UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
FACULTAD DE VETERINARIA
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA
EVALUACIÓN DEL MODO DE ACCIÓN DE
TOXINAS DE DINOFLAGELADOS Y CIANOBACTERIAS
EN CÉLULAS HEPÁTICAS
Tesis doc o al
Hena López Alonso
Lugo, 2013
Luis M. Bo ana López, Ca ed á ico de Fa macología de la Uni e sidad de San iago
de Compos ela,
INFORMA:
Que la esis doc o al i ulada “E aluación del modo de acción de oxinas de
dino lagelados y cianobac e ias en células hepá icas”, ecogida en la p esen e
memo ia, de la que es au o a la Licenciada en Ve e ina ia po la Uni e sidad de
San iago de Compos ela Dña. Hena López Alonso, ha sido ealizada bajo su
codi ección en el depa amen o de Fa macología de la Facul ad de Ve e ina ia y
cumple las condiciones exigidas pa a que su au o a pueda op a al g ado de Doc o a
po la Uni e sidad de San iago de Compos ela, o o gando su ap obación pa a la
lec u a y de ensa de la misma.
Pa a que así cons e a los e ec os opo unos, i ma la p esen e en Lugo, a 24 de
Sep iemb e de 2013.
Luis M. Bo ana López Hena López Alonso
Doc o en Fa macia
Codi ec o de esis
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA
Facul ad de Ve e ina ia
Campus Uni e si a io
27002, Lugo (Spain)
Tel.: + 34 982822233
Fax: + 34 982822233
Juan And és Rubiolo, Doc o con a ado po el depa amen o de Fa macología de la
uni e sidad de San iago de Compos ela,
INFORMA:
Que la esis doc o al i ulada “E aluación del modo de acción de oxinas de
dino lagelados y cianobac e ias en células hepá icas”, ecogida en la p esen e
memo ia, de la que es au o a la Licenciada en Ve e ina ia po la Uni e sidad de
San iago de Compos ela Dña. Hena López Alonso, ha sido ealizada bajo su
codi ección en el depa amen o de Fa macología de la Facul ad de Ve e ina ia y
cumple las condiciones exigidas pa a que su au o a pueda op a al g ado de Doc o a
po la Uni e sidad de San iago de Compos ela, o o gando su ap obación pa a la
lec u a y de ensa de la misma.
Pa a que así cons e a los e ec os opo unos, i ma la p esen e en Lugo, a 24 de
Sep iemb e de 2013.
Juan And és Rubiolo Hena López Alonso
Doc o en Ciencias e
Ingenie ía de los Alimen os
Codi ec o de esis
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA
Facul ad de Ve e ina ia
Campus Uni e si a io
27002, Lugo (Spain)
Tel.: + 34 982822233
Fax: + 34 982822233
AGRADECIMIENTOS
A Luis M. Bo ana po habe me dado la opo unidad de abaja en es e labo a o io, po
sus es ue zos pa a que es e cuen e con la inanciación su icien e, po los aliosos
consejos que han hecho más ácil el desa ollo de es a esis, y po hace de es e
depa amen o, di e so y nume oso, un g upo al que es ácil uni se en el abajo y la
con i encia.
A Juan, po es a siemp e dispues o a explica , po habe me enseñado, ayudado y
animado en algunos momen os di íciles. Po habe me o ecido siemp e una ac i ud
amable y educada, y po habe me a ado como a un compañe o. En de ini i a, po se
un g an in es igado y una mejo pe sona.
A oda la gen e que abaja en el labo a o io y que di ec a o indi ec amen e ha
pa icipado en es a esis, po su ayuda en es os años.
A mis dos compañe os del an iguo “comedo ”, po los buenos momen os, las cha las
ag adables, las isas, y po hace que uno enga más ganas de eni a abaja cada
mañana.
A mis compañe os de pasillo, a mis “compis” de despacho, y en especial a la
enca gada de la in endencia, po hace de és e un ambien e ag adable donde es udia ,
esc ibi , comen a , e incluso me enda .
Y mil g acias a odos los que me quie en y que po supues o ado o, en especial a los
“míos” (g andes y pequeños), po su e e no e incondicional apoyo.
ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS
ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS
ADN: Ácido desoxi ibonucleico
AO: Ácido okadaico
ASP: En enenamien o po oxinas amnésicas
AZP: Azaspi ácidos
CA: Ciclina A
CB: Ciclina B
CD: Ciclina D
CDKs: Quinasa dependien es de ciclinas
CE: Ciclina E
CFP: En enenamien o po cigua oxina
CYN: Cilind ospe mopsina
CYP450: Ci oc omo P450
Da: Dal on
DL50: Dosis le al 50
DSP: En enenamien o po oxinas dia éicas
DTX-1, DTX-2, DTX-3: Dino isis oxina -1, -2, -3
DTXs: Dino isis oxinas
EGF: Fac o de c ecimien o epi elial
eq: equi alen es
EU-NRL: Labo a o ios nacionales de e e encia de la unión eu opea
FAO: O ganización de la naciones unidas pa a la ag icul u a y la alimen ación
FITC: Iso iociana o de luo esceína
h: ho a
HAB: Flo aciones algales noci as
HGF: Fac o de c ecimien o hepá ico
H.P.: Hepa oci os P ima ios
IC50: Concen ación inhibi o ia 50
IOC: Comisión Oceanog á ica In e gube namen al de la UNESCO
I.P.: Yodu o de p opidio
kg: Kilog amo
LDH: Lac a o deshid ogenasa
MC: Mic ocis ina
mg: Milig amo
ml: Milili o
MTT: Me il iazol e azolio
ng: Nanog amo
nM: Nanomola
NSP: En enenamien o po oxinas neu o óxicas
OMS: O ganización mundial de la salud
PC: Pun o de con ol
PP1, PP2, PP3: Fos a asas de se ina- eonina 1, 2A y 3
PR: Pun o de es icción
PSP: En enenamien o po oxinas pa alizan es
PTXs: Pali oxinas
ROS: Especies eac i as de oxígeno
Ub: Ubiqui ina
UE-NLRs: labo a o ios de e e encia de la UE de bio oxinas ma inas
WHO: O ganización mundial de la salud
g: Mic og amo
ÍNDICE
___________________________________________________________ In oducción
6
Resumiendo, las consecuencias nega i as de i adas de es as lo aciones noci as son
múl iples: el posible iesgo que supone pa a la segu idad alimen a ia es posiblemen e
la más ascenden e, además, los posibles pe juicios económicos pueden se muy
se ios y a ec a a nume osos sec o es en e los que cabe des aca la ac i idad
acuícola y pesque a, el u ismo y o os como son las desalinizado as. El sec o
acuícola iene que a on a pé didas debidas al inc emen o de las asas de mo alidad,
y a peo es índices de con e sión en e o as. Así mismo, cuando la moni o ización de
las aguas e idencia un mayo ni el de especies i oplanc ónicas po encialmen e
pelig osas, suele p ocede se po pa e de las au o idades compe en es al “cie e” de
las zonas de cap u a, y po an o, el sec o se e obligado a de ene la ac i idad
ex ac i a y en ocasiones ambién la come cialización de especies p oceden es de la
acuicul u a, con los consecuen es pe juicios de dis in a índole que es o supone. A
mayo es, algunas cianobac e ias libe an sus ancias olá iles que esul an
desag adables e incluso i i an es, que sumado al aspec o poco a ac i o de las aguas
con g andes can idades de mic oalgas o cianobac e ias, hace que las ac i idades
u ís icas y de ec eo se ean ambién damni icadas [13].
Po lo an o, la p esencia de ico oxinas esul a un cla o p oblema de salud pública,
además de un p oblema económico y ecológico. Como consecuencia de odo es o, en
las úl imas décadas se ha is o inc emen ado el in e és de la comunidad cien í ica en
elación a es e ema, así como la p eocupación de di e sos sec o es p o esionales
implicados, y de la sociedad en gene al, po las posibles consecuencias que es e
enómeno pudie a ene , ya que cada ez exis e un mayo consumo y una mayo
dis ibución de p oduc os alimen icios de o igen ma ino [23].
1.1-CLASIFICACIÓN DE LAS FICOTOXINAS
Las in oxicaciones alimen a ias causadas po oxinas ma inas son diagnos icadas en
base a la sin oma ología clínica (no exis e una p ueba clínica pa a de e mina la
___________________________________________________________ In oducción
7
e iología de la in oxicación), de ahí que algunos au o es clasi iquen las oxinas en base
a la sin oma ología clínica que el pacien e in oxicado mani ies a [23]. En o os
supues os, y debido a la apa ición ecien e de nue os me aboli os óxicos, las oxinas
no se pueden encaja en ninguno de es os g upos, po lo que la clasi icación ha ido
modi icándose con el paso del iempo.
Basándose en la sin oma ología clínica, se sabe que exis en oxinas neu o óxicas que
causan el sínd ome conocido como NSP (Neu o oxic Shell ish Poisoning), pa alizan es
que causan el PSP (Pa aly ic Shell ish Poisoning), dia eicas esponsables del DSP
(Dia he ic Shell ish Poisoning), amnésicas causan es del sínd ome ASP (Amnesic
Shell ish Poisoning), la in oxicación po azaspi ácidos (AZP), y la in oxicación po
pali oxinas (PTXs). Po o o lado se conoce la in oxicación causada po el pez Globo,
po la cigua e a (CFP o Cigua e a Fish Poisoning), y po úl imo las in oxicaciones
p oducidas po cianobac e ias [28]. Las ablas 1 y 2 esumen las p incipales oxinas
conocidas p oducidas po dino lagelados, dia omeas y cianobac e ias, así como sus
p incipales o ganismos p oduc o es, los ó ganos y ejidos diana, y los sín omas más
habi uales que mani ies a un se humano u o o mamí e o as esul a in oxicado.
Algunos au o es incluyen, aunque como un g upo apa e, la in oxicación po
escomb oides. Es la in oxicación más ecuen e p oducida po el consumo de
p oduc os del ma , y su o igen adica en el consumo de pescado con al os ni eles de
his amina. La causa de que el pescado con enga ni eles de his amina po encialmen e
pelig osos, se debe a la de iciencia en los mé odos de conse ación del pescado as
su cap u a [23].
Tabla 1: Clasi icación de las oxinas ma inas
GRUPOS
TOXINAS
ORGANISMOS
PRODUCTORES1
DIANA
SÍNTOMAS
REFERENCIAS
TOXINAS MARINAS
Pa alizan es
(PSP)
Saxi oxinas (STXs), Gonyau oxinas (GTXs),
N-sul oca bamoil-11hid oxisul a o oxinas
(Cs)
Alexand ium sp.
Gymnodinium sp. Py odinium sp
Sinapsis ne iosa
(bloquea canal de
calcio)
Pa es esia, dolo de cabeza, a axia y disme ía,
ómi os, comp omiso espi a o io y mue e.
[23, 28-33]
Dia eicas
(DSP)
Ácido okadaico (AO)
Dino isis oxinas (DTXs)
P o ocen um sp (P. Lima,
P. A ena ium…)
Dinophysis sp (D Acu a…)
Phalac oma o unda um
In es ino,
hígado…(inhiben las
PP)
Se e os sín omas gas oin es inales: dia ea,
náuseas, ómi os, e o ijones…
[23, 28, 29, 33-
38]
Pec eno oxina
Pec eno oxina (PTX)
Dinophysis sp
P o ocen um sp
Hígado
Signos de allo hepá ico en a ón
[23, 28, 29, 33,
34, 37, 39]
Yeso oxina
Yeso oxina (YTX)
Lingulodinium polyed um,
Gonyaulax spini e a,
P o oce a ium e icula um
Mioca dio…
Descoo dinación mo o a en a ón
[23, 28, 29, 33,
34, 40]
Amnésicas
(ASP)
Ácido Domóico (DA)
Chond ia a ma a.
Pseudo-ni zschia sp
Ce eb o, e ina,
mioca dio (Ac i a
ecep o es de
kaina o)
Náuseas y ómi os, dolo de cabeza, dia ea,
cambios de es ado men al, dis unción del sis ema
ne ioso au ónomo, amnesia, con ulsiones, coma y
mue e
[23, 28, 29, 33,
41]
Neu o óxicas
(NSP)
Cigua o oxinas, Mai o oxina, B e e oxina,
Iminas cíclicas
Gambie discus oxicus
Gymnodinium b e e
Ka enia selli o mis
Gambie discus oxicus
Sinapsis ne iosa
Pa es esias, signos gas oin es inales, espasmos,
diplopía, al e aciones de la ma cha, al e ación de la
e mo-pe cepción, dolo músculo-esquelé ico, y
di icul ad espi a o ia
[23, 28, 29, 33,
42-46]
Pali oxina
Pali oxina (PLTX)
Os eopsis spp
Tejido
musculo-esquelé ico,
mioca dio
Dia ea, ieb e al a, os, abdomiasis, di icul ad
espi a o ia, insu iciencia ca díaca…
[33, 47-50]
Azaspi ácidos
Azaspi ácidos (AZAs)
Azadinium spinosum
(P o ope idinum c assipes)
Hígado pánc eas,
mioca dio…
Nauseas, ómi os, dia ea se e a, e o ijones.
Reacción in lama o ia po con ac o y po inhalación.
Di icul ad espi a o ia
[23, 28, 29, 33,
51-53]
Te odo oxina
Te odo oxina (TTX)
Vib io sp
Sinapsis ne iosa y
ejido musculo-
esquelé ico
En umecimien o de ca a y ex emidades,
decaimien o, apa ía, pa álisis ascenden e, allo
espi a o io y ci cula o io y mue e
[23, 28, 29, 33,
54-56]
1: Ejemplos de los p incipales o ganismos p oduc o es de las oxinas
Tabla 2: Clasi icación de las oxinas de agua dulce
GRUPOS
TOXINAS
ORGANISMOS
PRODUCTORES1
DIANA
SÍNTOMAS
REFERENCIAS
TOXINAS DE AGUA DULCE
Hepa o oxinas
Mic ocis inas
(LR, LA, YR, RR).
Mic ocys is sp, Anabaena sp,
Nodula ia sp, Nos oc sp,
Oscilla o ia sp
Hígado
Gas oen e i is, dia ea, allo hepá ico y mue e.
Ca cinogénesis
[57-59]
Nodula ina
Nodula ia spumigena
Hígado
Sín omas asociados a hepa o oxicidad.
Ca cinogénesis
[57, 58, 60]
Cilind ospe mopsina (CYN)
(ci o oxina)
Cylind ospe mopsis acibo skii,
Aphanizomenon o alispo um,
Aphanizomenon los-aquae,
Umezakia
na ans, Rhaphdiopsis cu a a
Hígado, iñón, imo,
co azón...
Hepa oen e i is, allo enal.
Ca cinogénesis.
[57, 58, 61]
Neu o oxinas
Saxi oxina
Anabaena ci cinalis,
Aphanizomenon sp.
Cylind ospe mopsis acibo skii
Sinapsis ne iosa
Pa es esia, dolo de cabeza, a axia y disme ía,
ómi os, comp omiso espi a o io y mue e
[23, 57, 58]
Ana oxina-a
Ana oxina-a (s)
Anabaena sp
Oscilla o ia sp
Sinapsis ne iosa
Pé dida de coo dinación, asciculaciones
muscula es, con ulsiones, disnea, apnea y
mue e
[58, 62, 63]
De mo oxinas
Aplisia oxina
Ligbia oxina
L. majuscula
(M. p oducens)
Piel
I i ación se e a.
Ca cinogénesis.
[58, 63, 64]
I i an es
Lipopolisacá idos
Cualquie ejido
expues o
E i ema en dis in os g ados, disneas de base
alé gica, i i ación gás ica…
[58, 65]
1: Ejemplos de los p incipales o ganismos p oduc o es de las oxinas
___________________________________________________________ In oducción
10
Exis en, po an o, a ios c i e ios posibles a la ho a de encuad a a es as ico oxinas
en una clasi icación. Re i iéndose a la o denación que a iende a los ó ganos
a ec ados, podemos deci que uno de los g upos más ele an es es el de las
hepa o oxinas. És as, en lo e e en e a su p esencia en las aguas y a su epe cusión
pa a la salud humana son las más ecuen es. Es o se debe, en pa e, a la con inua
mejo a de la me odología pa a su análisis, y a la es anda ización y ex ensión de los
con oles pa a la de ección de las mismas [19].
1.2-HEPATOTOXINAS
Las hepa o oxinas son un p oblema pa a la salud pública. Algunas, como el ácido
okadaico (AO) y las dino isis oxinas (DTXs) (que aunque siendo oxinas dia eicas,
pos e io men e se demos ó que ambién a ec an al hígado), pueden se inge idas a
a és del consumo de alimen os del ma con aminados [13]. O as ico oxinas de agua
dulce, como las mic ocis inas (MC), la nodula ina o la cilind ospe mopsina (CYN), son
p incipalmen e inge idas a a és del agua de consumo, aunque además exis en o as
ías de en ada que son menos ecuen es, como la inhalación o el con ac o con las
mucosas [66, 67].
1.2.1-HEPATOTOXINAS DE ORIGEN MARINO
El ácido okadaico y las dino isis oxinas-1, -2, y -3 (DTX-1, DTX-2, DTX-3) son las
p incipales oxinas implicadas en el sínd ome conocido como “DSP” (dia he ic
shell ish poisoning) o en enenamien o po oxinas dia éicas [68]. Es e sínd ome ue
desc i o po p ime a ez en Japón a inales de los años 70 del siglo pasado [69], y
desde en onces ha mos ado una incidencia c ecien e [70]. El AO se dis ibuye
ampliamen e a lo la go del plane a [13], y es la oxina DSP p edominan e en España
[71] y Eu opa, si bien se han de ec ado ambién g andes can idades de DTX-2 en las
cos as españolas, po uguesas e i landesas [72-76]. Desde p incipios del siglo 21
___________________________________________________________ In oducción
11
pa ece es a ambién p esen e en mejillones de las cos as del su de No uega,
asociada al AO [77]. Es e g upo de ico oxinas ma inas se ca ac e izan po se odos
ellos compues os policé idos que con ienen un anillo u ano o pi ano, y un g upo
uncional al a-hid oxi ca boxílico. Es as moléculas sólo se dis inguen po la posición de
los g upos me ilo [39].
R1
R2
R3
R4
P.M.
AO
CH3
H
H
H
804.5
DTX-1
CH3
CH3
H
H
818.5
DTX-2
H
H
CH3
H
804.5
DTX-3
CH3
CH3
H
Acilo
Figu a 1: Es uc u a del AO y DTX-1, -2, y -3 [78].
El ácido okadaico le debe su nomb e a la esponja de la que se aisló po p ime a ez a
p incipio de los años 80, Halichond ia okadai [79]. La DTX-2, se aisló po p ime a ez
en I landa, en 1992, a pa i de ex ac o de mejillón [80]. A pesa de es o, se sabe que
son las mic oalgas de los géne os Dinophysis spp. y P o ocen um spp. las
p oduc o as de es os compues os lipo ílicos y e moes ables. Son muchas las especies
p oduc o as de oxinas DSP, en e las que cabe ci a Dinophysis acumina a,
Dinophysis acu a, Dinophysis o ii, P o ocen um lima y P o ocen um conca um [81-
83]. La p oducción de es as oxinas a ía en unción de la especie y de los mo o ipos
egionales y es acionales de las mic oalgas [13].
Las moléculas oxicas se acumulan en la glándula diges i a y en el ejido g aso de
algunos bi al os, (especialmen e los mejillones, pe o ambién iei as, almejas y
os as) que al alimen a se po il ación del i oplanc on con aminado, an acumulando
g andes can idades de es as oxinas. Además, los peces que se alimen en con es os
___________________________________________________________ In oducción
12
il ado es con aminados pueden a su ez acumula es as moléculas, siendo el hígado
y las gónadas los ejidos del pez que albe gan mayo can idad de oxina [84]. El iempo
que un bi al o necesi a es a en un ambien e con aminado pa a esul a óxico es muy
a iable y depende de di e sos ac o es como son: la oxicidad de la especie de
dino lagelado que es é p esen e en el agua, la abundancia ela i a de o as especies
no óxicas [70] y la ausencia de silica os en el agua (que a o ece el c ecimien o de
especies de Dino lagelados) [85]. El iempo necesa io pa a que los bi al os eliminen
las oxinas acumuladas es ambién a iable, a pesa de es o, algunos es udios
apun an a que en gene al pa ecen p esen a un pa ón bi ásico que comp ende una
ase de eliminación ápida de unos pocos días de du ación y o a ase de pé dida más
g adual du an e las semanas siguien es [86]. Sin emba go, o os es udios no han
podido es ablece con ce eza es a di e enciación de ases [87].Po an o, el pa ón de
acumulación y depu ación de oxina es pa icula pa a cada ipo de bi al o, y pa ece
se independien e de la oxina de que se a e.
Cuando el se humano ingie e es os alimen os con aminados con oxinas DSPs, se
p oducen sín omas gas oin es inales de dis in a in ensidad, aunque gene almen e
se e os, y elacionados di ec amen e con la can idad de oxina inge ida. Los sín omas
apa ecen poco iempo después de la inges a, en e los 30 minu os y las dos ho as
pos e io es, habi ualmen e son au olimi an es, y en ningún caso le ales, obse ándose
una mejo ía clínica del pacien e in oxicado en 3-4 días [70, 88].
Respec o al mecanismo de acción de es os compues os, se ha demos ado que las
oxinas DSP son inhibido es de las os a asas de se ina- eonina 1, 2A y 3 (PP1, PP2A
y PP3) [13, 89, 90]. Las os a asas son un g upo de p o eínas es echamen e
elacionadas con di e sos p ocesos me abólicos de la célula. Es a inhibición puede
explica la emp ana in lamación en la mucosa in es inal y la apa ición epen ina de la
dia ea como sín oma p edominan e de es as in oxicaciones, pues la inhibición de las
os a asas po pa e del AO p o oca una hipe os o ilación de las p o eínas que
___________________________________________________________ In oducción
13
con olan la libe ación de sodio y de las p o eínas ci oesquelé icas o de unión,
p oduciendo una libe ación descon olada de solu os y consecuen emen e una pé dida
pasi a de luidos hacia el lumen in es inal [13, 83, 84].
Es udios in i o ealizados en a ón, e elan que as la adminis ación ía o al de AO
se p oducen daños en hígado, in es ino delgado y en el es ómago no glandula [91-
93]. Además, como mues an los esul ados expues os du an e el encuen o del año
2001 de los labo a o ios de e e encia de la UE de Bio oxinas ma inas (UE-NLRs), el
AO se abso be con acilidad a a és del epi elio gas oin es inal, pues ascu idos
5 minu os desde la adminis ación ía o al, la oxina es aba p esen e en pulmón,
hígado, co azón, iñón e in es ino delgado y g ueso. T anscu idas dos semanas el AO
seguía p esen e en asos sanguíneos e hígado, y has a cua o semanas más a de en
in es ino [94, 95]. También se ha publicado que el AO a a iesa la ba e a
hema oplacen a ia de a onas p eñadas [96]. Ensayos ealizados con a ones
mos a on que la dosis empleada de AO y o as oxinas, y posiblemen e la ía de
adminis ación de las mismas, de e mina los ó ganos que se en a ec ados y la
se e idad de las lesiones obse adas [93]. Yasumo o e al en 1978, obse a on como
las DSPs e an mucho más le ales cuando se adminis aban ía o al que ía
in ape i oneal [69], sin emba go publicaciones pos e io es han demos ado que la
dosis le al de es as oxinas adminis adas po ía o al es de 3 a 6 eces supe io a la
dosis le al cuando se adminis a ía pa en e al, y así lo ecoge un in o me del
encuen o FAO/WHO/IOC del 2006 [97]. Es a disc epancia puede ene explicación en
el hecho de que Yasumo o e al en 1978 emplea on ex ac os de mejillón con aminado,
y es os pod ían con ene o as moléculas óxicas no con empladas en el a ículo.
Aunque al AO se le conside a gene almen e una en e o oxina [98, 99], as una
adminis ación in a enosa en la a a, el AO esul a se una po en e hepa o oxina pe o
con signos gas oin es inales inde ec ables [100]. En 1996, Ma ías e al. ealiza on un
es udio en el que inyec a on una dosis única de AO ma cado adioac i amen e ía
___________________________________________________________ In oducción
14
in amuscula a a ones, es e abajo indica que en el pa ón de exc eción del AO es án
implicadas la sec eción bilia y la ci culación en e o-hepá ica [101].
Además de los mencionados signos gas oen é icos asociados a la in oxicación po
oxinas DSP, ambién son conocidos o os e ec os noci os. F anchinia e al. publica on
un abajo en el que obse aban como bajas dosis de es a oxina adminis ada a
a ones ía o al eje cen inmunosup esión [102]. En o os es udios ambién se cons a ó
una ma cada inmunosup esión e e sible en monoci os humanos de sang e pe i é ica
cuando se a a on es as células en condiciones in i o con dosis bajas de AO [70].
Aunque el AO (ac i ado me abólicamen e o no) sob e células de Salmonella
yphimu ium no pa ece ene capacidad mu agénica [103], en células euca io as se ha
demos ado que el AO iene una po en e capacidad mu agénica. Sob e células de
pulmón de háms e se e aluó la mu agénesis del AO no ac i ado me abólicamen e, y
los au o es del es udio sugi ie on que es a p opiedad no se debe a la o mación de
aduc os, sino a que p obablemen e el es ado de os o ilación de las p o eínas
epa ado as de ADN se al e a, y es o es lo que a o ece la mu agénesis [70]. O os
au o es a i man que la o mación de aduc os es posible, y es á condicionada po las
dosis de AO empleadas pa a el a amien o de di e sas líneas celula es (BHK21, C13
y HESV) [104]. Po o o lado son a ios los es udios que han demos ado que algunas
DTXs como el AO y la DTX-1 p omue en umo es en di e sos ó ganos como la piel, el
hígado y el es ómago de a as y a ones [105-107]. Según los p ime os es udios
ealizados po Fujiki, H. e al, al aumen a la can idad de p o eínas os o iladas en los
sis emas celula es, se p omue en los umo es, lo que esal a la capacidad de las
p o eínas os a asas como sup eso es umo ales [107, 108]. Sin emba go, pos e io es
a ículos de es e mismo g upo han demos ado que la inhibición de las p o eínas
os a asas no es su icien e pa a que se p esen e un mayo desa ollo de umo es
[109]. En es e sen ido, una ecien e e isión a i ma que posiblemen e la i i ación
p oducida po es as oxinas sea esencial en el desa ollo de umo es asociado al AO,
___________________________________________________________ In oducción
15
no así la inhibición de las p o eínas os a asas, y se llega a la conclusión de que es
necesa ia una e-e aluación del mecanismo de oxicidad de es as oxinas, al menos
en lo conce nien e a su capacidad mu agénica [110]. En e e encia a la geno oxicidad
y la capacidad de p omo e umo es de la DTX-2, no hay da os publicados. En el se
humano el e ec o geno óxico a la go plazo del AO y las DTXs se desconocen [25].
Tan o in i o como in i o, la DTX-2 ha mos ado se una oxina menos po en e que el
AO. Po ía in ape i oneal en a ón la DL50 (can idad de una sus ancia necesa ia pa a
ma a a la mi ad de la población some ida a es udio [111]) de la DTX-2 ue de
≈ 337,5 µg/kg, y pa a el AO de ≈ 212,5 µg/kg, po an o, el AO esul a se un 40% más
óxico que la DTX-2. Así mismo, en la capacidad de inhibición de las os a asas se ha
cons a ado que el AO es casi dos eces más po en e que la DTX-2, lo que concue da
pe ec amen e con la idea de que es es e el p incipal mecanismo ci o óxico de es as
moléculas [77]. La di e encia de po encia en e el AO y la DTX-2 es mayo en cul i os
p ima ios de neu onas ce ebela es, obse ándose que el AO es unas 4 eces más
óxico que la DTX-2. T as incuba se es as células du an e 24 ho as con la oxina, se
de e minó que la IC50 (concen ación de una molécula necesa ia pa a inhibi el 50% de
una ac i idad biológica [111]) de DTX-2 es ≈ 8 nM, mien as que pa a el AO es
de ≈ 2 nM [112]. Se ía in e esan e con a con esul ados de ensayos in i o que
pe mi iesen de e mina una DL50 compa ada en e AO y DTX-2 adminis adas po ía
o al, ya que es a es la ía de con aminación más p obable pa a el se humano. Es o
no se ha ealizado has a el momen o, posiblemen e debido a la escasez de DTX-2
disponible, lo que hace que sólo se hayan publicado da os a es e espec o pa a el
AO [77]. La li e a u a e e en e a la oxicidad aguda del AO adminis ado ía o al
apo a da os a iables en cuan o a la dosis le al pa a a ones, que a desde los 400 a
los 2000 mg/kg [91, 93, 99]. Sus en ado po es os da os, la FAO es ableció en 2006
como dosis aguda de e e encia 0,33 µg OA eq/kg [113]. En es e sen ido la legislación
___________________________________________________________ In oducción
22
Figu a 3: Resumen g á ico de los e ec os conocidos de la CYN.
1.3-HÍGADO COMO MODELO DE ESTUDIO
En los mamí e os, el hígado, es un ó gano muy i igado (a él le llega el 24% del gas o
ca díaco) que iene di e sas unciones como la sín esis de ácidos bilia es que
pa icipan en la diges ión de los alimen os, el me abolismo de glúcidos y lípidos, la
ese a de cie os elemen os, i aminas (como la B12) y glucógeno, y la sín esis de
ac o es de coagulación (como el ib inógeno y la p o ombina). Pe o una de sus
unciones más des acadas es la de oxi icación de la sang e que en a en el
pa énquima hepá ico a a és de la ena po a. Es a sang e que se ecoge del ac o
in es inal y el bazo, con luye en el hígado y pasa a a és del mismo pa a que los
nu ien es y o as moléculas, como los p incipios ac i os de los á macos y las oxinas,
sean me abolizadas [152]. Del p oceso de me abolización de las oxinas pueden
esul a moléculas inocuas, o moléculas con una mayo capacidad noci a que la que
___________________________________________________________ In oducción
23
enían an es de se me abolizadas [153]. Sabiendo que al hígado llega g an pa e del
olumen sanguíneo ci culan e, y que en él se me aboliza casi oda sus ancia que aya
a se exc e ada del o ganismo, no debe ex aña que muchas oxinas engan un e ec o
noci o sob e es e ó gano, aún en el supues o de que és e no uese su diana p incipal.
Po eso el hígado es un ó gano a ene en cuen a en el es udio de las oxinas.
Pa a el es udio del e ec o de sus ancias sob e la unción hepá ica, el empleo de
modelos de expe imen ación in i o o ece cie as en ajas en e al empleo de
modelos animales. Las necesa ias conside aciones é icas en el ámbi o de la
in es igación empujan a educi al máximo el núme o de animales empleados con
ines cien í icos y expe imen ales. En es e sen ido, con el empleo de cul i os celula es,
como mé odo al e na i o, se sa is ace la egla de las es e es ( eemplazo, educción
y e inamien o). És a “ egla” se con empla ya desde los años 50 po la comunidad
cien í ica, y la no ma i a eu opea y nacional ( ela i a a la p o ección de los animales
u ilizados pa a expe imen ación y o os ines cien í icos) exige su cumplimien o. En
es e con ex o, se escogió como modelo de es udio dos líneas celula es de o igen
hepá ico: una línea de hepa oca cinoma humano (HEPG2) y o a de hepa oci os
inmo alizados de a a (Clone 9). T as comp oba en los p ime os es udios, la
a iabilidad en los e ec os que el AO y la DTX-2 ienen en unción de la línea celula , y
conside ando lo que o os au o es habían is o p e iamen e espec o a la mayo
sensibilidad de los hepa oci os p ima ios en e a algunas oxinas, nos decan amos po
el empleo de H.P. de a a en los expe imen os consiguien es. Es os cul i os p ima ios
man ienen unas ca ac e ís icas más p óximas a los hepa oci os en su ambien e na u al
que las líneas celula es, po lo an o los es udios lle ados a cabo con cul i os
p ima ios, son más ele an es, aunque ambién más complejos. Apo an da os ace ca
del e ec o que pueden ene las oxinas, que gene almen e son más ep oducibles en
el animal i o, y po an o son más ú iles a la ho a de de e mina el po encial daño que
es as puedan induci .
OBJETIVOS
_____________________________________________________________ Obje i os
25
2-OBJETIVOS
La c ecien e p esencia de di e sas ico oxinas, an o en aguas ma inas como en los
ecu sos híd icos, ha despe ado g an in e és en la comunidad cien í ica po conoce
cómo es as moléculas eje cen su oxicidad sob e los se es i os.
El obje i o de la p esen e esis doc o al es escla ece , en la medida de lo posible, la
ci o oxicidad y los mecanismos de acción de las ico oxinas de agua ma ina AO y
DTX-2, y de agua dulce CYN, sob e dos líneas celula es hepá icas (HepG2 y Clone 9),
y sob e H.P. de a a. En es e sen ido, podemos clasi ica nues os obje i os en dos
pa es:
Analiza el e ec o compa ado del ácido okadaico y de la dino isis oxina-2 en las
líneas hepá icas Clone 9 y HepG2, y en H.P. de a a de e minando:
o La oxicidad ela i a en los dis in os ipos celula es.
o La di e encia en e los alo es de oxicidad in i o, con los que se
conocen in i o.
o Tipo de mue e inducida po ambas oxinas en los dis in os ipos
celula es.
o Al e aciones en la p oli e ación celula de las líneas hepá icas en
es udio, y de hepa oci os p ima ios expues os a mi ógenos.
Analiza el e ec o de la CYN, a concen aciones sub-mic omola es, en cul i os
de H.P. de a a de e minando:
o La oxicidad y el ipo de mue e celula inducida po la oxina .
o La posible pa icipación del es és oxida i o en la inducción de
mue e celula .
_____________________________________________________________ Obje i os
26
o El e ec o en el me abolismo an ioxidan e celula .
o El e ec o sob e la sín esis de p o eínas.
o La elación en e la inhibición de la sín esis de p o eínas y la
inducción de mue e celula .
PUBLICACIONES
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3-PUBLICACIONES
En es e apa ado se p esen an los esul ados ob enidos du an e el anscu so de es a
esis doc o al. Es os esul ados se incluyen en los es a ículos adjun os, publicados
en e is as in e nacionales. En los dos p ime os a ículos se mues an los da os
ob enidos as la e aluación compa ada de AO y DTX-2 sob e células hepá icas
(HepG2, Clone 9 y H.P. de a a), y el e ce a ículo ecoge los esul ados de i ados de
los ensayos ealizados con CYN sob e H.P. de a a. En cada uno de los a ículos los
esul ados se acompañan de la me odología cien í ica empleada y de las conclusiones
ob enidas en cada caso.
3.1-Es udio compa ado de AO y DTX-2 sob e células hepá icas.
3.1.1-Okadaic acid and dinophysis oxin 2 ha e di e en ial oxicological e ec s
in hepa ic cell lines inducing cell cycle a es , a G0/G1 o G2/M wi h abe an
mi osis depending on he cell line.
RESUMEN:
El ácido okadaico es una de las oxinas implicadas en la In oxicación dia eica po
ma iscos que a ec a al se humano, y cuya apa ición se asocia al consumo de bi al os
con aminados. Las p incipales oxinas esponsables de es a In oxicación son el ácido
okadaico (AO), la dino isis oxina-1, -2, y -3 (DTX-1, -2 y -3). Po un lado, as inyección
in ape i oneal en a ón, la DTX-2 es ap oximadamen e un 40% menos óxica que el
AO. Po o o lado, la ci o oxicidad y la geno oxicidad del AO es muy a iable en unción
de las líneas celula es en las que se e alúe, po lo que esul ados simila es pod ían
espe a se de la DTX-2. Pa a de e mina si e ec i amen e es e supues o es cie o,
noso os es udiamos el e ec o del AO y la DTX-2 en dos líneas celula es de o igen
hepá ico: HepG2 y Clone 9. Es es e es udio se e aluó la ci o oxicidad, y el e ec o
sob e el ciclo celula y su egulación. Los esul ados ob enidos indican que en cul i os
de Clone 9 an o el AO como la DTX-2 son equipo en es, mien as que sob e células
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de HepG2 el AO es más po en e que la DTX-2. Ambas oxinas ienen e ec os
con a ios en lo que espec a al ciclo celula , ya que de ienen el ciclo celula de
Clone 9 en G2/M e inducen mi osis abe an es, mien as que en HepG2 el ciclo celula
se de iene en G0/G1. El es udio del e ec o de es as oxinas sob e la dis ibución
subcelula de p53 e eló su p esencia en el núcleo de ambos ipos celula es. La
exp esión génica de ciclinas y quinasas dependien es de ciclinas ue di e en e pa a las
dos líneas celula es. Las oxinas inducen un inc emen o en la exp esión de ciclinas A,
B, y D en las células Clone 9 mien as que en HepG2 las ciclinas A y B dec ecen, así
como ambién dec ece la exp esión de la quinasa 1 dependien e de ciclina.
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3.1.2- Compa a i e s udy o oxicological and cell cycle e ec s o okadaic acid
and dinophysis oxin-2 in p ima y a hepa ocy es.
RESUMEN:
En es e abajo nos plan eamos como obje i o de es e es udio de e mina la oxicidad
ela i a y los e ec os que ienen sob e el ciclo celula de hepa oci os p ima ios de a a
en cul i o el ácido okadaico y dino isis oxina-2. Pa a e alua la ci o oxicidad se empleó
el ensayo colo imé ico basado en la educción me abólica del MTT
(me il iazol e azolio), el análisis de la ac i idad de la caspasa-3, y la libe ación de LDH
(lac a o deshid ogenasa) al medio de cul i o. El ciclo celula se analizó empleando
ci ome ía de lujo con análisis de imagen, y el e ec o de las oxinas sob e la
p oli e ación celula se e aluó a a és de PCR cuan i a i a y mic oscopía con ocal.
A pa i de los ensayos ealizados obse amos que pa a los H.P. en cul i o la DTX-2
es menos óxica que el AO con una di e encia de po encia simila a la obse ada in
i o en a ones as inyección in ape i oneal. A su ez, ambas oxinas inducen
apop osis con un inc emen o signi ica i o de la ac i idad de la caspasa-3 en los
cul i os a ados. Es as oxinas inhibie on el ciclo celula de los hepa oci os en G1,
modi icando las células diploides y las diploides binucleadas. En hepa oci os
p oli e an es expues os a las oxinas se de ec ó como la exp esión del gen y los
ni eles de p o eína p53 dec ecie on. Po o o lado, el es udio del ci oesquele o de
ubulina de los H.P. expues os a DTX-2 y AO puso de mani ies o que es a p o eína se
localizaba en el núcleo, mien as que en el ci oplasma man enía un pa ón g anulado.
Los da os ob enidos de es e abajo demues an la di e encia de po encia que ienen el
AO y la DTX-2 sob e los H.P. de a a en cul i o, y la di e encia de po encia que ienen
es igual a la obse ada in i o as inyección in ape i oneal en a ones. Ambas oxinas
de u ie on el ciclo celula de los H.P. en G1, incluso de células binucleadas diploides.
En es a inhibición del ciclo celula pod ía es a in oluc ado p53 así como la ubulina.
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DISCUSIÓN
_____________________________________________________________ Discusión
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4-DISCUSIÓN
La p esencia de las ico oxinas en aguas ma inas y con inen ales, y ambién en
p oduc os del ma empleados pa a el consumo humano hace necesa io ene un mejo
y mayo conocimien o del mecanismo de acción de es as oxinas pa a apo a a quien
co esponda, mejo es he amien as de decisión con el in de adop a medidas de
p o ección de la salud pública más e icien es, equilib adas y ajus adas al pelig o eal
que es as oxinas suponen. Como esul ado de los expe imen os lle ados a cabo en
es a esis, se ob u ie on una se ie de esul ados que a con inuación se discu en.
4.1.-Es udio del e ec o de las oxinas dia eicas (AO y DTX-2) sob e hepa oci os
p ima ios y ans o mados
Po un lado, en la p esen e esis doc o al se ealizó un análisis oxicológico de AO y
DTX-2 sob e las células Clone 9, HepG2 y H.P. de a a, pa a así p o undiza en el
conocimien o de los mecanismos de acción de es as oxinas y e alua
compa a i amen e, analogías y di e encias del AO espec o de la DTX-2. Es os
esul ados se publica on en sendos abajos i ulados “Okadaic acid and dinophysis
oxin 2 ha e di e en ial oxicological e ec s in hepa ic cell lines inducing cell cycle
a es , a G0/G1 o G2/M wi h abe an mi osis depending on he cell line” y
“Compa a i e s udy o oxicological and cell cycle e ec s o okadaic acid and
dinophysis oxin-2 in p ima y a hepa ocy es”. En los ci ados es udios, se obse ó
cómo el AO y la DTX-2 son equipo en es pa a la línea celula Clone 9, mien as que
pa a las células HepG2, así como pa a los H.P. de a a, la DTX-2 es un 40% menos
po en e que el AO. És a di e encia de po encia es la misma que obse a on Aune e .al.
as la adminis ación in ape i oneal de las oxinas en a ones [77]. Sin emba go en
o os a ículos publicados, ealizados con cul i os de neu onas ce ebela es, la
di e encia de po encia en e AO y DTX-2 es mayo [112] que la que noso os
obse amos en la línea HepG2 y en el cul i o p ima io de hepa oci os.
_____________________________________________________________ Discusión
62
La oxicidad que el AO mos ó en nues os ensayos, se encuen a en e los lími es
an e io men e publicados po o os g upos que han desc i o IC50 en e 5 y
100 nM [154-157]. Las células Clone 9 y los H.P. cuando son expues as al AO y a la
DTX-2 mues an una sensibilidad simila , y a su ez son más sensibles que las
HepG2. Aunando algunos da os publicados an e io men e jun o con los ob enidos en
és a esis, pa ece cla o que las líneas celula es no son el mejo modelo pa a el es udio
de la oxicidad ela i a en e es as oxinas debido a la a iabilidad de los esul ados
obse ados en e es as.
4.1.1-Es udio de la ci o oxicidad del AO y la DTX-2 en células hepá icas
Cuando es udiamos el ipo de mue e celula inducida po el a amien o de las células
hepá icas con AO y DTX-2 imos que en las células Clone 9 la población subdiploide
aumen ó espec o a las células no expues as a las oxinas, y lo hizo en mayo g ado
cuando se emplea on mayo es concen aciones de ambas moléculas. Además, en el
es udio de p53, se obse ó cómo és a p o eína había mig ado al núcleo en las células
a adas. Pa a en ende mejo la implicación de es e hallazgo cabe ci a algunos
aspec os uncionales de p53, ambién conocida como “p o eína sup eso a umo al”. Se
conoce el papel ascenden al que p53 juega en la espues a de las células an e
es ímulos lesi os, an e los cuales, es a p o eína se ac i a pa a impedi la p og esión
de células mu adas o dañadas. p53 es un ac o de ansc ipción cuya exp esión se
induce an e múl iples señales de daño celula (la más es udiada el daño del ADN). La
ac i ación de p53 supone a su ez una egulación posi i a o nega i a (según los
casos) de dis in os genes e ec o es in oluc ados en di e sas unciones celula es, en e
las que cabe des aca la de ención del ciclo celula , la senescencia y la
apop osis [158]. La p o eína p53 es compleja en su es uc u a y ambién posee una
as a complejidad uncional. Además, es a p o eína su e di e sas ans o maciones
pos - ansc ipcionales como son la os o ilación, la ace ilación y la ubiqui inización.
_____________________________________________________________ Discusión
63
Es as modi icaciones acon ecen p e ia mig ación de p53 al núcleo, y ac úan como
e icien es he amien as pa a egula la ac i ación-desac i ación de p53, así como su
es abilidad y su ida media [159]. Además de las ías clásicas de ac i idad de p53
dependien es de la ansc ipción de di e sos genes, es udios más ecien es han
demos ado las bases del mecanismo de acción de p53 cuando eje ce una ac i idad
p oapop ó ica independien e de ansc ipción [160, 161], que además iene luga en
cualquie ipo de célula que se ea some ida a alguno de los ac o es es esan es que
ac i an p53, como son po ejemplo el daño del ADN y la hipoxia [160-162].
Pos e io men e o os g upos co obo a on con sus es udios la exis encia de una
mue e celula p og amada mi ocond ial, mediada di ec amen e po p53 [163-167].
Conside ando las ías que p53 emplea pa a induci la mue e p og amada de las
células, la p esencia de p53 en el núcleo de las células Clone 9 a adas indica que al
menos cie o g ado de apop osis es á in oluc ado en la ci o oxicidad obse ada as la
incubación de es a línea celula con las ico oxinas. Es e hecho no ocu e en el caso
de la línea de hepa oma humano HepG2. Sin emba go, en los H.P., an o la población
sub-G0 como la ac i idad de la caspasa-3 aumen a on signi ica i amen e, lo que
apun a a que ambién en es e caso la apop osis es á implicada, en la mue e de los
H.P. no obs an e, no puede desca a se la posible p esencia de nec osis celula , ya
que los hepa oci os a ados libe a on cie a can idad de LDH al medio de cul i o.
4.1.2-El AO y la DTX-2 a ec an de dis in a mane a el ciclo celula de dis in os
ipos de células hepá icas
Las dos oxinas inhibie on el ciclo celula de las líneas celula es es udiadas y de los
H.P. de a a, pe o lo hicie on en di e en es ases. Sob e las Clone 9, el AO y la DTX-2
ienen un e ec o simila , inhibiendo el ciclo celula en G2/M e induciendo la apa ición
de células con mi osis abe an es. Es o se deduce del hecho de que la población de
células Clone 9 con múl iples núcleos es p oduc o de una seg egación abe an e de
los c omosomas, sin que exis a a iación en la can idad de ADN con espec o a
_____________________________________________________________ Discusión
70
malignidad [189]. Po es o, la p esencia de ubulina en el núcleo de H.P. expues os a
AO y DTX-2 puede se una consecuencia del es és químico p oducido po es as
moléculas. Sin emba go, o a posible causa que no debemos desca a es la p esencia
de es as células en condiciones de cul i o, ya que pe íodos la gos de incubación
pueden p oduci cie o es és en las células, es és que sumado al gene ado po los
compues os en es udio puede p oduci mig ación de ubulina hacia el núcleo.
4.2-Es udio del e ec o de CYN sob e hepa oci os p ima ios
En es a esis doc o al ambién se plan eó como obje i o en ende el mecanismo de
acción de la oxina de agua dulce CYN, a in de apo a in o mación que ayude, en la
medida de lo posible, a en ende el e ec o p oducido po la oxina du an e los
episodios de in oxicación de di e sas poblaciones. En el abajo publicado en la e is a
“Chemichal Resea ch in Toxicology”, denominado “P o ein syn hesis inhibi ion and
oxida i e s ess induced by cylind ospe mopsin elici apop osis in p ima y a
hepa ocy es” e aluamos di e sos aspec os implicados en la mue e de los H.P. de a a
a causa de la CYN.
4.2.1-La CYN, a concen aciones nanomola es, es oxica e induce apop osis en
H.P.
A las concen aciones empleadas en nues o abajo la CYN demos ó se ci o óxica
pa a los H.P. con un pa ón dependien e de la dosis y del iempo, siendo la apop osis
el p incipal ipo de mue e celula inducido como lo indican los di e sos expe imen os
que lle amos a cabo. En es os expe imen os obse amos que la ac i idad de
caspasa-3 es aba inc emen ada, de mane a dosis dependien e, en las células a adas
con CYN. A su ez, expe imen os de ci ome ía de lujo po imagen p e ia inción de
yodu o de p opidio (I.P.) mos a on un aumen o de la población sub-G0 en las células
a adas con CYN espec o a los con oles. Du an e la apop osis se p oduce una
ca ac e ís ica agmen ación in e nucleosomal del ADN po acción de endonucleasas,
_____________________________________________________________ Discusión
71
es as enzimas gene an agmen os de amaño a iable y múl iplos de
ap oximadamen e 200 pa es de bases [190, 191], y pa e de es os agmen os son los
que se localizan en la población sub-G0 as el análisis ci omé ico. Pa a con i ma la
exis encia de apop osis en H.P. a ados con CYN se lle a on a cabo expe imen os de
inción con Anexina V conjugada con iso iociana o de luo esceína (FITC) que se
analiza on po de ección espec o luo imé ica y po mic oscopía con ocal. Es os
ensayos con i ma on la inducción de apop osis po CYN, pues odas las
concen aciones p obadas p o oca on un inc emen o del núme o de células ma cadas.
La Anexina V se une a la os a idilse ina, que habi ualmen e se encuen a en la ca a
ci osólica de la memb ana celula , pe o que as una señal apop ó ica, en los p ime os
es adios del p oceso, se ansloca y se si úa en la ca a ex e na de la memb ana
celula [192]. Po an o, como és e es un suceso emp ano en la apop osis, noso os
op amos po a a las células du an e 6 h. En es e caso se io como aumen aba la
p opo ción de células ma cadas, lo que pone de mani ies o que la CYN desencadena
ápidamen e apop osis sob e los H.P. Además se empleó mic oscopía con ocal pa a
e alua los esul ados del ma caje conjun o con I.P. y Anexina V. En es e expe imen o
imos un lige o inc emen o de I.P. en las células que habían sido expues as a la oxina
du an e 48 h, lo que es indica i o de la pé dida de in eg idad de la memb ana celula .
A in de es ablece si además de apop osis, la CYN p oducía pé dida de in eg idad
celula p opia de la nec osis, e aluamos la libe ación al medio de cul i o de lac a o
deshid ogenasa, que se p oduce debido a la pe meabilización celula que se obse a
du an e la mue e nec ó ica. Sólo se obse ó un inc emen o signi ica i o de es a
enzima as 72 h de a amien o. Tan o la inción nuclea con I.P. que se menciona
más a iba como la apa ición de la LDH en el medio de cul i o, después de la gos
iempos de incubación, nos indican que es posible la p esencia de cie o g ado de
nec osis, sin emba go, es más p obable una nec osis secunda ia a consecuencia de la
apop osis, cuya p esencia se ha obse ado en células en cul i o [29]. Majno e al
_____________________________________________________________ Discusión
72
de alla on ya en 1995 las ases y ca ac e ís icas de las células apop ó ica. Ellos
desc ibie on una ase a día de la apop osis en la que se obse an imágenes ípicas
de células nec ó icas, a i mando que es a segunda ase de apop osis debía se
llamada “nec osis apop ó ica” [190]. Un ejemplo de nec osis apop ó ica es el de los
cue pos hialinos de Councilman, asociados a cie as en e medades hepá icas [193].
O os g upos de in es igación han empleado la libe ación de LDH como mé odo pa a
es ablece la iabilidad celula de H.P. a ados con la CYN [145, 147]. Es os au o es
emplea on concen aciones de oxina muy supe io es a las nues as, lo que indica que
la CYN induce apop osis o nec osis en unción de las concen aciones empleadas. La
p esencia de apop osis a es as concen aciones no se puede desca a debido a que
los au o es mencionados no ealiza on expe imen os que pe mi iesen hace lo.
4.2.2-La CYN inhibe la sín esis de p o eína a concen aciones nanomola es en
H.P.
Se sabe que la CYN en concen aciones mic omola es inhibe la sín esis de p o eínas
de H.P. de a a y a ón [61, 147]. Pa a de e mina si es o ambién se obse aba a
concen aciones nanomola es (induc o as de apop osis), ealizamos expe imen os
pa a de e mina la sín esis p o eica a a és de inco po ación le leucina i iada
([3H-Leucina]). De o ma pa alela ealizamos expe imen os de iabilidad celula con
alama blue a in de es ablece si exis ía alguna elación en e el e ec o de la CYN
sob e la sín esis p o eica y la ci o oxicidad obse ada pa a es a molécula. La CYN
360 nM al cabo de 24 h eje ció una o al inhibición de la sín esis p o eica que se
man u o has a las 48 h. A és a inhibición le acompañó una disminución en la iabilidad
celula del 50% y 75% as 24 y 48 h espec i amen e. Sin emba go, cuando la sín esis
p o eica de los H.P. ue inhibida en el mismo g ado empleando cicloheximida, la
oxicidad obse ada después de 24 y 48 h de a amien o ue mucho meno ,
compa able a la eje cida po la concen ación de CYN de 180 nM, que no p odujo una
o al inhibición de la sín esis de p o eínas, como si hizo la cicloheximida. Es o nos
_____________________________________________________________ Discusión
73
indicó que la inhibición de la sín esis p o eica no es el único mecanismo implicado en
la mue e celula causada po es a ciano oxina. Sus en ando es a hipó esis se
encuen an los da os ob enidos de los expe imen os en los que se expuso a los H.P. a
CYN du an e 6 h pa a luego segui incubando las células sin oxina has a cumpli se las
24 o las 48 h. Es os demos a on que an e una inhibición de sín esis p o eica nula o
muy in e io a la obse ada en los expe imen os en los que la oxina se man u o en el
medio has a las 24 y 48 h, se obse ó una educción impo an e de la iabilidad
celula . Con es os expe imen os en los que se eno ó el medio de cul i o, e i ando la
oxina después de 6 h de exposición, comp obamos que la inhibición es i e e sible ya
que la asa de inhibición se man u o cons an e (o incluso disminuyó un poco mas)
desde las 6 h has a que se cumplie on las 24 y 48 h. Es o concue da con lo publicado
po o os in es igado es [147]. Si se compa an los esul ados ob enidos de los dos
g upos de expe imen os, se puede e que la CYN necesi a cie o iempo pa a eje ce
o almen e su pode inhibi o io sob e la sín esis de p o eínas, una ez que se
encuen a en con ac o con las células. En es e sen ido, ya se ha demos ado que la
ac i ación me abólica es á implicada en la oxicidad de la CYN [145, 194], y és a
pod ía se la azón po la cual las células a adas con oxina du an e 6 h y luego
incubadas con medio esco has a las 24 o 48 h se asocian con meno es asas de
iabilidad que las células que simplemen e pe manecie on 6 h en p esencia de CYN.
También es á elacionado con es e hecho, que siendo la inhibición de la sín esis
p o eica p oducida po CYN i e e sible, y aunque CYN 360 nM inhibió o almen e la
sín esis p o eica después de 24 h, no se obse ó lo mismo en las células que ue on
a adas con CYN 360 nM du an e 6 h y que luego ue on incubadas en medio esco
has a las 24 y 48 h. En es e úl imo caso, an e una inhibición de sín esis p o eica
i e e sible, se espe a ía que la sín esis p o eica a las 24 y 48 h se man u iese nula,
sin emba go como mues an los expe imen os ealizados, la sín esis a es os iempos
ue simila (o lige amen e meno ) a la obse ada en los cul i os con ol. Es o indica
_____________________________________________________________ Discusión
74
que la ac i ación me abólica p oducida po CYN puede se necesa ia pa a posibili a la
inhibición i e e sible de sín esis p o eica.
4.2.3-El es és oxida i o es á in oluc ado en la ci o oxicidad de CYN en H.P.
Son a ios los abajos publicados que a i man que as expone di e sos ipos
celula es y modelos animales a CYN se educen los ni eles y la sín esis de
glu a ión [146, 148, 195], según No is e al., in i o es a disminución no con ibuye
signi ica i amen e a la oxicidad aguda de CYN [148]. O os au o es (que ambién
obse a on me mas de al menos un 50% en los ni eles de glu a ión en odas las
condiciones es udiadas) pa a e alua el p obable inc emen o de es és oxida i o en la
célula emplea on malondialdehído como indicado del mismo, y no obse a on cambio
signi ica i o en los ni eles de es és oxida i o en H.P. de a ón a ados con CYN. Po
es o conside an imp obable que la p esencia de especies eac i as de oxígeno (ROS)
medie en la ci o oxicidad asociada a CYN. Sin emba go, ellos emplea on dosis muy
supe io es (CYN 5 µM) a las empleadas en nues o abajo, u ilizando incubaciones de
12 h, y en es as condiciones, las células su ie on mue e po nec osis. [145]. En
nues os expe imen os, cuando de e minamos la p esencia ROS en las células
a adas con CYN se obse ó un inc emen o de es e indicado de es és oxida i o. Las
ROS aumen a on de un modo dependien e de la concen ación de la oxina y del
iempo de exposición a la misma. De igual modo, se obse a la ac i ación de la
espues a an ioxidan e celula , enden e a con a es a es a si uación de es és
oxida i o a a és de la inducción del ac o de ansc ipción N F2, y la ep esión de la
ansc ipción de Keap1 (inhibido de N F2). Como consecuencia, se obse a un
aumen o en la concen ación in acelula de N F2. Pa a de e mina si el es és
oxida i o obse ado es aba in oluc ado en la mue e de los H.P. se u ilizó es e a ol,
una molécula conocida po sus p opiedades ci op o ec o as en e al es és oxida i o
en di e sos cul i os celula es incluyendo los H.P. [196, 197]. Es e compues o p o egió
_____________________________________________________________ Discusión
75
pa cialmen e a las células a adas con CYN. La ci op o ección obse ada ue dosis
dependien e, al menos du an e las p ime as 24 h. Sin emba go a las 48 h la ac i idad
ci op o ec o a ue meno . Nues o abajo indica que el es és oxida i o es á
in oluc ado en la ci o oxicidad inducida po la CYN sob e H.P. de a a. Es a di e encia
con los abajos ealizados po o os au o es que se mencionan más a iba pod ía se
debida a las di e en es concen aciones de oxina empleadas. Meno es
concen aciones de CYN du an e pe iodos de incubación más la gos inducen
apop osis, mien as que mayo es concen aciones pa ecen p oduci nec osis, en cuyo
caso el daño a la célula pod ía se de al magni ud que la mue e se p oduce en un
co o pe iodo de iempo sin da opción a que se obse e es és oxida i o, o que es e
es és oxida i o sea i ele an e con espec o a o os p ocesos lesi os.
CONCLUSIONES
__________________________________________________________ Conclusiones
77
5-CONCLUSIONES
5.1-Conclusiones del es udio del AO y la DTX-2 en células hepá icas:
A. El ácido okadaico y la dino isis oxina-2 son equipo en es en cul i os de
hepa oci os ans o mados de a a (células Clone 9), pe o el ácido okadaico es
más óxico que la dino isis oxina-2 en células de hepa oma humano (células
HepG2) y en H.P. de a a.
B. Los esul ados de iabilidad ob enidos en líneas celula es indican que es as no
son el mejo modelo p edic i o de oxicidad ela i a, al menos pa a las
moléculas e aluadas.
C. Los cul i os de hepa oci os p ima ios mos a on una sensibilidad en e el ácido
okadaico y la dino isis oxina-2 simila a la obse ada in i o después de
adminis ación in ape i oneal.
D. En células Clone 9 el ácido okadaico y la dino isis oxina-2 induje on
al e aciones en la seg egación de los c omosomas, gene ando husos mi ó icos
abe an es y consecuen emen e mi osis abe an es.
E. En células HepG2 y H.P. p oli e an es no se obse a on allos en la mi osis
pe o las oxinas inhibie on el ciclo celula en ase G0/G1.
F. Las dos oxinas es udiadas induje on la sob e exp esión de las ciclinas A, B, y
D en células Clone 9, mien as que en las células HepG2 egula on
posi i amen e la ciclina D y nega i amen e las ciclinas A2 y B1. Es as
al e aciones se ie on e lejadas en la inhibición del ciclo celula de las células
Clone 9 en ase G2 y de las células HepG2 en la ase G0/G1.
G. En H.P. p oli e an es, ambas oxinas inhibie on el ciclo celula en G0/G1
p e iniendo el inc emen o en la exp esión de p53 inducida po los mi ógenos, y
siendo el e ec o del ácido okadaico mayo que el de la Dino isis oxina-2.
__________________________________________________________ Conclusiones
78
H. En las células Clone 9 a adas se obse a como p53 mig a al núcleo, sin
emba go en HepG2 no se obse a di e encia en la sub localización celula de
p53 al compa a las células a adas espec o a los cul i os con ol.
5.2-Conclusiones del es udio CYN sob e H.P. de a a.
I. A concen aciones nanomola es, la CYN es óxica pa a H.P. de a a
induciendo:
i. Inhibición de la sín esis de p o eínas
ii. Inhibición del ciclo celula
iii. Aumen o en las especies eac i as del oxígeno
i . Ac i ación de la espues a an ioxidan e celula
. Apop osis
J. El es és oxida i o es á in oluc ado en la mue e celula inducida po
cilind ospe mopsina.
K. La inhibición de la sín esis de p o eínas en H.P. a ados con CYN a
concen aciones nanomola es es o al e i e e sible
L. La ac i ación me abólica de CYN puede se necesa ia pa a la inhibición de la
sín esis p o eica y la consecuen e ci o oxicidad, aunque es a hipó esis equie e
con i mación expe imen al.
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