SAL
IRE1α
pPERK
peIF2α
eIF2α
β-ac in
Figu a 13. E ec os de la adminis ación c ónica ICV de MCH (2,5 µg/día) y de la sob e-exp esión
hepá ica de GRP78 en la inmunohis oquímica de GFP y GRP78 sob e co es his ológicos (A), inges a
(B), peso (E), TG hepá icos (D), his ología de Oil- ed O y H&E (E), y sob e los ni eles de p o eínas
hepá icas de LPL, a io pJNK/JNK, pIRE1α/IRE1α, pPERK, peIF2α/eIF2α, XBP1-S, CHOP, caspasa 3 y
clea ed caspasa 3 (F). La β-ac ina se u ilizó pa a no maliza los ni eles de p o eína. Los alo es
indican la media ± el e o es ánda de un n de 7 animales po g upo. Tes -s uden de una cola;
*P<0,05; **P<0,01 y ***P<0,001 en e al con ol.
Ad GFP + Salino-ICV
Ad GFP + MCH-ICV (2,5 μg/día)
Ad GRP78 + Salino-ICV
Ad GRP78 + MCH-ICV (2,5 μg/día)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Ad GFP Ad GRP78
mg TG /g hígado
*
Ad GFP
SAL MCH MCH
Ad GRP78
SAL
IRE1α
pPERK
peIF2α
eIF2α
β-ac in
Ad GFP
SAL MCH MCH
Ad GRP78
SAL
IRE1α
pPERK
peIF2α
eIF2α
β-ac in
Ad GFP
SAL MCH MCH
Ad GRP78
SAL
IRE1α
pPERK
peIF2α
eIF2α
β-ac in
Clea Casp 3
XBP1-S
CHOP
Caspase 3
β-ac in
Ad GFP
SAL MCH MCH
Ad GRP78
SAL
Clea Casp 3
XBP1-S
CHOP
Caspase 3
β-ac in
Ad GFP
SAL MCH MCH
Ad GRP78
SAL
Clea Casp 3
XBP1-S
CHOP
Caspase 3
β-ac in
Ad GFP
SAL MCH MCH
Ad GRP78
SAL
Clea Casp 3
XBP1-S
CHOP
Caspase 3
β-ac in
Ad GFP
SAL MCH MCH
Ad GRP78
SAL

Resul ados
130
Figu a 15. E ec os de la adminis ación c ónica IP de MCH sob e la inges a (A), el peso (B), ni eles
de mRNA en g asa epididimal de FAS, ACCα, LPL (C) y p o eína en hígado de pAMPK, pACC, ACCα y
en g asa epididimal de ACCα, FAS, CIDEA y pJNK (D-E). El HPRT se u ilizó pa a no maliza los
ni eles de mRNA. La β-ac ina se u ilizó pa a no maliza los ni eles de p o eína. Los alo es indican
la media ± el e o es ánda de un n de 8-7 animales po g upo. Tes -s uden de una cola.
1.4 La adminis ación cen al de MCH inc emen a la abso ción lipídica de la
die a
Además de la adiposidad gene ada po la adminis ación cen al de MCH en ejido
adiposo y en hígado, se es udió si a ni el in es inal hubie a algún e ec o mediado po
MCH. Aunque no se hayan de ec ado di e encias en los ni eles de de ecación (Figu a
14A), el con enido en TG de las heces de ambos g upos MCH y MCH pai - ed ue
signi ica i amen e mayo que el g upo con ol (Figu a 14B).
La adminis ación pe i é ica de MCH no a ec a al p og ama
2.
lipogénico de g asa e hígado
Pa a desca a la posibilidad de que el MCH di unda desde el CNS hacia la pe i e ia
y p oduzca su acción lipogénica po una acción di ec a, se ealizó una adminis ación
pe i é ica in a-pe i oneal (IP) de MCH du an e 7 días en a a. La dosis adminis ada en
la pe i e ia ue la misma que en ICV (10 µg/día). La adminis ación IP de MCH no
inc emen ó peso ni inges a (Figu a 15A-B); en la pe i e ia, no moduló la exp esión
génica o p o eica de p o eínas in oluc adas en el me abolismo lipídico an o en el
ejido adiposo blanco (Figu a 15C-D) como en el hígado (Figu a 15E).
0
1
2
3
4
5
6
De ecación en 24h (g)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
mg TG/g de heces
***
**
A
B
Figu a 14. E ec os de la adminis ación c ónica ICV
de MCH sob e la asa de de ecación en 24h (A) y en
el con enido de iglicé idos en las heces (B). Los
alo es indican la media ± el e o es ánda de un
n de 8-7 animales po g upo. Tes ANOVA de una
ía; **P<0,01 y ***P<0,001 en e al con ol.
Salino-ICV
MCH-ICV (10 μg/día)
MCH-ICV pai ed (10 μg/día)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
pAMPK pACC ACCα
Ni eles de p o eína hepá ica
(% con ol)
E
Ganancia de peso (g)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0
50
100
150
200
250
Inges a acumulada (g)
A
B
0
20
40
60
80
100
120
140
FAS ACCαLPL
Ni eles de ARNm de WAT
(% con ol)
0
20
40
60
80
100
120
ACCαFAS CIDEA pJNK1
Ni eles p o eicos de WAT
(% con ol)
FAS
Sal MCH
ACCα
CIDEA
β-ac in
pJNK1
C
D
pACC
ACCα
pAMPK
β-ac in
Sal MCH
MCH-IP (10μg/day)
Salino-IP
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
131
Figu a 16. E ec os de la adminis ación
c ónica IP de MCH sob e la inges a (A), el
peso (B), ni eles de mRNA en g asa
epididimal (C) y p o eína en g asa
epididimal e hígado de ACCα, CIDEA y pAMPK
y ACCα espec i amen e (D-E). La β-ac ina
se u ilizó pa a no maliza los ni eles de
p o eína. Los alo es indican la media ± el
e o es ánda de un n de 8-7 animales po
g upo. Tes -s uden de una cola; *P<0,05 y
***P<0,001 en e al con ol.
Sin emba go, la adminis ación IP de MCH no asegu a que sea comple amen e
abso bida po el o en e sanguíneo. Po ello, se ealizó una adminis ación c ónica
in a enosa (IV) en a a du an e una semana en las mismas dosis que en ICV
(10µg/día), u ilizando en es e caso un g upo pai - ed. Los esul ados mos a on que la
adminis ación IV de MCH inc emen ó inges a y peso, pe o es e úl imo aumen o es
dependien e de inges a (Figu a 16A-B). Sin emba go, los e ec os pe i é icos en el
me abolismo lipídico de g asa e hígado se man u ie on inal e ados as la
adminis ación IV de MCH (Figu a 16C-D).
MCH cen al ealiza su e ec o pe i é ico median e el sis ema
3.
ne ioso au ónomo
3.1 El sis ema ne ioso simpá ico modula los e ec os cen ales de MCH
sob e el ejido adiposo blanco
El ejido adiposo blanco es á conec ado al CNS median e el sis ema ne ioso
au ónomo, en pa icula po el sis ema ne ioso simpá ico (SNS)(258). Los ecep o es
β-ad ené gicos (β-ARs) ansmi en el mensaje del SNS al ejido adiposo, modulando el
me abolismo lipídico. La adminis ación c ónica ICV de MCH en a as, disminuyó
signi ica i amen e la exp esión de los 3 ecep o es independien emen e de su e ec o
o exigénico (Figu a 17A). Pa a escla ece cómo la acción de MCH en el CNS modula la
ine ación simpá ica e e en e hacia el ejido adiposo, se ealizó un egis o mul i- ib a
sob e la ac i idad ne iosa au ónoma del ejido adiposo. La adminis ación ICV de
MCH, disminuyó la ac i idad ne iosa egis ada en los ne ios e e en es que ine an
el ejido adiposo epididimal de a as (Figu a 17B-C); siendo es a disminución
dependien e de la dosis (Figu a 17D). La adminis ación ICV de MCH no edujo la
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Inges a acumulada (g)
***
0
5
10
15
20
25
**
Ganancia de peso (g)
A
B
0
20
40
60
80
100
120
140
160
ACCαCIDEA
Ni eles p o eicos de WAT
(% con ol)
Sal MCH MCH-p
ACCα
CIDEA
β-ac in
0
20
40
60
80
100
120
140
pAMPK ACCα
Ni eles de p o eína hepá ica
(% con ol)
Sal MCH MCH-p
β-ac in
ACCα
pAMPK
C
D
MCH-IV (10μg/day)
Salino-IV
MCH-IV pai - ed (10μg/day)
Resul ados
132
Figu a 17. E ec os de la adminis ación c ónica ICV de MCH sob e los ni eles de mRNA de los
ecep o es β-ad ené gicos en g asa epididimal (A) y en la ac i idad ne iosa de los ne ios
e e en es que ine an en ejido adiposo blanco (B-C). E ec o de la adminis ación ICV de MCH a
di e en es dosis sob e el SNA de ne ios e e en es del ejido adiposo (D) y sob e los ne ios
e e en es y a e en es as secciona el opues o espec i amen e (E) El HPRT se u ilizó pa a
no maliza los ni eles de mRNA. Los alo es indican la media ± el e o es ánda de un n de 7
animales po g upo. Tes ANOVA de una ía; *P<0,05 en e al con ol.
espues a simpá ica de ne io dis al (a e en e) del ejido adiposo g aso as la sección
del ne io dis al (e e en e, Figu a 17E); po o o lado, as co a el ne io a e en e,
MCH cen al ue capaz de educi la ac i idad simpá ica del ne io a e en e (Figu a
17E).
0
20
40
60
80
100
120
140
β1-AR β2-AR β3-AR
*
***
Ni eles de ARNm de WAT
(% con ol)
A
Baseline 4 h h
2
- 2
0
1 sec
WAT SNA ( ol s)
2
- 2
0
Sal-ICV
Sal-MCH
Salino-ICV
MCH-ICV (10 μg/día)
MCH-ICV pai ed (10 μg/día)
B
C
-90
-80
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
5Sal 10
MCH (ug)
*
*
WAT SNA (%)D
D
E
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
133
Figu a 18. E ec os de la adminis ación c ónica ICV de MCH en a ones WT y iple KO pa a los
ecep o es β-ad ené gicos sob e la inges a (A), el peso (B) los ni eles p o eicos en g asa de pAMPK,
pACC, ACCα y FAS (C) y sob e la acumulación de iglicé idos hepá icos (D) La β-ac ina se u ilizó
pa a no maliza los ni eles de p o eína. Los alo es indican la media ± el e o es ánda de un n de
7-6 animales po g upo. Tes -s uden de una cola; *P<0,05 y ***P<0,001 en e al con ol.
Como consecuencia a es os esul ados, co obo amos el e ec o de MCH sob e el
SNS, adminis ando MCH ICV du an e 7 días (2,5 µg/día) a a ones iple-KO (TKO) pa a
los es ecep o es β-ad ené gicos. MCH inc emen ó inges a an o en los WT como en
los TKO (Figu a 18A), pe o el inc emen o de peso sólo se obse ó en los TKO (Figu a
18B). En el ejido adiposo, MCH inc emen ó los ni eles p o eicos de ACCα y FAS en los
WT a di e encia de los TKO (Figu a 18C). Sin emba go, el hígado de los TKO se obse ó
sensible a los e ec os sob e la acumulación de lípidos hepá icos inducido po MCH
(Figu a 19D).
3.2 EL sis ema ne ioso pa asimpá ico modula los e ec os cen ales de MCH
sob e el hígado
La ine ación au ónoma del hígado in oluc a an o al SNS como al sis ema ne ioso
pa asimpá ico (PSNS) (276). Sin emba go, es el PSNS el in oluc ado en p ocesos que
a o ecen la acumulación ene gé ica (283). Po ello, se es udió si el ne io ago es á
in oluc ado en los e ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo hepá ico. T as
ealiza una ago omía median e la disección de amas do sales y en ales del ne io
ago de a as, se adminis ó MCH ICV de o ma c ónica du an e una semana. La
e iciencia de la ago omía (VGX) se comp obó po la obse ación de hipe o ia
es omacal (Figu a 19A). El inc emen o de peso e inges a inducido po MCH, se de ec ó
en las a as con ol (sham) pe o no en las ago omizadas (Figu a 19B-C). Po o o lado,
la in usión cen al de MCH, edujo los ácidos g asos lib es del sue o (Figu a 19D) e
0
50
100
150
200
250
pAMPK pACC ACCαFAS
Ni eles de p o eína de WAT (% con ol)
*
*
A
B
C
D
WT MCH-ICV (2,5μg/día)
WT Salino-ICV
TKO Salino-ICV
TKO MCH-ICV (2,5μg/día)
Sal MCH
WT
Sal MCH
FAS
β-ac in
pAMPK
pACC
ACCα
TKO
µg TG/mg hígado
0
2
4
6
8
10
12
****
Inges a acumulada (g)
0
5
10
15
20
25
30
**
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
*
Ganancia de peso (g)
Resul ados
140
A
B
C
VMH
Ad GFP
3
em
Inges a acumulada (g)
0
20
40
60
80
100
120
140
Ganancia de peso (g)
0
2
4
6
8
10
pACC
ACC
pAMPK
β-ac in
LPL
Ad-GFP Ad-MCH-R
VMH
Ni eles de p o eína hepá ica
(% con ol)
0
20
40
60
80
100
120
140
pAMPK pACC ACCαLPL
VMH Ad-MCHR
VHM Ad-GFP
0
20
40
60
80
100
120
140
160
ACC CIDEA pHSL FAS
Ni eles p o eicos de WAT
(% con ol)
D
E
Figu a 25. E ec o de la sob e-exp esión de MCH-R o GFP en el VMH (A) sob e inges a (B), peso (C),
ni eles p o eicos de pAMPK, pACC, ACCα, y LPL en el en el hígado (D); y sob e los ni eles p o eicos
de ACCα, CIDEA, pHSL y FAS en el ejido adiposo blanco (E). La β-ac ina se u ilizó pa a no maliza
los ni eles de p o eína. Los alo es indican la media ± el e o es ánda de un n de 7 animales po
g upo. Tes -S uden de una cola.
CIDEA
ACC
FAS
pHSL
β-ac in
Ad-GFP Ad-MCH-R
VMH
CIDEA
ACC
FAS
pHSL
β-ac in
Ad-GFP Ad-MCH-R
VMH
CIDEA
ACC
FAS
pHSL
β-ac in
Ad-GFP Ad-MCH-R
VMH
CIDEA
ACC
FAS
pHSL
β-ac in
Ad-GFP Ad-MCH-R
VMH
CIDEA
ACC
FAS
pHSL
β-ac in
Ad-GFP Ad-MCH-R
VMH
4.3 La inhibición gené ica del MCH-R1 en el LHA, educe la es ea ohepa i is
inducida po die a de icien e el colina-me ionina, a a és del ne io ago
Has a aho a, se ha mos ado que la sob e-exp esión de MCH-R1 o la
adminis ación de MCH en el LHA modulaba el me abolismo hepá ico. Po an o, se
quiso de e mina si la inhibición del MCH-R1 en dicha á ea, se ía su icien e pa a
mejo a el es ado hepá ico de a as alimen adas con una die a de icien e en me ionina
y colina (MCD). Es a die a MCD p oduce es ea ohepa i is no alcohólica sin p oduci
ningún o o e en o isiológico elacionado con obesidad o sínd ome me abólico (389).
Pa a inhibi el MCH-R1, se adminis ó median e es e eo axia en el LHA (Figu a 26A) un
len i i us que codi ica un RNA ho quilla (shRNA) con a el mRNA de MCH-R1 en a as
alimen adas con die a MCD. T as comp oba la e iciencia del aislamien o de p o eínas
del núcleo hipo alámico la e al (Figu a 26B), la educción del MCH-R1 po el shRNA en
el LHA se demos ó median e wes e n blo (Figu a 26C). La inhibición del MCH-R1 en el
LHA, edujo el con enido de iglicé idos hepá icos en a as con es ea ohepa i is
(Figu a 26D). Los depósi os lipídicos obse ado en las inciones hepá icas Oil Red O y

E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
141
hema oxilina-eosina, mos a on una impo an e es ea osis de las a as alimen adas
con MCD en compa ación con las alimen adas con die a no mal (es ánda ). Sin
emba go, las a as a adas con el shRNA an i MCH-R1 alimen adas con die a MCD,
p esen a on una ma cada educción de los depósi os lipídicos (Figu a 26E). Así mismo,
la inción ic ómica de Masson, u ilizada pa a eñi las ib as de colágeno, mos a on
una educción de la ib osis ca ac e ís ica de la es ea ohepa i is al ededo de la ena
cen al de las á eas po a de a as en las que se inhibió el MCH-R1 alimen adas con
die a MCD (Figu a 26E).
*
LHA
3
1 mm
GFP
0
20
40
60
80
100
120
MCH-R
Ni eles p o eicos de LHA
(% con ol)
*
shRNA
MCH-R
GFP
MCH-R
βac in
Chow + LHA Len i -
GFP Chow + LHA Len i -
shRNA MCH-R Sham MCD + LHA
Len i - shRNA MCH-R
Sham MCD + LHA
Len i -GFP
Oil Red O
VGX MCD + LHA
Len i -GFP VGX MCD + LHA
Len i -shRNA MCH-R
200 µm 200 µm200 µm 200 µm200 µm200 µm
H&E
100 µm 100 µm100 µm 100 µm 100 µm100 µm
Chow + LHA Len i -
GFP Chow + LHA Len i -
shRNA MCH-R Sham MCD + LHA
Len i - shRNA MCH-R
Sham MCD + LHA
Len i -GFP VGX MCD + LHA
Len i -GFP VGX MCD + LHA
Len i -shRNA MCH-R
T ic ómico de
Masson
50 µm 50 µm 50 µm 50 µm50 µm50 µm
Chow + LHA Len i -
GFP Chow + LHA Len i -
shRNA MCH-R Sham MCD + LHA
Len i - shRNA MCH-R
Sham MCD + LHA
Len i -GFP VGX MCD + LHA
Len i -GFP VGX MCD + LHA
Len i -shRNA MCH-R
A
B
0
2
4
6
8
10
12
14
16
mg TG /g hígado
*
C
D
Figu a 26 Localización de la adminis ación de len i i us en el núcleo la e al de ec ando GFP (A).
Comp obación de la e icacia del aislamien o de núcleos hipo alámicos median e wes e n blo de
p o eínas especí icas de ARC y LHA espec i amen e: AGRP y p o-MCH (B). E ec o de la inhibición de
MCH-R en el LHA en a as alimen adas con die a MCD y ago omizadas, sob e los ni eles de
iglicé idos hepá icos (D) y sob e la mo ología hepá ica en his ologías de Oil- ed O, H&E y inción
ic ómica de Masson (E). La β-ac ina se u ilizó pa a no maliza los ni eles de p o eína. Los alo es
indican la media ± el e o es ánda de un n de 8-7 animales po g upo. Tes -S uden de una cola;
*P<0,05 y ***P<0,001 en e al con ol.
ARC LHA
AGRP
p o-MCH
β-ac ina
0
50
100
150
200
250
AGRP p o-MCH
Ni eles p o eicos (% con ol)
***
***
Sham + LHA Len i - GFP
Sham + LHA Len i -shRNA MCH-R
VGX + LHA Len i -GFP
VGX + LHA Len i -shRNA MCH-R
E
ARC
LHA
Resul ados
142
La e e sión del daño hepá ico inducido po la die a MCD as la inhibición del
MCH-R1 en el la e al, ambién se e lejó en la educción de los ni eles sé icos de la
alanina amino ansaminasa (ALT) y de la aspa a o amino as e asa (AST) (Figu a 27A).
A ni el p o eico, la educción de MCH-R1 en el LHA, edujo los ni eles p o eicos de LPL,
pJNK1 y los ma cado es del ER-s ess y apop osis (Figu a 27B). Como se ha desc i o con
an e io idad, el ne io ago media los e ec os hepá icos inducidos po la
adminis ación c ónica cen al de MCH. Po ello, se es udió si la mejo a de la
es ea ohepa i is inducida po MCD debido a la educción del MCH-R1 en el LHA, es aba
mediado po el ne io ago. Los esul ados mos a on que la ago omía bloquea los
e ec os del silenciamien o del MCH-R1 en el LHA sob e los ni eles de iglicé idos
hepá icos (Figu a 26D), inción his ológica de Oil ed O, H&E y ib osis (Figu a 26E);
ni eles sé icos de AST y ALT (Figu a 27A) y ni eles p o eicos en el hígado (Figu a 27B).
Sham + LHA Len i - GFP
Sham + LHA Len i -shRNA MCH-R
VGX + LHA Len i -GFP
VGX + LHA Len i -shRNA MCH-R
0
2
4
6
8
10
12
AST ALT
**
Ni eles sé icos UI/ L
A
0
20
40
60
80
100
120
140
160
LPL pJNK1/JNK1 pIRE1α/IRE1αpPERK pelF2α/elF2αXBP1-S CHOP Caspase 3 Clea ed
Caspase 3
** ***
*
Ni eles de p o eína hepá ica
(% con ol)
*
**
B
pIRE1α
JNK1
LPL
pJNK1
shRNA
MCH-R
Sham
GFP shRNA
MCH-R
VGX
GFP
β-ac in
IRE1α
shRNA
MCH-R
Sham
GFP shRNA
MCH-R
VGX
GFP
peIF2α
eIF2α
β-ac in
pPERK
XBP1-S
Clea Casp 3
CHOP
Caspase 3
β-ac in
shRNA
MCHR
Sham
GFP shRNA
MCH-R
VGX
GFP
Figu a 27. E ec o de la inhibición de MCH-R en el LHA en a as alimen adas con die a MCD y
ago omizadas, sob e los ni eles sé icos de las ansaminasas ALT y AST (A) y sob e los ni eles de
p o eínas hepá icas de LPL, a io pJNK/JNK, pIRE1α/IRE1α, pPERK, peIF2α/eIF2α, XBP1-S, CHOP,
caspasa 3 y clea ed caspasa 3 (B). La β-ac ina se u ilizó pa a no maliza los ni eles de p o eína. Los
alo es indican la media ± el e o es ánda de un n de 7 animales po g upo. Tes -S uden de una
cola; *P<0,05 y **P<0,01 en e al con ol.
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
143
El sis ema opioide, median e el ecep o kappa, media las acciones
5.
cen ales de MCH sob e el me abolismo lipídico del hígado
5.1 El MCH-R1 y el KOR co-localizan en el LHA, y MCH induce la p oducción
de p odino ina
Es udios p e ios han demos ado que exis e una asociación an o ana ómica como
uncional en e MCH y el sis ema kappa opioide (173,253,254). Sin emba go se
desconoce si KOR modula las acciones pe i é icas de MCH o si el sis ema cen al kappa
opioide es capaz de modula di ec amen e el me abolismo pe i é ico. Usando la
p o eína guía dToma o, se iden i ica on en el LHA las neu onas que exp esan CRE-
MCH-R1 en a ones ansgénicos y se es udió si dichas neu onas exp esaban KOR
median e una doble inmunohis oquímica (Figu a 28A). El análisis con ocal de la doble
inmunohis oquímica de e minó que la mayo ía de las células que exp esan el MCH-R1
(Figu a 28A panel a) son posi i as pa a KOR (Figu a 28A panel b-c).
Figu a 28. Doble inmunohis oquímica de MCH-R (A, panel a)
y KOR (A, panel b) pa a mos a la co-localización de MCH-R
y KOR (A, panel c) en el LHA de a ones ansgénicos c e-
MCH dToma o. Las líneas pun eadas ama illas indican
neu onas posi i as pa a ambos MCH-R y KOR (A). La línea
pun eada blanca ep esen a una neu ona posi i a sólo pa a
KOR. Ba a de escala 10 µm. E ec o de la adminis ación
c ónica ICV de MCH sob e los ni eles de exp esión p o eica
de p odino ina en el LHA (B). E ec o de la die a MCD sob e
los ni eles de MCH y p odino ina en el LHA compa ado con
a as alimen adas con die a es ánda (C). E ec o del bloqueo
de MCH-R en el LHA sob e a as alimen adas con die a MCD,
sob e los ni eles p o eicos de p odino ina en el LHA (D). La
β-ac ina se u ilizó pa a no maliza los ni eles de p o eína.
Los alo es indican la media ± el e o es ánda de un n de
8-7 animales po g upo. Tes -S uden de dos colas.
*P<0,025, **P<0,005 y ***P<0,001 en e al con ol.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
P odino ina
Ni eles p o eicos de LHA
(% con ol)
**
A
B
P odin
Salino MCH
-ac in
ca b
MCH-R κOR MCH-R/κOR
MCH-ICV (10μg/day)
Salino-ICV
Die a chow
Die a MCD
0
50
100
150
200
250
300
***
**
Ni eles p o eicos de LHA
(% con ol)
MCH P odino ina
Chow MCD
P odin
MCH
β-ac in
0
20
40
60
80
100
120
140
Ni eles p o eicos de LHA
(% con ol)
*
P odino ina
Die a MCD + LHA Len i -GFP
Die a MCD + LHA Len i -shRNA MCH-R
P odin
GFP shRNA
MCH-R
-ac in
C
D
Resul ados
144
Siendo la p odino ina el ligando na u al de KOR, de e minamos si MCH in luye en
su exp esión. Obse amos que la adminis ación c ónica ICV de MCH, inc emen ó
signi ica i amen e la exp esión de p odino ina en el hipo álamo la e al (Figu a 28B).
En a as alimen adas con die a MCD, exis e un inc emen o signi ica i o en la exp esión
an o de MCH como de p odino ina en el LHA, en compa ación con a as alimen adas
con es ánda (Figu a 28C). Sin emba go, al inhibi el MCH-R1 en el la e al median e un
shRNA en esas a as, se edujo signi ica i amen e los ni eles de p odino ina en el LHA
(Figu a 28D).
5.2 Los a ones KO pa a KOR son esis en es a los e ec os cen ales de MCH
sob e el ER-s ess y el me abolismo lipídico del hígado
En co espondencia con el hecho de que la adminis ación cen al de MCH, induce
la p oducción de p odino ina en el LHA, se es udió si la in usión c ónica ICV de MCH
e a capaz de modula el me abolismo lipídico y del ER-s ess hepá ico en a ones KO
pa a KOR. La adminis ación c ónica ICV de MCH (2,5 µg/día) es imuló inges a y
ganancia de peso an o en el eno ipo sal aje (WT) como en los KOR-KO (Figu a 29A-B).
Sin emba go, mien as que en los WT el a amien o con MCH inc emen a los ni eles
de TG hepá icos, los a ones KOR-KO e an esis en es a dicho e ec o inducido po MCH
(Figu a 29-EC).
0
5
10
15
20
25
30
35
WT κOR-KO
**
Inges a acumulada (g)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
WT κOR-KO
**
Ganancia de peso (g)
A
B
WT Salino-ICV
WT MCH-ICV (2,5 μg/día)
κOR-KO Salino ICV
κOR-KO MCH-ICV(2,5 μg/dìa)
Oil Red O
WT Salino-ICV WT MCH-ICV
50 µm 50 µm
κOR-KO Salino-ICV
200
κOR-KO MCH-ICV
50 µm 50 µm
C
H&E
WT Salino-ICV WT MCH-ICV
50 µm
κOR-KO Salino-ICV κOR-KO MCH-ICV
50 µm
50 µm
Figu a 29. E ec os de la adminis ación c ónica ICV de MCH (2,5µg/día) en a ones WT y KOR-KO
sob e la inges a (A), peso (B) iglicé idos hepá icos (C) y sob e la acumulación lipídica sob e co es
his ológicos de hígado con inción de Oil ed O y H&E (D). Los alo es indican la media ± el e o
es ánda de un n de 8-7 animales po g upo. Tes -s uden de una cola; *P<0,05 en e al con ol.
D
0
1
2
3
4
5
6
WT κOR-KO
mg TG /g hígado
*
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
145
A ni el p o eico, an o las p o eínas cla e del me abolismo lipídico hepá ico (LPL y
pJNK1) como del ER-s ess y apop osis p esen an, un inc emen o signi ica i o en
a ones WT a ados con MCH, pe o no en lo KOR-KO (Figu a 30A).
5.3 El silenciamien o gené ico de KOR en el LHA p o ege en e al e ec o
adipogénico y ER-s ess hepá ico inducido po MCH median e el ANS
Median e el uso de un adeno i us asociado (AAV) se adminis ó un shRNA con a
KOR en el LHA median e es e eo axia. La e iciencia de la adminis ación en el la e al se
co obo ó median e la de ección de GFP (Figu a 31A) y midiendo los ni eles p o eicos
de KOR en el hipo álamo la e al ( igu a 31B). 3 semanas después de la adminis ación
del AAV-shRNA KOR, se adminis ó MCH ICV du an e una semana (10 µg/día). La
adminis ación c ónica ICV de MCH inc emen a inges a y peso independien emen e de
la inhibición de KOR (Figu a 31C-D). Como se ha desc i o en la in oducción, en la
medula oblonga a del onco ence álico, el núcleo do somedial del ne io ago (Figu a
31E) es imp escindible en el con ol del ono pa asimpá ico del ne io ago (390). La
adminis ación c ónica ICV de MCH, inc emen ó la inmuno eac i idad del ma cado de
ac i idad neu onal c-Fos en las neu onas del DMV (Figu a 31F). Sin emba go, el
silenciamien o de KOR en el LHA impidió la ac i ación neu onal del DMV inducido po
la adminis ación c ónica de MCH (Figu a 31G).
Ni eles de p o eína hepá ica (% con ol)
0
50
100
150
200
250
300
LPL pJNK1/JNK1 pIRE1α/IRE1αpPERK pelF2α/elF2αXBP1-S CHOP Caspasa 3 Clea ed
Caspase 3
350
450 **
WT
Salino MCH MCH
KO kOR
Salino
JNK1
pJNK1
LPL
pIRE1α
β-ac in
IRE1α
pPERK
pelF2α
el Fα
β-ac in
WT
Salino MCH MCH
KO kOR
Salino
Clea Casp 3
XBP1-S
CHOP
Caspase 3
β-ac in
WT
Salino MCH MCH
KO kOR
Salino
Figu a 30. E ec os de la adminis ación c ónica ICV de MCH (2,5 µg/día) en a ones WT y KOR-KO
sob e los ni eles de p o eínas hepá icas de LPL, a io pJNK/JNK, pIRE1α/IRE1α, pPERK,
peIF2α/eIF2α, XBP1-S, CHOP, caspasa 3 y clea ed caspasa 3. La β-ac ina se u ilizó pa a no maliza
los ni eles de p o eína. Los alo es indican la media ± el e o es ánda de un n de 8-7 animales po
g upo. Tes -s uden de una cola; *P<0,05 y **P<0,01 en e al con ol.
A
WT Salino-ICV
WT MCH-ICV (2,5 μg/día)
κOR-KO Salino ICV
κOR-KO MCH-ICV(2,5 μg/dìa)
IRE1α
pPERK
pelF2α
el Fα
β-ac in
WT
Salino MCH MCH
KO kOR
Salino
IRE1α
pPERK
pelF2α
el Fα
β-ac in
WT
Salino MCH MCH
KO kOR
Salino
IRE1α
pPERK
pelF2α
el Fα
β-ac in
WT
Salino MCH MCH
KO kOR
Salino
Clea Casp 3
XBP1-S
CHOP
Caspase 3
β-ac in
WT
Salino MCH MCH
KO kOR
Salino
Clea Casp 3
XBP1-S
CHOP
Caspase 3
β-ac in
WT
Salino MCH MCH
KO kOR
Salino
Clea Casp 3
XBP1-S
CHOP
Caspase 3
β-ac in
WT
Salino MCH MCH
KO kOR
Salino

Resul ados
146
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Inges a acumulada (g)
*
*
0
5
10
15
20
25
30
Ganancia de peso (g)
*
A
B
0
20
40
60
80
100
120
κOR
Ni eles p o eicos de LHA
(% con ol)
*
LHA AAV-GFP + Salino-ICV
LHA AAV-GFP + MCH-ICV (10 μg/day)
LHA AAV shRNA-κOR + Salino-ICV
LHA AAV shRNA-κOR + MCH-ICV (10 μg/day)
shRNA
κOR
GFP
κOR
βac in
C
D
Inmuno c- os/LHA
AAV-GFP + MCH-ICV
200 µm
10N
10N CC
200 µm
10N
10N CC
Inmuno c- os/LHA AAV-
GFP + Salino-ICV
0
50
100
150
200
Células IR c-FOS
***
E
200 µm
10N
10N CC
Inmuno c- os/LHA AAV
shRNA-κOR-Salino-ICV Inmuno c- os/LHA AAV
shRNA-κOR-MCH-ICV
200 µm
10N
10N CC
CC 10N
10N
12N 12N
Sol Sol
G
G AP
B egma -13,80 200 µm
Tinción de Nissl
0
50
100
150
200
Células IR C-FOS
F
G
Figu a 31. Comp obación de la adminis ación del AAV shRNA-KOR en el LHA median e GFP (A) y
disminución a ni el p o eico de KOR po e ec o del shRNA (B). E ec o de la inhibición de KOR en el
LHA a as con a amien o c ónico ICV de MCH (10 µg/día) sob e peso e inges a (C-D).
Fo omic og a ía de una sección médula oblonga a del onco encé alo, ep esen ando el DMV con
inción de Nissl (E). E ec o de la inhibición de KOR en el LHA a as con a amien o c ónico ICV de
MCH (10 µg/día) sob e la inmuno eac i idad de c-Fos en el DMV (F-G).
G : núcleo g ácil; AP: á ea
pos ema; SubP: á ea subpos ema; Sol: ac o soli a io; 10N: ne io ago; CC: canal cen al; 12N:
ne io hipogloso.
La β-ac ina se u ilizó pa a no maliza los ni eles de p o eína. Tes -s uden de
una cola; Los alo es indican la media ± el e o es ánda de un n de 8-7 animales po g upo.
*P<0,05 y ***P<0,001 en e al con ol.
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
147
A ni el pe i é ico, el inc emen o de los ni eles de iglicé idos inducido po MCH se
bloquea al silencia KOR en el LHA (Figu a 32A-B). En el hígado, la inhibición de KOR en
el LHA impide el inc emen o de las p o eínas implicadas en la acumulación lipídica, ER-
s ess y apop osis inducido po MCH (Figu a 32C).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
GFP shRNA
κOR
mg TG /g hígado
LHA AAV-GFP + Salino-ICV
LHA AAV-GFP + MCH-ICV (10 μg/day)
LHA AAV shRNA-κOR + Salino-ICV
LHA AAV shRNA-κOR + MCH-ICV (10 μg/day)
A
LHA AAV-GFP +
Salino-ICV LHA AAV-GFP +
MCH-ICV
Oil Red O
50 µm 50 µm
LHA AAV shRNA-κOR +
Saline-ICV LHA AAV shRNA-κOR +
MCH-ICV
50 µm 50 µm
H&E
50 µm
50 µm
LHA AAV-GFP +
Salino-ICV LHA AAV-GFP +
MCH-ICV
50 µm 50 µm
LHA AAV shRNA-κOR +
Salino-ICV LHA AAV shRNA-κOR +
MCH-ICV
B
0
50
100
150
200
250
300
LPL pJNK1/JNK1 pIRE1α/IRE1αpPERK pel 2α/el 2αXBP1-S CHOP Caspase 3 Clea ed
Caspase 3
Ni eles de p o eína hepá ica
(% con ol)
** *
**
**** *** **
pIRE1α
pJNK1
shRNA κOR
Salino MCH
GFP
Salino MCH
JNK1
LPL
β-ac in
IRE1α
pPERK
eIF2α
β-ac in
pelF2α
shRNA κOR
Salino MCH
GFP
Salino MCH
β-ac in
CHOP
Caspase 3
Clea Casp 3
XBP1-S
shRNA κOR
Salino MCH
GFP
Salino MCH
C
Figu a 32. E ec os del silenciamien o de KOR en el LHA en a as con adminis ación c ónica ICV de
MCH (10 µg/día) sob e los TG hepá icos (A), his ología de Oil- ed O y H&E (B) y sob e los ni eles de
p o eínas hepá icas de LPL, a io pJNK/JNK, pIRE1α/IRE1α, pPERK, peIF2α/eIF2α, XBP1-S, CHOP,
caspasa 3 y clea ed caspasa 3 (C). La β-ac ina se u ilizó pa a no maliza los ni eles de p o eína. Los
alo es indican la media ± el e o es ánda de un n de 8-7 animales po g upo. Tes -s uden de
una cola; *P<0,05; **P<0,01 y ***P<0,001 en e al con ol.
Resul ados
148
La especi icidad de es os e ec os sob e el hígado, se comp obó median e el análisis
de las p o eínas moduladas po la adminis ación cen al MCH en g asa. EL
silenciamien o de KOR en el la e al, no impidió que la adminis ación c ónica ICV de
MCH eje za su e ec o sob e el me abolismo lipídico del ejido adiposo blanco (Figu a
33A).
5.4 La inhibición génica de KOR en el LHA, educe la es ea ohepa i is
inducida po la die a MCD
T es semanas después de la adminis ación del AAV con el shRNA-KOR en el LHA,
las a as ue on alimen adas con MCD du an e es semanas. La e iciencia de la
adminis ación i al en el LHA, se co obo ó median e la de ección de GFP (Figu a
34A). La inhibición de KOR en el LHA, edujo signi ica i amen e an o el con enido de
TG hepá icos, como la deposición de colágeno al ededo de la ena cen al de los
lóbulos hepá icos (Figu a 34B-C). También cabe des aca una educción de los ni eles
de mRNA de los p incipales ma cado es de in lamación (TNF-α, IL-6, CD36, CD68) en el
hígado de a as alimen adas con MCD (Figu a 34D). Aco de con es os esul ados, en el
hígado de las a as con el KOR silenciado en el LHA, lo ni eles p o eicos de LPL, pJNK1 y
ma cado es de ER-s ess se de ec a on educidos en e al con ol (Figu a 34E).
Figu a 33. E ec os del silenciamien o de KOR en el LHA en a as con adminis ación c ónica ICV de
MCH (10 µg/día) sob e los sob e los ni eles de p o eína de FAS y la a io pHSL/HSL en el ejido
adiposo blanco (A). La β-ac ina se u ilizó pa a no maliza los ni eles de p o eína. Los alo es indican
la media ± el e o es ánda de un n de 8-7 animales po g upo. Tes -s uden de una cola; *P<0,05;
**P<0,01 y ***P<0,001 en e al con ol.
FAS
HSL
pHSL
β-ac in
shRNA κOR
Salino MCH
GFP
Salino MCH
0
50
100
150
200
250
300
FAS pHSL/HSL
*
**
***
Ni eles de p o eína en WAT
(% con ol)
*
A
LHA AAV-GFP + Salino-CV
LHA AAV-GFP + MCH-ICV (10 μg/día)
LHA AAV shRNA-κOR + Salino-ICV
LHA AAV shRNA-κOR + MCH-ICV (10 μg/día)
E ec os cen ales de MCH sob e el me abolismo pe i é ico
149
Die a MCD + LHA AAV-GFP
Die a MCD + LHA AAV shRNA-κOR
3 1 mm
GFP
LHA
0
5
10
15
20
25
**
mg TG /g hígado
Die a MCD +LHA
AAV-GFP Die a MCD + LHA
AAV shRNA-κOR
200 µm
Oil Red O
200 µm
H&E
100 µm 100 µm
Die a MCD +LHA
AAV-GFP Die a MCD + LHA
AAV shRNA-κOR
T ic ómico de
Masson
50 µm 50 µm
Die a MCD +LHA
AAV-GFP Die a MCD + LHA
AAV shRNA-κOR
A
B
C
0
20
40
60
80
100
120
TNFαIL-6 CD36 CD68
**
Ni eles de ARNm hepá ico
(% con ol)
*
D
0
20
40
60
80
100
120
140
LPL pJNK1/JNK1 pIRE1α/IRE1αpPERK pEi 2α/Ei 2αXBP1-S CHOP
**
**
Ni eles de p o eína hepá ica
(% con ol)
*
*
GFP shRNA
κOR
pIRE1α
pJNK1
JNK1
LPL
β-ac in
IRE1α
pPERK
eIF2α
β-ac in
pelF2α
CHOP
XBP1-S
GFP shRNA
κOR
Figu a 34. Localización de la adminis ación de len i i us en el núcleo la e al de ec ando GFP (A).
E ec o de la inhibición de KOR en el LHA en a as alimen adas con die a MCD, sob e los ni eles de
iglicé idos hepá icos (B), sob e la mo ología hepá ica en his ologías de Oil- ed O, H&E y inción
ic ómica de Masson (C), sob e los ni eles de mRNA de TNF-α, IL-6, CD36, CD68 (D) y sob e los
ni eles de p o eínas hepá icas de LPL, a io pJNK/JNK, pIRE1α/IRE1α, pPERK, peIF2α/eIF2α, XBP1-S
y CHOP. La β-ac ina se u ilizó pa a no maliza los ni eles de p o eína. El HPRT se u ilizó pa a
no maliza los ni eles de mRNA. Los alo es indican la media ± el e o es ánda de un n de 8-7
animales po g upo. Tes -s uden de una cola; *P<0,05 y **P<0,01 en e al con ol.