Papel de la nedilación de PCK1 en la gluconeogénesis hepática

ESCUELA DE DOCTORADO
INTERNACIONAL DE LA USC
Uxía
Fe nández Paz
Tesis doc o al
Papel de la nedilación de PCK1
en la gluconeogénesis hepá ica
San iago de Compos ela, 2024
P og ama de doc o ado en Endoc inología
1
TESIS DOCTORAL
PAPEL DE LA NEDILACIÓN DE PCK1
EN LA GLUCONEOGÉNESIS
HEPÁTICA
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
Di ec o es: Rubén Noguei as Pozo
Ca los Diéguez González
PROGRAMA DE DOCTORADO EN ENDOCRINOLOGÍA
SANTIAGO DE COMPOSTELA
AÑO 2024
2
DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES
Doña Uxía Fe nández Paz
Declo a no ene ningún con lic o de in e és en elación con la Tesis Doc o al
i ulada:
PAPEL DE LA NEDILACIÓN DE PCK1 EN LA GLUCONEOGÉNESIS
HEPÁTICA
3
Resumen
La nedilación es un mecanismo pos aduccional que ag ega una p o eína simila a la
ubiqui ina, a sabe , la p o eína 8 egulada nega i amen e du an e el desa ollo exp esada po
células p ecu so as neu ales (NEDD8). En es e abajo mos amos en a ones que la
nedilación en el hígado es á modulada po la disponibilidad de nu ien es. La inhibición de
la nedilación en el hígado de a ón educe la capacidad gluconeogénica y las acciones
hipe glucémicas de las ho monas con a egulado as. Además, las pe sonas con diabe es ipo
2 p esen an ni eles ele ados de nedilación hepá ica. A ni el mecanís ico, el ayuno o la
es icción caló ica de a ones conduce a la nedilación de la os oenolpi u a o ca boxiquinasa
1 (PCK1) en es esiduos de lisina: K278, K342 y K387. Encon amos que la mu ación de
las es lisinas PCK1 que es án nediladas educe su asa de ac i idad gluconeogénica. Las
simulaciones de dinámica molecula mues an que la nedilación de PCK1 pod ía eposiciona
dos bucles que odean el cen o ca alí ico en una con igu ación abie a, haciendo que el cen o
ca alí ico sea más accesible. Nues o es udio e ela que la nedilación de PCK1 p opo ciona
un mecanismo p eciso pa a con ola el me abolismo de la glucosa al incula la
disponibilidad o al de nu ien es con la homeos asis me abólica.
Abs ac
Neddyla ion is a pos - ansla ional mechanism ha adds a ubiqui in-like p o ein, namely
neu al p ecu so cell exp essed de elopmen ally down- egula ed p o ein 8 (NEDD8). In his
wo k, we show in mice ha neddyla ion in li e is modula ed by nu ien a ailabili y.
Inhibi ion o neddyla ion in mouse li e educes gluconeogenic capaci y and he
hype glycemic ac ions o coun e egula o y ho mones. Fu he , people wi h ype 2 diabe es
display ele a ed hepa ic neddyla ion le els. A mechanis ic le el, as ing o calo ic es ic ion
o mice leads o neddyla ion o phosphoenolpy u a e ca boxykinase 1 (PCK1) a h ee lysine
esidues—K278, K342 and K387. PCK1. We ind ha mu a ing he h ee PCK1 lysines ha
a e neddyla ed educes i s gluconeogenic ac i i y a e. Molecula dynamics simula ions show
ha neddyla ion o PCK1 could e-posi ion wo loops su ounding he ca aly ic cen e in o
4
an open con igu a ion, ende ing he ca aly ic cen e mo e accessible. Ou s udy e eals ha
neddyla ion o PCK1 p o ides a inely- uned mechanism o con olling glucose me abolism
by linking whole nu ien a ailabili y o me abolic homeos asis.
Resumo
A nedilación é un mecanismo pos aducional que ag ega unha p o eína semellan e á
ubiqui ina, a sabe , a p o eína 8 egulada nega i amen e du an e o desen ol emen o
exp esada po células p ecu so as neu onais (NEDD8). Nes e aballo mos amos en a os
nos que a nedilación no ígado es á modulada pola dispoñibilidade de nu in es. A inhibición
da nedilación no ígado de a o educe a capacidade gluconeoxénica e as accións
hipe glucemian es das ho monas con a egulado as. Po én, as pe sonas con diabe e ipo 2
p esen an ni eis ele ados de nedilación hepá ica. A ni el mecanís ico, o xaxún ou a
es icción caló ica de a os conduce á nedilación da os oenolpi u a o ca boxiquinasa 1
(PCK1) en es esiduos de lisina: K278, K342 y K387. Encon amos que a mu ación das
es lisinas PCK1 que es án nediladas educe a súa asa de ac i idade gluconeoxénica. As
simulacións de dinámica molecula mos an que a nedilación de PCK1 pode ía eposiciona
dous bucles que odean o cen o ca alí ico nunha con igu ación abe a, acendo que o cen o
ca alí ico sexa máis accesible. O noso es udio e ela que a nedilación de PCK1 p opo ciona
un mecanismo p eciso pa a con ola o me abolismo da glucosa ao incula a dispoñibilidade
o al de nu in es coa homeos asis me abólica.

5
Tabla de con enido
Tabla de con enido ............................................................................................................................. 5
Ab e ia u as, ac ónimos y anglicismos: .............................................................................................. 9
1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 17
1.1 Homeos asis glucídica ....................................................................................................... 17
1.1.1 Regulación de los ni eles de glucosa en sang e. ....................................................... 17
1.1.1.1 Es ado abso i o ................................................................................................. 17
1.1.1.2 Es ado in e p andial y pos p and ial .................................................................. 17
1.1.2 Diabe es ..................................................................................................................... 18
1.1.3 Papel del hígado en la egulación de la homeos asis glucídica ................................. 21
1.1.4 Sis emas de de ección de glucosa en sang e ............................................................ 21
1.1.4.1 De ección y con ol de los ni eles de glucemia a ni el cen al .......................... 21
1.1.4.2 De ección de los ni eles de glucemia po el hígado ........................................... 24
1.1.4.3 De ección de los ni eles de glucemia po el pánc eas ....................................... 25
1.1.4.4 De ección de los ni eles de glucemia po el in es ino ....................................... 26
1.1.5 Sis emas de egulación de la homeos asis glucídica ................................................. 27
1.1.5.1 Adap aciones me abólicas al ayuno ................................................................... 27
1.1.5.1.1 Glucagón ........................................................................................................ 28
1.1.5.1.2 Ad enalina ...................................................................................................... 29
1.1.5.1.3 Glucoco icoides ............................................................................................ 31
1.1.5.1.4 Ho mona de c ecimien o y gh elina .............................................................. 32
1.1.5.2 Adap aciones me abólicas a la hipe glucemia. .................................................. 34
1.1.5.2.1 Insulina ........................................................................................................... 34
1.1.5.2.2 Amilina ........................................................................................................... 38
1.1.5.2.3 Inc e inas ....................................................................................................... 39
1.1.6 Mecanismos hepá icos pa a man ene la no moglucemia ....................................... 41
1.1.6.1 U ilización de glucosa en el hígado: glucólisis .................................................... 42
1.1.6.1.1 Regulación alos é ica y endoc ina de la glucólisis ......................................... 45
1.1.6.1.2 Regulación ansc ipcional de la glucólisis .................................................... 45
1.1.6.2 Almacenamien o de glucosa en el hígado: glucogenogénesis ........................... 47
1.1.6.2.1 Regulación de la glucogenogénesis ............................................................... 48
1.1.6.3 P oducción endógena de glucosa ....................................................................... 49
6
1.1.6.3.1 Glucogenolisis ................................................................................................ 49
1.1.6.3.2 Gluconeogénesis ............................................................................................ 52
1.1.6.4 Libe ación de glucosa al o en e sanguíneo ...................................................... 65
1.2 Modi icaciones pos aduccionales .................................................................................... 65
1.2.1 Ubiqui inación ........................................................................................................... 66
1.2.2 Nedilación .................................................................................................................. 67
1.2.2.1 Complejo CRL ...................................................................................................... 69
1.2.2.2 P o eínas eguladas po nedilación .................................................................... 71
2. HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 75
3. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 77
4. METODOLOGÍA .......................................................................................................................... 79
4.1 Animales de expe imen ación ........................................................................................... 79
4.2 P ocedimien os en animales ............................................................................................. 81
3.2.1 Moni o ización de la inges a y el peso co po al. ............................................................. 81
4.2.1 Es udio del e ec o del es ado nu icional en los ni eles de nedilación .................... 81
4.2.2 Es udio del e ec o de la glucosa en los ni eles de nedilación ................................... 81
4.2.3 Ayuno de 24 ho as..................................................................................................... 81
4.2.4 Res icción caló ica .................................................................................................... 81
4.2.5 Inyección in ape i oneal .......................................................................................... 82
4.2.6 Adminis ación de ho monas .................................................................................... 82
4.2.6.1 Adminis ación de lep ina ................................................................................... 82
4.2.6.2 Adminis ación de glucagón ............................................................................... 82
4.2.6.3 Adminis ación de ad enalina ............................................................................. 82
4.2.6.4 Adminis ación de co isol .................................................................................. 83
4.2.6.5 Adminis ación de insulina ................................................................................. 83
4.2.7 Tes s de ole ancia .................................................................................................... 83
4.2.7.1 Tes de ole ancia a pi u a o .............................................................................. 83
4.2.7.2 Tes de ole ancia a glucosa ............................................................................... 83
4.2.7.3 Tes de ole ancia a insulina ............................................................................... 84
4.2.7.4 Tes de ole ancia a glice ol ................................................................................ 84
4.2.8 T a amien o con MLN4924 ....................................................................................... 84
4.2.9 Inyección en la ena de la cola .................................................................................. 85
4.2.10 De e minación de la p oducción hepá ica de glucosa .............................................. 86
7
4.2.10.1 Ci ugía pa a la canulación de la ena yugula .................................................... 86
4.2.10.2 In usión con glucosa i iada ............................................................................... 87
4.2.11 Análisis his ológico del ejido hepá ico. .................................................................... 88
4.2.11.1 Hema oxilina/eosina ........................................................................................... 88
4.2.11.2 Inmunohis oquímica ........................................................................................... 88
4.2.12 Sac i icio, ecogida de ejidos y mues as. ................................................................ 89
4.3 Cul i os celula es ............................................................................................................... 89
4.3.1 T a amien os celula es .............................................................................................. 90
4.3.1.1 T ans ecciones .................................................................................................... 90
4.3.1.1.1 Silenciamien o de NAE1, NEDD8 y PCK1 en la línea celula AML12 .............. 90
4.3.1.1.2 Sob eexp esión de PCK1 en la línea celula AML12 ...................................... 91
4.3.1.2 Es udio del e ec o del es ado nu icional ........................................................... 91
4.3.1.3 T a amien o con MLN4924 ................................................................................. 92
4.3.1.4 Medición de la glucosa en el medio. .................................................................. 92
4.3.1.5 De e minación de la ac i idad enzimá ica de PCK1. .......................................... 93
4.4 Mues as de hígado de pacien es. .................................................................................... 93
4.5 Análisis molecula ............................................................................................................. 94
4.5.1 Análisis de la exp esión p o eica median e Wes e n Blo ......................................... 94
4.5.1.1 Ex acción de p o eínas o ales y p epa ación de las mues as. ........................ 94
4.5.1.2 Cuan i icación de los ex ac os p o eicos. .......................................................... 96
4.5.1.3 P epa ación de las mues as pa a elec o o esis en SDS-PAGE. ........................ 96
4.5.1.4 Elec o o esis SDS-PAGE. .................................................................................... 97
4.5.2 T ans e encia semi-húmeda. ..................................................................................... 98
4.5.2.1 Inmunode ección de p o eínas. .......................................................................... 99
4.5.2.1.1 Bloqueo. ......................................................................................................... 99
4.5.2.1.2 Incubación con an icue po p ima io. ............................................................ 99
4.5.2.1.3 Incubación con an icue po secunda io........................................................ 100
4.5.2.1.4 De ección po quimioluminiscencia. ........................................................... 101
4.5.2.2 Cuan i icación de la densidad óp ica de las bandas. ........................................ 101
4.5.3 De ección de ho monas en sue o. .......................................................................... 101
4.5.4 De ección de me aboli os en sue o. ....................................................................... 102
4.5.5 Immunop ecipi ación de PCK1. ............................................................................... 102
4.5.6 Modelado de p o eínas. .......................................................................................... 103
8
4.5.7 Cuan i icación de p o eína po SWATH-MS (Sequen ial Window Acquisi ion o all
Theo e ical Mass Spec a) en expe imen os de pull-down. ................................................... 103
4.5.8 De e minación del si io de nedilación. .................................................................... 104
4.6 Análisis es adís ico. ......................................................................................................... 104
5. RESULTADOS ........................................................................................................................... 107
5.1 La nedilación hepá ica se ac i a du an e la p i ación de nu ien es y es necesa ia pa a
man ene los ni eles de glucosa en sang e. ............................................................................... 107
5.1.1 La nedilación hepá ica es á egulada po la disponibilidad nu icional. ................. 107
5.1.2 La inhibición de la nedilación hepá ica educe la p oducción de glucosa. ............. 110
5.1.3 La inhibición de la nedilación hepá ica educe la p oducción de glucosa de mane a
independien e del sexo. .......................................................................................................... 112
5.1.4 La inhibición de la nedilación hepá ica no modi ica los ni eles de p o eínas de
enzimas gluconeogénicas o ace il-CoA. .................................................................................. 113
5.2 La nedilación hepá ica egula la acción de las ho monas con a egulado as. .............. 116
5.3 La nedilación hepá ica es á asociada con la esis encia a la insulina. ............................ 120
5.3.1 La inhibición de la nedilación educe la hipe glucemia inducida po una die a al a en
g asas. 120
5.3.2 La nedilación hepá ica es á aumen ada en el hígado de pe sonas con diabe es ipo
2. 122
5.4 PCK1 se nedila an e la de iciencia de nu ien es y es a PTM es necesa ia pa a su
ac i idad gluconeogénica. ........................................................................................................... 124
5.4.1 PCK1 aumen a su nedilación en ayuno y en es icción caló ica. ........................... 124
5.4.2 PCK1 es á nedilado en es lisinas después de es icción caló ica y ayuno. .......... 127
5.4.3 La nedilación de PCK1 en sus esiduos K278, K342 y K387 es necesa ia pa a su
ac i idad gluconeogénica in i o. ........................................................................................... 130
5.4.4 La nedilación de PCK1 en sus esiduos K278, K342 y K387 es la esponsable de la
p oducción hepá ica de glucosa in i o. ................................................................................. 134
6. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 138
7. CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 146
8. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................................... 148
ANEXOS ........................................................................................................................................... 165
Ab e ia u as, ac ónimos y anglicismos
15
TAC: ácidos ica boxílicos
TBST: solución salina amponada con is y poliso ba o
TEMED: e ame il-e ilendiamina
TSH: ho mona es imulado a de la i oides
TZD: iazolidinedionas
UBA3: subunidad ac i ado a 3 de la enzima E1
UBE1: enzima ac i ado a de ubiqui ina 1
UBE2F: enzima de conjugación de ubiqui ina E2 F
UBE2M/UBC12: enzima de conjugación de ubiqui ina E2 M
UCHL3: Hid olasa L3 ubiqui ina C- e minal
UFD: dominio pliegue de ubiqui ina
UGT: glucu onil ans e asa
VMN: núcleo en omedial
VLDL: lipop o eína de muy baja densidad
WT: wild ype
XIAP: P o eína Inhibido a de la Apop osis Ligada al C omosoma X
ANGLICISMOS:
Bachg ound: ondo
Bu e : ampón
Enhance : po enciado
Knockdown: educido
Knockou : eliminación, desac i ación
S ipping: desmon ado
Plug: apón

INTRODUCCIÓN
In oducción
17
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Homeos asis glucídica
1.1.1 Regulación de los ni eles de glucosa en sang e.
La concen ación de glucosa en sang e se man iene no malmen e den o de un es echo
ma gen, po lo gene al en o no a 90-100 mg/dl (no moglucemia) y su egulación es un
p oceso c í ico, complejo y coo dinado, ya que se a a de la p incipal uen e de ene gía a
ni el celula . De hecho, los bajos ni eles de glucosa en sang e, o hipoglucemia, ápidamen e
p o oca e en os me abólicos en ó ganos como el ce eb o o el in es ino que necesi an una
uen e con inua de glucosa [1]. Es po ello que el o ganismo necesi a man ene los ni eles de
glucosa cons an es, siendo la inges a de alimen os la p incipal uen e de asimilación de
glucosa en condiciones isiológicas. Sin emba go, una ez concluido el pe íodo pos pand ial,
la p oducción de glucosa se uel e c ucial pa a e i a un descenso en los ni eles de glucosa
en sang e.
1.1.1.1 Es ado abso i o
Los ca bohid a os p o enien es de la die a son dige idos y p ocesados po a ias glucosidasas
en el ac o diges i o, y los monosacá idos esul an es, p incipalmen e glucosa, son
anspo ados a a ios ejidos cons i uyendo la p incipal uen e pa a la gene ación de
adenosín i os a o (ATP). Es e anspo e de glucosa a a és de la pa ed in es inal es
mediado po el anspo ado de glucosa sodio-dependien e (SGLT1), y po el anspo ado
de glucosa-independien e de acili ación de la di usión (GLUT5) en el caso de la uc osa.
Po cada molécula de glucosa, se anspo an al in e io de la célula epi elial dos iones de
sodio, los cuales eg esan a la luz in es inal median e la bomba de sodio y po asio [2]. Cuando
la can idad de glucosa en el lumen in es inal se encuen a en ni eles ele ados po encima de
la sa u ación de SLGT1 y, además, es p olongada en el iempo, un anspo ado
independien e de monosacá idos (GLUT2) del lado con aluminal de la célula epi elial
in es inal se ansloca de la memb ana basal a la apical pa a aumen a la abso ción de glucosa.
Es a en a en onces a la ci culación po la ena po a, que la anspo a al hígado [3].
1.1.1.2 Es ado in e p andial y pos p and ial
Po o o lado, en e comidas o en es ado de ayuno como el ayuno noc u no, el apo e de
glucosa al o en e sanguíneo p o iene en p ime a ins ancia de la lisis del glucógeno
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
18
almacenado en el hígado. Es e, jun o con el músculo, es el p incipal almacén de glucógeno,
y, además, cuando el ayuno se p olonga, es capaz de p oduci glucosa de no o a pa i de
sus a os no glucídicos como el glice ol p o enien e de la lipólisis del ejido adiposo, el
lac a o y algunos aminoácidos (p incipalmen e alanina y glu amina) p oceden es del ejido
muscula esquelé ico. Además, el hígado iene la capacidad de sin e iza cue pos ce ónicos
(β-hid oxibu i a o, ace o-ace a o y ace ona) a pa i de ácidos g asos lib es. Es os pueden se
u ilizados como uen e de ene gía po odos los ejidos y ó ganos, pe o son especialmen e
impo an es pa a el ce eb o, pa a el cual cons i uyen dos e cios de su uen e de u ilización
de ene gía en si uaciones isiológicas, y la única uen e en si uaciones en las que la glucosa
puede escasea , como du an e el ayuno [4].
1.1.2 Diabe es
Como ya se ha mencionado, el man enimien o de la no moglucemia exige una espues a
coo dinada a ni el cen al y pe i é ico. Teniendo en cuen a que la sec eción de insulina y su
acción son p ocesos undamen ales pa a man ene la no moglucemia, de ec os en cualquie a
de los mecanismos in oluc ados en esos p ocesos pueden da luga al desequilib io
me abólico esponsable del desa ollo de la diabe es. Es a pa ología es causada po la
combinación de dos ac o es p incipales: un de ec o en la sec eción de insulina po pa e de
las células β del pánc eas (diabe es ipo 1), y po la incapacidad de los ejidos sensibles a
insulina de esponde co ec amen e a es a ho mona (diabe es ipo 2) [5]. Todo ello iene
como consecuencia que los ni eles de glucosa en sang e se ele en de o ma ano mal y
man enidos en el iempo. En ese sen ido, la cap ación de glucosa es imulada po insulina
(sob e odo en el músculo esquelé ico) es á eno memen e educida en pacien es con diabe es
ipo 2. Además, el concomi an e uso de adioisó opos ha pe mi ido mos a que la p oducción
hepá ica de glucosa no se e su icien emen e inhibida po la insulina, lo cual pone de
mani ies o la p esencia de esis encia a insulina an o hepá ica como pe i é ica [6].
En es adíos iniciales, las células β-panc eá icas pueden compensa el exceso de glucosa en
sang e o hipe glucemia, y la esis encia a insulina, p oduciendo y sec e ando más insulina,
gene ando así hipe insulinemia [7]. Además, el acla amien o de es a ho mona po el hígado
ambién juega un papel undamen al en el desa ollo de la en e medad [8, 9].
In oducción
19
La hipe insulinemia compensa o ia que se gene a pa a con ola la hipe glucemia iene como
e ec o cola e al un aumen o de la lipogénesis hepá ica, hipe lipidemia, y la expansión del
ejido adiposo, debido a su pode lipogénico [10, 11]. Es o a su ez p o oca un aumen o en
el lujo de lípidos a ni el hepá ico, p omo iendo la es ea osis hepá ica, la esis encia a
insulina y un aumen o en la asa gluconeogénica al aumen a el lujo de lípidos en o ma de
ácidos g asos lib es (NEFAs) y glice ol. Es o úl imo, jun o con la esis encia hepá ica a
insulina que hace que es a ho mona sea incapaz de inhibi comple amen e la gluconeogénesis
hepá ica, iene como consecuencia un aumen o en los ni eles de glucosa que empeo a el
pe il glucémico [12]. En ese sen ido, se ha is o que el aumen o de la p oducción hepá ica
de glucosa aumen ada en es ado pos p and ial se debe a ese aumen o en la asa
gluconeogénica y no a una mayo asa de glucogenolisis [13].
A ni el epidemiológico, la diabe es melli us ipo 2 (DMT2) es de una de las pa ologías
médicas más desa ian es del siglo XXI y que a de la mano del p og esi o aumen o de la
p e alencia de la obesidad, con i iéndose ambas en las pandemias de es e siglo [14]. En la
ac ualidad, ap oximadamen e 1 de cada 11 adul os en el mundo su e diabe es, y la
O ganización Mundial de la Salud (OMS) ha ca alogado a es a pa ología como la sép ima
causa de mue e. Pa a 2045 se es ima que hab á 693 millones de pacien es diabé icos en el
mundo, y el cos e de es a pa ología supe a á los 850.000 millones de dóla es po año, y se á
esponsable di ec a de una educción de has a 12 años en la espe anza de ida de los
pacien es, así como la causan e de 5 millones de mue es anuales en odo el mundo [15].
Las causas de la diabe es ipo 2, a di e encia de la diabe es ipo 1 p oducida po un dé ici en
la sín esis de insulina po las células β-panc eá icas y que sí iene un po en e ac o gené ico,
en es e caso son mul i ac o iales e incluyen an o ac o es gené icos, como ambien ales que
a ec an al uncionamien o de las células β-panc eá icas y a la sensibilidad a insulina del
músculo, hígado, ejido adiposo e incluso el p opio pánc eas. Es udios de asociación del
genoma comple o (GWAS, po sus siglas en inglés) encon a on más de 400 genes
elacionados con el desa ollo de es a en e medad, p incipalmen e genes elacionados con la
unción panc eá ica. Sin emba go, el peso de la gené ica es ela i amen e mino i a io y
supone menos del 20% del iesgo de desa olla la en e medad [16, 17]. Po o o lado,
es udios de modi icación de hábi os sos ienen que cambios en el es ilo de ida, como el
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
20
aumen o de la indus ialización e inges a de p oduc os e inados e hipe pala ables, y el
c ecien e seden a ismo de la sociedad, ienen un papel c ucial. Además, se señalan o os
ac o es ambien ales como la con aminación ambien al, las condiciones socioeconómicas y
psicosociales, el abaquismo y la al a de sueño [18]. Asimismo, el es ilo de ida pa en al, la
p og amación in au e ina y al e aciones me abólicas posna ales emp anas pueden
in luencia el iesgo de padece es a en e medad median e al e aciones en la me ilación del
ADN [19-21].
Siguiendo la línea de que la mayo ía de pacien es con diabe es ipo 2 ienen sob epeso y que
la obesidad juega un papel impo an e en su desa ollo, el exceso de g asa abdominal es á
asociado a una mayo libe ación de NEFAs a la sang e, lo cual es imula la gluconeogénesis
hepá ica; educe el acla amien o de insulina y aumen a la sín esis de lipop o eínas de
densidad muy baja (VLDL). A ni el del músculo esquelé ico, los NEFAs p o ocan una
educción en la asa de oxidación de glucosa y una educción en la asa de almacenamien o
de glucosa en o ma de glucógeno (el llamado e ec o Randle) [22]. Todo ello con ibuyendo
a la ele ación de los ni eles de glucosa en sang e y a la hipe glucemia. Nume osos pacien es
obesos que padecen esis encia a insulina poseen ambién el denominado Sínd ome
Me abólico, que asocia la diabe es ipo 2, dislipidemia e hipe ensión a e ial; odos ellos
ac o es ag a an es del iesgo ca dio ascula [23], la p incipal causa de mue e a ni el
mundial según la OMS, y en España, según da os del Ins i u o Nacional de Es adís ica (INE).
Además de que el exceso de ejido adiposo en pacien es con obesidad se elaciona con una
mayo libe ación de NEFAs, ambién se elaciona con la acumulación de lípidos ec ópica,
educiendo la capacidad de los di e en es ó ganos de unciona y esponde co ec amen e.
En ese sen ido, la es ea osis hepá ica es común en es os pacien es y la es ea osis hepá ica no
alcohólica es conside ada aho a como pa e del Sínd ome Me abólico asociada a esis encia
a insulina. Además, los ni eles de iglicé idos in amuscula es se encuen an inc emen ados
en pacien es obesos y se co elaciona con una mayo se e idad de esis encia a insulina a
ni el muscula [24].
El papel de las ho monas con a egulado as en la esis encia a insulina de la diabe es ipo 2
ambién es impo an e en el desa ollo de es a en e medad. Quienes la padecen poseen unos
ni eles de glucagón en sang e ele ados, de mane a que es a ho mona con ibuye a po encia

In oducción
21
la gluconeogénesis y la glucogenolisis, sob e odo en p esencia de una de iciencia de insulina
[21]. Aco de con es o, se ha demos ado que los ni eles ci culan es de glucagón disminuyen
no ablemen e du an e la in usión sis émica de insulina [25], y que el man enimien o de los
ni eles ci culan es de glucagón cons an es du an e dicha in usión sis émica de insulina,
disminuyen la capacidad de es a pa a sup imi la p oducción hepá ica de glucosa [26].
1.1.3 Papel del hígado en la egulación de la homeos asis glucídica
Con odo, la concen ación de glucosa en sang e su e luc uaciones du an e los es ados de
ayuno y alimen ación, y la egulación coo dinada en e la u ilización y la p oducción de
glucosa es c í ica pa a man ene los ni eles de glucosa en sang e cons an es en un ango
isiológico. Una de las p incipales unciones del hígado es man ene esa no moglucemia,
al e ando la asa de libe ación de glucosa (glucogenolisis) y con olando p ocesos de
p oducción de glucosa de no o (gluconeogénesis) [27]. Los hepa oci os cons i uyen uno de
los pocos ipos celula es que ienen la capacidad de consumi y p oduci glucosa. El con ol
no moglucémico, po an o, es esul ado de un equilib io en e es os dos p ocesos.
Pa a lle a a cabo es as acciones isiológicas que man ienen los ni eles de glucosa ci culan es
den o del ango homeos á ico, es necesa ia una es echa coo dinación en e los sis emas de
de ección de los ni eles ci culan es de glucosa (p incipalmen e el sis ema ne ioso cen al,
el hígado, el pánc eas y el ac o gas oin es inal) y el es o de ejidos y ó ganos. Es a
comunicación sis émica se lle a a cabo p incipalmen e po la acción coo dinada de las
p incipales ho monas in oluc adas en la homeos asis de la glucosa, es o es, la insulina y las
ho monas con a egulado as: el glucagón, la ad enalina, los glucoco icoides y la ho mona
de c ecimien o.
1.1.4 Sis emas de de ección de glucosa en sang e
Po odas las azones mencionadas, es esencial que el cue po de ec e los ni eles de glucosa
plasmá ica cons an emen e pa a se capaz de esponde ápida y adecuadamen e cuando los
ecu sos ene gé icos son insu icien es.
1.1.4.1 De ección y con ol de los ni eles de glucemia a ni el cen al
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
22
A ni el cen al, el hipo álamo juega un papel undamen al en la de ección y egulación de los
ni eles de glucosa en sang e median e la coo dinación de la espues a del o ganismo pa a
man ene la homeos asis de la glucosa y asegu a se de que haya su icien e ene gía disponible.
En cuan o a la de ección de los ni eles de glucosa, las neu onas de ec o as de glucosa pueden
clasi ica se en dos ca ego ías: neu onas exci adas po glucosa (GE), que aumen an la
ecuencia de su po encial de acción an e al os ni eles de glucosa; y neu onas inhibidas po
glucosa (GI), que aumen an la ecuencia de su po encial de acción y su po encial de
memb ana en espues a a un descenso de los ni eles de glucosa [28]. Las neu onas de ec o as
de glucosa se encuen an en múl iples egiones del ce eb o, incluyendo el a cua o (ARC), el
núcleo pa a en icula (PVH), el núcleo en omedial (VMH), el núcleo la e al (LH), el
núcleo sup aóp ico, el núcleo del ac o soli a io (NTS) y el á ea pos ema (AP) [29, 30].
En e los núcleos hipo alámicos, el VMH ha sido econocido como uno de los p incipales
luga es de de ección de los ni eles de glucosa y de egulación de la homeos asis glucídica a
ni el sis émico [29, 31].
Ni eles ele ados de glucosa ac i an neu onas GE, p o ocando un e ec o inhibi o io en la
espues a sis émica a la hipoglucemia y ac i ando la espues a a hipe glucemia. Como
esul ado de es a ac i ación, se es imula la libe ación del neu o ansmiso ácido γ-
aminobu í ico (GABA) en el VMN del hipo álamo, y el NTS, o neu opép idos
ano exigénicos en el ARC [32]. Ello iene como esul ado la ac i ación del sis ema ne ioso
au ónomo pa asimpá ico que es imula la libe ación de insulina desde el pánc eas [32, 33].
Po el con a io, cuando los ni eles de glucosa descienden, aumen a la ac i idad de neu onas
GI en el ARC, el PVN, el VMH, y el LH [34]. Esa mayo ac i ación neu onal es á
mayo i a iamen e asociada con la sec eción de los neu o ansmiso es glu ama o y
no ad enalina [35]. En es e apa ado, cabe des aca el papel del núcleo VMH en la espues a
con a egulado a, pues o que se ha desc i o que lesiones del VMH bloquean la espues a
sis émica ho monal a la hipoglucemia, y que la glucop i ación en el VMH aumen a
ápidamen e los ni eles de glucosa en sang e como esul ado de la libe ación de ho monas
con a egulado as (glucagón, ad enalina, y co icos e oides) median e la ac i ación del
sis ema ne ioso simpá ico, dando como esul ado inal la es imulación de la glucogenolisis,
la gluconeogénesis y la libe ación de glucosa, pa a así, en úl ima ins ancia, da como
In oducción
23
esul ado el aumen o de los ni eles de glucosa en sang e [28, 36, 37]. En línea con es o, se
ha is o que la ac i ación de la sec eción de glucagón po hipoglucemia hipe insulinémica
se puede bloquea median e la in usión de glucosa en el VMH, y es a inhibición se puede
p e eni median e la adminis ación en el VMH de un an agonis a del ecep o GABAA
(GABAAR), lo que indica que la sec eción de GABA inducida po glucosa en el VMH
bloquea la espues a con a egulado a [38].
El sis ema ne ioso cen al ambién a ec a a la homeos asis glucídica sis émica median e
ine aciones del sis ema ne ioso simpá ico y pa asimpá ico. Las ib as e e en es simpá icas
en los islo es panc eá icos libe an no ad enalina pa a es imula la libe ación de la sec eción
de glucagón median e la unión a ecep o es α-ad ené gicos en las células α; e inhiben la
sec eción de insulina median e la ac i ación de ecep o es β-ad ené gicos de las células β.
Po el con a io, las ib as pa asimpá icas en ían inpu s coliné gicos a los islo es panc eá icos
pa a inhibi la sec eción de glucagón en las células α, así como aumen a la sec eción de
insulina median e la libe ación de ace ilcolina que se une a ecep o es musca ínicos en las
células β [29]. Además de la acción en los islo es panc eá icos, el ce eb o ambién modula la
libe ación de ad enalina desde la médula ad enal. Po úl imo, desde el eje hipo álamo-
hipo isa io, la adenohipó isis libe a ho monas hipo isa ias, en e ellas la ho mona
ad enoco icó opa (ACTH) con el in de es imula la p oducción de glucoco icoides en la
médula sup a enal; y la libe ación de GH po la adenohipó isis como consecuencia de
cambios en la libe ación hipo alámica de la ho mona libe ado a de GH (GHRH) y de la
soma os a ina (SST) [39, 40].
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
24
Figu a 1. Rep esen ación esquemá ica del con ol me abólico a ni el cen al. Imagen de elabo ación p opia con
Bio ende .
1.1.4.2 De ección de los ni eles de glucemia po el hígado
Cuando los ni eles de glucemia son al os, los senso es hepá icos inducen una espues a
adap a i a pa a di igi el me abolismo glucídico hacia el consumo y almacenamien o de
glucosa. En el hígado se exp esan 5 ipos de anspo ado es GLUT (GLUT 1, GLUT 2,
GLUT 5, GLUT 8 y GLUT 9) [41]. Sin emba go, GLUT2 es el p incipal anspo ado de
memb ana que pe mi e a la glucosa en a en los hepa oci os [42]. En los hepa oci os, GLUT2
con ola la mayo pa e de la cap ación de glucosa dependiendo de los ni eles de glucosa
ci culan e en el o en e sanguíneo. Sin emba go, su ac i idad no pa ece se c í ica pa a la
de ección de los ni eles de glucosa pos p and ial, ya que se ha is o que la de iciencia de
GLUT2 en el hígado de a ones no al e a la sec eción de insulina es imulada po glucosa en
las células β-panc eá icas [43].
In oducción
31
Po úl imo, la ad enalina a ec a a la homeos asis glucídica no solo po sus e ec os en el hígado
y ejidos pe i é icos, sino ambién po al e a la sec eción a insulina. Se ha desc i o que la
adminis ación in a enosa de ad enalina p o oca in ole ancia a glucosa al al e a la
sensibilidad a insulina hepá ica y pe i é ica. Con ello, la ad enalina inhibe la libe ación de
insulina desde las células β-panc eá icas a a és de ecep o es α2-ad ené gico, y con ello la
cap ación de glucosa po los ejidos pe i é icos, con el in de man ene la glucosa lib e en la
sang e [48, 49]. De hecho, se ha is o que los ni eles de ad enalina y no ad enalina es án
ele ados en pacien es diabé icos ipo 1 en el momen o de su diagnós ico, y sus ni eles se
ees ablecen a ni eles basales as el a amien o con insulina [76].
Con odo, la unión de la ad enalina a cualquie a de sus ecep o es iene como esul ado la
ele ación de los ni eles in acelula es de AMPc, que ac i a a PKA, la cual os o ila a
di e en es p o eínas eniendo como consecuencia inal un aumen o de los ni eles de glucosa
en sang e y la disponibilidad de sus a os que si en como uen e de ene gía pa a supli una
mayo demanda ene gé ica como lo es el eje cicio, o una espues a de lucha o huida [77].
1.1.5.1.3 Glucoco icoides
Los glucoco icoides son ho monas es e oideas sec e adas po la co eza de las glándulas
sup a enales, y son las enca gadas, jun o con la ho mona de c ecimien o, de la espues a
len a a la hipoglucemia, cuando el es ímulo del ayuno es pe sis en e en el iempo. En
mamí e os, es os glucoco icoides son el co isol, la co isona y la co icos e ona, aunque el
co isol es la o ma biológicamen e ac i a en humanos y la co icos e ona en oedo es.
Aunque siemp e se ha conside ado al glucagón como la ho mona con más pode induc o de
la gluconeogénesis du an e el ayuno, a ones ad enalec omizados p esen an una capacidad
gluconeogénica meno en si uaciones de ayuno, un e ec o que es es au ado as la
adminis ación de glucoco icoides [78, 79].
Es e conjun o de ho monas omen an la acción del glucagón, ya que ienen la capacidad de
es imula di ec amen e la p oducción endógena de glucosa en el hígado [10, 80], pe o
ambién p omue en el almacenamien o de glucógeno o glucogenogénesis en es e ó gano,
es imulando la ac i idad de la glucógeno sin asa (GS). Indi ec amen e, los glucoco icoides
ambién p o een de p ecu so es gluconeogénicos p omo iendo la deg adación de p o eínas

UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
32
en el músculo esquelé ico pa a gene a aminoácidos [81], y p omo iendo la lipólisis en el
ejido adiposo blanco, libe ando glice ol y ácidos g asos [82].
Po o o lado, en el ejido adiposo blanco y en el músculo esquelé ico, disminuyen la
u ilización de glucosa an agonizando la acción de la insulina [83]. Todos es os e ec os ienen
como in ele a los ni eles de glucosa ci culan es pa a es a disponibles en si uaciones de
es és, pe o una exposición c ónica ienen un e ec o con ap oducen e, causando
hipe glucemia y esis encia a insulina [84, 85]. Con a iamen e, al e aciones en la ía de
señalización de los glucoco icoides desembocan en una mejo a en la sensibilidad a insulina
y en la u ilización de glucosa en músculo esquelé ico, en modelos de a ón y humano.
Cohe en emen e, los ni eles de glucoco icoides es án ele ados en la sang e de a ones ob/ob
y db/db compa ado con a ones wild ype (WT), de mane a que es os a ones son esis en es
a insulina [86, 87]. De hecho, ensayos de clamp euglicémico-hipe insulinémico han
demos ado que los glucoco icoides disminuyen la asa de in usión de glucosa necesa ia pa a
man ene la no moglucemia, p e ienen la inhibición po la insulina de la p oducción
endógena hepá ica de glucosa, e inhiben la u ilización de glucosa en el músculo esquelé ico
[88].
Po o o lado, los glucoco icoides egulan la libe ación de glucagón e insulina desde el
pánc eas, aumen ando los ni eles de glucagón [85], e induciendo la hipe plasia de los islo es
panc eá icos, lo cual da luga a hipe insulinemia [89].
A ni el molecula , su ecep o , GR o NR3C1a, eside en el ci oplasma unido a chape onas
Hsp90 has a que su ligando, los glucoco icoides, se unen al ecep o . En onces, se ansloca
al núcleo, donde se une a elemen os espues a de glucoco icoides (GREs) pa a p omo e la
ansc ipción de genes especí icos.
1.1.5.1.4 Ho mona de c ecimien o y gh elina
La ho mona de c ecimien o, GH, ambién conocida como soma o opina, es una ho mona
pep ídica de 191 aminoácidos sec e ado po la hipó isis con un i mo ci cadiano que da luga
a la sec eción de más de la mi ad de la sec eción o al du an e la noche y que es
desencadenada po la ase de ondas len as del sueño [90]. Es a ho mona aumen a
di ec amen e la p oducción de glucosa po el hígado al aumen a la disponibilidad de
In oducción
33
sus a os (como lac a o, glice ol y aminoácidos) y ac i a enzimas cla e in oluc adas en es e
p oceso. Po o o lado, la GH inhibe la cap ación de glucosa po los ejidos pe i é icos como
el ejido muscula y el ejido adiposo, de mane a que la sensibilidad a insulina de los ejidos
pe i é icos disminuye desde las 2 has a las 12 h as la adminis ación ansi o ia de es a
ho mona. En línea con es o, pacien es con ac omegalia y, po an o, al os ni eles ci culan es
de es a ho mona, p esen an in ole ancia a glucosa y una mayo esis encia a insulina [91].
Po o o lado, en con as e con el glucagón y la ad enalina, los cuales inhiben la acción de la
insulina, el e ec o inhibi o io de la GH sob e la insulina a da a ias ho as en desa olla se
[92].
A ni el molecula , la GH se une a su ecep o , GHR, en la supe icie de sus células diana,
en e las que se incluyen los hepa oci os y los adipoci os. Es a unión ac i a una cascada de
señalización in acelula que in oluc a las quinasas Janus (JAK) y los ac o es de
ansc ipción de ansduc o es de señal y ac i ado es de ansc ipción (STAT). Las p o eínas
JAK ac i adas se au o os o ilan en esiduos de i osina en el dominio ci oplasmá ico del
ecep o , y las p o eínas STAT se unen al ecep o os o ilado. Las quinasas JAK os o ilan
a las p o eínas STAT en esiduos de i osina y en onces se dime izan y se anslocan al núcleo
de la célula. Den o del núcleo, los díme os STAT se unen a los elemen os de espues a de
genes diana pa a es imula su ansc ipción [93]. Es o esul a en la sín esis de p o eínas
in oluc adas en el c ecimien o y desa ollo celula , en la es imulación de la libe ación de
ácidos g asos desde el ejido adiposo, y en el aumen o de la sín esis de glucógeno y la
gluconeogénesis en el hígado. Finalmen e, la señalización de la GH es egulada po
e oalimen ación nega i a y es á in luenciada po o as ho monas, como la insulina y el
ac o de c ecimien o simila a la insulina ipo 1 (IGF-1).
Además del e ec o eje cido po la GH, es udios ecien es han pues o de mani ies o que
algunos e ec os de la GH pueden se mime izados po la gh elina, un sec e agogo de la GH.
La gh elina es una ho mona sec e ada po el es ómago du an e el ayuno que inc emen a el
ape i o y la inges a de alimen os, y que es imula la sec eción de GH po la hipó isis. Aunque
el papel de la gh elina en la gluconeogénesis hepá ica no es an di ec o como el de o as
ho monas con a egulado as, la gh elina puede in lui en la egulación de la homeos asis
glucídica median e mecanismos indi ec os, dado que la es imulación del ape i o y la inges a
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
34
de alimen os aumen a la disponibilidad de sus a os me abólicos. También egula la acción
de ho monas con a egulado as como la GH y el glucagón, y algunas publicaciones ecien es
sugie en que la gh elina puede educi la sensibilidad a insulina, lo cual a ec a a la cap ación
de glucosa po los ejidos y aumen a la p oducción de glucosa po el hígado [94, 95].
Des aca , asimismo, que la gh elina es sin e izada en el pánc eas endoc ino po las células ε
[96].
Po úl imo, des aca que an o la GH como la gh elina juegan un papel especialmen e
ele an e en elación a la p e ención de la hipoglucemia en ayuno en animales some idos a
es icción caló ica pa cial (60%). La adap ación al ayuno en es as condiciones es á mediada
po un ma cado aumen o de la GH plasmá ica, que es p o ocado a su ez po un aumen o de
la gh elina plasmá ica. De es a mane a, la ins au ación de la hipoglucemia es e asada de
o ma muy ma cada po la adminis ación an o de gh elina como de GH, indicando que el
e ec o es mediado po GH. Además, se ha is o que a ones con silenciamien o hepá ico del
ecep o de GH exhiben una ma cada hipoglucemia debido a una disminución de la
p oducción de glucosa po el hígado, y una caída de iacilglicé idos hepá icos [97]. Sin
emba go, en humanos, el e ec o de la gh elina no es á an cla o, debido al e ec o sup eso de
la insulina sob e la gh elina con o sin hipoglucemia [30, 98].
1.1.5.2 Adap aciones me abólicas a la hipe glucemia.
1.1.5.2.1 Insulina
Descubie a en 1921 po Ban ing y Bes , la insulina es una ho mona sec e ada po las células
β del pánc eas an e el aumen o de los ni eles de glucosa en sang e pa a disminui sus ni eles
y de ol e los al es ado no moglucémico.
Es a ho mona se sin e iza a pa i de un pép ido p ecu so llamado p ep oinsulina que
con iene es segmen os: el pép ido señal, la cadena A de insulina y la cadena B de insulina.
La p ep oinsulina es di igida al e ículo endoplasmá ico, donde el pép ido señal se escinde,
dando luga a la p oinsulina. Es a cons a de dos cadenas pep ídicas, A y B, unidas po una
egión llamada pép ido C, y se almacena en g ánulos de sec eción en el ci oplasma de las
células β. An es de su libe ación a la sang e, la p oinsulina se con ie e en insulina median e
la eliminación del pép ido C [99].
In oducción
35
En es ado pos pand ial, la sec eción de insulina iene luga en dos ases: una inicial ápida,
de insulina p e iamen e sin e izada y almacenada en esícula ci oplasmá icas de las células
β, y una ase a día donde la insulina es sin e izada de no o y que iene luga si los ni eles de
glucosa ci culan es pe manecen ele ados en el iempo [100]. Aunque la glucosa es el mayo
es ímulo de sec eción de insulina, los ni eles ci culan es de aminoácidos (especialmen e
a ginina, leucina y lisina), la acción de las ho monas gas oin es inales con e ec o inc e ina
como GLP-1 y GIP, y la es imulación po el sis ema ne ioso simpá ico a a és del ne io
ago ambién ienen un e ec o en su sín esis y libe ación [101].
La p incipal unción de la insulina es egula el me abolismo glucídico, p incipal y
di ec amen e median e la inhibición de la gluconeogénesis hepá ica, y secunda ia e
indi ec amen e ac uando en el pánc eas, el ce eb o, el músculo y el ejido adiposo [102].
En p ime luga , la insulina inhibe di ec amen e la gluconeogénesis al a ec a a la
ansc ipción de genes in oluc ados en el con ol gluconeogénico, como lo son PCK1 y
G6Pasa [103], p incipalmen e median e la ac i ación de la quinasa AKT, la cual os o ila e
inac i a al ac o de ansc ipción p o eína Fo khead Box O1 (FoxO1) y a su coac i ado
PGC-1α [104]. En condiciones de es és celula , FoxO1 es ac i ado po desace ilasas como
la si uina 1 (SIRT1) y se une a los elemen os espues a de los genes diana gluconeogénicos
[105, 106]. Al inhibi la ac i idad de FOXO1, la insulina educe la exp esión de genes que
p omue en la gluconeogénesis [107, 108]. De mane a aco de con es o, a ones con una
deleción de FOXO1 especí icamen e en el hígado mues an ni eles de glucosa en ayuno más
bajos, mien as que cuando se exp esa cons i u i amen e, los ni eles de glucosa en ayuno
aumen an [109, 110].
Además de inhibi di ec amen e la p oducción de glucosa, la insulina ambién egula la
homeos asis glucídica a a és de mecanismos indi ec os. En p ime luga , median e la
inhibición de la sec eción de glucagón po las células α del pánc eas, lo cual indi ec amen e
conlle a la educción de la p oducción hepá ica de glucosa al educi la señalización del
glucagón en el hígado [111, 112]. En segundo luga , median e la educción de sus a os
gluconeogénicos libe ados desde el ejido adiposo y el músculo esquelé ico. Es o lo hace
median e la inhibición de la lipólisis (po an o impidiendo la desin eg ación de los
iglicé idos en ácidos g asos lib es y glice ol) y la p o eólisis (impidiendo la libe ación de
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
36
aminoácidos al o en e sanguíneo) en el ejido adiposo o en el músculo esquelé ico,
espec i amen e. Con ello, se ha is o que una educción de los ni eles de ácidos g asos lib es
en la sang e p o oca una meno p oducción de glucosa po pa e del hígado [113]. O o modo
median e el cual la insulina educe la disponibilidad de sus a os gluconeogénicos en
ci culación en la sang e es aumen ando la cap ación de glucosa po los ejidos pe i é icos
[114, 115], p omo iendo el almacenamien o de iacilglicé icos (TAGs) en los adipoci os
(lipogénesis) median e la disminución de la ac i idad de la HSL y la inducción de enzimas
lipogénicas; y el almacenamien o de glucosa en o ma de glucógeno en el hígado y en el
músculo esquelé ico, po an o es imulando la glucogenogénesis [10]. Es a acción la ealiza
median e la es imulación de la enzima GS, cla e pa a la sín esis de glucógeno, y median e
inhibición de la ac i idad de la GP, enzima esponsable de la desin eg ación del glucógeno,
po an o e i ando la libe ación de glucosa [1, 116].
A ni el molecula , la ía de señalización de insulina se ac i a cuando es a se une a su
ecep o , IR, en la supe icie de la memb ana celula . Se a a de un ecep o que es una
p o eína ansmemb ana con ac i idad i osina quinasa que se ac i a al uni se el ligando. Es a
ac i ación esul a en la os o ilación de esiduos de i osina en el p opio ecep o de insulina.
Los sus a os del ecep o de insulina (IRS) son p o eínas adap ado as que se os o ilan en
esiduos de i osina en espues a a la ac i ación del ecep o , y su os o ilación p opo ciona
si ios de unión pa a o as p o eínas señalizado as, como la p o eína os a idilinosi ol 3-
quinasa (PI3K), que con ie e el os a idilinosi ol 4,5-bi os a o (PIP2) en os a idilinosi ol
2,4,5- i os a o (PIP3). Es e úl imo pe mi e que la p o eína quinasa-1 dependien e de la
p o eína quinasa 1 de la pi u a o deshid ogenasa (PDK1) se una y os o ile a la p o eína
quinasa dependien e de p o eína quinasa B (PKB/AKT), ac i ándola y pe mi iendo su
anslocación del ci oplasma al núcleo [117, 118]. AKT ac i ado puede os o ila y modula
la ac i idad de a ios ac o es de ansc ipción como FOXO1 que, en asociación con el
coac i ado 1-al a del ecep o gamma ac i ado po p oli e ado de pe oxisomas (PGC1α),
p omue e la ansc ipción de G6Pasa y PCK1. AKT ambién inhibe la glucogenolisis y
p omue e la glucogenogénesis median e la ac i ación de GK y la os o ilación e inac i ación
de GSK3 [119].

In oducción
37
Además de la ía PI3K-AKT, la insulina puede ac i a la ía de la p o eína quinasa po
mi ógenos (MAPK), que es á implicada en la p oli e ación celula y la di e enciación, y la
ía de señalización de mTOR (obje o de la apamicina en mamí e os). En el caso de la ía
de las MAPK, la unión de la insulina a su ecep o p o oca la os o ilación del mismo en
luga es que si en de si ios de unión pa a p o eínas adap ado as como SHC que eclu an
p o eínas como GRB2 ( ac o de unión a Son o Se enless homólogo 1). GRB2 se asocia con
SOS (Son o Se enless), dando luga a la ac i ación de RAS. La ac i ación de RAS ac i a la
cascada de quinasas RAF, MEK (MAP quinasa ac i ada po mi ógenos) y ERK (quinasa
egulada po señales ex acelula es). ERK ac i ada se ansloca al núcleo, donde os o ila
ac o es de ansc ipción y modula la exp esión de genes implicados en ías de p oli e ación
celula , di e enciación, y o os p ocesos celula es [117, 118].
Es impo an e señala que la unción de AKT en el núcleo es solo una pequeña pa e de su
unción en la célula, ya que su ac i idad en o as pa es de la célula como el ci oplasma o la
memb ana plasmá ica, donde aumen a la anslocación de anspo ado es de glucosa (como
GLUT4), es esencial pa a lle a a cabo sus di e sas unciones en la egulación del
me abolismo y el c ecimien o o supe i encia celula .
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
38
Figu a 4. Rep esen ación esquemá ica de la ía de señalización de la insulina. Imagen de elabo ación p opia con
Bio ende .
La egulación de la ía de señalización de insulina es á al amen e egulada y coo dinada, y
su dis unción puede con ibui a as o nos me abólicos como la esis encia a insulina y la
diabe es ipo 2.
Po o o lado, como ya se ha mencionado an e io men e en es a sección, pese a que la insulina
es la p incipal ho mona enca gada de disminui los ni eles ci culan es de glucosa, su acción
se e e o zada con la ac uación de o as ho monas impo an es como son la amilina y las
inc e inas.
1.1.5.2.2 Amilina
La amilina, ambién conocida como polipép ido amiloide ipo 1, es una ho mona pep ídica
que se p oduce y sec e a jun o con la insulina (en una a io 20:1 insulina-amilina) en las
In oducción
39
células β-panc eá icas. Es a ho mona es sin e izada a pa i del mismo p ecu so de la
insulina: la p oinsulina.
Una ez libe ada en el o en e sanguíneo, la amilina abaja en coo dinación con la insulina
pa a man ene la homeos asis glucémica, p incipalmen e de dos mane as: alen izando la
elocidad de aciado gás ico, en especial los ca bohid a os, pa a e i a picos de glucemia
as las comidas, e inhibiendo la libe ación de glucagón. Además, se ha desc i o que la
amilina ienen un papel en el con ol de la inges a y peso co po al, educiéndolos [101, 120].
1.1.5.2.3 Inc e inas
El é mino inc e inas se e ie e al pode de cie as moléculas de es imula o inc emen a la
sec eción de insulina en espues a a la inges a de alimen os. Es e e ec o ue desc i o po
p ime a ez en 1967, po Pe ley y Kipnis, cuando obse a on que la inges a de alimen os
p oducía un aumen o de insulina supe io al de la in usión di ec a de glucosa in a enosa
[121]. Pa a pone de ele ancia la con ibución de las inc e inas, señala que es as
con ibuyen en un 50% al o al de insulina sec e ada después de una comida [122].
Los dos pép idos más impo an es y es udiados en el con ex o de la homeos asis de la glucosa
son los pép idos in es inales GLP-1 y GIP.
GIP
El polipép ido inhibido gás ico (GIP, po sus siglas en inglés), ambién conocido como
polipép ido insulino ópico dependien e de glucosa, ue la p ime a inc e ina desc i a, en 1971
po B own y D ybu gh, y es sin e izada en las células K del in es ino delgado, p incipalmen e
en el duodeno y el yeyuno, en espues a a la inges a de alimen os, especialmen e
ca bohid a os y g asas [123].
Una de las p incipales acciones del GIP es es imula la sec eción de insulina (e ec o
insulino ópico) an e el aumen o de los ni eles de glucosa, median e la unión a su ecep o
(GIPR) localizado en las células β-panc eá icas. Además de es imula la sec eción de
insulina, el GIP puede ene un e ec o di ec o sob e la cap ación de glucosa en ejidos
pe i é icos, como el músculo y el ejido adiposo, ayudando así a disminui los ni eles de
glucosa en sang e; y en la egulación de la sec eción de ácido gás ico en el es ómago, lo que
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
40
puede ene implicaciones en la diges ión y abso ción de nu ien es, y azón po la cual GIP
debe su nomb e. Además de sus e ec os en el me abolismo glucídico, GIP ambién iene un
papel impo an e en el me abolismo lipídico, a o eciendo la lipogénesis al es imula la
sín esis de iglicé idos y educiendo la lipólisis en el ejido adiposo. Finalmen e, GIP es
deg adado po la dipep idil pep idasa-4 (DPP4) [122].
En esumen, el GIP es una ho mona inc e ina que juega un papel impo an e en la egulación
de la glucemia al es imula la sec eción de insulina y, posiblemen e, al acili a la cap ación
de glucosa en los ejidos. Sin emba go, a di e encia del GLP-1, el GIP no iene un e ec o
cla o en la inhibición de la libe ación de glucagón. Ambas ho monas inc e inas, jun o con
o os ac o es, con ibuyen al con ol de los ni eles de glucosa en sang e en espues a a la
inges a de alimen os.
GLP-1
Ca o ce años más a de, en 1985, Schmid y colabo ado es desc ibie on el Pép ido 1 Simila
al Glucagón (GLP-1, po sus siglas en inglés), una ho mona sec e ada p incipalmen e po las
células L del in es ino delgado en espues a a la inges a de alimen os. El GLP-1 iene un
papel undamen al en la egulación de la glucemia a a és de a ios mecanismos: en p ime
luga , median e la es imulación de la sec eción de insulina po pa e de las células β an e un
es ímulo de aumen o en los ni eles de glucosa en sang e [124]. Es e e ec o insulino ópico
se alcanza median e la unión de GLP-1 a su ecep o especí ico (GLP-1R), que es á acoplado
al aumen o de los ni eles in acelula es de AMPc y Ca2+ en las células β [122]. En segundo
luga , median e la inhibición de la sec eción de glucagón po pa e de las células α-
panc eá icas, con ibuyendo así a que los ni eles de glucemia no se dispa en y
man eniéndolos en un ango no moglucémico [125]. Además de eso, GLP-1 iene un papel
alen izando el aciado gás ico, disminuyendo la inges a [126], y alen izando la asa de
p oducción de glucosa endógena [127]. Al igual que GIP, GLP-1 es suscep ible a la
deg adación enzimá ica po la DPP-4, la cual lo con ie e en una o ma biológicamen e
inac i a.
In oducción
47
Figu a 6. Rep esen ación esquemá ica de la egulación de la glucólisis. Las lechas ojas indican inhibición, mien as
que las lechas e des indican ac i ación. Imagen de elabo ación p opia con Bio ende .
1.1.6.2 Almacenamien o de glucosa en el hígado: glucogenogénesis
Como se mencionó an e io men e, la G6P puede des ia se hacia la sín esis de glucógeno, el
cual supone un almacén de glucosa impo an e en es ado de ayuno. El exceso de glucosa
p o enien e de la die a que no se almacena como glucógeno se con ie e en g asa median e
lipogénesis de no o en el hígado [145].

UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
48
A ni el molecula , la G6P es isome izada en glucosa 1- os a o (G1P) po la enzima
os oglucomu asa (PGM-1), y en onces es con e ida po la enzima glucu onil ans e asa
(UGT) en UDP-glucosa, que es el p ecu so del glucógeno. La glucogenina (GYG1/2) inicia
la sín esis de glucógeno po au oglucosilación, anspo ando esiduos de glucosa desde la
UDP-glucosa hacia sí misma, o mando una cadena co a linea de ap oximadamen e 10-20
esiduos de glucosa. La GS es la enzima más impo an e en es e p oceso, ya que pe mi e la
elongación de las cadenas de glucógeno, ca alizando la ans e encia del esiduo de glucosa
de la UDP-glucosa al ex emo no educ o de la cadena de glucógeno p eexis en e, median e
un enlace α1-4 glucosídico [139].
1.1.6.2.1 Regulación de la glucogenogénesis
La ac i ación de la GS, enzima cla e de la glucogenogénesis, y la inhibición de la GP, la
enzima cla e de la glucogenolisis, son los dos p ocesos cla e que egulan la o mación de
glucógeno. Las dos son alos é icamen e eguladas po G6P, el p ecu so del glucógeno, de
mane a que la G6P ac i a alos é icamen e a la GS, mien as que inhibe la GP [134, 135].
La ac i idad de ambas enzimas es ambién egulada po modi icaciones pos aduccionales.
La os o ilación de la GS, p incipalmen e po la enzima glucógeno sin asa quinasa 3 (GSK-
3), inhibe la ac i idad de la enzima. En con as e, la os o ilación de la GP aumen a su
ac i idad. Tan o la GS como la GP son suscep ibles de des os o ilación po la p o eína
os a asa 1 (PP1). Se ha is o que an o la glucosa como la insulina aumen an la ac i idad de
PP1, mien as que el glucagón y la epine ina han sido elacionados con su inac i ación
[133].
Con odo, en condiciones de ayuno, la GSK-3 des os o ilada y ac i a, os o ila e inac i a a
la GS, lle ando a la inhibición de la sín esis de glucógeno hepá ico. Sin emba go, en es ado
pos pand ial, la insulina sec e ada po las células β-panc eá icas es imula la GS median e la
ac i ación de AKT, que os o ila e inac i a a GSK-3, po an o, aumen ando la sín esis de
glucógeno. Además, la insulina ambién es imula la ace ilación de la GP, lo cual p omue e
su des os o ilación e inhibición po la PP1, inhibiendo así la glucogenolisis [146]; y es imula
la exp esión de la GK, lo cual indi ec amen e aumen a la cap ación de glucosa po los
hepa oci os al aumen a la os o ilación de la glucosa y gene a G6P [147]. Po an o, de
mane a indi ec a, es imula la glucogenogénesis al aumen a los ni eles de G6P.
In oducción
49
Po o o lado, la sec eción de glucagón y ca ecolaminas (ad enalina y no ad enalina), ac i an
a PKA median e el aumen o de los ni eles in acelula es de AMPc. PKA os o ila y ac i a
en onces la GP. El glucagón ambién inhibe la ace ilación de la GP, lo cual disminuye la
habilidad de la PP1 de uni se a la GP, y po an o disminuye su capacidad de des os o ilación
e inac i ación de es a enzima [146].
Figu a 7. Rep esen ación esquemá ica de la egulación de la glucogenogénesis y glucogenolisis. Imagen de
elabo ación p opia con Bio ende .
1.1.6.3 P oducción endógena de glucosa
Du an e el es ado de ayuno, la combinación de al os ni eles de glucagón y bajos ni eles de
insulina inc emen a la p oducción hepá ica de glucosa pa a esponde a las demandas
ene gé icas de los ejidos pe i é icos. El hígado con ibuye a la p oducción endógena de
glucosa median e dos ías de p oducción de G6P. En la ase pos abso i a inicial, es deci ,
du an e pe íodos co os de ayuno, la G6P hepá ica de i a de la lisis del glucógeno
(glucogenolisis). Sin emba go, a medida que el ayuno se p olonga en el iempo, los depósi os
de glucógeno se an ago ando, y en onces la G6P p o iene de la sín esis de no o
(gluconeogénesis). Se conside a que los depósi os de glucógeno con ibuyen a la p oducción
endógena de glucosa du an e 10-12h en oedo es y 20h en humanos.
1.1.6.3.1 Glucogenolisis
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
50
La deg adación de glucógeno en el ci osol de los hepa oci os se lle a a cabo po la acción de
dos enzimas: la GP y la enzima des ami icado a de glucógeno (AGL). La GP libe a glucosa-
1- os a o de la cadena lineal de glucógeno, mien as que la AGL sepa a o des ami ica las
di e en es cadenas de glucógeno.
Regulación de la glucogenolisis
La GP es ac i a cuando es os o ilada en el esiduo de se ina 14. El glucagón y la ad enalina,
que inc emen an los ni eles in acelula es de AMPc, p omue en la ac i ación de la PKA,
que os o ila y ac i a a GP, desencadenando de es e modo la glucogenolisis. La AGL es la
enzima enca gada de la des ami icación del glucógeno, es deci , la enzima enca gada de
elimina las ami icaciones de una cadena de glucógeno, con i iendo las amas en cadenas
lineales, lo que acili a su pos e io deg adación y libe ación de glucosa. La egulación de la
AGL se e a ec ada po la PKA ac i ada as la unión del glucagón a su ecep o , de mane a
que PKA os o ila y ac i a la AGL. La de iciencia congéni a de la GP causa la en e medad
de He s, que se ca ac e iza po la incapacidad de mo iliza glucosa a pa i del glucógeno en
espues a a ayuno o a glucagón [148], mien as que la de iciencia de la AGL p o oca la
en e medad de Co i-Fo bes, que se ca ac e iza po la acumulación excesi a de glucógeno en
los ejidos a ec ados, en e ellos el hígado, el co azón y el músculo esquelé ico [149].
El esul ado inal de la glucogenolisis es la libe ación de glucosa-1 os a o a pa i del
glucógeno almacenado. Es a se con ie e en glucosa-6 os a o, que luego se hid oliza en
glucosa y Pi median e la enzima glucosa-6- os a asa (G6Pasa). En es e pun o, hay que señala
que el almacenamien o de glucógeno es una especi icidad del hígado en e los ó ganos
gluconeogénicos, ya que el iñón y el in es ino delgado son incapaces de ealiza la sín esis
de glucógeno en condiciones isiológicas [150]. Además, aunque el ejido muscula sí enga
la capacidad de sin e iza glucógeno, la glucosa libe ada as la glucogenolisis no puede se
libe ada a la ci culación y po an o se u ilizada po o os ejidos, ya que el músculo no posee
la G6Pasa que des os o ila la G6P. Po an o, la G6P queda e enida en el ejido muscula y
solo puede se de i ada hacia glucólisis pa a así ob ene ene gía pa a su p opio
uncionamien o [151].
In oducción
51
Figu a 8. Rep esen ación esquemá ica de glucogenolisis y sus enzimas implicadas. Imagen de elabo ación p opia con
Bio ende .
Ciclo de Co i
Debido a que el músculo no posee la enzima G6Pasa que pe mi a la libe ación de la glucosa
al o en e sanguíneo, en condiciones donde el eque imien o de glucosa po pa e del
músculo (po ejemplo, du an e un eje cicio de al a in ensidad) sea al o, exis e el denominado
Ciclo de Co i. Es e consis e en la ci culación cíclica de glucosa y lac a o en e el hígado y el
músculo. En es as condiciones de al a in ensidad, el glucógeno muscula se desdobla a
glucosa y, median e glucólisis anae obia ( e men ación), la enzima lac a o deshid ogenasa
con ie e el pi u a o en lac a o. El lac a o iaja has a el hígado a a és del sis ema
ci cula o io, y ahí se con ie e de nue o en glucosa a a és de la gluconeogénesis. Es a
glucosa e o na a la ci culación y es lle ada de nue o al músculo. De es a mane a, la célula
muscula ob iene ATP de mane a inmedia a pese a las condiciones de baja disponibilidad de
oxígeno, e i ando la acidosis lác ica, y se egene a el NAD+ pa a que pueda con inua la
glucólisis.
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
52
Figu a 9. Rep esen ación esquemá ica del ciclo de Co i en e el hígado y el músculo. Imagen de elabo ación p opia
con Bio ende .
1.1.6.3.2 Gluconeogénesis
Si el ayuno se p olonga en el iempo, los depósi os de glucógeno se ago an y la sín esis de
glucosa de no o a pa i de p ecu so es no glucídicos se con ie e en el p incipal mecanismo
pa a man ene la euglucemia. Es e p oceso, conocido como gluconeogénesis, es el
mecanismo más impo an e de p oducción hepá ica de glucosa, ya que pe mi e un apo e
con inuo de glucosa a los ejidos pe i é icos cuando las ese as de glucógeno se han ago ado
y el ayuno pe sis e o cuando la demanda ene gé ica es muy al a. Tan solo exis en o os dos
ó ganos, aunque con una con ibución mucho meno que el hígado, que puedan lle a a cabo
es a unción: el in es ino y el iñón. Los es ó ganos poseen es a capacidad debido a que son
los únicos ó ganos que exp esan la enzima G6Pasa capaz de hid oliza la G6P y libe a la al
o en e sanguíneo [152, 153].
La gluconeogénesis cons i uye la u a casi opues a a la glucólisis, compa iendo ambos
p ocesos sie e eacciones enzimá icas, pues o que son e e sibles. Tan solo di ie en en cua o
enzimas, que son las que cons i uyen los pun os de con ol de la gluconeogénesis: la PDH, la
G6Pasa, la uc osa 1,6-bi os a asa (FBPasa1), la PC, y la os oenolpi u a o ca boxiquinasa
(PEPCK o PCK) [133]. La de iciencia congéni a de cualquie a de es as enzimas da luga a
in ole ancia al ayuno con hipoglucemia ce ónica y acidosis lác ica [154].

In oducción
53
La gluconeogénesis comienza con la con e sión de pi u a o en oxalace a o po la enzima PC
en la mi ocond ia, y e mina con la con e sión en glucosa as a ias eacciones enzimá icas
en el ci osol. Inicialmen e, PC ca aliza la ca boxilación del pi u a o pa a o ma oxalace a o,
que ing esa en el Ciclo de K ebs. Es a eacción, además de se necesa ia pa a la sín esis de
no o de la glucosa, es un p oceso anaple ó ico muy impo an e, que pe mi e epone los
ni eles de oxalace a o en el Ciclo de K ebs [138, 155, 156]. Los ni eles de PC es án
débilmen e egulados po su ac i ación ansc ipcional, aunque sí se ha desc i o que en es ado
de ayuno se inc emen a su exp esión y sus ni eles de p o eína [157].
Dado que el oxalace a o o mado po PC se debe anspo a ue a de la mi ocond ia, al
ci osol, donde se encuen an el es o de enzimas gluconeogénicas, el oxalace a o es educido
a mala o po la enzima mala o deshid ogenasa mi ocond ial. De es a mane a, el oxalace a o
se anspo a al ci osol en o ma de mala o median e un sis ema llamado lanzade a mala o-
aspa a o. Una ez en el ci osol, el mala o es eoxidado a oxalace a o po la enzima mala o
deshid ogenasa ci osólica.
Figu a 10. Rep esen ación esquemá ica de la lanzade a de mala o-aspa a o en e la ma iz mi ocond ial y el
ci osol. Imagen de elabo ación p opia con Bio ende .
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
54
Du an e el ayuno, se es imula la ca boxilación de pi u a o pa a p oduci glucosa, mien as
que se sup ime la oxidación de glucosa median e la desca boxilación de pi u a o po el
complejo PDH [158]. Es e complejo se e inhibido po quinasas PDKs, las cuales lo
os o ilan e inac i an, educiendo la con e sión de pi u a o a ace il-CoA y po an o
educiendo la en ada de es e úl imo al ciclo de K ebs [159]. Exis en 4 iso o mas que
os o ilan a la PDH, siendo PDK2 y PDK4 las iso o mas más abundan es, exp esándose en
una g an a iedad de ejidos, aunque mayo i a iamen e en co azón, iñones e hígado; mien as
que PDK3 y PDK1 se limi an a exp esa se en ce eb o e hígado [160, 161]. De es e modo, los
ni eles de PDK2 y PDK4 se en aumen ados du an e el ayuno y en pacien es diabé icos
[162]. La deleción de PDK4 aumen a la ac i idad del complejo PDH, po lo que el pi u a o
es di igido hacia el ciclo de K ebs pa a su oxidación comple a, y deja de es a disponible pa a
la gluconeogénesis. Es o úl imo p o oca una hipoglucemia du an e el ayuno en los a ones
knockou de PDK4 [163, 164].
Una ez con e ido el pi u a o en oxalace a o, la enzima PCK1 ca aliza la o mación de PEP
a pa i de oxalace a o. Una ez en el ci osol, el PEP es secuencialmen e ans o mado en 2-
os oglice a o, 3- os oglice a o, 1,3-bi os oglice a o, y glice aldehido 3- os a o, una iosa
que puede in e con e i se en dihid oxiace ona os a o. La combinación de glice aldehido y
dihid oxiace ona os a o p oduce F1,6BP, y la des os o ilación de es a da luga a F6P, que
se ans o ma en glucosa 6- os a o (G6P).
En e los sus a os gluconeogénicos se encuen an algunos aminoácidos, los cuales pueden
con e i se en pi u a o o en in e media ios del ciclo de K ebs; el lac a o (que puede se
con e ido en pi u a o po la enzima lac a o deshid ogenasa); y el glice ol, p o enien e de la
lipólisis del ejido adiposo, que puede con e i se en dihid oxiace ona os a o (DHAP), que
pasa a glice ol 3- os a o (G3P) o di ec amen e a F1,6BP, po an o en ando en la u a
gluconeogénica po encima o después de PCK1 [165].
La enzima bi uncional os o uc oquinasa 2 (PFK2)/ FBPasa2 (PFKFB1) juega un papel
c í ico en el cambio de gluconeogénesis a glucólisis, y ice e sa [141]. Es a enzima
bi uncional egula la p oducción de F2,6-BP, que es un ac i ado alos é ico de la PFK1, una
enzima de la u a glucolí ica. Cuando los ni eles de glucosa son bajos, el glucagón inac i a
PFK2, aumen ando la ac i idad de la FBPasa. Es o p o oca una disminución en la p oducción
In oducción
55
de F2,6BP y educe la glucólisis y po encia la gluconeogénesis. La enzima FBP1 con ie e
F1,6BP en F6P, que en onces se con ie e en G6P. Es a en a en el e ículo endoplasmá ico,
donde la G6Pasa con ie e la G6P en glucosa.
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
56
Figu a 11. Rep esen ación esquemá ica de gluconeogénesis y los pun os de in eg ación de los di e en es sus a os
gluconeogénicos. Las ías elacionadas con la gluconeogénesis es án ma cadas en iole a, mien as que aquellas de
la glucólisis pe manecen en neg o. Imagen de elabo ación p opia con Bio ende .
In oducción
63
En cuan o al me abolismo del glucógeno, PKA os o ila y ac i a la glucógeno os o ilasa
quinasa (GPK), que a su ez os o ila y ac i a la GP, enzima cla e en la glucogenolisis que
ca aliza la libe ación de glucosa-1- os a o (G1P) a pa i del glucógeno almacenado. PKA
ambién os o ila y desac i a la glucógeno sin asa, una enzima que ca aliza la sín esis de
glucógeno [193].
Po úl imo, el glucagón egula la asa glucolí ica median e la inhibición de la
os o uc oquinasa-1 (PFK-1). Al inhibi es a enzima, el glucagón educe la con e sión de
F6P a F1,6P, un paso c ucial en la glucólisis [201-203]. La acción del glucagón cesa cuando
el glucagón se disocia de su ecep o o cuando se deg ada el AMPc po la enzima
os odies e asa.
Figu a 13. Rep esen ación esquemá ica de la egulación de los ni eles de glucosa median e la ía de señalización
del glucagón y la ad enalina. Imagen de elabo ación p opia con Bio ende .

UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
64
Regulación po glucoco icoides y ecep o es nuclea es
La egulación de la gluconeogénesis mediada po glucoco icoides es p incipal y
di ec amen e a a és de la es imulación de la ansc ipción de PCK1, aunque ambién
G6Pasa y FBPasa.
A ni el molecula , los glucoco icoides, como el co isol, son sus ancias liposolubles que
pueden a a esa la memb ana celula hacia el ci osol, donde se unen a su ecep o (GR)
eclu ado po chape onas [204]. La unión del glucoco icoide a su ecep o p o oca la
disociación de las chape onas, y el complejo GR-glucoco icoide puede en onces ansloca se
al núcleo, donde in e acciona con egiones especí icas del ADN, llamadas elemen os de
espues a a glucoco icoides (GRE, po sus siglas en inglés), p esen es en los p omo o es de
los genes diana. La unión del complejo GR-glucoco icoide al GRE del p omo o de PCK1
es imula su ansc ipción y po an o la gluconeogénesis. El knockdown de GR en el hígado
inhibe la exp esión de genes gluconeogénicos, educe los ni eles de glucosa en ayuno, y
educe la hipe glucemia en a ones db/db y con diabe es inducida po es ep ozo ocina (STZ)
[205, 206]. La desace ilasa HDAC6 desace ila a la chape ona HSP90, e i ando que es a se
disocie del GR y po an o e i ando la anslocación nuclea del GR. Los a ones knockou
de HDAC6 poseen una anslocación nuclea abe an e del GR, y po an o meno es ni eles
de ac i ación ansc ipcional de los genes PCK1, G6Pasa, FBPasa y PC en el hígado [207].
Regulación po ho mona de c ecimien o
La GH es imula la ía de JAK2/STAT5, donde STAT5, os o ilado y ac i ado, se ansloca
al núcleo y se une di ec amen e al p omo o de PCK1 [208] y al de PDK4 [209], es imulando
di ec amen e la gluconeogénesis, e, indi ec amen e, inhibiendo la en ada de pi u a o en el
ciclo de K ebs y, po an o, des iándolo hacia la p oducción de glucosa [210].
La acción gluconeogénica de la GH se encuen a egulada nega i amen e po múl iples
ac o es, en e los que se encuen an los ácidos bilia es y el ac o de c ecimien o de
ib oblas os 21 (FGF21). Los p ime os ac i an al ecep o FXR, el cual es imula la exp esión
del ep eso SHP que impide la unión de STAT5 a los p omo o es de PCK1, PDK y G6Pasa,
impidiendo así la gluconeogénesis. De es e modo, se ha is o que a ones knockou de SHP
In oducción
65
mues an una cie a hipe glucemia en ayuno y su sob eexp esión en a ones diabé icos mejo a
sus ni eles de glucemia [212-214].
Regulación po insulina
Tal como se ha mencionado en apa ados an e io es en es a esis, la insulina puede inhibi la
p oducción hepá ica de glucosa de o ma di ec a, ac uando en el hígado a a és de su
ecep o ubicado en la memb ana celula , o de o ma indi ec a, ac uando en el pánc eas, el
ce eb o y el ejido adiposo [102]. Aco demen e, la deleción de los ecep o es de insulina
especí icamen e en el hígado iene como esul ado in ole ancia a glucosa e hipe glucemia
[211]. En línea con es o, la esis encia a insulina es un de e minan e pa a el desa ollo de la
diabe es ipo 2.
1.1.6.4 Libe ación de glucosa al o en e sanguíneo
La G6P gene ada a pa i de la glucogenolisis o la gluconeogénesis se ansloca del ci osol al
e ículo endoplásmico po el anspo ado de glucosa 6- os a o (G6P , ambién conocido
como SLC37A4), donde da luga a glucosa median e la des os o ilación po la G6Pasa. La
de iciencia congéni a de la G6P o la G6Pasa da luga a la en e medad de Von Gie ke o
glucogenosis ipo I (GSD-I), la cual se ca ac e iza po una acumulación ano mal de
glucógeno y una incapacidad de man ene la no moglucemia, po an o dando luga a una
hipoglucemia du an e los pe íodos in e p andiales. La ele ada acumulación in acelula de
glucosa 6- os a o p omue e la u ilización de ías al e na i as pa a la u ilización de glucosa,
incluyendo la lipólisis, lo cual p o oca un aumen o en los ni eles de iacilglicé idos y
coles e ol en sang e, y hepa omegalia debido a la acumulación de glucógeno y ácidos g asos
en el hígado [212].
La glucosa es inalmen e libe ada al o en e sanguíneo a a és de los anspo ado es
bidi eccionales GLUT2. Análogamen e, los pacien es con mu aciones en el gen SLC2A2 que
codi ica pa a el anspo ado GLUT2 desa ollan el Sínd ome de Fanconi-Bickel,
padeciendo hipoglucemia en pe íodos de ayuno y acumulación de glucógeno [213].
1.2 Modi icaciones pos aduccionales
La ac i idad de una p o eína puede se modi icada de a ias mane as pa a egula su unción
biológica. De hecho, las modi icaciones pos aduccionales de p o eínas son los mayo es
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
66
egulado es de las unciones de una célula euca io a. En ese sen ido, las modi icaciones
pos aduccionales (PTMs) de p o eínas egulado as pe mi en espues as adap a i as a una
a iedad de señales me abólicas. De es e modo, la ac i idad de una p o eína puede se
modi icada de di e sas mane as pa a egula su unción biológica. Es as modi icaciones
pueden se e e sibles o i e e sibles y es án eguladas po di e sos p ocesos celula es [214,
215]. La ubiqui inación es la mejo ca ac e izada de esas modi icaciones y es á in oluc ada
en la egulación de cada aspec o de la homeos asis celula , p incipalmen e a a és de sus
unciones p o eosomales [216].
1.2.1 Ubiqui inación
La ubiqui inación es una de las modi icaciones pos aduccionales más impo an es que
juegan un papel undamen al en el man enimien o de la homeos asis y pa a el co ec o
uncionamien o celula . La ubiqui inación de p o eínas iene luga po una se ie secuencial
de es eacciones enzimá icas: en p ime luga , el esiduo Gly del ex emo C- e minal de la
ubiqui ina es ac i ado median e ATP po una enzima E1 ac i ado a, la E1 ubiqui ina-
ac i an e (UBE1), dando luga a la o mación de un enlace ioés e en e la ubiqui ina y el
esiduo Cys del cen o ac i o de la enzima E1. A con inuación, la ubiqui ina ac i ada se
ans ie e a un esiduo Cys de una enzima E2 conjugado a una ez más median e un enlace
ioés e . Finalmen e, una enzima E3 ligasa une el ex emo C- e minal de la ubiqui ina a un
esiduo Lys de una p o eína sus a o median e un enlace pep ídico. La unión de una molécula
de ubiqui ina a una p o eína sus a o al e a su localización celula o su unción. Sin emba go,
la adición de a ios esiduos de ubiqui ina (poliubiqui inación) es señal pa a la deg adación
de dicha p o eína en el sis ema p o eosomal [217].
In oducción
67
Figu a 14. Rep esen ación esquemá ica del (1) p oceso de ubiqui inación y (2) su papel en la deg adación de
p o eínas po el p o eosoma. Adap ado de "Ubiqui in p o easome sys em", po BioRende .com (2023). Ob enido de
h ps://app.bio ende .com/bio ende - empla es
1.2.2 Nedilación
Análogamen e, la nedilación es un p oceso de conjugación de la p o eína NEDD8 (neu al
p ecu so cell-exp essed de elopmen ally down egula ed p o ein 8) a p o eínas diana, no
pa a ma ca las pa a deg adación, sino pa a egula su unción y ac i idad. NEDD8 es una
p o eína ipo ubiqui ina, y, en e odas las p o eínas de es a amilia, NEDD8 es la que poseen
la mayo simili ud y homología con espec o a la ubiqui ina [218].
NEDD8 ue po p ime a ez desc i o que se exp esa en el ce eb o de a ones en ase
emb iona ia [219], jugando un papel en la emb iogénesis, y cuya exp esión disminuye en el
ce eb o en ases del desa ollo más a anzadas. Pese a que an o NEDD8 como ubiqui ina
con engan una secuencia conse ada de esiduos Leu-A g-Gly-Gly en su ex emo C-
e minal, y que es c ucial en el caso de la ubiqui ina pa a su conjugación a p o eínas sus a o,
ambas p o eínas di ie en en sus unciones debido a di e encias en sus es uc u as [218]. De
es e modo, NEDD8 posee sie e esiduos di e enciales que se conse an en e sus o ólogos
pe o que di ie en de los de la ubiqui ina, po an o siendo esponsables de las in e acciones
especí icas de NEDD8. Uno de esos esiduos, Ala-72, impide la in e acción de NEDD8 con
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
68
la enzima ubiqui ina E1 [220], mien as que los o os seis son esenciales pa a egula las
ac i idades de ubiqui ina ligasa de NEDD8 [221].
Al igual que la ubiqui ina, NEDD8 es sin e izado como un p ecu so con cinco esiduos
adicionales en su ex emo C- e minal que son escindidos po hid olasas como la hid olasa
L3 ubiqui ina C- e minal (UCH-L3) [222] y la desdenilasa 1 (NEDP1/DEN1/SENP8) [223,
224], con el in de deja expues o un esiduo de glicina en su ex emo C- e minal. Mien as
que UCHL3 posee una especi icidad dual po p ocesa an o NEDD8 como ubiqui ina [225],
DEN1 es especí ica del p ocesamien o del p ecu so de NEDD8, así como de su
desconjugación de las p o eínas sus a o [226].
Una ez p ocesado, NEDD8 se une co alen emen e a p o eínas sus a o de una mane a
simila a la ubiqui ina median e una cascada de enzimas E1 ac i ado as, enzimas E2
conjugado as y enzimas E3 ligasas. En un p ime momen o, el NEDD8 madu o es ac i ado
po una enzima E1 ac i ado a, la enzima E1 ac i ado a de NEDD8 (NAE1), que es en
ealidad un he e odíme o, o mado po una subunidad egulado a NAE1/APPBP1 y una
subunidad ca alí ica UBA3 (ab e ia u a de Modi icado simila a la ubiqui ina que ac i a la
enzima 3) [227]. El dominio pliegue de ubiqui ina (UFD) en el ex emo C- e minal de UBA3
juega un papel impo an e mediando las in e acciones con las enzimas E2 conjugado as de
NEDD8 [228].
Una ez ac i ado po NAE1, NEDD8 es ans e ido a un esiduo de cis eína de una enzima
E2 conjugado a de NEDD8 median e una eacción de ans iolación. Has a aho a se han
iden i icado dos enzimas E2 conjugado as de NEDD8: UBE2M ( ambién conocida como
Ubc12) y UBE2F [229, 230]. La ex ensión N- e minal y el dominio ca alí ico de UBA2M o
UBE2F in e acciona con el su co hid o óbico de UBE3 y el UFD de NAE1, espec i amen e
[231]. Además, en los úl imos años se ha demos ado que UBE2M y UBE2F in e accionan
en e sí, de mane a que UBE2M p omue e la ubiqui inación y deg adación de UBE2F, an o
en condiciones isiológicas como de es és [232].
T as la o mación del puen e ioés e , el complejo E2-NEDD8 in e acciona con E3-ligasas
pa a ans e i el esiduo de NEDD8 a p o eínas diana. Los sus a os nedilados pueden se
desnedilados po una desnedilasa, que son p o easas como NEDP1 (p o easa 1 especí ica de

In oducción
69
NEDD8) y CSN (signalosoma COP9), y el NEDD8 lib e es eciclado. De en e odos los
sus a os nedilados que han sido iden i icados has a aho a, solo las p o eínas cullin se
conside an su sus a o isiológico [233].
Figu a 15. Rep esen ación esquemá ica la cascada de nedilación. Imagen de elabo ación p opia con Bio ende .
1.2.2.1 Complejo CRL
La nedilación es á es echamen e elacionada con los complejos CRL (Cullin-RING Ligase),
que son complejos p o eicos in oluc ados en la ubiqui inación de p o eínas, esponsables del
20% de ubiqui inaciones de p o eínas pa a su deg adación en el sis ema p o eosomal. La
unión de NEDD8 a una lisina C- e minal de las cullins p o oca un cambio de con o mación
abie o del CRL, lo cual da luga a su ac i ación y pe mi e el acceso de sus a os pa a se
ubiqui inizados [234].
El complejo CRL es una E3 o mada po cua o componen es, incluidas las cullins, una
p o eína adap ado a, un ecep o que econoce el sus a o, y una p o eína RING.
Es uc u almen e, las cullins ac úan como p o eínas andamio con su ex emo N- e minal
unido a una p o eína adap ado a, y a una p o eína ecep o de sus a o, y con su ex emo C-
e minal unido al componen e p o eína RING [235].
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
70
Figu a 16. Rep esen ación esquemá ica del complejo cullin-RING ligasas. Imagen de elabo ación p opia con
Bio ende .
En el genoma humano se han iden i icado ocho miemb os de la amilia cullin (CUL1, CUL2,
CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5, CUL7 y CUL9), odos ellos con un dominio homólogo
cullin conse ado en su ex emo C- e minal, el cual es esponsable de la in e acción de las
cullins con el componen e RING, el cual es á cons i uido po la p o eína RBX1 (Ring-Box
1) o RBX2 (Ring-Box 2), las cuales es án in oluc adas en la ans e encia de la ubiqui ina a
p o eínas sus a o diana. El dominio N- e minal de las p o eínas RING media la unión con la
p o eína cullin, mien as que su ex emo C- e minal se une y ac i a enzimas E2 conjugado as.
UBE2M p omue e la nedilación de p o eínas cullins asociadas a Rbx1 (CUL1-3, CUL4A y
CUL4B), mien as que UBE2F p omue e la nedilación de la CUL5 asociada a Rbx2 [231,
235].
Con espec o a las p o eínas adap ado as, Skp1 se une a las cullins 1 y 7, la elongina B/C
in e acciona con las cullins 2 y 5, y DDB1 a las cullins 4A y 4B. Po o o lado, con espec o
a los ecep o es econocedo es de sus a o, se han iden i icado 69 p o eínas F-box pa a
CRL1/SCF, 80 p o eínas SOCS pa a CRL2/5 180 p o eínas BTB pa a CRL3, 90 p o eínas
DCAF pa a CRIL4A/4B, y una p o eína adap ado a, FBXW8, pa a CRL7 [236]. Con odo,
las CRLs consis en en más de 400 componen es que o man las ocho ubiqui ina- ligasas E3
dependien es de las cullin-RING.
In oducción
71
En gene al, la mayo ía de p o eínas de ida co a son sus a os de CRLs, incluyendo
egulado es del ciclo celula , ac o es de ansc ipción, moléculas de señalización, y p o eínas
egulado as de la ansc ipción y apop osis. Dado que los sus a os de las CRLs son a ias
moléculas cla e en di e en es p ocesos celula es, no es de ex aña que las CRLs y su
ac i ación po nedilación jueguen un papel cla e en mul i ud de p ocesos biológicos. Ello
ambién implica que las CRLs se encuen en ano malmen e eguladas en a ias
en e medades en humanos y que hayan se ido como dianas e apéu icas pa a el a amien o
de dichas en e medades [237, 238].
Figu a 17. Rep esen ación esquemá ica de la amilia de cullin-RING ligasas: componen es y sus a os. Imagen de
elabo ación p opia con Bio ende basada en la ig.1.3 de [235].
1.2.2.2 P o eínas eguladas po nedilación
Los sus a os suscep ibles de se nedilados incluyen no solo cullins sino ambién a ias
p o eínas no cullins, lo que sugie e que la nedilación, además del CRLs, egula a ios
p ocesos celula es, en e los cuales se incluye la señalización de ecep o es i osina quinasas,
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
72
apop osis, espues a de daño al ADN y ansc ipción [239]. En e esas p o eínas suscep ibles
de se nediladas se encuen an el gen 3 asociado a cánce de mama (BCA3, po sus siglas en
inglés), el ecep o del ac o de c ecimien o epidé mico (EGFR), el ac o 1α inducible po
hipoxia (HIF-1α), el inhibido de apop osis ligado al c omosoma X (XIAP), la caspasa 7
[240-244] y el ac o de ansc ipción p53, una p o eína sup eso a umo al [245], cuya
nedilación po la ligasa MDM2 (de sus siglas en inglés "mu ine doble minu e 2") p e iene
su anslocación nuclea [246] y sup ime su ac i idad ansc ipcional [247] median e su
deg adación p o eosomal a a és de su ubiqui inación. Cu iosamen e, y como es común con
las ligasas de la amilia RING, se ha desc i o que MDM2 a su ez se au onedila [247].
Consis en emen e, la sob eexp esión o inhibición de NAE1 inhibe o po encia la ac i idad de
p53, espec i amen e [248]. Po o o lado, el papel de la nedilación en la egulación
ansc ipcional se ha ex endido a o os miemb os de la amilia de p53, de mane a que la
nedilación de TP73 inhibe la ac i idad ansc ipcional debido a su eclusión ci oplasmá ica
[247, 249]. Como úl imo ejemplo, ambién se ha desc i o que la nedilación es abiliza al
an ígeno humano R (HuR) [250, 251], una p o eína de unión a ARN que es abiliza los ARNm
diana implicados en la desdi e enciación, p oli e ación y supe i encia celula , odas
ca ac e ís icas bien es ablecidas del cánce . Con ello, la es abilización de HuR po su
nedilación p omue e la supe i encia del ca cinoma hepa ocelula y las células de cánce de
colon [251, 252].
An e es e con ex o de cánce no es de ex aña que los ni eles de enzimas ca alí icas de la
nedilación (NAE1, NEDD8, UBE2M/UBE2F) se encuen en signi ica i amen e
inc emen ados en a ios ipos de cánce es humanos, incluyendo cánce de pulmón,
hepa oca cinoma, glioblas oma y cánce de mama [237, 238, 253, 254], lo cual ha hecho de
la nedilación una diana a ac i a pa a e apias oncológicas. Es o ha p opiciado el desa ollo
del á maco MLN4924 ( ambién conocido como Pe onedis a ), un po en e y selec i o
inhibido de NAE1 descubie o en 2009 [255]. El MLN4924 o ma un aduc o con NEDD8,
inhibiendo la ac i idad enzimá ica de NAE1 [256]. Se ha desc i o que el MLN4924 eje ce
signi ica i os e ec os an icance ígenos, p incipalmen e desencadenando apop osis celula ,
senescencia y au o agia [238, 253, 257, 258]. En con as e, y en un con ex o más isiológico,
la inhibición a macológica, median e MLN4924, de la nedilación de PPARγ educe la
adipogénesis y la o mación de go as lipídicas en el ejido adiposo [259-262].
Me odología
79
4. METODOLOGÍA
4.1 Animales de expe imen ación
Todos los p ocedimien os ealizados en los animales ue on ealizados bajo la ap obación del
Comi é É ico de la Uni e sidad de San iago de Compos ela, bajo la esponsabilidad del
p o eso Rubén Noguei as Pozo, y egis ados con el núme o de p ocedimien o
15010/2017/007 (anexo 1) y bajo el cumplimien o del Real Dec e o 53/2013 del 1 de eb e o.
Po an o, dicho p ocedimien o se ha ealizado bajo el ampa o del ma co legisla i o igen e:
Di ec i a 2010/63/UE del Pa lamen o y Consejo Eu opeo del 22 de sep iemb e de 2010
ela i a a la p o ección de los animales u ilizados pa a ines cien í icos; aspues o a la no ma
española con el Real Dec e o 53/2013, del 1 de eb e o, po el que se es ablecen las no mas
básicas aplicables pa a la p o ección de los animales u ilizados en expe imen ación y o os
ines cien í icos, incluyendo la docencia. Además, conside ando las implicaciones é icas
asociadas al uso de animales con ines cien í icos, los diseños expe imen ales se ealiza on
eniendo en cuen a el p incipio de las es e es ( educción, e inamien o y eemplazo), po
an o in en ando u iliza el meno núme o de animales posible, que los p ocedimien os uesen
lo menos dolo osos posible pa a ellos, y u ilizando modelos in i o siemp e que uese una
al e na i a.
Los di e en es modelos animales u ilizados en es a esis ue on man enidos en el animala io
CEBEGA, en San iago de Compos ela, en condiciones lib es de pa ógenos (SPF),
man enidos en salas con empe a u a egulada en o no a 22°C y con ciclos de luz oscu idad
de 12h (08.00 ho as - 20.00 ho as), y con un pe iodo de aclima ación en las ins alaciones de
mínimo de 7 días p e ios a cualquie a p ocedimien o.
3.1.1. Modelos animales.
En es a esis doc o al se han empleado indis in amen e machos o hemb as de las siguien es
cepas:
o Ra ones wild ype (WT) C57BL/6J suminis ados po el Cen o de In es igación Animal
de Galicia (CEBEGA).
o Ra ones con el gen Pck1 lanqueado po secuencias LoxP (backg ound gené ico agou i y
C57BL/6J).

UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
80
o Ra ones que exp esan el gen de la ecombinasa C e bajo la exp esión del p omo o de la
albúmina y los enhance s de la α- e op o eina ( ansgen Al pC e), con igu ación que
po encia la ansc ipción de la albúmina [272].
o Ra ones he e ocigo os de NAE1 (backg ound C57BL/6J) p opo cionados po el
labo a o io de la D .Ma ínez-Chan a , del CIC bioGUNE [273].
o Ra ones bioNEDD8 (backg ound C57BL/6J) con NEDD8 bio inizado, p opo cionados
po el labo a o io de la D .Ma ínez-Chan a , del CIC bioGUNE.
o Ra ones BKS.Cg-Dock7m +/+ Lep db/J (db/db), p oceden es de la casa come cial The
Jackson Labo a o y ( e . 000642).
Du an e odo ese iempo, los animales ue on man enidos en condiciones de acceso lib e a
die a es ánda (61,3% ca bohid a os, 25,2% p o eínas y 13,5% g asas) y a agua, excep o en
los p ocedimien os expe imen os en los que se especi ique o a condición. Pa a e i ica el
co ec o bienes a de los animales, es os ue on moni o izados pe iódicamen e median e un
seguimien o con olado de masa co po al e inges a, además de alo a su co ec o aspec o
ísico y conduc ual, y acos umb a los al manejo po el pe sonal del labo a o io pa a educi
en odo lo posible el es és gene ado du an e los expe imen os lle ados a cabo.
La es abulación de los animales ue colec i a en odos los expe imen os, a excepción de las
es icciones caló icas y as las ci ugías, donde en esos casos pe manecie on
indi idualizados. El núme o de animales u ilizado en cada expe imen o es á indicado en su
co espondien e pie de igu a. Pa a odos los expe imen os se u ilizó una mezcla de a ones
an o machos como hemb as den o de cada g upo expe imen al, excep o en una única
ocasión en la que igu a indicado que se u iliza on solamen e hemb as.
Los animales ue on sac i icados y los ejidos ecolec ados ápidamen e se in oduje on en hielo
seco pa a e i a su deg adación. Los ejidos y los sue os sanguíneos ue on man enidos a −80 °C
has a que ue on analizados.
Me odología
81
4.2 P ocedimien os en animales
3.2.1 Moni o ización de la inges a y el peso co po al.
La de e minación de la masa co po al y la inges a se ealizó median e una balanza de
p ecisión una ez a la semana, siemp e el mismo día de la semana. Dado que los animales se
man u ie on en g upo en una misma caja, el cálculo de la inges a se ealizó median e el
p omedio en unción del núme o de indi iduos de cada caja.
4.2.1 Es udio del e ec o del es ado nu icional en los ni eles de nedilación
Pa a es udia el e ec o del es ado nu icional en los ni eles hepá icos de los ma cado es de
nedilación (NAE1, NEDD8 y cullins nediladas), los a ones WT ue on alimen ados ad
libi um con die a es ánda , some idos a ayuno du an e 24 h, o some idos a ayuno du an e 24
h y después ealimen ados con die a es ánda du an e 24 h más.
4.2.2 Es udio del e ec o de la glucosa en los ni eles de nedilación
Pa a es udia el e ec o de la glucosa sob e los ni eles hepá icos de los ma cado es de
nedilación (NAE1, NEDD8 y cullins nediladas), los a ones WT ue on alimen ados ad
libi um con die a es ánda , some idos a ayuno du an e 24 h, o some idos a ayuno du an e 24
h y después ealimen ados únicamen e con azúca (AB Azuca e a Ibe ia S.L) du an e 24 h
más.
4.2.3 Ayuno de 24 ho as
Pa a es udia el papel de la nedilación en la p oducción de glucosa du an e el ayuno, los
a ones ue on some idos a un ayuno de 24 ho as desde las 08.30 ho as has a las 08.30 ho as
del día siguien e. Se les pesó y se les midie on los ni eles de glucemia con un glucóme o
an es y después del ayuno.
4.2.4 Res icción caló ica
Pa a la ealización del ensayo de es icción caló ica, los animales ue on indi idualizados
los 5 días p e ios al comienzo del ensayo, con acceso ad libi um a die a es ánda p e iamen e
pesada. Du an e esos días de aclima ación, se moni o izó la inges a pa a de e mina la
can idad de comida consumida dia iamen e po cada a ón. T as eso, los a ones ue on
di ididos alea o iamen e en dos g upos, de los cuales uno de ellos con inuó cinco días más
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
82
con die a ad libi um, mien as que los a ones del o o g upo ue on some idos a una
es icción del 60% de su inges a [274]. Cada día a las 17.30 ho as se les pesó y midió sus
ni eles de glucemia y, a las 18:00 ho as se alimen ó a cada uno de es os a ones some idos a
es icción caló ica con la can idad equi alen e al 40% de su inges a dia ia du an e la semana
de aclima ación. Finalmen e, los a ones ue on sac i icados a las 17:30 ho as (an es de se
alimen ados) del cua o día de es icción caló ica y el sue o sanguíneo y el hígado ue on
ecogidos pa a su análisis.
4.2.5 Inyección in ape i oneal
La inyección in ape i oneal (ip) consis e en la adminis ación de sus ancias en la ca idad
pe i oneal, que es el espacio que odea los ó ganos i ales. La inyección se ealiza en el
cuad an e in e io de echo o izquie do del abdomen del animal, suje ando a es e en posición
decúbi o supina y lige amen e inclinado hacia abajo pa a desplaza las ísce as hacia abajo
y no pe o a las. La aguja BD Mic olance, 25G 5/8” 0.5x16 mm, BD Medical Su gicals
Sys ems), acoplada a una je inga (1 ml BD slip ip si inge, bulk, non-s e ile, BD Medical
Su gicals Sys ems), se in oduce en un ángulo de 45⁰ has a un pun o donde no se no e
esis encia.
4.2.6 Adminis ación de ho monas
4.2.6.1 Adminis ación de lep ina
Pa a es udia el e ec o de la lep ina en la egulación de los ni eles de p o eínas de los
ma cado es de nedilación (NAE1, NEDD8 y cullins nediladas) en el hígado, a ones WT
ue on a ados con salino como ehículo, o con lep ina ecombinan e (Sigma Ald ich, e .
L4146) en una dosis de 0.5 mg/kg cada 12 ho as du an e 3 días, adminis ada po ía ip [275].
4.2.6.2 Adminis ación de glucagón
Los a ones, man enidos p e iamen e en ayuno du an e la noche, ue on a ados con salino
o con glucagón 200 μg/kg (Sigma-Ald ich, e . G1774) po ía ip. T anscu idos 30 minu os
as la inyección, se midie on los ni eles de glucosa en sang e [198] con un glucóme o
(Glucoca d, A k ay, EEUU).
4.2.6.3 Adminis ación de ad enalina
Me odología
83
Los a ones, man enidos p e iamen e en ayuno du an e la noche, ue on a ados con salino
o con L-ad enalina a una dosis de 100 μg/kg (The moFishe , e . L04911) po ía ip. La dosis
se escogió as la ealización de un ensayo de dosis espues a, donde se seleccionó la dosis
más baja capaz de ele a los ni eles de glucosa en sang e (da os no mos ados). Los ni eles
de glucemia se midie on con un glucóme o a los 15, 30, 45 y 60 minu os as la
adminis ación de la ho mona.
4.2.6.4 Adminis ación de co isol
Los a ones, man enidos p e iamen e en ayuno du an e la noche, ue on a ados con salino
o con succina o sódico de hid oco isona a una dosis de 20 mg/kg (San a C uz Bio echnology,
e . sc-250130) po ía ip. La dosis se escogió as la ealización de un ensayo de dosis
espues a, donde se seleccionó la dosis más baja capaz de ele a los ni eles de glucosa en
sang e (da os no mos ados). Los ni eles de glucemia se midie on con un glucóme o a los
15, 30, 45 y 60 minu os as la adminis ación de la ho mona.
4.2.6.5 Adminis ación de insulina
T as un ayuno de 6 ho as, los a ones ue on a ados con salino o con insulina (Ac apid,
No o No disk) a una dosis de 0.35 U/kg po ía ip. Los ni eles de glucosa en sang e ue on
medidos con un glucóme o a los 10 y a los 20 minu os as su adminis ación.
4.2.7 Tes s de ole ancia
4.2.7.1 Tes de ole ancia a pi u a o
Pa a conoce la capacidad gluconeogénica de los di e en es g upos expe imen ales de
a ones, se ealizó un es de ole ancia a pi u a o (PTT, py u a e ole ance es ), que es un
sus a o po enciado de la gluconeogénesis [276]. T as un ayuno noc u no de 12 ho as, se
midie on los ni eles de glucemia basales y se ealizó la adminis ación de pi u a o (Sigma-
Ald ich, e . P2256) po ía ip a una dosis de 1.25 g/kg. Se midie on los ni eles de glucosa
a los 20, 40, 60, 90 y 120 minu os después de la inyección. Con los da os ob enidos se
cons uyó una cu a, de la cual se calculó el á ea bajo la cu a (AUC) de los dis in os g upos
expe imen ales.
4.2.7.2 Tes de ole ancia a glucosa
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
84
Pa a conoce la capacidad de ole ancia a la glucosa de los di e en es g upos expe imen ales
de a ones, se ealizó un es de ole ancia a glucosa (GTT, glucose ole ance es ) (Sigma-
Ald ich, e . G8270). T as un ayuno noc u no de 12 ho as, se midie on los ni eles de
glucemia basales y se ealizó la adminis ación de D-glucosa (2 g/kg) po ía ip [277]. Se
midie on los ni eles de glucosa a los 15, 30, 60, 90 y 120 minu os después de la inyección.
Con los da os ob enidos se cons uyó una cu a, de la cual se calculó el á ea bajo la cu a
(AUC) de los dis in os g upos expe imen ales.
4.2.7.3 Tes de ole ancia a insulina
Pa a conoce la sensibilidad a insulina de los di e en es g upos expe imen ales de a ones, se
ealizó un es de ole ancia a insulina (ITT, insulin ole ance es ) (Ac apid, No o No disk).
T as un ayuno diu no de 6 ho as que no maliza la glucemia y la insulinemia a ni eles basales
independien es del iempo anscu ido desde la úl ima comida, se midie on los ni eles de
glucemia basales y se ealizó la adminis ación de insulina (0.35 U/kg) po ía ip. Se midie on
los ni eles de glucosa a los 15, 30, 60, 90 y 120 minu os después de la inyección. Con los
da os ob enidos se cons uyó una cu a, de la cual se calculó el á ea bajo la cu a (AUC) de
los dis in os g upos expe imen ales.
4.2.7.4 Tes de ole ancia a glice ol
Pa a conoce la capacidad de los di e en es g upos expe imen ales pa a p oduci glucosa a
pa i de glice ol, se ealizó un es de ole ancia a glice ol (GlyTT, glice ol ole ance es ),
que es un p ecu so y, po an o, po enciado de la gluconeogénesis. T as un ayuno noc u no
de 12 ho as se ealizó la adminis ación de glice ol (1 g/kg) po ía ip [278]. Se midie on los
ni eles de glucosa a los 20, 40, 60, 90 y 120 minu os después de la inyección. Con los da os
ob enidos se cons uyó una cu a, de la cual se calculó el á ea bajo la cu a (AUC) de los
dis in os g upos expe imen ales.
4.2.8 T a amien o con MLN4924
Pa a comp oba el e ec o que iene el bloqueo de la nedilación, se adminis ó MLN4924
(MedChemExp ess, New Je sey, EEUU, e . HY-70062), ambién llamado pe onedis a , un
conocido inhibido de NAE1 [255], a los a ones a una dosis de 60 mg/kg po ía subcu ánea

Me odología
85
3 días an es del expe imen o. 2-Hid oxip opyl-β-ciclodex ina (Sigma, #H107) ue u ilizada
como ehículo.
4.2.9 Inyección en la ena de la cola
La inyección en la ena la e al de la cola del a ón (TVI, ail ein injec ion) es el mé odo más
común y e icien e de adminis a ec o es i ales en el hígado. La in ección en el hígado
aumen a con la elección del AAV ( i us adenoasociado) se o ipo 8 como ec o , pues posee
una al a a inidad po in ec a hepa oci os.
Los a ones se inmo iliza on en un cepo (TV-150-STD, Bioseb, F ancia) que deja lib e la
cola. An es de adminis a las sus ancias, es necesa io dila a la ena median e la exposición
a una lámpa a é mica du an e unos 5-10 segundos. Cuando la ena es é dila ada, se p ocede
desin ección con e anol 70% y, una ez desin ec ada la zona, se p ocede a la adminis ación
de 100 µl de la sus ancia, de mane a casi pa alela al aso sanguíneo. Pa a comp oba si
es amos accediendo a la ena de o ma co ec a, bas a con comp oba si apa ece sang e al
aspi a , o bien, no ap ecia ninguna esis encia al p esiona el émbolo de la aguja al inyec a .
Una ez inoculada la sus ancia, se e i a la aguja despacio, y se p esiona la zona has a de ene
la hemo agia.
En es a esis, se ha u ilizado es a ía de adminis ación pa a inyec a los di e en es i us que
modi ican la exp esión génica de nedilación:
Tabla 1. Lis a de i us inyec ados en la ena de la cola de los a ones.
Vi us
Casa come cial y e e encia
Dosis
(UV/ml)
Vehículo
AAV8-DIO-shNAE1
Vec o Builde ( e . VB191026-
1075pqj)
1010
Sue o isiológico
AAV8-DIO-shNEDD8
Vec o Builde ( e . VB191025-
5729jaz)
1010
Sue o isiológico
AAV8-DIO-NAE1
Vec o Builde ( e . VB191025-
5576yay)
1010
Sue o isiológico
AAV-DIO-EGFP
Vec o Builde ( e . VB010000-
9487ngd)
1010
Sue o isiológico
AAV8-C e-GFP
Tebubio (#189SL100835)
1010
Sue o isiológico
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
86
AAV8-GFP
Signagen Labo a o ies ( e .
SL100,833)
1010
Sue o isiológico
AAV8-PCK1 WT
O igene ( e . RC204758)
1010
Sue o isiológico
AAV8-K278R-K342R-
K387R-PCK1
Vec o Builde ( e . VB210921-
1406 )
1010
Sue o isiológico
4.2.10 De e minación de la p oducción hepá ica de glucosa
4.2.10.1 Ci ugía pa a la canulación de la ena yugula
Pa a la de e minación de la p oducción hepá ica de glucosa (HGP), p e iamen e es necesa io
la implan ación de un ca é e en la ena yugula , pa a ene un pun o de acceso ascula pa a
la in usión de glucosa i iada. La implan ación del ca é e se ealiza como se desc ibe: 7 días
an es del ensayo, se anes esia al a ón con una mezcla de ke amina (80 mg/kg)/xilacina (5
mg/kg) ía ip combinado con una mezcla de iso luo ano y oxígeno inhalado du an e odo el
p ocedimien o. A con inuación, se asu an las zonas de las incisiones, se desin ec an con
clo hexidina (Galeno Especialidades Ve e ina ias S.L., España), y se coloca al animal en
posición decúbi o supino, en una zona de abajo asép ica, y en di ección os al hacia el
in es igado . Después se le adminis a an ibió ico (Bay il, 10 mg/kg), y an iin lama o ios
(Me acam, dosis 5 mg/kg), ambos po ía subcu ánea.
La ci ugía comienza con la ealización de una pequeña incisión en la zona de echa del cuello,
unos 5 mm po encima del músculo pec o al. A con inuación, se aísla la ena yugula con
cuidado y se coloca y cie a una ligadu a de seda 7/0 (Me silk E hicon, e . W817) en el
ex emo. Se coloca o a ligadu a, es a ez de o ma holgada, en el ex emo caudal de la ena
expues a. Se ealiza una pequeña incisión con un ángulo de 30⁰ po encima de la ligadu a
ce álica y ápidamen e se inse a 1 mm el ca é e (Ins ech Labo a o ies, e . C20PU-
MJV2011) p e iamen e ellenado con salino hepa inizado a una concen ación de 25 U/mL.
Se cie a la ligadu a caudal al ededo del ca é e y se comp ueba que la sang e luye a a és
de es e median e el aspi ado con una je inga con salino hepa inizado conec ada al ca é e . Se
desconec a la je inga del ca é e y se cie a con un plug (Ins ech Labo a o ies, e . SP25/12).
A con inuación, se coloca al a ón en posición decúbi o p ono, y se le ealiza una pequeña
incisión en la zona in aescapula as habe desin ec ado la zona con clo hexidina. Se
a a iesa subcu áneamen e hacia el lado en al del animal, donde se localiza el ex emo lib e
Me odología
87
del ca é e unido a un plug. Es e pasa subcu áneamen e hacia el lado do sal, donde se conec a
a un bo ón de acceso ascula (Ins ech Labo a o ies, e . VAB62BS/25). Po úl imo, se
su u an las incisiones con seda 5/0 (Me silk E hicon, e . W500H) y se comp ueba el lujo
sanguíneo a a és del bo ón do sal median e el uso de una je inga hepa inizada con 200 U/ml
de hepa ina conec adas a un inyec o PinPo (Ins ech Labo a o ies, e . PNP3M). Du an e
odo el p ocedimien o de ci ugía, los a ones siguen una moni o ización del pulso, sa u ación
de oxígeno y empe a u a median e el sis ema de moni o ización de PhysioSui e (Ken
Scien i ic, Alemania).
Solamen e los a ones que hayan ecupe ado al menos 90% de su peso co po al as 7 días de
ecupe ación se án incluidos en los g upos expe imen ales. Los animales se some e án a un
ayuno de 24 ho as o a una es icción caló ica an es del inicio de la p ueba, momen o en el
cual se colocan en jaulas de lib e mo imien o conec ados median e un bo ón de acceso
ascula en el do so del animal, al como se desc ibe en el p o ocolo de Ayala y colabo ado es
[279]. De es a mane a, los animales pe manecen lib es, conscien es y sin ningún ipo de
manipulación du an e odo el iempo que du e la p ueba.
4.2.10.2 In usión con glucosa i iada
Dado que los animales es aban en es icción caló ica o en ayuno 24h, no ue necesa io
some e los a ayuno el día de la pe usión. Du an e la pe usión, los a ones ecibie on una
in usión de [3-3H]-glucosa (0.05 μCi/min) ( e . NET331C005MC, Pe kin Elme , EEUU)
du an e 2h. A los 110 y a los 120 minu os, se midie on los ni eles de glucemia con un
glucóme o y se oma on mues as de sang e de la ena de la cola (25 μl) en un ubo colec o
con EDTA ( e . 16.444.100, Mic o e e, Sa s ed AG & Co HG, Alemania). Las mues as de
sang e ue on a adas con 50 µl de 0.3N ZnSO4 y 50 µl de 0.3N Ba(OH)2 y después
cen i ugadas a 9000 RCFs du an e 10 minu os. T as ese iempo, se ecogió el sob enadan e
y se pipe ea on 10 µl po duplicado en ubos de cen elleo (Pico P ias 6 mL, e . 6000192,
Pe kin Elme , EEUU). Es os se dejan e apo a oda la noche en una campana de ex acción
de gases y, al día siguien e, se añaden 100 µl de agua des ilada y 3 mL de líquido de cen elleo
(Pico-Fluo Plus, e . 6013699, Pe kin Elme , EEUU). Po úl imo, se leyó la adiac i idad
en los ubos en un con ado de cen elleo líquido T i-Ca b 2810 TR (Cien í ica Andina, Pe ú).
Ma emá icamen e, el cálculo se basa en la p emisa de que el i io se inco po a a la glucosa
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
88
du an e la gluconeogénesis, y la libe ación de agua i iada cuando se deja e apo a e leja la
asa de p oducción de glucosa endógena (Ra o HGP, po sus siglas en inglés). Y po an o, el
Ra se puede calcula di idiendo la ac i idad de la mues a en e la concen ación especí ica
del isó opo, es o es, la ac i idad del isó opo po unidad de masa.
4.2.11 Análisis his ológico del ejido hepá ico.
En la ealización de es a esis, se ealiza on inciones his ológicas pa a es udia el posible
e ec o de la manipulación de la nedilación en el hígado. Las mues as de hígado se ecogen
en ces illas y se embeben en o malina (Bio-Op ica, e . 65-30001) du an e el sac i icio. T as
24 h, se cambia la o malina po e anol 70%.
4.2.11.1 Hema oxilina/eosina
Pa a ealiza es a inción, el ejido p e iamen e ijado con o malina se incluye en pa a ina
pa a se seccionado en un mic ó omo. Los co es de pa a ina se a an con xilol pa a elimina
los excesos de la misma. A con inuación, los co es se pasan po un p oceso de ehid a ación,
consis en e en alcoholes de concen ación dec ecien e (100, 95 y 70º). T as un la ado con
H2O des ilada, se sume gen en hema oxilina (Bio Óp ica) du an e 10 minu os, se la an e
inmedia amen e de pasa po un alcohol ácido. T as el la ado, se sume gen 30 segundos en
eosina (Bio Óp ica). Pa a deshid a a la mues a, los co es se pasan po los mismos alcoholes
en g aduación c ecien e y, an es de mon a , se dejan sume gidos 10 minu os en xilol. Los
po aobje os se mon an en medio de mon aje acuoso. Es a écnica nos pe mi e isualiza la
es uc u a gene al del ejido y, dado que la hema oxilina es de na u aleza ca iónica (básica),
iñe de azul las es uc u as basó ilas (ácidas) como los núcleos celula es; y la eosina, que es
de na u aleza ácida, iñe de osa las es uc u as de na u aleza básica, como el ci oplasma.
4.2.11.2 Inmunohis oquímica
Es a écnica nos pe mi e de ec a la p esencia y localización de de e minadas p o eínas en el
p opio ejido. En el desa ollo de es e p oyec o de in es igación, se u ilizó la
inmunohis oquímica pa a comp oba la educción en los ni eles de NAE1 y NEDD8 en los
modelos animales donde se silenciaban es os genes. Pa a ello, las mues as ijadas en pa a ina
ue on despa a inadas, hid a adas, p e a adas en bu e THE PTLink pH9 y bloqueadas con
Me odología
95
Una ez ealizado el co espondien e ensayo, en el caso de cul i os celula es, se ealiza on
dos la ados con PBS y se le añadió a cada pocillo un olumen de ampón de lisis ( abla 3)
que cub iese la supe icie (ap oximadamen e 120 µL). A con inuación, se desp endie on las
células de la supe icie del pocillo con un aspado (Falcon, e .353085) y se ecogió la
suspensión en un ubo de polip opileno de 1,5 mL. En el caso de mues as de hígado
conse adas a -80 ⁰C, se ob u o una pequeña po ción pa a su p ocesado. Las mues as deben
man ene se en hielo du an e odo el p oceso, pa a e i a la deg adación de las p o eínas. El
ejido y el ampón de lisis se coloca on jun o con una boli a de ace o en un ubo de
polip opileno de 2 ml, y se homogeniza on en el Tissue lyse du an e 4 minu os a una
ecuencia de 25 agi aciones po segundo. El ampón de lisis acili a, jun o con la
homogenización mecánica, la o u a del ejido y los componen es celula es, disol iéndose
las p o eínas del ejido en el mismo.
Tabla 3. Composición del ampón de lisis disuel o en agua des ilada.
Compues o
Re e encia y casa
come cial
Concen ación
T is-HCl ph 7.5
T6066, MERCK
50 mM
EGTA
E3889, MERCK
1 mM
EDTA
E9884, MERCK
1 mM
T i on X-100
X100, MERCK
1% ol/ ol
O o anada o sódico
S6508, MERCK
1 mM
Fluo u o sódico
S7920, MERCK
50 mM
Pi o os a o sódico
221368, MERCK
5 mM
Saca osa
84097, MERCK
0.27 mM
Fluo u o de
enilme ilsul onilo
P7626, MERCK
1 mM
Cock ail inhibido
p o easas (ROCHE)
11836145001,
ROCHE
1 pas illa/50mL
A con inuación, se cen i uga on las mues as a 12000 RCF a 4 ⁰C du an e 10 minu os en el
caso de ex ac os celula es, o 25 minu os en el caso de ex ac os de hígado, en una cen í uga

UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
96
(Eppendo 5415R). El sob enadan e (ex ac o p o eico) se aspasó a un nue o ubo,
desca ando el p ecipi ado ( es os celula es) y la capa supe io de g asa.
4.5.1.2 Cuan i icación de los ex ac os p o eicos.
Pa a cuan i ica la can idad de p o eína con enida en el ex ac o, ealizamos un mé odo
colo imé ico con la solución B ad o d (Bio- ad P o ein Assay Ki ). Es e mé odo se basa en
el cambio de colo del colo an e Coomasie b illian blue G-250 en espues a a di e en es
concen aciones de p o eínas. El ca ac e ís ico colo ma ón de es e compues o se uel e
azul en p esencia de p o eínas.
Se p epa ó una cu a pa ón de se oalbúmina bo ina con diluciones se iadas a pa i de la
máxima concen ación (1 mg/mL). Se ca ga on 5µl (en el caso de ex ac os celula es) o 10
µl (en el caso de ex ac os de hígados p e iamen e diluidos 1:70 en agua des ilada) de las
mues as po duplicado y 10 µL de las diluciones se iadas de BSA ambién po duplicado, en
una placa mul ipocillo (Del alab, España, e . 900011). A cada uno de los pocillos se les
añadió 250 µL de eac i o B ad o d (dilución 1:5) y se midió la abso bancia a 550 nm en el
espec o o óme o (Mul iskan GO, The mo Scien i ic, Massachuse s, EEUU) as se
p e iamen e incubados a 37 ⁰C du an e 5 minu os.
4.5.1.3 P epa ación de las mues as pa a elec o o esis en SDS-PAGE.
T as la cuan i icación, se p epa a on las mues as jun o con el ampón de ca ga ( ampón de
Laemmli, abla 4). Es e ampón pe mi e do a a odas las p o eínas de ca ga nega i a en
p opo ción a su amaño, g acias al dudecil-sul a o sódico (SDS) y además pe mi e su
desna u alización g acias al β-me cap oe anol, el cual elimina los puen es disul u o. Todas
las mues as deben ene la misma concen ación inal pa a que en el olumen de ca ga en la
elec o o esis (16 µL) haya 8 µg de p o eína. T as añadi el ampón de ca ga las mues as se
calen a on a 95⁰C du an e 5 minu os pa a su comple a desna u alización.
Me odología
97
Tabla 4. Composición del ampón de Laemmli disuel o en agua des ilada.
Compues o
Re e encia y casa
come cial
Concen ación
T is-HCl ph 6.7
250 mM
Glice ol
G5516, MERCK
50% ol/ ol
Dodecilsul a o sódico
(SDS)
L4509, MERCK
10% peso/ ol
β-me cap oe anol
M3148, MERCK
5% ol/ ol
Azul de b omo enol
8122, MERCK
0.0005% peso/ ol
4.5.1.4 Elec o o esis SDS-PAGE.
Es a écnica consis e en la sepa ación de las p o eínas, de ca ga nega i a, po su peso
molecula . Se incluyen las mues as en un gel de ac ilamida-bisac ilamida y, al aplica le
co ien e eléc ica, las p o eínas mig an a a és del gel hacia el polo posi i o de la co ien e.
El gel es á o mado po dos acciones:
- Gel concen ado : se localiza en la pa e supe io sob e el que se incluye un peine pa a
o ma los pocillos donde se ca ga án las mues as ( abla 5).
- Gel sepa ado : pe mi e la sepa ación de las p o eínas. La concen ación de ac ilamida-
bisac ilamida de e mina á el amaño del po o de la malla o mada po el gel, y po an o
el g ado de sepa ación de las p o eínas según su amaño ( abla 6).
Tabla 5. Composición del gel SDS-PAGE concen ado .
Compues o
Re e encia y casa
come cial
Volumen (mL)
8%
10%
15%
H2O des ilada
11.5
9.9
1.5
30% Ac ilamida/Bis
29:1
1610156, Bio-Rad
6.7
8.3
5
T is-HCl 1 M pH 8.8
6.3
6.3
3.3
Dodecilsul a o sódico
(SDS) 10%
L4509, MERCK
0.25
0.25
0.1
Amonio pe sul a o
(APS) 10%
A3678, MERCK
0.25
0.25
0.1
Te ame il-
e ilendiamina
(TEMED)
T9281, MERCK
0.015
0.01
0.01
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
98
Tabla 6. Composición del gel SDS-PAGE sepa ado a po cen ajes 8, 10 y 15.
Los geles, colocados en un equipo Mini-PROTEAN Te a Cell (165-8004, Bio-Rad) se
sume gie on en bu e de elec o o esis, y se ca ga on 16 μl de cada mues a en los pocillos
del gel. En el p ime pocillo de odos los geles se ca gó el ma cado de peso molecula
(P ecision Plus P o ein S anda s-Dual Colo , Bio-Rad, e . 161-0374). Las condiciones de
elec o o esis ue on: ol aje cons an e de 120 V aplicados con un equipo Powe Pac HC
High Cu en Powe Suppy (Bio-Rad, e . 164-5052) du an e 1-2 ho as. La composición del
bu e de elec o o esis (en H2O des ilada) se encuen a en la abla 7.
Tabla 7. Composición del ampón de elec o o esis disuel o en agua des ilada.
4.5.2 T ans e encia semi-húmeda.
Una ez que haya e minado la elec o o esis, el siguien e paso es la ans e encia a un
sopo e sólido, pa a lo cual u ilizamos memb anas de luo u o de poli inilideno (PVDF) de
0,2 µM (BioRad, e . 1620177). Un paso p e io es la ac i ación de las memb anas,
sume giéndolas en me anol (Ca lo E ba, e . 414816), agua des ilada y, po úl imo, en
ampón de ans e encia ( abla 8). A con inuación, se ealiza el mon aje, de mane a que el gel
quede en con ac o con la memb ana y con una esponja húmeda (Ex a Thick Blo Pape ,
Compues o
Re e encia y casa
come cial
Volumen (mL)
H2O des ilada
4.1
30% Ac ilamida/Bis 29:1
1610156, Bio-Rad
1
T is-HCl 1 M pH 6.8
0.75
Dodecilsul a o sódico (SDS)
10%
L4509, MERCK
0.06
Amonio pe sul a o (APS) 10%
A3678, MERCK
0.06
Te ame il-e ilendiamina
(TEMED)
T9281, MERCK
0.006
Compues o
Re e encia y
casa come cial
Can idad
T is-HCl
T6066, MERCK
200 mM
Glicina
G7126, MERCK
20 mM
Dodecilsul a o
sódico (SDS)
L4509, MERCK
1%
peso/ ol
Me odología
99
BioRad, e . 1703960) a cada lado en un equipo T ans-blo Semi-D y T ans e Cell (Bio-
Rad, e . 170-3940). Se conec a la unidad de ans e encia a una uen e de alimen ación
(BioRad) a un ampe aje 0,8 mA/ cm2 aplicados con un equipo Powe Pac HC High Cu en
Powe Suppy du an e 1 ho a y 40 minu os.
Tabla 8. Composición del ampón de ans e encia disuel o en agua des ilada.
4.5.2.1 Inmunode ección de p o eínas.
4.5.2.1.1 Bloqueo.
T as la ans e encia de las p o eínas a memb anas de PVDF, és as se incuba on en una
solución 5% (m/ ) BSA en bu e de la ado TBS-T en agi ación a empe a u a ambien e
du an e 1 ho a. La composición del bu e de la ado TBS-T es la siguien e (en H2O des ilada)
se desc ibe en la abla 9.
Tabla 9. Composición del ampón de la ado de memb anas disuel o en agua des ilada.
Con el bloqueo, la albúmina en solución se une a odos aquellos luga es de la memb ana que
no es én ya ocupados po las ans e idas desde el gel, disminuyendo el uido de ondo y
los alsos posi i os.
4.5.2.1.2 Incubación con an icue po p ima io.
Compues o
Re e encia y
casa come cial
Can idad
T is-HCl
T6066, MERCK
40 mM
Glicina
G7126, MERCK
40 mM
Dodecilsul a o
sódico (SDS)
L4509, MERCK
0.36%
peso/ ol
Me anol
414816, Ca lo
E ba Reagen s
20%
ol/ ol
Compues o
Re e encia y
casa
come cial
Can idad
T is-HCl
20 mM
NaCl
146 mM
Tween-20
P9416,
MERCK
0,1%
ol/ ol
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
100
El siguien e paso ue incuba las memb anas con el an icue po especí ico con a la p o eína
de es udio ( abla 10). El an icue po se diluyó según las ecomendaciones de la casa
come cial (1:500 o 1:1000) en BSA al 3% y se dejó incu
bando en agi ación du an e oda la noche a 4 ⁰C (o una ho a a empe a u a ambien e si se
a aba de una p o eína cons i u i a). T as la incubación se ealiza on 3 la ados con TBS-T
pa a elimina los es os de an icue po p ima io que no se hubiesen unido.
Tabla 10. Lis a de an icue pos u ilizados en es a esis.
4.5.2.1.3 Incubación con an icue po secunda io.
Pa a de ec a la p esencia de la p o eína y ampli ica la señal del an icue po p ima io, al día
siguien e, las memb anas ue on la adas con bu e de la ado TBS-T, es eces du an e 5
minu os. En onces se incuba on las memb anas con una solución 3% (m/ ) BSA en bu e
de la ado TBS-T que con iene el an icue po secunda io especí ico (Tabla 9) pa a el
an icue po p ima io u ilizado, a una concen ación 1:5.000, en agi ación y a empe a u a
P o eína diana
Casa come cial
( e e encia)
Reac i idad de especie
Dilución
NEDD8
Abcam (ab81264)
Monoclonal conejo
1:1000
Fos oenolpi u a o
Ca boxiquinasa 1 (PCK1)
Abcam (ab70358)
Policlonal conejo
1:1000
Enzima ac i ado a de
NEDD8 (NAE1)
Cell Signaling (14321S)
Monoclonal conejo
1:1000
Glucosa 6-Fos a asa
(G6Pase)
Abcam (ab93857)
Monoclonal conejo
1:1000
Pi u a o Ca boxilasa (PC)
Abcam (EPR7366)
Monoclonal conejo
1:1000
Cullin-2
San a C uz (sc-166506)
Mouse monoclonal
1:1000
Glice aldehideo 3- os a o
Deshid ogenasa (GAPDH)
Me ck (CB1001)
Mouse monoclonal
1:5000
UBE1
Cell Signaling (4891)
Policlonal conejo
1:1000
a-Tubulina
Sigma (T5168)
Monoclonal a ón
1:5000
β -Ac ina
Sigma (A5316)
Monoclonal a ón
1:5000
Secunda io conejo
policlonal an i- a ón
DAKO (P0260)
1:5000
Secunda io cab a
policlonal an i-conejo
DAKO (P0448)
1:5000

Me odología
101
ambien e du an e 1 ho a. Los an icue pos secunda ios u ilizados es án asociados a la enzima
pe oxidasa.
4.5.2.1.4 De ección po quimioluminiscencia.
Pa a de ec a el an icue po secunda io se incuba on las memb anas con una mezcla 1:1 de
sus a o de la pe oxidasa y po enciado de quimioluminiscencia (Pie ce ECL Wes e n
Blo ing Subs a e, The mo Scien i ic, e .32106). Inmedia amen e después, pa a de ec a la
eacción que iene luga , se coloca on las memb anas en un casse e de au o adiog a ía
(Hype casse e, Ame sham Biosciences).
El e elado u o luga en una sala oscu a en donde, pa a la isualización, se u iliza on
películas adiog á icas Fuji ilm (FujiMedical X-Ray Fil Supe RX, Fuji ilm Co po a ion, e .
47410 19289). Es as hojas de e elado se in oduje on en el casse e de au o adiog a ía sob e
las memb anas y se dejó expone la señal quimioluminiscen e du an e unos minu os, en
unción de la p o eína.
Pos e io men e se e i ó la película y se sume gió en una solución e elado a (dilución 1:10)
(De elope /Replenishe , Ag a-Ge ae G oup, e . G150) has a que se isualizó la señal
buscada, en cuyo momen o se sume gió la película en el líquido ijado (dilución 1:10)
(Manual Fixing Ba h, Ag a-Ge ae G oup, e . G354) du an e unos segundos con el in de
ija la señal.
4.5.2.2 Cuan i icación de la densidad óp ica de las bandas.
Las imágenes de las películas o og á icas ue on digi alizadas con un escáne de al a
esolución ( esolución 400-800 ppp, CanonScan 9900F, Canon). Pa a de e mina la can idad
ela i a de p o eína en cada mues a, se u ilizó el p og ama Image J 1.6.0 (ImageJ 1.40g,
Na ional Ins i u es o Heal h). El es udio cuan i a i o se ealizó co igiendo la densidad óp ica
de las señales de inmunode ección po la señal de ondo de cada placa; es os alo es se
ela i iza on con espec o al con ol cons i u i o (GAPDH) de cada memb ana.
4.5.3 De ección de ho monas en sue o.
Los ni eles de ad enalina (Cusabio Technology LLC, Hous on, EEUU, e . CSB-E08679m-
96T), co isol (Enzo Li e Sciences, Nue a Yo k, EEUU, e . ADI-900-097), glucagón
(Me codia, Upsala, Suecia, e .10-1281-01), e insulina (Me ck, Da ms ad , Alemania, e .
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
102
EZRMI) se lle ó a cabo median e ki s de ELISAS come ciales siguiendo las ins ucciones
de la casa come cial.
4.5.4 De ección de me aboli os en sue o.
La de ección en sue o de aminoácidos o ales (Abbexa, Camb idge, R.U., e . 298965) y L-
alanina (Abcam, Camb idge, R.U., e . 83394), y ace il-CoA (Abcam, Camb idge, R.U., e .
ab87546) en hígado y sue o de a ones some idos a es icción caló ica del 60% o a ayuno
24 h, se lle ó a cabo median e ki s come ciales especí icos siguiendo las ins ucciones de la
casa come cial.
4.5.5 Immunop ecipi ación de PCK1.
Los ex ac os (p epa ados a pa i de 1 mg de p o eína) se examina on median e
inmuno ans e encia. Pa a el ensayo de inmunop ecipi ación, los ex ac os de hígado se
incuba on con 1 μg de an icue po especí ico de PCK1 (Abcam, Camb idge, R.U., e .
ab70358) acoplado a p o eína G-Se a osa (Me ck, Da ms ad , Alemania, e . P3296).
Después de la incubación du an e la noche a 4°C con agi ación, las p o eínas cap u adas se
cen i uga on a 10.000 g, se ecogie on los sob enadan es y las pe las se la a on cua o eces
en ampón de lisis ( abla 3). Las pe las se calen a on du an e 5 min a 95 °C en 10 µl de
ampón de mues a. Los ex ac os y los inmunop ecipi ados se examina on median e
elec o o esis SDS-PAGE y se ans i ie on con an icue pos con a PCK1 (Abcam,
Camb idge, R.U., e . ab70358) y NEDD8 (Abcam, Camb idge, R.U., e . ab81264). La
memb ana se incubó p ime o con el an icue po p ima io an i-NEDD8 y luego se ealizó un
p ocedimien o de ex acción de s ipping basado en β-me cap oe anol donde se incuba la
memb ana 30 minu os a 50 ⁰C en agi ación ( abla 11) (Me ck, Da ms ad , Alemania, e .
M3140) pa a e i ica el PCK1 o al inmunop ecipi ado.
Tabla 11. Composición del ampón de s ipping pa a un olumen inal de 50 mL.
Compues o
Re e encia y
casa
come cial
Volumen
(mL)
T is-HCl pH 6.8
3.125
Dodecilsul a o sódico
(SDS) 10%
L4509,
MERCK
10
β-me cap oe anol
M3148,
MERCK
0.35
Me odología
103
4.5.6 Modelado de p o eínas.
Las es uc u as de PCK1 y NEDD8 de la especie Mus musculus se ob u ie on con el
algo i mo de p edicción AlphaFold [285]. Todos los modelos de p o eínas neddiladas se
cons uye on u ilizando la p o eína WT como plan illa con UCSF Chime a y los pa áme os
de enlace isopep ídico se ob u ie on median e cálculos RHF/6-31G* u ilizando GAMESS-
US. La ma iz de Hesse en coo denadas ca esianas se analizó median e el mé odo Semina io,
u ilizando el módulo Ca Hess2FC de AMBER. Las simulaciones de dinámica molecula
(MD) se ealiza on con el so wa e OpenMM [286] en una pla a o ma CUDA con campo de
ue za AMBER 19SB, malla de pa ículas Ewald pa a in e acciones elec os á icas de la go
alcance con un lími e de suma de Ewald de 10 Å y es icción de la longi ud de odos los
enlaces que in oluc an un á omo de hid ógeno. Cada sis ema se sol a ó con moléculas de
agua modelo de agua ígida (OPC) de 4 pun os y 3 ca gas óp imas y se neu alizó con
con aiones de clo o y sodio de acue do con la ca ga o al de la p o eína. En p ime luga ,
cada sis ema se some ió a 2500 pasos de minimización de ene gía a 298 K. Se u ilizó un
e mos a o Lange in pa a con ola la empe a u a con un coe icien e de icción de 1 ps-1 y
un amaño de paso de 0,002 ps. Pa a e alua los mo imien os de esiduos y á omos, cada
sis ema se some ió a una simulación MD de 250 ns y se gua da on ins an áneas de las
ayec o ias cada 1 ps. Finalmen e, el análisis de ayec o ia se ealizó con el módulo
CPPTRAJ de AMBER [229]. Las ep esen aciones g á icas y análisis adicionales se
ealiza on con O iginP o 2019b y g á icos molecula es con UCFS Chime aX.
4.5.7 Cuan i icación de p o eína po SWATH-MS (Sequen ial Window
Acquisi ion o all Theo e ical Mass Spec a) en expe imen os de pull-down.
El análisis se ealizó como lo desc ibió an e io men e nues o g upo [287]. B e emen e, el
mé odo u ilizado incluye: c eación de la biblio eca espec al, cuan i icación ela i a median e
adquisición SWATH, análisis de da os SWATH, análisis espec omé ico de masas median e
LC-MSMS de inmunop ecipi ación de PCK1, de e minación del si io de nedilación, y
análisis de da os p o eómicos. Los da os de p o eómica de espec ome ía de masas se han
deposi ado en Conso cio P o eomeXchange a a és del eposi o io de socios PRIDE con el
iden i icado de conjun o de da os PXD043054.
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
104
4.5.8 De e minación del si io de nedilación.
Los a chi os sin p ocesa adqui idos u ilizando un mé odo DDA se analiza on con el
so wa e PEAKS 8 S udio (Bioin o ma ics Solu ions Inc., Wa e loo, Canadá) u ilizando una
base de da os Unip o de mouse. La ole ancia de masa del pép ido se ajus ó a 10 ppm y 0,01
Da pa a MS/MS. Las modi icaciones a iables incluidas ue on las siguien es: oxidación de
M, ca bamidome ilación de C y Glygly de K (nedilación de cis eínas) como se desc ibió
an e io men e [262, 288, 289].Pa a la iden i icación de pép idos de al a con ianza se u ilizó
una FDR ( asa de descub imien o also) del 1 % y un mínimo de 2 pép idos clasi icados pa a
el il ado de pép idos. El análisis uncional se ealizó median e el so wa e de acceso abie o
FunRich (he amien a de análisis de en iquecimien o uncional) pa a el en iquecimien o
uncional y el análisis de edes de in e acción (h p:// un ich.o g/index.h ml). Pa a las
es adís icas, FunRich u iliza p uebas hipe geomé icas, BH y Bon e oni.
4.6 Análisis es adís ico.
Los da os ob enidos en los expe imen os ue on analizados median e el p og ama es adís ico
P ism So wa e Ve sion 6.0 pa a Windows 10 (G aphPad So wa e, Bos on, Massachuse s
USA, www.g aphpad.com). Los da os apa ecen exp esados como media ± e o es ánda de
la media. El amaño mues al de cada g upo expe imen al apa ece de allado en los pies de
igu a del apa ado Resul ados. Se excluye on las mues as y/o animales cuyo alo se
des iaba más de 2 eces la des iación es ánda (SEM). En odos los análisis, se conside a on
signi ica i os (*) los esul ados con una p<0,05; muy signi ica i os (**) con una p<0,01 y
ex emadamen e signi ica i os (***) con p<0,001.
An es de ealiza el análisis es adís ico, se ealizó un es de no malidad pa a cada se ie de
da os, donde se u ilizó el es Shapi o-Wilks cuando n≥7 y el es de Kolmogo o -Smi no
cuando n<6. En base a lo ob enido es es e es , se aplica on es s pa amé icos (dis ibución
no mal) o no pa amé icos:
❖ P ueba T de s uden . Compa a las medias de dos poblaciones independien es asumiendo
que siguen una dis ibución no mal. En un con as e de hipó esis bila e al (2 colas), se
es udia la desigualdad en e las medias, siendo la egión c í ica del es adís ico ambas
egiones co espondien es a la cola in e io y supe io de la dis ibución. En un con as e
Resul ados
111
Después de un ayuno de 24 h, los a ones en odos los modelos mos a on ni eles educidos
de glucosa en sang e (Figu as 19M-P). Igualmen e, cuando se some ió a RC, ninguno de
es os modelos pudo man ene la glucosa en sang e como lo hicie on los a ones con ol
(Figu as 19Q-T), a pesa de mos a un cu so simila de pé dida de peso du an e la RC (Figu a
19U-X). Consis en emen e, en ayunas (Figu a 19Y) y es icción caló ica (Figu a 19Z), los
a ones con eliminación hepá ica de NAE1 mos a on una educción de la p oducción
hepá ica de glucosa en compa ación con los a ones con ol he manos de camada.

UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
112
Figu a 19. La nedilación es necesa ia pa a man ene los ni eles de glucosa en sang e y no a ec a a la ole ancia a
glucosa o a la sensibilidad a insulina. (A-D), p ueba de ole ancia al pi u a o (PTT), (E-H) p ueba de ole ancia a glucosa
(GTT), y (I-L) p ueba de ole ancia a insulina (ITT) de (i) a ones wild ype (WT) a ados con ehículo o el inhibido de
NAE1 MLN4924, (ii) a ones NAE1+/– o sus he manos de camada de con ol, (iii) a ones Al p- C e+/– inyec ados con
AAV-DIO que exp esan GFP o shNAE1 y (i ) a ones Al p-C e+/– inyec ados con AAV-DIO que exp esan GFP o
shNEDD8. (M-P), ni eles de glucosa en sang e después de un ayuno de 24 h pa a (M) a ones WT a ados con ehículo o
MLN4924, (N) a ones NAE1+/– y sus he manos de camada como con ol, (O) a ones Al p-C e+/– inyec ados con
AAVDIO que exp esa GFP o shNAE1 y (P) Ra ones Al p-C e+/– inyec ados con AAVDIO que exp esan GFP o shNEDD8.
(Q-T), ni eles de glucosa en sang e y (U-X) cambio de peso co po al de a ones some idos a RC del 60% pa a (Q, I) a ones
WT a ados con ehículo o MLN4924, (R, V) a ones NAE1+/– o sus he manos de camada de con ol, (S, W) a ones Al p-
C e+/– inyec ados con AAV-DIO que exp esan GFP o shNAE1 y (T, X) a ones Al p-C e+/– inyec ados con AAV-DIO
que exp esan GFP o shNEDD8. (R-S) P oducción hepá ica de glucosa (HGP) en a ones Al p-C e+/– inyec ados con AAV-
DIO que exp esan GFP o shNAE1 (Y) some idos a RC del 60% o a (Z) ayuno du an e 24h; n = 5–15 po g upo. Los da os
se p esen an como media ± SEM. P ueba no pa eada de dos colas: *P < 0,05, y **P < 0,01.
5.1.3 La inhibición de la nedilación hepá ica educe la p oducción de glucosa de
mane a independien e del sexo.
También es udiamos la nedilación en el hígado de a ones hemb a, encon ando un aumen o
simila en los ni eles de p o eína NAE1 en ayunas (Figu a 20A). Los a ones hemb a con
una eliminación de NAE1 mediada po shRNA (AAV DIO-shNAE1) mos a on una
espues a simila a la de los a ones macho, ya que los ni eles de glucosa en sang e después
24 h de ayuno y el aumen o de los ni eles de glucosa du an e una p ueba de ole ancia al
pi u a o (PTT) ue on más bajos que en los a ones con ol, pe o no después de la
Resul ados
113
adminis ación de glice ol (GlyTT) (Figu a 20B-D), el cual es un sus a o gluconeogénico
que se inco po a a la ía gluconeogénica en pasos pos e io es a PCK1.
En conjun o, es os hallazgos demues an que la nedilación juega un papel impo an e en el
man enimien o de la p oducción de glucosa po el hígado de o ma independien e del sexo.
Figu a 20. La nedilación ambién es necesa ia pa a man ene los ni eles de glucosa en sang e en hemb as. (A) Ni eles
de p o eína de NAE1 en el hígado de a ones hemb a wild ype some idos a ayuno du an e 24h. (n=7-10 po g upo). (B)
P ueba de ole ancia al pi u a o (PTT), (C) P ueba de ole ancia al glice ol (GlyTT) y (D) ni eles de glucosa en ayunas
después de 24 h en a ones hemb a Al p-C e+/- inyec ados con AAV-DIO-GFP o AAV-DIO-shNAE1 (n=6-18 po g upo).
La exp esión de GAPDH si ió como con ol de ca ga y los alo es de con ol se no maliza on al 100%. Los da os se
p esen an como media ± SEM; P ueba no pa eada de dos colas: *P<0,05, Y **P<0,01.
5.1.4 La inhibición de la nedilación hepá ica no modi ica los ni eles de p o eínas
de enzimas gluconeogénicas o ace il-CoA.
Dado que la inhibición de la nedilación en el hígado disminuyó la capacidad gluconeogénica,
medimos la exp esión de enzimas gluconeogénicas cla e y ace il-CoA en el hígado de dos
modelos animales de de e io o de la nedilación: i) inhibición a macológica usando
MLN4924; y ii) a ones con una eliminación de NAE1 mediada po shRNA. Some imos a
es os a ones a 24 ho as de ayuno y es icción caló ica, y, como e a de espe a , los ni eles
de p o eína de pi u a o ca boxilasa (PC), glucosa 6- os a asa (G6Pasa) y os oenolpi u a o
ca boxiquinasa 1 (PCK1) aumen a on en el hígado de los a ones en ayunas y some idos a
es icción caló ica (Figu a 21A, B, G, H). Sin emba go, no hubo di e encias en e los a ones
a ados con ehículo y MLN4924 o en e los a ones con ol y a ones shNAE1 (Figu a 21A-
H). De mane a simila , no se de ec a on di e encias en los ni eles hepá icos de ace il CoA
después de la inhibición de la nedilación (Figu a 21A, B, G, H).
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
114
Man ene la homeos asis de la glucosa equie e una espues a con a egulado a e icien e de
la inges a/p oducción de glucosa. Po lo an o, ambién medimos los ni eles ci culan es de
ho monas implicadas en la espues a con a egulado a de la glucosa, es o es, ad enalina,
glucagón y co icos e ona, en los modelos desc i os an e io men e. No se encon a on
cambios en e los a ones de con ol y aquellos animales donde se a enuó la nedilación
(Figu a 21C, D, I, J). Los ni eles de insulina se eduje on en a ones a ados con shNAE1
en ayunas (Figu a 21D), sin cambios en los o os modelos expe imen ales (Figu a 21C, I, J).
Todo ello sugie e que la inhibición de la nedilación hepá ica no modi ica los ni eles de
ho monas con a egulado as.
Finalmen e, ambién se midió el con enido de alanina y los ni eles de aminoácidos o ales en
el hígado, así como los ni eles de aminoácidos sé icos, en los dos modelos animales de
a enuación de la nedilación desc i os an e io men e, some idos a 24 ho as de ayuno o a
es icción caló ica (Figu as 21E, F, K, L). Es as mediciones no de ec a on di e encias en el
con enido hepá ico de alanina o aminoácidos o ales y los ni eles plasmá icos de aminoácidos
o ales en e los dos modelos animales some idos a ayuno 24h y a es icción caló ica,
excep o pa a los a ones a ados con MLN4924 y los a ones donde NAE1 se silenció en el
hígado y se ayuna on du an e 24 ho as, donde se encon a on ni eles más al os de
aminoácidos en el hígado (Figu as 21E y F). Como los aminoácidos son impo an es sus a os
gluconeogénicos du an e el ayuno y la es icción caló ica, es os esul ados indican que la
educción de la p oducción de glucosa cuando se al e a la nedilación hepá ica no depende de
la disponibilidad de aminoácidos.
Resul ados
115
Figu a 21. La inhibición de la nedilación hepá ica no a ec a los ni eles ci culan es de ho monas con a egulado as
de la glucosa. Ni eles de p o eína hepá ica de pi u a o ca boxilasa (PC), os oenolpu i a o ca boxiquinasa 1 (PCK1) y
glucosa 6- os asa (G6Pasa) y ni eles de ace il-CoA en el hígado; ni eles sé icos de epine ina, glucagón, co icos e ona e
insulina; y con enido de alanina hepá ica y aminoácidos sé icos e hepá icos en a ones WT después de la adminis ación de
ehículo o MLN4924 y luego (A, C, E) en ayunas du an e 24 h, o (G, I, K) some idos a es icción caló ica; y en a ones
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
116
Al p C e+/- inyec ados con AAV-DIO-GFP o AAV-dioshNAE1 some idos a (B, D, F) ayuno de 24 h y (H, J, L) es icción
caló ica. n = 4-8 animales po g upo. La exp esión de GAPDH si ió como con ol de ca ga y los alo es de con ol se
no maliza on al 100%. Los da os se p esen an como media ± SEM; ANOVA unidi eccional seguido de la p ueba pos hoc
de Bon e oni (paneles izquie dos A, B, G y H) y la p ueba no pa eada de dos colas (A-L): *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P
< 0,001.
5.2 La nedilación hepá ica egula la acción de las ho monas con a egulado as.
Dado que nues os esul ados indican que la gluconeogénesis se al e a cuando se inhibe la
nedilación hepá ica, que íamos es udia en de alle si la nedilación es aba in oluc ada en la
espues a con a egulado a de la glucosa.
Pa a esol e es o, a amos nues os cua o modelos de nedilación al e ada con glucagón,
ad enalina o glucoco icoides, ho monas que es imulan la gluconeogénesis. En a ones
no males, es a adminis ación p o ocó las acciones hipe glucémicas espe adas (Figu a 22),
con ni eles egulados al alza de NAE1 y NEDD8 y cullins nediladas en el hígado (Figu as
23B, D, F). Po el con a io, la de iciencia de nedilación a enuó signi ica i amen e los e ec os
hipe glucémicos del a amien o ho monal en cada uno de los cua o modelos (Figu a 22).
Po an o, la nedilación media la acción de las ho monas con a egulado as de la glucosa y
es necesa ia pa a la p oducción de glucosa hepá ica.

Resul ados
117
Figu a 22. La nedilación es necesa ia pa a la acción gluconeogénica de las ho monas con a egulado as. (A – D),
Glucosa en sang e después de la adminis ación in ape i oneal (ip) de solución salina o glucagón (200 μg kg –1) pa a (A)
a ones WT a ados con ehículo o MLN4924, (B) NAE1+/– a ones o sus compañe os de camada como con ol, (C)
a ones Al p-C e+/– inyec ados con AAV-DIO que exp esan GFP o shNAE1 y (D) a ones Al p-C e+/– inyec ados con
AAV-DIO que exp esan GFP o shNEDD8. (E – H), Ni eles de glucosa en sang e después de la adminis ación i.p.
adminis ación de solución salina o ad enalina (100 μg kg-1) pa a I) a ones WT a ados con ehículo o MLN4924, (F)
NAE1+/– y sus compañe os de camada de con ol, (G) a ones Al p-C e+/– inyec ados con AAVDIO que exp esa GFP o
shNAE1 y (H) a ones Al p-C e+/– inyec ados con AAVDIO que exp esa GFP o shNEDD8. (I – L), glucosa en sang e
después de la adminis ación i.p. adminis ación de solución salina o hid oco isona (20 mg kg–1) pa a (I) a ones WT
a ados con ehículo o MLN4924, (J) a ones NAE1+/– o sus compañe os de camada de con ol, (K) a ones Al p-C e+/–
inyec ados con AAV-DIO que exp esa GFP o shNAE1 y (L) a ones Al p-C e+/– inyec ados con AAV-DIO que exp esa
cualquie a de los dos GFP o shNEDD8; n = 3–10 po g upo. Los da os se p esen an como media ± SEM; ANOVA
unidi eccional seguido de p ueba pos hoc de Bon e oni: *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001. # deno a di e encias en e
los di e en es g upos de animales a ados con la misma ho mona gluco egulado a.
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
118
Los ni eles de enzimas gluconeogénicas y ace il-CoA ue on simila es en a ones cuya
nedilación ue inhibida a macológicamen e y en a ones con una desac i ación de NAE1
mediada po shRNA a ados con glucagón, ad enalina o glucoco icoides (Figu a 23I-T),
excep o en los a ones a ados con ad enalina y MLN4924 que mos a on ni eles más bajos
de ace il-CoA (Figu a 23N). Es o sugie e que, en gene al, la nedilación no egula los ni eles
de p o eínas de las enzimas gluconeogénicas ni la disponibilidad de ace il-CoA.
Resul ados
119
Figu a 23. Las ho monas con a egulado as de la glucosa inducen la nedilación en el hígado. Ra ones WT a ados
con solución salina o glucagón (A) pa a ni eles de glucosa en sang e; (B) ni eles de p o eína hepá ica de NAE1, NEDD8 y
cullins nedilados. Ra ones WT a ados con salino o ad enalina (C) ni eles de glucosa; (D) ni eles de p o eína hepá ica de
NAE1, NEDD8 y cullins nediladas. Ra ones WT a ados con salino o hid oco isona (E) ni eles de glucosa en sang e; (F)
ni eles de p o eína hepá ica de NAE1, NEDD8 y cullins nediladas. (G) Peso co po al y (H) ni eles de p o eína PCK1 en
a ones WT alimen ados con STD o HFD al 60% du an e 4 días. Ni eles de p o eína de (I) pi u a o ca boxilasa (PC),
os oenolpu i a o ca boxiquinasa 1 (PCK1) y glucosa 6- ni eles de p o eína hepá ica de os a asa (G6Pasa), y ni eles
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
120
sé icos de (J) ace il-CoA en a ones WT a ados con ehículo o MLN4924 y luego con salino o glucagón (200 μg kg-1).
(K) Ni eles de p o eína hepá ica PC, PCK1 y G6Pasa y (L) ni eles sé icos de ace il-CoA en a ones Al p-C e inyec ados
con AAV-DIO-GFP o AAV-DIO-shNAE1 y luego con salino o glucagón (200 μg kg-1). (M) Ni eles de p o eína hepá ica
PC, PCK1 y G6Pasa y (N) ni eles sé icos de ace il-CoA en a ones WT a ados con ehículo o MLN4924 y luego con
salino o ad enalina (100 μg kg-1). (O) ni eles de p o eína hepá ica PC, PCK1 y G6Pasa y (P) ni eles sé icos de ace il-CoA
en Al p-Ra ones C e inyec ados con AAV-DIO-GFP o AAV-DIO-shNAE1 y luego con salino o ad enalina (100 μg kg-1).
(Q) Ni eles de p o eína hepá ica de PC, PCK1 y G6Pasa y (R) ni eles sé icos de ace il-CoA en a ones WT ehículo a ado
o MLN4924 y luego con salino o hid oco isona (20 mg kg-1). (S) Ni eles de p o eína hepá ica de PC, PCK1 y G6Pasa y
(T) ni eles sé icos de ace il-CoA en a ones Al p-C e inyec ados con AAV-DIOGFP o AAV-DIO-shNAE1 y luego con
salino o hid oco isona (20 mg kg-1). n = 4-12 animales po g upo. La exp esión de GAPDH si ió como con ol de ca ga
y los alo es de con ol se no maliza on al 100%. Los da os se p esen an como media ± SEM; P ueba no pa eada de dos
colas: *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001.
5.3 La nedilación hepá ica es á asociada con la esis encia a la insulina.
5.3.1 La inhibición de la nedilación educe la hipe glucemia inducida po una
die a al a en g asas.
A con inuación, e aluamos si la inhibición de la nedilación pod ía disminui la esis encia a
la insulina. La insulina inhibe la p oducción de glucosa en el hígado, y es a acción se usa
ampliamen e pa a medi la unción de la insulina hepá ica [293]. Pa a es o, alimen amos a
a ones con una die a al a en g asas (HFD) po un co o plazo (4 días), lo que empeo ó la
sensibilidad a la insulina hepá ica y es imuló la p oducción de glucosa hepá ica sin p oduci
cambios signi ica i os en el peso co po al, (Figu a 23G-H) [294, 295]. Nues os esul ados
mos a on que los a ones en las cua o condiciones de inhibición de la nedilación mos a on
ni eles educidos de glucosa du an e el PTT después de 4 días con HFD (Figu as 24A–D).
Es os esul ados indica on que el bloqueo de la nedilación mejo ó la gluconeogénesis
inducida po HFD.
A con inuación, ealizamos un expe imen o de ganancia de unción sob eexp esando NAE1
(AAV-DIO-NAE1) en el hígado ( a ones li NAE1). Es os a ones man u ie on el mismo
peso que los a ones de con ol, pe o mos a on una mayo capacidad pa a con e i pi u a o
en glucosa sin cambios en la ole ancia a la glucosa o la sensibilidad a la insulina en
compa ación con los a ones de con ol (Figu a 24E-J). Además, los a ones li NAE1
ambién mos a on ni eles de glucosa más al os que los a ones de con ol du an e el ayuno
de 24 h (Figu a 24K) y después del a amien o agudo con insulina (Figu a 24L), lo que
sugie e que la ac i ación de la nedilación en el hígado a o ece la p oducción de glucosa
hepá ica e impide las acciones hipoglucemian es de la insulina.
Resul ados
127
ansgenes y los cebado es de PCR u ilizados pa a el geno ipado se indican en los ma e iales y sección de mé odos. El a ón
Bi A de con ol exp esa únicamen e la enzima bac e iana Bi A, mien as que los a ones bioNedd8 exp esan un único
polipép ido que codi ica un pép ido nedilado e ique ado usionado con Bi A. En los a ones BioNEDD8, la enzima Bi A
media la bio inilación de NEDD8 con la e ique a que acep a bio ina. Luego, el NEDD8 bio inilado se inco po a a los
conjugados. (B) Análisis de ans e encia Wes e n de bio ina y NEDD8 que mues a un aumen o de la mancha en los a ones
bioNEDD8 en elación con bi A, an o de en ada como de descenso (PD). (C) Cambio de peso co po al y ni eles de glucosa
en sang e en a ones WT y a ones BioNEDD8 alimen ados ad libi um o some idos a una es icción caló ica del 60%
du an e 4 días. n = 4-5 animales po g upo. (D) Ni eles de NEDD8 en las acciones de en ada, lujo y elución del IP. (E)
G á ico ci cula que mues a el po cen aje de p o eínas nediladas de las p o eínas hepá icas o ales iden i icadas en a ones
bionedd8, según lo de e minado po p o eómica LC-MS/MS (n = 4 o 5). (F) Análisis de en iquecimien o uncional
PANTHER de p o eínas nediladas en el hígado. Nedilación de PCK1 du an e una es icción caló ica de 4 días (del 60%)
(G) o ayuno de 24 h (H), como lo mues a la inmuno ans e encia después de la inmunop ecipi ación de PCK1. (I) Ni eles
de p o eínas PCK1 y NEDD8 as la inmunop ecipi ación de PCK1 en a ones WT as la adminis ación de ehículo o
MLN4924 y some idos a es icción caló ica (RC) y ayuno de 24 h. (J-K) Ni eles de p o eína PCK1 y NAE1 después de la
inmunop ecipi ación de PCK1, y ni eles de p o eína NAE1 ela i izados a PCK1 inmunop ecipi ada, de hígados de a ones
alimen ados ad libi um o some idos a una es icción caló ica de 4 días (del 60%) (J) o 24 -h ayuno (K). (L) Ni eles de
p o eínas NEDD8 y Cullin2 después de la inmunop ecipi ación de cullin2 en a ones WT some idos a es icción caló ica
(RC) y ayuno de 24 h. Los da os se p esen an como media ± SEM; ANOVA unidi eccional seguido de la p ueba pos hoc
de Bon e oni *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001.
5.4.2 PCK1 es á nedilado en es lisinas después de es icción caló ica y ayuno.
El análisis STRING del in e ac oma uncional después de la inmunop ecipi ación de PCK1
comp endió 1631 p o eínas en la condición de ayuno de 24 h y 1142 en la condición RC, con
968 de ellas comunes a ambas condiciones. Además, an o en RC como en ayuno 24h,
apa ecen un g upo de p o eínas implicadas en nedilación (indicadas en ojo; Figu a 27A).
Pa a iden i ica si ios de modi icación en PCK1 que po encialmen e pod ían se si ios de
nedilación, p ime o inmunop ecipi amos PCK1 del hígado de a ones alimen ados ad libi um
o some idos a ayuno y luego ealizamos análisis LC-MS/MS. El análisis ealizado po el
so wa e PEAKS de los espec os pep ídicos de PCK1 e eló que es lisinas PCK1 es aban
po encialmen e nediladas en condiciones de ayuno: K278, K342 y K387 (Figu a 27B). Pa a
de e mina cómo la nedilación pod ía a ec a la ac i idad de PCK1, analizamos sus e ec os
sob e la es uc u a, p es ando especial a ención a los esiduos nedilados. Pa a ob ene
in o mación sob e las consecuencias es uc u ales y dinámicas de la nedilación de PCK1,
ealizamos simulaciones de dinámica molecula de PCK1 en di e en es condiciones: i) no
nedilada, ii) mononedilada, iii) binedilada o i ) inedilada (Figu a 27D). Los es esiduos
de lisina se dis ibuyen po la supe icie de la enzima y odos e an accesibles al disol en e
(Figu a 27E). El análisis de ayec o ia e eló que la nedilación de PCK1 a ec ó
p incipalmen e a las luc uaciones a ómicas y a la posición de los bucles 95-118 y 460-470,
que odean la ca idad enzimá ica y el cen o ca alí ico. La mononedilación en K387 indujo

UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
128
la mayo pe u bación de la hendidu a enzimá ica, ab iéndola y pe mi iendo la en ada de
Mn2+ en el cen o ca alí ico de PCK1, un paso c í ico pa a la ac i idad de es a enzima (Figu as
27C-27E). Es de des aca que K387 es la lisina más conse ada a lo la go de la e olución de
las es lisinas y es á p esen e en odas las secuencias de PCK1 que analizamos, en una amplia
gama de especies, desde micobac e ias has a mamí e os (Figu a 28A). El hecho de que se
man enga an conse ada a lo la go de la e olución deja en e e su impo ancia biológica.
Resul ados
129
Figu a 27. PCK1 es á nedilada en es lisinas después de la es icción caló ica y el ayuno y es a modi icación al e a
su es uc u a. (A) Análisis de asociación uncional pa a la inmunop ecipi ación de PCK1 en condiciones de alimen ación
ad libi um, es icción caló ica (RC) y ayuno. Los cí culos ojos mues an p o eínas elacionadas con la nedilación. (B)
PCK1 inmunop ecipi ado se some ió a análisis de espec ome ía de masas. Se mues an posibles si ios modi icados. K*,
modi icado con GG. (C) Es uc u as p omedio de PCK1 (izquie da, oli a) y PCK1-K387-NEDD8 (de echa, ojo) después
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
130
de una simulación de dinámica molecula . La nedilación de PCK1 al e a la dinámica y la con o mación de los bucles 95–
118 y 460–470 (líneas discon inuas cian). Vis a en p o undidad de la abe u a de la g ie a de la p o eína as la nedilación
de PCK1 que hace que el ion Mn2+ sea accesible al sus a o. (D) Supe icies p omedio de PCK1 nedilada después de
simulación de dinámica molecula . Las es uc u as es án alineadas con espec o al módulo PKC1 en una o ien ación que
pe mi e isualiza has a es moléculas de NEDD8 po PKC1. (E) Rep esen ación en cin a de la es uc u a PCK1 de
M.musculus con si ios de nedilación iden i icados colo eados en azul oscu o. Los bucles 95–118 y 460–470 es án esal ados
en cian, y el ion Mn2+, en e de cla o.
Figu a 28. Filogénesis de las es lisinas de PCK1 que pueden se nediladas. (A) Alineamien o de secuencia múl iple
CLUSTAL de las egiones que lanquean los esiduos K278, K342 y K387 y el á bol ilogené ico de la p o eína PCK1. Se
indican los pun os de la e olución donde apa ecen po p ime a ez las lisinas.
5.4.3 La nedilación de PCK1 en sus esiduos K278, K342 y K387 es necesa ia
pa a su ac i idad gluconeogénica in i o.
Finalmen e, pa a comp ende mejo las consecuencias uncionales de la nedilación de PCK1,
silenciamos NAE1 y NEDD8 y luego incubamos los hepa oci os en un medio sin nu ien es
(pa a c ea una condición de ayuno in i o). Las células en ayunas enían una mayo
ac i idad de PCK1; po el con a io, la inhibición de NAE1 y NEDD8 bloqueó la ac i idad
de PCK1 inducida po el ayuno, con ni eles concomi an es de glucosa más bajos en el medio
(Figu a 29A-C y Figu a 30A-C). Es os esul ados ambién se co obo a on in i o: la
inhibición de NAE1 en el hígado disminuyó la ac i idad de PCK1 en a ones en es icción
Resul ados
131
caló ica (Figu a 29D). En línea con es os hallazgos, y al igual que con la p o eómica y el
modelado, encon amos que mu a los es esiduos de lisina de PCK1 al mismo iempo (p.
ej., K278, K342 y K387) o K387 no al e ó los ni eles de p o eína de PCK1, pe o edujo su
ac i idad y los ni eles de glucosa en el medio (Figu a 30D-F). Consis en emen e, la
ac i idad y la p oducción de glucosa podían es au a se en hepa oci os ayunados e inhibidos
po PCK1 al sob eexp esa PCK1 wild ype pe o no al sob eexp esa el iple mu an e de
PCK1 o el mu an e único de PCK1, K387R (Figu a 30D-F), lo que esal a la ele ancia de la
nedilación en es os esiduos de lisina pa a la ac i idad enzimá ica de PCK1 y, po an o, de
sus unciones gluconeogénicas.
Es impo an e des aca que los ni eles de p o eína de PCK1 se ele a on de mane a simila
en los mu an es y de PCK1 wild ype (Figu a 30F), lo que espalda que la nedilación de
PCK1, y no sus ni eles de p o eína o al, son los que modulan su ac i idad.
Dado que o as modi icaciones además de la nedilación pueden modi ica es as lisinas e
incluso o os esiduos po enciales de PCK1 pod ían nedila se y no de ec a se, epe imos los
expe imen os a ando nues os di e en es g upos expe imen ales in i o con MLN4924,
pa a es udia cualquie posible e ec o adi i o o siné gico, lo cual es c í ico especialmen e en
ausencia de ensayos que e alúen la nedilación de los mu an es PCK1. Como al, los
hepa oci os se a a on con ehículo o MLN4924 en condiciones de depleción de nu ien es
(medio KHH du an e 6 ho as). Los esul ados indica on que, como se espe aba, el
silenciamien o de PCK1 edujo los ni eles de p o eína y la ac i idad de PCK1 y la libe ación
de glucosa en el medio. El esca e de PCK1-WT es au ó los ni eles de p o eína y la ac i idad
de PCK1 y aumen ó la sec eción de glucosa en el medio (Figu a 30G-I). Sin emba go, el
a amien o con MLN4924 disminuyó la ac i idad de PCK1-WT, impidiendo la libe ación
de glucosa al medio (sin cambios en los ni eles de p o eína PCK1) (Figu a 30G-I). Siguiendo
el mismo p ocedimien o expe imen al, los hepa oci os que exp esan el PCK1 mu an e iple
o el PCK1 mu an e único (K387R) ambién se a a on con ehículo o MLN4924. Los
esul ados indican que el mu an e iple o el mu an e único PCK1 (K387R) no pudie on
es au a la ac i idad de PCK1 o los ni eles de glucosa y, po lo an o, MLN4924 no causó
ningún e ec o (Figu a 30J-O). Es os hallazgos indican que las mu aciones en es esiduos de
lisina de PCK1 al mismo iempo (K278, K342 y K387) son ele an es pa a man ene la
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
132
capacidad gluconeogénica de PCK1, y que si PCK1 es á nedilada en o os esiduos di e en es
a K278, K342 y K387, no es án in oluc ados o no son esenciales pa a la ac i idad
gluconeogénica de PCK1, ya que el a amien o con MLN4924 en siPCK1 + pPCK1 K278R-
K342R-K387R no u o un e ec o adi i o o siné gico, es deci , MLN4924 no edujo aún más
la p oducción de glucosa o la ac i idad de PCK1 en esas células.
Figu a 29. La ac i idad de PCK1 y la concomi an e p oducción de glucosa se en educidas al inhibi la nedilación.
(A) Ac i idad de PCK1 y (b) p oducción de glucosa en células AML12 ans ec adas con siRNA acío o siRNA NEDD8 y
48 h más a de man enidas en medio comple o o KHH du an e 6 h. (C) También se mues a la co elación en e la p oducción
de glucosa y la ac i idad de PCK1 en es as células. (D) Ac i idad de PCK1 en el hígado de a ones Al p-C e +/- inyec ados
con AAV-DIO que exp esa GFP o shNAE1. n = 5-6 po g upo. Los da os se p esen an como media ± SEM; p ueba no
pa eada de dos colas (C y E) o ANOVA unidi eccional seguida de p ueba pos hoc de Bon e oni (B): *P<0,05, **P<0,01
y ***P<0,001.

Resul ados
133
Figu a 30. La nedilación de PCK1 en sus esiduos K278, K342 y K387 es necesa ia pa a su ac i idad gluconeogénica
in i o. (A) Ac i idad de PCK1 y (B) p oducción de glucosa en células AML12 ans ec adas con siRNA acío o siRNA
con a NEDD8 y 48 h más a de man enidas en medio comple o o KHH du an e 6 h. (C) También se mues a la co elación
en e la p oducción de glucosa y la ac i idad de PCK1 en es as células. (D) ac i idad de PCK1, (E) p oducción de glucosa
y (F) ni eles de p o eína de PCK1 en células AML12 man enidas en medio comple o o KHH y ans ec adas con siRNA
acío codi icado, siRNA-PCK1, con ol de plásmido, un plásmido que codi ica el ipo sal aje. PCK1 o un plásmido que
codi ica PCK1 con mu ación iple o simple (pPCK1-K278R-K342R-K387R o pPCK1-K387R). (G-O) Ac i idad de PCK1,
p oducción de glucosa y ni eles de p o eína de PCK1 en células AML12 en las mismas condiciones que an es y a adas
con MLN4924. no e = 5-6. La exp esión de GAPDH si ió como con ol de ca ga y los alo es de con ol se no maliza on
al 100%. Los da os se p esen an como media ± SEM; P ueba no pa eada de dos colas (B) y ANOVA unidi eccional seguida
de p ueba pos hoc de Bon e oni (A, D – O): *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001.
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
134
5.4.4 La nedilación de PCK1 en sus esiduos K278, K342 y K387 es la esponsable
de la p oducción hepá ica de glucosa in i o.
Pa a demos a la ele ancia in i o de PCK1 nedilado en los es esiduos desc i os
an e io men e, silenciamos PCK1 en el hígado de a ones adul os inyec ando un i us AAV-
C e en la ena de la cola de a ones PCK1 loxP (PCK1 LKO). Luego, en es os a ones
inyec amos AAV-DIOPCK1w pa a esca a la exp esión de PCK1 hepá ico de ipo sal aje
o un i us AAV-DIO-PCK1mu pa a sob eexp esa el iple mu an e PCK1 (K278R-K342R-
K387R) en el hígado. La deleción de PCK1 en el hígado de a ones adul os edujo los ni eles
de glucosa as la adminis ación de pi u a o mien as que el esca e de PCK1 de ipo sal aje
no malizó los ni eles de glucosa du an e el PTT, sin cambios en la ole ancia a la glucosa o
la sensibilidad a la insulina (Figu a 31A-D). Luego some imos a es os a ones a un ayuno
du an e 24 ho as y descub imos que el esca e de PCK1 de ipo sal aje mos aba ni eles más
al os de glucosa y p oducción de glucosa hepá ica (HGP) que los a ones PCK1 KO hepá ico
(Figu a 31E). Sin emba go, la exp esión hepá ica del iple mu an e PCK1 en a ones en los
que PCK1 ue p e iamen e inac i ado (Figu a 31F), no no malizó los ni eles de glucosa
du an e la PTT sin cambios en GTT e ITT (Fig. 31G-I). Pa a co obo a aún más nues os
esul ados, ambién some imos a nues os a ones a una p ueba de ole ancia al glice ol, ya
que el glice ol e i a la ac i idad de PCK1, ya que se inco po a a la ía gluconeogénica en
pasos pos e io es. Como se mues a en la Figu a 20C y en la Figu a 31J, no hubo di e encias
en la p oducción de glucosa después de la adminis ación de glice ol en e los di e en es
g upos, lo que des aca que la capacidad gluconeogénica de es os a ones se al e a
especí icamen e po la ac i idad de PCK1. Finalmen e, cuando se some ie on a un ayuno de
24 ho as, los a ones que exp esaban el iple mu an e PCK1 no pudie on aumen a la
glucemia o la p oducción de glucosa hepá ica, mos ando ni eles de glucosa en sang e
simila es a los de los a ones PCK1 KO hepá icos (Figu a 31K).
Resul ados
135
Figu a 31. La nedilación de PCK1 es necesa ia pa a su unción gluconeogénica in i o. (A) Ni eles de p o eína PCK1,
(B) p ueba de ole ancia a la glucosa (GTT), (C) p ueba de ole ancia a la insulina (ITT), (D) p ueba de ole ancia al pi u a o
(PTT), (E) ni eles de glucosa en sang e du an e ayuno de 24 ho as y p oducción de glucosa hepá ica (HGP) en a ones
con ol, a ones que ca ecen de PCK1 en el hígado (PCK1 LKO) ( a ones PCK1 loxP inyec ados con AAV-C e en la ena
de la cola) y PCK1 LKO inyec ados con AAVPCK1 wild ype (WT). (F) Ni eles de p o eína PCK1, (G) GTT, (H) ITT, (I)
PTT, (J) p ueba de ole ancia al glice ol (GlyTT), (K) ni eles de glucosa en sang e du an e ayuno de 24 ho as y p oducción
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
136
de glucosa hepá ica en a ones de con ol, PCK1 LKO y PCK1 LKO inyec ado con iple mu an e AAV-PCK1 (n = 5-10
animales po g upo). La exp esión de GAPDH si ió como con ol de ca ga y los alo es de con ol se no maliza on al
100%. Los da os se p esen an como media ± SEM; ANOVA unidi eccional seguido de p ueba pos hoc de Bon e oni: *P
< 0,05 y ***P < 0,001. # Deno a di e encias en e los a ones PCK1 LKO + AAV-PCK1 WT y PCK1 LKO + AAV-PCK1-
K278R-K342R-K387R.
Discusión
143
desa ollo de e apias di igidas a es as condiciones. Con espec o a la exp esión de PCK1 en
la diabe es ipo 2, la li e a u a exis en e mues a da os di e en es, ya que algunos han
demos ado que no había elación en e la hipe glucemia en ayunas y la exp esión de la
p o eína PCK1 [313], mien as que o os de ec a on una mayo exp esión de PCK1 en a ones
diabé icos [314, 315]. En línea con es o, pa a a e igua si la sob eexp esión de PCK1 en el
hígado p o oca hipe glucemia y diabe es ipo 2, Vale a y colabo ado es gene a on a ones
ansgénicos que sob eexp esaban PCK1-c en el hígado [172]. Es os a ones e an
hipe glucémicos e hipe insulinémicos, y enían una disminución del con enido de glucógeno
hepá ico y de los ni eles de ARNm de GLUT-4 en el músculo, odo lo cual sugie e esis encia
a la insulina. Es a idea ha sido espaldada po es udios de clamp euglucémicos-
hipe insulinémicos, en los que la sob eexp esión de PCK1 p o ocó un aumen o del HGP y
la disminución de la capacidad de la insulina pa a sup imi la gluconeogénesis [316]. Po
o o lado, en 2003, Duplus y colabo ado es desc ibie on una población de pacien es obesos
con diabe es ipo 2 con un polimo ismo de un solo nucleó ido (SNP) en las posiciones -1097
y -967 pb del p omo o de PCK1 que se co elacionaba con los ni eles de glucosa en sang e
[317]. El caso opues o ue ilus ado po Pe ales y colabo ado es [318], quienes u iliza on el
silenciamien o del ARN de PCK1 pa a sup imi la exp esión de PCK1 en a ones diabé icos,
lo que esul ó en la mode ación de la hipe glucemia. En conjun o, es os es udios es ablecen
a PCK1 como gen posiblemen e implicado en el desa ollo de la diabe es, y, el hecho de que
es a p o eína necesi e es a nedilada, como se explica a lo la go de es a esis, pa a que su
ac i idad gluconeogénica sea plena, ab e las pue as pa a nue as ías de in es igación con la
nedilación de PCK1 como diana pa a el a amien o de la diabe es ipo 2.
Cie amen e, la egulación de la unción de PCK1 es bas an e compleja y los a iados
eno ipos expe imen ales en a ones han sido ampliamen e discu idos [167]. Aunque nues os
esul ados iden i ican la nedilación de PCK1 como un nue o mecanismo pa a egula la
homeos asis de la glucosa en oedo es, una limi ación del p esen e abajo es que no
in es igamos si las mu aciones desc i as en los si ios nedilados de PCK1 ambién son
ele an es en humanos y si es as mu aciones es án elacionadas con la diabe es ipo 2
humana. Más es udios gené icos en pe sonas con diabe es ipo 2 debe ía dilucida es os
aspec os. De hecho, nues o abajo no excluye que o as p o eínas ambién puedan se
nediladas en ayuno o es icción caló ica. En ealidad, nues o en oque p o eómico de ec ó

Bibliog a ía
144
más p o eínas que es aban nediladas en esas condiciones. Po lo an o, se á necesa ia más
in es igación pa a dilucida el papel uncional en la gluconeogénesis de o as p o eínas
nediladas.
Tomando odos nues os esul ados en conjun o, en la p esen e esis se desc ibe un nue o
papel de la nedilación en la egulación de la homeos asis de la glucosa, an o en condiciones
isiológicas como pa o isiológicas, in oluc ándose en el desa ollo de la diabe es ipo 2 en
humanos. De es e modo, PCK1 y su egulación eme gen como piezas cla e en el
ompecabezas del me abolismo, desempeñando un papel c ucial en la sín esis de glucosa y
en la egulación del me abolismo ene gé ico. Su es udio con inuo o ece posibilidades pa a
el a ance en la comp ensión y a amien o de di e sas en e medades me abólicas. En
de ini i a, nues os esul ados e elan un nue o mecanismo que pa icipa en el con ol
p eciso de la homeos asis de la glucosa en odo el cue po, asociando la espues a de la
nedilación de PCK1 y su ac i idad gluconeogénica a la disponibilidad de nu ien es.
CONCLUSIONES
UXÍA FERNÁNDEZ PAZ
146
7. CONCLUSIONES
Los esul ados ob enidos du an e la ealización de es a esis nos pe mi en es ablece las
siguien es conclusiones:
• Los ni eles hepá icos de las p incipales p o eínas implicadas en la nedilación
(NAE1 y NEDD8) es án ue emen e egulados po el es ado nu icional,
aumen ando du an e el ayuno y disminuyendo as la inges a.
• La nedilación en el hígado es undamen al pa a la gluconeogénesis y al e aciones
de es e p oceso p o ocan una disminución de la p oducción hepá ica de glucosa.
• El glucagón, la ad enalina y los glucoco icoides inducen un inc emen o de la
nedilación en el hígado y equie en que PCK1 sea nedilado pa a induci sus
acciones gluconeogénicas.
• El bloqueo de la nedilación mejo a el pe il glucémico en si uaciones de esis encia
a insulina.
• En el hígado de los pacien es con diabe es ipo 2 se encuen a un inc emen o en los
ni eles de p o eína de NAE1, NEDD8 y cullins nediladas.
• PCK1 debe nedila se en sus lisinas K278, K342 y K387 pa a eje ce su ac i idad
gluconeogénica, y mu aciones en es os esiduos p o ocan una disminución en la
ac i idad enzimá ica de PCK1 y, po ende, de la p oducción hepá ica de glucosa.
• En su conjun o, es os esul ados demues an la iden i icación de un nue o
mecanismo biológico de g an ele ancia en el con ex o de la homeos asis
me abólica, y más conc e amen e en el de la glucemia.
BIBLIOGRAFÍA
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