Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico

Tesis doctoral Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico Mónica Imbernón Piedra Santiago de Compostela -2016- Departamento de Fisiología — CIMUS — Programa de doctorado en Endocrinología Portada y contraportada: Corte sagital del tronco encéfalo de rata; se muestra una inmunohistoquímica de c-Fos sobre el núcleo dorsal del nervio vago, tras una semana de administración crónica central de MCH. Microfotografía realizada por la Profesora Rosalía Gallego. Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico Mónica Imbernón Piedra Departamento de Fisiología — CIMUS — Programa de doctorado en Endocrinología Santiago de Compostela 2016 Tesis doctoral Dr. Rubén Nogueiras Pozo, Profesor Titular del Departamento de Fisiología de la Universidad de Santiago de Compostela. Dr. Carlos Diéguez González, Catedrático del Departamento de Fisiología de la Universidad de Santiago de Compostela. Certifican que la tesis: “Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico” elaborada por Mónica Imbernón Piedra ha sido realizada bajo su dirección en el laboratorio de “Metabolismo Molecular” del Centro de Investigaciones en Medicina Molecular y Enfermedades Crónicas (CIMUS) de la Universidad de Santiago de Compostela, estimando que se encuentra concluida y en condiciones de ser presentada para optar al grado de Doctor. Y para que así conste, firman la presente autorización: Fdo. Rubén Nogueiras Pozo Fdo. Carlos Diéguez González "Cuando alguien busca, suele ocurrir que sus ojos sólo ven aquello que anda buscando, y ya no logra encontrar nada ni se vuelve receptivo a nada porque sólo piensa en lo que busca, porque tiene un objetivo y se halla poseído por él. Buscar significa tener un objetivo, pero encontrar significa ser libre, estar abierto, carecer de objetivos..." Herman Hesse; Siddharta, 1975 2.8 Fenotipado metabólico ................................................................................ 85 2.9 Perfusión intracardiaca ................................................................................ 87 Técnicas experimentales in vitro ......................................................................... 87 3. 3.1 Análisis de RNA mensajero por PCR en tiempo real .................................... 87 3.2 Análisis de proteína por western blot .......................................................... 92 97 3.3 Análisis histológico de tejido central y periférico ........................................ 98 3.4 Inmunohistoquímica .................................................................................... 99 3.5 Análisis de metabolitos .............................................................................. 102 3.6 Actividad enzimática .................................................................................. 102 Análisis estadístico ............................................................................................. 104 4. 4.1 Test paramétricos ....................................................................................... 104 Diseño experimental.......................................................................................... 106 5. 5.1 Administración crónica ICV de MCH .......................................................... 106 5.2 Administración crónica ICV de MCH en modelos de ratón modificados genéticamente ....................................................................................................... 106 5.3 Administración periférica de MCH ............................................................. 107 5.4 Estimulación de lipólisis por isoprotenol ................................................... 108 5.5 Bloqueo farmacológico del ER-stress ......................................................... 109 5.6 Bloqueo genético del ER-stress hepático ................................................... 109 5.7 Efecto de la vagotomía sobre la acción central de MCH ........................... 110 5.8 Sobre-expresión génica en núcleos hipotalámicos .................................... 111 5.9 Administración crónica de MCH en núcleos hipotalámicos. ..................... 112 5.10 Silenciamiento genético de MCH-R1 en el hipotálamo lateral (LHA) ........ 113 5.11 Silenciamiento genético de KOR en el hipotálamo lateral (LHA) ............... 114 RESULTADOS ................................................................................................................. 119 MCH central modula el metabolismo lipídico periférico .................................. 119 1. 1.1 La administración central de MCH controla la adiposidad independientemente de la ingesta. ...................................................................... 119 1.2 La administración central de MCH regula el metabolismo lipídico del tejido adiposo blanco ...................................................................................................... 121 1.3 La administración central de MCH regula el metabolismo lipídico del hígado mediante el ER-stress y JNK1. ............................................................................... 123 1.4 La administración central de MCH incrementa la absorción lipídica de la dieta 130 La administración periférica de MCH no afecta al programa lipogénico de grasa 2. e hígado ..................................................................................................................... 130 MCH central realiza su efecto periférico mediante el sistema nervioso 3. autónomo ................................................................................................................. 131 3.1 El sistema nervioso simpático modula los efectos centrales de MCH sobre el tejido adiposo blanco ............................................................................................ 131 3.2 EL sistema nervioso parasimpático modula los efectos centrales de MCH sobre el hígado ...................................................................................................... 133 Los efectos periféricos de MCH en el CNS se modulan desde el núcleo arcuato y 4. núcleo lateral del hipotálamo ................................................................................... 135 4.1 La acción de MCH y su receptor en el ARC, modulan el metabolismo lipídico del tejido adiposo .................................................................................................. 135 4.2 La acción de MCH y su receptor en el LHA, modulan el metabolismo lipídico del hígado .............................................................................................................. 137 4.3 La inhibición genética del MCH-R1 en el LHA, reduce la esteatohepatitis inducida por dieta deficiente el colina-metionina, a través del nervio vago ........ 140 El sistema opioide, mediante el receptor kappa, media las acciones centrales de 5. MCH sobre el metabolismo lipídico del hígado ........................................................ 143 5.1 El MCH-R1 y el KOR co-localizan en el LHA, y MCH induce la producción de prodinorfina ........................................................................................................... 143 5.2 Los ratones KO para KOR son resistentes a los efectos centrales de MCH sobre el ER-stress y el metabolismo lipídico del hígado ....................................... 144 5.3 El silenciamiento genético de KOR en el LHA protege frente al efecto adipogénico y ER-stress hepático inducido por MCH mediante el ANS ............... 145 5.4 La inhibición génica de KOR en el LHA, reduce la esteatohepatitis inducida por la dieta MCD .................................................................................................... 148 5.5 La sobre-expresión de KOR en el LHA produce adiposidad hepática inducido por la activación de ER-stress ................................................................................ 150 DISCUSIÓN .................................................................................................................... 155 CONCLUSIONES ............................................................................................................. 165 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................... 169 AGRADECIMIENTOS ...................................................................................................... 195 ACRÓNIMOS Y ABREVIATURAS Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 17 ACRÓNIMOS Y ABREVIATURAS AAV: adenovirus adeno-asociado ACC: acetil-CoA carboxilasa ACTH: hormona adrenocorticotropa (adrenocorticotropic hormone) Ad: adenovirus AGL: ácido graso libre AgRP: péptido similar a agutí (agouti related protein) ALT: alanina aminotransferasa AMPK: proteína kinasa activada por AMP (5' adenosine monophosphate-activated protein kinase) ANOVA: análisis de la varianza ANS: sistema nervioso autónomo (autonomic nervous system) AP: antero-posterior ARC: arcuato ASK1: kinasa señalizadora de apoptosis 1 AST: aspartato aminotransferasa ATF α/β: factor de transcripción activado α/β (activated transcription factor) ATP: adenosín trifosfato BAT: tejido adiposo marrón (brown adipose tissue) BSA: sero-albúmina bovina CAMKK: kinasa activada por calcio calmodulina (calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase) CART: transcrito relacionado a cocaína-anfetamina (cocaine-amphetamine related transcript) CCK: colecistoquinina Acrónimos y abreviaturas 18 CHOP: proteína homóloga C/EBP (C/EBP homologous protein) ChREBP: proteína de unión en respuesta a carbohidratos (carbohydrate-responsive element-binding protein) CIDEA: efector A inductor de muerte celular por fragmentación de DNA (cell death– inducing DNA fragmentation factor-α-like effector A) CNS: sistema nervioso central (central nervous system) CPT1: carnitina palmitoil transferasa 1 CVO: órgano circunventricular (circumventricular organ) DAB: diaminobencidino DEPC: dietilpirocarbonato DMH: núcleo dorsomedial del hipotálamo (dorsomedial hypothalamus) DMV: núcleo dorsal del nervio vago DNA: ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid) DOR: receptor opioide delta (delta opioid receptor) DV: dorso ventral EE: gasto energético (energy expenditure) eIf2α: factor de iniciación eucariota 2 (eukaryotic initiation factor 2) ER: retículo endoplasmático (endoplasmatic reticulum) ER-stress: estrés del retículo endoplasmático (endoplasmatic reticulum stress) FQ: food quotient FXR: receptor X farnesoide (Farnesoid X receptor) GABA: ácido γ-aminobutírico (Gamma-Aminobutyric acid) GFP: proteína verde fluorescente (green fluorescent protein) GHSR-1a: receptor 1a de ghrelina (growth hormone secretagogue receptor) GIP: polipéptido inhibidor gástrico (gastric inhibitory polypeptide) GLP-1: péptido similar al glucagón 1 (glucagon-like peptide-1) GnRH: hormona liberadora de gonadotropina (gonadotropin-releasing hormone) Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 19 GPCR: receptor 7 transmembrana asociado a proteína G (G protein–coupled receptors) GPR78/BIP: proteína regulada por glucosa 78/chaperona de unión a inmunoglobulina (G protein-coupled receptor 78/binding immunoglobulin protein) GTT: test de tolerancia a glucosa (glucose tolerance test) H&E: hematoxilina y eosina HSL: hormona sensible a lipasa ICV: intra-cerebro ventricular IKK-β: inhibidor de factor nuclear kinasa β (inhibitor of nuclear factor kappa-β kinase subunit beta) IL: interleukina IP: intraperitoneal IR: receptor de insulina (insulin receptor) IRE1α: proteína requerida de inositol 1 α (inositol-requiring enzyme 1 α) JNK: c-Jun N-terminal kinasa KO: knock out KOR: receptor opioide kappa (kappa opioid receptor) L: lateral LDLR: receptor de lipoproteína de baja densidad (low density lipoprotein receptor) LHA: hipotálamo lateral (lateral hypothalamus) LPL: lipoproteína lipasa LPS: endotoxina lipopolisacárido (lipopolysaccharides endotoxin) LRH1: receptor de hígado homólogo 1 (liver receptor homolog-1) MC3/4R: receptor de melanocortina 3/4 (melanocortin 3/4 receptor) MCD: dieta deficiente en metionina y colina (metionin and choline deficient diet) MCH: hormona concentradora de melanina (melanin concentrating hormone) MCH-R1/2: receptor la de la hormona concentradora de melanina 1/2 (melanin concentrating hormone receptor 1/2) Acrónimos y abreviaturas 20 MOR: receptor opioide mu (mu opioid receptor) MTP: microsomal triglyceride transfer protein Nac: núcleo accumbens NAFLD: enfermedad de hígado graso no alcohólico (non alcoholic fatty liver disease) NASH: esteatohepatitis no alcohólica (non alcoholic steatohepatitis) NEFAs: ácidos grasos libres no esterificados (non-esterified fatty acids) NEI: neuropéptido E-I NFKβ: factor nuclear kβ (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) NGE: neuropéptido G-E NPY: neuropéptido Y NPYR: receptor del neuropéptido Y (NPY receptor) NTS: núcleo del tracto solitario Ob-R: receptor de leptina (obese receptor) OGTT: test oral de tolerancia a glucosa (oral glucose tolerance test) OXR1/2: receptor de orexina 1/2 (orexin receptor) OXY: oxitomodulina PBS: tampón fosfato salino (phosphate buffer saline) PCG-1α: peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator 1α PCR: reacción en cadena de la polimerasa (polimerase chain reaction) RT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (real time polimerase chain reaction) PEPCK: fosfoenol piruvato carboxikinasa (phosphoenolpyruvate carboxykinase) PERK: kinasa del factor de transcripción pancreático del retículo endoplásmico iniciador de la traducción eucariota (protein kinase R (PKR)-like endoplasmic reticulum kinase) PI3K: fosfoinositol 3 kinasa (phosphatidylinositide 3-kinases) PK: piruvato kinasa Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 21 PKA: proteína kinasa A POMC: propiomelanocortina PPAR-γ: receptor del peroxisoma-proliferador activado gamma (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) PSNS: sistema nervioso parasimpático (parasympathetic nervous system) PUFAs: ácidos grasos poli-insaturados (polyunsaturated fatty acids) PVH: núcleo paraventricular (paraventricular hypothalamus) PYY: péptido YY RNA: ácido ribonucleico (ribonuclei acid) ROS: especies reactivas de oxígeno RQ: tasa de respiración metabólica (respiratory quotient) SC: subcutáneo SCARB1: scavenger receptor class B member 1 SCD-1: esteoril-CoA desaturasa SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico. SF1: factor esteroidogénico 1 shRNA: short hairp ribonuclei acid SNA: actividad nerviosa del simpático (sympathetic nervous activity) SNS: sistema nervioso simpático (sympathetic nervous system) SOCS3: supresor de la señalización de la citokina 3 (suppressor of cytokine signaling 3) SREBP1: proteína de unión reguladora de esterol tipo 1-c (sterol regulatory elementbinding transcription factor 1) STAT: transductor de señal activador de la transcripción (signal transducer and activator of transcription) TG: triglicéridos TKO: triple knock out TLR-4: receptor kinasa tipo Toll 4 (toll like receptor 4) Introducción 28 1.2 Gasto energético Como previamente se ha mencionado, el gasto energético total comprende la actividad espontánea, el metabolismo basal y la termogénesis que realiza el individuo. 1.2.1 Actividad física La actividad espontánea o física abarca entre un 8-15% del gasto energético total en humanos (9). Engloba tanto la actividad física involuntaria como voluntaria de cada organismo, siendo este último un factor muy variable si además le incluimos la actividad deportiva. El principal combustible que se utiliza para la contracción muscular es la glucosa, puesto que el músculo puede almacenarla limitadamente en forma de glucógeno. Sin embargo en ayuno o si el esfuerzo es considerado cuando se agota el glucógeno almacenado, el músculo comienza a consumir ácidos grasos provenientes del tejido adiposo blanco. 1.2.2 Metabolismo basal Es la energía empleada para el sustento básico del organismo en un estado de reposo: metabolismo celular y mantenimiento fisiológico de las funciones orgánicas. Durante un día la tasa metabólica basal varía, siendo mayor durante el día que durante la noche. Durante el día también se detectan variaciones, aumentado tras la comida debido a un proceso denominado acción dinámica de la comida (termogénesis inducida por la dieta) (2). Este proceso está bajo control hormona; de hecho, hace más de un siglo que se conoce la influencia de las hormonas tiroideas en la modulación del metabolismo basal; la desregulación del eje tiroideo conlleva importantes alteraciones en el balance energético (10,11) 1.2.3 Termogénesis Si bien se podría considerar la termogénesis como parte del metabolismo basal, la importancia de este proceso en el mantenimiento de la temperatura en organismos homeotermos, merece un estudio aparte por la fina regulación del proceso, la cantidad de energía que se utiliza y su influencia sobre la variación del balance energético. El tejido adiposo marrón es el encargado de llevar a cabo el proceso de disipación de la energía en forma de calor. El desacoplamiento de la respiración mitocondrial, favorece que el gradiente de protones asociado a la fosforilación oxidativa a pase por la proteína Imagen 3. Uso de los combustibles en tejido adiposo marrón. Tras la oxidación del combustible, se favorece el desacoplamiento de la respiración mitocondrial, generando calor (12) Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 29 desacoplante 1 (UCP1), transformando la energía del gradiente en calor en vez de en ATP (12) (Imagen 3). La capacidad termogénica del tejido adiposo marrón es fundamental para la termorregulación corporal, producción de calor en neonatos, mamíferos hibernadores y probablemente ayuda a quemar el exceso de energía ante dietas hipercalóricas (13). 1.3 Partición nutricional Es muy importante conocer cómo se regula el uso de combustibles que derivarán en el gasto o en el almacenamiento de la energía. Como se ha mencionado con anterioridad, los principales combustibles son el azúcar y los lípidos, que serán utilizados por cada tejido en diferentes estados nutricionales con diferentes finalidades. Por lo tanto, si la glucosa es la primera fuente de energía para los tejidos tras una ingesta y tiene un almacenamiento limitado, sólo la grasa va a determinar la cantidad de energía almacenada en el cuerpo; el balance energético dependerá directamente de este factor. La grasa puede participar directamente en procesos oxidativos de músculo, tejido adiposo marrón, o formar parte del almacenamiento energético en el tejido adiposo blanco. La nutrición particional establece la función metabólica de la grasa en los diferentes estados energéticos de un organismo (14) (Imagen 4). El hígado juega un importante papel en la partición nutricional puesto que es el principal productor de combustibles. Tras la ingesta y en respuesta a la insulina, el hígado adquiere y almacena la glucosa en forma de glucógeno y usa la glucosa como combustible mediante la glucólisis. Tras la glucólisis las concentraciones de acetil-CoA aumentan y gracias a la acción de la insulina se favorece la formación de la acetil-CoA- carboxilasa (ACC) para producir malonil-CoA a partir de acetil-CoA (15). El malonil-CoA es la molécula precursora de los ácidos grasos y señaliza la disponibilidad de nutrientes. Ante la abundancia de combustibles, la malonil-CoA se acumula e inhibe la carnitina palmitoil transferasa 1 A (CPT1-A), impidiendo el transporte de los ácidos grasos a la mitocondria para su β oxidación (16). Los ácidos grasos generados se empaquetan en lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) que serán transportados por la sangre hasta el tejido adiposo. Por otro lado, los lípidos adquiridos de la dieta se empaquetan en quilomicrones (lipoproteínas) que los trasportan hacia los tejidos Imagen 4. La partición nutricional establece la función de la grasa en los diferentes estados energéticos, pudiendo ser almacenada u oxidada, modulando el balance energético (14). Introducción 30 periféricos. En el tejido adiposo, la lipoproteína lipasa (LPL) incorpora a los adipocitos los TG de las VLDL y quilomicrones, almacenado los lípidos en un proceso dependiente de insulina (2). Considerando que la cantidad de grasa que se puede almacenar en tejido adiposo es casi ilimitada, la glucosa sólo se puede almacenar en forma de glucógeno en cantidades relativamente pequeñas en el hígado y en el músculo. La consecuencia es que en condiciones de ayuno, la glucosa se guardará para los órganos que son dependientes de la misma como el cerebro. Tras agotar las reservas de glucógeno, el hígado sintetiza glucosa mediante la gluconeogénesis a partir de metabolitos residuales del metabolismo del músculo (lactato y alanina) y del glicerol, procedente de la lipólisis del tejido adiposo graso. Esta lipólisis de los TG almacenados en los adipocitos, liberará ácidos grasos al plasma que serán adquiridos por los tejidos periféricos para su oxidación, principalmente músculo esquelético, corazón e hígado (17). ingesta ayuno A B Imagen 5. Representación del metabolismo intermediario y la partición nutricional tras la ingesta (A) y en ayuno (B) en los diferentes estados energéticos. Adaptado de (2) y (17). Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 31 Regulación de la homeostasis energética 2. La homeostasis energética requiere de una fina regulación entre consumo, almacenamiento y gasto de energía. La ingesta, la partición nutricional, el uso de los combustibles y el almacenamiento energético, están controlados por circuitos neuroendocrinos que se localizan en diferentes áreas del sistema nervioso central (CNS) tales como el hipotálamo o el tronco encefálico. Este modelo se basa en un constante flujo de información desde los órganos periféricos con actividad metabólica (tracto gastrointestinal, tejido adiposo, páncreas, hígado, etc.) hacia el CNS. A continuación, se genera una respuesta que se trasmitirá a los órganos periféricos implicados. 2.1 Señales del tracto gastrointestinal al CNS Uno de los principales ejes para la regulación de la homeostasis energética es el circuito CNS-tracto gastrointestinal. Esta comunicación se consigue por la interacción neuronal y hormonal entre ambos sistemas (18,19). En cada tramo del tracto, diferentes estructuras secretan hormonas que irán o directamente al cerebro pasando la barrera hematoencefálica o activarán neuronas aferentes del sistema nervioso autónomo (ANS) que transmite la señal al CNS y/o directamente regularan el metabolismo de los órganos periféricos por el troco encefálico (Imagen 6) 2.1.1 Ghrelina Se descubrió como ligando del receptor de los secretagogos de la hormona de crecimiento (GHSR-1a) (20,21). Se trata de un péptido de 28 aminoácidos caracterizado por presentar un grupo O-n-octanoico en el residuo 3 de serina, que es producido y secretado por las células parietales del estómago (22). Sus niveles circulantes aumentan antes de la ingesta, disminuyendo a valores iniciales tras la comida en proporción a las calorías ingeridas (23). La expresión y secreción de la ghrelina varían según el estado energético; aumenta en ayuno, en pérdida de peso y en la hipoglicemia inducida por la insulina (24-26). La administración central o periférica de ghrelina estimula la ingesta y la adiposidad (27); por lo que se considera a la ghrelina una señal entérica moduladora de la homeostasis energética. La ghrelina es la única hormona peptídica que estimula el apetito (orexigénica) en lugar de actuar Imagen 6. Hormonas derivadas del tracto gastrointestinal moduladoras de la homeostasis energética (19). Introducción 32 como una señal de saciedad (anorexigénica) (28). En el CNS, la ghrelina atraviesa la barrera hematoencefálica en un proceso aún sin definir y ejerce su acción sobre su receptor GHRS-1A hipotalámico. Este receptor se expresa predominantemente en las neuronas que co-expresan el péptido similar a Agutí y neuropéptido Y (AgRP/NPY) en el núcleo arcuato del hipotálamo y en neuronas del núcleo ventromedial (VMH). En estas neuronas, la ghrelina activa una ruta en la que participan SIRT1/AMPK/p53 y los ácidos grasos (29,30) que induce la expresión de ambos AgRP y NPY, los cuales mediad los efectos de ghrelina sobre el metabolismo lipídico (31,32). A nivel periférico, el efecto adipogénico sobre el tejido adiposo blanco es independiente del efecto orexigénico de la ghrelina a través de los receptores de melanocortinas del hipotálamo; transmitiendo la señal a la grasa a través del sistema nervioso simpático (Imagen 7) (33-36). Se ha descrito que el efecto orexigénico de la ghrelina no sólo es modulado por las neuronas AgRP/NPY sino que también se regula en el tronco-encéfalo a través de su efecto hormonal (37) o a través de las señales aferentes del nervio vago activadas por la secreción de ghrelina en el estómago (38). 2.1.2 Insulina Hormona secretada por las células beta de los islotes de Langerhans pancreáticos en respuesta a altas concentraciones de glucosa en sangre. Actúa por medio del receptor de insulina tirosin-kinasa (IR) activando la vía PI3K/AKT en tejidos periféricos como músculo esquelético, grasa e hígado para reducir los niveles de glucosa circulantes. La insulina es la hormona de mayor potencial anabólico, favoreciendo la síntesis y almacenamiento de carbohidratos, lípidos y proteínas (Imagen 8). A su vez, inhibe la degradación y liberación de ácidos grasos y glucosa al torrente sanguíneo inhibiendo la expresión de enzimas que favorece la degradación de los combustibles, favoreciendo, por tanto, el almacenamiento energético en los tejidos periféricos. (39). Imagen 7. Síntesis y acciones de ghrelina. La mayor parte de la ghrelina circulante se sintetiza en el estómago, modulando ingesta y peso corporal mediante la activación de neuronas AgRP/NPY en el núcleo arcuato del hipotálamo (36). Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 33 El descubrimiento de que la insulina modula la expresión de neuropéptidos en el hipotálamo y regula el metabolismo energético, ha puesto de manifiesto que el cerebro es un órgano sensible a la insulina. A nivel central, la insulina ejerce una función reguladora del balance energético, la reproducción y la supervivencia neuronal (40-42). La expresión del IR en el cerebro es muy dispersa con elevadas concentraciones en el bulbo olfatorio, corteza cerebral, hipotálamo, cerebelo e hipocampo (43,44). La insulina, cuya secreción es dependiente de los niveles de glucosa en sangre y proporcional a la cantidad de grasa (45), atraviesa la barrera hematoencefálica en proporción a las concentraciones plasmáticas en un proceso de transporte saturable mediado por un trasportador (46-48). En el ARC, la insulina actúa sobre las neuronas AgRP/NPY y POMC/CART. La insulina, disminuye la producción y expresión de NPY, favoreciendo la de POMC; y por tanto activa la ruta de las melanocortinas produciendo una reducción de la ingesta (49,50). Además del efecto anorexigénico, la acción hipotalámica de la insulina modula también el metabolismo de la glucosa, incrementando la sensibilidad a la insulina en tejidos periféricos y reduciendo la gluconeogénesis hepática (51). Por último, a través del CNS, la insulina también puede regular la cantidad de grasa de manera independiente a su efecto anorexigénico, ya que la insulina central disminuye la lipólisis en el tejido adiposo blanco (42). 2.1.3 Glucagón Hormona secretada por las células alfa de los islotes de Langerhans pancreáticos derivado del gen pre-pro-glucagón, en respuesta a bajos niveles de glucosa plasmática (52). Esta hormona contrarresta la hipoglucemia y se opone a las acciones de la Imagen 8. Regulación del metabolismo por la insulina. La insulina estimula la captación de glucosa, aminoácidos y ácidos grasos en las células, y aumenta la expresión o actividad de las enzimas que catalizan glucógeno, lípidos y la síntesis de proteínas, mientras que inhibe la actividad o expresión de los que cataliza la degradación. (39) Introducción 34 insulina mediante la activación de la síntesis y movilización de la glucosa hepática (53). Sin embargo, además de su implicación en el metabolismo de la glucosa, se ha descrito que el glucagón también está involucrado en la regulación del metabolismo lipídico y gasto energético. Numerosos estudios han descrito que el efecto del glucagón sobre el metabolismo lipídico se traduce en una reducción de la síntesis y secreción de componentes implicados en el almacenamiento energético (triglicéridos, VLDL, colesterol) y en una movilización lipídica (54,55). A nivel central, el receptor de glucagón se distribuye en diversas regiones como el tálamo, bulbo olfatorio e hipotálamo (56). Se ha descrito que la administración periférica de glucagón reduce la ingesta pero este efecto es más acusado cuando la administración es central (57); la acción anorexigénica del glucagón implican la vía PKA/CAMKK/AMPK en el ARC (58). 2.1.4 Hormonas intestinales En el intestino delgado, la digestión y absorción de nutrientes deriva en la secreción de señales intestinales de saciedad como la colecistoquinina (CCK), péptido YY (PYY) y como las incretinas polipéptido inhibidor gástrico (GIP), péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) y la oxitomodulina (OXY) (59).  CCK: péptido sintetizado en el yeyuno y duodeno en respuesta a la presencia de nutrientes. Tiene una vida media de entre 1-2 minutos, siendo su principal acción reducir el apetito activando aferencias del nervio vago. Tiene funciones locales como el retraso del vaciado gástrico, estimulación de la secreción de enzimas pancreáticas y contracción de la vesícula biliar (59).  PYY: este péptido se localiza a lo largo del intestino con una mayor concentración en el colón y en el recto. Aunque existe alguna controversia al respecto, la forma 1-36 es orexigénica mientras que PYY 3-36 ejerce un efecto anorexigénico. Sus efectos post-pandriales incluyen retraso del vaciado gástrico y reducción de la secreción gástrica. Se han detectado acciones sobre el metabolismo de la glucosa pero con un componente de dimorfismo sexual, que puede ser asociado a las diferencias de género sobre el eje hipotálamo-hipofisario (60).  GIP: es un péptido incretina (hormona que activa la secreción de insulina en el páncreas tras la administración oral de glucosa) sintetizado en las células K del duodeno y yeyuno, activado por la presencia de glucosa y grasa. No se ha descrito que tenga un importante efecto anorexigénico, pero sí que promueve el almacenamiento energético, actuando directamente sobre el tejido adiposo, e incrementando su adiposidad. Además, recientemente se ha demostrado que la asociación de GIP, GLP-1 y glucagón en una quimera genera un potente triagonista con una potente acción anti obesidad (61).  GLP-1: es una incretina derivada del procesamiento post-transcripcional del gen pre-pro-glucagón en las células L del intestino y en el CNS (62). Las acciones de GLP-1 abarcan diversos tejidos, estimulando la secreción de insulina en el páncreas, retrasando el vaciado gástrico e incrementando la presión sanguínea en el corazón. En Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 35 el cerebro, GLP-1 ejerce su acción metabólica entre otras zonas, en el hipotálamo, actuando como una hormona de saciedad y en el metabolismo de la glucosa. La activación central de GLP-1 estimula la incorporación de glucosa en el músculo y favorece la formación de glucógeno en el hígado (63). Las acciones centrales de GLP-1 también involucran al metabolismo lipídico en el tejido adiposo graso reduciendo el almacenamiento de TG independientemente de la ingesta (64). El tejido adiposo marrón está también regulado por los efectos centrales de GLP-1 incrementado el programa termogénico, favoreciendo también la transformación de los adipocitos del tejido adiposo blanco a un fenotipo de adipocito marrón (browning) (65,66).  OXM: péptido que, como GLP-1, es el resultado del procesamiento posttranscripcional del gen pre-pro-glucagón que se libera tras la ingesta. Ejerce su acción mediante el receptor de GLP-1 pero con mucha menos afinidad. OXM reduce la secreción de ácido por el estómago y reduce ingesta. 2.2 Señales del tejido adiposo blanco al CNS El tejido adiposo no es un órgano que solamente acumula y libera lípidos, es un importante órgano endocrino que secreta una gran variedad de sustancias incluyendo hormonas esteroideas, citoquinas y factores de crecimiento, reguladores del metabolismo lipídico, etc (67,68). Estos factores se denominan adipokinas, y funcionan como parte de un complejo conjunto de sistemas de control fisiológicos que regulan el tejido local y la fisiología del organismo completo (Imagen 9). Por tanto, las adipokinas contribuyen a la regulación de diversos procesos biológicos incluyendo inflamación y función inmune, biología vascular, hematopoyesis, proliferación celular y angiogénesis (69). En este caso, destacamos las adipokinas más directamente involucradas en la regulación del balance energético y el metabolismo. 2.2.1 Leptina El término leptina proviene del griego (leptos: delgado). Es una hormona secretada por el tejido adiposo blanco descubierta tras la caracterización del efecto de la ausencia del gen de la leptina y de su receptor en ratones (ob/ob y db/db Imagen 9. Principales adipokinas y metabolitos sintetizados y secretados por el tejido adiposo blanco (67). Introducción 36 respectivamente). Estas mutaciones recesivas del gen obeso (ob) y del gen diabetes (db) producen en esos ratones obesidad y diabetes tipo 2, generando un síndrome parecido a la obesidad mórbida en humanos (70,71). Los ratones ob/ob y db/db tienen idénticos fenotipos, pesando tres veces más que los ratones normales, mostrando un aumento de hasta en cinco veces del contenido de grasa corporal. Son hiperfágicos, apenas tienen actividad locomotora y son sexualmente inactivos debido a su hipogonadismo. La leptina funciona dentro de un sistema de regulación a largo plazo, modulando la cantidad de alimentos consumidos en relación con la cantidad de energía gastada (72). Se considera la principal hormona moduladora de energía, puesto que posee una función de retroalimentación negativa que mantiene constante la masa del tejido adiposo. La leptina se secreta por los adipocitos ya sea como péptido de 16 KDa como ligada a una forma soluble de su receptor (Ob-R). La cantidad de leptina secretada se correlaciona positivamente con la cantidad de masa grasa, sugiriendo que su regulación está ligada a un mecanismo sensible a los lípidos (73). Un aumento de los niveles plasmáticos genera un balance energético negativo, mientras que la reducción de los niveles de leptina circulante produce un balance energético positivo (ingesta > gasto energético). La leptina llega al CNS mediante el órgano circunventricular (CVO) atravesando la barreara hematoencefálica en un proceso dependiente de tanicitos (células de la glía especializadas), que translocan la leptina de la sangre al tercer ventrículo, y de ahí accede a los núcleos hipotalámicos (Imagen 10) (74,75). En el hipotálamo, la leptina ejerce su acción sobre neuronas que expresen su receptor mediante una ruta de señalización dependiente de STAT3 (76,77). Ya en el ARC, la leptina despolariza las neuronas POMC, cuya respuesta anorexigénica produce un descenso de la ingesta y una aumento del gasto energético (78). Por otro lado y de forma simultánea, la leptina inhibe en el núcleo arcuato a las neuronas de efecto orexigénico AgRP/NPY, potenciando el efecto saciante de la hormona (79). Imagen 10. Leptina y la regulación de la masa grasa. Se secreta por el tejido adiposo en proporción a la cantidad total de masa grasa, el tamaño de los adipocitos y su contenido en triglicéridos. La leptina actúa principalmente en el hipotálamo, produciendo un efecto anoréxigénico (71). Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 37 2.2.2 Adiponectina Es una proteína secretada y producida exclusivamente por los adipocitos, siendo una de las proteínas plasmáticas más abundantes en el torrente sanguíneo (80). Se considera un factor anti-inflamatorio, presentando una correlación negativa en su concentración plasmática respecto a la cantidad de tejido adiposo (81). Por ello, la producción de adiponectina es inhibida por factores pro-inflamatorios como el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) e interleukina 6, así como el estrés y la hipoxia (82). Numerosos estudios clínicos muestran una relación entre la adiponectina y obesidad: la adiponectina está reducida en pacientes obesos, siendo la elevada concentración de esta proteína en el plasma un factor protector frente a la diabetes. A nivel metabólico la adiponectina incrementa la oxidación de ácidos grasos en el músculo y reduce niveles plasmáticos de glucosa, ácidos grasos libres y triglicéridos mediante la ruta de la AMP kinasa (AMPK) (83). 2.2.3 Resistina La resistina es una adipokina perteneciente a un grupo de proteínas asociadas a procesos inflamatorios. A pesar de ser una adipokina, se ha descrito que esta proteína también es producida por otros tejidos como el tejido adiposo marrón, estómago, intestino y músculo (84). Su nombre proviene de su efecto sobre la resistencia a la insulina que produce en ratones (85); ratones knock-out para la resistina tienen menores niveles de glucosa post-pandrial y menor gluconeogénesis hepática que los normales (86). La habilidad de la resistina para modular la resistencia a la insulina, está asociada con la activación del supresor de la señalización de la citokina 3 (SOCS3), inhibidor de la señalización de la insulina en adipocitos (87). En roedores, la resistina es regulada por el estatus metabólico y nutricional, disminuyendo en el ayuno y estando incrementado en estados de obesidad y diabetes tipo 2 (88). Al igual que la leptina, los principales efectos de la resistina sobre el metabolismo energético son mediados por el hipotálamo; la administración central de resistina reduce la ingesta y regula el metabolismo lipídico de tejidos periféricos (89,90). Introducción 44 3.3 Hormona concentradora de melanina (MCH) Esta hormona deriva su nombre de la capacidad para agregar gránulos llenos de melanina en la piel de los peces teleósteos, localizando la pigmentación en un área concreta clareando el color del resto del pez (142,143). La alteración del color de la piel de estos peces permite al animal que se confunda con el fondo, haciéndolo menos visibles ante un depredador (144). Tras el aislamiento inicial del MCH en la hipófisis del salmón (145), se identificó una secuencia de 17 aminoácidos (146) con un puente de cisteína entre las posiciones 5 y 14 formando una estructura anillar, imprescindible para su función biológica (147). Posteriormente, MCH fue identificado en el hipotálamo de rata como un péptido cíclico de 19 aminoácidos con una elevada homología con la del salmón (Imagen 13). Los análisis del mRNA revelaron que el transcrito (tanto en humanos, rata y ratón) produce una preprohormona de 165 aminoácidos. De esta preprohormona se pueden producir dos péptidos además del MCH, neuropéptido E-I (NEI) y neuropéptido G-E (NGE) (148). MCH es traducido como una prohormona; procesamientos proteolíticos en dos residuos de arginina genera el péptido MCH maduro generando una estructura primaria se mantiene conservada en los mamíferos (Imagen 15). De igual modo se conserva la estructura de NEI, pero sin embargo, hay variaciones en la estructura de NGE. El papel de los otros dos péptidos codificados del gen Promch se desconocen; la administración de péptidos sintéticos de NEI y NGE sólo o en combinación con MCH, no produce ningún efecto en ingesta (149). Sin embargo, se ha descrito que NEI incrementa la actividad locomotora, induce la secreción de la hormona luteinizante y está involucrado en la secreción de la hormona adenocorticotropa inducida por estrés (150-152). Por otro lado se ha descrito que MCH, NEI y NGE interactúan en modelos células mediante mecanismos paracrinos y autocrinos (153,154). Imagen 14. Secuencia de aminoácidos de la hormona MCH de mamíferos. Los aminoácidos en verde son residuos conservados entre mamíferos y el salmón; los naranjas son difieren respecto al salmón (153). Imagen 15. Esquema representativo de la estructura del gen Promch. El gen MCH humano se localiza en el brazo largo del cromosoma 12 (12q23- 24). EL gen contiene dos intrones y tres exones. Los péptidos NGE, NEI y MCH se codifican de los exones 2 y 3 (153). Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 45 3.3.1 Neuronas MCH En el sistema nervioso central, la expresión de MCH se limita a las células magnocelulares en el hipotálamo lateral y en la denominada zona incerta (ZI) (141). Las neuronas MCH en el LHA, juegan un papel integrador entre señales de la periferia, (actuando vía las neuronas de primer orden en el ARC y señales desde áreas extrahipotalámicas), modulando ingesta, bebida, y comportamientos de búsqueda de alimentos y sistema hedónico. Neuronas del ARC detectan variaciones en los parámetros homeostáticos y transmiten la información a otras áreas incluyendo el núcleo lateral. Las neuronas MCH de segundo orden del LH, realizan múltiples proyecciones a lo largo del cerebro, modulando y coordinando el comportamiento alimentario (155). El registro de la actividad de las neuronas MCH, muestran un bajo nivel de actividad comparado con neuronas orexinas o GABAérgicas (156,157). Por tanto, la actividad de la neuronas MCH depende de su activación por neuromoduladores relacionados con señales de hambre-saciedad provenientes de la periferia o de otras zonas hipotalámicas involucradas en la modulación de la ingesta, principalmente en condiciones de deprivación energética (4,158). Las neuronas MCH responden a diversos factores y neuromoduladores como glucosa, neurotransmisores como glutamato y GABA; neuropéptidos excitatorios como serotonina, dopamina, noradrenalina y canabinoides; y péptidos hipotalámicos como NPY, α-MSH (155). Sin embargo, la acción de hormonas como leptina, ghrelina e insulina sobre MCH, es controvertida y se piensa que sus efectos son principalmente indirectos. En el LHA, las neuronas MCH co-existen con otra población similar, las neuronas orexinas; con características similares pero no coincidentes. Sin embargo, una característica común a ambas poblaciones, es su conexión monosináptica con otras áreas del encéfalo. Las neuronas MCH proyectan a múltiples áreas como el córtex prefrontal, eminencia media, núcleo accumbens (Nac), núcleo estriado dorsal y ventral, córtex piriforme y en tronco encéfalo (141,159). Sin embargo, es importante tener en cuenta, que la expresión y proyección de neuronas MCH varía entre rata y ratón (160). 3.3.2 MCH-R y su distribución encefálica MCH activa a su receptor MCH-R1 (161), una proteína G transmembrana, con una secuencia muy conservada entre ratas, ratones y humanos (162). En líneas celulares recombinantes, se ha descrito que MCH se une a su receptor MCH-R1, con una afinidad de aproximadamente 1 nM (163). Una vez unido el MCH a su receptor MCH- R1 tipo 7 transmembrana GPCR Gi/Gq, se activan múltiples rutas de señalización. La activación del MCH-R1 incrementa la concentración del Ca2+ intracelular libre, se inhibe la adenilato ciclasa y se estimula el metabolismo del fosfatidilinositol y la ruta de ERK1/2 (164). Los RNA mensajeros del receptor MCH-R1 presentan en el cerebro una distribución similar a las proyecciones de la neuronas MCH-inmunoreactivas, como 1) córtex piriforme y el bulbo olfativo, 2) Nac y el VTA, y 3) todos los núcleos hipotalámicos; es decir lugares que señalan la implicación del MCH sobre el Introducción 46 comportamiento, sistema de recompensa y metabolismo energético (165-167) (Imagen 16). Tras la identificación del MCH-R1 se identificó un segundo receptor para MCH; MCH-R2 detectado en humanos y primates, pero no presente en roedores, con un 38% de homología con el MCH-R1 (168-170). La distribución del MCH-R2 en el cerebro de los primates casi se superpone a la del MCH-R1, mostrando este último una expresión más elevada y una distribución más amplia (171). EL MCH-R2 se expresa en diversas zonas del cerebro incluyendo la amígdala y el hipocampo.(170,172). La distribución anatómica de neuronas que expresan en MCH-R1 se ha realizado mediante la detección de su mRNA mediante técnicas de hibridación in situ, debido a la dificultad por encontrar un anticuerpo adecuado para los análisis anatómicos. Esto limita el estudio sobre las características de las neuronas que contengan el MCH-R1, como la co-expresión con neurotransmisores o la caracterización del tipo neuronal en el que se expresa. En un reciente estudio, Chee at al. (173), generaron un modelo en el que las neuronas que expresan el MCH-R1 se identifican por la co-expresión de una proteína fluorescente dependiente de la expresión de cre-recombinasa (ratón Mchr1- cre/tdTomato). Las neuronas MCH-R1 en el hipotálamo constituyen una población muy heterogénea y co-expresan múltiples neuropéptidos implicados en la homeostasis energética. En el hipotálamo paraventricular, las neuronas MCH-R1 se expresan en las poblaciones que expresan dinorfina, enkefalina, factor liberador de corticotropina y factor liberador de tirotropina. En el núcleo arcuato, el MCH-R1 co-expresa con el 35% de las neuronas NPY sensibles a leptina y más del 70% de neuronas POMC sensibles a leptina (165,166). Imagen 16. Estructura (derecha) y distribución (izquierda) de MCH y MCH-R1 en el cerebro de rata. Los puntos negros indican localización de los cuerpos neuronales productores de MCH, y las líneas las proyecciones de dichas neuronas. Los puntos blancos indican las zonas del cerebro donde se detectó expresión del ARNm de MCH-R1 (166). Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 47 3.3.3 MCH, comportamiento y sistema de recompensa Como se ha mencionado anteriormente, las neuronas MCH proyectan a diferentes áreas del comportamiento. Ratones deficientes en MCH presentan anomalías en el comportamiento olfativo, los machos presentan más agresividad y las hembras tienen deficiencias en la sincronización del ciclo hormonal e instinto maternal (174). Por otro lado, MCH está también involucrado en el sueño, siendo la secreción de MCH mucho más elevada en las fases profundas de sueño, y apenas detectadas en vigilia, involucrando su acción en desordenes de sueño (175). Tras su administración en la amígdala e hipocampo, se ha observado que MCH también está involucrado en la memoria cognitiva en ratas (176). Mediante el uso de un modelo de ratones con depresión inducido por estrés, se ha observado que existe un incremento de la expresión de MCH-R en el hipocampo. Este hecho es coincidente con el fenotipo ansiolítica generado por el déficit de MCH-R, sin embargo el efecto anti-depresivo de esta ablación sólo era detectada en hembras. Este estudio muestra la potencial acción de antagonistas de MCH para el tratamiento de desórdenes del comportamiento y depresión (177,178). Además de los núcleos hipotalámicos, el Nac es importante en la regulación de la ingesta. El Nac contiene elevadas concentraciones de MCH-R1 (173) y las neuronas MCH que proyectan hacia el VTA están involucradas en la regulación hedónica del apetito (179). La ausencia del gen Promch disminuye la apetencia por la dieta alta en grasa y el azúcar (149,180). Registros in vivo demuestran que MCH reduce la actividad neuronal del Nac en animales en movimiento (181); en concordancia con otros estudios farmacológicos y electrofisiológicos, la reducción de la excitación neuronal del Nac incrementa la ingesta (182,183). A su vez, el Nac proyecta recíprocamente hacia el LHA modulando su actividad neural (184). Los circuitos generados por las conexiones de neuronas Orexina-VTA y la conexión de las neuronas MCH-NAc generan importantes estructuras anatómicas que conectan las acciones homeostáticas del hipotálamo con los circuitos límbicos de recompensa. 3.3.4 MCH y el metabolismo energético En el hipotálamo, los MCH-R1 se expresan en el ARC, VMH, PVH y en el LH, mostrando la relevancia de la MCH sobre la regulación de la ingesta y el metabolismo energético (165). Los niveles centrales del RNA mensajero de MCH son elevados en modelos deficientes de leptina (ob/ob) en comparación con los controles delgados durante el ayuno (185). Esta idea preliminar del MCH como péptido orexigénico se confirmó cuando se observó un rápido incremento de la ingesta en ratas tras la administración intracerebro-ventricular (ICV) de MCH (185,186). Desde el LH, las neuronas MCH proyectan al núcleo vago dorsal (DMV) en el NTS del tronco encéfalo (187), y para determinar los efectos de MCH sobre el NTS se administró MCH en el cuarto ventrículo (187). No se observaron efectos en la ingesta, pero sí una disminución en la temperatura corporal y una tendencia a la disminución de la Introducción 48 actividad física, sugiriendo que el MCH actúa también sobre el tronco-encéfalo en línea con su acción hipotalámica de conservación de la energía. Por otro lado, la administración de ICV de MCH incrementa la ingesta de agua independientemente de la ingesta de pienso (188). Por otro lado, la administración ICV de MCH, aumenta la ingesta de alcohol y sacarosa, pero estos efectos deben estar asociados a la relación de MCH con el sistema de recompensa (189). Se han generado múltiples modelos de animales modificados genéticamente para explorar las funciones de MCH en el metabolismo energético y demás funciones sobre el comportamiento. Los modelos murinos deficientes en algún gen (KO) incluyen múltiples constructos que previenen la síntesis de MCH o del MCH-R, modelos transgénicos incluyen la sobre-expresión del gen Promch. Los estudios resultantes de estos modelos muestran que la pérdida de la funcionalidad de MCH produce fenotipos delgados y resistentes a la obesidad (190) (Tabla 1). 3.3.5 Modelos genéticos de MCH  Ratones KO para MCH La eliminación del gen Promch en ratones con una cepa mixta de C57BL/6 X 129SvJ, genera un ratón hipofágico y con un aumento del gasto energético (191). Pesan entre un 25-30% menos que los controles, junto con una reducción de los niveles de leptina y del contenido en grasa corporal. Esta disminución de la leptina se traduce en una disminución central de POMC, pero no en un aumento de AgRP o NPY. Cuando ratones deficientes en MCH, tanto de la cepa C57BL/6 X 129SvJ y la C57BL/6 X 129/SvEv (menos susceptible al engorde por dieta alta en grasa) se exponen a dieta alta en grasa, presentan una resistencia a la obesidad, gracias a su elevado gasto energético (191,192). La alimentación de ratones Promch-/- C57BL/6 con HFD durante 15 semanas, pone de manifiesto no sólo una resistencia a la acumulación lipídica, sino una mejora en la inflamación y adiposidad hepática así como una mejora en la sensibilidad a la insulina (193). La evaluación de la ausencia del gen Promch en cepas puras confirma su incremento en el gasto energético, y favorece una mayor carrera sobre rueda de roedor (192,194). Una de las características del envejecimiento es la acumulación lipídica en el tejido adiposo visceral que contribuye a un aumento en la resistencia a la insulina asociada al envejecimiento (195). Los ratones KO para el gen Promch, persisten con su fenotipo delgado a los 19 meses de edad, siendo los machos un 30% y las hembras un 25% más delgados que sus controles, efecto debido a una disminución de la masa grasa (196). Estos ratones, mejoran el test a la tolerancia a la glucosa oral (OGTT) por una mayor sensibilidad a la insulina, cuyos niveles plasmáticos son menores que los controles de fenotipo salvaje. Además la disminución en la actividad locomotora asociada al envejecimiento se revierte en estos ratones. Para evitar los efectos compensatorios en el desarrollo neuronal en los ratones Promch-/- que puedan interferir en el fenotipo desarrollado en adultos, se generó otro ratón que presentara en su desarrollo embrionario neuronas MCH activas. Usando la Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 49 cepa de ratón FVB/n, se generó modelo genético inducible mediante el uso de la toxina ataxin-3, eliminándose las neuronas MCH en ratones con 4 semanas de edad. Estos ratones muestran un fenotipo prácticamente similar a los ratones Promch-/- (delgados, hipofágicos y con un incremento del gasto energético), pero con actividad locomotora normal (197). Debido a los altos niveles de MCH detectados en ratones ob/ob, se generó un ratón con doble deleción de leptina y MCH, en espera de resolver el fenotipo obeso de los ob/ob (198). En términos de ingesta no se observan diferencias entre los ob/ob y los Promch-/- ob/ob. pero estos últimos son más delgados debido a un aumento de hasta 3 veces en la actividad locomotora y un 25% más de gasto energético. Al cruzar tanto el modelo inducible Promch-/- ataxin-3, como los Promch-/- con los ob/ob, se observó una mejora de la diabetes, la esteatosis y la obesidad inducido por la ausencia de leptina (197,198). Los efectos de la MCH sobre el metabolismo no sólo se limitan a la modulación de la ingesta y el gasto energético, influye también en la modulación del metabolismo periférico, ratones deficientes en el gen Promch expuestos a una dieta alta en grasa, están protegidos ante la hepatoesteatosis (acumulación lipídica en el hígado) inducida por dieta (193).  Ratones transgénicos para MCH El fenotipo producido por ratones transgénicos que sobre-expresan MCH, también confirma el papel endógeno de MCH en la homeostasis energética. Utilizando la cepa FVB, se generó un ratón que sobre-expresaba el gen Promch en el hipotálamo lateral dos veces más que un ratón normal (199). Este ratón transgénico come un 10% más de la dieta alta en grasa y es un 12% más pesado que los WT. Los niveles de glucosa eran más elevados respecto a los controles tanto en estado post pandrial, como durante el test de tolerancia a la glucosa (GTT), siendo resistentes a la insulina. Los Promch transgénicos heterocigotos de la cepa C57BL/6, son hiperfágicos con dieta normal, más pesados y resistentes a insulina; sin embargo, no presentan variación en los niveles de glucosa (199).  Ratones KO para el MCH-R Estudios con ratones KO Mchr1, aclara y confirma el papel de MCH en el metabolismo energético. Usando una cepa mixta de C57BL/6 X 129SvJ, la ausencia del gen Mchr1 en ratones también produce un fenotipo delgado presentado resistencia a la administración exógena de MCH (200). Sin embargo son hiperfágicos comparados con el control. Cuando se exponen a dieta alta en grasa, ganan menos peso que los controles a pesar de la hiperfagia; este hecho se puede explicar por el elevado tono simpático (aumento de la lipólisis) y su hiperactividad (200). Casi simultáneamente, otro grupo generó el mismo ratón, observando los mismos resultados frente a la dieta alta en grasa (resistentes a la ganancia de peso inducida por la dieta) (201). Detectaron que los niveles de insulina y leptina eran menores que en los controles, pero no observaron diferencias en los niveles de glucosa. El modelo heterocigoto no presentaba diferencias de ningún tipo respecto del control (201). Estudios posteriores Introducción 50 mostraron que los ratones Mchr1-/- presentan un 250% más actividad locomotora en la rueda acompañado de hiperfagia (202); mayor tasa metabólica, hiperactividad y mayor actividad cardiaca sin cambios en la presión arterial (203). El modelo de Mchr1-/- con un fondo genético de C57BL/6 muestra menores niveles de insulina y mayor temperatura corporal (204,205). Ratones deficientes de leptina ob/ob, la ausencia de Mchr1, reduce la adiposidad (aunque no el peso corporal), mejora la respuesta al OGTT, incrementa la actividad locomotora espontánea y mejora la termorregulación tras la exposición a frío, mostrando de nuevo que MCH es un importante mediador de la respuesta al déficit de leptina (205). Recientemente, para estudiar los efectos del MCH-R2 característico de humanos, se ha generado un modelo de ratón específico para su estudio en el que se coexpresaban ambos receptores, determinado que la expresión del MCH-R2 tiene un efecto protector frente a la obesidad inducida por dieta alta en grasa, abriendo nuevas posibilidades a nuevos agonistas sobre el MCH-R2 para el tratamiento de la obesidad (206). Se ha descrito que el MCH-R1 se expresa también en tejido periféricos como el tejido adiposo, próstata e intestino (168). En relación a este punto, en ratones KO para el gen de Promch a los que se le indujo químicamente colitis, presentan menores niveles de inflamación que el fenotipo salvaje, sugiriendo el papel de MCH en la respuesta inmune intestinal (207). De hecho, estos ratones deficientes de MCH son más susceptibles a la morbilidad cuando se infectan con Salmonella, presentando una inflamación más severa y más mortalidad (208). Por otro lado MCH y su receptor están presentes en la piel de humanos (209); además, en el cultivo primario de melanocitos humanos, MCH parece bloquear las acciones melanogénicas de α-MSH (209). De esta propiedad de MCH ha surgido la idea del uso de anticuerpos anti MCH-R1 para el tratamiento del vitíligo, enfermedad de la piel caracterizada por la pérdida de pigmentación (210). Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 51 Genotipo Fenotipo Referencia Promch -/- C57BL/6 x 129SvJ Hipofagia, adiposidad reducida, incremento de la tasa metabólica y bajo peso Shimada et al., 1998 (191) Promch -/- C57BL/6 Normofagia, adiposidad reducida, incremento de actividad y tasa metabólica, y bajo peso Zhou et al., 2005 Kokkotou et al., 2005 (194-192) Promch -/- C57BL/6 Ancianos, adiposidad reducida, glucosa reducida, sensibilidad a la insulina Jeon et al., 2006 (196) Promch -/- C57BL/6 Alimentados con HFD, resistentes a hepatoesteatosis inducida por dieta, mejora sensibilidad a glucosa Wang et al., 2010 (193) Promch -/- C57BL/6 x 129SvEv Hiperfagia, adiposidad reducida, incremento de la tasa metabólica y bajo peso Kokkotou et al., 2005 (194) Promch; ataxin-3 FVB/n Hipofagia, adiposidad reducida, incremento tasa metabólica y bajo peso Alon y Friedman ., 2006 (197) Promch; ataxin-3; ob/ob (FVB/n x C57BL/6) Hiperfagia, adiposidad reducida, glucosa reducida, esteatosis reducida y bajo peso Alon y Friedman ., 2006 (197) Promch -/-; ob/ob C57BL/6 Adiposidad reducida, glucosa reducida, incremento de actividad y tasa metabólica, y bajo peso Segal-Lieberman et al., 2003 (198) Promch tg/tg FVB Sobrepeso, hiperfagia en HFD, incremento de glucosa y resistencia a insulina Ludwig et al., 2001 (199) Promch tg/+ C57BL/6 Sobrepeso, hiperfágico con estándar, normo-glucosa y resistente a insulina Ludwig et al., 2001 (199) Mchr1-/- C57BL/6 x 129SvJ Adiposidad reducida, hiperfagia, hiperactividad, bajo peso, incremento de actividad y tasa metabólica, y resistencia a insulina Marsh et al., 2002 Chen et al.,2002 Astrand et al., 2004 Zhou et al., 2005 (200, 203, 318) Mchr1-/+ C57BL/6 x 129SvJ Sin diferencias frente al control Chen et al.,2002 (104) Mchr1-/- C57BL/6 Hipoinsulinemia, mejora al OGTT y elevada temperatura corporal Bjursell et al., 2006 Ahnaou et al., 2011 (205, 204) Mchr1-/-; ob/ob C57BL/6 Adiposidad reducida, hipoinsulinemia, mejora al OGTT e incremento de actividad Bjursell et al., 2006 (205) Origen: Adaptado de MacNeil et al., 2013 3.3.6 Estudios farmacológicos de MCH La hormona concentradora de melanina, y en ocasiones derivados de MCH, se han utilizado para evaluar la acción de MCH en la homeostasis energética. La administración aguda en el ventrículo lateral (ICV) de MCH (5-30 µg) en ratas Long Evans incrementa ingesta (185), efecto que también se produce en ratas Sprague- Dawley (185,211), con un efecto máximo a las 2 horas de su administración (211). Tabla 1|Modelos genéticos de ratón que muestran la relevancia de MCH en la homeostasis energética. Introducción 52 Utilizando una solución enriquecida con sacarosa, la administración ICV de MCH incrementa su bebida (212); también ocurre utilizando bebida con glucosa pero no con sacarina, indicando que la acción dipsogénica de MCH está más relacionada con el contenido calórico que con el sabor (213). En una comparación en paralelo, MCH es el péptido con menor intensidad orexigénica respecto a AgRP y NPY (214). Respecto a la acción núcleo específica de MCH, su administración en el núcleo paraventricular del hipotálamo y en el Nac incrementa ingesta en las 4 horas posteriores a su administración; sin embargo, la administración directa sobre el ARC incrementa ingesta tras una hora después de su infusión(215,216). La administración crónica de MCH en roedores no sólo incrementa ingesta, sino que favorece la obesidad (211,217,218). La administración crónica de MCH durante 12 días incrementa peso en ratas (211). El uso crónico de análogos de MCH, también incrementa el peso e ingesta tras su administración crónica ICV en comparación con los controles (219). En ratones, la administración crónica durante 14 días no se incrementa ingesta en dieta estándar, pero sí lo hace con una dieta moderadamente alta en grasa; no obstante, con ambas dietas, la acción crónica ICV de MCH incrementa el peso de los ratones sin variación en la actividad locomotora (217,218). Este efecto produce en los ratones un incremento en los depósitos grasos, leptina, TG hepáticos, glucosa plasmática e insulina (217). Este efecto sobre el metabolismo de la glucosa, también se ha observado en ratones tras la administración ICV de MCH durante 4 días (220). Aunque la ingesta no terminó de producir un incremento significativo, la administración ICV de MCH produjo resistencia a la insulina y un incremento de la glucosa plasmática en ayuno. 3.3.7 Estudios farmacológicos sobre el MCH-R1 El estudio de análogos de MCH, dejó al descubierto los aminoácidos clave para la activación del MCH-R1, por lo que se comenzaron a producir péptidos antagonistas para el receptor, como el Ac-(Ava9-10, Ava14-15)-MCH (6-16)-NH2 (221-223). Su administración ICV aguda bloquea las 2 horas iniciales de hiperfagia inducida por MCH (219,224), mientras que su administración crónica durante 14 días reduce ingesta y peso (219). En ratones C57BL/6 alimentados con dieta moderadamente alta en grasa, la administración ICV del péptido durante 28 días reduce peso, ingesta, glucosa en plasma, colesterol, y los depósitos grasos y el peso del hígado (224). Este péptido no ejercía su acción en ratones Mchr1-/-, corroborando su especificidad. Ratones obesos alimentados durante un año con dieta alta en grasa (peso corporal de aproximadamente 60 g), se trataron ICV durante 4 semanas con el péptido antagonista del MCH-R1(225). Los ratones perdieron peso y se redujeron los niveles de leptina e insulina. EL hígado de estos ratones perdieron un 50% de peso y disminuyeron los marcadores hepáticos en suero. Continuado con el estudio sobre la esteatosis hepática y MCH, se trataron ICV ratones alimentados con dieta deficiente en colina y metionina que produce esteatohepatitis (226). El tratamiento redujo drásticamente la acumulación de triglicéridos en el hígado. La habilidad del antagonista del MCH-R1 de Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 53 mejorar la esteatosis hepática, se comprobó en un modelo de hembras ovariectomizadas alimentadas con dieta estándar. Treinta semanas después de la ovariectomía, presentan un incremento de peso respecto a los controles. Tras el tratamiento de las mismas con el antagonista de MCH-R1 durante 4 semanas, se observó senda disminución de peso y TG hepáticos (227). Estos modelos genéticos y farmacológicos, evidencian la relevancia de MCH como señal moduladora de los estados fisiológicos con balance energético negativo. Existen evidencias que muestran que las neuronas MCH responden a señales metabólicas periféricas en el hipotálamo. Diferentes estados fisiológicos tales como la restricción de alimentos, el ayuno y el déficit génico de leptina, provocan aumentos significativos del mRNA de MCH (185,228); la administración ICV de leptina reduce los niveles mRNA de MCH (229). Además de la leptina, la glucosa es un nutriente que activa o inhibe la actividad neuronal en los núcleos hipotalámicos (230). La modulación de los concentraciones plasmáticas de la glucosa, se realiza mediante la secreción de insulina por el páncreas, pero el cerebro también está involucrado en dicha modulación (231- 233). Las neuronas MCH, responden a las concentraciones fisiológicas de glucosa mediante una despolarización de la membrana, que produce su activación en un mecanismo dependiente de canales de K+ dependientes de ATP y UCP2 (234,235). La excitación de las neuronas MCH inducido por glucosa, tiene un efecto en la modulación del metabolismo periférico sobre el mantenimiento del estado euglicémico; sugiriendo que las neuronas MCH controlan el metabolismo de la glucosa favoreciendo su síntesis por el hígado y/o incrementando la incorporación de glucosa al músculo o la grasa (235). Sin embargo, los mecanismos fisiológicos bajo los cuales se modula la expresión de MCH en el LH con detalle, están aún por elucidar. 3.3.8 MCH y el eje hipotálamo-hipofisario Además de los amplios estudios sobre la relación de MCH en la homeostasis energética, también se ha descrito una relación entre MCH y la liberación de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) en el hipotálamo, y por tanto con el eje hipotálamo-hipofisario. La administración de MCH en la eminencia media y el área preóptica (zonas donde se localizan las neuronas GnRH) en modelos ovariectomizados, adrenalectomizados y privados de testosterona, produce la liberación de la hormona luteinizante (LH), no siendo así cuando MCH se administra en otras áreas hipotalámicas como el VMH. Este estudio fue el primero que relacionó MCH con el eje hipotálamo-hipofisario (236). Posteriormente, estudios neuroanatómicos mostraron que en aproximadamente el 50-55% de las neuronas GnRH presentan el MCH-R1, y que las neuronas MCH realizan sinapsis con el 85% de las neuronas GnRH (237). Esta liberación de GnRH aparentemente inducida por MCH, coincide con la disminución significativa de los niveles del mRNA de MCH durante la preñez y lactancia; el incremento de prolactina disminuye los niveles de MCH, puesto que puede estar modulando tanto la secreción de GnRH y de la hormona corticotropa (ACTH) durante Introducción 60 Patologías hepáticas asociadas a la homeostasis energética 4. Dependiendo del aporte nutricional, el hígado puede cambiar desde almacenar glucosa en forma de glucógeno a fabricarla y liberarla al torrente sanguíneo, siendo por tanto el árbitro del consumo de energía del resto de tejidos dependientes de glucosa. También es el centro encargado del metabolismo de los aminoácidos y de la detoxificación amónica, siendo el único capaz de generar un compuesto soluble, la urea, para la liberación del amonio derivado del metabolismo proteico. Es importante destacar también su papel en el metabolismo lipídico, sintetiza y degrada lipoproteínas y convierte el exceso de carbohidratos en ácidos grasos para su almacenamiento, además de fabricar cuerpos cetónicos, sustrato que consume el cerebro ante la ausencia de glucosa en estados de inanición. Otras muchas y vitales funciones además de las enumeradas, hacen que el hígado constituya el principal integrador periférico del metabolismo intermediario. El hígado es esencial para mantener el equilibrio metabólico a través del almacenamiento o liberación de grandes cantidades de energía según el estado nutricional del organismo. La función principal del hígado es la del mantenimiento de la concentración de glucosa sanguínea constante a pesar del estado nutricional, y de gestionar el almacenamiento energético. En un estado post-pandrial el hígado centra su actividad en el almacenamiento energético, en forma de glucógeno y triglicéridos, en un proceso dependiente de insulina y del sistema nervioso parasimpático (15,283). Hay tres maneras por las que los triglicéridos pueden formar parte de las reservas hepáticas: lipogénesis de novo, ácidos grasos libres provenientes principalmente del tejido adiposo y triglicéridos de lipoproteínas remanentes (Imagen 20) (285). De todas ellas, la lipogénesis de novo contribuye a una pequeña parte de los TG constituyentes de las VLDL hepáticas (286,287). Los lípidos que provienen de la dieta se empaquetan en el intestino en lipoporteínas denominadas quilomicrones, que los transportan a través de la linfa hacia el hígado, donde se incorporan al mismo por la acción de la LPL Durante la fase postpandrial, estos lípidos son almacenados en el Imagen 20. Rutas metabólicas de ácidos grasos libres y TG involucradas en la oxidación, almacenamiento y secreción de las VLDL en el hígado (284). Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 61 hígado, donde serán acoplados a la apoproteína Apo B100 para formar lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), que serán secretadas y distribuidas por el tejido adiposo. La contribución de TG por parte de lipoproteínas remanentes es importante. En el caso de los remanentes de quilomicrones, existe una rápida eliminación de la sangre por parte del hígado, sobre todo en estado post-pandrial (288,289). En ratones neonatales, la sobreexpresión de la LPL hepática aumenta la secreción de las VLDL con TG provenientes de lipoproteínas remanentes (290); además, estudios in vitro han determinado que los TG aportados por los remanentes contribuyen en la ruta secretora de los mismos (291). Sin embargo, en circunstancias normales, los ácidos grasos libres no esterificados (NEFAs) son los que contribuyen en su mayoría al reservorio hepático de triglicéridos (292). La elasticidad hepática en relación con su capacidad de almacenamiento de triglicéridos, le permite acomodarse a las concentraciones plasmáticas de NEFAs, que, cuando se acumulan en exceso, pueden ser oxidados y/o empaquetados en VLDL por el hígado. Esta flexibilidad en el almacenaje lipídico, permite neutralizar la toxicidad generada por los NEFAs provenientes de la lipólisis del tejido adiposo blanco (293). 4.1 Enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) NAFLD es el término clínico-patológico que abarca un espectro de enfermedades hepáticas que van desde la simple acumulación de triglicéridos en los hepatocitos (esteatosis hepática), a la esteatosis inflamatoria (esteato-hepatitis), fibrosis y cirrosis (285). La enfermedad fue descrita por primera vez en 1980 (294) y está dividida en diferentes categorías histológicas; 1) esteatosis hepática con o sin una ligera inflamación y 2) esteato-hepatitis no alcohólica (NASH) que se diferencia de la anterior por la presencia de un importante daño en los hepatocitos con o sin fibrosis pudiendo derivar en hepato-carcinoma (Imagen 21) (295). La presencia de fibrosis hepática, es uno de los signos más importantes en la determinación de un pronóstico hacia el desarrollo de cirrosis. Dado que la mayoría de pacientes que progresan a estados avanzados de fibrosis tenían en origen esteato-hepatitis (296), la morbilidad hepática atribuida a pacientes con NASH que desarrollaran finalmente cirrosos es de un 20% (296). Sin embargo, la esteatosis no alcohólica tiene un curso más benigno, con un estimado riesgo de progresión a cirrosis de menos del 4%, siendo aun así, los que presentan una ligera inflamación, aquellos con un mayor riesgo (296-298). Introducción 62 4.1.1 Epidemiología La prevalencia del NAFLD en la población general se estima que es alrededor de entre un 14 y 24 % (15,299-301). Normalmente se ha tratado como una enfermedad específica de adultos, pero la prevalencia de la enfermedad ha aumentado intensamente en todas los segmentos de la población incluidos los niños. EL incremento de la prevalencia de la obesidad y la diabetes tipo 2 en la población es seguramente el responsable del floreciente número de individuos con esteatosis hepática (302). Imagen 21. A grandes rasgos, la enfermedad de hígado graso no alcohólico se divide entre las que no desarrollan inflamación (NAFLD) (paneles A-B) y las que presentan diversos grados de inflamación (NASH) (panel C); pudiendo llegar incluso a fibrosis hepática (panel D), donde se observa que el colágeno invade los sinusoides hepáticos. Si la enfermedad continúa se acaba desarrollando cirrosis hepática (panel E) donde el colágeno ya empieza a formar nódulos (punta de flecha) (294). Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 63 4.1.2 Fisiopatología de la esteatosis hepática El desarrollo de la esteatosis está modulado por diversos mecanismos metabólicos, genéticos, ambientales e incluso dependientes de la microbiota intestinal (303). La sobre-nutrición y la obesidad observada en pacientes con NAFLD está acompañado de hipertrigliceridemia y resistencia a la insulina, de hecho se ha considerado la NAFLD como parte del síndrome metabólico, siendo la resistencia a la insulina un requisito para su desarrollo (304,305); la prevalencia de esteatosis en pacientes con obesidad es alrededor del 75% (15). Los mecanismos por los que el hígado acumula lípidos y genera un desequilibrio en el almacenamiento graso reflejado en grandes gotas lipídicas pueden ser 1) incremento de incorporación de lípidos, 2) aumento en la biosíntesis de novo de ácidos grasos, 3) desajuste en la síntesis o secreción de lipoproteínas y 4) una reducción de la oxidación de los ácidos grasos (306). La sobre-nutrición implica un mayor almacenamiento lipídico derivado de las lipoproteínas, así como un aumento de la biosíntesis de novo inducido por insulina derivado del exceso de carbohidratos y grasas contenidos en las dietas de altas calorías (Imagen 22). En pacientes con NAFLD, los triglicéridos intra-hepáticos provienen en su mayoría de NEFAs circulantes tanto de origen exógeno como endógeno (lipólisis) (307). Los pacientes con diabetes tipo 2 incorporan al hígado ácidos grasos libres provenientes de la dieta un 50% más rápido que los controles (308). Estos pacientes presentan elevados niveles de ácidos grasos circulantes, debido a que la resistencia a la insulina impide la inhibición de la lipólisis en el tejido adiposo (309). Sin embargo también se ha descrito que existe una mayor ratio de biosíntesis de novo de lípidos en pacientes con Imagen 22. Alteraciones metabólicas hepáticas derivadas de la acumulación de triglicéridos en estados de resistencia a la insulina (15). Introducción 64 NAFLD y resistencia a insulina (307,310). En un estado de hiper-insulinemia e hiperglicemia la insulina y la glucosa induce la expresión hepática de los factores de transcripción denominados proteína de unión reguladora de esterol tipo 1-c (SREBP1- c) y la proteína de unión en respuesta a carbohidratos (ChREBP) respectivamente, activadores de enzimas implicadas en la biosíntesis de novo de lípidos (311). Sorprendentemente, incluso bajo un importante estado de resistencia a la insulina, ésta es capaz de continuar estimulando la SREBP-1c, activando la biosíntesis lipídica de novo contribuyendo a la formación de un hígado graso (312). La composición de los ácidos grasos del hígado también influye en la cantidad de triglicéridos que se acumulan mediante la alteración de la actividad de AMPK. La deleción genética de la esteroil CoA desaturasa (SCD-1), una enzima responsable de la síntesis de ácidos grasos monoinsaturados, protege contra el desarrollo de hígado graso y la resistencia a la insulina en ratones (313,314). En ausencia de SCD-1, la AMPK se activa (315), lo que resulta en la fosforilación y la inhibición de ACC (316) y ChREBP (317), así como una reducción en los niveles de expresión de SREBP-1c (318). El fármaco antidiabético metformina también activa la AMPK hepática (318). El tratamiento de ratones ob/ob con metformina reduce notablemente la esteatosis hepática (319), y su administración a seres humanos con esteato-hepatitis mejora la funcionabilidad hepática y la disminución de tamaño del hígado (305). Una segunda clase de fármacos antidiabéticos, las tiazolidinedionas (TZDs), se reconocen principalmente como fármacos que activan el receptor del peroxisomaproliferador activado gamma (PPAR-γ). Sin embargo, existen estudios que sugieren que también pueden activar AMPK (320,321). Los estudios piloto en humanos utilizando la pioglitazona (322,323) y la rosiglitazona (324) han demostrado la eficacia de estos agentes en la reducción de la grasa hepática, presumiblemente como consecuencia de los acontecimientos moleculares que resumidos en la imagen 23. Imagen 23. Consecuencias de la activación de AMPK en el hígado. LA metformina y los TZDs, activan AMPK, reduciendo la lipogénesis por tres mecanismos diferenciados. Como resultado disminuye la concentración de malonil-CoA, activándose la CPT1A, incrementando, por tanto, la oxidación de los ácidos grasos libres. (15). Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 65 En conjunto, estos estudios sugieren que el aumento de la lipogénesis hepática es una importante alteración metabólica subyacente en la patogénesis de la esteatosis en hígados resistentes a la insulina. Este aumento de la lipogénesis, en realidad puede generar alteraciones metabólicas que conducen a un mayor contenido de triglicéridos hepáticos. La primera la alteración es directa, a través del aumento de la síntesis de triglicéridos. El segundo es una alteración indirecta, a través de una mayor producción de malonil-CoA, que al inhibir el CPT-1A impide la entrada de los ácidos grasos a la mitocondria, y por tanto, reduce la β-oxidación (Imagen 22). En el desarrollo de la esteatosis, además de la influencia del tejido adiposo como fuete de ácidos grasos, el intestino delgado también puede intervenir. Estudios realizados en ratones libres de gérmenes demuestran el papel de la microbiota intestinal en la absorción y almacenamiento energético derivado de la ingesta de alimentos. El trasplante de la microbiota intestinal de ratones normales a aquellos libre de gérmenes (proceso conocido como convencionalización) da lugar a un aumento de peso, de masa grasa y resistencia a la insulina (325); lo que sugiere que la microbiota intestinal influye en la absorción de energía adiposidad, inflamación y resistencia a la insulina. La endotoxina lipopolisacárido (LPS) es un constituyente principal de muchas de las bacterias constituyentes de la microbiota. La manipulación de la microbiota intestinal, incluso mediante el uso de determinados ingredientes en la alimentación, puede afectar al metabolismo de los LPS incrementando sus niveles circulantes. Una dieta alta en grasa o en carbohidratos en humanos, incrementa los niveles circulante de LPS en tan sólo tres días (326). La endotoxemia por LPS empeora la obesidad en si misma pero no genera procesos inflamatorios. En ratones con endotoxemia inducida el aumento de tejido adiposo y la esteatosis resistencia hepática a la insulina se desarrolló de igual manera que tras la ingesta de una dieta alta en grasa (327). Estos estudios muestran que la endotoxinemia induce acumulación lipídica en el hígado pero no esteato-hepatitis. Introducción 66 4.2 Esteato-hepatitis no alcohólica (NASH) A pesar de la alta prevalencia del hígado graso no alcohólico y su potencialidad para dejar graves secuelas, los factores etiológicos subyacentes que determinan la progresión de la enfermedad a esteatoheptatitis, fibrosis e incluso cirrosis siguen siendo poco conocidos. Existen limitaciones para estudiar los cambios moleculares y fisiológicos que favorecen la transición de esteatosis a NASH por varios factores. En primer lugar no hay modelos animales que incorporan todas las características del NASH humano; en segundo lugar, las técnicas no invasivas disponibles para estudiar el metabolismo hepático en humanos es limitado. Por lo tanto, nuestra compresión actual de los mecanismos por los que la esteatosis hepática progresa a NASH se basa exclusivamente en los datos relativos modelos animales. La progresión de esteatosis a esteato-hepatitis se asocia a una lipotoxicidad que genera una disfunción mitocondrial, estrés del retículo endoplasmático (ER-stress), formación de especies reactivas al oxígeno (ROS) y activación de rutas inflamatorias; es decir c-Jun N-terminal kinasa (JNK), el inhibidor de factor nuclear kβ (IKK-β) y receptor kinasa tipo Toll 4 (TLR-4) (Figura 24) (328,329). La β-oxidación mitocondrial es la principal ruta de degradación de los ácidos grasos bajo condiciones fisiológicas normales, pero también puede ser la mayor fuente de ROS (330). En pacientes con NAFLD se han detectado anormalidades en la ultraestructura mitocondrial hepática (331), lo que explica la reducida tasa de respiración mitocondrial de los mismos (332). Una de las razones de esa disfunción está en la lipotoxicidad, generada por la acumulación de lípidos saturados como el palmitato en la esteatosis. Su oxidación genera la acumulación de metabolitos tóxicos Imagen 24. Representación esquemática de la fisiopatología de la esteato-hepatitis no alcohólica (327). Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 67 derivados de los mismos, produciendo la disfunción mitocondrial y lipotoxicidad (328,329). La disfunción y la reducción en tasa de respiración mitocondrial dan lugar a la generación de ROS (Imagen 25). Si la capacidad oxidativa de las mitocondrias se reduce, los ácidos grasos citosólicos se acumulan y se activan vías alternativas de oxidación en peroxisomas y microsomas, resultando en una mayor acumulación de ROS debido a que dichas oxidaciones son menos efectivas (333,334). La acumulación de ROS y de ácidos grasos mitocondriales producirá la peroxidación lipídica (335), debido a la reacción entre los ROS y los ácidos grasos poli-insaturados (PUFAs), generando aldehídos de PUFAs con un vida media más longeva que los ROS amplificando los efectos del estrés oxidativo. Adicionalmente, la peroxidación de los PUFAs amplifica la proteólisis de la ApoB en el retículo endoplasmático, reduciendo la secreción de VLDL en roedores (336), contribuyendo a una mayor acumulación lipídica en el hígado. En este contexto de lipotoxicidad y estrés oxidativo se generan importantes daños en la homeostasis del hepatocito, afectando de forma negativa en la síntesis de nucleótidos y proteínas; se agota el glutatión como anti-oxidante y aumenta la producción de la citokina pro-inflamatoria TNF-α facilitando la entrada de células inflamatorias al hígado y activando las células Kupffer a células estrelladas, promoviendo el depósito de colágeno, fibrosis y perpetuación de la respuesta inflamatoria (15). Imagen 25. Mecanismos de generación de ROS en hepatocitos derivados del metabolismo lipídico en NAFLD (16). Introducción 68 4.2.1 Acción del tejido adiposo blanco sobre el desarrollo de NASH La hipertrofia del tejido adiposo en organismos obesos, también contribuye a la generación del NASH. Existe una estrecha relación entre los adipocitos hipertróficos resistentes a la insulina, la inmunidad desregulada tanto en la grasa como en el hígado y la esteato-hepatitis inducida por lipotoxicidad. Los adipocitos y la fracción vascular del tejido graso (estroma) segregan una serie de hormonas, factores del complemento, citokinas (TNF-α, interleukinas), quimiocinas y adipokinas funcionando como un tejido endocrino. Como se ha mencionado con anterioridad, la adiponectina es una de estas adipokinas, cuya reducida secreción de la misma en obesidad altera el metabolismo de lípidos y la sensibilidad de la insulina en el hígado; la administración de adiponectina en ratones obesos alimentados con dieta alta en grasa alivia espectacularmente la hepatomegalia, esteatosis e inflamación (337). En la esteatoheptatitis, la disminución de la secreción de adiponectina por los adipocitos disfuncionales contribuye a la formación de NASH (338). Los macrófagos del tejido adiposo son una importarte fracción del estroma (339,340). La activación de los macrófagos del tejido adiposo, juegan un importante papel en la disfunción de la grasa generando resistencia a la insulina, liberación de ácidos grasos libres al torrente sanguíneo y la deposición grasa ectópica en el hígado (328). En el estroma hay dos tipos de macrófagos: 1) los macrófagos M1 o macrófagos de activación clásica que juegan un papel clave en la inmunidad humoral y en la respuesta a patógenos; secretan grandes cantidades de citokinas pro-inflamatorias (TNF-α, IL-6, IL-12...) y bajos niveles de citokinas anti-inflamatorias (IL-10); y 2) macrófagos M2 o de activación alternativa con función anti-inflamatoria (341). Un aumento de macrófagos M1 respecto a M2 es característico de roedores alimentados con dieta alta en grasa (341,342) y humanos obesos (343). Las células Kupffer son el equivalente a los macrófagos del tejido adiposo. En primer lugar son promocitos y monoblastos de la médula ósea que se diferencian en monocitos en la sangre periférica, localizándose en las sinusoides hepáticas como macrófagos especializados del sistema retículo-endotelial del hígado. Como se observa en la imagen 24, las células Kupffer (células estrelladas al activarse) son la mayor fuente de citokinas inflamatorias y su interacción con las células B y T produce una función similar a los macrófagos M1 en el desarrollo de resistencia a la insulina, inflamación y apoptosis hepática (344,345). La activación de los macrófagos del tejido adiposo precede a la activación de las células Kupffer. En ratones alimentados con dieta alta en grasa, la activación de macrófagos y la expresión de citokinas inflamatorias en el tejido adiposo sucede rápidamente y eventualmente generan esteato-hepatitis (346,347). Sin embargo, la infiltración de macrófagos M1 y la esteato-hepatitis ocurre semanas después de la desregulación del tejido adiposo. Teniendo en cuenta estos estudios, el desequilibrio entre macrófagos M1/M2 y la liberación de factores inflamatorios por las células Kupffer son importantes factores para el desarrollo de NASH (Imagen 26). Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 69 4.2.2 Efecto del estrés del retículo endoplasmático en NASH El desequilibrio crónico del balance energético entre la oferta y la demanda de nutrientes, como se observa en la obesidad, expone a las células a sucesos lipotóxicos que, como consecuencia, activan vías de estrés celular. Numerosos estudios han señalado la estrecha relación entre el metabolismo lipídico y el estrás del retículo endoplasmático (Estrés-RE) en el desarrollo de NASH (348-352). El ER-stress es una consecuencia de la acumulación de proteínas mal desplegadas en el lumen del retículo endoplasmático producidas por estímulos biológicos, fisiológicos o patológicos (353). El retículo endoplasmático es exquisitamente sensible a las alteraciones en la homeostasis celular detectado por la chaperona de unión a inmunoglobulina/proteína regulada por glucosa 78 (BIP/GRP78) (353). La acumulación de las proteínas desplegadas en el lumen del retículo secuestra GPR78 apartándolo del dominio que constituye GPR78 con los tres sensores, cuya consecuencia es la activación de los mismos. La activación de los tres sensores de estrés por la disociación de GPR78 ante la acumulación de proteínas defectuosas en el lumen del retículo desencadena la denominada “respuesta ante proteínas mal plegadas” (UPR) para restaurar el correcto funcionamiento de retículo endoplasmático. El desencadenante de la UPR por GPR78 activa 3 de vías de transducción de señales diferentes; 1) proteína requerida de inositol (IRE) 1α, 2) kinasa del factor de transcripción pancreático del retículo endoplásmico Imagen 26. En el tejido adiposo, la fracción vascular estromal incluye células inmunitarias. En la obesidad, la activación de los macrófagos contribuye al desarrollo de adipocitos disfuncionales resistentes a la insulina; éstos liberan cantidades excesivas de ácidos grasos libres, generando resistencia a la insulina y lipoapoptosis en tejidos periféricos como el hígado. La acumulación de metabolitos tóxicos derivados de los lípidos, activa las vías inflamatorias de los hepatocitos y células Kupffer que deriva en daño hepático (327). MATERIAL Y MÉTODOS Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 79 MATERIAL Y MÉTODOS Animales de experimentación 1. Todos los experimentos con animales fueron revisados y aprobados por el comité ético de la universidad de Santiago de Compostela (procedimientos del Prof. Rubén Nogueiras Pozo; 1500AE/12/FUN01/FIS02/RNP2 y 15005AE/12/FUN01/FIS02/RNP1) de acuerdo con la normativa europea y española para el uso de animales de experimentación animal; realizado, por tanto, en cumplimiento de la directiva 2010/63/UE del Parlamento y Consejo Europeo del 22 de septiembre de 2010 relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos; real decreto de España 1201/2005, del 10 de Octubre, sobre protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos y bajo el real decreto de España 296/2008 del 30 de diciembre, de protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos, incluida la docencia. En vista de las consideraciones éticas asociadas con el uso de animales, los diseños experimentales se realizaron teniendo en cuenta el principio de las tres R (reemplazo, reducción y refinamiento). En base a estos principios, durante la realización de esta tesis doctoral, se aseguró que los procedimientos realizados fueran aquellos que: implicaran el uso mínimo de animales para alcanzar los objetivos; afectara lo mínimo a la capacidad de sentir dolor, sufrimiento, angustia o daño duradero; y, por tanto, tuvieran mayores probabilidades de producir resultados satisfactorios. Debido a la naturaleza intrínseca de la tesis (objetivos y perspectiva fisiológica del estudio) se limitó seriamente la posibilidad de reemplazar el uso de animales. La homeostasis energética implica la comunicación de los tejidos periféricos (hígado, tracto gastrointestinal, tejido adiposo) con el CNS a través de señales que llegan al cerebro por el torrente sanguíneo; por ello, la sustitución de los modelos animales por modelos celulares o tejidos aislados no se consideró factible. Sin embargo, sí se realizaron esfuerzos con el fin de reducir lo máximo posible el número de roedores utilizados en los procedimientos. Con este objetivo, se estudiaron las diferentes variables a evaluar en cada experimento y se coordinó su diseño. La metodología empleada permitió la recolección de múltiples muestras de tejidos y la realización de distintos análisis sobre los mismos animales siempre que fuera posible. La experiencia adquirida permitió refinar los procedimientos experimentales a fin de eliminar o reducir al mínimo cualquier posible dolor, sufrimiento, angustia o daño duradero como se ha mencionado previamente. En todos los procedimientos experimentales se usaron ratas (cepa Sprague- Dawley) o ratones (cepas C57-BL6 o Swiss) macho de entre 8 a 10 semanas de edad, con pesos comprendidos entre 200-250 gr en ratas y entre 25-30 gr en ratones. Los animales se estabularon bajo condiciones controladas de luz (12 horas luz/ 12 horas Material y métodos 80 oscuridad) y temperatura, con un periodo de adaptación, previo a los procedimientos experimentales, de entre 5 a 7 días. Los animales se mantuvieron con acceso libre a comida y agua, excepto en los procedimientos experimentales que requieran un control de ingesta. Con el fin de reducir el estrés causado por el procedimiento experimental y para acostumbrarlos al manejo por el personal del laboratorio, durante el periodo de adaptación se monitorizó periódicamente la ingesta y el peso. Cuando se requería de una cirugía que implicara un procedimiento invasivo o potencialmente doloroso, los animales deben encontrarse bajo los efectos de una anestesia general. Para ello, se administró intraperitonealmente (IP) una solución anestésica disuelta en suero fisiológico, consistente en 80 mg/kg de ketamina (Imalgene 1000, Merial) y 8 mg/kg de xilacina (Rompun, Bayer HealthCare) para rata, y 100 mg/kg de ketamina, 20 mg/kg de xilacina para ratón. Tras la intervención se administró subcutáneamente (SC) suero fisiológico para evitar la deshidratación causada por la anestesia, y ketoprofeno (Orudis 100 mg, Sanofi Aventis) a una dosis de 2,5 mg/kg como analgésico para rata y ratón. Tras la cirugía, con el fin de realizar un seguimiento exhaustivo de la ingesta y el peso corporal, los animales se estabularon individualmente. Las dietas utilizadas se detallan en los diseños experimentales. Se utilizó dieta estándar y dieta deficiente en metionina y colina (MCD). Al final de los procedimientos, cuando se requería la colección de muestras/tejidos, los animales fueron sacrificaron por decapitación. Las muestras de tejido obtenidas por disección, se exponían a rápida congelación en anhídrido carbónico sólido (nieve carbónica) y posteriormente almacenadas a – 80 oC (análisis de RNA, proteína, valores séricos); para análisis histológicos se les introducía en paraformaldehído 10% para su posterior inclusión en parafina. Para estudios a nivel central, las ratas se anestesiaban y se procedía a su perfusión intracardiaca con suero salino para eliminar toda la sangre del torrente y posteriormente con paraformaldehído 10%. Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 81 Técnicas experimentales in vivo. 2. 2.1 Canulación intra cerebroventricular (ICV) Esta intervención se realiza para tener acceso al ventrículo lateral del cerebro de rata o ratón. La inyección de diversas sustancias en dicho ventrículo, permite el acceso de las mismas al hipotálamo. Para ello se utilizaron cánulas fabricadas a partir de un tubo de polietileno de 20 y 22 gauges para rata o ratón respectivamente (PE-20 y PE 50, Becto-Dickinson). El extremo de la cánula se realiza de forma biselada con un tamaño de bisel de 0,5 mm y una distancia desde el extremo a un tope incorporado previamente de 4 mm para rata y 2,5 mm para ratón. El otro extremo de la cánula queda sellado hasta el día del experimento. El procedimiento requiere anestesia general. A continuación se realiza un corte en sagital en la piel que recubre la cabeza, dejando la parte superior del cráneo al descubierto. Se limpia bien la zona hasta que el bregma queda al descubierto, siendo éste el punto de origen para la implantación de la cánula. La cánula se implanta en el lado derecho o izquierdo (asignado aleatoriamente) del ventrículo lateral [desde el bregma: -0,9 mm anteroposterior (AP), ±1,5 mediolateral (L), -3,50 mm dorsoventral (DV) en ratas; -0,6 mm AP, ±1,2 mm L, 2 mm DV en ratones]. Una vez implantada se adhiere al cráneo con cianocrilato. Una vez se haya secado, se cierra la abertura cosiendo con seda quirúrgica o cianocrilato según convenga. 2.2 Bombas osmóticas Para la administración crónica de un compuesto en el cerebro, se utilizaron bombas osmóticas de 7 días (modelo 2001 para ratas, 1007D para ratones, Alzet Osmotic Pumps) que liberan de forma continua y constante la sustancia. Entre 4-8 horas antes de la intervención, las bombas deben prepararse e hidratarse con el compuesto en un baño a 37 oC; de esta forma se asegura que la sustancia ya se esté liberando al implantarlo. Se realizaron do tipos de infusión crónica: en el ventrículo lateral y núcleo-específica. - Infusión en el ventrículo lateral: tras colocar la cánula ICV como se ha descrito previamente, la bomba se une a la cánula mediante un tubo de silicona de grado médico (Degania) y se sella la unión con cianocrilato. La bomba se coloca bajo la piel del animal en la zona retrocervical y se cose con seda quirúrgica. - Infusión núcleo-hipotalámica: en este caso, se realiza una administración bilateral del compuesto al núcleo específico de la rata, mediante dos bombas osmóticas modelo 1007D. Para ello, se implantaron unas cánulas a medida (Plastic One) que consisten en un pedestal con dos entradas en dirección posterior, una para cada bomba, y dos salidas en dirección ventral hacia cada núcleo. Para el núcleo arcuato la medida entre las salidas ventrales fue de 0,6 mm y una longitud DV de 10,1 Material y métodos 82 mm, implantándose a -2,8 mm respecto al bregma. Para el núcleo lateral, la medida entre las salidas ventrales era de 4 mm y una longitud DV de 8 mm, implantándose a - 2,9 mm respecto el bregma. Las bombas se unen al conector mediante tubo de silicona y se sella la unión con cianocrilato. La incisión se sutura con seda quirúrgica. 2.3 Estereotaxia Tanto para la implantación de bombas núcleo específicas, como para la administración directa de algún compuesto, se utiliza un aparato estereotáxico. Este instrumento permite localizar tridimensionalmente una zona para realizar una administración localizada de cualquier sustancia en el cerebro. En este caso, la administración se realiza bilateralmente en diferentes núcleos hipotalámicos. Cada núcleo tiene una coordenada concreta, utilizando el bregma como punto de referencia para la obtención de las coordenadas estereotáxicas anteroposterior (AP), lateral (L) y dorso-ventral (DV), siguiendo las indicaciones del atlas estereotáxico del cerebro de rata y de ratón (360,361). El bregma es el punto craneal en el que confluyen las suturas del hueso frontal con los dos temporales. Siguiendo las indicaciones del atlas, las coordenadas de los núcleos hipotalámicos estudiados fueron las siguientes: - Núcleo arcuato en rata: -2,8 mm AP; ± 0,3 mm L y 10,2 mm DV. - Núcleo lateral en rata: -2,85 mm AP; ± 2 mm L; -8,1 mm DV. - Núcleo ventromedial en rata: -2,85 mm AP; ± 0,6 mm L; 10,1 mm DV. - Núcleo lateral en ratón: -1,3 mm AP; ±1,1 mm L; -5,2 mm DV. Una vez anestesiado el animal, se coloca en el estereotáxico y se fija el cráneo en los planos vertical y horizontal. Se realiza una incisión sobre la piel en dirección sagital. Tras rebatir la piel se localiza el bregma, y se determinan las tres coordenadas del punto de referencia (AP, L y DV). A estas coordenadas les serán sumadas o restadas las coordenadas de cada núcleo hipotalámico a estudio. Una vez localizada la zona se procederá a realizar el orificio y la posterior administración de una sustancia utilizado una jeringa Hamilton 7001 KH 25 gauges o implantando las cánulas núcleo específicas para la implantación de bombas de bombas osmóticas explicado anteriormente. Tras ello, se sutura la abertura con seda quirúrgica. 2.4 Administración viral en la vena de la cola Para poder modular la expresión génica en el hígado, la administración de vectores adenovirales se realiza desde la vena de la cola de ratones. La administración por esta vía asegura la infección del virus en el hígado con una elevada especificidad (362,363). Este procedimiento no requiere de anestesia al no ser una intervención invasiva. El ratón se inmoviliza en un cepo especial que deja la cola libre. Para visualizar la vena con más claridad, se empapa con un algodón la zona con alcohol de 96 o. Con una aguja de 27 gauges, se administra el adenovirus a una dosis de 1*108 unidades virales Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 83 (UV) en un volumen de 100 µL. Tras el pinchazo, se presiona la zona hasta que no se observe ningún sangrado. 2.5 Canulación intravenosa (IV) Esta técnica está indicada para poder administrar directamente al torrente sanguíneo sustancias cuyo efecto se ve reflejado en la composición del suero sanguíneo; nos permite administrar y tomar muestra sanguínea con el animal en libre movimiento. La canulación se realiza en la vena yugular como la correcta vía de acceso al sistema cardiovascular, debido a la proximidad de la vena a la piel del cuello, facilidad de disección y gran calibre. Para ello se fabrican cánulas de la siguiente forma: cánula de polietileno PE-50 (Clay-Adams, Becton-Dickinson) y con una longitud de 8 cm; el extremo que será introducido en la vena, lleva acoplado un tubo de silástico de 4,5 cm para facilitar su entrada. Dentro de la cánula se inserta una guía de nylon de calibre 30 y diámetro de 0,32 ajustándose perfectamente al diámetro interno de la cánula. Esta guía evita el sangrado y la obturación la de la cánula. El espacio residual interno se rellena con un aceite vegetal mineral inerte (Sigma) que, por su viscosidad, evita la entrada de sangre en la cánula ya colocada. Tras anestesiar la rata, se fija el animal en posición supino y se disecciona la zona derecha de la piel del cuello y el músculo hasta ver la vena yugular externa. Una vez descubierta, se anuda con seda la parte cervical de la misma para evitar el posterior sangrado. A continuación se hace un pequeño corte en la pared de la vena con una micro-tijera y se introduce el extremo de silástico hasta llegar a la confluencia de la vena cava superior y la aurícula derecha. Se fija la cánula a la vena y a los músculos colindantes con seda quirúrgica. Para evitar molestias en la rata y facilitar es uso de la cánula, se hace pasar la misma por un trayecto subcutáneo hasta la zona retrocervical. De esta forma el extremo de la cánula externa queda libre para la administración de sustancias o extracción de muestra de sangre. 2.6 Vagotomía quirúrgica El procedimiento se realiza en ratas previamente anestesiadas. La rata se inmoviliza en posición supina y se realiza una incisión abdominal en la línea media. El hígado se mueve cuidadosamente a la derecha para exponer el esófago. Alrededor del mismo se localizan las ramas dorsales y ventrales del nervio vago y cuidadosamente se diseccionan ambas. Posteriormente se le realiza un punto de sutura al extremo de cada rama seccionada para evitar sangrados. Una vez finalizada la vagotomía, los músculos abdominales y la piel se suturan con seda. Los músculos abdominales y la piel se suturan con seda quirúrgica. La eficacia de la vagotomía se evaluó una semana después de la cirugía por la observación de hipertrofia del estómago en ratas post mortem. Sólo las ratas que mostraron un aumento evidente en el tamaño del Material y métodos 84 estómago después de la vagotomía se incluyeron en el análisis. El grupo control de la cirugía se realiza bajo el mismo procedimiento, pero una vez expuesto el esófago con las ramas del vago se sutura la abertura. 2.7 Registro de la actividad de la inervación simpática del tejido adiposo blanco (SNA) 1 El registro de la actividad nerviosa del simpático (SNA) se realizó en ratones C57 BK/6J (Jackson Laboratories) con una edad comprendida entre las 14 y 16 semanas. Se les realizó una canulación ICV y se dejaron recuperar 7 días. Tras la recuperación, los ratones se re-anestesiaron e inmediatamente se intubaron por la tráquea con un tubo de polietileno PE-50 para realizar un intercambio de flujo de aire ambiental enriquecido con O2. A continuación se realiza una canulación intravenosa en la vena yugular derecha y el la arteria carótida izquierda para realizar la perfusión de - cloralosa como sedante (dosis inicial de 12 mg/kg, dosis de mantenimiento 6.25 mg/kg/hora) por la yugular y para las mediciones hemodinámicas por la carótida. La temperatura se monitoriza mediante medición rectal, manteniéndola a 37ºC con ayuda de una mesa quirúrgica con control de temperatura y una lámpara de infrarrojos. Con el ratón en la misma posición, se hace una incisión en la zona inguinal para acceder al tejido adiposo blanco perigonadal del lado izquierdo. Una vez expuesta la grasa se identifica un solo nervio multifibroso y se genera un charco de aceite mineral de elevado peso molecular. A continuación se precede a su aislamiento y disección lejos de tejido conectivo y de los vasos sanguíneos. El nervio ya asilado se coloca cuidadosamente en un bipolar de calibre 36 con electrodos de hilo de platinoiridio y se sella con gel de silicona (Kwik -Sil; WPI, Sarasota, FL). La señal de la SNA se amplificó hasta 105 veces con un preamplificador Grass P5 y filtrado por un corte de baja (100hz) y alta (1000 Hz) frecuencia respectivamente. Estas señales amplificadas y filtradas se dirigen: i) un sistema de altavoces y a un osciloscopio (modelo 54501A, Hewlett-Packard Co) para la observación auditiva y visual de la SNA del tejido adiposo y ii) por un convertidor análogo-digital de MacLab (modelo 8S, ADInstruments), dónde se localizó la señal de ruido de fondo, colocando el cursor de medición para detectar el número de picos por segundo por encima de ese umbral (histograma de frecuencias). Tras todo el procedimiento quirúrgico, y la puesta a punto del registro del SNA, al ratón se le deja estabilizar durante 15-20 minutos. La actividad basal del nervio simpático del tejido adiposo se registró durante un periodo control de 10 minutos seguido de una inyección ICV del vehículo (solución salina, 2 µl) o MCH (dosis de 5 o 10 µg, 2 µl). La medición de SNA de la grasa se registró de forma continuada durante las 1 Procedimiento realizado por el Dr. Donald A. Morgan y el Dr. Kammal Rahmouni, en el departamento de farmacología del Caver College of Medicine de la Universidad de Iowa, Ciudad de Iowa, EEUU. Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 85 siguientes 4 horas. Para evaluar el efecto de la administración ICV de MCH (10 µg) en la actividad del nervio eferente respecto al nervio aferente, en algunos ratones, los nervios se cortaron en la parte distal y proximal respectivamente en el lugar de registro antes del tratamiento. Cualquier tipo de actividad de fondo detectado en estos ratones de nervios seccionados se resta a la SNA del tejido adiposo gonadal. 2.8 Fenotipado metabólico Para el fenotipado metabólico durante los tratamientos, se determinó la composición corporal utilizando un aparato de resonancia magnética nuclear para roedores (NMR, Echo Medical Systems) y el gasto energético, ingesta, actividad locomotora y tasa de respiración metabólica (RQ) utilizando un sistema de 12 cajas con medición simultánea de calorimetría indirecta (LAbMaster TSE Systems). El sistema permite que se puedan medir los parámetros de forma continua y simultáneamente en un máximo de 12 animales.  Composición corporal. Antes y después de los procedimientos experimentales, la composición corporal fue estimada mediante el NMR para determinar la variación de masa grasa y magra.  Sistema de calorimetría indirecta Para el estudio de los factores que regulan la partición nutricional, se utilizan sistemas de fenotipado indirecto o sistemas de calorimetría indirecta. Este tipo de sistema nos permite reflejar el estado nutricional del organismo en estudio bajo diferentes condiciones genéticas, farmacológicas u usando distintos tipos de dieta. El calcula de forma simultánea la actividad locomotora, la ingesta y la tasa de respiración metabólica. Con estas variables se puede hallar el gasto energético y establecer patrones de partición nutricional en las diferentes condiciones de estudio. Este aparato registra el gasto energético, actividad locomotora, ingesta y tasa de respiración. Cada 20 minutos, durante 48 horas, el LabMaster toma medidas de ingesta, consumo de O2 (vO2), producción de CO2 (vCO2) y actividad locomotora entre otros. Los animales se adaptaron al nuevo tipo de ambiente instalándolos en cajas de adaptación durante 48 horas antes de las mediciones. Con los valores obtenidos, se calculó la RQ de cada individuo durante cada medición dividiendo el vCO2 entre el vO2 (vCO2/vO2). El valor de gasto energético (EE) resultante (kcal/48h) fue también normalizado con el peso total del animal o con la masa magra, medido al final del proceso con NMR (EE/g masa magra). La actividad locomotora se detecta utilizando unos sensores de luz infrarroja que registran el movimiento en sentido horizontal y vertical. - Tasa de respiración metabólica (respiratory quotient; RQ) Nos permite detectar cuál es el principal combustible oxidado en el organismo estudiado. La RQ es, en términos de medición, la relación entre el volumen de CO2 Material y métodos 92 3.2 Análisis de proteína por western blot Para determinar los niveles de expresión proteica de los diferentes experimentos, realizamos la técnica de western blot de la que se obtiene como resultado una imagen fotográfica en la que sólo se disciernen aquellas proteínas contra las que se haya añadido un anticuerpo por inmunodetección indirecta. La imagen se obtiene por la impresión en una placa radiográfica de la quimioluminiscencia proveniente de una membrana en la que se inmovilizaron las proteínas de una muestra, separadas por su peso molecular mediante electroforesis SDS-PAGE. De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a una proteína constitutiva usada como control de carga proteica. 3.2.1 Extracción de proteína De las muestras de tejido conservadas a -80 oC, se obtuvo una pequeña porción para su procesado. Durante todo el proceso las muestras se deben de mantener en hielo durante el para evitar la degradación de las proteínas. El tejido y el tampón de lisis se colocan junto con una bolita de acero en un tubo de polipropileno de 2 ml y se homogeniza en el Tissue lyser. El tampón de lisis (Tabla 4) facilita, junto con la homogenización mecánica, la rotura del tejido y los componentes celulares disolviéndose las proteínas del tejido en el mismo. Tampón de lisis Tris-HCl pH 7,5 50 mM EGTA 1 mM EDTA 1 mM Tritón X-100 1% vol/vol Ortovanadato Sódico 1 mM Fluoruro Sódico 50 mM Pirofosfato Sódico 5 mM Sacarosa 0,27 M Fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM Cocktail inhibidor proteasas (ROCHE) 1 pastilla/50 mL Tras las homogenización las muestras se centrifugan a 13200 rpm a 4 oC durante 30 minutos. A continuación el sobrenadante (extracto proteico) se alicuotea a un tubo nuevo, descartando el precipitado (núcleos y artefactos de tejido) y la posible capa superior de grasa. En el caso de las muestras de tejido adiposo e hígado esteatósico se deben de realizar varias centrifugaciones sobre el extracto inicial para descartar la grasa. Tabla 4| Componentes del tampón de lisis disuelto en agua destilada. Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 93 3.2.2 Cuantificación de proteínas Para cuantificar las proteínas contenidas en el extracto realizamos un método colorimétrico con la solución de Bradford (Bio-rad Protein Assay Kit). El método se basa en el cambio del color marrón del colorante azul comassie G250 en un medio con ácido fosfórico (absorbancia 466 nm) al azul en presencia de proteínas. El colorante es de naturaleza hidrofóbica y se introduce en el interior de las estructuras proteicas, evitando su contacto en el ácido fosfórico de la solución tomando su original tonalidad azul (595 nm). Para la determinación en nuestras muestras realizamos una curva patrón de sero-albúmina bovina (BSA), realizando una curva de diluciones seriadas a partir de la máxima concentración (1 mg/mL). Realizamos una dilución de las muestras para poder realizar la cuantificación de 1:50 para el hígado y 1:25 para la grasa. Todas las muestras se miden por duplicado junto con la recta patrón, el punto 0 y la solución de Bradford en un espectrofotómetro a 550 nm. Previamente la mezcla de las muestras con el Bradford se incuba a 37 oC durante 7 minutos. 3.2.3 Preparación de las muestras para electroforesis en SDS-PAGE Tras la cuantificación debemos preparar las muestras junto con el tampón de carga (tampón de Laemmli, tabla 5). Este tampón permite dotar a todas las proteínas de carga negativa en proporción a su tamaño gracias al dodecil-sulfato sódico (SDS), y permite la desnaturalización de las proteínas con el β-mercaptoetanol, eliminado los puentes disulfuro. Todas las muestras deben tener la misma concentración final para que en el volumen de carga en la electroforesis (16 µl) haya 20 µg de proteína de hígado, 30 µg de proteína de grasa y 12 µg de proteína de cerebro. Tras añadir el tampón de carga y siempre previamente a realizar la electroforesis, las muestras deben calentarse a 95 oC durante 5 minutos para su completa desnaturalización. Una vez utilizadas se almacenan a -20 oC. El extracto original de proteínas sin tampón de carga se debe almacenar a -80 oC. La electroforesis SDS-PAGE consiste en la separación de las proteínas por su peso molecular. Se incluyen las proteínas desnaturalizadas y de carga negativa en un gel de acrilamida-bisacrilaminda. Al aplicarle una corriente eléctrica, las proteínas migran a través del gel hacia el polo positivo de la corriente, separándose por su peso molecular en gradiente de mayor a menor. Tampón Laemmli Tris-HCl pH 6,7 250 mM Glicerol 50% vol/vol SDS 10% peso/vol β-Mercaptoetanol 5% vol/vol Azul de bromofenol 0,0005 % peso/vol Tabla 5| Composición del tampón de Laemmli disuelto en agua destilada. Material y métodos 94 3.2.4 Electroforesis en SDS-PAGE La electroforesis SDS-PAGE consiste en la separación de las proteínas por su peso molecular. Se incluyen las proteínas desnaturalizadas y de carga negativa en un gel de acrilamida-bisacrilaminda (30% Acrilamida/Bis 29:1; Bio-Rad). Al aplicarle una corriente eléctrica, las proteínas migran a través del gel hacia el polo positivo de la corriente, separándose por su peso molecular en gradiente de mayor a menor. La concentración de acrilamida-bisacrilaminda determinará el tamaño del poro de la malla formada por el gel, y por tanto el grado de separación de las proteínas según su tamaño. El gel está formado por dos fracciones: - Gel concentrador: se localiza en la parte superior sobre el que se incluye un peine para formar pocillos y poder introducir la muestra. Este gel de 5% permite homogenizar la entrada de las proteínas en el gel separador (Tabla 6). - Gel separador: que permite la separación de las proteínas por el peso molecular El porcentaje de acrilamida-bisacrilamida varía en función del tamaño de las proteínas que queramos estudiar. En nuestro caso los porcentajes rondan entre el 8% y el 12 % (Tabla 7). Los geles se montan en la cubeta de electroforesis junto con el tampón de electroforesis (Tabla 8) que permite la trasmisión del voltaje. Se añaden las muestras junto con un marcador de proteínas coloreadas de peso molecular conocido (Bio-rad) y se conecta a la fuente de alimentación a un voltaje de entre 80-100 V. Gel concentrador 5% H2O destilada 4,1 mL 30% Acrilamida/Bis 1 mL Tris-HCl 1 M pH 6.8 0,75 mL 10% SDS 0,06 mL 10% persulfato amónico 0,06 mL TEMED 0,006 mL Gel separador 8% 10% 12% H2O destilada 11,5 mL 9,9 mL 8,2 mL 30% Acrilamida/Bis 6,7 mL 8,3 mL 10 mL Tris-HCl 1 M pH 6.8 6,3 mL 6,3 mL 6,3 mL 10% SDS 0,25 mL 0,25 mL 0,25 mL 10% persulfato amónico 0,25 mL 0,25 mL 0,25 mL TEMED 0,015 mL 0,01 mL 0,01 mL Tampón de electroforesis Tris-HCl 200 mM Glicina 20 mM SDS 1% peso/vol Tabla 6| Composición del gel SDSPAGE concentrador. Tabla 7| Composición de geles SDS-PAGE separador a porcentajes 8, 10 y 12. Tabla 8| Composición del tampón de electroforesis disuelto en agua destilada. Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 95 3.2.5 Transferencia semi-húmeda Una vez que las proteínas se separaron en el SDS-PAGE, las proteínas contenidas en el gel se transfieren a una membrana de polifluoruro de vinilideno (PVDF; Immobilon-P, Millipore) permitiendo que las proteínas queden fijadas quedan fijadas e inmovilizadas que permite el proceso de inmunodetección. El proceso de transferencia del gel a la membrana es de nuevo dependiente del voltaje, en este caso se realiza en un soporte horizontal donde se ponen ambos en contacto acotados por papel absorbente empapado de tampón de transferencia (Tabla 9) que favorece la trasmisión de la corriente en el proceso. Las proteínas pasan del gel de acrilamida a la membrana de PVDF donde quedan inmovilizadas. El proceso se realiza a amperaje constante 0,8 mA por cm2 durante una hora y 40 minutos. 3.2.6 Inmunodetección - Bloqueo: en primer lugar, se realiza el bloqueo de la membrana recién transferida. Este proceso consiste en incubar la membrana durante una hora a temperatura ambiente en agitación con una solución de BSA al 5% disuelto en tampón de lavado (TBS-T, Tabla 10). El BSA en disolución se une a todos aquellos lugares de la membrana que no estén ocupados por las transferidas desde el gel. De esta forma, los anticuerpos sólo podrán unirse a su antígeno específico, reduciendo el ruido de fondo y las inespecificidades. En ocasiones, hay anticuerpos que son más inespecíficos y en estos casos se bloquea con leche en polvo desnatada al 5%. - Anticuerpo primario: tras el bloqueo de la membrana se incuba con el anticuerpo específico contra la proteína de estudio (Tabla 11). El anticuerpo se diluye según las instrucciones del fabricante (1:500/1:1000) en TBS-T al 3% y se deja incubando en agitación una hora a temperatura ambiente o toda la noche a 4 oC. Tras la incubación se retira el anticuerpo y se realizan 3 lavados de 5 minutos cada uno con TBS-T. - Anticuerpo secundario: para detectar la presencia de la proteína y amplificar la señal del anticuerpo primario, se incuba la membrana con un anticuerpo secundario Tampón de transferencia Tris-HCl 40 mM Glicina 40 mM SDS 0,36% peso/vol Metanol 20% vol/vol Tampón de lavado (TBS-T) Tris-HCl 20 mM NaCl 146 mM Tween-20 0,1% vol/vol Tabla 9| Composición del tampón de transferencia disuelto en agua destilada. Tabla 10| Composición del tampón de lavado de membranas disuelto en agua destilada. Material y métodos 96 asociado a peroxidasa que reconoce la parte constante del primario. Se diluye en solución de incubación a una concentración de 1:5000. El tipo de secundario utilizado vendrá determinado por el tipo de huésped en el que se generó el anticuerpo primario. - Quimioluminiscencia: para detectar el anticuerpo secundario, se incuba la membrana con el sustrato de la peroxidasa y un potenciador de quimioluminiscencia (Pierce® ECL western blot substrate, Thermo Scientific) a volúmenes iguales (1:1) incubándose en agitación 1 minutos en oscuridad. Inmediatamente después, para detectar la luz emitida resultante de la reacción del sustrato con la peroxidasa, se coloca la membrana en un casete de autorradiografía y se expone a una película fotográfica (Fujifilm). Tras el revelado a distintos tiempos utilizando líquidos de revelado y fijado en una sala oscura, se observa el resultado de la interacción de los anticuerpos con la proteína de la muestra. - Análisis de resultados: para analizar los datos, se digitalizan las imágenes de las placas fotográficas mediante un escáner de alta resolución. Para determinar la cantidad relativa de proteína en cada muestra, se utiliza el programa ImageJ 1.46r (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA; http://imagej.nih.gov/ij), que detecta la cantidad de píxeles de la imagen de la proteína en todas las muestras de una misma placa radiográfica. El área de medición debe ser igual para todas las muestras. Estos valores se relativizan respecto al control constitutivo (β-actina), que debe ser detectada por cada gel de electroforesis. El valor final es normalizado y porcentuado respecto al grupo control de cada experimento. Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 97 ANTICUERPO TAMAÑO DILUCIÓN CASA COMERCIAL REFERENCIA ACC 265 kDa 1:5000 Millipore #04-322 fosfo-ACC (Ser79) 257 kDa 1:1000 Millipore #07-303 AMPKa1 63 kDa 1:1000 Millipore #07-350 AMPKa2 63 kDa 1:1000 Millipore #07-363 fosfo-AMPKalfa (Thr172)(40H9) 63 kDa 1:1000 Cell Signalling #2535 Lipoprotein-lipasa (LPL) 56 kDa 1:1000 Santa cruz biotechnology sc-32885 HSL (lipe) 90-117 kDa 1:1000 Abcam ab-45422 fosfo HSL (ser 680) 81-83 kDa 1:1000 Cell Signalling 4126 UCP 1 33 kDa 1:1000 Abcam ab23841 CPT1M (H-120) 75 kDa 1:1000 Santa cruz biotechnology sc-20670 FAS (H-300) 270 kDa 1:1000 Santa cruz biotechnology sc-20140 PGC-1 (H-300) 90 kDa 1:1000 Santa cruz biotechnology sc-13067 CIDE-A (N-19)-R 26 kDa 1:1000 Santa cruz biotechnology sc-8730-R JNK1/3 (C-17) 46-54 kDa 1:1000 Santa cruz biotechnology sc-474 fosfo-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185) 46-54 kDa 1:1000 Cell Signalling #4671 Caspasa-3 (8G10) 17, 19, 35 kDa 1:1000 Cell Signalling 9665 Cleaved Caspasa 3 (ASP 173) 17, 19 kDa 1:1000 Cell Signalling 9664 BIP(GRP78) 78 kDa 1:1000 Cell Signalling #3183 XBP1 29 kDa 1:1000 Santa cruz biotechnology sc-7160 CHOP (GADD R-20) 26 kDa 1:1000 Santa cruz biotechnology sc-793 IRE 1 110 KDa 1:1000 Abcam ab-37073 fosfo-IRE1 (Ser724) 110 kDa 1:1000 Novus Biologicals NB100-2323 elf2 α 36 kDa 1:1000 Santa cruz biotechnology sc-11386 fosfo-eIf2α 36 kDa 1:500 Santa cruz biotechnology sc-101670 β Actin 42 kDa 1:5000 Sigma A 5316 phospho-PERK (Thr 981) 125 kDa 1:1000 Santa cruz biotechnology sc-32577 GFP 30 kDa 1:5000 Abcam ab290 pro-MCH 40-54 kDa 1:1000 Santa cruz biotechnology sc-28931 MCH-R1 45 kDa 1:1000 Abnova PAB16225 AGRP 14 kDa 1:500 Abcam ab32882 kappa-opioide Receptor 1 42 kDa 1:1000 Sigma SAB2501442 Prodinorfina 35 kDa 1:1000 Abcam ab11137 c-Fos 50 kDa 1:1000 Santa cruz biotechnology sc-52 anti-DSRed Express 37 kDa 1:5000 Clontech #632496 IgG-CY5 cabra secundario 1:5000 Jackson labs 705-175-147 IgG-CY3 conejo secundario 1:5000 Jackson labs 711-165-152 IgG-HPRT ratón secundario 1:5000 Dakocytomation P0260 IgG-HPRT conejo secundario 1:5000 Dakocytomation P0448 IgG-HPRT cabra secundario 1:5000 Dakocytomation P0449 Tabla 11| Lista de anticuerpos utilizados para la inmunodetección por western blot o inmunohistoquímica. Material y métodos 98 3.3 Análisis histológico de tejido central y periférico Para determinar cómo los diferentes tratamientos y dietas afectan a la morfología y contenido de grasa del hígado y del tejido adiposo blanco, se realizaron tres técnicas histológicas: Oil-red O, hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson. Para observar la distribución anatómica de los grupos neuronales en las secciones de tronco encéfalo se realizó la tinción de Nissl. Tras las tinciones se observaron y fotografiaron los cortes con un microscopio (Zeiss) utilizando los objetivos de 10, 20 y 40 aumentos. 3.3.1 Tinción Oil-red O Esta tinción colorea las gotas lipídicas del tejido en un tono rojizo. Para ello secciones congeladas de hígado se cortaron en un criostato (8 µm) y se colocaron en portas. Estos portas se sumergieron en tinción Oil-Red O durante 10 minutos. Después se lavaron en H2O destilada y se contratiñeron con hematoxilina Meyers durante 3 minutos. Los portas se montaron en medio de montaje acuoso. Tinción hematoxilina/eosina. Esta técnica tiñe las estructuras celulares mostrando de forma general, la estructura del tejido. La hematoxilina es de naturaleza catiónica (básica) por lo que tiñe de azul estructuras basófilas (de naturaleza ácida) como los núcleos celulares. Por otro lado, la eosina es de naturaleza ácida tiñendo de rosa estructuras de naturaleza básica (acidófilas) como el citoplasma. Para la tinción, el tejido debe de estar incluido en parafina previa perfusión del animal. Los cortes de parafina son preparados con xilol para eliminar los excesos de la misma. Después se pasan los cortes por un proceso de rehidratación, consistente en alcoholes de concentración decreciente (100º, 95º y 70º). Tras un lavado con H2O destilada se sumerge en hematoxilina durante 10 minutos, se lava e inmediatamente se pasa por un alcohol ácido. Tras lavarlo se sumerge 30 segundos en eosina. Para deshidratar la muestra se pasan los cortes por mismo los alcoholes en graduación creciente, y antes de montar se deja sumergido 10 minutos en xilol. 3.3.2 Tinción tricrómica de Masson En este caso, la tinción es una combinación de tres tinciones que remarca los depósitos de colágeno al mismo tiempo que la estructura del tejido, en este caso el hígado. La estructura celular se observa rojo/rosado, los núcleos de violeta y el colágeno azul intenso. Para la tinción, el tejido debe de estar incluido en parafina previa perfusión del animal. Los cortes del tejido parafinado (8 μm) se desparafinan sumergiéndolos en xileno en durante unos 10-15 minutos. Las secciones posteriormente se hidratan con lavados seriados en alcoholes de 100o, 96o, 70o, y 50o; después se lavan con agua destilada. Tras el lavado, se sumergen los cortes en hematoxilina durante 3 minutos, se lava e inmediatamente y se sumerge en rojo Masson durante 5 minutos. Para retirar el exceso de rojo, se incuban con ácido fosfomolíbdico durante 6 minutos. Tras un lavado en agua destilada, se tiñe con azul Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 99 de anilina durante 2 minutos. Se vuelven a lavar los cortes, y se procede a deshidratar con alcohol, se aclara con xileno y se montan los portas con los cubres y aceite balsámico sintético. 3.3.3 Tinción de Nissl La tinción de Nissl del tronco encéfalo, se realizó siguiendo el protocolo de Bielschowsky-Plien añadiendo un 0,1% de violeta de cresilo. El colorante violeta de cresilo, es una anilina básica (con carga positiva) que se une a las regiones basófilas de las células del tejido nervioso. Esta tinción fue elegida por su idoneidad para el estudio de detalles citológicos y citoarquitectónicos. Se extrae el tronco-encéfalo situado en la base del cerebro de la rata perfundida. EL tejido queda en formalina 10% durante 24 horas. A continuación se transfieren a tampón fosfato 0,1 M durante 1 hora. Mediante el uso de un vibrotomo (Vibratome Series 1000, The Vibratome Company) se realizan secciones de 50 µm de grosor y se recogen en el tampón fosfato 0,1 M. Tras un par de lavados con agua destilada, se sumerge carbonato de litio 5% durante 10 minutos. Tras tres varios lavados con alcohol 70º, se realizó otro final con agua destilada. Los cortes se incubaron durante 6 minutos en una solución 0,1% de violeta de cresilo. Tras 3 lavados con alcohol a 96o seguido de otros tres lavados con alcohol 100o, los cortes se aclararon con xilol y se montaron en portas con aceite balsámico sintético. 3.4 Inmunohistoquímica Con esta técnica se pretende detectar en el propio tejido la presencia y localización de determinadas proteínas. En ocasiones también se requiere determinar la co-localización celular de dos proteínas diferentes. El proceso dependerá no sólo del tipo de tejido, sino también del tipo de método para revelar la señal (diaminobenzidina (DAB), fluorescencia), de las características del anticuerpo. En este trabajo se realizó inmunohistoquímica en cerebro e hígado de rata y ratón. Para el revelado de la señal se utilizó tanto DAB como fluorescencia. Para realizar las inmunohistoquímicas, el animal debe de ser previamente perfundido con formalina al 10% tal y como se ha descrito con anterioridad. 3.4.1 Detección de c-Fos en el tronco-encéfalo Se extrae el tronco-encéfalo situado en la base del cerebro de la rata perfundida. El tejido queda en formalina 10% durante 24 horas. A continuación se transfieren a tampón fosfato 0,1 M durante 1 hora. Mediante el uso de un vibrotomo (Vibratome Series 1000, The Vibratome Company) se realizan secciones de 50 µm de grosor y se recogen en el tampón fosfato 0,1 M. Para la detección inmunohistoquímica de la expresión de c-Fos, se incubaron secciones con anticuerpo primario c-Fos en flotación en dilución 1:1000 durante toda Material y métodos 100 la noche a 4 oC; al finalizar se hicieron 2 lavados de 10 minutos con tampón fosfato 0,1 M. Para inhibir la peroxidasa endógena, y evitar que el sistema de detección muestre falsos positivos, se incubaron los cortes con H2O2 al 3% en agua destilada durante 10 min y se hicieron nuevamente 2 lavados con tampón fosfato 0,1 M de 10 minutos. Como sistema de detección se utilizó el kit EnVision policlonal (polímero de dextrano conjugado con anticuerpos anti-conejo y con peroxidasa; Dako,) durante 30 minutos. Se prepara el DAB para la detección por reacción con peroxidasa según las instrucciones del fabricante (1 gota de DAB en 1 mL del disolvente suministrado; Dako). Tras el EnVision, se hicieron 2 lavados de 10 minutos y se incubó con DAB durante 10 minutos. Al finalizar la reacción, las secciones se extienden en portas xilanizados (Histobond, Marienfield-Superior) hasta que estén secos. Posteriormente se deshidrataron en etanol, se aclararon en xileno y se montaron con un medio de montaje permanente. La reacción fue observada y fotografiada bajo un microscopio de fluorescencia Provis AX70 (Olympus Corporation). Previa identificación del núcleo dorsal del nervio vago en el tronco encéfalo, identificado por la tinción de Nissl, se determinó mediante el uso del programa ImageJ, el número de células teñidas en cada sección como número representativo de células con inmuno-reactividad positiva a c- Fos. 3.4.2 Detección de la proteína verde fluorescente (GFP) en el cerebro Los cerebros perfundidos se sumergen en formalina al 10% durante 24 horas y continuación se transfieren a tampón fosfato 0,1 M. Se cortaron secciones de 50 µm de grosor en el vibratomo. Para la inmunofluorescencia, las secciones se incubaron en flotación durante toda la noche a 4ºC con anti-GFP de conejo diluido 1:1000 en PBS. Tras dos lavados de 5 minutos en tampón fosfato 0,1 M las secciones se incubaron 1 hora a temperatura ambiente, con anti-fragmento F (ab´)2 AlexaFluor® 488 (Molecular Probes) en una dilución 1:200. Las secciones se montaron en portas y se cubrieron con medio de montaje fluorescente. La fluorescencia fue observada y fotografiada bajo un microscopio de fluorescencia Provis AX70 (Olympus Corporation). 3.4.3 Inmunohistoquímica en muestras parafinadas. Se extrae el hígado de ratones y el cerebro de ratas previamente perfundidos y se sumerge en formalina 10% durante 24 horas. Tras la completa fijación, se parafina el tejido y se corta en secciones de 8 µm. A continuación se elimina la parafina y se rehidrata. Para finalizar, se procede a la exposición o recuperación antigénica sometiendo las secciones durante dos minutos y por dos veces a microondas de 800w. Tras un pretratamiento con citrato 10 mM para el análisis de BIP y MCH-R1 y Tris- EDTA 10 mM para el GFP, las secciones se incuban consecutivamente en 1) anti-GRP78 de conejo, anti-MCH-R de conejo o anti-GFP de conejo a la dilución de 1:200 1:300 o 1:1000 respectivamente toda la noche a 4 oC para GRP78 y MCH-R1, y 1 hora a temperatura ambiente para GFP; 2) para bloquear la peroxidasa endógena y evitar falsos positivos, se incuba peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos; 3) se Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 101 incuba con el anticuerpo secundario durante 30 minutos (Envision® HRP anti-rabbit, Dakocytomation); 4) se incuba con el sistema DAB de inmunodetección (3,3´- diaminobenzidinetetrahydrochloride; Dako) durante 10 minutos. Entre cada uno de los pasos de incubación, las secciones se lavan dos veces durante 10 minutos en tampón fosfato salino (PBS; 100 mM tampón fosfato, 0,656 M NaCl) y tras el DAB el lavado se realiza con agua destilada. Para finalizar, los cortes incubados se dehidratan lavando dos veces con xileno y se cubren con medio DePex Gurr® (VWR). Tras las tinciones se observaron y fotografiaron los cortes con un microscopio (Zeiss) utilizando os objetivo de 10, 20 y 40 aumentos. 3.4.4 Doble Inmunohistoquímica en cerebro de ratón 2 La doble inmunohistoquímica se realizó sobre cerebros previamente perfundidos de ratones transgénicos de genotipo Mchr1-cre/tdTomato 3 . Para exponer los lugares antigénicos y reducir la unión no específica de los reactivos inmunohistoquímicos, las secciones se trataron con H2O2 al 0,5% disuelto en PBS 0,1 M durante 10 minutos; y con unas solución de pepsina (10 mg/ml en solución 0,2 M HCl) durante 5 minutos a 37 oC. Después, las secciones se bloquearon con BSA al 2% en PBS durante 30 minutos para evitar la unión inespecífica de anticuerpos. Tras el pretratamiento, se incubaron en una solución con la mezcla del anti-KOR de cabra (2 µg/mL) y anti-DSRed Express de conejo (1:1000) durante 24 horas a 4 oC. Tras la incubación con los anticuerpos primarios, se incubaros con los respectivos secundarios anti-cabra IgG CY5-mono (1:2000) y anti-conejo IgG CY3-mono (1:3000). Los cortes se montaron en portas de cristal, se cubrieron y visualizaron en un microscopio confocal (Nikon A1R). 2 Procedimiento realizado por el Dr. Imre Kalló y el Dr. Zsolt Liposits en el laboratorios de Neurobiología endocrina, Instituto de Medicina experimenta, Academia húngara de ciencia, Budapest, Hungría. 3 Ratones generados y cedidos por la Dra. Melissa J Chee y la Dra. Eleftheria Maratos-Flier del departamento de Endocrinología, Centro médico Beth Israel Deaconess, departamento de Medicina, Facultad de Medicina, Universidad de Harvard, Boston, EEUU. Material y métodos 108 Grupos experimentales IP: Grupos experimentales IP: - IV-Salino - IP-Salino - IV-MCH - IP-MCH - IV-MCH pair-fed Tras la intervención IV y durante la administración IP, los animales se estabularon en individual y se monitorizó diariamente la ingesta y el peso durante la administración de MCH. 5.4 Estimulación de lipólisis por isoprotenol Para determinar si la administración crónica ICV de MCH mediaba la lipólisis periférica del tejido adiposo en rata, se administró intraperitonealmente (IP) isoprotenol (10 mg/kg) (Sigma Aldrich) a ratas tras 7 días con tratamiento crónico ICV de MCH (10 µg/día). Tras la administración IP de isoprotenol, se extrajo una muestra de sangre por capilaridad de la vena de cola a 0, 30, 60, 90, 120 y 240 minutos. Tras aislar el suero se determinó la concentración de ácidos grasos libres (AGL). Grupos experimentales: - ICV-Salino ad libitum + isoprotenol IP - ICV-MCH ad libitum + isoprotenol IP - ICV-MCH pair-fed + isoprotenol IP Tras la intervención, los animales se estabularon en individual y se monitorizó diariamente la ingesta y el peso. Dieta estándar Bombas ICV-MCH Rata 10 µg/día Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario Día 0 Día 7 Isoprotenol IP Extracción sangre 0, 30, 60, 90, 120 y 240 min Dieta estándar Administración IV MCH Rata 10 µg/día Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario Día 0 Día 7 Día -5 Canulación IV Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 109 5.5 Bloqueo farmacológico del ER-stress Para esclarecer el papel del ER-stress como mediador de los efectos de MCH en el metabolismo lipídico del hígado en rata, junto con la administración crónica ICV de MCH (10 µg/día), se co-administró cada 12 horas IP una chaperona química que resuelve el ER-stress, el ácido tauroso-deoxicólico (TUDCA). La dosis diaria de TUDCA fue de 250 mg/kg, el vehículo del TUDCA es tampón fosfato salino (PBS). El TUDCA se administró durante 7 días desde la implantación de las bombas osmóticas ICV. Grupos experimentales: - ICV-Salino + PBS IP - ICV-MCH + PBS IP - ICV-Salino + TUDCA IP - ICV-MCH + TUDCA IP Tras la intervención los animales se estabularon en individual y se monitorizó diariamente la ingesta y el peso. 5.6 Bloqueo genético del ER-stress hepático Otra aproximación más exacta para la inhibición del ER-stress el hígado, consistió en la administración por la vena de la cola, de un vector adenoviral que sobre-exprese la chaperona GPR78 (1*108 UV/100 µl) (ViraQuest). Debido a las características biológicas del adenovirus, la infección y sobre-expresión del gen que porta es de acción inmediata, pero el efecto es transitorio, durando unos 7 días. El mismo día que la implantación de bombas osmóticas ICV para la administración crónica de MCH (2,5 µg/día). La especificidad de la técnica se demuestra por una mayor infección en el hígado respecto a otros órganos como el bazo o la grasa epididimal (Imagen 31). Dieta estándar Bombas ICV-MCH Rata 10 µg/día Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario Día 0 Día 7 TUDCA IP (250 mg/kg/día) WAT GFP βactina Imagen 31. Expresión de GFP en extractos proteicos de hígado, bazo y grasa epididimal de ratones, una semana después de la administración por la vena de la cola de adenovirus que sobre-expresan GFP. Material y métodos 110 Grupos experimentales: - ICV-Salino + Ad-GFP - ICV-Salino + Ad-GRP78 - ICV-MCH + Ad-GFP - ICV-MCH + Ad-GRP78 Tras la intervención los animales se estabularon en individual y se monitorizó diariamente la ingesta y el peso. 5.7 Efecto de la vagotomía sobre la acción central de MCH Para determinar si el sistema nervioso parasimpático modula los efectos periféricos inducidos por MCH, se secciona el nervio vago en ratas (VGX). Al grupo control de la vagotomía se le denomina sham, al cual se le realizó la intervención invasiva, pero sin seccionar el vago. Una semana después de la intervención, se implantan bombas osmóticas para la administración crónica ICV de MCH durante una semana (10 µg/día). La comprobación de la eficacia de la vagotomía se comprobó por la hipertrofia estomacal tras su sacrificio, descartando del experimento aquellas cuya vagotomía no se realizó con éxito. Grupos experimentales: - Sham + ICV-salino - Sham + ICV-MCH - VGX + ICV-salino - VGX + ICV-MCH Tras la vagotomía, los animales se estabularon en individual; tras la implantación de las bombas y monitorizó diariamente la ingesta y el peso. Dieta estándar Bombas ICV-MCH Ratón 2,5 µg/día Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario Ad-GRP78 IV cola Día 0 Día 7 Dieta estándar Bombas ICV-MCH Rata 10 µg/día Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario Día 0 Día 7 Día -5 Vagotomía Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 111 5.8 Sobre-expresión génica en núcleos hipotalámicos Para esclarecer qué núcleo hipotalámico era el encargado de producir los efectos periféricos debido a la administración central ICV de MCH, se administró estereotáxicamente y de forma bilateral, 1 µl de vector adenoviral por núcleo (107 UV/mL), que sobre-expresaba el MCH-R1 durante 7 días (Signagen, SL100704) en los núcleos arcuato, lateral y ventromedial del hipotálamo de rata. Para estudiar la acción del KOR sobre el metabolismo peroférico en rata, se administró estereotáxicamente y de forma bilateral en el LHA, 1 µl de vector adenoviral por núcleo (107 UV/mL), que sobre-expresaba el KOR (Signagen, SL100702) durante 7 días. En el grupo control se administra de forma bilateral, 1 µl un adenovirus que sobreexpresa GFP en cada uno de los núcleos mencionados (Signagen, SL100708). Con la detección de GFP se visualiza el lugar de administración, comprobando la eficacia de la administración (Imagen 32). Dieta estándar ARC Ad MCH-R1 Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario Día 0 Día 7 Dieta estándar LH Ad MCH-R1 Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario Día 0 Día 7 Dieta estándar VMH Ad MCH-R1 Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario Día 0 Día 7 VMH Ad GFP 3v em 100 μm Ad GFP ARC 3v em Ad GFP 1 mm 3v em Dieta estándar LH Ad KOR Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario Día 0 Día 7 Imagen 32. Expresión de GFP en diferentes núcleos hipotalámicos tras la administración núcleo específica de adenovirus que sobre-expresan GFP. LH Material y métodos 112 Para determinar si el efecto hepático de la sobre-expresión de KOR en el LHA está modulado por el ER-stress en ratón, simultáneamente a la administración estereotáxica bilateral de Ad KOR en el LHA, se administró en la vena de la cola el adenovirus que sobre-expresa la chaperona GRP78 y se sacrificó a la semana de administración de ambos virus. Grupos experimentales: Grupos experimentales: - ARC Ad GFP - LHA Ad GFP - ARC Ad MCH-R1 - LHA Ad KOR - LHA Ad GFP - LHA Ad MCH-R1 Grupos experimentales: - VMH Ad GFP - LHA Ad GFP + IV Ad GFP - VMH Ad MCH-R1 - LHA Ad GFP + IV Ad GRP78 - LHA Ad GFP + IV Ad GRP78 - LHA Ad GFP + IV Ad GRP78 Tras la intervención los animales se estabularon en individual y se monitorizó diariamente la ingesta y el peso. 5.9 Administración crónica de MCH en núcleos hipotalámicos. Para corroborar los efectos periféricos inducidos por la sobre-expresión del MCH- R1 en los núcleos ARC y LHA del hipotálamo, mediante el uso de cánulas núcleoespecíficas hechas a medida, se administró MCH de forma crónica y bilateral en el núcleo arcuato y en núcleo lateral del hipotálamo. Dieta estándar Bombas ARC-MCH Rata 10 µg/día Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario Día 0 Día 7 Dieta estándar Bombas LHA-MCH Rata 10 µg/día Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario Día 0 Día 7 Dieta estándar LH Ad-KOR Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario IV cola Ad-GRP78 Día 0 Día 7 Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 113 Grupos experimentales: - ARC-Salino - ARC-MCH - LHA-Salino - LHA-MCH Tras la intervención los animales se estabularon en individual y se monitorizó diariamente la ingesta y el peso. 5.10 Silenciamiento genético de MCH-R1 en el hipotálamo lateral (LHA) Para determinar la acción de la inhibición del MCH-R1 sobre el metabolismo periférico, se administró estereotáxicamente y de forma bilateral en el LHA, 1 µl de vector lentiviral (1*107 UV/mL) con un shRNA para inhibir la traducción del mRNA del MCH-R1 (Sigma, SHCLNV, TRCN0000028357). Debido a la naturaleza del virus, el efecto de la inhibición no aparece hasta 3 semanas después de la infección, pero el efecto es permanente. En el grupo control se administra de forma bilateral, 1 µl un lentivirus Turbo-GFP (Sigma, SHCLNV, SHC003 Turbo-GFP) en cada uno de los núcleos mencionados. Con la detección de GFP se visualiza el lugar de administración, comprobando la eficacia de la administración. Tras la intervención los animales se estabularon 3 individuos por caja y se monitorizó semanalmente la ingesta y el peso. Grupos experimentales: - LHA Lentivirus Turbo-GFP - LHA Lentivirus shRNA MCH-R1 Para determinar el efecto de la inhibición del MCH-R1 en el LHA sobre el metabolismo hepático, se alimentó a las ratas con dieta deficiente en metionina y ARC MCH osmotic pumpsARC MCH osmotic pumpsARC MCH osmotic pumps LHA MCH osmotic pumpsLHA MCH osmotic pumps ARC MCH osmotic pumpsARC MCH osmotic pumpsARC MCH osmotic pumps LHA MCH osmotic pumpsLHA MCH osmotic pumps Dieta estándar LHA Lentiv shARN MCH-R1 Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario Semana 0 Semana 4 Imagen 33.Marcas de las guías de las cánulas núcleo específicas para la administración crónica de MCH. Material y métodos 114 colina (MCD) durante tres semanas tras el inicio del efecto del lentivirus. Al mismo tiempo, para determinar si la interrupción del PSNS mediaba la acción hepática del bloqueo del MCH-R1 en el LHA, se vagotomizaron las ratas al comienzo del efecto del virus y de la acción de la dieta. La dieta MCD se intercambió por la estándar 5 días después de la cirugía para facilitar la recuperación de las ratas. Grupos experimentales: - Sham + LHA Lentivirus Turbo-GFP - Sham + LHA Lentivirus shRNA MCH-R1 - VGX + LHA Lentivirus Turbo-GFP - VGX + LHA Lentivirus shRNA MCH-R1 Tras la administración de los lentivirus en el LHA los animales se estabularon 3 ratas por caja y se monitorizó semanalmente la ingesta y el peso. Tras la vagotomía, los animales se estabularon en individual y se monitorizó semanalmente la ingesta y el peso. 5.11 Silenciamiento genético de KOR en el hipotálamo lateral (LHA) Para determinar si el receptor KOR en el hipotálamo lateral media las acciones periféricas de MCH, se silenció la expresión del hipotálamo lateral simultáneamente a la administración crónica ICV de MCH en ratas. Para el silenciamiento de KOR se utilizó un adenovirus adeno-asociado (AAV) de serotipo 1, que codifica un shRNA para inhibir la transcripción de KOR (245). Se administró estereotáxicamente y de forma bilateral en el LHA, 1 µl del AAV shRNA KOR 6 (1*109 UV /mL). Tres semanas después de la administración de los AVV (tiempo necesario para realizar la infección) se implantaron bombas osmóticas ICV para la infusión crónica de MCH durante una semana (10 µg/día). En el grupo control se administra de forma bilateral, 1 µl de AAV-GFP en el LHA. Con la detección de GFP se visualiza el lugar de administración, comprobando la eficacia de la administración. 6 AAVs (AAV1 shARN KOR y AAV1 GFP) cedidos por el Dr. Roger A. Adan, Departamento de Neurociencia y Farmacología, Instituto Rudolf Magnus, Universidad de Utrecht, Utrecht, Holanda. Dieta estándar LHA Lentiv shARN MCH-R1 Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario 3 Semanas Día -5 Vagotomía 3 Semanas Dieta MCD Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 115 Tras la administración del AAV, los animales se estabularon 3 ratas por caja y se monitorizó semanalmente la ingesta y el peso. Tras la implantación de las bombas osmóticas, se estabularon los animales encajas individuales y se monitorizó diariamente peso e ingesta. Grupos experimentales: - AAV GFP + ICV-Salino - AAV GFP + ICV-MCH - AAV shRNA KOR + ICV-Salino - AAV shRNA KOR + ICV-MCH Finalmente, para determinar si los efectos del silenciamiento de KOR en el LHA afecta al metabolismo hepático, se alimentó a las ratas con dieta deficiente en metionina y colina (MCD) durante tres semanas tras el inicio del efecto del AAV. Grupos experimentales: - AAV GFP + dieta MCD - AAV shRNA KOR + dieta MCD Dieta estándar LHA AAV shARN KOR Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario 3 Semanas Bombas ICV-MCH Rata 10 µg/día 1 Semana Dieta estándar LHA AAV shARN KOR Sacrificio Periodo de adaptación 7 días Llegada animalario 3 Semanas 3 Semanas Dieta MCD RESULTADOS Resultados 124 La fosforilación de JNK en el hígado está asociada al desarrollo de esteatohepatitis y resistencia a la insulina. Debido a los resultados observados sobre el efecto adipogénico de MCH en el hígado, estudiamos el efecto central de MCH en ratones KO para JNK1. La administración central de MCH (2,5 µg/día) en ratones KO para JNK1 y salvajes (WT) durante una semana, incrementó la ingesta en ambos genotipos (Figura 7A). Sin embargo en los ratones JNK1-KO, MCH no fue capaz de inducir el aumento de peso esperado (Figura 7B) ni de disminuir los AGL plasmáticos (Figura 7C). Sin embargo, la administración ICV de MCH si fue capaz de modular el metabolismo lipídico del tejido adiposo graso en ratones JNK-KO, puesto que hay un incremento en CIDEA (Figura 7D). A nivel hepático MCH es moduló la expresión proteica de pAMPK y pACC en ratones JNK1-KO, pero no indujo un aumento en LPL (Figura 7E). 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 pAMPK AMPKα1 AMPKα2 pACC ACCαFAS LPL Niveles de proteína hepática (% control) * * *** *** * * * * F Figura 6. Efectos de la administración crónica ICV de MCH en los niveles de proteína hepática de pAMPK, AMPKα1, AMPKα2, pACC, FAS y LPL (A), sobre la actividad enzimática de LPL en el hígado (B) y sobre los niveles proteicos de JNK1 y pJNK1 en el hígado (C-D). La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 7 animales por grupo. Test ANOVA de una vía; *P<0,05; **P<0,01 y ***P<0,001 frente al control. AMPKα1 AMPKα2 pACC pAMPK Sal MCH MCH-pf FAS LPL ACCα β-actin Sal MCH MCHpf β-actin JNK1 pJNK1 B C D Salino-ICV MCH-ICV (10 μg/día) MCH-ICV pair fed (10 μg/día) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Actividad LPL hepática (pmol/ml/min) * * 0 20 40 60 80 100 120 JNK1 ** ** Niveles de proteína hepática (% control) * * 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 pJNK/JNK Niveles de proteína hepática (% control) A Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 125 Para corroborar que estos mismos efectos se reproducen en rata, se realizó una aproximación farmacológica mediante una co-administración periférica intraperitoneal (IP) cada 12 horas, del inhibidor de JNK1 SP-600125 (384) (20 mg/kg/día), al mismo tiempo que las bombas ICV administrando MCH a nivel central (10µg/día). El inhibidor de JNK1 bloqueó tanto el efecto orexigénico como el incremento de peso inducido por MCH (Figura 8A-B). El descenso de los AGL séricos inducido por MCH, también se bloqueó con la co-administración del inhibidor de JNK1 (Figura 8C). En el tejido adiposo blanco, el fármaco también inhibió la sobre-expresión de CIDEA inducida por MCH (Figura 8D). En el hígado, la única proteína cuyo efecto inducido por MCH fue bloqueado por la co-administración del fármaco es LPL (Figura 8E). Como previamente se ha descrito en la introducción, la respuesta a la presencia de proteínas desplegadas (UPR) en el retículo endoplasmático inducido por el ER-stress hepático, está estrechamente relacionado con un desarrollo en la adiposidad hepática y una activación de JNK1 (354,356,357). Por ello se ha estudiado la ruta UPR inducida por ER-stress en los hígados de ratas a los que se les administró MCH-ICV durante una semana. MCH central, indujo una activación de las proteínas involucradas en el ER- stress (pIRE1α, pPERK, peIF2α, XBP1-S, CHOP) y apoptosis (caspasa 3 y cleaved caspasa 3) independientemente de la ingesta (Figura 9A). 0 5 10 15 20 25 30 35 WT JNK1 -/- Ingesta acumulada (g) ** A B C D CIDEA β-actin Sal MCH JNK1 -/- E AMPKα1 AMPKα2 Sal MCH LPL pAMPK β-actin pACC JNK1 -/- ACC Figura 7. Efectos de la administración crónica ICV de MCH (2,5 µg/día) en la ingesta (A), peso (B), niveles de AGL séricos (C) y niveles proteicos de CIDEA (D) en grasa epididimal de ratones WT y JNK1-KO. Efecto de la infusión central de MCH sobre niveles proteicos de pAMPK, pACC, LPL, ACC, AMPKα1 y AMPKα2 en hígado de ratones JNK1-KO (E). La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n 7-6 animales por grupo. Test t-student de una cola; *P<0,05 y **P<0,01 frente al control. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 WT JNK -/- Ganancia de peso (g) * 0 5 10 15 20 25 30 WT JNK -/- AGL suero (mg/dL) * 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 CIDEA ** Niveles de proteína en WAT (% control) 0 20 40 60 80 100 120 140 pAMPK pACC LPL ACCαAMPKα1 AMPKα2 ** ** Niveles de proteína hepática (% control) WT MCH-ICV (2,5μg/día) WT Salino-ICV JNK1 -/- Salino-ICV JNK1 -/- MCH-ICV (2,5μg/día) Resultados 126 Figura 8. Efectos de la administración crónica ICV de MCH en el ventrículo lateral y la administración IP del inhibidor de JNK1 SP600125 sobre la ingesta (A), peso corporal (B) y AGL en el suero de ratas (C), y sobre los niveles proteicos de CIDEA en grasa epididimal (D), de pAMPK, AMPKα1, AMPKα2 y LPL en hígado de ratas (E). La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 7 animales por grupo. Test ANOVA de una vía; *P<0,05 y **P<0,01 frente al control. Figura 9. Efectos de la administración ICV crónica de MCH en ratas (10 µg/día) sobre los niveles de proteínas hepáticas de pIRE1α, pPERK, peIF2α/eIF2α, XBP1-S, CHOP, caspasa 3 y cleaved caspasa 3 (A). La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 7 animales por grupo. Test ANOVA de una vía; *P<0,05 y **P<0,01 frente al control. A B C AMPKα1 AMPKα2 pAMPK LPL β-actin Sal MCH MCH+SP 75 80 85 90 95 100 105 ** *** Ingesta acumulada (g) -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 ** * Ganancia de peso/control 0 5 10 15 20 25 30 35 40 AGL suero (mg/dL) ** MCH-ICV (10μg/day) + salino IP Salino-ICV + salino IP MCH-ICV (10μg/day) + SP 600125 IP 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 CIDEA Niveles de proteína en WAT (% control) ** D Sal MCH MCH+SP CIDEA β-actin 0 20 40 60 80 100 120 140 160 pAMPK AMPKα1 AMPKα2 LPL **** Niveles de proteína hepática (% control) E Cleav Casp 3 Caspase 3 XBP1-S CHOP β-actin SAL MCH IRE1α elF2α peIF2α pPERK pIRE1α MCH-pf Salino-ICV MCH-ICV (10 μg/day) MCH-ICV pair-fed (10 μg/day) A 0 50 100 150 200 250 pIRE1α/IRE1αpPERK peIF2α/eIF2αXBP1-S CHOP Caspase 3 Cleaved Caspase 3 ** ** * # Liver protein levels (% control) ** *** Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 127 Para determinar la relevancia del efecto del ER-stress sobre los efectos de MCH en la acumulación de lípidos en el hígado, simultáneamente a la administración crónica ICV de MCH en ratas, se co-administró de manera intraperitoneal una chaperona química que resuelve la UPR (351,385), el ácido tauroso-deoxicólico (TUDCA). Para determinar la dosis de TUDCA adecuada, aquella más alta que no induzca cambios en ingesta y peso, se realizó una dosis respuesta mediante la administración IP de TUDCA cada 12 horas (Figura 10). Tras este ensayo se determinó que la dosis adecuada de TUDCA es de 250 mg/kg/día. Como se observa en la Figura 11, la administración IP de TUDCA durante una semana, simultáneamente a la infusión ICV de MCH, bloqueó la acumulación de lípidos en el hígado inducido por MCH. La administración central de MCH no indujo un incremento en la concentración de TG hepáticos (Figura 11A) ni gotas lipídicas (Figura 11B) en ratas co-administradas con TUDCA. Figura 10. Efectos de la administración crónica de TUDCA durante 4 días sobre el peso (A) y la ingesta (B) a las dosis de 62,5; 125; 250 y 500 mg/kg/día. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 6 animales por grupo. Test ANOVA de una vía; **P<0,01 frente al control. A B 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Vehículo 62,5 mg/kg 125 mg/kg 250 mg/kg 500 mg/kg ** Ingesta acumulada (g) Dosis TUDCA 0 5 10 15 20 25 Vehículo 62,5 mg/kg 125 mg/kg 250 mg/kg 500 mg/kg Ganancia de peso (g) Dosis TUDCA 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 PBS TUDCA mg TG /g hígado * A Salino-IP + MCHICVPBS-IP + Salino-ICV Oil Red O 50 µm TUDCA-IP + Salino-ICV TUDCA-IP + MCH-ICV 50 µm50 µm PBS-IP + Salino-ICV PBS-IP + MCH-ICV (10 μg/día) TUDCA-IP (250 mg/kg/día) + Salino-ICV TUDCA-IP (250 mg/kg/día) + MCH-ICV (10 μg/día) B PBS-IP + Salino-ICV H&E 50 µm 50 µm PBS-IP + MCH-ICV TUDCA-IP + Salino-ICV TUDCA-IP + MCH-ICV 50 µm 50 µm Figura 11. Efectos de la administración crónica ICV de MCH (10 µg/día) y de TUDCA IP (250 mg/kg/día), sobre los triglicéridos hepáticos (A) y sobre la acumulación lipídica vista como gotas rojas en cortes histológicos de hígado con tinción de Oil Red O y como acumulación citoplasmática de grasa en la tinción hematoxilina-eosina (H&E) (B). Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 7 animales por grupo. PBS es tampón fosfato salino, vehículo de TUDCA. Test t-student de una cola; *P<0,05 frente al control. Resultados 128 Los efectos sobre el bloqueo de la adiposidad hepática inducido por MCH mediante el uso de TUDCA, se tradujo a nivel proteico en un bloqueo del incremento de los niveles de LPL y de pJNK (Figura 12A). Consecuentemente, TUDCA bloqueó el incremento del ER-stress hepático inducido por MCH (Figura 12A). En una segunda aproximación, se estudió a GRP78, la chaperona del retículo endoplasmático que facilita en adecuado plegamiento de las proteínas, actuando previamente a la UPR (386-388). Utilizando esta propiedad, se realizó una sobreexpresión de GRP78 en el hígado. Para ello se administró en la vena de la cola de ratones C57BL/6, adenovirus que contienen el gen salvaje (WT) de GRP78 o GFP (proteína verde fluorescente) (121) al mismo tiempo que la administración crónica ICV de MCH (2,5µg/día) durante una semana. La eficiencia de la infección se corroboró mediante una inmunohistoquímica de GFP o GRP78 sobre cortes de hígado prefijados (Figura 13A). La sobre-expresión hepática de GRP78, no bloqueó los efectos orexigénicos ni la ganancia de peso inducida por MCH (Figura 13B-C), pero si la adiposidad hepática favorecida por MCH (Figura 13D-E). A nivel de proteína hepática, la sobre-expresión de GRP78 bloqueó el incremento de la expresión de LPL, pJNK1, marcadores de ER-stress y apoptosis en ratones tratados ICV con MCH (Figura 13F). 0 50 100 150 200 250 300 LPL pJNK1/JNK1 pIRE1α/IRE1αpPERK pelF2α/elF2αXBP1-S CHOP Caspase 3 Cleaved Caspase 3 Niveles de proteína hepática (% control) * ** * ** * A pJNK1 pIRE1α LPL JNK1 PBS SAL MCH MCH TUDCA SAL β-actin IRE1α pPERK peIF2α eIF2α β-actin PBS SAL MCH MCH TUDCA SAL Caspase 3 CHOP Cleav Casp 3 XBP1-S PBS SAL MCH MCH TUDCA SAL β-actin PBS-IP + Salino-ICV PBS-IP + MCH-ICV (10 μg/día) TUDCA-IP (250 mg/kg/día) + Salino-ICV TUDCA-IP (250 mg/kg/día) + MCH-ICV (10 μg/día) Figura 12. Efectos de la administración crónica ICV de MCH (10 µg/día) y de TUDCA (250 mg/kg/día) sobre los niveles de proteínas hepáticas de LPL, ratio pJNK/JNK, pIRE1α/IRE1α, pPERK, peIF2α/eIF2α, XBP1-S, CHOP, caspasa 3 y cleaved caspasa 3 (A). La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 7 animales por grupo. Test t-student de una cola; *P<0,05 y **P<0,01 frente al control. Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 129 50 µm GRP78-Ad GRP78 GRP78-Ad GFP 50 µm Corte de hígado 50 µm GFP-Ad GRP78 GFP-Ad GFP 100 µm 100 µm Corte de hígado A 0 5 10 15 20 25 30 35 Ad GFP Ad GRP78 *** Ingesta acumulada (g) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Ad GFP Ad GRP78 ** * Ganancia de peso (g) Ad GFP + Salino-ICV Ad GFP + MCH-ICV Oil Red O 50 µm 50 µm Ad GRP78 + Saline-ICV Ad GRP78 + MCH-ICV 50 µm50 µm Ad GFP + Saline-ICV Ad GFP + MCH-ICV H&E 50 µm 50 µm Ad GRP78 + Saline-ICV Ad GRP78 + MCH-ICV 50 µm 50 µm 0 50 100 150 200 250 LPL pJNK1/JNK1 pIRE1α/IRE1αpPERK pelF2α/elF2αXBP1-S CHOP Caspase 3 Cleaved Caspase 3 Niveles de proteína hepática (% control) * * *** ** *** Ad GFP SAL MCH MCH Ad GRP78 SAL JNK1 pJNK1 LPL pIRE1α β-actin Ad GFP SAL MCH MCH Ad GRP78 SAL IRE1α pPERK peIF2α eIF2α β-actin Figura 13. Efectos de la administración crónica ICV de MCH (2,5 µg/día) y de la sobre-expresión hepática de GRP78 en la inmunohistoquímica de GFP y GRP78 sobre cortes histológicos (A), ingesta (B), peso (E), TG hepáticos (D), histología de Oil-red O y H&E (E), y sobre los niveles de proteínas hepáticas de LPL, ratio pJNK/JNK, pIRE1α/IRE1α, pPERK, peIF2α/eIF2α, XBP1-S, CHOP, caspasa 3 y cleaved caspasa 3 (F). La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 7 animales por grupo. Test t-student de una cola; *P<0,05; **P<0,01 y ***P<0,001 frente al control. Ad GFP + Salino-ICV Ad GFP + MCH-ICV (2,5 μg/día) Ad GRP78 + Salino-ICV Ad GRP78 + MCH-ICV (2,5 μg/día) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Ad GFP Ad GRP78 mg TG /g hígado * Ad GFP SAL MCH MCH Ad GRP78 SAL IRE1α pPERK peIF2α eIF2α β-actin Ad GFP SAL MCH MCH Ad GRP78 SAL IRE1α pPERK peIF2α eIF2α β-actin Ad GFP SAL MCH MCH Ad GRP78 SAL IRE1α pPERK peIF2α eIF2α β-actin Cleav Casp 3 XBP1-S CHOP Caspase 3 β-actin Ad GFP SAL MCH MCH Ad GRP78 SAL Cleav Casp 3 XBP1-S CHOP Caspase 3 β-actin Ad GFP SAL MCH MCH Ad GRP78 SAL Cleav Casp 3 XBP1-S CHOP Caspase 3 β-actin Ad GFP SAL MCH MCH Ad GRP78 SAL Cleav Casp 3 XBP1-S CHOP Caspase 3 β-actin Ad GFP SAL MCH MCH Ad GRP78 SAL Resultados 130 Figura 15. Efectos de la administración crónica IP de MCH sobre la ingesta (A), el peso (B), niveles de mRNA en grasa epididimal de FAS, ACCα, LPL (C) y proteína en hígado de pAMPK, pACC, ACCα y en grasa epididimal de ACCα, FAS, CIDEA y pJNK (D-E). El HPRT se utilizó para normalizar los niveles de mRNA. La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 8-7 animales por grupo. Test t-student de una cola. 1.4 La administración central de MCH incrementa la absorción lipídica de la dieta Además de la adiposidad generada por la administración central de MCH en tejido adiposo y en hígado, se estudió si a nivel intestinal hubiera algún efecto mediado por MCH. Aunque no se hayan detectado diferencias en los niveles de defecación (Figura 14A), el contenido en TG de las heces de ambos grupos MCH y MCH pair-fed fue significativamente mayor que el grupo control (Figura 14B). La administración periférica de MCH no afecta al programa 2. lipogénico de grasa e hígado Para descartar la posibilidad de que el MCH difunda desde el CNS hacia la periferia y produzca su acción lipogénica por una acción directa, se realizó una administración periférica intra-peritoneal (IP) de MCH durante 7 días en rata. La dosis administrada en la periferia fue la misma que en ICV (10 µg/día). La administración IP de MCH no incrementó peso ni ingesta (Figura 15A-B); en la periferia, no moduló la expresión génica o proteica de proteínas involucradas en el metabolismo lipídico tanto en el tejido adiposo blanco (Figura 15C-D) como en el hígado (Figura 15E). 0 1 2 3 4 5 6 Defecación en 24h (g) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 mg TG/g de heces *** ** A B Figura 14. Efectos de la administración crónica ICV de MCH sobre la tasa de defecación en 24h (A) y en el contenido de triglicéridos en las heces (B). Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 8-7 animales por grupo. Test ANOVA de una vía; **P<0,01 y ***P<0,001 frente al control. Salino-ICV MCH-ICV (10 μg/día) MCH-ICV pair fed (10 μg/día) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 pAMPK pACC ACCα Niveles de proteína hepática (% control) E Ganancia de peso (g) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 50 100 150 200 250 Ingesta acumulada (g) A B 0 20 40 60 80 100 120 140 FAS ACCαLPL Niveles de ARNm de WAT (% control) 0 20 40 60 80 100 120 ACCαFAS CIDEA pJNK1 Niveles proteicos de WAT (% control) FAS Sal MCH ACCα CIDEA β-actin pJNK1 C D pACC ACCα pAMPK β-actin Sal MCH MCH-IP (10μg/day) Salino-IP Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 131 Figura 16. Efectos de la administración crónica IP de MCH sobre la ingesta (A), el peso (B), niveles de mRNA en grasa epididimal (C) y proteína en grasa epididimal e hígado de ACCα, CIDEA y pAMPK y ACCα respectivamente (D-E). La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 8-7 animales por grupo. Test t-student de una cola; *P<0,05 y ***P<0,001 frente al control. Sin embargo, la administración IP de MCH no asegura que sea completamente absorbida por el torrente sanguíneo. Por ello, se realizó una administración crónica intravenosa (IV) en rata durante una semana en las mismas dosis que en ICV (10µg/día), utilizando en este caso un grupo pair-fed. Los resultados mostraron que la administración IV de MCH incrementó ingesta y peso, pero este último aumento es dependiente de ingesta (Figura 16A-B). Sin embargo, los efectos periféricos en el metabolismo lipídico de grasa e hígado se mantuvieron inalterados tras la administración IV de MCH (Figura 16C-D). MCH central realiza su efecto periférico mediante el sistema 3. nervioso autónomo 3.1 El sistema nervioso simpático modula los efectos centrales de MCH sobre el tejido adiposo blanco El tejido adiposo blanco está conectado al CNS mediante el sistema nervioso autónomo, en particular por el sistema nervioso simpático (SNS)(258). Los receptores β-adrenérgicos (β-ARs) transmiten el mensaje del SNS al tejido adiposo, modulando el metabolismo lipídico. La administración crónica ICV de MCH en ratas, disminuyó significativamente la expresión de los 3 receptores independientemente de su efecto orexigénico (Figura 17A). Para esclarecer cómo la acción de MCH en el CNS modula la inervación simpática eferente hacia el tejido adiposo, se realizó un registro multi-fibra sobre la actividad nerviosa autónoma del tejido adiposo. La administración ICV de MCH, disminuyó la actividad nerviosa registrada en los nervios eferentes que inervan el tejido adiposo epididimal de ratas (Figura 17B-C); siendo esta disminución dependiente de la dosis (Figura 17D). La administración ICV de MCH no redujo la 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Ingesta acumulada (g) *** 0 5 10 15 20 25 ** Ganancia de peso (g) A B 0 20 40 60 80 100 120 140 160 ACCαCIDEA Niveles proteicos de WAT (% control) Sal MCH MCH-pf ACCα CIDEA β-actin 0 20 40 60 80 100 120 140 pAMPK ACCα Niveles de proteína hepática (% control) Sal MCH MCH-pf β-actin ACCα pAMPK C D MCH-IV (10μg/day) Salino-IV MCH-IV pair-fed (10μg/day) Resultados 132 Figura 17. Efectos de la administración crónica ICV de MCH sobre los niveles de mRNA de los receptores β-adrenérgicos en grasa epididimal (A) y en la actividad nerviosa de los nervios eferentes que inervan en tejido adiposo blanco (B-C). Efecto de la administración ICV de MCH a diferentes dosis sobre el SNA de nervios eferentes del tejido adiposo (D) y sobre los nervios eferentes y aferentes tras seccionar el opuesto respectivamente (E) El HPRT se utilizó para normalizar los niveles de mRNA. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 7 animales por grupo. Test ANOVA de una vía; *P<0,05 frente al control. respuesta simpática de nervio distal (aferente) del tejido adiposo graso tras la sección del nervio distal (eferente, Figura 17E); por otro lado, tras cortar el nervio aferente, MCH central fue capaz de reducir la actividad simpática del nervio aferente (Figura 17E). 0 20 40 60 80 100 120 140 β1-AR β2-AR β3-AR * *** Niveles de ARNm de WAT (% control) A Baseline 4th hr 2 - 2 0 1 sec WAT SNA (volts) 2 - 2 0 Sal-ICV Sal-MCH Salino-ICV MCH-ICV (10 μg/día) MCH-ICV pair fed (10 μg/día) B C -90 -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 5Sal 10 MCH (ug) * * WAT SNA (%)D D E Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 133 Figura 18. Efectos de la administración crónica ICV de MCH en ratones WT y triple KO para los receptores β-adrenérgicos sobre la ingesta (A), el peso (B) los niveles proteicos en grasa de pAMPK, pACC, ACCα y FAS (C) y sobre la acumulación de triglicéridos hepáticos (D) La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 7-6 animales por grupo. Test t-student de una cola; *P<0,05 y ***P<0,001 frente al control. Como consecuencia a estos resultados, corroboramos el efecto de MCH sobre el SNS, administrando MCH ICV durante 7 días (2,5 µg/día) a ratones triple-KO (TKO) para los tres receptores β-adrenérgicos. MCH incrementó ingesta tanto en los WT como en los TKO (Figura 18A), pero el incremento de peso sólo se observó en los TKO (Figura 18B). En el tejido adiposo, MCH incrementó los niveles proteicos de ACCα y FAS en los WT a diferencia de los TKO (Figura 18C). Sin embargo, el hígado de los TKO se observó sensible a los efectos sobre la acumulación de lípidos hepáticos inducido por MCH (Figura 19D). 3.2 EL sistema nervioso parasimpático modula los efectos centrales de MCH sobre el hígado La inervación autónoma del hígado involucra tanto al SNS como al sistema nervioso parasimpático (PSNS) (276). Sin embargo, es el PSNS el involucrado en procesos que favorecen la acumulación energética (283). Por ello, se estudió si el nervio vago está involucrado en los efectos centrales de MCH sobre el metabolismo hepático. Tras realizar una vagotomía mediante la disección de ramas dorsales y ventrales del nervio vago de ratas, se administró MCH ICV de forma crónica durante una semana. La eficiencia de la vagotomía (VGX) se comprobó por la observación de hipertrofia estomacal (Figura 19A). El incremento de peso e ingesta inducido por MCH, se detectó en las ratas control (sham) pero no en las vagotomizadas (Figura 19B-C). Por otro lado, la infusión central de MCH, redujo los ácidos grasos libres del suero (Figura 19D) e 0 50 100 150 200 250 pAMPK pACC ACCαFAS Niveles de proteína de WAT (% control) * * A B C D WT MCH-ICV (2,5μg/día) WT Salino-ICV TKO Salino-ICV TKO MCH-ICV (2,5μg/día) Sal MCH WT Sal MCH FAS β-actin pAMPK pACC ACCα TKO µg TG/mg hígado 0 2 4 6 8 10 12 **** Ingesta acumulada (g) 0 5 10 15 20 25 30 ** 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 * Ganancia de peso (g) Resultados 140 A B C VMH Ad GFP 3v em Ingesta acumulada (g) 0 20 40 60 80 100 120 140 Ganancia de peso (g) 0 2 4 6 8 10 pACC ACC pAMPK β-actin LPL Ad-GFP Ad-MCH-R VMH Niveles de proteína hepática (% control) 0 20 40 60 80 100 120 140 pAMPK pACC ACCαLPL VMH Ad-MCHR VHM Ad-GFP 0 20 40 60 80 100 120 140 160 ACC CIDEA pHSL FAS Niveles proteicos de WAT (% control) D E Figura 25. Efecto de la sobre-expresión de MCH-R o GFP en el VMH (A) sobre ingesta (B), peso (C), niveles proteicos de pAMPK, pACC, ACCα, y LPL en el en el hígado (D); y sobre los niveles proteicos de ACCα, CIDEA, pHSL y FAS en el tejido adiposo blanco (E). La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 7 animales por grupo. Test t-Student de una cola. CIDEA ACC FAS pHSL β-actin Ad-GFP Ad-MCH-R VMH CIDEA ACC FAS pHSL β-actin Ad-GFP Ad-MCH-R VMH CIDEA ACC FAS pHSL β-actin Ad-GFP Ad-MCH-R VMH CIDEA ACC FAS pHSL β-actin Ad-GFP Ad-MCH-R VMH CIDEA ACC FAS pHSL β-actin Ad-GFP Ad-MCH-R VMH 4.3 La inhibición genética del MCH-R1 en el LHA, reduce la esteatohepatitis inducida por dieta deficiente el colina-metionina, a través del nervio vago Hasta ahora, se ha mostrado que la sobre-expresión de MCH-R1 o la administración de MCH en el LHA modulaba el metabolismo hepático. Por tanto, se quiso determinar si la inhibición del MCH-R1 en dicha área, sería suficiente para mejorar el estado hepático de ratas alimentadas con una dieta deficiente en metionina y colina (MCD). Esta dieta MCD produce esteatohepatitis no alcohólica sin producir ningún otro evento fisiológico relacionado con obesidad o síndrome metabólico (389). Para inhibir el MCH-R1, se administró mediante estereotaxia en el LHA (Figura 26A) un lentivirus que codifica un RNA horquilla (shRNA) contra el mRNA de MCH-R1 en ratas alimentadas con dieta MCD. Tras comprobar la eficiencia del aislamiento de proteínas del núcleo hipotalámico lateral (Figura 26B), la reducción del MCH-R1 por el shRNA en el LHA se demostró mediante western blot (Figura 26C). La inhibición del MCH-R1 en el LHA, redujo el contenido de triglicéridos hepáticos en ratas con esteatohepatitis (Figura 26D). Los depósitos lipídicos observado en las tinciones hepáticas Oil Red O y Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 141 hematoxilina-eosina, mostraron una importante esteatosis de las ratas alimentadas con MCD en comparación con las alimentadas con dieta normal (estándar). Sin embargo, las ratas tratadas con el shRNA anti MCH-R1 alimentadas con dieta MCD, presentaron una marcada reducción de los depósitos lipídicos (Figura 26E). Así mismo, la tinción tricrómica de Masson, utilizada para teñir las fibras de colágeno, mostraron una reducción de la fibrosis característica de la esteatohepatitis alrededor de la vena central de las áreas porta de ratas en las que se inhibió el MCH-R1 alimentadas con dieta MCD (Figura 26E). * LHA 3v 1 mm GFP 0 20 40 60 80 100 120 MCH-R Niveles proteicos de LHA (% control) * shRNA MCH-R GFP MCH-R βactin Chow + LHA Lentiv- GFP Chow + LHA LentivshRNA MCH-R Sham MCD + LHA LentivshRNA MCH-R Sham MCD + LHA Lentiv-GFP Oil Red O VGX MCD + LHA Lentiv-GFP VGX MCD + LHA Lentiv-shRNA MCH-R 200 µm 200 µm200 µm 200 µm200 µm200 µm H&E 100 µm 100 µm100 µm 100 µm 100 µm100 µm Chow + LHA Lentiv- GFP Chow + LHA LentivshRNA MCH-R Sham MCD + LHA LentivshRNA MCH-R Sham MCD + LHA Lentiv-GFP VGX MCD + LHA Lentiv-GFP VGX MCD + LHA Lentiv-shRNA MCH-R Tricrómico de Masson 50 µm 50 µm 50 µm 50 µm50 µm50 µm Chow + LHA Lentiv- GFP Chow + LHA LentivshRNA MCH-R Sham MCD + LHA LentivshRNA MCH-R Sham MCD + LHA Lentiv-GFP VGX MCD + LHA Lentiv-GFP VGX MCD + LHA Lentiv-shRNA MCH-R A B 0 2 4 6 8 10 12 14 16 mg TG /g hígado * C D Figura 26 Localización de la administración de lentivirus en el núcleo lateral detectando GFP (A). Comprobación de la eficacia del aislamiento de núcleos hipotalámicos mediante western blot de proteínas específicas de ARC y LHA respectivamente: AGRP y pro-MCH (B). Efecto de la inhibición de MCH-R en el LHA en ratas alimentadas con dieta MCD y vagotomizadas, sobre los niveles de triglicéridos hepáticos (D) y sobre la morfología hepática en histologías de Oil-red O, H&E y tinción tricrómica de Masson (E). La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 8-7 animales por grupo. Test t-Student de una cola; *P<0,05 y ***P<0,001 frente al control. ARC LHA AGRP pro-MCH β-actina 0 50 100 150 200 250 AGRP pro-MCH Niveles proteicos (% control) *** *** Sham + LHA Lentiv- GFP Sham + LHA Lentiv-shRNA MCH-R VGX + LHA Lentiv-GFP VGX + LHA Lentiv-shRNA MCH-R E ARC LHA Resultados 142 La reversión del daño hepático inducido por la dieta MCD tras la inhibición del MCH-R1 en el lateral, también se reflejó en la reducción de los niveles séricos de la alanina aminotransaminasa (ALT) y de la aspartato aminotrasferasa (AST) (Figura 27A). A nivel proteico, la reducción de MCH-R1 en el LHA, redujo los niveles proteicos de LPL, pJNK1 y los marcadores del ER-stress y apoptosis (Figura 27B). Como se ha descrito con anterioridad, el nervio vago media los efectos hepáticos inducidos por la administración crónica central de MCH. Por ello, se estudió si la mejora de la esteatohepatitis inducida por MCD debido a la reducción del MCH-R1 en el LHA, estaba mediado por el nervio vago. Los resultados mostraron que la vagotomía bloquea los efectos del silenciamiento del MCH-R1 en el LHA sobre los niveles de triglicéridos hepáticos (Figura 26D), tinción histológica de Oil red O, H&E y fibrosis (Figura 26E); niveles séricos de AST y ALT (Figura 27A) y niveles proteicos en el hígado (Figura 27B). Sham + LHA Lentiv- GFP Sham + LHA Lentiv-shRNA MCH-R VGX + LHA Lentiv-GFP VGX + LHA Lentiv-shRNA MCH-R 0 2 4 6 8 10 12 AST ALT ** Niveles séricos UI/ L A 0 20 40 60 80 100 120 140 160 LPL pJNK1/JNK1 pIRE1α/IRE1αpPERK pelF2α/elF2αXBP1-S CHOP Caspase 3 Cleaved Caspase 3 ** *** * Niveles de proteína hepática (% control) * ** B pIRE1α JNK1 LPL pJNK1 shRNA MCH-R Sham GFP shRNA MCH-R VGX GFP β-actin IRE1α shRNA MCH-R Sham GFP shRNA MCH-R VGX GFP peIF2α eIF2α β-actin pPERK XBP1-S Cleav Casp 3 CHOP Caspase 3 β-actin shRNA MCHR Sham GFP shRNA MCH-R VGX GFP Figura 27. Efecto de la inhibición de MCH-R en el LHA en ratas alimentadas con dieta MCD y vagotomizadas, sobre los niveles séricos de las transaminasas ALT y AST (A) y sobre los niveles de proteínas hepáticas de LPL, ratio pJNK/JNK, pIRE1α/IRE1α, pPERK, peIF2α/eIF2α, XBP1-S, CHOP, caspasa 3 y cleaved caspasa 3 (B). La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 7 animales por grupo. Test t-Student de una cola; *P<0,05 y **P<0,01 frente al control. Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 143 El sistema opioide, mediante el receptor kappa, media las acciones 5. centrales de MCH sobre el metabolismo lipídico del hígado 5.1 El MCH-R1 y el KOR co-localizan en el LHA, y MCH induce la producción de prodinorfina Estudios previos han demostrado que existe una asociación tanto anatómica como funcional entre MCH y el sistema kappa opioide (173,253,254). Sin embargo se desconoce si KOR modula las acciones periféricas de MCH o si el sistema central kappa opioide es capaz de modular directamente el metabolismo periférico. Usando la proteína guía tdTomato, se identificaron en el LHA las neuronas que expresan CREMCH-R1 en ratones transgénicos y se estudió si dichas neuronas expresaban KOR mediante una doble inmunohistoquímica (Figura 28A). El análisis confocal de la doble inmunohistoquímica determinó que la mayoría de las células que expresan el MCH-R1 (Figura 28A panel a) son positivas para KOR (Figura 28A panel b-c). Figura 28. Doble inmunohistoquímica de MCH-R (A, panel a) y KOR (A, panel b) para mostrar la co-localización de MCH-R y KOR (A, panel c) en el LHA de ratones transgénicos cre- MCH tdTomato. Las líneas punteadas amarillas indican neuronas positivas para ambos MCH-R y KOR (A). La línea punteada blanca representa una neurona positiva sólo para KOR. Barra de escala 10 µm. Efecto de la administración crónica ICV de MCH sobre los niveles de expresión proteica de prodinorfina en el LHA (B). Efecto de la dieta MCD sobre los niveles de MCH y prodinorfina en el LHA comparado con ratas alimentadas con dieta estándar (C). Efecto del bloqueo de MCH-R en el LHA sobre ratas alimentadas con dieta MCD, sobre los niveles proteicos de prodinorfina en el LHA (D). La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 8-7 animales por grupo. Test t-Student de dos colas. *P<0,025, **P<0,005 y ***P<0,001 frente al control. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Prodinorfina Niveles proteicos de LHA (% control) ** A B Prodin Salino MCH -actin ca b MCH-R κOR MCH-R/κOR MCH-ICV (10μg/day) Salino-ICV Dieta chow Dieta MCD 0 50 100 150 200 250 300 *** ** Niveles proteicos de LHA (% control) MCH Prodinorfina Chow MCD Prodin MCH β-actin 0 20 40 60 80 100 120 140 Niveles proteicos de LHA (% control) * Prodinorfina Dieta MCD + LHA Lentiv-GFP Dieta MCD + LHA Lentiv-shRNA MCH-R Prodin GFP shRNA MCH-R -actin C D Resultados 144 Siendo la prodinorfina el ligando natural de KOR, determinamos si MCH influye en su expresión. Observamos que la administración crónica ICV de MCH, incrementó significativamente la expresión de prodinorfina en el hipotálamo lateral (Figura 28B). En ratas alimentadas con dieta MCD, existe un incremento significativo en la expresión tanto de MCH como de prodinorfina en el LHA, en comparación con ratas alimentadas con estándar (Figura 28C). Sin embargo, al inhibir el MCH-R1 en el lateral mediante un shRNA en esas ratas, se redujo significativamente los niveles de prodinorfina en el LHA (Figura 28D). 5.2 Los ratones KO para KOR son resistentes a los efectos centrales de MCH sobre el ER-stress y el metabolismo lipídico del hígado En correspondencia con el hecho de que la administración central de MCH, induce la producción de prodinorfina en el LHA, se estudió si la infusión crónica ICV de MCH era capaz de modular el metabolismo lipídico y del ER-stress hepático en ratones KO para KOR. La administración crónica ICV de MCH (2,5 µg/día) estimuló ingesta y ganancia de peso tanto en el fenotipo salvaje (WT) como en los KOR-KO (Figura 29A-B). Sin embargo, mientras que en los WT el tratamiento con MCH incrementa los niveles de TG hepáticos, los ratones KOR-KO eran resistentes a dicho efecto inducido por MCH (Figura 29-EC). 0 5 10 15 20 25 30 35 WT κOR-KO ** Ingesta acumulada (g) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 WT κOR-KO ** Ganancia de peso (g) A B WT Salino-ICV WT MCH-ICV (2,5 μg/día) κOR-KO Salino ICV κOR-KO MCH-ICV(2,5 μg/dìa) Oil Red O WT Salino-ICV WT MCH-ICV 50 µm 50 µm κOR-KO Salino-ICV 200 κOR-KO MCH-ICV 50 µm 50 µm C H&E WT Salino-ICV WT MCH-ICV 50 µm κOR-KO Salino-ICV κOR-KO MCH-ICV 50 µm 50 µm Figura 29. Efectos de la administración crónica ICV de MCH (2,5µg/día) en ratones WT y KOR-KO sobre la ingesta (A), peso (B) triglicéridos hepáticos (C) y sobre la acumulación lipídica sobre cortes histológicos de hígado con tinción de Oil red O y H&E (D). Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 8-7 animales por grupo. Test t-student de una cola; *P<0,05 frente al control. D 0 1 2 3 4 5 6 WT κOR-KO mg TG /g hígado * Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 145 A nivel proteico, tanto las proteínas clave del metabolismo lipídico hepático (LPL y pJNK1) como del ER-stress y apoptosis presentan, un incremento significativo en ratones WT tratados con MCH, pero no en lo KOR-KO (Figura 30A). 5.3 El silenciamiento genético de KOR en el LHA protege frente al efecto adipogénico y ER-stress hepático inducido por MCH mediante el ANS Mediante el uso de un adenovirus asociado (AAV) se administró un shRNA contra KOR en el LHA mediante estereotaxia. La eficiencia de la administración en el lateral se corroboró mediante la detección de GFP (Figura 31A) y midiendo los niveles proteicos de KOR en el hipotálamo lateral (figura 31B). 3 semanas después de la administración del AAV-shRNA KOR, se administró MCH ICV durante una semana (10 µg/día). La administración crónica ICV de MCH incrementa ingesta y peso independientemente de la inhibición de KOR (Figura 31C-D). Como se ha descrito en la introducción, en la medula oblongata del tronco encefálico, el núcleo dorsomedial del nervio vago (Figura 31E) es imprescindible en el control del tono parasimpático del nervio vago (390). La administración crónica ICV de MCH, incrementó la inmunoreactividad del marcador de actividad neuronal c-Fos en las neuronas del DMV (Figura 31F). Sin embargo, el silenciamiento de KOR en el LHA impidió la activación neuronal del DMV inducido por la administración crónica de MCH (Figura 31G). Niveles de proteína hepática (% control) 0 50 100 150 200 250 300 LPL pJNK1/JNK1 pIRE1α/IRE1αpPERK pelF2α/elF2αXBP1-S CHOP Caspasa 3 Cleaved Caspase 3 350 450 ** WT Salino MCH MCH KO kOR Salino JNK1 pJNK1 LPL pIRE1α β-actin IRE1α pPERK pelF2α elfFα β-actin WT Salino MCH MCH KO kOR Salino Cleav Casp 3 XBP1-S CHOP Caspase 3 β-actin WT Salino MCH MCH KO kOR Salino Figura 30. Efectos de la administración crónica ICV de MCH (2,5 µg/día) en ratones WT y KOR-KO sobre los niveles de proteínas hepáticas de LPL, ratio pJNK/JNK, pIRE1α/IRE1α, pPERK, peIF2α/eIF2α, XBP1-S, CHOP, caspasa 3 y cleaved caspasa 3. La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 8-7 animales por grupo. Test t-student de una cola; *P<0,05 y **P<0,01 frente al control. A WT Salino-ICV WT MCH-ICV (2,5 μg/día) κOR-KO Salino ICV κOR-KO MCH-ICV(2,5 μg/dìa) IRE1α pPERK pelF2α elfFα β-actin WT Salino MCH MCH KO kOR Salino IRE1α pPERK pelF2α elfFα β-actin WT Salino MCH MCH KO kOR Salino IRE1α pPERK pelF2α elfFα β-actin WT Salino MCH MCH KO kOR Salino Cleav Casp 3 XBP1-S CHOP Caspase 3 β-actin WT Salino MCH MCH KO kOR Salino Cleav Casp 3 XBP1-S CHOP Caspase 3 β-actin WT Salino MCH MCH KO kOR Salino Cleav Casp 3 XBP1-S CHOP Caspase 3 β-actin WT Salino MCH MCH KO kOR Salino Resultados 146 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Ingesta acumulada (g) * * 0 5 10 15 20 25 30 Ganancia de peso (g) * A B 0 20 40 60 80 100 120 κOR Niveles proteicos de LHA (% control) * LHA AAV-GFP + Salino-ICV LHA AAV-GFP + MCH-ICV (10 μg/day) LHA AAV shRNA-κOR + Salino-ICV LHA AAV shRNA-κOR + MCH-ICV (10 μg/day) shRNA κOR GFP κOR βactin C D Inmuno c-fos/LHA AAV-GFP + MCH-ICV 200 µm 10N 10N CC 200 µm 10N 10N CC Inmuno c-fos/LHA AAVGFP + Salino-ICV 0 50 100 150 200 Células IR c-FOS *** E 200 µm 10N 10N CC Inmuno c-fos/LHA AAV shRNA-κOR-Salino-ICV Inmuno c-fos/LHA AAV shRNA-κOR-MCH-ICV 200 µm 10N 10N CC CC 10N 10N 12N 12N Sol Sol Gr Gr AP Bregma -13,80 200 µm Tinción de Nissl 0 50 100 150 200 Células IR C-FOS F G Figura 31. Comprobación de la administración del AAV shRNA-KOR en el LHA mediante GFP (A) y disminución a nivel proteico de KOR por efecto del shRNA (B). Efecto de la inhibición de KOR en el LHA ratas con tratamiento crónico ICV de MCH (10 µg/día) sobre peso e ingesta (C-D). Fotomicrografía de una sección médula oblongata del tronco encéfalo, representando el DMV con tinción de Nissl (E). Efecto de la inhibición de KOR en el LHA ratas con tratamiento crónico ICV de MCH (10 µg/día) sobre la inmunoreactividad de c-Fos en el DMV (F-G). Gr: núcleo grácil; AP: área postrema; SubP: área subpostrema; Sol: tracto solitario; 10N: nervio vago; CC: canal central; 12N: nervio hipogloso. La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Test t-student de una cola; Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 8-7 animales por grupo. *P<0,05 y ***P<0,001 frente al control. Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 147 A nivel periférico, el incremento de los niveles de triglicéridos inducido por MCH se bloquea al silenciar KOR en el LHA (Figura 32A-B). En el hígado, la inhibición de KOR en el LHA impide el incremento de las proteínas implicadas en la acumulación lipídica, ER- stress y apoptosis inducido por MCH (Figura 32C). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 GFP shRNA κOR mg TG /gr hígado LHA AAV-GFP + Salino-ICV LHA AAV-GFP + MCH-ICV (10 μg/day) LHA AAV shRNA-κOR + Salino-ICV LHA AAV shRNA-κOR + MCH-ICV (10 μg/day) A LHA AAV-GFP + Salino-ICV LHA AAV-GFP + MCH-ICV Oil Red O 50 µm 50 µm LHA AAV shRNA-κOR + Saline-ICV LHA AAV shRNA-κOR + MCH-ICV 50 µm 50 µm H&E 50 µm 50 µm LHA AAV-GFP + Salino-ICV LHA AAV-GFP + MCH-ICV 50 µm 50 µm LHA AAV shRNA-κOR + Salino-ICV LHA AAV shRNA-κOR + MCH-ICV B 0 50 100 150 200 250 300 LPL pJNK1/JNK1 pIRE1α/IRE1αpPERK pelf2α/elf2αXBP1-S CHOP Caspase 3 Cleaved Caspase 3 Niveles de proteína hepática (% control) ** * ** **** *** ** pIRE1α pJNK1 shRNA κOR Salino MCH GFP Salino MCH JNK1 LPL β-actin IRE1α pPERK eIF2α β-actin pelF2α shRNA κOR Salino MCH GFP Salino MCH β-actin CHOP Caspase 3 Cleav Casp 3 XBP1-S shRNA κOR Salino MCH GFP Salino MCH C Figura 32. Efectos del silenciamiento de KOR en el LHA en ratas con administración crónica ICV de MCH (10 µg/día) sobre los TG hepáticos (A), histología de Oil-red O y H&E (B) y sobre los niveles de proteínas hepáticas de LPL, ratio pJNK/JNK, pIRE1α/IRE1α, pPERK, peIF2α/eIF2α, XBP1-S, CHOP, caspasa 3 y cleaved caspasa 3 (C). La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 8-7 animales por grupo. Test t-student de una cola; *P<0,05; **P<0,01 y ***P<0,001 frente al control. Resultados 148 La especificidad de estos efectos sobre el hígado, se comprobó mediante el análisis de las proteínas moduladas por la administración central MCH en grasa. EL silenciamiento de KOR en el lateral, no impidió que la administración crónica ICV de MCH ejerza su efecto sobre el metabolismo lipídico del tejido adiposo blanco (Figura 33A). 5.4 La inhibición génica de KOR en el LHA, reduce la esteatohepatitis inducida por la dieta MCD Tres semanas después de la administración del AAV con el shRNA-KOR en el LHA, las ratas fueron alimentadas con MCD durante tres semanas. La eficiencia de la administración viral en el LHA, se corroboró mediante la detección de GFP (Figura 34A). La inhibición de KOR en el LHA, redujo significativamente tanto el contenido de TG hepáticos, como la deposición de colágeno alrededor de la vena central de los lóbulos hepáticos (Figura 34B-C). También cabe destacar una reducción de los niveles de mRNA de los principales marcadores de inflamación (TNF-α, IL-6, CD36, CD68) en el hígado de ratas alimentadas con MCD (Figura 34D). Acorde con estos resultados, en el hígado de las ratas con el KOR silenciado en el LHA, lo niveles proteicos de LPL, pJNK1 y marcadores de ER-stress se detectaron reducidos frente al control (Figura 34E). Figura 33. Efectos del silenciamiento de KOR en el LHA en ratas con administración crónica ICV de MCH (10 µg/día) sobre los sobre los niveles de proteína de FAS y la ratio pHSL/HSL en el tejido adiposo blanco (A). La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 8-7 animales por grupo. Test t-student de una cola; *P<0,05; **P<0,01 y ***P<0,001 frente al control. FAS HSL pHSL β-actin shRNA κOR Salino MCH GFP Salino MCH 0 50 100 150 200 250 300 FAS pHSL/HSL * ** *** Niveles de proteína en WAT (% control) * A LHA AAV-GFP + Salino-CV LHA AAV-GFP + MCH-ICV (10 μg/día) LHA AAV shRNA-κOR + Salino-ICV LHA AAV shRNA-κOR + MCH-ICV (10 μg/día) Efectos centrales de MCH sobre el metabolismo periférico 149 Dieta MCD + LHA AAV-GFP Dieta MCD + LHA AAV shRNA-κOR 3v 1 mm GFP LHA 0 5 10 15 20 25 ** mg TG /gr hígado Dieta MCD +LHA AAV-GFP Dieta MCD + LHA AAV shRNA-κOR 200 µm Oil Red O 200 µm H&E 100 µm 100 µm Dieta MCD +LHA AAV-GFP Dieta MCD + LHA AAV shRNA-κOR Tricrómico de Masson 50 µm 50 µm Dieta MCD +LHA AAV-GFP Dieta MCD + LHA AAV shRNA-κOR A B C 0 20 40 60 80 100 120 TNFαIL-6 CD36 CD68 ** Niveles de ARNm hepático (% control) * D 0 20 40 60 80 100 120 140 LPL pJNK1/JNK1 pIRE1α/IRE1αpPERK pEif2α/Eif2αXBP1-S CHOP ** ** Niveles de proteína hepática (% control) * * GFP shRNA κOR pIRE1α pJNK1 JNK1 LPL β-actin IRE1α pPERK eIF2α β-actin pelF2α CHOP XBP1-S GFP shRNA κOR Figura 34. Localización de la administración de lentivirus en el núcleo lateral detectando GFP (A). Efecto de la inhibición de KOR en el LHA en ratas alimentadas con dieta MCD, sobre los niveles de triglicéridos hepáticos (B), sobre la morfología hepática en histologías de Oil-red O, H&E y tinción tricrómica de Masson (C), sobre los niveles de mRNA de TNF-α, IL-6, CD36, CD68 (D) y sobre los niveles de proteínas hepáticas de LPL, ratio pJNK/JNK, pIRE1α/IRE1α, pPERK, peIF2α/eIF2α, XBP1-S y CHOP. La β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteína. El HPRT se utilizó para normalizar los niveles de mRNA. Los valores indican la media ± el error estándar de un n de 8-7 animales por grupo. Test t-student de una cola; *P<0,05 y **P<0,01 frente al control.