Papel de la nedilación de PCK1 en la gluconeogénesis hepática

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Uxía Fernández Paz Tesis doctoral Papel de la nedilación de PCK1 en la gluconeogénesis hepática Santiago de Compostela, 2024 Programa de doctorado en Endocrinología 1 TESIS DOCTORAL PAPEL DE LA NEDILACIÓN DE PCK1 EN LA GLUCONEOGÉNESIS HEPÁTICA UXÍA FERNÁNDEZ PAZ Directores: Rubén Nogueiras Pozo Carlos Diéguez González PROGRAMA DE DOCTORADO EN ENDOCRINOLOGÍA SANTIAGO DE COMPOSTELA AÑO 2024 2 DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERESES Doña Uxía Fernández Paz Declora no tener ningún conflicto de interés en relación con la Tesis Doctoral titulada: PAPEL DE LA NEDILACIÓN DE PCK1 EN LA GLUCONEOGÉNESIS HEPÁTICA 3 Resumen La nedilación es un mecanismo postraduccional que agrega una proteína similar a la ubiquitina, a saber, la proteína 8 regulada negativamente durante el desarrollo expresada por células precursoras neurales (NEDD8). En este trabajo mostramos en ratones que la nedilación en el hígado está modulada por la disponibilidad de nutrientes. La inhibición de la nedilación en el hígado de ratón reduce la capacidad gluconeogénica y las acciones hiperglucémicas de las hormonas contrarreguladoras. Además, las personas con diabetes tipo 2 presentan niveles elevados de nedilación hepática. A nivel mecanístico, el ayuno o la restricción calórica de ratones conduce a la nedilación de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa 1 (PCK1) en tres residuos de lisina: K278, K342 y K387. Encontramos que la mutación de las tres lisinas PCK1 que están nediladas reduce su tasa de actividad gluconeogénica. Las simulaciones de dinámica molecular muestran que la nedilación de PCK1 podría reposicionar dos bucles que rodean el centro catalítico en una configuración abierta, haciendo que el centro catalítico sea más accesible. Nuestro estudio revela que la nedilación de PCK1 proporciona un mecanismo preciso para controlar el metabolismo de la glucosa al vincular la disponibilidad total de nutrientes con la homeostasis metabólica. Abstract Neddylation is a post-translational mechanism that adds a ubiquitin-like protein, namely neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 8 (NEDD8). In this work, we show in mice that neddylation in liver is modulated by nutrient availability. Inhibition of neddylation in mouse liver reduces gluconeogenic capacity and the hyperglycemic actions of counterregulatory hormones. Further, people with type 2 diabetes display elevated hepatic neddylation levels. At mechanistic level, fasting or caloric restriction of mice leads to neddylation of phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (PCK1) at three lysine residues—K278, K342 and K387. PCK1. We find that mutating the three PCK1 lysines that are neddylated reduces its gluconeogenic activity rate. Molecular dynamics simulations show that neddylation of PCK1 could re-position two loops surrounding the catalytic center into 4 an open configuration, rendering the catalytic center more accessible. Our study reveals that neddylation of PCK1 provides a finely-tuned mechanism of controlling glucose metabolism by linking whole nutrient availability to metabolic homeostasis. Resumo A nedilación é un mecanismo postraducional que agrega unha proteína semellante á ubiquitina, a saber, a proteína 8 regulada negativamente durante o desenvolvemento expresada por células precursoras neuronais (NEDD8). Neste traballo mostramos en ratos nos que a nedilación no fígado está modulada pola dispoñibilidade de nutrintes. A inhibición da nedilación no fígado de rato reduce a capacidade gluconeoxénica e as accións hiperglucemiantes das hormonas contrarreguladoras. Porén, as personas con diabete tipo 2 presentan niveis elevados de nedilación hepática. A nivel mecanístico, o xaxún ou a restricción calórica de ratos conduce á nedilación da fosfoenolpiruvato carboxiquinasa 1 (PCK1) en tres residuos de lisina: K278, K342 y K387. Encontramos que a mutación das tres lisinas PCK1 que están nediladas reduce a súa tasa de actividade gluconeoxénica. As simulacións de dinámica molecular mostran que a nedilación de PCK1 podería reposicionar dous bucles que rodean o centro catalítico nunha configuración aberta, facendo que o centro catalítico sexa máis accesible. O noso estudio revela que a nedilación de PCK1 proporciona un mecanismo preciso para controlar o metabolismo da glucosa ao vincular a dispoñibilidade total de nutrintes coa homeostasis metabólica. 5 Tabla de contenido Tabla de contenido ............................................................................................................................. 5 Abreviaturas, acrónimos y anglicismos: .............................................................................................. 9 1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 17 1.1 Homeostasis glucídica ....................................................................................................... 17 1.1.1 Regulación de los niveles de glucosa en sangre. ....................................................... 17 1.1.1.1 Estado absortivo ................................................................................................. 17 1.1.1.2 Estado interprandial y postprandrial .................................................................. 17 1.1.2 Diabetes ..................................................................................................................... 18 1.1.3 Papel del hígado en la regulación de la homeostasis glucídica ................................. 21 1.1.4 Sistemas de detección de glucosa en sangre ............................................................ 21 1.1.4.1 Detección y control de los niveles de glucemia a nivel central .......................... 21 1.1.4.2 Detección de los niveles de glucemia por el hígado ........................................... 24 1.1.4.3 Detección de los niveles de glucemia por el páncreas ....................................... 25 1.1.4.4 Detección de los niveles de glucemia por el intestino ....................................... 26 1.1.5 Sistemas de regulación de la homeostasis glucídica ................................................. 27 1.1.5.1 Adaptaciones metabólicas al ayuno ................................................................... 27 1.1.5.1.1 Glucagón ........................................................................................................ 28 1.1.5.1.2 Adrenalina ...................................................................................................... 29 1.1.5.1.3 Glucocorticoides ............................................................................................ 31 1.1.5.1.4 Hormona de crecimiento y ghrelina .............................................................. 32 1.1.5.2 Adaptaciones metabólicas a la hiperglucemia. .................................................. 34 1.1.5.2.1 Insulina ........................................................................................................... 34 1.1.5.2.2 Amilina ........................................................................................................... 38 1.1.5.2.3 Incretinas ....................................................................................................... 39 1.1.6 Mecanismos hepáticos para mantener la normoglucemia ....................................... 41 1.1.6.1 Utilización de glucosa en el hígado: glucólisis .................................................... 42 1.1.6.1.1 Regulación alostérica y endocrina de la glucólisis ......................................... 45 1.1.6.1.2 Regulación transcripcional de la glucólisis .................................................... 45 1.1.6.2 Almacenamiento de glucosa en el hígado: glucogenogénesis ........................... 47 1.1.6.2.1 Regulación de la glucogenogénesis ............................................................... 48 1.1.6.3 Producción endógena de glucosa ....................................................................... 49 6 1.1.6.3.1 Glucogenolisis ................................................................................................ 49 1.1.6.3.2 Gluconeogénesis ............................................................................................ 52 1.1.6.4 Liberación de glucosa al torrente sanguíneo ...................................................... 65 1.2 Modificaciones postraduccionales .................................................................................... 65 1.2.1 Ubiquitinación ........................................................................................................... 66 1.2.2 Nedilación .................................................................................................................. 67 1.2.2.1 Complejo CRL ...................................................................................................... 69 1.2.2.2 Proteínas reguladas por nedilación .................................................................... 71 2. HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 75 3. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 77 4. METODOLOGÍA .......................................................................................................................... 79 4.1 Animales de experimentación ........................................................................................... 79 4.2 Procedimientos en animales ............................................................................................. 81 3.2.1 Monitorización de la ingesta y el peso corporal. ............................................................. 81 4.2.1 Estudio del efecto del estado nutricional en los niveles de nedilación .................... 81 4.2.2 Estudio del efecto de la glucosa en los niveles de nedilación ................................... 81 4.2.3 Ayuno de 24 horas..................................................................................................... 81 4.2.4 Restricción calórica .................................................................................................... 81 4.2.5 Inyección intraperitoneal .......................................................................................... 82 4.2.6 Administración de hormonas .................................................................................... 82 4.2.6.1 Administración de leptina ................................................................................... 82 4.2.6.2 Administración de glucagón ............................................................................... 82 4.2.6.3 Administración de adrenalina ............................................................................. 82 4.2.6.4 Administración de cortisol .................................................................................. 83 4.2.6.5 Administración de insulina ................................................................................. 83 4.2.7 Tests de tolerancia .................................................................................................... 83 4.2.7.1 Test de tolerancia a piruvato .............................................................................. 83 4.2.7.2 Test de tolerancia a glucosa ............................................................................... 83 4.2.7.3 Test de tolerancia a insulina ............................................................................... 84 4.2.7.4 Test de tolerancia a glicerol ................................................................................ 84 4.2.8 Tratamiento con MLN4924 ....................................................................................... 84 4.2.9 Inyección en la vena de la cola .................................................................................. 85 4.2.10 Determinación de la producción hepática de glucosa .............................................. 86 7 4.2.10.1 Cirugía para la canulación de la vena yugular .................................................... 86 4.2.10.2 Infusión con glucosa tritiada ............................................................................... 87 4.2.11 Análisis histológico del tejido hepático. .................................................................... 88 4.2.11.1 Hematoxilina/eosina ........................................................................................... 88 4.2.11.2 Inmunohistoquímica ........................................................................................... 88 4.2.12 Sacrificio, recogida de tejidos y muestras. ................................................................ 89 4.3 Cultivos celulares ............................................................................................................... 89 4.3.1 Tratamientos celulares .............................................................................................. 90 4.3.1.1 Transfecciones .................................................................................................... 90 4.3.1.1.1 Silenciamiento de NAE1, NEDD8 y PCK1 en la línea celular AML12 .............. 90 4.3.1.1.2 Sobreexpresión de PCK1 en la línea celular AML12 ...................................... 91 4.3.1.2 Estudio del efecto del estado nutricional ........................................................... 91 4.3.1.3 Tratamiento con MLN4924 ................................................................................. 92 4.3.1.4 Medición de la glucosa en el medio. .................................................................. 92 4.3.1.5 Determinación de la actividad enzimática de PCK1. .......................................... 93 4.4 Muestras de hígado de pacientes. .................................................................................... 93 4.5 Análisis molecular ............................................................................................................. 94 4.5.1 Análisis de la expresión proteica mediante Western Blot......................................... 94 4.5.1.1 Extracción de proteínas totales y preparación de las muestras. ........................ 94 4.5.1.2 Cuantificación de los extractos proteicos. .......................................................... 96 4.5.1.3 Preparación de las muestras para electroforesis en SDS-PAGE. ........................ 96 4.5.1.4 Electroforesis SDS-PAGE. .................................................................................... 97 4.5.2 Transferencia semi-húmeda. ..................................................................................... 98 4.5.2.1 Inmunodetección de proteínas. .......................................................................... 99 4.5.2.1.1 Bloqueo. ......................................................................................................... 99 4.5.2.1.2 Incubación con anticuerpo primario. ............................................................ 99 4.5.2.1.3 Incubación con anticuerpo secundario........................................................ 100 4.5.2.1.4 Detección por quimioluminiscencia. ........................................................... 101 4.5.2.2 Cuantificación de la densidad óptica de las bandas. ........................................ 101 4.5.3 Detección de hormonas en suero. .......................................................................... 101 4.5.4 Detección de metabolitos en suero. ....................................................................... 102 4.5.5 Immunoprecipitación de PCK1. ............................................................................... 102 4.5.6 Modelado de proteínas. .......................................................................................... 103 8 4.5.7 Cuantificación de proteína por SWATH-MS (Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra) en experimentos de pull-down. ................................................... 103 4.5.8 Determinación del sitio de nedilación. .................................................................... 104 4.6 Análisis estadístico. ......................................................................................................... 104 5. RESULTADOS ........................................................................................................................... 107 5.1 La nedilación hepática se activa durante la privación de nutrientes y es necesaria para mantener los niveles de glucosa en sangre. ............................................................................... 107 5.1.1 La nedilación hepática está regulada por la disponibilidad nutricional. ................. 107 5.1.2 La inhibición de la nedilación hepática reduce la producción de glucosa. ............. 110 5.1.3 La inhibición de la nedilación hepática reduce la producción de glucosa de manera independiente del sexo. .......................................................................................................... 112 5.1.4 La inhibición de la nedilación hepática no modifica los niveles de proteínas de enzimas gluconeogénicas o acetil-CoA. .................................................................................. 113 5.2 La nedilación hepática regula la acción de las hormonas contrarreguladoras. .............. 116 5.3 La nedilación hepática está asociada con la resistencia a la insulina. ............................ 120 5.3.1 La inhibición de la nedilación reduce la hiperglucemia inducida por una dieta alta en grasas. 120 5.3.2 La nedilación hepática está aumentada en el hígado de personas con diabetes tipo 2. 122 5.4 PCK1 se nedila ante la deficiencia de nutrientes y esta PTM es necesaria para su actividad gluconeogénica. ........................................................................................................... 124 5.4.1 PCK1 aumenta su nedilación en ayuno y en restricción calórica. ........................... 124 5.4.2 PCK1 está nedilado en tres lisinas después de restricción calórica y ayuno. .......... 127 5.4.3 La nedilación de PCK1 en sus residuos K278, K342 y K387 es necesaria para su actividad gluconeogénica in vitro. ........................................................................................... 130 5.4.4 La nedilación de PCK1 en sus residuos K278, K342 y K387 es la responsable de la producción hepática de glucosa in vivo. ................................................................................. 134 6. DISCUSIÓN ............................................................................................................................... 138 7. CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 146 8. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................................... 148 ANEXOS ........................................................................................................................................... 165 Abreviaturas, acrónimos y anglicismos 15 TAC: ácidos tricarboxílicos TBST: solución salina tamponada con tris y polisorbato TEMED: tetrametil-etilendiamina TSH: hormona estimuladora de la tiroides TZD: tiazolidinedionas UBA3: subunidad activadora 3 de la enzima E1 UBE1: enzima activadora de ubiquitina 1 UBE2F: enzima de conjugación de ubiquitina E2 F UBE2M/UBC12: enzima de conjugación de ubiquitina E2 M UCHL3: Hidrolasa L3 ubiquitina C-terminal UFD: dominio pliegue de ubiquitina UGT: glucuroniltransferasa VMN: núcleo ventromedial VLDL: lipoproteína de muy baja densidad WT: wild type XIAP: Proteína Inhibidora de la Apoptosis Ligada al Cromosoma X ANGLICISMOS: Bachground: fondo Buffer: tampón Enhancer: potenciador Knockdown: reducido Knockout: eliminación, desactivación Stripping: desmontado Plug: tapón INTRODUCCIÓN Introducción 17 1. INTRODUCCIÓN 1.1 Homeostasis glucídica 1.1.1 Regulación de los niveles de glucosa en sangre. La concentración de glucosa en sangre se mantiene normalmente dentro de un estrecho margen, por lo general en torno a 90-100 mg/dl (normoglucemia) y su regulación es un proceso crítico, complejo y coordinado, ya que se trata de la principal fuente de energía a nivel celular. De hecho, los bajos niveles de glucosa en sangre, o hipoglucemia, rápidamente provoca eventos metabólicos en órganos como el cerebro o el intestino que necesitan una fuente continua de glucosa [1]. Es por ello que el organismo necesita mantener los niveles de glucosa constantes, siendo la ingesta de alimentos la principal fuente de asimilación de glucosa en condiciones fisiológicas. Sin embargo, una vez concluido el período postpandrial, la producción de glucosa se vuelve crucial para evitar un descenso en los niveles de glucosa en sangre. 1.1.1.1 Estado absortivo Los carbohidratos provenientes de la dieta son digeridos y procesados por varias glucosidasas en el tracto digestivo, y los monosacáridos resultantes, principalmente glucosa, son transportados a varios tejidos constituyendo la principal fuente para la generación de adenosín trifosfato (ATP). Este transporte de glucosa a través de la pared intestinal es mediado por el transportador de glucosa sodio-dependiente (SGLT1), y por el transportador de glucosa-independiente de facilitación de la difusión (GLUT5) en el caso de la fructosa. Por cada molécula de glucosa, se transportan al interior de la célula epitelial dos iones de sodio, los cuales regresan a la luz intestinal mediante la bomba de sodio y potasio [2]. Cuando la cantidad de glucosa en el lumen intestinal se encuentra en niveles elevados por encima de la saturación de SLGT1 y, además, es prolongada en el tiempo, un transportador independiente de monosacáridos (GLUT2) del lado contraluminal de la célula epitelial intestinal se transloca de la membrana basal a la apical para aumentar la absorción de glucosa. Esta entra entonces a la circulación por la vena porta, que la transporta al hígado [3]. 1.1.1.2 Estado interprandial y postprandrial Por otro lado, entre comidas o en estado de ayuno como el ayuno nocturno, el aporte de glucosa al torrente sanguíneo proviene en primera instancia de la lisis del glucógeno UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 18 almacenado en el hígado. Este, junto con el músculo, es el principal almacén de glucógeno, y, además, cuando el ayuno se prolonga, es capaz de producir glucosa de novo a partir de sustratos no glucídicos como el glicerol proveniente de la lipólisis del tejido adiposo, el lactato y algunos aminoácidos (principalmente alanina y glutamina) procedentes del tejido muscular esquelético. Además, el hígado tiene la capacidad de sintetizar cuerpos cetónicos (β-hidroxibutirato, aceto-acetato y acetona) a partir de ácidos grasos libres. Estos pueden ser utilizados como fuente de energía por todos los tejidos y órganos, pero son especialmente importantes para el cerebro, para el cual constituyen dos tercios de su fuente de utilización de energía en situaciones fisiológicas, y la única fuente en situaciones en las que la glucosa puede escasear, como durante el ayuno [4]. 1.1.2 Diabetes Como ya se ha mencionado, el mantenimiento de la normoglucemia exige una respuesta coordinada a nivel central y periférico. Teniendo en cuenta que la secreción de insulina y su acción son procesos fundamentales para mantener la normoglucemia, defectos en cualquiera de los mecanismos involucrados en esos procesos pueden dar lugar al desequilibrio metabólico responsable del desarrollo de la diabetes. Esta patología es causada por la combinación de dos factores principales: un defecto en la secreción de insulina por parte de las células β del páncreas (diabetes tipo 1), y por la incapacidad de los tejidos sensibles a insulina de responder correctamente a esta hormona (diabetes tipo 2) [5]. Todo ello tiene como consecuencia que los niveles de glucosa en sangre se eleven de forma anormal y mantenidos en el tiempo. En ese sentido, la captación de glucosa estimulada por insulina (sobre todo en el músculo esquelético) está enormemente reducida en pacientes con diabetes tipo 2. Además, el concomitante uso de radioisótopos ha permitido mostrar que la producción hepática de glucosa no se ve suficientemente inhibida por la insulina, lo cual pone de manifiesto la presencia de resistencia a insulina tanto hepática como periférica [6]. En estadíos iniciales, las células β-pancreáticas pueden compensar el exceso de glucosa en sangre o hiperglucemia, y la resistencia a insulina, produciendo y secretando más insulina, generando así hiperinsulinemia [7]. Además, el aclaramiento de esta hormona por el hígado también juega un papel fundamental en el desarrollo de la enfermedad [8, 9]. Introducción 19 La hiperinsulinemia compensatoria que se genera para controlar la hiperglucemia tiene como efecto colateral un aumento de la lipogénesis hepática, hiperlipidemia, y la expansión del tejido adiposo, debido a su poder lipogénico [10, 11]. Esto a su vez provoca un aumento en el flujo de lípidos a nivel hepático, promoviendo la esteatosis hepática, la resistencia a insulina y un aumento en la tasa gluconeogénica al aumentar el flujo de lípidos en forma de ácidos grasos libres (NEFAs) y glicerol. Esto último, junto con la resistencia hepática a insulina que hace que esta hormona sea incapaz de inhibir completamente la gluconeogénesis hepática, tiene como consecuencia un aumento en los niveles de glucosa que empeora el perfil glucémico [12]. En ese sentido, se ha visto que el aumento de la producción hepática de glucosa aumentada en estado postprandrial se debe a ese aumento en la tasa gluconeogénica y no a una mayor tasa de glucogenolisis [13]. A nivel epidemiológico, la diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) es de una de las patologías médicas más desafiantes del siglo XXI y que va de la mano del progresivo aumento de la prevalencia de la obesidad, convirtiéndose ambas en las pandemias de este siglo [14]. En la actualidad, aproximadamente 1 de cada 11 adultos en el mundo sufre diabetes, y la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha catalogado a esta patología como la séptima causa de muerte. Para 2045 se estima que habrá 693 millones de pacientes diabéticos en el mundo, y el coste de esta patología superará los 850.000 millones de dólares por año, y será responsable directa de una reducción de hasta 12 años en la esperanza de vida de los pacientes, así como la causante de 5 millones de muertes anuales en todo el mundo [15]. Las causas de la diabetes tipo 2, a diferencia de la diabetes tipo 1 producida por un déficit en la síntesis de insulina por las células β-pancreáticas y que sí tiene un potente factor genético, en este caso son multifactoriales e incluyen tanto factores genéticos, como ambientales que afectan al funcionamiento de las células β-pancreáticas y a la sensibilidad a insulina del músculo, hígado, tejido adiposo e incluso el propio páncreas. Estudios de asociación del genoma completo (GWAS, por sus siglas en inglés) encontraron más de 400 genes relacionados con el desarrollo de esta enfermedad, principalmente genes relacionados con la función pancreática. Sin embargo, el peso de la genética es relativamente minoritario y supone menos del 20% del riesgo de desarrollar la enfermedad [16, 17]. Por otro lado, estudios de modificación de hábitos sostienen que cambios en el estilo de vida, como el UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 20 aumento de la industrialización e ingesta de productos refinados e hiperpalatables, y el creciente sedentarismo de la sociedad, tienen un papel crucial. Además, se señalan otros factores ambientales como la contaminación ambiental, las condiciones socioeconómicas y psicosociales, el tabaquismo y la falta de sueño [18]. Asimismo, el estilo de vida parental, la programación intrauterina y alteraciones metabólicas posnatales tempranas pueden influenciar el riesgo de padecer esta enfermedad mediante alteraciones en la metilación del ADN [19-21]. Siguiendo la línea de que la mayoría de pacientes con diabetes tipo 2 tienen sobrepeso y que la obesidad juega un papel importante en su desarrollo, el exceso de grasa abdominal está asociado a una mayor liberación de NEFAs a la sangre, lo cual estimula la gluconeogénesis hepática; reduce el aclaramiento de insulina y aumenta la síntesis de lipoproteínas de densidad muy baja (VLDL). A nivel del músculo esquelético, los NEFAs provocan una reducción en la tasa de oxidación de glucosa y una reducción en la tasa de almacenamiento de glucosa en forma de glucógeno (el llamado efecto Randle) [22]. Todo ello contribuyendo a la elevación de los niveles de glucosa en sangre y a la hiperglucemia. Numerosos pacientes obesos que padecen resistencia a insulina poseen también el denominado Síndrome Metabólico, que asocia la diabetes tipo 2, dislipidemia e hipertensión arterial; todos ellos factores agravantes del riesgo cardiovascular [23], la principal causa de muerte a nivel mundial según la OMS, y en España, según datos del Instituto Nacional de Estadística (INE). Además de que el exceso de tejido adiposo en pacientes con obesidad se relaciona con una mayor liberación de NEFAs, también se relaciona con la acumulación de lípidos ectópica, reduciendo la capacidad de los diferentes órganos de funcionar y responder correctamente. En ese sentido, la esteatosis hepática es común en estos pacientes y la esteatosis hepática no alcohólica es considerada ahora como parte del Síndrome Metabólico asociada a resistencia a insulina. Además, los niveles de triglicéridos intramusculares se encuentran incrementados en pacientes obesos y se correlaciona con una mayor severidad de resistencia a insulina a nivel muscular [24]. El papel de las hormonas contrarreguladoras en la resistencia a insulina de la diabetes tipo 2 también es importante en el desarrollo de esta enfermedad. Quienes la padecen poseen unos niveles de glucagón en sangre elevados, de manera que esta hormona contribuye a potenciar Introducción 21 la gluconeogénesis y la glucogenolisis, sobre todo en presencia de una deficiencia de insulina [21]. Acorde con esto, se ha demostrado que los niveles circulantes de glucagón disminuyen notablemente durante la infusión sistémica de insulina [25], y que el mantenimiento de los niveles circulantes de glucagón constantes durante dicha infusión sistémica de insulina, disminuyen la capacidad de esta para suprimir la producción hepática de glucosa [26]. 1.1.3 Papel del hígado en la regulación de la homeostasis glucídica Con todo, la concentración de glucosa en sangre sufre fluctuaciones durante los estados de ayuno y alimentación, y la regulación coordinada entre la utilización y la producción de glucosa es crítica para mantener los niveles de glucosa en sangre constantes en un rango fisiológico. Una de las principales funciones del hígado es mantener esa normoglucemia, alterando la tasa de liberación de glucosa (glucogenolisis) y controlando procesos de producción de glucosa de novo (gluconeogénesis) [27]. Los hepatocitos constituyen uno de los pocos tipos celulares que tienen la capacidad de consumir y producir glucosa. El control normoglucémico, por tanto, es resultado de un equilibrio entre estos dos procesos. Para llevar a cabo estas acciones fisiológicas que mantienen los niveles de glucosa circulantes dentro del rango homeostático, es necesaria una estrecha coordinación entre los sistemas de detección de los niveles circulantes de glucosa (principalmente el sistema nervioso central, el hígado, el páncreas y el tracto gastrointestinal) y el resto de tejidos y órganos. Esta comunicación sistémica se lleva a cabo principalmente por la acción coordinada de las principales hormonas involucradas en la homeostasis de la glucosa, esto es, la insulina y las hormonas contrarreguladoras: el glucagón, la adrenalina, los glucocorticoides y la hormona de crecimiento. 1.1.4 Sistemas de detección de glucosa en sangre Por todas las razones mencionadas, es esencial que el cuerpo detecte los niveles de glucosa plasmática constantemente para ser capaz de responder rápida y adecuadamente cuando los recursos energéticos son insuficientes. 1.1.4.1 Detección y control de los niveles de glucemia a nivel central UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 22 A nivel central, el hipotálamo juega un papel fundamental en la detección y regulación de los niveles de glucosa en sangre mediante la coordinación de la respuesta del organismo para mantener la homeostasis de la glucosa y asegurarse de que haya suficiente energía disponible. En cuanto a la detección de los niveles de glucosa, las neuronas detectoras de glucosa pueden clasificarse en dos categorías: neuronas excitadas por glucosa (GE), que aumentan la frecuencia de su potencial de acción ante altos niveles de glucosa; y neuronas inhibidas por glucosa (GI), que aumentan la frecuencia de su potencial de acción y su potencial de membrana en respuesta a un descenso de los niveles de glucosa [28]. Las neuronas detectoras de glucosa se encuentran en múltiples regiones del cerebro, incluyendo el arcuato (ARC), el núcleo paraventricular (PVH), el núcleo ventromedial (VMH), el núcleo lateral (LH), el núcleo supraóptico, el núcleo del tracto solitario (NTS) y el área postrema (AP) [29, 30]. Entre los núcleos hipotalámicos, el VMH ha sido reconocido como uno de los principales lugares de detección de los niveles de glucosa y de regulación de la homeostasis glucídica a nivel sistémico [29, 31]. Niveles elevados de glucosa activan neuronas GE, provocando un efecto inhibitorio en la respuesta sistémica a la hipoglucemia y activando la respuesta a hiperglucemia. Como resultado de esta activación, se estimula la liberación del neurotransmisor ácido γaminobutírico (GABA) en el VMN del hipotálamo, y el NTS, o neuropéptidos anorexigénicos en el ARC [32]. Ello tiene como resultado la activación del sistema nervioso autónomo parasimpático que estimula la liberación de insulina desde el páncreas [32, 33]. Por el contrario, cuando los niveles de glucosa descienden, aumenta la actividad de neuronas GI en el ARC, el PVN, el VMH, y el LH [34]. Esa mayor activación neuronal está mayoritariamente asociada con la secreción de los neurotransmisores glutamato y noradrenalina [35]. En este apartado, cabe destacar el papel del núcleo VMH en la respuesta contrarreguladora, puesto que se ha descrito que lesiones del VMH bloquean la respuesta sistémica hormonal a la hipoglucemia, y que la glucoprivación en el VMH aumenta rápidamente los niveles de glucosa en sangre como resultado de la liberación de hormonas contrarreguladoras (glucagón, adrenalina, y corticosteroides) mediante la activación del sistema nervioso simpático, dando como resultado final la estimulación de la glucogenolisis, la gluconeogénesis y la liberación de glucosa, para así, en última instancia, dar como Introducción 23 resultado el aumento de los niveles de glucosa en sangre [28, 36, 37]. En línea con esto, se ha visto que la activación de la secreción de glucagón por hipoglucemia hiperinsulinémica se puede bloquear mediante la infusión de glucosa en el VMH, y esta inhibición se puede prevenir mediante la administración en el VMH de un antagonista del receptor GABAA (GABAAR), lo que indica que la secreción de GABA inducida por glucosa en el VMH bloquea la respuesta contrarreguladora [38]. El sistema nervioso central también afecta a la homeostasis glucídica sistémica mediante inervaciones del sistema nervioso simpático y parasimpático. Las fibras eferentes simpáticas en los islotes pancreáticos liberan noradrenalina para estimular la liberación de la secreción de glucagón mediante la unión a receptores α-adrenérgicos en las células α; e inhiben la secreción de insulina mediante la activación de receptores β-adrenérgicos de las células β. Por el contrario, las fibras parasimpáticas envían inputs colinérgicos a los islotes pancreáticos para inhibir la secreción de glucagón en las células α, así como aumentar la secreción de insulina mediante la liberación de acetilcolina que se une a receptores muscarínicos en las células β [29]. Además de la acción en los islotes pancreáticos, el cerebro también modula la liberación de adrenalina desde la médula adrenal. Por último, desde el eje hipotálamohipofisario, la adenohipófisis libera hormonas hipofisarias, entre ellas la hormona adrenocorticótropa (ACTH) con el fin de estimular la producción de glucocorticoides en la médula suprarrenal; y la liberación de GH por la adenohipófisis como consecuencia de cambios en la liberación hipotalámica de la hormona liberadora de GH (GHRH) y de la somatostatina (SST) [39, 40]. UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 24 Figura 1. Representación esquemática del control metabólico a nivel central. Imagen de elaboración propia con Biorender. 1.1.4.2 Detección de los niveles de glucemia por el hígado Cuando los niveles de glucemia son altos, los sensores hepáticos inducen una respuesta adaptativa para dirigir el metabolismo glucídico hacia el consumo y almacenamiento de glucosa. En el hígado se expresan 5 tipos de transportadores GLUT (GLUT 1, GLUT 2, GLUT 5, GLUT 8 y GLUT 9) [41]. Sin embargo, GLUT2 es el principal transportador de membrana que permite a la glucosa entrar en los hepatocitos [42]. En los hepatocitos, GLUT2 controla la mayor parte de la captación de glucosa dependiendo de los niveles de glucosa circulante en el torrente sanguíneo. Sin embargo, su actividad no parece ser crítica para la detección de los niveles de glucosa postprandrial, ya que se ha visto que la deficiencia de GLUT2 en el hígado de ratones no altera la secreción de insulina estimulada por glucosa en las células β-pancreáticas [43]. Introducción 31 Por último, la adrenalina afecta a la homeostasis glucídica no solo por sus efectos en el hígado y tejidos periféricos, sino también por alterar la secreción a insulina. Se ha descrito que la administración intravenosa de adrenalina provoca intolerancia a glucosa al alterar la sensibilidad a insulina hepática y periférica. Con ello, la adrenalina inhibe la liberación de insulina desde las células β-pancreáticas a través de receptores α2-adrenérgico, y con ello la captación de glucosa por los tejidos periféricos, con el fin de mantener la glucosa libre en la sangre [48, 49]. De hecho, se ha visto que los niveles de adrenalina y noradrenalina están elevados en pacientes diabéticos tipo 1 en el momento de su diagnóstico, y sus niveles se reestablecen a niveles basales tras el tratamiento con insulina [76]. Con todo, la unión de la adrenalina a cualquiera de sus receptores tiene como resultado la elevación de los niveles intracelulares de AMPc, que activa a PKA, la cual fosforila a diferentes proteínas teniendo como consecuencia final un aumento de los niveles de glucosa en sangre y la disponibilidad de sustratos que sirven como fuente de energía para suplir una mayor demanda energética como lo es el ejercicio, o una respuesta de lucha o huida [77]. 1.1.5.1.3 Glucocorticoides Los glucocorticoides son hormonas esteroideas secretadas por la corteza de las glándulas suprarrenales, y son las encargadas, junto con la hormona de crecimiento, de la respuesta lenta a la hipoglucemia, cuando el estímulo del ayuno es persistente en el tiempo. En mamíferos, estos glucocorticoides son el cortisol, la cortisona y la corticosterona, aunque el cortisol es la forma biológicamente activa en humanos y la corticosterona en roedores. Aunque siempre se ha considerado al glucagón como la hormona con más poder inductor de la gluconeogénesis durante el ayuno, ratones adrenalectomizados presentan una capacidad gluconeogénica menor en situaciones de ayuno, un efecto que es restaurado tras la administración de glucocorticoides [78, 79]. Este conjunto de hormonas fomentan la acción del glucagón, ya que tienen la capacidad de estimular directamente la producción endógena de glucosa en el hígado [10, 80], pero también promueven el almacenamiento de glucógeno o glucogenogénesis en este órgano, estimulando la actividad de la glucógeno sintasa (GS). Indirectamente, los glucocorticoides también proveen de precursores gluconeogénicos promoviendo la degradación de proteínas UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 32 en el músculo esquelético para generar aminoácidos [81], y promoviendo la lipólisis en el tejido adiposo blanco, liberando glicerol y ácidos grasos [82]. Por otro lado, en el tejido adiposo blanco y en el músculo esquelético, disminuyen la utilización de glucosa antagonizando la acción de la insulina [83]. Todos estos efectos tienen como fin elevar los niveles de glucosa circulantes para estar disponibles en situaciones de estrés, pero una exposición crónica tienen un efecto contraproducente, causando hiperglucemia y resistencia a insulina [84, 85]. Contrariamente, alteraciones en la vía de señalización de los glucocorticoides desembocan en una mejora en la sensibilidad a insulina y en la utilización de glucosa en músculo esquelético, en modelos de ratón y humano. Coherentemente, los niveles de glucocorticoides están elevados en la sangre de ratones ob/ob y db/db comparado con ratones wild type (WT), de manera que estos ratones son resistentes a insulina [86, 87]. De hecho, ensayos de clamp euglicémico-hiperinsulinémico han demostrado que los glucocorticoides disminuyen la tasa de infusión de glucosa necesaria para mantener la normoglucemia, previenen la inhibición por la insulina de la producción endógena hepática de glucosa, e inhiben la utilización de glucosa en el músculo esquelético [88]. Por otro lado, los glucocorticoides regulan la liberación de glucagón e insulina desde el páncreas, aumentando los niveles de glucagón [85], e induciendo la hiperplasia de los islotes pancreáticos, lo cual da lugar a hiperinsulinemia [89]. A nivel molecular, su receptor, GR o NR3C1a, reside en el citoplasma unido a chaperonas Hsp90 hasta que su ligando, los glucocorticoides, se unen al receptor. Entonces, se transloca al núcleo, donde se une a elementos respuesta de glucocorticoides (GREs) para promover la transcripción de genes específicos. 1.1.5.1.4 Hormona de crecimiento y ghrelina La hormona de crecimiento, GH, también conocida como somatotropina, es una hormona peptídica de 191 aminoácidos secretado por la hipófisis con un ritmo circadiano que da lugar a la secreción de más de la mitad de la secreción total durante la noche y que es desencadenada por la fase de ondas lentas del sueño [90]. Esta hormona aumenta directamente la producción de glucosa por el hígado al aumentar la disponibilidad de Introducción 33 sustratos (como lactato, glicerol y aminoácidos) y activar enzimas clave involucradas en este proceso. Por otro lado, la GH inhibe la captación de glucosa por los tejidos periféricos como el tejido muscular y el tejido adiposo, de manera que la sensibilidad a insulina de los tejidos periféricos disminuye desde las 2 hasta las 12 h tras la administración transitoria de esta hormona. En línea con esto, pacientes con acromegalia y, por tanto, altos niveles circulantes de esta hormona, presentan intolerancia a glucosa y una mayor resistencia a insulina [91]. Por otro lado, en contraste con el glucagón y la adrenalina, los cuales inhiben la acción de la insulina, el efecto inhibitorio de la GH sobre la insulina tarda varias horas en desarrollarse [92]. A nivel molecular, la GH se une a su receptor, GHR, en la superficie de sus células diana, entre las que se incluyen los hepatocitos y los adipocitos. Esta unión activa una cascada de señalización intracelular que involucra las quinasas Janus (JAK) y los factores de transcripción de transductores de señal y activadores de transcripción (STAT). Las proteínas JAK activadas se autofosforilan en residuos de tirosina en el dominio citoplasmático del receptor, y las proteínas STAT se unen al receptor fosforilado. Las quinasas JAK fosforilan a las proteínas STAT en residuos de tirosina y entonces se dimerizan y se translocan al núcleo de la célula. Dentro del núcleo, los dímeros STAT se unen a los elementos de respuesta de genes diana para estimular su transcripción [93]. Esto resulta en la síntesis de proteínas involucradas en el crecimiento y desarrollo celular, en la estimulación de la liberación de ácidos grasos desde el tejido adiposo, y en el aumento de la síntesis de glucógeno y la gluconeogénesis en el hígado. Finalmente, la señalización de la GH es regulada por retroalimentación negativa y está influenciada por otras hormonas, como la insulina y el factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-1). Además del efecto ejercido por la GH, estudios recientes han puesto de manifiesto que algunos efectos de la GH pueden ser mimetizados por la ghrelina, un secretagogo de la GH. La ghrelina es una hormona secretada por el estómago durante el ayuno que incrementa el apetito y la ingesta de alimentos, y que estimula la secreción de GH por la hipófisis. Aunque el papel de la ghrelina en la gluconeogénesis hepática no es tan directo como el de otras hormonas contrarreguladoras, la ghrelina puede influir en la regulación de la homeostasis glucídica mediante mecanismos indirectos, dado que la estimulación del apetito y la ingesta UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 34 de alimentos aumenta la disponibilidad de sustratos metabólicos. También regula la acción de hormonas contrarreguladoras como la GH y el glucagón, y algunas publicaciones recientes sugieren que la ghrelina puede reducir la sensibilidad a insulina, lo cual afecta a la captación de glucosa por los tejidos y aumenta la producción de glucosa por el hígado [94, 95]. Destacar, asimismo, que la ghrelina es sintetizada en el páncreas endocrino por las células ε [96]. Por último, destacar que tanto la GH como la ghrelina juegan un papel especialmente relevante en relación a la prevención de la hipoglucemia en ayuno en animales sometidos a restricción calórica parcial (60%). La adaptación al ayuno en estas condiciones está mediada por un marcado aumento de la GH plasmática, que es provocado a su vez por un aumento de la ghrelina plasmática. De esta manera, la instauración de la hipoglucemia es retrasada de forma muy marcada por la administración tanto de ghrelina como de GH, indicando que el efecto es mediado por GH. Además, se ha visto que ratones con silenciamiento hepático del receptor de GH exhiben una marcada hipoglucemia debido a una disminución de la producción de glucosa por el hígado, y una caída de triacilglicéridos hepáticos [97]. Sin embargo, en humanos, el efecto de la ghrelina no está tan claro, debido al efecto supresor de la insulina sobre la ghrelina con o sin hipoglucemia [30, 98]. 1.1.5.2 Adaptaciones metabólicas a la hiperglucemia. 1.1.5.2.1 Insulina Descubierta en 1921 por Banting y Best, la insulina es una hormona secretada por las células β del páncreas ante el aumento de los niveles de glucosa en sangre para disminuir sus niveles y devolverlos al estado normoglucémico. Esta hormona se sintetiza a partir de un péptido precursor llamado preproinsulina que contiene tres segmentos: el péptido señal, la cadena A de insulina y la cadena B de insulina. La preproinsulina es dirigida al retículo endoplasmático, donde el péptido señal se escinde, dando lugar a la proinsulina. Esta consta de dos cadenas peptídicas, A y B, unidas por una región llamada péptido C, y se almacena en gránulos de secreción en el citoplasma de las células β. Antes de su liberación a la sangre, la proinsulina se convierte en insulina mediante la eliminación del péptido C [99]. Introducción 35 En estado postpandrial, la secreción de insulina tiene lugar en dos fases: una inicial rápida, de insulina previamente sintetizada y almacenada en vesícula citoplasmáticas de las células β, y una fase tardía donde la insulina es sintetizada de novo y que tiene lugar si los niveles de glucosa circulantes permanecen elevados en el tiempo [100]. Aunque la glucosa es el mayor estímulo de secreción de insulina, los niveles circulantes de aminoácidos (especialmente arginina, leucina y lisina), la acción de las hormonas gastrointestinales con efecto incretina como GLP-1 y GIP, y la estimulación por el sistema nervioso simpático a través del nervio vago también tienen un efecto en su síntesis y liberación [101]. La principal función de la insulina es regular el metabolismo glucídico, principal y directamente mediante la inhibición de la gluconeogénesis hepática, y secundaria e indirectamente actuando en el páncreas, el cerebro, el músculo y el tejido adiposo [102]. En primer lugar, la insulina inhibe directamente la gluconeogénesis al afectar a la transcripción de genes involucrados en el control gluconeogénico, como lo son PCK1 y G6Pasa [103], principalmente mediante la activación de la quinasa AKT, la cual fosforila e inactiva al factor de transcripción proteína Forkhead Box O1 (FoxO1) y a su coactivador PGC-1α [104]. En condiciones de estrés celular, FoxO1 es activado por desacetilasas como la sirtuina 1 (SIRT1) y se une a los elementos respuesta de los genes diana gluconeogénicos [105, 106]. Al inhibir la actividad de FOXO1, la insulina reduce la expresión de genes que promueven la gluconeogénesis [107, 108]. De manera acorde con esto, ratones con una deleción de FOXO1 específicamente en el hígado muestran niveles de glucosa en ayuno más bajos, mientras que cuando se expresa constitutivamente, los niveles de glucosa en ayuno aumentan [109, 110]. Además de inhibir directamente la producción de glucosa, la insulina también regula la homeostasis glucídica a través de mecanismos indirectos. En primer lugar, mediante la inhibición de la secreción de glucagón por las células α del páncreas, lo cual indirectamente conlleva la reducción de la producción hepática de glucosa al reducir la señalización del glucagón en el hígado [111, 112]. En segundo lugar, mediante la reducción de sustratos gluconeogénicos liberados desde el tejido adiposo y el músculo esquelético. Esto lo hace mediante la inhibición de la lipólisis (por tanto impidiendo la desintegración de los triglicéridos en ácidos grasos libres y glicerol) y la proteólisis (impidiendo la liberación de UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 36 aminoácidos al torrente sanguíneo) en el tejido adiposo o en el músculo esquelético, respectivamente. Con ello, se ha visto que una reducción de los niveles de ácidos grasos libres en la sangre provoca una menor producción de glucosa por parte del hígado [113]. Otro modo mediante el cual la insulina reduce la disponibilidad de sustratos gluconeogénicos en circulación en la sangre es aumentando la captación de glucosa por los tejidos periféricos [114, 115], promoviendo el almacenamiento de triacilglicéricos (TAGs) en los adipocitos (lipogénesis) mediante la disminución de la actividad de la HSL y la inducción de enzimas lipogénicas; y el almacenamiento de glucosa en forma de glucógeno en el hígado y en el músculo esquelético, por tanto estimulando la glucogenogénesis [10]. Esta acción la realiza mediante la estimulación de la enzima GS, clave para la síntesis de glucógeno, y mediante inhibición de la actividad de la GP, enzima responsable de la desintegración del glucógeno, por tanto evitando la liberación de glucosa [1, 116]. A nivel molecular, la vía de señalización de insulina se activa cuando esta se une a su receptor, IR, en la superficie de la membrana celular. Se trata de un receptor que es una proteína transmembrana con actividad tirosina quinasa que se activa al unirse el ligando. Esta activación resulta en la fosforilación de residuos de tirosina en el propio receptor de insulina. Los sustratos del receptor de insulina (IRS) son proteínas adaptadoras que se fosforilan en residuos de tirosina en respuesta a la activación del receptor, y su fosforilación proporciona sitios de unión para otras proteínas señalizadoras, como la proteína fosfatidilinositol 3- quinasa (PI3K), que convierte el fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) en fosfatidilinositol 2,4,5-trifosfato (PIP3). Este último permite que la proteína quinasa-1 dependiente de la proteína quinasa 1 de la piruvato deshidrogenasa (PDK1) se una y fosforile a la proteína quinasa dependiente de proteína quinasa B (PKB/AKT), activándola y permitiendo su translocación del citoplasma al núcleo [117, 118]. AKT activado puede fosforilar y modular la actividad de varios factores de transcripción como FOXO1 que, en asociación con el coactivador 1-alfa del receptor gamma activado por proliferador de peroxisomas (PGC1α), promueve la transcripción de G6Pasa y PCK1. AKT también inhibe la glucogenolisis y promueve la glucogenogénesis mediante la activación de GK y la fosforilación e inactivación de GSK3 [119]. Introducción 37 Además de la vía PI3K-AKT, la insulina puede activar la vía de la proteína quinasa por mitógenos (MAPK), que está implicada en la proliferación celular y la diferenciación, y la vía de señalización de mTOR (objeto de la rapamicina en mamíferos). En el caso de la vía de las MAPK, la unión de la insulina a su receptor provoca la fosforilación del mismo en lugares que sirven de sitios de unión para proteínas adaptadoras como SHC que reclutan proteínas como GRB2 (factor de unión a Son of Sevenless homólogo 1). GRB2 se asocia con SOS (Son of Sevenless), dando lugar a la activación de RAS. La activación de RAS activa la cascada de quinasas RAF, MEK (MAP quinasa activada por mitógenos) y ERK (quinasa regulada por señales extracelulares). ERK activada se transloca al núcleo, donde fosforila factores de transcripción y modula la expresión de genes implicados en vías de proliferación celular, diferenciación, y otros procesos celulares [117, 118]. Es importante señalar que la función de AKT en el núcleo es solo una pequeña parte de su función en la célula, ya que su actividad en otras partes de la célula como el citoplasma o la membrana plasmática, donde aumenta la translocación de transportadores de glucosa (como GLUT4), es esencial para llevar a cabo sus diversas funciones en la regulación del metabolismo y el crecimiento o supervivencia celular. UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 38 Figura 4. Representación esquemática de la vía de señalización de la insulina. Imagen de elaboración propia con Biorender. La regulación de la vía de señalización de insulina está altamente regulada y coordinada, y su disfunción puede contribuir a trastornos metabólicos como la resistencia a insulina y la diabetes tipo 2. Por otro lado, como ya se ha mencionado anteriormente en esta sección, pese a que la insulina es la principal hormona encargada de disminuir los niveles circulantes de glucosa, su acción se ve reforzada con la actuación de otras hormonas importantes como son la amilina y las incretinas. 1.1.5.2.2 Amilina La amilina, también conocida como polipéptido amiloide tipo 1, es una hormona peptídica que se produce y secreta junto con la insulina (en una ratio 20:1 insulina-amilina) en las Introducción 39 células β-pancreáticas. Esta hormona es sintetizada a partir del mismo precursor de la insulina: la proinsulina. Una vez liberada en el torrente sanguíneo, la amilina trabaja en coordinación con la insulina para mantener la homeostasis glucémica, principalmente de dos maneras: ralentizando la velocidad de vaciado gástrico, en especial los carbohidratos, para evitar picos de glucemia tras las comidas, e inhibiendo la liberación de glucagón. Además, se ha descrito que la amilina tienen un papel en el control de la ingesta y peso corporal, reduciéndolos [101, 120]. 1.1.5.2.3 Incretinas El término incretinas se refiere al poder de ciertas moléculas de estimular o incrementar la secreción de insulina en respuesta a la ingesta de alimentos. Este efecto fue descrito por primera vez en 1967, por Perley y Kipnis, cuando observaron que la ingesta de alimentos producía un aumento de insulina superior al de la infusión directa de glucosa intravenosa [121]. Para poner de relevancia la contribución de las incretinas, señalar que estas contribuyen en un 50% al total de insulina secretada después de una comida [122]. Los dos péptidos más importantes y estudiados en el contexto de la homeostasis de la glucosa son los péptidos intestinales GLP-1 y GIP. GIP El polipéptido inhibidor gástrico (GIP, por sus siglas en inglés), también conocido como polipéptido insulinotrópico dependiente de glucosa, fue la primera incretina descrita, en 1971 por Brown y Dryburgh, y es sintetizada en las células K del intestino delgado, principalmente en el duodeno y el yeyuno, en respuesta a la ingesta de alimentos, especialmente carbohidratos y grasas [123]. Una de las principales acciones del GIP es estimular la secreción de insulina (efecto insulinotrópico) ante el aumento de los niveles de glucosa, mediante la unión a su receptor (GIPR) localizado en las células β-pancreáticas. Además de estimular la secreción de insulina, el GIP puede tener un efecto directo sobre la captación de glucosa en tejidos periféricos, como el músculo y el tejido adiposo, ayudando así a disminuir los niveles de glucosa en sangre; y en la regulación de la secreción de ácido gástrico en el estómago, lo que UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 40 puede tener implicaciones en la digestión y absorción de nutrientes, y razón por la cual GIP debe su nombre. Además de sus efectos en el metabolismo glucídico, GIP también tiene un papel importante en el metabolismo lipídico, favoreciendo la lipogénesis al estimular la síntesis de triglicéridos y reduciendo la lipólisis en el tejido adiposo. Finalmente, GIP es degradado por la dipeptidil peptidasa-4 (DPP4) [122]. En resumen, el GIP es una hormona incretina que juega un papel importante en la regulación de la glucemia al estimular la secreción de insulina y, posiblemente, al facilitar la captación de glucosa en los tejidos. Sin embargo, a diferencia del GLP-1, el GIP no tiene un efecto claro en la inhibición de la liberación de glucagón. Ambas hormonas incretinas, junto con otros factores, contribuyen al control de los niveles de glucosa en sangre en respuesta a la ingesta de alimentos. GLP-1 Catorce años más tarde, en 1985, Schmidt y colaboradores describieron el Péptido 1 Similar al Glucagón (GLP-1, por sus siglas en inglés), una hormona secretada principalmente por las células L del intestino delgado en respuesta a la ingesta de alimentos. El GLP-1 tiene un papel fundamental en la regulación de la glucemia a través de varios mecanismos: en primer lugar, mediante la estimulación de la secreción de insulina por parte de las células β ante un estímulo de aumento en los niveles de glucosa en sangre [124]. Este efecto insulinotrópico se alcanza mediante la unión de GLP-1 a su receptor específico (GLP-1R), que está acoplado al aumento de los niveles intracelulares de AMPc y Ca2+ en las células β [122]. En segundo lugar, mediante la inhibición de la secreción de glucagón por parte de las células αpancreáticas, contribuyendo así a que los niveles de glucemia no se disparen y manteniéndolos en un rango normoglucémico [125]. Además de eso, GLP-1 tiene un papel ralentizando el vaciado gástrico, disminuyendo la ingesta [126], y ralentizando la tasa de producción de glucosa endógena [127]. Al igual que GIP, GLP-1 es susceptible a la degradación enzimática por la DPP-4, la cual lo convierte en una forma biológicamente inactiva. Introducción 47 Figura 6. Representación esquemática de la regulación de la glucólisis. Las flechas rojas indican inhibición, mientras que las flechas verdes indican activación. Imagen de elaboración propia con Biorender. 1.1.6.2 Almacenamiento de glucosa en el hígado: glucogenogénesis Como se mencionó anteriormente, la G6P puede desviarse hacia la síntesis de glucógeno, el cual supone un almacén de glucosa importante en estado de ayuno. El exceso de glucosa proveniente de la dieta que no se almacena como glucógeno se convierte en grasa mediante lipogénesis de novo en el hígado [145]. UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 48 A nivel molecular, la G6P es isomerizada en glucosa 1-fosfato (G1P) por la enzima fosfoglucomutasa (PGM-1), y entonces es convertida por la enzima glucuroniltransferasa (UGT) en UDP-glucosa, que es el precursor del glucógeno. La glucogenina (GYG1/2) inicia la síntesis de glucógeno por autoglucosilación, transportando residuos de glucosa desde la UDP-glucosa hacia sí misma, formando una cadena corta linear de aproximadamente 10-20 residuos de glucosa. La GS es la enzima más importante en este proceso, ya que permite la elongación de las cadenas de glucógeno, catalizando la transferencia del residuo de glucosa de la UDP-glucosa al extremo no reductor de la cadena de glucógeno preexistente, mediante un enlace α1-4 glucosídico [139]. 1.1.6.2.1 Regulación de la glucogenogénesis La activación de la GS, enzima clave de la glucogenogénesis, y la inhibición de la GP, la enzima clave de la glucogenolisis, son los dos procesos clave que regulan la formación de glucógeno. Las dos son alostéricamente reguladas por G6P, el precursor del glucógeno, de manera que la G6P activa alostéricamente a la GS, mientras que inhibe la GP [134, 135]. La actividad de ambas enzimas es también regulada por modificaciones postraduccionales. La fosforilación de la GS, principalmente por la enzima glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK- 3), inhibe la actividad de la enzima. En contraste, la fosforilación de la GP aumenta su actividad. Tanto la GS como la GP son susceptibles de desfosforilación por la proteína fosfatasa 1 (PP1). Se ha visto que tanto la glucosa como la insulina aumentan la actividad de PP1, mientras que el glucagón y la epinefrina han sido relacionados con su inactivación [133]. Con todo, en condiciones de ayuno, la GSK-3 desfosforilada y activa, fosforila e inactiva a la GS, llevando a la inhibición de la síntesis de glucógeno hepático. Sin embargo, en estado postpandrial, la insulina secretada por las células β-pancreáticas estimula la GS mediante la activación de AKT, que fosforila e inactiva a GSK-3, por tanto, aumentando la síntesis de glucógeno. Además, la insulina también estimula la acetilación de la GP, lo cual promueve su desfosforilación e inhibición por la PP1, inhibiendo así la glucogenolisis [146]; y estimula la expresión de la GK, lo cual indirectamente aumenta la captación de glucosa por los hepatocitos al aumentar la fosforilación de la glucosa y generar G6P [147]. Por tanto, de manera indirecta, estimula la glucogenogénesis al aumentar los niveles de G6P. Introducción 49 Por otro lado, la secreción de glucagón y catecolaminas (adrenalina y noradrenalina), activan a PKA mediante el aumento de los niveles intracelulares de AMPc. PKA fosforila y activa entonces la GP. El glucagón también inhibe la acetilación de la GP, lo cual disminuye la habilidad de la PP1 de unirse a la GP, y por tanto disminuye su capacidad de desfosforilación e inactivación de esta enzima [146]. Figura 7. Representación esquemática de la regulación de la glucogenogénesis y glucogenolisis. Imagen de elaboración propia con Biorender. 1.1.6.3 Producción endógena de glucosa Durante el estado de ayuno, la combinación de altos niveles de glucagón y bajos niveles de insulina incrementa la producción hepática de glucosa para responder a las demandas energéticas de los tejidos periféricos. El hígado contribuye a la producción endógena de glucosa mediante dos vías de producción de G6P. En la fase postabsortiva inicial, es decir, durante períodos cortos de ayuno, la G6P hepática deriva de la lisis del glucógeno (glucogenolisis). Sin embargo, a medida que el ayuno se prolonga en el tiempo, los depósitos de glucógeno se van agotando, y entonces la G6P proviene de la síntesis de novo (gluconeogénesis). Se considera que los depósitos de glucógeno contribuyen a la producción endógena de glucosa durante 10-12h en roedores y 20h en humanos. 1.1.6.3.1 Glucogenolisis UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 50 La degradación de glucógeno en el citosol de los hepatocitos se lleva a cabo por la acción de dos enzimas: la GP y la enzima desramificadora de glucógeno (AGL). La GP libera glucosa- 1-fosfato de la cadena lineal de glucógeno, mientras que la AGL separa o desramifica las diferentes cadenas de glucógeno. Regulación de la glucogenolisis La GP es activa cuando es fosforilada en el residuo de serina 14. El glucagón y la adrenalina, que incrementan los niveles intracelulares de AMPc, promueven la activación de la PKA, que fosforila y activa a GP, desencadenando de este modo la glucogenolisis. La AGL es la enzima encargada de la desramificación del glucógeno, es decir, la enzima encargada de eliminar las ramificaciones de una cadena de glucógeno, convirtiendo las ramas en cadenas lineales, lo que facilita su posterior degradación y liberación de glucosa. La regulación de la AGL se ve afectada por la PKA activada tras la unión del glucagón a su receptor, de manera que PKA fosforila y activa la AGL. La deficiencia congénita de la GP causa la enfermedad de Hers, que se caracteriza por la incapacidad de movilizar glucosa a partir del glucógeno en respuesta a ayuno o a glucagón [148], mientras que la deficiencia de la AGL provoca la enfermedad de Cori-Forbes, que se caracteriza por la acumulación excesiva de glucógeno en los tejidos afectados, entre ellos el hígado, el corazón y el músculo esquelético [149]. El resultado final de la glucogenolisis es la liberación de glucosa-1 fosfato a partir del glucógeno almacenado. Esta se convierte en glucosa-6 fosfato, que luego se hidroliza en glucosa y Pi mediante la enzima glucosa-6-fosfatasa (G6Pasa). En este punto, hay que señalar que el almacenamiento de glucógeno es una especificidad del hígado entre los órganos gluconeogénicos, ya que el riñón y el intestino delgado son incapaces de realizar la síntesis de glucógeno en condiciones fisiológicas [150]. Además, aunque el tejido muscular sí tenga la capacidad de sintetizar glucógeno, la glucosa liberada tras la glucogenolisis no puede ser liberada a la circulación y por tanto ser utilizada por otros tejidos, ya que el músculo no posee la G6Pasa que desfosforila la G6P. Por tanto, la G6P queda retenida en el tejido muscular y solo puede ser derivada hacia glucólisis para así obtener energía para su propio funcionamiento [151]. Introducción 51 Figura 8. Representación esquemática de glucogenolisis y sus enzimas implicadas. Imagen de elaboración propia con Biorender. Ciclo de Cori Debido a que el músculo no posee la enzima G6Pasa que permita la liberación de la glucosa al torrente sanguíneo, en condiciones donde el requerimiento de glucosa por parte del músculo (por ejemplo, durante un ejercicio de alta intensidad) sea alto, existe el denominado Ciclo de Cori. Este consiste en la circulación cíclica de glucosa y lactato entre el hígado y el músculo. En estas condiciones de alta intensidad, el glucógeno muscular se desdobla a glucosa y, mediante glucólisis anaerobia (fermentación), la enzima lactato deshidrogenasa convierte el piruvato en lactato. El lactato viaja hasta el hígado a través del sistema circulatorio, y ahí se convierte de nuevo en glucosa a través de la gluconeogénesis. Esta glucosa retorna a la circulación y es llevada de nuevo al músculo. De esta manera, la célula muscular obtiene ATP de manera inmediata pese a las condiciones de baja disponibilidad de oxígeno, evitando la acidosis láctica, y se regenera el NAD+ para que pueda continuar la glucólisis. UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 52 Figura 9. Representación esquemática del ciclo de Cori entre el hígado y el músculo. Imagen de elaboración propia con Biorender. 1.1.6.3.2 Gluconeogénesis Si el ayuno se prolonga en el tiempo, los depósitos de glucógeno se agotan y la síntesis de glucosa de novo a partir de precursores no glucídicos se convierte en el principal mecanismo para mantener la euglucemia. Este proceso, conocido como gluconeogénesis, es el mecanismo más importante de producción hepática de glucosa, ya que permite un aporte continuo de glucosa a los tejidos periféricos cuando las reservas de glucógeno se han agotado y el ayuno persiste o cuando la demanda energética es muy alta. Tan solo existen otros dos órganos, aunque con una contribución mucho menor que el hígado, que puedan llevar a cabo esta función: el intestino y el riñón. Los tres órganos poseen esta capacidad debido a que son los únicos órganos que expresan la enzima G6Pasa capaz de hidrolizar la G6P y liberarla al torrente sanguíneo [152, 153]. La gluconeogénesis constituye la ruta casi opuesta a la glucólisis, compartiendo ambos procesos siete reacciones enzimáticas, puesto que son reversibles. Tan solo difieren en cuatro enzimas, que son las que constituyen los puntos de control de la gluconeogénesis: la PDH, la G6Pasa, la fructosa 1,6-bifosfatasa (FBPasa1), la PC, y la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK o PCK) [133]. La deficiencia congénita de cualquiera de estas enzimas da lugar a intolerancia al ayuno con hipoglucemia cetónica y acidosis láctica [154]. Introducción 53 La gluconeogénesis comienza con la conversión de piruvato en oxalacetato por la enzima PC en la mitocondria, y termina con la conversión en glucosa tras varias reacciones enzimáticas en el citosol. Inicialmente, PC cataliza la carboxilación del piruvato para formar oxalacetato, que ingresa en el Ciclo de Krebs. Esta reacción, además de ser necesaria para la síntesis de novo de la glucosa, es un proceso anaplerótico muy importante, que permite reponer los niveles de oxalacetato en el Ciclo de Krebs [138, 155, 156]. Los niveles de PC están débilmente regulados por su activación transcripcional, aunque sí se ha descrito que en estado de ayuno se incrementa su expresión y sus niveles de proteína [157]. Dado que el oxalacetato formado por PC se debe transportar fuera de la mitocondria, al citosol, donde se encuentran el resto de enzimas gluconeogénicas, el oxalacetato es reducido a malato por la enzima malato deshidrogenasa mitocondrial. De esta manera, el oxalacetato se transporta al citosol en forma de malato mediante un sistema llamado lanzadera malatoaspartato. Una vez en el citosol, el malato es reoxidado a oxalacetato por la enzima malato deshidrogenasa citosólica. Figura 10. Representación esquemática de la lanzadera de malato-aspartato entre la matriz mitocondrial y el citosol. Imagen de elaboración propia con Biorender. UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 54 Durante el ayuno, se estimula la carboxilación de piruvato para producir glucosa, mientras que se suprime la oxidación de glucosa mediante la descarboxilación de piruvato por el complejo PDH [158]. Este complejo se ve inhibido por quinasas PDKs, las cuales lo fosforilan e inactivan, reduciendo la conversión de piruvato a acetil-CoA y por tanto reduciendo la entrada de este último al ciclo de Krebs [159]. Existen 4 isoformas que fosforilan a la PDH, siendo PDK2 y PDK4 las isoformas más abundantes, expresándose en una gran variedad de tejidos, aunque mayoritariamente en corazón, riñones e hígado; mientas que PDK3 y PDK1 se limitan a expresarse en cerebro e hígado [160, 161]. De este modo, los niveles de PDK2 y PDK4 se ven aumentados durante el ayuno y en pacientes diabéticos [162]. La deleción de PDK4 aumenta la actividad del complejo PDH, por lo que el piruvato es dirigido hacia el ciclo de Krebs para su oxidación completa, y deja de estar disponible para la gluconeogénesis. Esto último provoca una hipoglucemia durante el ayuno en los ratones knockout de PDK4 [163, 164]. Una vez convertido el piruvato en oxalacetato, la enzima PCK1 cataliza la formación de PEP a partir de oxalacetato. Una vez en el citosol, el PEP es secuencialmente transformado en 2- fosfoglicerato, 3-fosfoglicerato, 1,3-bifosfoglicerato, y gliceraldehido 3-fosfato, una triosa que puede interconvertirse en dihidroxiacetona fosfato. La combinación de gliceraldehido y dihidroxiacetona fosfato produce F1,6BP, y la desfosforilación de esta da lugar a F6P, que se transforma en glucosa 6-fosfato (G6P). Entre los sustratos gluconeogénicos se encuentran algunos aminoácidos, los cuales pueden convertirse en piruvato o en intermediarios del ciclo de Krebs; el lactato (que puede ser convertido en piruvato por la enzima lactato deshidrogenasa); y el glicerol, proveniente de la lipólisis del tejido adiposo, que puede convertirse en dihidroxiacetona fosfato (DHAP), que pasa a glicerol 3-fosfato (G3P) o directamente a F1,6BP, por tanto entrando en la ruta gluconeogénica por encima o después de PCK1 [165]. La enzima bifuncional fosfofuctoquinasa 2 (PFK2)/ FBPasa2 (PFKFB1) juega un papel crítico en el cambio de gluconeogénesis a glucólisis, y viceversa [141]. Esta enzima bifuncional regula la producción de F2,6-BP, que es un activador alostérico de la PFK1, una enzima de la ruta glucolítica. Cuando los niveles de glucosa son bajos, el glucagón inactiva PFK2, aumentando la actividad de la FBPasa. Esto provoca una disminución en la producción Introducción 55 de F2,6BP y reduce la glucólisis y potencia la gluconeogénesis. La enzima FBP1 convierte F1,6BP en F6P, que entonces se convierte en G6P. Esta entra en el retículo endoplasmático, donde la G6Pasa convierte la G6P en glucosa. UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 56 Figura 11. Representación esquemática de gluconeogénesis y los puntos de integración de los diferentes sustratos gluconeogénicos. Las vías relacionadas con la gluconeogénesis están marcadas en violeta, mientras que aquellas de la glucólisis permanecen en negro. Imagen de elaboración propia con Biorender. Introducción 63 En cuanto al metabolismo del glucógeno, PKA fosforila y activa la glucógeno fosforilasa quinasa (GPK), que a su vez fosforila y activa la GP, enzima clave en la glucogenolisis que cataliza la liberación de glucosa-1-fosfato (G1P) a partir del glucógeno almacenado. PKA también fosforila y desactiva la glucógeno sintasa, una enzima que cataliza la síntesis de glucógeno [193]. Por último, el glucagón regula la tasa glucolítica mediante la inhibición de la fosfofructoquinasa-1 (PFK-1). Al inhibir esta enzima, el glucagón reduce la conversión de F6P a F1,6P, un paso crucial en la glucólisis [201-203]. La acción del glucagón cesa cuando el glucagón se disocia de su receptor o cuando se degrada el AMPc por la enzima fosfodiesterasa. Figura 13. Representación esquemática de la regulación de los niveles de glucosa mediante la vía de señalización del glucagón y la adrenalina. Imagen de elaboración propia con Biorender. UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 64 Regulación por glucocorticoides y receptores nucleares La regulación de la gluconeogénesis mediada por glucocorticoides es principal y directamente a través de la estimulación de la transcripción de PCK1, aunque también G6Pasa y FBPasa. A nivel molecular, los glucocorticoides, como el cortisol, son sustancias liposolubles que pueden atravesar la membrana celular hacia el citosol, donde se unen a su receptor (GR) reclutado por chaperonas [204]. La unión del glucocorticoide a su receptor provoca la disociación de las chaperonas, y el complejo GR-glucocorticoide puede entonces translocarse al núcleo, donde interacciona con regiones específicas del ADN, llamadas elementos de respuesta a glucocorticoides (GRE, por sus siglas en inglés), presentes en los promotores de los genes diana. La unión del complejo GR-glucocorticoide al GRE del promotor de PCK1 estimula su transcripción y por tanto la gluconeogénesis. El knockdown de GR en el hígado inhibe la expresión de genes gluconeogénicos, reduce los niveles de glucosa en ayuno, y reduce la hiperglucemia en ratones db/db y con diabetes inducida por estreptozotocina (STZ) [205, 206]. La desacetilasa HDAC6 desacetila a la chaperona HSP90, evitando que esta se disocie del GR y por tanto evitando la translocación nuclear del GR. Los ratones knockout de HDAC6 poseen una translocación nuclear aberrante del GR, y por tanto menores niveles de activación transcripcional de los genes PCK1, G6Pasa, FBPasa y PC en el hígado [207]. Regulación por hormona de crecimiento La GH estimula la vía de JAK2/STAT5, donde STAT5, fosforilado y activado, se transloca al núcleo y se une directamente al promotor de PCK1 [208] y al de PDK4 [209], estimulando directamente la gluconeogénesis, e, indirectamente, inhibiendo la entrada de piruvato en el ciclo de Krebs y, por tanto, desviándolo hacia la producción de glucosa [210]. La acción gluconeogénica de la GH se encuentra regulada negativamente por múltiples factores, entre los que se encuentran los ácidos biliares y el factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21). Los primeros activan al receptor FXR, el cual estimula la expresión del represor SHP que impide la unión de STAT5 a los promotores de PCK1, PDK y G6Pasa, impidiendo así la gluconeogénesis. De este modo, se ha visto que ratones knockout de SHP Introducción 65 muestran una cierta hiperglucemia en ayuno y su sobreexpresión en ratones diabéticos mejora sus niveles de glucemia [212-214]. Regulación por insulina Tal como se ha mencionado en apartados anteriores en esta tesis, la insulina puede inhibir la producción hepática de glucosa de forma directa, actuando en el hígado a través de su receptor ubicado en la membrana celular, o de forma indirecta, actuando en el páncreas, el cerebro y el tejido adiposo [102]. Acordemente, la deleción de los receptores de insulina específicamente en el hígado tiene como resultado intolerancia a glucosa e hiperglucemia [211]. En línea con esto, la resistencia a insulina es un determinante para el desarrollo de la diabetes tipo 2. 1.1.6.4 Liberación de glucosa al torrente sanguíneo La G6P generada a partir de la glucogenolisis o la gluconeogénesis se transloca del citosol al retículo endoplásmico por el transportador de glucosa 6-fosfato (G6Pt, también conocido como SLC37A4), donde da lugar a glucosa mediante la desfosforilación por la G6Pasa. La deficiencia congénita de la G6Pt o la G6Pasa da lugar a la enfermedad de Von Gierke o glucogenosis tipo I (GSD-I), la cual se caracteriza por una acumulación anormal de glucógeno y una incapacidad de mantener la normoglucemia, por tanto dando lugar a una hipoglucemia durante los períodos interprandiales. La elevada acumulación intracelular de glucosa 6-fosfato promueve la utilización de vías alternativas para la utilización de glucosa, incluyendo la lipólisis, lo cual provoca un aumento en los niveles de triacilglicéridos y colesterol en sangre, y hepatomegalia debido a la acumulación de glucógeno y ácidos grasos en el hígado [212]. La glucosa es finalmente liberada al torrente sanguíneo a través de los transportadores bidireccionales GLUT2. Análogamente, los pacientes con mutaciones en el gen SLC2A2 que codifica para el transportador GLUT2 desarrollan el Síndrome de Fanconi-Bickel, padeciendo hipoglucemia en períodos de ayuno y acumulación de glucógeno [213]. 1.2 Modificaciones postraduccionales La actividad de una proteína puede ser modificada de varias maneras para regular su función biológica. De hecho, las modificaciones postraduccionales de proteínas son los mayores UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 66 reguladores de las funciones de una célula eucariota. En ese sentido, las modificaciones postraduccionales (PTMs) de proteínas reguladoras permiten respuestas adaptativas a una variedad de señales metabólicas. De este modo, la actividad de una proteína puede ser modificada de diversas maneras para regular su función biológica. Estas modificaciones pueden ser reversibles o irreversibles y están reguladas por diversos procesos celulares [214, 215]. La ubiquitinación es la mejor caracterizada de esas modificaciones y está involucrada en la regulación de cada aspecto de la homeostasis celular, principalmente a través de sus funciones proteosomales [216]. 1.2.1 Ubiquitinación La ubiquitinación es una de las modificaciones postraduccionales más importantes que juegan un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis y para el correcto funcionamiento celular. La ubiquitinación de proteínas tiene lugar por una serie secuencial de tres reacciones enzimáticas: en primer lugar, el residuo Gly del extremo C-terminal de la ubiquitina es activado mediante ATP por una enzima E1 activadora, la E1 ubiquitinaactivante (UBE1), dando lugar a la formación de un enlace tioéster entre la ubiquitina y el residuo Cys del centro activo de la enzima E1. A continuación, la ubiquitina activada se transfiere a un residuo Cys de una enzima E2 conjugadora una vez más mediante un enlace tioéster. Finalmente, una enzima E3 ligasa une el extremo C-terminal de la ubiquitina a un residuo Lys de una proteína sustrato mediante un enlace peptídico. La unión de una molécula de ubiquitina a una proteína sustrato altera su localización celular o su función. Sin embargo, la adición de varios residuos de ubiquitina (poliubiquitinación) es señal para la degradación de dicha proteína en el sistema proteosomal [217]. Introducción 67 Figura 14. Representación esquemática del (1) proceso de ubiquitinación y (2) su papel en la degradación de proteínas por el proteosoma. Adaptado de "Ubiquitin proteasome system", por BioRender.com (2023). Obtenido de https://app.biorender.com/biorender-templates 1.2.2 Nedilación Análogamente, la nedilación es un proceso de conjugación de la proteína NEDD8 (neural precursor cell-expressed developmentally downregulated protein 8) a proteínas diana, no para marcarlas para degradación, sino para regular su función y actividad. NEDD8 es una proteína tipo ubiquitina, y, entre todas las proteínas de esta familia, NEDD8 es la que poseen la mayor similitud y homología con respecto a la ubiquitina [218]. NEDD8 fue por primera vez descrito que se expresa en el cerebro de ratones en fase embrionaria [219], jugando un papel en la embriogénesis, y cuya expresión disminuye en el cerebro en fases del desarrollo más avanzadas. Pese a que tanto NEDD8 como ubiquitina contengan una secuencia conservada de residuos Leu-Arg-Gly-Gly en su extremo C- terminal, y que es crucial en el caso de la ubiquitina para su conjugación a proteínas sustrato, ambas proteínas difieren en sus funciones debido a diferencias en sus estructuras [218]. De este modo, NEDD8 posee siete residuos diferenciales que se conservan entre sus ortólogos pero que difieren de los de la ubiquitina, por tanto siendo responsables de las interacciones específicas de NEDD8. Uno de esos residuos, Ala-72, impide la interacción de NEDD8 con UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 68 la enzima ubiquitina E1 [220], mientras que los otros seis son esenciales para regular las actividades de ubiquitina ligasa de NEDD8 [221]. Al igual que la ubiquitina, NEDD8 es sintetizado como un precursor con cinco residuos adicionales en su extremo C-terminal que son escindidos por hidrolasas como la hidrolasa L3 ubiquitina C-terminal (UCH-L3) [222] y la desdenilasa 1 (NEDP1/DEN1/SENP8) [223, 224], con el fin de dejar expuesto un residuo de glicina en su extremo C-terminal. Mientras que UCHL3 posee una especificidad dual por procesar tanto NEDD8 como ubiquitina [225], DEN1 es específica del procesamiento del precursor de NEDD8, así como de su desconjugación de las proteínas sustrato [226]. Una vez procesado, NEDD8 se une covalentemente a proteínas sustrato de una manera similar a la ubiquitina mediante una cascada de enzimas E1 activadoras, enzimas E2 conjugadoras y enzimas E3 ligasas. En un primer momento, el NEDD8 maduro es activado por una enzima E1 activadora, la enzima E1 activadora de NEDD8 (NAE1), que es en realidad un heterodímero, formado por una subunidad reguladora NAE1/APPBP1 y una subunidad catalítica UBA3 (abreviatura de Modificador similar a la ubiquitina que activa la enzima 3) [227]. El dominio pliegue de ubiquitina (UFD) en el extremo C-terminal de UBA3 juega un papel importante mediando las interacciones con las enzimas E2 conjugadoras de NEDD8 [228]. Una vez activado por NAE1, NEDD8 es transferido a un residuo de cisteína de una enzima E2 conjugadora de NEDD8 mediante una reacción de transtiolación. Hasta ahora se han identificado dos enzimas E2 conjugadoras de NEDD8: UBE2M (también conocida como Ubc12) y UBE2F [229, 230]. La extensión N-terminal y el dominio catalítico de UBA2M o UBE2F interacciona con el surco hidrofóbico de UBE3 y el UFD de NAE1, respectivamente [231]. Además, en los últimos años se ha demostrado que UBE2M y UBE2F interaccionan entre sí, de manera que UBE2M promueve la ubiquitinación y degradación de UBE2F, tanto en condiciones fisiológicas como de estrés [232]. Tras la formación del puente tioéster, el complejo E2-NEDD8 interacciona con E3-ligasas para transferir el residuo de NEDD8 a proteínas diana. Los sustratos nedilados pueden ser desnedilados por una desnedilasa, que son proteasas como NEDP1 (proteasa 1 específica de Introducción 69 NEDD8) y CSN (signalosoma COP9), y el NEDD8 libre es reciclado. De entre todos los sustratos nedilados que han sido identificados hasta ahora, solo las proteínas cullin se consideran su sustrato fisiológico [233]. Figura 15. Representación esquemática la cascada de nedilación. Imagen de elaboración propia con Biorender. 1.2.2.1 Complejo CRL La nedilación está estrechamente relacionada con los complejos CRL (Cullin-RING Ligase), que son complejos proteicos involucrados en la ubiquitinación de proteínas, responsables del 20% de ubiquitinaciones de proteínas para su degradación en el sistema proteosomal. La unión de NEDD8 a una lisina C-terminal de las cullins provoca un cambio de conformación abierto del CRL, lo cual da lugar a su activación y permite el acceso de sustratos para ser ubiquitinizados [234]. El complejo CRL es una E3 formada por cuatro componentes, incluidas las cullins, una proteína adaptadora, un receptor que reconoce el sustrato, y una proteína RING. Estructuralmente, las cullins actúan como proteínas andamio con su extremo N-terminal unido a una proteína adaptadora, y a una proteína receptor de sustrato, y con su extremo C- terminal unido al componente proteína RING [235]. UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 70 Figura 16. Representación esquemática del complejo cullin-RING ligasas. Imagen de elaboración propia con Biorender. En el genoma humano se han identificado ocho miembros de la familia cullin (CUL1, CUL2, CUL3, CUL4A, CUL4B, CUL5, CUL7 y CUL9), todos ellos con un dominio homólogo cullin conservado en su extremo C-terminal, el cual es responsable de la interacción de las cullins con el componente RING, el cual está constituido por la proteína RBX1 (Ring-Box 1) o RBX2 (Ring-Box 2), las cuales están involucradas en la transferencia de la ubiquitina a proteínas sustrato diana. El dominio N-terminal de las proteínas RING media la unión con la proteína cullin, mientras que su extremo C-terminal se une y activa enzimas E2 conjugadoras. UBE2M promueve la nedilación de proteínas cullins asociadas a Rbx1 (CUL1-3, CUL4A y CUL4B), mientras que UBE2F promueve la nedilación de la CUL5 asociada a Rbx2 [231, 235]. Con respecto a las proteínas adaptadoras, Skp1 se une a las cullins 1 y 7, la elongina B/C interacciona con las cullins 2 y 5, y DDB1 a las cullins 4A y 4B. Por otro lado, con respecto a los receptores reconocedores de sustrato, se han identificado 69 proteínas F-box para CRL1/SCF, 80 proteínas SOCS para CRL2/5 180 proteínas BTB para CRL3, 90 proteínas DCAF para CRIL4A/4B, y una proteína adaptadora, FBXW8, para CRL7 [236]. Con todo, las CRLs consisten en más de 400 componentes que forman las ocho ubiquitinaligasas E3 dependientes de las cullin-RING. Introducción 71 En general, la mayoría de proteínas de vida corta son sustratos de CRLs, incluyendo reguladores del ciclo celular, factores de transcripción, moléculas de señalización, y proteínas reguladoras de la transcripción y apoptosis. Dado que los sustratos de las CRLs son varias moléculas clave en diferentes procesos celulares, no es de extrañar que las CRLs y su activación por nedilación jueguen un papel clave en multitud de procesos biológicos. Ello también implica que las CRLs se encuentren anormalmente reguladas en varias enfermedades en humanos y que hayan servido como dianas terapéuticas para el tratamiento de dichas enfermedades [237, 238]. Figura 17. Representación esquemática de la familia de cullin-RING ligasas: componentes y sustratos. Imagen de elaboración propia con Biorender basada en la fig.1.3 de [235]. 1.2.2.2 Proteínas reguladas por nedilación Los sustratos susceptibles de ser nedilados incluyen no solo cullins sino también varias proteínas no cullins, lo que sugiere que la nedilación, además del CRLs, regula varios procesos celulares, entre los cuales se incluye la señalización de receptores tirosina quinasas, UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 72 apoptosis, respuesta de daño al ADN y transcripción [239]. Entre esas proteínas susceptibles de ser nediladas se encuentran el gen 3 asociado a cáncer de mama (BCA3, por sus siglas en inglés), el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), el factor 1α inducible por hipoxia (HIF-1α), el inhibidor de apoptosis ligado al cromosoma X (XIAP), la caspasa 7 [240-244] y el factor de transcripción p53, una proteína supresora tumoral [245], cuya nedilación por la ligasa MDM2 (de sus siglas en inglés "murine doble minute 2") previene su translocación nuclear [246] y suprime su actividad transcripcional [247] mediante su degradación proteosomal a través de su ubiquitinación. Curiosamente, y como es común con las ligasas de la familia RING, se ha descrito que MDM2 a su vez se autonedila [247]. Consistentemente, la sobreexpresión o inhibición de NAE1 inhibe o potencia la actividad de p53, respectivamente [248]. Por otro lado, el papel de la nedilación en la regulación transcripcional se ha extendido a otros miembros de la familia de p53, de manera que la nedilación de TP73 inhibe la actividad transcripcional debido a su reclusión citoplasmática [247, 249]. Como último ejemplo, también se ha descrito que la nedilación estabiliza al antígeno humano R (HuR) [250, 251], una proteína de unión a ARN que estabiliza los ARNm diana implicados en la desdiferenciación, proliferación y supervivencia celular, todas características bien establecidas del cáncer. Con ello, la estabilización de HuR por su nedilación promueve la supervivencia del carcinoma hepatocelular y las células de cáncer de colon [251, 252]. Ante este contexto de cáncer no es de extrañar que los niveles de enzimas catalíticas de la nedilación (NAE1, NEDD8, UBE2M/UBE2F) se encuentren significativamente incrementados en varios tipos de cánceres humanos, incluyendo cáncer de pulmón, hepatocarcinoma, glioblastoma y cáncer de mama [237, 238, 253, 254], lo cual ha hecho de la nedilación una diana atractiva para terapias oncológicas. Esto ha propiciado el desarrollo del fármaco MLN4924 (también conocido como Pevonedistat), un potente y selectivo inhibidor de NAE1 descubierto en 2009 [255]. El MLN4924 forma un aducto con NEDD8, inhibiendo la actividad enzimática de NAE1 [256]. Se ha descrito que el MLN4924 ejerce significativos efectos anticancerígenos, principalmente desencadenando apoptosis celular, senescencia y autofagia [238, 253, 257, 258]. En contraste, y en un contexto más fisiológico, la inhibición farmacológica, mediante MLN4924, de la nedilación de PPARγ reduce la adipogénesis y la formación de gotas lipídicas en el tejido adiposo [259-262]. Metodología 79 4. METODOLOGÍA 4.1 Animales de experimentación Todos los procedimientos realizados en los animales fueron realizados bajo la aprobación del Comité Ético de la Universidad de Santiago de Compostela, bajo la responsabilidad del profesor Rubén Nogueiras Pozo, y registrados con el número de procedimiento 15010/2017/007 (anexo 1) y bajo el cumplimiento del Real Decreto 53/2013 del 1 de febrero. Por tanto, dicho procedimiento se ha realizado bajo el amparo del marco legislativo vigente: Directiva 2010/63/UE del Parlamento y Consejo Europeo del 22 de septiembre de 2010 relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos; traspuesto a la norma española con el Real Decreto 53/2013, del 1 de febrero, por el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y otros fines científicos, incluyendo la docencia. Además, considerando las implicaciones éticas asociadas al uso de animales con fines científicos, los diseños experimentales se realizaron teniendo en cuenta el principio de las tres erres (reducción, refinamiento y reemplazo), por tanto intentando utilizar el menor número de animales posible, que los procedimientos fuesen lo menos dolorosos posible para ellos, y utilizando modelos in vitro siempre que fuese una alternativa. Los diferentes modelos animales utilizados en esta tesis fueron mantenidos en el animalario CEBEGA, en Santiago de Compostela, en condiciones libres de patógenos (SPF), mantenidos en salas con temperatura regulada en torno a 22°C y con ciclos de luz oscuridad de 12h (08.00 horas - 20.00 horas), y con un periodo de aclimatación en las instalaciones de mínimo de 7 días previos a cualquiera procedimiento. 3.1.1. Modelos animales. En esta tesis doctoral se han empleado indistintamente machos o hembras de las siguientes cepas: o Ratones wild type (WT) C57BL/6J suministrados por el Centro de Investigación Animal de Galicia (CEBEGA). o Ratones con el gen Pck1 flanqueado por secuencias LoxP (background genético agouti y C57BL/6J). UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 80 o Ratones que expresan el gen de la recombinasa Cre bajo la expresión del promotor de la albúmina y los enhancers de la α-fetoproteina (transgen AlfpCre), configuración que potencia la transcripción de la albúmina [272]. o Ratones heterocigotos de NAE1 (background C57BL/6J) proporcionados por el laboratorio de la Dr.Martínez-Chantar, del CIC bioGUNE [273]. o Ratones bioNEDD8 (background C57BL/6J) con NEDD8 biotinizado, proporcionados por el laboratorio de la Dr.Martínez-Chantar, del CIC bioGUNE. o Ratones BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J (db/db), procedentes de la casa comercial The Jackson Laboratory (ref. 000642). Durante todo ese tiempo, los animales fueron mantenidos en condiciones de acceso libre a dieta estándar (61,3% carbohidratos, 25,2% proteínas y 13,5% grasas) y a agua, excepto en los procedimientos experimentos en los que se especifique otra condición. Para verificar el correcto bienestar de los animales, estos fueron monitorizados periódicamente mediante un seguimiento controlado de masa corporal e ingesta, además de valorar su correcto aspecto físico y conductual, y acostumbrarlos al manejo por el personal del laboratorio para reducir en todo lo posible el estrés generado durante los experimentos llevados a cabo. La estabulación de los animales fue colectiva en todos los experimentos, a excepción de las restricciones calóricas y tras las cirugías, donde en esos casos permanecieron individualizados. El número de animales utilizado en cada experimento está indicado en su correspondiente pie de figura. Para todos los experimentos se utilizó una mezcla de ratones tanto machos como hembras dentro de cada grupo experimental, excepto en una única ocasión en la que figura indicado que se utilizaron solamente hembras. Los animales fueron sacrificados y los tejidos recolectados rápidamente se introdujeron en hielo seco para evitar su degradación. Los tejidos y los sueros sanguíneos fueron mantenidos a −80 °C hasta que fueron analizados. Metodología 81 4.2 Procedimientos en animales 3.2.1 Monitorización de la ingesta y el peso corporal. La determinación de la masa corporal y la ingesta se realizó mediante una balanza de precisión una vez a la semana, siempre el mismo día de la semana. Dado que los animales se mantuvieron en grupo en una misma caja, el cálculo de la ingesta se realizó mediante el promedio en función del número de individuos de cada caja. 4.2.1 Estudio del efecto del estado nutricional en los niveles de nedilación Para estudiar el efecto del estado nutricional en los niveles hepáticos de los marcadores de nedilación (NAE1, NEDD8 y cullins nediladas), los ratones WT fueron alimentados ad libitum con dieta estándar, sometidos a ayuno durante 24 h, o sometidos a ayuno durante 24 h y después realimentados con dieta estándar durante 24 h más. 4.2.2 Estudio del efecto de la glucosa en los niveles de nedilación Para estudiar el efecto de la glucosa sobre los niveles hepáticos de los marcadores de nedilación (NAE1, NEDD8 y cullins nediladas), los ratones WT fueron alimentados ad libitum con dieta estándar, sometidos a ayuno durante 24 h, o sometidos a ayuno durante 24 h y después realimentados únicamente con azúcar (AB Azucarera Iberia S.L) durante 24 h más. 4.2.3 Ayuno de 24 horas Para estudiar el papel de la nedilación en la producción de glucosa durante el ayuno, los ratones fueron sometidos a un ayuno de 24 horas desde las 08.30 horas hasta las 08.30 horas del día siguiente. Se les pesó y se les midieron los niveles de glucemia con un glucómetro antes y después del ayuno. 4.2.4 Restricción calórica Para la realización del ensayo de restricción calórica, los animales fueron individualizados los 5 días previos al comienzo del ensayo, con acceso ad libitum a dieta estándar previamente pesada. Durante esos días de aclimatación, se monitorizó la ingesta para determinar la cantidad de comida consumida diariamente por cada ratón. Tras eso, los ratones fueron divididos aleatoriamente en dos grupos, de los cuales uno de ellos continuó cinco días más UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 82 con dieta ad libitum, mientras que los ratones del otro grupo fueron sometidos a una restricción del 60% de su ingesta [274]. Cada día a las 17.30 horas se les pesó y midió sus niveles de glucemia y, a las 18:00 horas se alimentó a cada uno de estos ratones sometidos a restricción calórica con la cantidad equivalente al 40% de su ingesta diaria durante la semana de aclimatación. Finalmente, los ratones fueron sacrificados a las 17:30 horas (antes de ser alimentados) del cuarto día de restricción calórica y el suero sanguíneo y el hígado fueron recogidos para su análisis. 4.2.5 Inyección intraperitoneal La inyección intraperitoneal (ip) consiste en la administración de sustancias en la cavidad peritoneal, que es el espacio que rodea los órganos vitales. La inyección se realiza en el cuadrante inferior derecho o izquierdo del abdomen del animal, sujetando a este en posición decúbito supina y ligeramente inclinado hacia abajo para desplazar las vísceras hacia abajo y no perforarlas. La aguja BD Microlance, 25G 5/8” 0.5x16 mm, BD Medical Surgicals Systems), acoplada a una jeringa (1 ml BD sliptip siringe, bulk, non-sterile, BD Medical Surgicals Systems), se introduce en un ángulo de 45⁰ hasta un punto donde no se note resistencia. 4.2.6 Administración de hormonas 4.2.6.1 Administración de leptina Para estudiar el efecto de la leptina en la regulación de los niveles de proteínas de los marcadores de nedilación (NAE1, NEDD8 y cullins nediladas) en el hígado, ratones WT fueron tratados con salino como vehículo, o con leptina recombinante (Sigma Aldrich, ref. L4146) en una dosis de 0.5 mg/kg cada 12 horas durante 3 días, administrada por vía ip [275]. 4.2.6.2 Administración de glucagón Los ratones, mantenidos previamente en ayuno durante la noche, fueron tratados con salino o con glucagón 200 μg/kg (Sigma-Aldrich, ref. G1774) por vía ip. Transcurridos 30 minutos tras la inyección, se midieron los niveles de glucosa en sangre [198] con un glucómetro (Glucocard, Arkray, EEUU). 4.2.6.3 Administración de adrenalina Metodología 83 Los ratones, mantenidos previamente en ayuno durante la noche, fueron tratados con salino o con L-adrenalina a una dosis de 100 μg/kg (ThermoFisher, ref. L04911) por vía ip. La dosis se escogió tras la realización de un ensayo de dosis respuesta, donde se seleccionó la dosis más baja capaz de elevar los niveles de glucosa en sangre (datos no mostrados). Los niveles de glucemia se midieron con un glucómetro a los 15, 30, 45 y 60 minutos tras la administración de la hormona. 4.2.6.4 Administración de cortisol Los ratones, mantenidos previamente en ayuno durante la noche, fueron tratados con salino o con succinato sódico de hidrocortisona a una dosis de 20 mg/kg (Santa Cruz Biotechnology, ref. sc-250130) por vía ip. La dosis se escogió tras la realización de un ensayo de dosis respuesta, donde se seleccionó la dosis más baja capaz de elevar los niveles de glucosa en sangre (datos no mostrados). Los niveles de glucemia se midieron con un glucómetro a los 15, 30, 45 y 60 minutos tras la administración de la hormona. 4.2.6.5 Administración de insulina Tras un ayuno de 6 horas, los ratones fueron tratados con salino o con insulina (Actrapid, Novo Nordisk) a una dosis de 0.35 U/kg por vía ip. Los niveles de glucosa en sangre fueron medidos con un glucómetro a los 10 y a los 20 minutos tras su administración. 4.2.7 Tests de tolerancia 4.2.7.1 Test de tolerancia a piruvato Para conocer la capacidad gluconeogénica de los diferentes grupos experimentales de ratones, se realizó un test de tolerancia a piruvato (PTT, pyruvate tolerance test), que es un sustrato potenciador de la gluconeogénesis [276]. Tras un ayuno nocturno de 12 horas, se midieron los niveles de glucemia basales y se realizó la administración de piruvato (Sigma- Aldrich, ref. P2256) por vía ip a una dosis de 1.25 g/kg. Se midieron los niveles de glucosa a los 20, 40, 60, 90 y 120 minutos después de la inyección. Con los datos obtenidos se construyó una curva, de la cual se calculó el área bajo la curva (AUC) de los distintos grupos experimentales. 4.2.7.2 Test de tolerancia a glucosa UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 84 Para conocer la capacidad de tolerancia a la glucosa de los diferentes grupos experimentales de ratones, se realizó un test de tolerancia a glucosa (GTT, glucose tolerance test) (Sigma- Aldrich, ref. G8270). Tras un ayuno nocturno de 12 horas, se midieron los niveles de glucemia basales y se realizó la administración de D-glucosa (2 g/kg) por vía ip [277]. Se midieron los niveles de glucosa a los 15, 30, 60, 90 y 120 minutos después de la inyección. Con los datos obtenidos se construyó una curva, de la cual se calculó el área bajo la curva (AUC) de los distintos grupos experimentales. 4.2.7.3 Test de tolerancia a insulina Para conocer la sensibilidad a insulina de los diferentes grupos experimentales de ratones, se realizó un test de tolerancia a insulina (ITT, insulin tolerance test) (Actrapid, Novo Nordisk). Tras un ayuno diurno de 6 horas que normaliza la glucemia y la insulinemia a niveles basales independientes del tiempo transcurrido desde la última comida, se midieron los niveles de glucemia basales y se realizó la administración de insulina (0.35 U/kg) por vía ip. Se midieron los niveles de glucosa a los 15, 30, 60, 90 y 120 minutos después de la inyección. Con los datos obtenidos se construyó una curva, de la cual se calculó el área bajo la curva (AUC) de los distintos grupos experimentales. 4.2.7.4 Test de tolerancia a glicerol Para conocer la capacidad de los diferentes grupos experimentales para producir glucosa a partir de glicerol, se realizó un test de tolerancia a glicerol (GlyTT, glicerol tolerance test), que es un precursor y, por tanto, potenciador de la gluconeogénesis. Tras un ayuno nocturno de 12 horas se realizó la administración de glicerol (1 g/kg) por vía ip [278]. Se midieron los niveles de glucosa a los 20, 40, 60, 90 y 120 minutos después de la inyección. Con los datos obtenidos se construyó una curva, de la cual se calculó el área bajo la curva (AUC) de los distintos grupos experimentales. 4.2.8 Tratamiento con MLN4924 Para comprobar el efecto que tiene el bloqueo de la nedilación, se administró MLN4924 (MedChemExpress, New Jersey, EEUU, ref. HY-70062), también llamado pevonedistat, un conocido inhibidor de NAE1 [255], a los ratones a una dosis de 60 mg/kg por vía subcutánea Metodología 85 3 días antes del experimento. 2-Hidroxipropyl-β-ciclodextrina (Sigma, #H107) fue utilizada como vehículo. 4.2.9 Inyección en la vena de la cola La inyección en la vena lateral de la cola del ratón (TVI, tail vein injection) es el método más común y eficiente de administrar vectores virales en el hígado. La infección en el hígado aumenta con la elección del AAV (virus adenoasociado) serotipo 8 como vector, pues posee una alta afinidad por infectar hepatocitos. Los ratones se inmovilizaron en un cepo (TV-150-STD, Bioseb, Francia) que deja libre la cola. Antes de administrar las sustancias, es necesario dilatar la vena mediante la exposición a una lámpara térmica durante unos 5-10 segundos. Cuando la vena esté dilatada, se procede desinfección con etanol 70% y, una vez desinfectada la zona, se procede a la administración de 100 µl de la sustancia, de manera casi paralela al vaso sanguíneo. Para comprobar si estamos accediendo a la vena de forma correcta, basta con comprobar si aparece sangre al aspirar, o bien, no apreciar ninguna resistencia al presionar el émbolo de la aguja al inyectar. Una vez inoculada la sustancia, se retira la aguja despacio, y se presiona la zona hasta detener la hemorragia. En esta tesis, se ha utilizado esta vía de administración para inyectar los diferentes virus que modifican la expresión génica de nedilación: Tabla 1. Lista de virus inyectados en la vena de la cola de los ratones. Virus Casa comercial y referencia Dosis (UV/ml) Vehículo AAV8-DIO-shNAE1 Vector Builder (ref. VB191026- 1075pqj) 1010 Suero fisiológico AAV8-DIO-shNEDD8 Vector Builder (ref. VB191025- 5729jaz) 1010 Suero fisiológico AAV8-DIO-NAE1 Vector Builder (ref. VB191025- 5576yay) 1010 Suero fisiológico AAV-DIO-EGFP Vector Builder (ref. VB010000- 9487ngd) 1010 Suero fisiológico AAV8-Cre-GFP Tebubio (#189SL100835) 1010 Suero fisiológico UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 86 AAV8-GFP Signagen Laboratories (ref. SL100,833) 1010 Suero fisiológico AAV8-PCK1 WT Origene (ref. RC204758) 1010 Suero fisiológico AAV8-K278R-K342R- K387R-PCK1 Vector Builder (ref. VB210921- 1406frv) 1010 Suero fisiológico 4.2.10 Determinación de la producción hepática de glucosa 4.2.10.1 Cirugía para la canulación de la vena yugular Para la determinación de la producción hepática de glucosa (HGP), previamente es necesario la implantación de un catéter en la vena yugular, para tener un punto de acceso vascular para la infusión de glucosa tritiada. La implantación del catéter se realiza como se describe: 7 días antes del ensayo, se anestesia al ratón con una mezcla de ketamina (80 mg/kg)/xilacina (5 mg/kg) vía ip combinado con una mezcla de isofluorano y oxígeno inhalado durante todo el procedimiento. A continuación, se rasuran las zonas de las incisiones, se desinfectan con clorhexidina (Galeno Especialidades Veterinarias S.L., España), y se coloca al animal en posición decúbito supino, en una zona de trabajo aséptica, y en dirección rostral hacia el investigador. Después se le administra antibiótico (Baytril, 10 mg/kg), y antiinflamatorios (Metacam, dosis 5 mg/kg), ambos por vía subcutánea. La cirugía comienza con la realización de una pequeña incisión en la zona derecha del cuello, unos 5 mm por encima del músculo pectoral. A continuación, se aísla la vena yugular con cuidado y se coloca y cierra una ligadura de seda 7/0 (Mersilk Ethicon, ref. W817) en el extremo. Se coloca otra ligadura, esta vez de forma holgada, en el extremo caudal de la vena expuesta. Se realiza una pequeña incisión con un ángulo de 30⁰ por encima de la ligadura cefálica y rápidamente se inserta 1 mm el catéter (Instech Laboratories, ref. C20PU- MJV2011) previamente rellenado con salino heparinizado a una concentración de 25 U/mL. Se cierra la ligadura caudal alrededor del catéter y se comprueba que la sangre fluye a través de este mediante el aspirado con una jeringa con salino heparinizado conectada al catéter. Se desconecta la jeringa del catéter y se cierra con un plug (Instech Laboratories, ref. SP25/12). A continuación, se coloca al ratón en posición decúbito prono, y se le realiza una pequeña incisión en la zona intraescapular tras haber desinfectado la zona con clorhexidina. Se atraviesa subcutáneamente hacia el lado ventral del animal, donde se localiza el extremo libre Metodología 87 del catéter unido a un plug. Este pasa subcutáneamente hacia el lado dorsal, donde se conecta a un botón de acceso vascular (Instech Laboratories, ref. VAB62BS/25). Por último, se suturan las incisiones con seda 5/0 (Mersilk Ethicon, ref. W500H) y se comprueba el flujo sanguíneo a través del botón dorsal mediante el uso de una jeringa heparinizada con 200 U/ml de heparina conectadas a un inyector PinPort (Instech Laboratories, ref. PNP3M). Durante todo el procedimiento de cirugía, los ratones siguen una monitorización del pulso, saturación de oxígeno y temperatura mediante el sistema de monitorización de PhysioSuite (Kent Scientific, Alemania). Solamente los ratones que hayan recuperado al menos 90% de su peso corporal tras 7 días de recuperación serán incluidos en los grupos experimentales. Los animales se someterán a un ayuno de 24 horas o a una restricción calórica antes del inicio de la prueba, momento en el cual se colocan en jaulas de libre movimiento conectados mediante un botón de acceso vascular en el dorso del animal, tal como se describe en el protocolo de Ayala y colaboradores [279]. De esta manera, los animales permanecen libres, conscientes y sin ningún tipo de manipulación durante todo el tiempo que dure la prueba. 4.2.10.2 Infusión con glucosa tritiada Dado que los animales estaban en restricción calórica o en ayuno 24h, no fue necesario someterlos a ayuno el día de la perfusión. Durante la perfusión, los ratones recibieron una infusión de [3-3H]-glucosa (0.05 μCi/min) (ref. NET331C005MC, Perkin Elmer, EEUU) durante 2h. A los 110 y a los 120 minutos, se midieron los niveles de glucemia con un glucómetro y se tomaron muestras de sangre de la vena de la cola (25 μl) en un tubo colector con EDTA (ref. 16.444.100, Microvette, Sarstedt AG & Co HG, Alemania). Las muestras de sangre fueron tratadas con 50 µl de 0.3N ZnSO4 y 50 µl de 0.3N Ba(OH)2 y después centrifugadas a 9000 RCFs durante 10 minutos. Tras ese tiempo, se recogió el sobrenadante y se pipetearon 10 µl por duplicado en tubos de centelleo (Pico Prias 6 mL, ref. 6000192, Perkin Elmer, EEUU). Estos se dejan evaporar toda la noche en una campana de extracción de gases y, al día siguiente, se añaden 100 µl de agua destilada y 3 mL de líquido de centelleo (Pico-Fluor Plus, ref. 6013699, Perkin Elmer, EEUU). Por último, se leyó la radiactividad en los tubos en un contador de centelleo líquido Tri-Carb 2810 TR (Científica Andina, Perú). Matemáticamente, el cálculo se basa en la premisa de que el tritio se incorpora a la glucosa UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 88 durante la gluconeogénesis, y la liberación de agua tritiada cuando se deja evaporar refleja la tasa de producción de glucosa endógena (Ra o HGP, por sus siglas en inglés). Y por tanto, el Ra se puede calcular dividiendo la actividad de la muestra entre la concentración específica del isótopo, esto es, la actividad del isótopo por unidad de masa. 4.2.11 Análisis histológico del tejido hepático. En la realización de esta tesis, se realizaron tinciones histológicas para estudiar el posible efecto de la manipulación de la nedilación en el hígado. Las muestras de hígado se recogen en cestillas y se embeben en formalina (Bio-Optica, ref. 65-30001) durante el sacrificio. Tras 24 h, se cambia la formalina por etanol 70%. 4.2.11.1 Hematoxilina/eosina Para realizar esta tinción, el tejido previamente fijado con formalina se incluye en parafina para ser seccionado en un micrótomo. Los cortes de parafina se tratan con xilol para eliminar los excesos de la misma. A continuación, los cortes se pasan por un proceso de rehidratación, consistente en alcoholes de concentración decreciente (100, 95 y 70º). Tras un lavado con H2O destilada, se sumergen en hematoxilina (Bio Óptica) durante 10 minutos, se lavan e inmediatamente de pasar por un alcohol ácido. Tras el lavado, se sumergen 30 segundos en eosina (Bio Óptica). Para deshidratar la muestra, los cortes se pasan por los mismos alcoholes en graduación creciente y, antes de montar, se dejan sumergidos 10 minutos en xilol. Los portaobjetos se montan en medio de montaje acuoso. Esta técnica nos permite visualizar la estructura general del tejido y, dado que la hematoxilina es de naturaleza catiónica (básica), tiñe de azul las estructuras basófilas (ácidas) como los núcleos celulares; y la eosina, que es de naturaleza ácida, tiñe de rosa las estructuras de naturaleza básica, como el citoplasma. 4.2.11.2 Inmunohistoquímica Esta técnica nos permite detectar la presencia y localización de determinadas proteínas en el propio tejido. En el desarrollo de este proyecto de investigación, se utilizó la inmunohistoquímica para comprobar la reducción en los niveles de NAE1 y NEDD8 en los modelos animales donde se silenciaban estos genes. Para ello, las muestras fijadas en parafina fueron desparafinadas, hidratadas, pretratadas en buffer THE PTLink pH9 y bloqueadas con Metodología 95 Una vez realizado el correspondiente ensayo, en el caso de cultivos celulares, se realizaron dos lavados con PBS y se le añadió a cada pocillo un volumen de tampón de lisis (tabla 3) que cubriese la superficie (aproximadamente 120 µL). A continuación, se desprendieron las células de la superficie del pocillo con un raspador (Falcon, ref.353085) y se recogió la suspensión en un tubo de polipropileno de 1,5 mL. En el caso de muestras de hígado conservadas a -80 ⁰C, se obtuvo una pequeña porción para su procesado. Las muestras deben mantenerse en hielo durante todo el proceso, para evitar la degradación de las proteínas. El tejido y el tampón de lisis se colocaron junto con una bolita de acero en un tubo de polipropileno de 2 ml, y se homogenizaron en el Tissue lyser durante 4 minutos a una frecuencia de 25 agitaciones por segundo. El tampón de lisis facilita, junto con la homogenización mecánica, la rotura del tejido y los componentes celulares, disolviéndose las proteínas del tejido en el mismo. Tabla 3. Composición del tampón de lisis disuelto en agua destilada. Compuesto Referencia y casa comercial Concentración Tris-HCl ph 7.5 T6066, MERCK 50 mM EGTA E3889, MERCK 1 mM EDTA E9884, MERCK 1 mM Triton X-100 X100, MERCK 1% vol/vol Ortovanadato sódico S6508, MERCK 1 mM Fluoruro sódico S7920, MERCK 50 mM Pirofosfato sódico 221368, MERCK 5 mM Sacarosa 84097, MERCK 0.27 mM Fluoruro de fenilmetilsulfonilo P7626, MERCK 1 mM Cocktail inhibidor proteasas (ROCHE) 11836145001, ROCHE 1 pastilla/50mL A continuación, se centrifugaron las muestras a 12000 RCF a 4 ⁰C durante 10 minutos en el caso de extractos celulares, o 25 minutos en el caso de extractos de hígado, en una centrífuga UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 96 (Eppendorf 5415R). El sobrenadante (extracto proteico) se traspasó a un nuevo tubo, descartando el precipitado (restos celulares) y la capa superior de grasa. 4.5.1.2 Cuantificación de los extractos proteicos. Para cuantificar la cantidad de proteína contenida en el extracto, realizamos un método colorimétrico con la solución Bradford (Bio-rad Protein Assay Kit). Este método se basa en el cambio de color del colorante Coomasie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. El característico color marrón de este compuesto se vuelve azul en presencia de proteínas. Se preparó una curva patrón de seroalbúmina bovina con diluciones seriadas a partir de la máxima concentración (1 mg/mL). Se cargaron 5µl (en el caso de extractos celulares) o 10 µl (en el caso de extractos de hígados previamente diluidos 1:70 en agua destilada) de las muestras por duplicado y 10 µL de las diluciones seriadas de BSA también por duplicado, en una placa multipocillo (Deltalab, España, ref. 900011). A cada uno de los pocillos se les añadió 250 µL de reactivo Bradford (dilución 1:5) y se midió la absorbancia a 550 nm en el espectrofotómetro (Multiskan GO, Thermo Scientific, Massachusetts, EEUU) tras ser previamente incubados a 37 ⁰C durante 5 minutos. 4.5.1.3 Preparación de las muestras para electroforesis en SDS-PAGE. Tras la cuantificación, se prepararon las muestras junto con el tampón de carga (tampón de Laemmli, tabla 4). Este tampón permite dotar a todas las proteínas de carga negativa en proporción a su tamaño, gracias al dudecil-sulfato sódico (SDS) y además permite su desnaturalización gracias al β-mercaptoetanol, el cual elimina los puentes disulfuro. Todas las muestras deben tener la misma concentración final para que en el volumen de carga en la electroforesis (16 µL) haya 8 µg de proteína. Tras añadir el tampón de carga las muestras se calentaron a 95⁰C durante 5 minutos para su completa desnaturalización. Metodología 97 Tabla 4. Composición del tampón de Laemmli disuelto en agua destilada. Compuesto Referencia y casa comercial Concentración Tris-HCl ph 6.7 250 mM Glicerol G5516, MERCK 50% vol/vol Dodecilsulfato sódico (SDS) L4509, MERCK 10% peso/vol β-mercaptoetanol M3148, MERCK 5% vol/vol Azul de bromofenol 8122, MERCK 0.0005% peso/vol 4.5.1.4 Electroforesis SDS-PAGE. Esta técnica consiste en la separación de las proteínas, de carga negativa, por su peso molecular. Se incluyen las muestras en un gel de acrilamida-bisacrilamida y, al aplicarle corriente eléctrica, las proteínas migran a través del gel hacia el polo positivo de la corriente. El gel está formado por dos fracciones: - Gel concentrador: se localiza en la parte superior sobre el que se incluye un peine para formar los pocillos donde se cargarán las muestras (tabla 5). - Gel separador: permite la separación de las proteínas. La concentración de acrilamidabisacrilamida determinará el tamaño del poro de la malla formada por el gel, y por tanto el grado de separación de las proteínas según su tamaño (tabla 6). Tabla 5. Composición del gel SDS-PAGE concentrador. Compuesto Referencia y casa comercial Volumen (mL) 8% 10% 15% H2O destilada 11.5 9.9 1.5 30% Acrilamida/Bis 29:1 1610156, Bio-Rad 6.7 8.3 5 Tris-HCl 1 M pH 8.8 6.3 6.3 3.3 Dodecilsulfato sódico (SDS) 10% L4509, MERCK 0.25 0.25 0.1 Amonio persulfato (APS) 10% A3678, MERCK 0.25 0.25 0.1 Tetrametiletilendiamina (TEMED) T9281, MERCK 0.015 0.01 0.01 UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 98 Tabla 6. Composición del gel SDS-PAGE separador a porcentajes 8, 10 y 15. Los geles, colocados en un equipo Mini-PROTEAN Tetra Cell (165-8004, Bio-Rad) se sumergieron en buffer de electroforesis, y se cargaron 16 μl de cada muestra en los pocillos del gel. En el primer pocillo de todos los geles se cargó el marcador de peso molecular (Precision Plus Protein Standars-Dual Color, Bio-Rad, ref. 161-0374). Las condiciones de electroforesis fueron: voltaje constante de 120 V aplicados con un equipo PowerPac HC High Current Power Suppy (Bio-Rad, ref. 164-5052) durante 1-2 horas. La composición del buffer de electroforesis (en H2O destilada) se encuentra en la tabla 7. Tabla 7. Composición del tampón de electroforesis disuelto en agua destilada. 4.5.2 Transferencia semi-húmeda. Una vez que haya terminado la electroforesis, el siguiente paso es la transferencia a un soporte sólido, para lo cual utilizamos membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,2 µM (BioRad, ref. 1620177). Un paso previo es la activación de las membranas, sumergiéndolas en metanol (Carlo Erba, ref. 414816), agua destilada y, por último, en tampón de transferencia (tabla 8). A continuación, se realiza el montaje, de manera que el gel quede en contacto con la membrana y con una esponja húmeda (Extra Thick Blot Paper, Compuesto Referencia y casa comercial Volumen (mL) H2O destilada 4.1 30% Acrilamida/Bis 29:1 1610156, Bio-Rad 1 Tris-HCl 1 M pH 6.8 0.75 Dodecilsulfato sódico (SDS) 10% L4509, MERCK 0.06 Amonio persulfato (APS) 10% A3678, MERCK 0.06 Tetrametil-etilendiamina (TEMED) T9281, MERCK 0.006 Compuesto Referencia y casa comercial Cantidad Tris-HCl T6066, MERCK 200 mM Glicina G7126, MERCK 20 mM Dodecilsulfato sódico (SDS) L4509, MERCK 1% peso/vol Metodología 99 BioRad, ref. 1703960) a cada lado en un equipo Trans-blot Semi-Dry Transfer Cell (Bio- Rad, ref. 170-3940). Se conecta la unidad de transferencia a una fuente de alimentación (BioRad) a un amperaje 0,8 mA/ cm2 aplicados con un equipo PowerPac HC High Current Power Suppy durante 1 hora y 40 minutos. Tabla 8. Composición del tampón de transferencia disuelto en agua destilada. 4.5.2.1 Inmunodetección de proteínas. 4.5.2.1.1 Bloqueo. Tras la transferencia de las proteínas a membranas de PVDF, éstas se incubaron en una solución 5% (m/v) BSA en buffer de lavado TBS-T en agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. La composición del buffer de lavado TBS-T es la siguiente (en H2O destilada) se describe en la tabla 9. Tabla 9. Composición del tampón de lavado de membranas disuelto en agua destilada. Con el bloqueo, la albúmina en solución se une a todos aquellos lugares de la membrana que no estén ya ocupados por las transferidas desde el gel, disminuyendo el ruido de fondo y los falsos positivos. 4.5.2.1.2 Incubación con anticuerpo primario. Compuesto Referencia y casa comercial Cantidad Tris-HCl T6066, MERCK 40 mM Glicina G7126, MERCK 40 mM Dodecilsulfato sódico (SDS) L4509, MERCK 0.36% peso/vol Metanol 414816, Carlo Erba Reagents 20% vol/vol Compuesto Referencia y casa comercial Cantidad Tris-HCl 20 mM NaCl 146 mM Tween-20 P9416, MERCK 0,1% vol/vol UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 100 El siguiente paso fue incubar las membranas con el anticuerpo específico contra la proteína de estudio (tabla 10). El anticuerpo se diluyó según las recomendaciones de la casa comercial (1:500 o 1:1000) en BSA al 3% y se dejó incu bando en agitación durante toda la noche a 4 ⁰C (o una hora a temperatura ambiente si se trataba de una proteína constitutiva). Tras la incubación se realizaron 3 lavados con TBS-T para eliminar los restos de anticuerpo primario que no se hubiesen unido. Tabla 10. Lista de anticuerpos utilizados en esta tesis. 4.5.2.1.3 Incubación con anticuerpo secundario. Para detectar la presencia de la proteína y amplificar la señal del anticuerpo primario, al día siguiente, las membranas fueron lavadas con buffer de lavado TBS-T, tres veces durante 5 minutos. Entonces se incubaron las membranas con una solución 3% (m/v) BSA en buffer de lavado TBS-T que contiene el anticuerpo secundario específico (Tabla 9) para el anticuerpo primario utilizado, a una concentración 1:5.000, en agitación y a temperatura Proteína diana Casa comercial (referencia) Reactividad de especie Dilución NEDD8 Abcam (ab81264) Monoclonal conejo 1:1000 Fosfoenolpiruvato Carboxiquinasa 1 (PCK1) Abcam (ab70358) Policlonal conejo 1:1000 Enzima activadora de NEDD8 (NAE1) Cell Signaling (14321S) Monoclonal conejo 1:1000 Glucosa 6-Fosfatasa (G6Pase) Abcam (ab93857) Monoclonal conejo 1:1000 Piruvato Carboxilasa (PC) Abcam (EPR7366) Monoclonal conejo 1:1000 Cullin-2 Santa Cruz (sc-166506) Mouse monoclonal 1:1000 Gliceraldehideo 3- fosfato Deshidrogenasa (GAPDH) Merck (CB1001) Mouse monoclonal 1:5000 UBE1 Cell Signaling (4891) Policlonal conejo 1:1000 a-Tubulina Sigma (T5168) Monoclonal ratón 1:5000 β -Actina Sigma (A5316) Monoclonal ratón 1:5000 Secundario conejo policlonal anti-ratón DAKO (P0260) 1:5000 Secundario cabra policlonal anti-conejo DAKO (P0448) 1:5000 Metodología 101 ambiente durante 1 hora. Los anticuerpos secundarios utilizados están asociados a la enzima peroxidasa. 4.5.2.1.4 Detección por quimioluminiscencia. Para detectar el anticuerpo secundario se incubaron las membranas con una mezcla 1:1 de sustrato de la peroxidasa y potenciador de quimioluminiscencia (Pierce ECL Western Blotting Substrate, Thermo Scientific, ref.32106). Inmediatamente después, para detectar la reacción que tiene lugar, se colocaron las membranas en un cassette de autorradiografía (Hypercassette, Amersham Biosciences). El revelado tuvo lugar en una sala oscura en donde, para la visualización, se utilizaron películas radiográficas Fujifilm (FujiMedical X-Ray Fil Super RX, Fujifilm Corporation, ref. 47410 19289). Estas hojas de revelado se introdujeron en el cassette de autorradiografía sobre las membranas y se dejó exponer la señal quimioluminiscente durante unos minutos, en función de la proteína. Posteriormente se retiró la película y se sumergió en una solución reveladora (dilución 1:10) (Developer/Replenisher, Agfa-Gevaert Group, ref. G150) hasta que se visualizó la señal buscada, en cuyo momento se sumergió la película en el líquido fijador (dilución 1:10) (Manual Fixing Bath, Agfa-Gevaert Group, ref. G354) durante unos segundos con el fin de fijar la señal. 4.5.2.2 Cuantificación de la densidad óptica de las bandas. Las imágenes de las películas fotográficas fueron digitalizadas con un escáner de alta resolución (resolución 400-800 ppp, CanonScan 9900F, Canon). Para determinar la cantidad relativa de proteína en cada muestra, se utilizó el programa Image J 1.6.0 (ImageJ 1.40g, National Institutes of Health). El estudio cuantitativo se realizó corrigiendo la densidad óptica de las señales de inmunodetección por la señal de fondo de cada placa; estos valores se relativizaron con respecto al control constitutivo (GAPDH) de cada membrana. 4.5.3 Detección de hormonas en suero. Los niveles de adrenalina (Cusabio Technology LLC, Houston, EEUU, ref. CSB-E08679m- 96T), cortisol (Enzo Life Sciences, Nueva York, EEUU, ref. ADI-900-097), glucagón (Mercodia, Upsala, Suecia, ref.10-1281-01), e insulina (Merck, Darmstadt, Alemania, ref. UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 102 EZRMI) se llevó a cabo mediante kits de ELISAS comerciales siguiendo las instrucciones de la casa comercial. 4.5.4 Detección de metabolitos en suero. La detección en suero de aminoácidos totales (Abbexa, Cambridge, R.U., ref. 298965) y L- alanina (Abcam, Cambridge, R.U., ref. 83394), y acetil-CoA (Abcam, Cambridge, R.U., ref. ab87546) en hígado y suero de ratones sometidos a restricción calórica del 60% o a ayuno 24 h, se llevó a cabo mediante kits comerciales específicos siguiendo las instrucciones de la casa comercial. 4.5.5 Immunoprecipitación de PCK1. Los extractos (preparados a partir de 1 mg de proteína) se examinaron mediante inmunotransferencia. Para el ensayo de inmunoprecipitación, los extractos de hígado se incubaron con 1 μg de anticuerpo específico de PCK1 (Abcam, Cambridge, R.U., ref. ab70358) acoplado a proteína G-Sefarosa (Merck, Darmstadt, Alemania, ref. P3296). Después de la incubación durante la noche a 4°C con agitación, las proteínas capturadas se centrifugaron a 10.000 g, se recogieron los sobrenadantes y las perlas se lavaron cuatro veces en tampón de lisis (tabla 3). Las perlas se calentaron durante 5 min a 95 °C en 10 µl de tampón de muestra. Los extractos y los inmunoprecipitados se examinaron mediante electroforesis SDS-PAGE y se transfirieron con anticuerpos contra PCK1 (Abcam, Cambridge, R.U., ref. ab70358) y NEDD8 (Abcam, Cambridge, R.U., ref. ab81264). La membrana se incubó primero con el anticuerpo primario anti-NEDD8 y luego se realizó un procedimiento de extracción de stripping basado en β-mercaptoetanol donde se incuba la membrana 30 minutos a 50 ⁰C en agitación (tabla 11) (Merck, Darmstadt, Alemania, ref. M3140) para verificar el PCK1 total inmunoprecipitado. Tabla 11. Composición del tampón de stripping para un volumen final de 50 mL. Compuesto Referencia y casa comercial Volumen (mL) Tris-HCl pH 6.8 3.125 Dodecilsulfato sódico (SDS) 10% L4509, MERCK 10 β-mercaptoetanol M3148, MERCK 0.35 Metodología 103 4.5.6 Modelado de proteínas. Las estructuras de PCK1 y NEDD8 de la especie Mus musculus se obtuvieron con el algoritmo de predicción AlphaFold [285]. Todos los modelos de proteínas neddiladas se construyeron utilizando la proteína WT como plantilla con UCSF Chimera y los parámetros de enlace isopeptídico se obtuvieron mediante cálculos RHF/6-31G* utilizando GAMESSUS. La matriz de Hesse en coordenadas cartesianas se analizó mediante el método Seminario, utilizando el módulo CartHess2FC de AMBER. Las simulaciones de dinámica molecular (MD) se realizaron con el software OpenMM [286] en una plataforma CUDA con campo de fuerza AMBER ff19SB, malla de partículas Ewald para interacciones electrostáticas de largo alcance con un límite de suma de Ewald de 10 Å y restricción de la longitud de todos los enlaces que involucran un átomo de hidrógeno. Cada sistema se solvató con moléculas de agua modelo de agua rígida (OPC) de 4 puntos y 3 cargas óptimas y se neutralizó con contraiones de cloro y sodio de acuerdo con la carga total de la proteína. En primer lugar, cada sistema se sometió a 2500 pasos de minimización de energía a 298 K. Se utilizó un termostato Langevin para controlar la temperatura con un coeficiente de fricción de 1 ps-1 y un tamaño de paso de 0,002 ps. Para evaluar los movimientos de residuos y átomos, cada sistema se sometió a una simulación MD de 250 ns y se guardaron instantáneas de las trayectorias cada 1 ps. Finalmente, el análisis de trayectoria se realizó con el módulo CPPTRAJ de AMBER [229]. Las representaciones gráficas y análisis adicionales se realizaron con OriginPro 2019b y gráficos moleculares con UCFS ChimeraX. 4.5.7 Cuantificación de proteína por SWATH-MS (Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra) en experimentos de pull-down. El análisis se realizó como lo describió anteriormente nuestro grupo [287]. Brevemente, el método utilizado incluye: creación de la biblioteca espectral, cuantificación relativa mediante adquisición SWATH, análisis de datos SWATH, análisis espectrométrico de masas mediante LC-MSMS de inmunoprecipitación de PCK1, determinación del sitio de nedilación, y análisis de datos proteómicos. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD043054. UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 104 4.5.8 Determinación del sitio de nedilación. Los archivos sin procesar adquiridos utilizando un método DDA se analizaron con el software PEAKS 8 Studio (Bioinformatics Solutions Inc., Waterloo, Canadá) utilizando una base de datos Uniprot de mouse. La tolerancia de masa del péptido se ajustó a 10 ppm y 0,01 Da para MS/MS. Las modificaciones variables incluidas fueron las siguientes: oxidación de M, carbamidometilación de C y Glygly de K (nedilación de cisteínas) como se describió anteriormente [262, 288, 289].Para la identificación de péptidos de alta confianza se utilizó una FDR (tasa de descubrimiento falso) del 1 % y un mínimo de 2 péptidos clasificados para el filtrado de péptidos. El análisis funcional se realizó mediante el software de acceso abierto FunRich (herramienta de análisis de enriquecimiento funcional) para el enriquecimiento funcional y el análisis de redes de interacción (http://funrich.org/index.html). Para las estadísticas, FunRich utiliza pruebas hipergeométricas, BH y Bonferroni. 4.6 Análisis estadístico. Los datos obtenidos en los experimentos fueron analizados mediante el programa estadístico Prism Software Version 6.0 para Windows 10 (GraphPad Software, Boston, Massachusetts USA, www.graphpad.com). Los datos aparecen expresados como media ± error estándar de la media. El tamaño muestral de cada grupo experimental aparece detallado en los pies de figura del apartado Resultados. Se excluyeron las muestras y/o animales cuyo valor se desviaba más de 2 veces la desviación estándar (SEM). En todos los análisis, se consideraron significativos (*) los resultados con una p<0,05; muy significativos (**) con una p<0,01 y extremadamente significativos (***) con p<0,001. Antes de realizar el análisis estadístico, se realizó un test de normalidad para cada serie de datos, donde se utilizó el test Shapiro-Wilks cuando n≥7 y el test de Kolmogorov-Smirnof cuando n<6. En base a lo obtenido es este test, se aplicaron tests paramétricos (distribución normal) o no paramétricos: ❖ Prueba T de student. Compara las medias de dos poblaciones independientes asumiendo que siguen una distribución normal. En un contraste de hipótesis bilateral (2 colas), se estudia la desigualdad entre las medias, siendo la región crítica del estadístico ambas regiones correspondientes a la cola inferior y superior de la distribución. En un contraste Resultados 111 Después de un ayuno de 24 h, los ratones en todos los modelos mostraron niveles reducidos de glucosa en sangre (Figuras 19M-P). Igualmente, cuando se sometió a RC, ninguno de estos modelos pudo mantener la glucosa en sangre como lo hicieron los ratones control (Figuras 19Q-T), a pesar de mostrar un curso similar de pérdida de peso durante la RC (Figura 19U-X). Consistentemente, en ayunas (Figura 19Y) y restricción calórica (Figura 19Z), los ratones con eliminación hepática de NAE1 mostraron una reducción de la producción hepática de glucosa en comparación con los ratones control hermanos de camada. UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 112 Figura 19. La nedilación es necesaria para mantener los niveles de glucosa en sangre y no afecta a la tolerancia a glucosa o a la sensibilidad a insulina. (A-D), prueba de tolerancia al piruvato (PTT), (E-H) prueba de tolerancia a glucosa (GTT), y (I-L) prueba de tolerancia a insulina (ITT) de (i) ratones wild type (WT) tratados con vehículo o el inhibidor de NAE1 MLN4924, (ii) ratones NAE1+/– o sus hermanos de camada de control, (iii) ratones Alfp- Cre+/– inyectados con AAV-DIO que expresan GFP o shNAE1 y (iv) ratones Alfp-Cre+/– inyectados con AAV-DIO que expresan GFP o shNEDD8. (M-P), niveles de glucosa en sangre después de un ayuno de 24 h para (M) ratones WT tratados con vehículo o MLN4924, (N) ratones NAE1+/– y sus hermanos de camada como control, (O) ratones Alfp-Cre+/– inyectados con AAVDIO que expresa GFP o shNAE1 y (P) Ratones Alfp-Cre+/– inyectados con AAVDIO que expresan GFP o shNEDD8. (Q-T), niveles de glucosa en sangre y (U-X) cambio de peso corporal de ratones sometidos a RC del 60% para (Q, I) ratones WT tratados con vehículo o MLN4924, (R, V) ratones NAE1+/– o sus hermanos de camada de control, (S, W) ratones Alfp- Cre+/– inyectados con AAV-DIO que expresan GFP o shNAE1 y (T, X) ratones Alfp-Cre+/– inyectados con AAV-DIO que expresan GFP o shNEDD8. (R-S) Producción hepática de glucosa (HGP) en ratones Alfp-Cre+/– inyectados con AAVDIO que expresan GFP o shNAE1 (Y) sometidos a RC del 60% o a (Z) ayuno durante 24h; n = 5–15 por grupo. Los datos se presentan como media ± SEM. Prueba t no pareada de dos colas: *P < 0,05, y **P < 0,01. 5.1.3 La inhibición de la nedilación hepática reduce la producción de glucosa de manera independiente del sexo. También estudiamos la nedilación en el hígado de ratones hembra, encontrando un aumento similar en los niveles de proteína NAE1 en ayunas (Figura 20A). Los ratones hembra con una eliminación de NAE1 mediada por shRNA (AAV DIO-shNAE1) mostraron una respuesta similar a la de los ratones macho, ya que los niveles de glucosa en sangre después 24 h de ayuno y el aumento de los niveles de glucosa durante una prueba de tolerancia al piruvato (PTT) fueron más bajos que en los ratones control, pero no después de la Resultados 113 administración de glicerol (GlyTT) (Figura 20B-D), el cual es un sustrato gluconeogénico que se incorpora a la vía gluconeogénica en pasos posteriores a PCK1. En conjunto, estos hallazgos demuestran que la nedilación juega un papel importante en el mantenimiento de la producción de glucosa por el hígado de forma independiente del sexo. Figura 20. La nedilación también es necesaria para mantener los niveles de glucosa en sangre en hembras. (A) Niveles de proteína de NAE1 en el hígado de ratones hembra wild type sometidos a ayuno durante 24h. (n=7-10 por grupo). (B) Prueba de tolerancia al piruvato (PTT), (C) Prueba de tolerancia al glicerol (GlyTT) y (D) niveles de glucosa en ayunas después de 24 h en ratones hembra Alfp-Cre+/- inyectados con AAV-DIO-GFP o AAV-DIO-shNAE1 (n=6-18 por grupo). La expresión de GAPDH sirvió como control de carga y los valores de control se normalizaron al 100%. Los datos se presentan como media ± SEM; Prueba t no pareada de dos colas: *P<0,05, Y **P<0,01. 5.1.4 La inhibición de la nedilación hepática no modifica los niveles de proteínas de enzimas gluconeogénicas o acetil-CoA. Dado que la inhibición de la nedilación en el hígado disminuyó la capacidad gluconeogénica, medimos la expresión de enzimas gluconeogénicas clave y acetil-CoA en el hígado de dos modelos animales de deterioro de la nedilación: i) inhibición farmacológica usando MLN4924; y ii) ratones con una eliminación de NAE1 mediada por shRNA. Sometimos a estos ratones a 24 horas de ayuno y restricción calórica, y, como era de esperar, los niveles de proteína de piruvato carboxilasa (PC), glucosa 6-fosfatasa (G6Pasa) y fosfoenolpiruvato carboxiquinasa 1 (PCK1) aumentaron en el hígado de los ratones en ayunas y sometidos a restricción calórica (Figura 21A, B, G, H). Sin embargo, no hubo diferencias entre los ratones tratados con vehículo y MLN4924 o entre los ratones control y ratones shNAE1 (Figura 21A- H). De manera similar, no se detectaron diferencias en los niveles hepáticos de acetil CoA después de la inhibición de la nedilación (Figura 21A, B, G, H). UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 114 Mantener la homeostasis de la glucosa requiere una respuesta contrarreguladora eficiente de la ingesta/producción de glucosa. Por lo tanto, también medimos los niveles circulantes de hormonas implicadas en la respuesta contrarreguladora de la glucosa, esto es, adrenalina, glucagón y corticosterona, en los modelos descritos anteriormente. No se encontraron cambios entre los ratones de control y aquellos animales donde se atenuó la nedilación (Figura 21C, D, I, J). Los niveles de insulina se redujeron en ratones tratados con shNAE1 en ayunas (Figura 21D), sin cambios en los otros modelos experimentales (Figura 21C, I, J). Todo ello sugiere que la inhibición de la nedilación hepática no modifica los niveles de hormonas contrarreguladoras. Finalmente, también se midió el contenido de alanina y los niveles de aminoácidos totales en el hígado, así como los niveles de aminoácidos séricos, en los dos modelos animales de atenuación de la nedilación descritos anteriormente, sometidos a 24 horas de ayuno o a restricción calórica (Figuras 21E, F, K, L). Estas mediciones no detectaron diferencias en el contenido hepático de alanina o aminoácidos totales y los niveles plasmáticos de aminoácidos totales entre los dos modelos animales sometidos a ayuno 24h y a restricción calórica, excepto para los ratones tratados con MLN4924 y los ratones donde NAE1 se silenció en el hígado y se ayunaron durante 24 horas, donde se encontraron niveles más altos de aminoácidos en el hígado (Figuras 21E y F). Como los aminoácidos son importantes sustratos gluconeogénicos durante el ayuno y la restricción calórica, estos resultados indican que la reducción de la producción de glucosa cuando se altera la nedilación hepática no depende de la disponibilidad de aminoácidos. Resultados 115 Figura 21. La inhibición de la nedilación hepática no afecta los niveles circulantes de hormonas contrarreguladoras de la glucosa. Niveles de proteína hepática de piruvato carboxilasa (PC), fosfoenolpurivato carboxiquinasa 1 (PCK1) y glucosa 6-fosfasa (G6Pasa) y niveles de acetil-CoA en el hígado; niveles séricos de epinefrina, glucagón, corticosterona e insulina; y contenido de alanina hepática y aminoácidos séricos e hepáticos en ratones WT después de la administración de vehículo o MLN4924 y luego (A, C, E) en ayunas durante 24 h, o (G, I, K) sometidos a restricción calórica; y en ratones UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 116 Alfp Cre+/- inyectados con AAV-DIO-GFP o AAV-dioshNAE1 sometidos a (B, D, F) ayuno de 24 h y (H, J, L) restricción calórica. n = 4-8 animales por grupo. La expresión de GAPDH sirvió como control de carga y los valores de control se normalizaron al 100%. Los datos se presentan como media ± SEM; ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Bonferroni (paneles izquierdos A, B, G y H) y la prueba t no pareada de dos colas (A-L): *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001. 5.2 La nedilación hepática regula la acción de las hormonas contrarreguladoras. Dado que nuestros resultados indican que la gluconeogénesis se altera cuando se inhibe la nedilación hepática, queríamos estudiar en detalle si la nedilación estaba involucrada en la respuesta contrarreguladora de la glucosa. Para resolver esto, tratamos nuestros cuatro modelos de nedilación alterada con glucagón, adrenalina o glucocorticoides, hormonas que estimulan la gluconeogénesis. En ratones normales, esta administración provocó las acciones hiperglucémicas esperadas (Figura 22), con niveles regulados al alza de NAE1 y NEDD8 y cullins nediladas en el hígado (Figuras 23B, D, F). Por el contrario, la deficiencia de nedilación atenuó significativamente los efectos hiperglucémicos del tratamiento hormonal en cada uno de los cuatro modelos (Figura 22). Por tanto, la nedilación media la acción de las hormonas contrarreguladoras de la glucosa y es necesaria para la producción de glucosa hepática. Resultados 117 Figura 22. La nedilación es necesaria para la acción gluconeogénica de las hormonas contrarreguladoras. (A – D), Glucosa en sangre después de la administración intraperitoneal (ip) de solución salina o glucagón (200 μg kg –1) para (A) ratones WT tratados con vehículo o MLN4924, (B) NAE1+/– ratones o sus compañeros de camada como control, (C) ratones Alfp-Cre+/– inyectados con AAV-DIO que expresan GFP o shNAE1 y (D) ratones Alfp-Cre+/– inyectados con AAV-DIO que expresan GFP o shNEDD8. (E – H), Niveles de glucosa en sangre después de la administración i.p. administración de solución salina o adrenalina (100 μg kg-1) para I) ratones WT tratados con vehículo o MLN4924, (F) NAE1+/– y sus compañeros de camada de control, (G) ratones Alfp-Cre+/– inyectados con AAVDIO que expresa GFP o shNAE1 y (H) ratones Alfp-Cre+/– inyectados con AAVDIO que expresa GFP o shNEDD8. (I – L), glucosa en sangre después de la administración i.p. administración de solución salina o hidrocortisona (20 mg kg–1) para (I) ratones WT tratados con vehículo o MLN4924, (J) ratones NAE1+/– o sus compañeros de camada de control, (K) ratones Alfp-Cre+/– inyectados con AAV-DIO que expresa GFP o shNAE1 y (L) ratones Alfp-Cre+/– inyectados con AAV-DIO que expresa cualquiera de los dos GFP o shNEDD8; n = 3–10 por grupo. Los datos se presentan como media ± SEM; ANOVA unidireccional seguido de prueba post hoc de Bonferroni: *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001. # denota diferencias entre los diferentes grupos de animales tratados con la misma hormona glucorreguladora. UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 118 Los niveles de enzimas gluconeogénicas y acetil-CoA fueron similares en ratones cuya nedilación fue inhibida farmacológicamente y en ratones con una desactivación de NAE1 mediada por shRNA tratados con glucagón, adrenalina o glucocorticoides (Figura 23I-T), excepto en los ratones tratados con adrenalina y MLN4924 que mostraron niveles más bajos de acetil-CoA (Figura 23N). Esto sugiere que, en general, la nedilación no regula los niveles de proteínas de las enzimas gluconeogénicas ni la disponibilidad de acetil-CoA. Resultados 119 Figura 23. Las hormonas contrarreguladoras de la glucosa inducen la nedilación en el hígado. Ratones WT tratados con solución salina o glucagón (A) para niveles de glucosa en sangre; (B) niveles de proteína hepática de NAE1, NEDD8 y cullins nedilados. Ratones WT tratados con salino o adrenalina (C) niveles de glucosa; (D) niveles de proteína hepática de NAE1, NEDD8 y cullins nediladas. Ratones WT tratados con salino o hidrocortisona (E) niveles de glucosa en sangre; (F) niveles de proteína hepática de NAE1, NEDD8 y cullins nediladas. (G) Peso corporal y (H) niveles de proteína PCK1 en ratones WT alimentados con STD o HFD al 60% durante 4 días. Niveles de proteína de (I) piruvato carboxilasa (PC), fosfoenolpurivato carboxiquinasa 1 (PCK1) y glucosa 6- niveles de proteína hepática de fosfatasa (G6Pasa), y niveles UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 120 séricos de (J) acetil-CoA en ratones WT tratados con vehículo o MLN4924 y luego con salino o glucagón (200 μg kg-1). (K) Niveles de proteína hepática PC, PCK1 y G6Pasa y (L) niveles séricos de acetil-CoA en ratones Alfp-Cre inyectados con AAV-DIO-GFP o AAV-DIO-shNAE1 y luego con salino o glucagón (200 μg kg-1). (M) Niveles de proteína hepática PC, PCK1 y G6Pasa y (N) niveles séricos de acetil-CoA en ratones WT tratados con vehículo o MLN4924 y luego con salino o adrenalina (100 μg kg-1). (O) niveles de proteína hepática PC, PCK1 y G6Pasa y (P) niveles séricos de acetil-CoA en Alfp-Ratones Cre inyectados con AAV-DIO-GFP o AAV-DIO-shNAE1 y luego con salino o adrenalina (100 μg kg-1). (Q) Niveles de proteína hepática de PC, PCK1 y G6Pasa y (R) niveles séricos de acetil-CoA en ratones WT vehículo tratado o MLN4924 y luego con salino o hidrocortisona (20 mg kg-1). (S) Niveles de proteína hepática de PC, PCK1 y G6Pasa y (T) niveles séricos de acetil-CoA en ratones Alfp-Cre inyectados con AAV-DIOGFP o AAV-DIO-shNAE1 y luego con salino o hidrocortisona (20 mg kg-1). n = 4-12 animales por grupo. La expresión de GAPDH sirvió como control de carga y los valores de control se normalizaron al 100%. Los datos se presentan como media ± SEM; Prueba t no pareada de dos colas: *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001. 5.3 La nedilación hepática está asociada con la resistencia a la insulina. 5.3.1 La inhibición de la nedilación reduce la hiperglucemia inducida por una dieta alta en grasas. A continuación, evaluamos si la inhibición de la nedilación podría disminuir la resistencia a la insulina. La insulina inhibe la producción de glucosa en el hígado, y esta acción se usa ampliamente para medir la función de la insulina hepática [293]. Para esto, alimentamos a ratones con una dieta alta en grasas (HFD) por un corto plazo (4 días), lo que empeoró la sensibilidad a la insulina hepática y estimuló la producción de glucosa hepática sin producir cambios significativos en el peso corporal, (Figura 23G-H) [294, 295]. Nuestros resultados mostraron que los ratones en las cuatro condiciones de inhibición de la nedilación mostraron niveles reducidos de glucosa durante el PTT después de 4 días con HFD (Figuras 24A–D). Estos resultados indicaron que el bloqueo de la nedilación mejoró la gluconeogénesis inducida por HFD. A continuación, realizamos un experimento de ganancia de función sobreexpresando NAE1 (AAV-DIO-NAE1) en el hígado (ratones livNAE1). Estos ratones mantuvieron el mismo peso que los ratones de control, pero mostraron una mayor capacidad para convertir piruvato en glucosa sin cambios en la tolerancia a la glucosa o la sensibilidad a la insulina en comparación con los ratones de control (Figura 24E-J). Además, los ratones livNAE1 también mostraron niveles de glucosa más altos que los ratones de control durante el ayuno de 24 h (Figura 24K) y después del tratamiento agudo con insulina (Figura 24L), lo que sugiere que la activación de la nedilación en el hígado favorece la producción de glucosa hepática e impide las acciones hipoglucemiantes de la insulina. Resultados 127 transgenes y los cebadores de PCR utilizados para el genotipado se indican en los materiales y sección de métodos. El ratón BirA de control expresa únicamente la enzima bacteriana BirA, mientras que los ratones bioNedd8 expresan un único polipéptido que codifica un péptido nedilado etiquetado fusionado con BirA. En los ratones BioNEDD8, la enzima BirA media la biotinilación de NEDD8 con la etiqueta que acepta biotina. Luego, el NEDD8 biotinilado se incorpora a los conjugados. (B) Análisis de transferencia Western de biotina y NEDD8 que muestra un aumento de la mancha en los ratones bioNEDD8 en relación con birA, tanto de entrada como de descenso (PD). (C) Cambio de peso corporal y niveles de glucosa en sangre en ratones WT y ratones BioNEDD8 alimentados ad libitum o sometidos a una restricción calórica del 60% durante 4 días. n = 4-5 animales por grupo. (D) Niveles de NEDD8 en las fracciones de entrada, flujo y elución del IP. (E) Gráfico circular que muestra el porcentaje de proteínas nediladas de las proteínas hepáticas totales identificadas en ratones bionedd8, según lo determinado por proteómica LC-MS/MS (n = 4 o 5). (F) Análisis de enriquecimiento funcional PANTHER de proteínas nediladas en el hígado. Nedilación de PCK1 durante una restricción calórica de 4 días (del 60%) (G) o ayuno de 24 h (H), como lo muestra la inmunotransferencia después de la inmunoprecipitación de PCK1. (I) Niveles de proteínas PCK1 y NEDD8 tras la inmunoprecipitación de PCK1 en ratones WT tras la administración de vehículo o MLN4924 y sometidos a restricción calórica (RC) y ayuno de 24 h. (J-K) Niveles de proteína PCK1 y NAE1 después de la inmunoprecipitación de PCK1, y niveles de proteína NAE1 relativizados a PCK1 inmunoprecipitada, de hígados de ratones alimentados ad libitum o sometidos a una restricción calórica de 4 días (del 60%) (J) o 24 -h ayuno (K). (L) Niveles de proteínas NEDD8 y Cullin2 después de la inmunoprecipitación de cullin2 en ratones WT sometidos a restricción calórica (RC) y ayuno de 24 h. Los datos se presentan como media ± SEM; ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Bonferroni *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001. 5.4.2 PCK1 está nedilado en tres lisinas después de restricción calórica y ayuno. El análisis STRING del interactoma funcional después de la inmunoprecipitación de PCK1 comprendió 1631 proteínas en la condición de ayuno de 24 h y 1142 en la condición RC, con 968 de ellas comunes a ambas condiciones. Además, tanto en RC como en ayuno 24h, aparecen un grupo de proteínas implicadas en nedilación (indicadas en rojo; Figura 27A). Para identificar sitios de modificación en PCK1 que potencialmente podrían ser sitios de nedilación, primero inmunoprecipitamos PCK1 del hígado de ratones alimentados ad libitum o sometidos a ayuno y luego realizamos análisis LC-MS/MS. El análisis realizado por el software PEAKS de los espectros peptídicos de PCK1 reveló que tres lisinas PCK1 estaban potencialmente nediladas en condiciones de ayuno: K278, K342 y K387 (Figura 27B). Para determinar cómo la nedilación podría afectar la actividad de PCK1, analizamos sus efectos sobre la estructura, prestando especial atención a los residuos nedilados. Para obtener información sobre las consecuencias estructurales y dinámicas de la nedilación de PCK1, realizamos simulaciones de dinámica molecular de PCK1 en diferentes condiciones: i) no nedilada, ii) mononedilada, iii) binedilada o iv) trinedilada (Figura 27D). Los tres residuos de lisina se distribuyen por la superficie de la enzima y todos eran accesibles al disolvente (Figura 27E). El análisis de trayectoria reveló que la nedilación de PCK1 afectó principalmente a las fluctuaciones atómicas y a la posición de los bucles 95-118 y 460-470, que rodean la cavidad enzimática y el centro catalítico. La mononedilación en K387 indujo UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 128 la mayor perturbación de la hendidura enzimática, abriéndola y permitiendo la entrada de Mn2+ en el centro catalítico de PCK1, un paso crítico para la actividad de esta enzima (Figuras 27C-27E). Es de destacar que K387 es la lisina más conservada a lo largo de la evolución de las tres lisinas y está presente en todas las secuencias de PCK1 que analizamos, en una amplia gama de especies, desde micobacterias hasta mamíferos (Figura 28A). El hecho de que se mantenga tan conservada a lo largo de la evolución deja entrever su importancia biológica. Resultados 129 Figura 27. PCK1 está nedilada en tres lisinas después de la restricción calórica y el ayuno y esta modificación altera su estructura. (A) Análisis de asociación funcional para la inmunoprecipitación de PCK1 en condiciones de alimentación ad libitum, restricción calórica (RC) y ayuno. Los círculos rojos muestran proteínas relacionadas con la nedilación. (B) PCK1 inmunoprecipitado se sometió a análisis de espectrometría de masas. Se muestran posibles sitios modificados. K*, modificado con GG. (C) Estructuras promedio de PCK1 (izquierda, oliva) y PCK1-K387-NEDD8 (derecha, rojo) después UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 130 de una simulación de dinámica molecular. La nedilación de PCK1 altera la dinámica y la conformación de los bucles 95– 118 y 460–470 (líneas discontinuas cian). Vista en profundidad de la abertura de la grieta de la proteína tras la nedilación de PCK1 que hace que el ion Mn2+ sea accesible al sustrato. (D) Superficies promedio de PCK1 nedilada después de simulación de dinámica molecular. Las estructuras están alineadas con respecto al módulo PKC1 en una orientación que permite visualizar hasta tres moléculas de NEDD8 por PKC1. (E) Representación en cinta de la estructura PCK1 de M.musculus con sitios de nedilación identificados coloreados en azul oscuro. Los bucles 95–118 y 460–470 están resaltados en cian, y el ion Mn2+, en verde claro. Figura 28. Filogénesis de las tres lisinas de PCK1 que pueden ser nediladas. (A) Alineamiento de secuencia múltiple CLUSTAL de las regiones que flanquean los residuos K278, K342 y K387 y el árbol filogenético de la proteína PCK1. Se indican los puntos de la evolución donde aparecen por primera vez las lisinas. 5.4.3 La nedilación de PCK1 en sus residuos K278, K342 y K387 es necesaria para su actividad gluconeogénica in vitro. Finalmente, para comprender mejor las consecuencias funcionales de la nedilación de PCK1, silenciamos NAE1 y NEDD8 y luego incubamos los hepatocitos en un medio sin nutrientes (para crear una condición de ayuno in vitro). Las células en ayunas tenían una mayor actividad de PCK1; por el contrario, la inhibición de NAE1 y NEDD8 bloqueó la actividad de PCK1 inducida por el ayuno, con niveles concomitantes de glucosa más bajos en el medio (Figura 29A-C y Figura 30A-C). Estos resultados también se corroboraron in vivo: la inhibición de NAE1 en el hígado disminuyó la actividad de PCK1 en ratones en restricción Resultados 131 calórica (Figura 29D). En línea con estos hallazgos, y al igual que con la proteómica y el modelado, encontramos que mutar los tres residuos de lisina de PCK1 al mismo tiempo (p. ej., K278, K342 y K387) o K387 no alteró los niveles de proteína de PCK1, pero redujo su actividad y los niveles de glucosa en el medio (Figura 30D-F). Consistentemente, la actividad y la producción de glucosa podían restaurarse en hepatocitos ayunados e inhibidos por PCK1 al sobreexpresar PCK1 wild type pero no al sobreexpresar el triple mutante de PCK1 o el mutante único de PCK1, K387R (Figura 30D-F), lo que resalta la relevancia de la nedilación en estos residuos de lisina para la actividad enzimática de PCK1 y, por tanto, de sus funciones gluconeogénicas. Es importante destacar que los niveles de proteína de PCK1 se elevaron de manera similar en los mutantes y de PCK1 wild type (Figura 30F), lo que respalda que la nedilación de PCK1, y no sus niveles de proteína total, son los que modulan su actividad. Dado que otras modificaciones además de la nedilación pueden modificar estas lisinas e incluso otros residuos potenciales de PCK1 podrían nedilarse y no detectarse, repetimos los experimentos tratando nuestros diferentes grupos experimentales in vitro con MLN4924, para estudiar cualquier posible efecto aditivo o sinérgico, lo cual es crítico especialmente en ausencia de ensayos que evalúen la nedilación de los mutantes PCK1. Como tal, los hepatocitos se trataron con vehículo o MLN4924 en condiciones de depleción de nutrientes (medio KHH durante 6 horas). Los resultados indicaron que, como se esperaba, el silenciamiento de PCK1 redujo los niveles de proteína y la actividad de PCK1 y la liberación de glucosa en el medio. El rescate de PCK1-WT restauró los niveles de proteína y la actividad de PCK1 y aumentó la secreción de glucosa en el medio (Figura 30G-I). Sin embargo, el tratamiento con MLN4924 disminuyó la actividad de PCK1-WT, impidiendo la liberación de glucosa al medio (sin cambios en los niveles de proteína PCK1) (Figura 30G-I). Siguiendo el mismo procedimiento experimental, los hepatocitos que expresan el PCK1 mutante triple o el PCK1 mutante único (K387R) también se trataron con vehículo o MLN4924. Los resultados indican que el mutante triple o el mutante único PCK1 (K387R) no pudieron restaurar la actividad de PCK1 o los niveles de glucosa y, por lo tanto, MLN4924 no causó ningún efecto (Figura 30J-O). Estos hallazgos indican que las mutaciones en tres residuos de lisina de PCK1 al mismo tiempo (K278, K342 y K387) son relevantes para mantener la UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 132 capacidad gluconeogénica de PCK1, y que si PCK1 está nedilada en otros residuos diferentes a K278, K342 y K387, no están involucrados o no son esenciales para la actividad gluconeogénica de PCK1, ya que el tratamiento con MLN4924 en siPCK1 + pPCK1 K278R- K342R-K387R no tuvo un efecto aditivo o sinérgico, es decir, MLN4924 no redujo aún más la producción de glucosa o la actividad de PCK1 en esas células. Figura 29. La actividad de PCK1 y la concomitante producción de glucosa se ven reducidas al inhibir la nedilación. (A) Actividad de PCK1 y (b) producción de glucosa en células AML12 transfectadas con siRNA vacío o siRNA NEDD8 y 48 h más tarde mantenidas en medio completo o KHH durante 6 h. (C) También se muestra la correlación entre la producción de glucosa y la actividad de PCK1 en estas células. (D) Actividad de PCK1 en el hígado de ratones Alfp-Cre +/- inyectados con AAV-DIO que expresa GFP o shNAE1. n = 5-6 por grupo. Los datos se presentan como media ± SEM; prueba t no pareada de dos colas (C y E) o ANOVA unidireccional seguida de prueba post hoc de Bonferroni (B): *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001. Resultados 133 Figura 30. La nedilación de PCK1 en sus residuos K278, K342 y K387 es necesaria para su actividad gluconeogénica in vitro. (A) Actividad de PCK1 y (B) producción de glucosa en células AML12 transfectadas con siRNA vacío o siRNA contra NEDD8 y 48 h más tarde mantenidas en medio completo o KHH durante 6 h. (C) También se muestra la correlación entre la producción de glucosa y la actividad de PCK1 en estas células. (D) actividad de PCK1, (E) producción de glucosa y (F) niveles de proteína de PCK1 en células AML12 mantenidas en medio completo o KHH y transfectadas con siRNA vacío codificado, siRNA-PCK1, control de plásmido, un plásmido que codifica el tipo salvaje. PCK1 o un plásmido que codifica PCK1 con mutación triple o simple (pPCK1-K278R-K342R-K387R o pPCK1-K387R). (G-O) Actividad de PCK1, producción de glucosa y niveles de proteína de PCK1 en células AML12 en las mismas condiciones que antes y tratadas con MLN4924. norte = 5-6. La expresión de GAPDH sirvió como control de carga y los valores de control se normalizaron al 100%. Los datos se presentan como media ± SEM; Prueba t no pareada de dos colas (B) y ANOVA unidireccional seguida de prueba post hoc de Bonferroni (A, D – O): *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001. UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 134 5.4.4 La nedilación de PCK1 en sus residuos K278, K342 y K387 es la responsable de la producción hepática de glucosa in vivo. Para demostrar la relevancia in vivo de PCK1 nedilado en los tres residuos descritos anteriormente, silenciamos PCK1 en el hígado de ratones adultos inyectando un virus AAV- Cre en la vena de la cola de ratones PCK1 loxP (PCK1 LKO). Luego, en estos ratones inyectamos AAV-DIOPCK1wt para rescatar la expresión de PCK1 hepático de tipo salvaje o un virus AAV-DIO-PCK1mut para sobreexpresar el triple mutante PCK1 (K278R-K342R- K387R) en el hígado. La deleción de PCK1 en el hígado de ratones adultos redujo los niveles de glucosa tras la administración de piruvato mientras que el rescate de PCK1 de tipo salvaje normalizó los niveles de glucosa durante el PTT, sin cambios en la tolerancia a la glucosa o la sensibilidad a la insulina (Figura 31A-D). Luego sometimos a estos ratones a un ayuno durante 24 horas y descubrimos que el rescate de PCK1 de tipo salvaje mostraba niveles más altos de glucosa y producción de glucosa hepática (HGP) que los ratones PCK1 KO hepático (Figura 31E). Sin embargo, la expresión hepática del triple mutante PCK1 en ratones en los que PCK1 fue previamente inactivado (Figura 31F), no normalizó los niveles de glucosa durante la PTT sin cambios en GTT e ITT (Fig. 31G-I). Para corroborar aún más nuestros resultados, también sometimos a nuestros ratones a una prueba de tolerancia al glicerol, ya que el glicerol evita la actividad de PCK1, ya que se incorpora a la vía gluconeogénica en pasos posteriores. Como se muestra en la Figura 20C y en la Figura 31J, no hubo diferencias en la producción de glucosa después de la administración de glicerol entre los diferentes grupos, lo que destaca que la capacidad gluconeogénica de estos ratones se altera específicamente por la actividad de PCK1. Finalmente, cuando se sometieron a un ayuno de 24 horas, los ratones que expresaban el triple mutante PCK1 no pudieron aumentar la glucemia o la producción de glucosa hepática, mostrando niveles de glucosa en sangre similares a los de los ratones PCK1 KO hepáticos (Figura 31K). Resultados 135 Figura 31. La nedilación de PCK1 es necesaria para su función gluconeogénica in vivo. (A) Niveles de proteína PCK1, (B) prueba de tolerancia a la glucosa (GTT), (C) prueba de tolerancia a la insulina (ITT), (D) prueba de tolerancia al piruvato (PTT), (E) niveles de glucosa en sangre durante ayuno de 24 horas y producción de glucosa hepática (HGP) en ratones control, ratones que carecen de PCK1 en el hígado (PCK1 LKO) (ratones PCK1 loxP inyectados con AAV-Cre en la vena de la cola) y PCK1 LKO inyectados con AAVPCK1 wild type (WT). (F) Niveles de proteína PCK1, (G) GTT, (H) ITT, (I) PTT, (J) prueba de tolerancia al glicerol (GlyTT), (K) niveles de glucosa en sangre durante ayuno de 24 horas y producción UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 136 de glucosa hepática en ratones de control, PCK1 LKO y PCK1 LKO inyectado con triple mutante AAV-PCK1 (n = 5-10 animales por grupo). La expresión de GAPDH sirvió como control de carga y los valores de control se normalizaron al 100%. Los datos se presentan como media ± SEM; ANOVA unidireccional seguido de prueba post hoc de Bonferroni: *P < 0,05 y ***P < 0,001. # Denota diferencias entre los ratones PCK1 LKO + AAV-PCK1 WT y PCK1 LKO + AAV-PCK1- K278R-K342R-K387R. Discusión 143 desarrollo de terapias dirigidas a estas condiciones. Con respecto a la expresión de PCK1 en la diabetes tipo 2, la literatura existente muestra datos diferentes, ya que algunos han demostrado que no había relación entre la hiperglucemia en ayunas y la expresión de la proteína PCK1 [313], mientras que otros detectaron una mayor expresión de PCK1 en ratones diabéticos [314, 315]. En línea con esto, para averiguar si la sobreexpresión de PCK1 en el hígado provoca hiperglucemia y diabetes tipo 2, Valera y colaboradores generaron ratones transgénicos que sobreexpresaban PCK1-c en el hígado [172]. Estos ratones eran hiperglucémicos e hiperinsulinémicos, y tenían una disminución del contenido de glucógeno hepático y de los niveles de ARNm de GLUT-4 en el músculo, todo lo cual sugiere resistencia a la insulina. Esta idea ha sido respaldada por estudios de clamp euglucémicoshiperinsulinémicos, en los que la sobreexpresión de PCK1 provocó un aumento del HGP y la disminución de la capacidad de la insulina para suprimir la gluconeogénesis [316]. Por otro lado, en 2003, Duplus y colaboradores describieron una población de pacientes obesos con diabetes tipo 2 con un polimofismo de un solo nucleótido (SNP) en las posiciones -1097 y -967 pb del promotor de PCK1 que se correlacionaba con los niveles de glucosa en sangre [317]. El caso opuesto fue ilustrado por Perales y colaboradores [318], quienes utilizaron el silenciamiento del ARN de PCK1 para suprimir la expresión de PCK1 en ratones diabéticos, lo que resultó en la moderación de la hiperglucemia. En conjunto, estos estudios establecen a PCK1 como gen posiblemente implicado en el desarrollo de la diabetes, y, el hecho de que esta proteína necesite estar nedilada, como se explica a lo largo de esta tesis, para que su actividad gluconeogénica sea plena, abre las puertas para nuevas vías de investigación con la nedilación de PCK1 como diana para el tratamiento de la diabetes tipo 2. Ciertamente, la regulación de la función de PCK1 es bastante compleja y los variados fenotipos experimentales en ratones han sido ampliamente discutidos [167]. Aunque nuestros resultados identifican la nedilación de PCK1 como un nuevo mecanismo para regular la homeostasis de la glucosa en roedores, una limitación del presente trabajo es que no investigamos si las mutaciones descritas en los sitios nedilados de PCK1 también son relevantes en humanos y si estas mutaciones están relacionadas con la diabetes tipo 2 humana. Más estudios genéticos en personas con diabetes tipo 2 debería dilucidar estos aspectos. De hecho, nuestro trabajo no excluye que otras proteínas también puedan ser nediladas en ayuno o restricción calórica. En realidad, nuestro enfoque proteómico detectó Bibliografía 144 más proteínas que estaban nediladas en esas condiciones. Por lo tanto, será necesaria más investigación para dilucidar el papel funcional en la gluconeogénesis de otras proteínas nediladas. Tomando todos nuestros resultados en conjunto, en la presente tesis se describe un nuevo papel de la nedilación en la regulación de la homeostasis de la glucosa, tanto en condiciones fisiológicas como patofisiológicas, involucrándose en el desarrollo de la diabetes tipo 2 en humanos. De este modo, PCK1 y su regulación emergen como piezas clave en el rompecabezas del metabolismo, desempeñando un papel crucial en la síntesis de glucosa y en la regulación del metabolismo energético. Su estudio continuo ofrece posibilidades para el avance en la comprensión y tratamiento de diversas enfermedades metabólicas. En definitiva, nuestros resultados revelan un nuevo mecanismo que participa en el control preciso de la homeostasis de la glucosa en todo el cuerpo, asociando la respuesta de la nedilación de PCK1 y su actividad gluconeogénica a la disponibilidad de nutrientes. CONCLUSIONES UXÍA FERNÁNDEZ PAZ 146 7. CONCLUSIONES Los resultados obtenidos durante la realización de esta tesis nos permiten establecer las siguientes conclusiones: • Los niveles hepáticos de las principales proteínas implicadas en la nedilación (NAE1 y NEDD8) están fuertemente regulados por el estado nutricional, aumentando durante el ayuno y disminuyendo tras la ingesta. • La nedilación en el hígado es fundamental para la gluconeogénesis y alteraciones de este proceso provocan una disminución de la producción hepática de glucosa. • El glucagón, la adrenalina y los glucocorticoides inducen un incremento de la nedilación en el hígado y requieren que PCK1 sea nedilado para inducir sus acciones gluconeogénicas. • El bloqueo de la nedilación mejora el perfil glucémico en situaciones de resistencia a insulina. • En el hígado de los pacientes con diabetes tipo 2 se encuentra un incremento en los niveles de proteína de NAE1, NEDD8 y cullins nediladas. • PCK1 debe nedilarse en sus lisinas K278, K342 y K387 para ejercer su actividad gluconeogénica, y mutaciones en estos residuos provocan una disminución en la actividad enzimática de PCK1 y, por ende, de la producción hepática de glucosa. • En su conjunto, estos resultados demuestran la identificación de un nuevo mecanismo biológico de gran relevancia en el contexto de la homeostasis metabólica, y más concretamente en el de la glucemia. 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