Evaluación del modo de acción de toxinas de dinoflagelados y cianobacterias en células hepáticas

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE VETERINARIA DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA EVALUACIÓN DEL MODO DE ACCIÓN DE TOXINAS DE DINOFLAGELADOS Y CIANOBACTERIAS EN CÉLULAS HEPÁTICAS Tesis doctoral Henar López Alonso Lugo, 2013 Luis M. Botana López, Catedrático de Farmacología de la Universidad de Santiago de Compostela, INFORMA: Que la tesis doctoral titulada “Evaluación del modo de acción de toxinas de dinoflagelados y cianobacterias en células hepáticas”, recogida en la presente memoria, de la que es autora la Licenciada en Veterinaria por la Universidad de Santiago de Compostela Dña. Henar López Alonso, ha sido realizada bajo su codirección en el departamento de Farmacología de la Facultad de Veterinaria y cumple las condiciones exigidas para que su autora pueda optar al grado de Doctora por la Universidad de Santiago de Compostela, otorgando su aprobación para la lectura y defensa de la misma. Para que así conste a los efectos oportunos, firma la presente en Lugo, a 24 de Septiembre de 2013. Luis M. Botana López Henar López Alonso Doctor en Farmacia Codirector de tesis DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA Facultad de Veterinaria Campus Universitario 27002, Lugo (Spain) Tel.: + 34 982822233 Fax: + 34 982822233 Juan Andrés Rubiolo, Doctor contratado por el departamento de Farmacología de la universidad de Santiago de Compostela, INFORMA: Que la tesis doctoral titulada “Evaluación del modo de acción de toxinas de dinoflagelados y cianobacterias en células hepáticas”, recogida en la presente memoria, de la que es autora la Licenciada en Veterinaria por la Universidad de Santiago de Compostela Dña. Henar López Alonso, ha sido realizada bajo su codirección en el departamento de Farmacología de la Facultad de Veterinaria y cumple las condiciones exigidas para que su autora pueda optar al grado de Doctora por la Universidad de Santiago de Compostela, otorgando su aprobación para la lectura y defensa de la misma. Para que así conste a los efectos oportunos, firma la presente en Lugo, a 24 de Septiembre de 2013. Juan Andrés Rubiolo Henar López Alonso Doctor en Ciencias e Ingeniería de los Alimentos Codirector de tesis DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGÍA Facultad de Veterinaria Campus Universitario 27002, Lugo (Spain) Tel.: + 34 982822233 Fax: + 34 982822233 AGRADECIMIENTOS A Luis M. Botana por haberme dado la oportunidad de trabajar en este laboratorio, por sus esfuerzos para que este cuente con la financiación suficiente, por los valiosos consejos que han hecho más fácil el desarrollo de esta tesis, y por hacer de este departamento, diverso y numeroso, un grupo al que es fácil unirse en el trabajo y la convivencia. A Juan, por estar siempre dispuesto a explicar, por haberme enseñado, ayudado y animado en algunos momentos difíciles. Por haberme ofrecido siempre una actitud amable y educada, y por haberme tratado como a un compañero. En definitiva, por ser un gran investigador y una mejor persona. A toda la gente que trabaja en el laboratorio y que directa o indirectamente ha participado en esta tesis, por su ayuda en estos años. A mis dos compañeros del antiguo “comedor”, por los buenos momentos, las charlas agradables, las risas, y por hacer que uno tenga más ganas de venir a trabajar cada mañana. A mis compañeros de pasillo, a mis “compis” de despacho, y en especial a la encargada de la intendencia, por hacer de éste un ambiente agradable donde estudiar, escribir, comentar, e incluso merendar. Y mil gracias a todos los que me quieren y que por supuesto adoro, en especial a los “míos” (grandes y pequeños), por su eterno e incondicional apoyo. ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS ADN: Ácido desoxirribonucleico AO: Ácido okadaico ASP: Envenenamiento por toxinas amnésicas AZP: Azaspirácidos CA: Ciclina A CB: Ciclina B CD: Ciclina D CDKs: Quinasa dependientes de ciclinas CE: Ciclina E CFP: Envenenamiento por ciguatoxina CYN: Cilindrospermopsina CYP450: Citocromo P450 Da: Dalton DL50: Dosis letal 50 DSP: Envenenamiento por toxinas diarréicas DTX-1, DTX-2, DTX-3: Dinofisistoxina -1, -2, -3 DTXs: Dinofisistoxinas EGF: Factor de crecimiento epitelial eq: equivalentes EU-NRL: Laboratorios nacionales de referencia de la unión europea FAO: Organización de la naciones unidas para la agricultura y la alimentación FITC: Isotiocianato de fluoresceína h: hora HAB: Floraciones algales nocivas HGF: Factor de crecimiento hepático H.P.: Hepatocitos Primarios IC50: Concentración inhibitoria 50 IOC: Comisión Oceanográfica Intergubernamental de la UNESCO I.P.: Yoduro de propidio kg: Kilogramo LDH: Lactato deshidrogenasa MC: Microcistina mg: Miligramo ml: Mililitro MTT: Metiltiazoltetrazolio ng: Nanogramo nM: Nanomolar NSP: Envenenamiento por toxinas neurotóxicas OMS: Organización mundial de la salud PC: Punto de control PP1, PP2, PP3: Fosfatasas de serina-treonina 1, 2A y 3 PR: Punto de restricción PSP: Envenenamiento por toxinas paralizantes PTXs: Palitoxinas ROS: Especies reactivas de oxígeno Ub: Ubiquitina UE-NLRs: laboratorios de referencia de la UE de biotoxinas marinas WHO: Organización mundial de la salud g: Microgramo ÍNDICE ___________________________________________________________ Introducción 6 Resumiendo, las consecuencias negativas derivadas de estas floraciones nocivas son múltiples: el posible riesgo que supone para la seguridad alimentaria es posiblemente la más trascendente, además, los posibles perjuicios económicos pueden ser muy serios y afectar a numerosos sectores entre los que cabe destacar la actividad acuícola y pesquera, el turismo y otros como son las desalinizadoras. El sector acuícola tiene que afrontar pérdidas debidas al incremento de las tasas de mortalidad, y a peores índices de conversión entre otras. Así mismo, cuando la monitorización de las aguas evidencia un mayor nivel de especies fitoplanctónicas potencialmente peligrosas, suele procederse por parte de las autoridades competentes al “cierre” de las zonas de captura, y por tanto, el sector se ve obligado a detener la actividad extractiva y en ocasiones también la comercialización de especies procedentes de la acuicultura, con los consecuentes perjuicios de distinta índole que esto supone. A mayores, algunas cianobacterias liberan sustancias volátiles que resultan desagradables e incluso irritantes, que sumado al aspecto poco atractivo de las aguas con grandes cantidades de microalgas o cianobacterias, hace que las actividades turísticas y de recreo se vean también damnificadas [13]. Por lo tanto, la presencia de ficotoxinas resulta un claro problema de salud pública, además de un problema económico y ecológico. Como consecuencia de todo esto, en las últimas décadas se ha visto incrementado el interés de la comunidad científica en relación a este tema, así como la preocupación de diversos sectores profesionales implicados, y de la sociedad en general, por las posibles consecuencias que este fenómeno pudiera tener, ya que cada vez existe un mayor consumo y una mayor distribución de productos alimenticios de origen marino [23]. 1.1-CLASIFICACIÓN DE LAS FICOTOXINAS Las intoxicaciones alimentarias causadas por toxinas marinas son diagnosticadas en base a la sintomatología clínica (no existe una prueba clínica para determinar la ___________________________________________________________ Introducción 7 etiología de la intoxicación), de ahí que algunos autores clasifiquen las toxinas en base a la sintomatología clínica que el paciente intoxicado manifiesta [23]. En otros supuestos, y debido a la aparición reciente de nuevos metabolitos tóxicos, las toxinas no se pueden encajar en ninguno de estos grupos, por lo que la clasificación ha ido modificándose con el paso del tiempo. Basándose en la sintomatología clínica, se sabe que existen toxinas neurotóxicas que causan el síndrome conocido como NSP (Neurotoxic Shellfish Poisoning), paralizantes que causan el PSP (Paralytic Shellfish Poisoning), diarreicas responsables del DSP (Diarrhetic Shellfish Poisoning), amnésicas causantes del síndrome ASP (Amnesic Shellfish Poisoning), la intoxicación por azaspirácidos (AZP), y la intoxicación por palitoxinas (PTXs). Por otro lado se conoce la intoxicación causada por el pez Globo, por la ciguatera (CFP o Ciguatera Fish Poisoning), y por último las intoxicaciones producidas por cianobacterias [28]. Las tablas 1 y 2 resumen las principales toxinas conocidas producidas por dinoflagelados, diatomeas y cianobacterias, así como sus principales organismos productores, los órganos y tejidos diana, y los síntomas más habituales que manifiesta un ser humano u otro mamífero tras resultar intoxicado. Algunos autores incluyen, aunque como un grupo aparte, la intoxicación por escombroides. Es la intoxicación más frecuente producida por el consumo de productos del mar, y su origen radica en el consumo de pescado con altos niveles de histamina. La causa de que el pescado contenga niveles de histamina potencialmente peligrosos, se debe a la deficiencia en los métodos de conservación del pescado tras su captura [23]. Tabla 1: Clasificación de las toxinas marinas GRUPOS TOXINAS ORGANISMOS PRODUCTORES1 DIANA SÍNTOMAS REFERENCIAS TOXINAS MARINAS Paralizantes (PSP) Saxitoxinas (STXs), Gonyautoxinas (GTXs), N-sulfocarbamoil-11hidroxisulfatotoxinas (Cs) Alexandrium sp. Gymnodinium sp. Pyrodinium sp Sinapsis nerviosa (bloquea canal de calcio) Parestesia, dolor de cabeza, ataxia y dismetría, vómitos, compromiso respiratorio y muerte. [23, 28-33] Diarreicas (DSP) Ácido okadaico (AO) Dinofisistoxinas (DTXs) Prorocentrum sp (P. Lima, P. Arenarium…) Dinophysis sp (D Acuta…) Phalacroma rotundatum Intestino, hígado…(inhiben las PP) Severos síntomas gastrointestinales: diarrea, náuseas, vómitos, retortijones… [23, 28, 29, 3338] Pectenotoxina Pectenotoxina (PTX) Dinophysis sp Prorocentrum sp Hígado Signos de fallo hepático en ratón [23, 28, 29, 33, 34, 37, 39] Yesotoxina Yesotoxina (YTX) Lingulodinium polyedrum, Gonyaulax spinifera, Protoceratium reticulatum Miocardio… Descoordinación motora en ratón [23, 28, 29, 33, 34, 40] Amnésicas (ASP) Ácido Domóico (DA) Chondria armata. Pseudo-nitzschia sp Cerebro, retina, miocardio (Activa receptores de kainato) Náuseas y vómitos, dolor de cabeza, diarrea, cambios de estado mental, disfunción del sistema nervioso autónomo, amnesia, convulsiones, coma y muerte [23, 28, 29, 33, 41] Neurotóxicas (NSP) Ciguatotoxinas, Maitotoxina, Brevetoxina, Iminas cíclicas Gambierdiscus toxicus Gymnodinium breve Karenia selliformis Gambierdiscus toxicus Sinapsis nerviosa Parestesias, signos gastrointestinales, espasmos, diplopía, alteraciones de la marcha, alteración de la termo-percepción, dolor músculo-esquelético, y dificultad respiratoria [23, 28, 29, 33, 42-46] Palitoxina Palitoxina (PLTX) Ostreopsis spp Tejido musculo-esquelético, miocardio Diarrea, fiebre alta, tos, rabdomiasis, dificultad respiratoria, insuficiencia cardíaca… [33, 47-50] Azaspirácidos Azaspirácidos (AZAs) Azadinium spinosum (Protoperidinum crassipes) Hígado páncreas, miocardio… Nauseas, vómitos, diarrea severa, retortijones. Reacción inflamatoria por contacto y por inhalación. Dificultad respiratoria [23, 28, 29, 33, 51-53] Tetrodotoxina Tetrodotoxina (TTX) Vibrio sp Sinapsis nerviosa y tejido musculoesquelético Entumecimiento de cara y extremidades, decaimiento, apatía, parálisis ascendente, fallo respiratorio y circulatorio y muerte [23, 28, 29, 33, 54-56] 1: Ejemplos de los principales organismos productores de las toxinas Tabla 2: Clasificación de las toxinas de agua dulce GRUPOS TOXINAS ORGANISMOS PRODUCTORES1 DIANA SÍNTOMAS REFERENCIAS TOXINAS DE AGUA DULCE Hepatotoxinas Microcistinas (LR, LA, YR, RR). Microcystis sp, Anabaena sp, Nodularia sp, Nostoc sp, Oscillatoria sp Hígado Gastroenteritis, diarrea, fallo hepático y muerte. Carcinogénesis [57-59] Nodularina Nodularia spumigena Hígado Síntomas asociados a hepatotoxicidad. Carcinogénesis [57, 58, 60] Cilindrospermopsina (CYN) (citotoxina) Cylindrospermopsis raciborskii, Aphanizomenon ovalisporum, Aphanizomenon flos-aquae, Umezakia natans, Rhaphdiopsis curvata Hígado, riñón, timo, corazón... Hepatoenteritis, fallo renal. Carcinogénesis. [57, 58, 61] Neurotoxinas Saxitoxina Anabaena circinalis, Aphanizomenon sp. Cylindrospermopsis raciborskii Sinapsis nerviosa Parestesia, dolor de cabeza, ataxia y dismetría, vómitos, compromiso respiratorio y muerte [23, 57, 58] Anatoxina-a Anatoxina-a (s) Anabaena sp Oscillatoria sp Sinapsis nerviosa Pérdida de coordinación, fasciculaciones musculares, convulsiones, disnea, apnea y muerte [58, 62, 63] Dermotoxinas Aplisiatoxina Ligbiatoxina L. majuscula (M. producens) Piel Irritación severa. Carcinogénesis. [58, 63, 64] Irritantes Lipopolisacáridos Cualquier tejido expuesto Eritema en distintos grados, disneas de base alérgica, irritación gástrica… [58, 65] 1: Ejemplos de los principales organismos productores de las toxinas ___________________________________________________________ Introducción 10 Existen, por tanto, varios criterios posibles a la hora de encuadrar a estas ficotoxinas en una clasificación. Refiriéndose a la ordenación que atiende a los órganos afectados, podemos decir que uno de los grupos más relevantes es el de las hepatotoxinas. Éstas, en lo referente a su presencia en las aguas y a su repercusión para la salud humana son las más frecuentes. Esto se debe, en parte, a la continua mejora de la metodología para su análisis, y a la estandarización y extensión de los controles para la detección de las mismas [19]. 1.2-HEPATOTOXINAS Las hepatotoxinas son un problema para la salud pública. Algunas, como el ácido okadaico (AO) y las dinofisistoxinas (DTXs) (que aunque siendo toxinas diarreicas, posteriormente se demostró que también afectan al hígado), pueden ser ingeridas a través del consumo de alimentos del mar contaminados [13]. Otras ficotoxinas de agua dulce, como las microcistinas (MC), la nodularina o la cilindrospermopsina (CYN), son principalmente ingeridas a través del agua de consumo, aunque además existen otras vías de entrada que son menos frecuentes, como la inhalación o el contacto con las mucosas [66, 67]. 1.2.1-HEPATOTOXINAS DE ORIGEN MARINO El ácido okadaico y las dinofisistoxinas-1, -2, y -3 (DTX-1, DTX-2, DTX-3) son las principales toxinas implicadas en el síndrome conocido como “DSP” (diarrhetic shellfish poisoning) o envenenamiento por toxinas diarréicas [68]. Este síndrome fue descrito por primera vez en Japón a finales de los años 70 del siglo pasado [69], y desde entonces ha mostrado una incidencia creciente [70]. El AO se distribuye ampliamente a lo largo del planeta [13], y es la toxina DSP predominante en España [71] y Europa, si bien se han detectado también grandes cantidades de DTX-2 en las costas españolas, portuguesas e irlandesas [72-76]. Desde principios del siglo 21 ___________________________________________________________ Introducción 11 parece estar también presente en mejillones de las costas del sur de Noruega, asociada al AO [77]. Este grupo de ficotoxinas marinas se caracterizan por ser todos ellos compuestos policétidos que contienen un anillo furano o pirano, y un grupo funcional alfa-hidroxi carboxílico. Estas moléculas sólo se distinguen por la posición de los grupos metilo [39]. R1 R2 R3 R4 P.M. AO CH3 H H H 804.5 DTX-1 CH3 CH3 H H 818.5 DTX-2 H H CH3 H 804.5 DTX-3 CH3 CH3 H Acilo Figura 1: Estructura del AO y DTX-1, -2, y -3 [78]. El ácido okadaico le debe su nombre a la esponja de la que se aisló por primera vez a principio de los años 80, Halichondria okadai [79]. La DTX-2, se aisló por primera vez en Irlanda, en 1992, a partir de extracto de mejillón [80]. A pesar de esto, se sabe que son las microalgas de los géneros Dinophysis spp. y Prorocentrum spp. las productoras de estos compuestos lipofílicos y termoestables. Son muchas las especies productoras de toxinas DSP, entre las que cabe citar Dinophysis acuminata, Dinophysis acuta, Dinophysis fortii, Prorocentrum lima y Prorocentrum concavum [8183]. La producción de estas toxinas varía en función de la especie y de los morfotipos regionales y estacionales de las microalgas [13]. Las moléculas toxicas se acumulan en la glándula digestiva y en el tejido graso de algunos bivalvos, (especialmente los mejillones, pero también vieiras, almejas y ostras) que al alimentarse por filtración del fitoplancton contaminado, van acumulando grandes cantidades de estas toxinas. Además, los peces que se alimenten con estos ___________________________________________________________ Introducción 12 filtradores contaminados pueden a su vez acumular estas moléculas, siendo el hígado y las gónadas los tejidos del pez que albergan mayor cantidad de toxina [84]. El tiempo que un bivalvo necesita estar en un ambiente contaminado para resultar tóxico es muy variable y depende de diversos factores como son: la toxicidad de la especie de dinoflagelado que esté presente en el agua, la abundancia relativa de otras especies no tóxicas [70] y la ausencia de silicatos en el agua (que favorece el crecimiento de especies de Dinoflagelados) [85]. El tiempo necesario para que los bivalvos eliminen las toxinas acumuladas es también variable, a pesar de esto, algunos estudios apuntan a que en general parecen presentar un patrón bifásico que comprende una fase de eliminación rápida de unos pocos días de duración y otra fase de pérdida más gradual durante las semanas siguientes [86]. Sin embargo, otros estudios no han podido establecer con certeza esta diferenciación de fases [87].Por tanto, el patrón de acumulación y depuración de toxina es particular para cada tipo de bivalvo, y parece ser independiente de la toxina de que se trate. Cuando el ser humano ingiere estos alimentos contaminados con toxinas DSPs, se producen síntomas gastrointestinales de distinta intensidad, aunque generalmente severos, y relacionados directamente con la cantidad de toxina ingerida. Los síntomas aparecen poco tiempo después de la ingesta, entre los 30 minutos y las dos horas posteriores, habitualmente son autolimitantes, y en ningún caso letales, observándose una mejoría clínica del paciente intoxicado en 3-4 días [70, 88]. Respecto al mecanismo de acción de estos compuestos, se ha demostrado que las toxinas DSP son inhibidores de las fosfatasas de serina-treonina 1, 2A y 3 (PP1, PP2A y PP3) [13, 89, 90]. Las fosfatasas son un grupo de proteínas estrechamente relacionadas con diversos procesos metabólicos de la célula. Esta inhibición puede explicar la temprana inflamación en la mucosa intestinal y la aparición repentina de la diarrea como síntoma predominante de estas intoxicaciones, pues la inhibición de las fosfatasas por parte del AO provoca una hiperfosforilación de las proteínas que ___________________________________________________________ Introducción 13 controlan la liberación de sodio y de las proteínas citoesqueléticas o de unión, produciendo una liberación descontrolada de solutos y consecuentemente una pérdida pasiva de fluidos hacia el lumen intestinal [13, 83, 84]. Estudios in vivo realizados en ratón, revelan que tras la administración vía oral de AO se producen daños en hígado, intestino delgado y en el estómago no glandular [9193]. Además, como muestran los resultados expuestos durante el encuentro del año 2001 de los laboratorios de referencia de la UE de Biotoxinas marinas (UE-NLRs), el AO se absorbe con facilidad a través del epitelio gastrointestinal, pues trascurridos 5 minutos desde la administración vía oral, la toxina estaba presente en pulmón, hígado, corazón, riñón e intestino delgado y grueso. Transcurridas dos semanas el AO seguía presente en vasos sanguíneos e hígado, y hasta cuatro semanas más tarde en intestino [94, 95]. También se ha publicado que el AO atraviesa la barrera hematoplacentaria de ratonas preñadas [96]. Ensayos realizados con ratones mostraron que la dosis empleada de AO y otras toxinas, y posiblemente la vía de administración de las mismas, determina los órganos que se ven afectados y la severidad de las lesiones observadas [93]. Yasumoto et al en 1978, observaron como las DSPs eran mucho más letales cuando se administraban vía oral que vía intraperitoneal [69], sin embargo publicaciones posteriores han demostrado que la dosis letal de estas toxinas administradas por vía oral es de 3 a 6 veces superior a la dosis letal cuando se administra vía parenteral, y así lo recoge un informe del encuentro FAO/WHO/IOC del 2006 [97]. Esta discrepancia puede tener explicación en el hecho de que Yasumoto et al en 1978 emplearon extractos de mejillón contaminado, y estos podrían contener otras moléculas tóxicas no contempladas en el artículo. Aunque al AO se le considera generalmente una enterotoxina [98, 99], tras una administración intravenosa en la rata, el AO resulta ser una potente hepatotoxina pero con signos gastrointestinales indetectables [100]. En 1996, Matías et al. realizaron un estudio en el que inyectaron una dosis única de AO marcado radioactivamente vía ___________________________________________________________ Introducción 14 intramuscular a ratones, este trabajo indica que en el patrón de excreción del AO están implicadas la secreción biliar y la circulación entero-hepática [101]. Además de los mencionados signos gastroentéricos asociados a la intoxicación por toxinas DSP, también son conocidos otros efectos nocivos. Franchinia et al. publicaron un trabajo en el que observaban como bajas dosis de esta toxina administrada a ratones vía oral ejercen inmunosupresión [102]. En otros estudios también se constató una marcada inmunosupresión reversible en monocitos humanos de sangre periférica cuando se trataron estas células en condiciones in vitro con dosis bajas de AO [70]. Aunque el AO (activado metabólicamente o no) sobre células de Salmonella typhimurium no parece tener capacidad mutagénica [103], en células eucariotas se ha demostrado que el AO tiene una potente capacidad mutagénica. Sobre células de pulmón de hámster se evaluó la mutagénesis del AO no activado metabólicamente, y los autores del estudio sugirieron que esta propiedad no se debe a la formación de aductos, sino a que probablemente el estado de fosforilación de las proteínas reparadoras de ADN se altera, y esto es lo que favorece la mutagénesis [70]. Otros autores afirman que la formación de aductos es posible, y está condicionada por las dosis de AO empleadas para el tratamiento de diversas líneas celulares (BHK21, C13 y HESV) [104]. Por otro lado son varios los estudios que han demostrado que algunas DTXs como el AO y la DTX-1 promueven tumores en diversos órganos como la piel, el hígado y el estómago de ratas y ratones [105-107]. Según los primeros estudios realizados por Fujiki, H. et al, al aumentar la cantidad de proteínas fosforiladas en los sistemas celulares, se promueven los tumores, lo que resalta la capacidad de las proteínas fosfatasas como supresores tumorales [107, 108]. Sin embargo, posteriores artículos de este mismo grupo han demostrado que la inhibición de las proteínas fosfatasas no es suficiente para que se presente un mayor desarrollo de tumores [109]. En este sentido, una reciente revisión afirma que posiblemente la irritación producida por estas toxinas sea esencial en el desarrollo de tumores asociado al AO, ___________________________________________________________ Introducción 15 no así la inhibición de las proteínas fosfatasas, y se llega a la conclusión de que es necesaria una re-evaluación del mecanismo de toxicidad de estas toxinas, al menos en lo concerniente a su capacidad mutagénica [110]. En referencia a la genotoxicidad y la capacidad de promover tumores de la DTX-2, no hay datos publicados. En el ser humano el efecto genotóxico a largo plazo del AO y las DTXs se desconocen [25]. Tanto in vitro como in vivo, la DTX-2 ha mostrado ser una toxina menos potente que el AO. Por vía intraperitoneal en ratón la DL50 (cantidad de una sustancia necesaria para matar a la mitad de la población sometida a estudio [111]) de la DTX-2 fue de ≈ 337,5 µg/kg, y para el AO de ≈ 212,5 µg/kg, por tanto, el AO resulta ser un 40% más tóxico que la DTX-2. Así mismo, en la capacidad de inhibición de las fosfatasas se ha constatado que el AO es casi dos veces más potente que la DTX-2, lo que concuerda perfectamente con la idea de que es este el principal mecanismo citotóxico de estas moléculas [77]. La diferencia de potencia entre el AO y la DTX-2 es mayor en cultivos primarios de neuronas cerebelares, observándose que el AO es unas 4 veces más tóxico que la DTX-2. Tras incubarse estas células durante 24 horas con la toxina, se determinó que la IC50 (concentración de una molécula necesaria para inhibir el 50% de una actividad biológica [111]) de DTX-2 es ≈ 8 nM, mientras que para el AO es de ≈ 2 nM [112]. Sería interesante contar con resultados de ensayos in vivo que permitiesen determinar una DL50 comparada entre AO y DTX-2 administradas por vía oral, ya que esta es la vía de contaminación más probable para el ser humano. Esto no se ha realizado hasta el momento, posiblemente debido a la escasez de DTX-2 disponible, lo que hace que sólo se hayan publicado datos a este respecto para el AO [77]. La literatura referente a la toxicidad aguda del AO administrado vía oral aporta datos variables en cuanto a la dosis letal para ratones, que va desde los 400 a los 2000 mg/kg [91, 93, 99]. Sustentado por estos datos, la FAO estableció en 2006 como dosis aguda de referencia 0,33 µg OA eq/kg [113]. En este sentido la legislación ___________________________________________________________ Introducción 22 Figura 3: Resumen gráfico de los efectos conocidos de la CYN. 1.3-HÍGADO COMO MODELO DE ESTUDIO En los mamíferos, el hígado, es un órgano muy irrigado (a él le llega el 24% del gasto cardíaco) que tiene diversas funciones como la síntesis de ácidos biliares que participan en la digestión de los alimentos, el metabolismo de glúcidos y lípidos, la reserva de ciertos elementos, vitaminas (como la B12) y glucógeno, y la síntesis de factores de coagulación (como el fibrinógeno y la protrombina). Pero una de sus funciones más destacadas es la detoxificación de la sangre que entra en el parénquima hepático a través de la vena porta. Esta sangre que se recoge del tracto intestinal y el bazo, confluye en el hígado y pasa a través del mismo para que los nutrientes y otras moléculas, como los principios activos de los fármacos y las toxinas, sean metabolizadas [152]. Del proceso de metabolización de las toxinas pueden resultar moléculas inocuas, o moléculas con una mayor capacidad nociva que la que ___________________________________________________________ Introducción 23 tenían antes de ser metabolizadas [153]. Sabiendo que al hígado llega gran parte del volumen sanguíneo circulante, y que en él se metaboliza casi toda sustancia que vaya a ser excretada del organismo, no debe extrañar que muchas toxinas tengan un efecto nocivo sobre este órgano, aún en el supuesto de que éste no fuese su diana principal. Por eso el hígado es un órgano a tener en cuenta en el estudio de las toxinas. Para el estudio del efecto de sustancias sobre la función hepática, el empleo de modelos de experimentación in vitro ofrece ciertas ventajas frente al empleo de modelos animales. Las necesarias consideraciones éticas en el ámbito de la investigación empujan a reducir al máximo el número de animales empleados con fines científicos y experimentales. En este sentido, con el empleo de cultivos celulares, como método alternativo, se satisface la regla de las tres erres (reemplazo, reducción y refinamiento). Ésta “regla” se contempla ya desde los años 50 por la comunidad científica, y la normativa europea y nacional (relativa a la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos) exige su cumplimiento. En este contexto, se escogió como modelo de estudio dos líneas celulares de origen hepático: una línea de hepatocarcinoma humano (HEPG2) y otra de hepatocitos inmortalizados de rata (Clone 9). Tras comprobar en los primeros estudios, la variabilidad en los efectos que el AO y la DTX-2 tienen en función de la línea celular, y considerando lo que otros autores habían visto previamente respecto a la mayor sensibilidad de los hepatocitos primarios frente a algunas toxinas, nos decantamos por el empleo de H.P. de rata en los experimentos consiguientes. Estos cultivos primarios mantienen unas características más próximas a los hepatocitos en su ambiente natural que las líneas celulares, por lo tanto los estudios llevados a cabo con cultivos primarios, son más relevantes, aunque también más complejos. Aportan datos acerca del efecto que pueden tener las toxinas, que generalmente son más reproducibles en el animal vivo, y por tanto son más útiles a la hora de determinar el potencial daño que estas puedan inducir. OBJETIVOS _____________________________________________________________ Objetivos 25 2-OBJETIVOS La creciente presencia de diversas ficotoxinas, tanto en aguas marinas como en los recursos hídricos, ha despertado gran interés en la comunidad científica por conocer cómo estas moléculas ejercen su toxicidad sobre los seres vivos. El objetivo de la presente tesis doctoral es esclarecer, en la medida de lo posible, la citotoxicidad y los mecanismos de acción de las ficotoxinas de agua marina AO y DTX-2, y de agua dulce CYN, sobre dos líneas celulares hepáticas (HepG2 y Clone 9), y sobre H.P. de rata. En este sentido, podemos clasificar nuestros objetivos en dos partes:  Analizar el efecto comparado del ácido okadaico y de la dinofisistoxina-2 en las líneas hepáticas Clone 9 y HepG2, y en H.P. de rata determinando: o La toxicidad relativa en los distintos tipos celulares. o La diferencia entre los valores de toxicidad in vitro, con los que se conocen in vivo. o Tipo de muerte inducida por ambas toxinas en los distintos tipos celulares. o Alteraciones en la proliferación celular de las líneas hepáticas en estudio, y de hepatocitos primarios expuestos a mitógenos.  Analizar el efecto de la CYN, a concentraciones sub-micromolares, en cultivos de H.P. de rata determinando: o La toxicidad y el tipo de muerte celular inducida por la toxina . o La posible participación del estrés oxidativo en la inducción de muerte celular. _____________________________________________________________ Objetivos 26 o El efecto en el metabolismo antioxidante celular. o El efecto sobre la síntesis de proteínas. o La relación entre la inhibición de la síntesis de proteínas y la inducción de muerte celular. PUBLICACIONES __________________________________________________________ Publicaciones 28 3-PUBLICACIONES En este apartado se presentan los resultados obtenidos durante el transcurso de esta tesis doctoral. Estos resultados se incluyen en los tres artículos adjuntos, publicados en revistas internacionales. En los dos primeros artículos se muestran los datos obtenidos tras la evaluación comparada de AO y DTX-2 sobre células hepáticas (HepG2, Clone 9 y H.P. de rata), y el tercer artículo recoge los resultados derivados de los ensayos realizados con CYN sobre H.P. de rata. En cada uno de los artículos los resultados se acompañan de la metodología científica empleada y de las conclusiones obtenidas en cada caso. 3.1-Estudio comparado de AO y DTX-2 sobre células hepáticas. 3.1.1-Okadaic acid and dinophysis toxin 2 have differential toxicological effects in hepatic cell lines inducing cell cycle arrest, at G0/G1 or G2/M with aberrant mitosis depending on the cell line. RESUMEN: El ácido okadaico es una de las toxinas implicadas en la Intoxicación diarreica por mariscos que afecta al ser humano, y cuya aparición se asocia al consumo de bivalvos contaminados. Las principales toxinas responsables de esta Intoxicación son el ácido okadaico (AO), la dinofisistoxina-1, -2, y -3 (DTX-1, -2 y -3). Por un lado, tras inyección intraperitoneal en ratón, la DTX-2 es aproximadamente un 40% menos tóxica que el AO. Por otro lado, la citotoxicidad y la genotoxicidad del AO es muy variable en función de las líneas celulares en las que se evalúe, por lo que resultados similares podrían esperarse de la DTX-2. Para determinar si efectivamente este supuesto es cierto, nosotros estudiamos el efecto del AO y la DTX-2 en dos líneas celulares de origen hepático: HepG2 y Clone 9. Es este estudio se evaluó la citotoxicidad, y el efecto sobre el ciclo celular y su regulación. Los resultados obtenidos indican que en cultivos de Clone 9 tanto el AO como la DTX-2 son equipotentes, mientras que sobre células __________________________________________________________ Publicaciones 29 de HepG2 el AO es más potente que la DTX-2. Ambas toxinas tienen efectos contrarios en lo que respecta al ciclo celular, ya que detienen el ciclo celular de Clone 9 en G2/M e inducen mitosis aberrantes, mientras que en HepG2 el ciclo celular se detiene en G0/G1. El estudio del efecto de estas toxinas sobre la distribución subcelular de p53 reveló su presencia en el núcleo de ambos tipos celulares. La expresión génica de ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas fue diferente para las dos líneas celulares. Las toxinas inducen un incremento en la expresión de ciclinas A, B, y D en las células Clone 9 mientras que en HepG2 las ciclinas A y B decrecen, así como también decrece la expresión de la quinasa 1 dependiente de ciclina. __________________________________________________________ Publicaciones 30 __________________________________________________________ Publicaciones 31 __________________________________________________________ Publicaciones 38 __________________________________________________________ Publicaciones 39 __________________________________________________________ Publicaciones 40 3.1.2Comparative study of toxicological and cell cycle effects of okadaic acid and dinophysistoxin-2 in primary rat hepatocytes. RESUMEN: En este trabajo nos planteamos como objetivo de este estudio determinar la toxicidad relativa y los efectos que tienen sobre el ciclo celular de hepatocitos primarios de rata en cultivo el ácido okadaico y dinofisistoxina-2. Para evaluar la citotoxicidad se empleó el ensayo colorimétrico basado en la reducción metabólica del MTT (metiltiazoltetrazolio), el análisis de la actividad de la caspasa-3, y la liberación de LDH (lactato deshidrogenasa) al medio de cultivo. El ciclo celular se analizó empleando citometría de flujo con análisis de imagen, y el efecto de las toxinas sobre la proliferación celular se evaluó a través de PCR cuantitativa y microscopía confocal. A partir de los ensayos realizados observamos que para los H.P. en cultivo la DTX-2 es menos tóxica que el AO con una diferencia de potencia similar a la observada in vivo en ratones tras inyección intraperitoneal. A su vez, ambas toxinas inducen apoptosis con un incremento significativo de la actividad de la caspasa-3 en los cultivos tratados. Estas toxinas inhibieron el ciclo celular de los hepatocitos en G1, modificando las células diploides y las diploides binucleadas. En hepatocitos proliferantes expuestos a las toxinas se detectó como la expresión del gen y los niveles de proteína p53 decrecieron. Por otro lado, el estudio del citoesqueleto de tubulina de los H.P. expuestos a DTX-2 y AO puso de manifiesto que esta proteína se localizaba en el núcleo, mientras que en el citoplasma mantenía un patrón granulado. Los datos obtenidos de este trabajo demuestran la diferencia de potencia que tienen el AO y la DTX-2 sobre los H.P. de rata en cultivo, y la diferencia de potencia que tienen es igual a la observada in vivo tras inyección intraperitoneal en ratones. Ambas toxinas detuvieron el ciclo celular de los H.P. en G1, incluso de células binucleadas diploides. En esta inhibición del ciclo celular podría estar involucrado p53 así como la tubulina. __________________________________________________________ Publicaciones 41 __________________________________________________________ Publicaciones 42 __________________________________________________________ Publicaciones 43 __________________________________________________________ Publicaciones 44 __________________________________________________________ Publicaciones 45 __________________________________________________________ Publicaciones 46 __________________________________________________________ Publicaciones 47 __________________________________________________________ Publicaciones 54 __________________________________________________________ Publicaciones 55 __________________________________________________________ Publicaciones 56 __________________________________________________________ Publicaciones 57 __________________________________________________________ Publicaciones 58 __________________________________________________________ Publicaciones 59 DISCUSIÓN _____________________________________________________________ Discusión 61 4-DISCUSIÓN La presencia de las ficotoxinas en aguas marinas y continentales, y también en productos del mar empleados para el consumo humano hace necesario tener un mejor y mayor conocimiento del mecanismo de acción de estas toxinas para aportar a quien corresponda, mejores herramientas de decisión con el fin de adoptar medidas de protección de la salud pública más eficientes, equilibradas y ajustadas al peligro real que estas toxinas suponen. Como resultado de los experimentos llevados a cabo en esta tesis, se obtuvieron una serie de resultados que a continuación se discuten. 4.1.-Estudio del efecto de las toxinas diarreicas (AO y DTX-2) sobre hepatocitos primarios y transformados Por un lado, en la presente tesis doctoral se realizó un análisis toxicológico de AO y DTX-2 sobre las células Clone 9, HepG2 y H.P. de rata, para así profundizar en el conocimiento de los mecanismos de acción de estas toxinas y evaluar comparativamente, analogías y diferencias del AO respecto de la DTX-2. Estos resultados se publicaron en sendos trabajos titulados “Okadaic acid and dinophysis toxin 2 have differential toxicological effects in hepatic cell lines inducing cell cycle arrest, at G0/G1 or G2/M with aberrant mitosis depending on the cell line” y “Comparative study of toxicological and cell cycle effects of okadaic acid and dinophysistoxin-2 in primary rat hepatocytes”. En los citados estudios, se observó cómo el AO y la DTX-2 son equipotentes para la línea celular Clone 9, mientras que para las células HepG2, así como para los H.P. de rata, la DTX-2 es un 40% menos potente que el AO. Ésta diferencia de potencia es la misma que observaron Aune et.al. tras la administración intraperitoneal de las toxinas en ratones [77]. Sin embargo en otros artículos publicados, realizados con cultivos de neuronas cerebelares, la diferencia de potencia entre AO y DTX-2 es mayor [112] que la que nosotros observamos en la línea HepG2 y en el cultivo primario de hepatocitos. _____________________________________________________________ Discusión 62 La toxicidad que el AO mostró en nuestros ensayos, se encuentra entre los límites anteriormente publicados por otros grupos que han descrito IC50 entre 5 y 100 nM [154-157]. Las células Clone 9 y los H.P. cuando son expuestas al AO y a la DTX-2 muestran una sensibilidad similar, y a su vez son más sensibles que las HepG2. Aunando algunos datos publicados anteriormente junto con los obtenidos en ésta tesis, parece claro que las líneas celulares no son el mejor modelo para el estudio de la toxicidad relativa entre estas toxinas debido a la variabilidad de los resultados observados entre estas. 4.1.1-Estudio de la citotoxicidad del AO y la DTX-2 en células hepáticas Cuando estudiamos el tipo de muerte celular inducida por el tratamiento de las células hepáticas con AO y DTX-2 vimos que en las células Clone 9 la población subdiploide aumentó respecto a las células no expuestas a las toxinas, y lo hizo en mayor grado cuando se emplearon mayores concentraciones de ambas moléculas. Además, en el estudio de p53, se observó cómo ésta proteína había migrado al núcleo en las células tratadas. Para entender mejor la implicación de este hallazgo cabe citar algunos aspectos funcionales de p53, también conocida como “proteína supresora tumoral”. Se conoce el papel trascendental que p53 juega en la respuesta de las células ante estímulos lesivos, ante los cuales, esta proteína se activa para impedir la progresión de células mutadas o dañadas. p53 es un factor de transcripción cuya expresión se induce ante múltiples señales de daño celular (la más estudiada el daño del ADN). La activación de p53 supone a su vez una regulación positiva o negativa (según los casos) de distintos genes efectores involucrados en diversas funciones celulares, entre las que cabe destacar la detención del ciclo celular, la senescencia y la apoptosis [158]. La proteína p53 es compleja en su estructura y también posee una vasta complejidad funcional. Además, esta proteína sufre diversas transformaciones post-transcripcionales como son la fosforilación, la acetilación y la ubiquitinización. _____________________________________________________________ Discusión 63 Estas modificaciones acontecen previa migración de p53 al núcleo, y actúan como eficientes herramientas para regular la activación-desactivación de p53, así como su estabilidad y su vida media [159]. Además de las vías clásicas de actividad de p53 dependientes de la transcripción de diversos genes, estudios más recientes han demostrado las bases del mecanismo de acción de p53 cuando ejerce una actividad proapoptótica independiente de transcripción [160, 161], que además tiene lugar en cualquier tipo de célula que se vea sometida a alguno de los factores estresantes que activan p53, como son por ejemplo el daño del ADN y la hipoxia [160-162]. Posteriormente otros grupos corroboraron con sus estudios la existencia de una muerte celular programada mitocondrial, mediada directamente por p53 [163-167]. Considerando las vías que p53 emplea para inducir la muerte programada de las células, la presencia de p53 en el núcleo de las células Clone 9 tratadas indica que al menos cierto grado de apoptosis está involucrado en la citotoxicidad observada tras la incubación de esta línea celular con las ficotoxinas. Este hecho no ocurre en el caso de la línea de hepatoma humano HepG2. Sin embargo, en los H.P., tanto la población sub-G0 como la actividad de la caspasa-3 aumentaron significativamente, lo que apunta a que también en este caso la apoptosis está implicada, en la muerte de los H.P. no obstante, no puede descartarse la posible presencia de necrosis celular, ya que los hepatocitos tratados liberaron cierta cantidad de LDH al medio de cultivo. 4.1.2-El AO y la DTX-2 afectan de distinta manera el ciclo celular de distintos tipos de células hepáticas Las dos toxinas inhibieron el ciclo celular de las líneas celulares estudiadas y de los H.P. de rata, pero lo hicieron en diferentes fases. Sobre las Clone 9, el AO y la DTX-2 tienen un efecto similar, inhibiendo el ciclo celular en G2/M e induciendo la aparición de células con mitosis aberrantes. Esto se deduce del hecho de que la población de células Clone 9 con múltiples núcleos es producto de una segregación aberrante de los cromosomas, sin que exista variación en la cantidad de ADN con respecto a _____________________________________________________________ Discusión 70 malignidad [189]. Por esto, la presencia de tubulina en el núcleo de H.P. expuestos a AO y DTX-2 puede ser una consecuencia del estrés químico producido por estas moléculas. Sin embargo, otra posible causa que no debemos descartar es la presencia de estas células en condiciones de cultivo, ya que períodos largos de incubación pueden producir cierto estrés en las células, estrés que sumado al generado por los compuestos en estudio puede producir migración de tubulina hacia el núcleo. 4.2-Estudio del efecto de CYN sobre hepatocitos primarios En esta tesis doctoral también se planteó como objetivo entender el mecanismo de acción de la toxina de agua dulce CYN, a fin de aportar información que ayude, en la medida de lo posible, a entender el efecto producido por la toxina durante los episodios de intoxicación de diversas poblaciones. En el trabajo publicado en la revista “Chemichal Research in Toxicology”, denominado “Protein synthesis inhibition and oxidative stress induced by cylindrospermopsin elicit apoptosis in primary rat hepatocytes” evaluamos diversos aspectos implicados en la muerte de los H.P. de rata a causa de la CYN. 4.2.1-La CYN, a concentraciones nanomolares, es toxica e induce apoptosis en H.P. A las concentraciones empleadas en nuestro trabajo la CYN demostró ser citotóxica para los H.P. con un patrón dependiente de la dosis y del tiempo, siendo la apoptosis el principal tipo de muerte celular inducido como lo indican los diversos experimentos que llevamos a cabo. En estos experimentos observamos que la actividad de caspasa-3 estaba incrementada, de manera dosis dependiente, en las células tratadas con CYN. A su vez, experimentos de citometría de flujo por imagen previa tinción de yoduro de propidio (I.P.) mostraron un aumento de la población sub-G0 en las células tratadas con CYN respecto a los controles. Durante la apoptosis se produce una característica fragmentación internucleosomal del ADN por acción de endonucleasas, _____________________________________________________________ Discusión 71 estas enzimas generan fragmentos de tamaño variable y múltiplos de aproximadamente 200 pares de bases [190, 191], y parte de estos fragmentos son los que se localizan en la población sub-G0 tras el análisis citométrico. Para confirmar la existencia de apoptosis en H.P. tratados con CYN se llevaron a cabo experimentos de tinción con Anexina V conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) que se analizaron por detección espectrofluorimétrica y por microscopía confocal. Estos ensayos confirmaron la inducción de apoptosis por CYN, pues todas las concentraciones probadas provocaron un incremento del número de células marcadas. La Anexina V se une a la fosfatidilserina, que habitualmente se encuentra en la cara citosólica de la membrana celular, pero que tras una señal apoptótica, en los primeros estadios del proceso, se transloca y se sitúa en la cara externa de la membrana celular [192]. Por tanto, como éste es un suceso temprano en la apoptosis, nosotros optamos por tratar las células durante 6 h. En este caso se vio como aumentaba la proporción de células marcadas, lo que pone de manifiesto que la CYN desencadena rápidamente apoptosis sobre los H.P. Además se empleó microscopía confocal para evaluar los resultados del marcaje conjunto con I.P. y Anexina V. En este experimento vimos un ligero incremento de I.P. en las células que habían sido expuestas a la toxina durante 48 h, lo que es indicativo de la pérdida de integridad de la membrana celular. A fin de establecer si además de apoptosis, la CYN producía pérdida de integridad celular propia de la necrosis, evaluamos la liberación al medio de cultivo de lactato deshidrogenasa, que se produce debido a la permeabilización celular que se observa durante la muerte necrótica. Sólo se observó un incremento significativo de esta enzima tras 72 h de tratamiento. Tanto la tinción nuclear con I.P. que se menciona más arriba como la aparición de la LDH en el medio de cultivo, después de largos tiempos de incubación, nos indican que es posible la presencia de cierto grado de necrosis, sin embargo, es más probable una necrosis secundaria a consecuencia de la apoptosis, cuya presencia se ha observado en células en cultivo [29]. Majno et al _____________________________________________________________ Discusión 72 detallaron ya en 1995 las fases y características de las células apoptótica. Ellos describieron una fase tardía de la apoptosis en la que se observan imágenes típicas de células necróticas, afirmando que esta segunda fase de apoptosis debía ser llamada “necrosis apoptótica” [190]. Un ejemplo de necrosis apoptótica es el de los cuerpos hialinos de Councilman, asociados a ciertas enfermedades hepáticas [193]. Otros grupos de investigación han empleado la liberación de LDH como método para establecer la viabilidad celular de H.P. tratados con la CYN [145, 147]. Estos autores emplearon concentraciones de toxina muy superiores a las nuestras, lo que indica que la CYN induce apoptosis o necrosis en función de las concentraciones empleadas. La presencia de apoptosis a estas concentraciones no se puede descartar debido a que los autores mencionados no realizaron experimentos que permitiesen hacerlo. 4.2.2-La CYN inhibe la síntesis de proteína a concentraciones nanomolares en H.P. Se sabe que la CYN en concentraciones micromolares inhibe la síntesis de proteínas de H.P. de rata y ratón [61, 147]. Para determinar si esto también se observaba a concentraciones nanomolares (inductoras de apoptosis), realizamos experimentos para determinar la síntesis proteica a través de incorporación le leucina tritiada ([3H-Leucina]). De forma paralela realizamos experimentos de viabilidad celular con alamar blue a fin de establecer si existía alguna relación entre el efecto de la CYN sobre la síntesis proteica y la citotoxicidad observada para esta molécula. La CYN 360 nM al cabo de 24 h ejerció una total inhibición de la síntesis proteica que se mantuvo hasta las 48 h. A ésta inhibición le acompañó una disminución en la viabilidad celular del 50% y 75% tras 24 y 48 h respectivamente. Sin embargo, cuando la síntesis proteica de los H.P. fue inhibida en el mismo grado empleando cicloheximida, la toxicidad observada después de 24 y 48 h de tratamiento fue mucho menor, comparable a la ejercida por la concentración de CYN de 180 nM, que no produjo una total inhibición de la síntesis de proteínas, como si hizo la cicloheximida. Esto nos _____________________________________________________________ Discusión 73 indicó que la inhibición de la síntesis proteica no es el único mecanismo implicado en la muerte celular causada por esta cianotoxina. Sustentando esta hipótesis se encuentran los datos obtenidos de los experimentos en los que se expuso a los H.P. a CYN durante 6 h para luego seguir incubando las células sin toxina hasta cumplirse las 24 o las 48 h. Estos demostraron que ante una inhibición de síntesis proteica nula o muy inferior a la observada en los experimentos en los que la toxina se mantuvo en el medio hasta las 24 y 48 h, se observó una reducción importante de la viabilidad celular. Con estos experimentos en los que se renovó el medio de cultivo, retirando la toxina después de 6 h de exposición, comprobamos que la inhibición es irreversible ya que la tasa de inhibición se mantuvo constante (o incluso disminuyó un poco mas) desde las 6 h hasta que se cumplieron las 24 y 48 h. Esto concuerda con lo publicado por otros investigadores [147]. Si se comparan los resultados obtenidos de los dos grupos de experimentos, se puede ver que la CYN necesita cierto tiempo para ejercer totalmente su poder inhibitorio sobre la síntesis de proteínas, una vez que se encuentra en contacto con las células. En este sentido, ya se ha demostrado que la activación metabólica está implicada en la toxicidad de la CYN [145, 194], y ésta podría ser la razón por la cual las células tratadas con toxina durante 6 h y luego incubadas con medio fresco hasta las 24 o 48 h se asocian con menores tasas de viabilidad que las células que simplemente permanecieron 6 h en presencia de CYN. También está relacionado con este hecho, que siendo la inhibición de la síntesis proteica producida por CYN irreversible, y aunque CYN 360 nM inhibió totalmente la síntesis proteica después de 24 h, no se observó lo mismo en las células que fueron tratadas con CYN 360 nM durante 6 h y que luego fueron incubadas en medio fresco hasta las 24 y 48 h. En este último caso, ante una inhibición de síntesis proteica irreversible, se esperaría que la síntesis proteica a las 24 y 48 h se mantuviese nula, sin embargo como muestran los experimentos realizados, la síntesis a estos tiempos fue similar (o ligeramente menor) a la observada en los cultivos control. Esto indica _____________________________________________________________ Discusión 74 que la activación metabólica producida por CYN puede ser necesaria para posibilitar la inhibición irreversible de síntesis proteica. 4.2.3-El estrés oxidativo está involucrado en la citotoxicidad de CYN en H.P. Son varios los trabajos publicados que afirman que tras exponer diversos tipos celulares y modelos animales a CYN se reducen los niveles y la síntesis de glutatión [146, 148, 195], según Norris et al., in vivo esta disminución no contribuye significativamente a la toxicidad aguda de CYN [148]. Otros autores (que también observaron mermas de al menos un 50% en los niveles de glutatión en todas las condiciones estudiadas) para evaluar el probable incremento de estrés oxidativo en la célula emplearon malondialdehído como indicador del mismo, y no observaron cambio significativo en los niveles de estrés oxidativo en H.P. de ratón tratados con CYN. Por esto consideran improbable que la presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) medie en la citotoxicidad asociada a CYN. Sin embargo, ellos emplearon dosis muy superiores (CYN 5 µM) a las empleadas en nuestro trabajo, utilizando incubaciones de 12 h, y en estas condiciones, las células sufrieron muerte por necrosis. [145]. En nuestros experimentos, cuando determinamos la presencia ROS en las células tratadas con CYN se observó un incremento de este indicador de estrés oxidativo. Las ROS aumentaron de un modo dependiente de la concentración de la toxina y del tiempo de exposición a la misma. De igual modo, se observa la activación de la respuesta antioxidante celular, tendente a contrarrestar esta situación de estrés oxidativo a través de la inducción del factor de transcripción NrF2, y la represión de la transcripción de Keap1 (inhibidor de NrF2). Como consecuencia, se observa un aumento en la concentración intracelular de NrF2. Para determinar si el estrés oxidativo observado estaba involucrado en la muerte de los H.P. se utilizó resveratrol, una molécula conocida por sus propiedades citoprotectoras frente al estrés oxidativo en diversos cultivos celulares incluyendo los H.P. [196, 197]. Este compuesto protegió _____________________________________________________________ Discusión 75 parcialmente a las células tratadas con CYN. La citoprotección observada fue dosis dependiente, al menos durante las primeras 24 h. Sin embargo a las 48 h la actividad citoprotectora fue menor. Nuestro trabajo indica que el estrés oxidativo está involucrado en la citotoxicidad inducida por la CYN sobre H.P. de rata. Esta diferencia con los trabajos realizados por otros autores que se mencionan más arriba podría ser debida a las diferentes concentraciones de toxina empleadas. Menores concentraciones de CYN durante periodos de incubación más largos inducen apoptosis, mientras que mayores concentraciones parecen producir necrosis, en cuyo caso el daño a la célula podría ser de tal magnitud que la muerte se produce en un corto periodo de tiempo sin dar opción a que se observe estrés oxidativo, o que este estrés oxidativo sea irrelevante con respecto a otros procesos lesivos. CONCLUSIONES __________________________________________________________ Conclusiones 77 5-CONCLUSIONES 5.1-Conclusiones del estudio del AO y la DTX-2 en células hepáticas: A. El ácido okadaico y la dinofisistoxina-2 son equipotentes en cultivos de hepatocitos transformados de rata (células Clone 9), pero el ácido okadaico es más tóxico que la dinofisistoxina-2 en células de hepatoma humano (células HepG2) y en H.P. de rata. B. Los resultados de viabilidad obtenidos en líneas celulares indican que estas no son el mejor modelo predictivo de toxicidad relativa, al menos para las moléculas evaluadas. C. Los cultivos de hepatocitos primarios mostraron una sensibilidad frente el ácido okadaico y la dinofisistoxina-2 similar a la observada in vivo después de administración intraperitoneal. D. En células Clone 9 el ácido okadaico y la dinofisistoxina-2 indujeron alteraciones en la segregación de los cromosomas, generando husos mitóticos aberrantes y consecuentemente mitosis aberrantes. E. En células HepG2 y H.P. proliferantes no se observaron fallos en la mitosis pero las toxinas inhibieron el ciclo celular en fase G0/G1. F. Las dos toxinas estudiadas indujeron la sobre expresión de las ciclinas A, B, y D en células Clone 9, mientras que en las células HepG2 regularon positivamente la ciclina D y negativamente las ciclinas A2 y B1. Estas alteraciones se vieron reflejadas en la inhibición del ciclo celular de las células Clone 9 en fase G2 y de las células HepG2 en la fase G0/G1. G. En H.P. proliferantes, ambas toxinas inhibieron el ciclo celular en G0/G1 previniendo el incremento en la expresión de p53 inducida por los mitógenos, y siendo el efecto del ácido okadaico mayor que el de la Dinofisistoxina-2. __________________________________________________________ Conclusiones 78 H. En las células Clone 9 tratadas se observa como p53 migra al núcleo, sin embargo en HepG2 no se observa diferencia en la sub localización celular de p53 al comparar las células tratadas respecto a los cultivos control. 5.2-Conclusiones del estudio CYN sobre H.P. de rata. I. A concentraciones nanomolares, la CYN es tóxica para H.P. de rata induciendo: i. Inhibición de la síntesis de proteínas ii. Inhibición del ciclo celular iii. Aumento en las especies reactivas del oxígeno iv. Activación de la respuesta antioxidante celular v. Apoptosis J. El estrés oxidativo está involucrado en la muerte celular inducida por cilindrospermopsina. K. La inhibición de la síntesis de proteínas en H.P. tratados con CYN a concentraciones nanomolares es total e irreversible L. La activación metabólica de CYN puede ser necesaria para la inhibición de la síntesis proteica y la consecuente citotoxicidad, aunque esta hipótesis requiere confirmación experimental. BIBLIOGRAFÍA ____________________________________________________________ Bibliografía 86 58. Hitzfeld B.C., Hoger S.J., and Dietrich D.R., Cyanobacterial toxins: removal during drinking water treatment, and human risk assessment. Environ Health Perspect, 2000. 108 Suppl 1: p. 113-22. 59. Duy T.N., Lam P.K., Shaw G.R., and Connell D.W., Toxicology and risk assessment of freshwater cyanobacterial (blue-green algal) toxins in water. Rev Environ Contam Toxicol, 2000. 163: p. 113-85. 60. Sivonen K., Kononen K., Carmichael W., Dahlem A., Rinehart K., Kiviranta J., and Niemela S., Occurrence of the hepatotoxic cyanobacterium Nodularia spumigena in the Baltic Sea and structure of the toxin. Applied and Enviromental Microbiology, 1989. 5(8): p. 1999-1995. 61. Runnegar M.T., Xie C., Snider B.B., Wallace G.A., Weinreb S.M., and Kuhlenkamp J., In vitro hepatotoxicity of the cyanobacterial alkaloid cylindrospermopsin and related synthetic analogues. Toxicol Sci, 2002. 67(1): p. 81-7. 62. Araoz R., Molgo J., and Tandeau de Marsac N., Neurotoxic cyanobacterial toxins. Toxicon, 2010. 56(5): p. 813-28. 63. Dittmann E., Fewer D.P., and Neilan B.A., Cyanobacterial toxins: biosynthetic routes and evolutionary roots. FEMS Microbiol Rev, 2013. 37(1): p. 23-43. 64. Nakagawa Y., Yanagita R.C., Hamada N., Murakami A., Takahashi H., Saito N., Nagai H., and Irie K., A simple analogue of tumor-promoting aplysiatoxin is an antineoplastic agent rather than a tumor promoter: development of a synthetically accessible protein kinase C activator with bryostatin-like activity. J Am Chem Soc, 2009. 131(22): p. 7573-9. 65. Stewart I., Schluter P., and Shaw G., Cyanobacterial lipopolysaccharides and human health - a review. Environmental Health: A Global Access Science Source, 2006. 5(1): p. 7. ____________________________________________________________ Bibliografía 87 66. Chorus I., Falconer I.R., Salas H.J., and Bartram J., Health risks caused by freshwater cyanobacteria in recreational waters. J Toxicol Environ Health B Crit Rev, 2000. 3(4): p. 323-47. 67. Chorus I. and Fastner J., Recreational exposure to cyanotoxins. Cyanotoxins - occurrence, causes, consequences, 2001: p. 190 - 199. 68. Yasumoto T., Murata M., Oshima Y., Sano M., Matsumoto G.K., and Clardy J., Diarrhetic shellfish toxins. Tetrahedron, 1985. 41(6): p. 1019-1025. 69. Yasumoto T., Oshima Y., and Yamaguchi M., Occurrence of a new type of shellfish poisoning in the Tohoku district. Bulletin of Japanese Society of Scientific Fisheries., 1978. 44: p. 1249-1255. 70. Aune T. and Yndestad M., Diarrhetic shellfish poisoning, in Algal Toxins in Seafood and Drinking Water, I.R. Falconer, Editor. 1993, Elsevier Science: London, UK. p. 87-104. 71. Fernandez M.L., Miguez A., Cacho E., and Martinez A., Detection of okadaic acid esters in the hexane extracts of Spanish mussels. Toxicon, 1996. 34(3): p. 381-7. 72. Ahmed Z., Sarker M., and Sack D., Protection of adult rabbits and monkeys from lethal shigellosis by oral immunization with a thymine-requiring and temperature-sensitive mutant of Shigella flexneri Y. Vaccine, 1990. 8: p. 153 - 158. 73. Vale P. and de M.S.M.A., First confirmation of human diarrhoeic poisonings by okadaic acid esters after ingestion of razor clams (Solen marginatus) and green crabs (Carcinus maenas) in Aveiro lagoon, Portugal and detection of okadaic acid esters in phytoplankton. Toxicon, 2002. 40(7): p. 989-96. 74. Vale P. and Sampayo M.A., Dinophysistoxin-2: a rare diarrhoeic toxin associated with Dinophysis acuta. Toxicon, 2000. 38(11): p. 1599-606. 75. Moroño A., Arévalo F., Fernández M.L., Maneiro J., Pazos Y., Salgado C., and Blanco J., Accumulation and transformation of DSP toxins in mussels Mytilus ____________________________________________________________ Bibliografía 88 galloprovincialis during a toxic episode caused by Dinophysis acuminata. Aquatic Toxicology, 2003. 62(4): p. 269-280. 76. Carmody E.P., James K.J., and Kelly S.S., Dinophysistoxin-2: the predominant diarrhoetic shellfish toxin in Ireland. Toxicon, 1996. 34(3): p. 351-9. 77. Aune T., Larsen S., Aasen J.A.B., Rehmann N., Satake M., and Hess P., Relative toxicity of dinophysistoxin-2 (DTX-2) compared with okadaic acid, based on acute intraperitoneal toxicity in mice. Toxicon, 2007. 49(1): p. 1-7. 78. CSID:23076274 h.w.c.c.C.-S.h.a., Aug 9, 2013). 79. Tachibana K., Scheuer P.J., Tsukitani Y., Kikuchi H., Van Engen D., Clardy J., Gopichand Y., and Schmitz F.J., Okadaic acid, a cytotoxic polyether from two marine sponges of the genus Halichondria. Journal of the American Chemical Society, 1981. 103(9): p. 2469-2471. 80. Hu T., Doyle J., Jackson D., Marr J., Nixon E., Pleasance S., Quilliam M.A., Walter J.A., and Wright J.L.C., Isolation of a new diarrhetic shellfish poison from Irish mussels. Journal of the Chemical Society, Chemical Communications, 1992. 0(1): p. 39-41. 81. Viviani R., Eutrophication, marine biotoxins, human health. Sci Total Environ, 1992. Suppl: p. 631-62. 82. Dickey R.W., Bobzin S.C., Faulkner D.J., Bencsath F.A., and Andrzejewski D., Identification of okadaic acid from a Caribbean dinoflagellate, Prorocentrum concavum. Toxicon, 1990. 28(4): p. 371-377. 83. Van Egmond H., Aune T., Lassus P., Speijers G., and Waldock M., Paralytic and diarrhoeic shellfish poisons: occurrence in Europe, toxicity, analysis and regulation. J. Nat. Toxins, 1993. 2: p. 41-83. 84. Van Apeldoorn M., Diarrhoeic shellfish poisoning: A review. 1998, RIVM/CSR. 85. Haamer J., Presence of the phycotoxin okadaic acid in mussels (Mytilus edulis) in relation to nutrient composition in Swedish coastal water. J. Shellfish Res, 1995. 14: p. 209-216. ____________________________________________________________ Bibliografía 89 86. Sedmak B. and Fanuko N., Occurrence ofDinophysis spp. and toxic shellfish in the Northern Adriatic. Journal of Applied Phycology, 1991. 3(4): p. 289-294. 87. Blanco J., Fernández M., Míguez A., and Moroño A., Okadaic acid depuration in the mussel Mytilus galloprovincialis: oneand two-compartment models and the effect of environmental conditions. Marine Ecology Progress Series, 1999. 176: p. 153-163. 88. Whittle K. and Gallacher S., Marine toxins. British Medical Bulletin, 2000. 56(1): p. 236-253. 89. Bialojan C. and Takai A., Inhibitory effect of a marine-sponge toxin, okadaic acid, on protein phosphatases. Specificity and kinetics. Biochem J, 1988. 256(1): p. 283-90. 90. Fujiki H. and Suganuma M., Unique features of the okadaic acid activity class of tumor promoters. J Cancer Res Clin Oncol, 1999. 125(3-4): p. 150-5. 91. Le Hegarat L., Jacquin A.G., Bazin E., and Fessard V., Genotoxicity of the marine toxin okadaic acid, in human Caco-2 cells and in mice gut cells. Environ Toxicol, 2006. 21(1): p. 55-64. 92. Tubaro A., Sosa S., Altinier G., Soranzo M.R., Satake M., Della Loggia R., and Yasumoto T., Short-term oral toxicity of homoyessotoxins, yessotoxin and okadaic acid in mice. Toxicon, 2004. 43(4): p. 439-45. 93. Tubaro A., Sosa S., Carbonatto M., Altinier G., Vita F., Melato M., Satake M., and Yasumoto T., Oral and intraperitoneal acute toxicity studies of yessotoxin and homoyessotoxins in mice. Toxicon, 2003. 41(7): p. 783-92. 94. EU-NRL, Minutes of the 4th meeting of EU National Reference Laboratories (EU-NRL) on marine biotoxins. 2001: Vigo, Spain. p. 29-31. 95. Matias W.G., Traore A., and Creppy E.E., Variations in the distribution of okadaic acid in organs and biological fluids of mice related to diarrhoeic syndrome. Human & Experimental Toxicology, 1999. 18(5): p. 345-350. ____________________________________________________________ Bibliografía 90 96. Matias W.G. and Creppy E.E., Transplacental passage of [3H]-okadaic acid in pregnant mice measured by radioactivity and high-performance liquid chromatography. Hum Exp Toxicol, 1996. 15(3): p. 226-30. 97. Anonymous, Report of the Joint FAO/IOC/WHO ad hoc Expert Consultation on Biotoxins in Molluscan Bivalves. 2005, Food and Agriculture Organization.: Oslo, Norway. p. 33. 98. Ito E. and Terao K., Injury and recovery process of intestine caused by okadaic acid and related compounds. Nat Toxins, 1994. 2(6): p. 371-7. 99. Ito E., Yasumoto T., Takai A., Imanishi S., and Harada K., Investigation of the distribution and excretion of okadaic acid in mice using immunostaining method. Toxicon, 2002. 40(2): p. 159-65. 100. Berven G., Saetre F., Halvorsen K., and Seglen P.O., Effects of the diarrhetic shellfish toxin, okadaic acid, on cytoskeletal elements, viability and functionality of rat liver and intestinal cells. Toxicon, 2001. 39(2-3): p. 349-62. 101. Matias W. and Creppy E., Evidence for enterohepatic circulation of okadaic acid in mice. Toxic Substance Mechanism, 1996b. 15: p. 405-414. 102. Franchinia A., Marchesini E., Poletti R., and Ottaviani E., Swiss mice CD1 fed on mussels contaminated by okadaic acid and yessotoxins: effects on thymus and spleen. Eur J Histochem, 2005. 49(2): p. 179-88. 103. Tubaro S., Sosa S., Bornancin A., and Hungerford J., Pharmacology and Toxicology of Diarrheic Shellfish Toxins., in Seafood and Freshwater Toxins. Pharmacology, Physiology, and Detection., L. Botana, Editor. 2008, CRC Press. p. 229-253. 104. Fessard V., Grosse Y., Pfohl-Leszkowicz A., and Puiseux-Dao S., Okadaic acid treatment induces DNA adduct formation in BHK21 C13 fibroblasts and HESV keratinocytes. Mutat Res, 1996. 361(2-3): p. 133-41. ____________________________________________________________ Bibliografía 91 105. Fujiki H., Sueoka E., Komori A., and Suganuma M., Tumor promotion and TNF ‐ α gene expression by the okadaic acid class tumor promoters. Journal of Environmental Science and Health, Part C, 1997. 15(1): p. 1-40. 106. Suganuma M., Tatematsu M., Yatsunami J., Yoshizawa S., Okabe S., Uemura D., and Fujiki H., An alternative theory of tissue specificity by tumor promotion of okadaic acid in glandular stomach of SD rats. Carcinogenesis, 1992. 13(10): p. 1841-5. 107. Fujiki H. and Suganuma M., Tumor promotion by inhibitors of protein phosphatases 1 and 2A: the okadaic acid class of compounds. Adv Cancer Res, 1993. 61: p. 143-94. 108. Fujiki H., Suganuma M., Suguri H., Yoshizawa S., Takagi K., Uda N., Wakamatsu K., Yamada K., Murata M., Yasumoto T., and et al., Diarrhetic shellfish toxin, dinophysistoxin-1, is a potent tumor promoter on mouse skin. Jpn J Cancer Res, 1988. 79(10): p. 1089-93. 109. Suganuma M., Okabe S., Sueoka E., Nishiwaki R., Komori A., Uda N., Isono K., and Fujiki H., Tautomycin: an inhibitor of protein phosphatases 1 and 2A but not a tumor promoter on mouse skin and in rat glandular stomach. J Cancer Res Clin Oncol, 1995. 121(9-10): p. 621-7. 110. Munday R., Is protein phosphatase inhibition responsible for the toxic effects of okadaic Acid in animals? Toxins (Basel), 2013. 5(2): p. 267-85. 111. Repeto-Jimenez M. and Repeto-Kuhn G., Toxicología fundamental. 4 ed, ed. E.D. Santos. 2009. 620. 112. Perez-Gomez A., Garcia-Rodriguez A., James K.J., Ferrero-Gutierrez A., Novelli A., and Fernandez-Sanchez M.T., The marine toxin dinophysistoxin-2 induces differential apoptotic death of rat cerebellar neurons and astrocytes. Toxicol Sci, 2004. 80(1): p. 74-82. ____________________________________________________________ Bibliografía 92 113. Toyofuku H., Joint FAO/WHO/IOC activities to provide scientific advice on marine biotoxins (research report). Marine Pollution Bulletin, 2006. 52(12): p. 1735-1745. 114. Miller A.P. and Tisdale E.S., Public Health Engineering: Epidemic of Intestinal Disorders in Charlestion, W. Va., Occurring Simultaneously with Unprecedented Water Supply Conditions. Am J Public Health Nations Health, 1931. 21(2): p. 198-200. 115. Zegura B., Straser A., and Filipic M., Genotoxicity and potential carcinogenicity of cyanobacterial toxins - a review. Mutat Res, 2011. 727(1-2): p. 16-41. 116. Honkanen R.E., Zwiller J., Moore R.E., Daily S.L., Khatra B.S., Dukelow M., and Boynton A.L., Characterization of microcystin-LR, a potent inhibitor of type 1 and type 2A protein phosphatases. J Biol Chem, 1990. 265(32): p. 19401-4. 117. Carmichael W., Freshwater blue-green algae (cyanobacteria) toxins - a review. The water environment - Algal toxins and health, 1981: p. 1 - 13. 118. Yu S.Z., Primary prevention of hepatocellular carcinoma. J Gastroenterol Hepatol, 1995. 10(6): p. 674-82. 119. Jochimsen E.M., Carmichael W.W., An J.S., Cardo D.M., Cookson S.T., Holmes C.E., Antunes M.B., de Melo Filho D.A., Lyra T.M., Barreto V.S., Azevedo S.M., and Jarvis W.R., Liver failure and death after exposure to microcystins at a hemodialysis center in Brazil. N Engl J Med, 1998. 338(13): p. 873-8. 120. Chiswell R.K., Shaw G.R., Eaglesham G., Smith M.J., Norris R.L., Seawright A.A., and Moore M.R., Stability of cylindrospermopsin, the toxin from the cyanobacterium, Cylindrospermopsis raciborskii: Effect of pH, temperature, and sunlight on decomposition. Environmental Toxicology, 1999. 14(1): p. 155-161. 121. Shaw G.R., Seawright A.A., Moore M.R., and Lam P.K., Cylindrospermopsin, a cyanobacterial alkaloid: evaluation of its toxicologic activity. Ther Drug Monit, 2000. 22(1): p. 89-92. ____________________________________________________________ Bibliografía 93 122. CSID:26396261 h.w.c.c.C.-S.h.a., Aug 9, 2013). 123. Ohtani I., Moore R., and Runnegar M., Cylindrospermopsin: A Potent Hepatotoxin from the Blue-Green Alga Cylindrospermopsis raciborskii. Journal of American Chemical Society., 1992. 114: p. 7941-7942. 124. Kinnear S., Cylindrospermopsin: a decade of progress on bioaccumulation research. Mar Drugs, 2010. 8(3): p. 542-64. 125. Stüken A., Rücker J., Endrulat T., Preussel K., Hemm M., Nixdorf B., Karsten U., and Wiedner C., Distribution of three alien cyanobacterial species (Nostocales) in northeast Germany: Cylindrospermopsis raciborskii, Anabaena bergii and Aphanizomenon aphanizomenoides. Phycologia, 2006. 45(6): p. 696703. 126. Bonilla S., Aubriot L., Soares M.C., Gonzalez-Piana M., Fabre A., Huszar V.L., Lurling M., Antoniades D., Padisak J., and Kruk C., What drives the distribution of the bloom-forming cyanobacteria Planktothrix agardhii and Cylindrospermopsis raciborskii? FEMS Microbiol Ecol, 2012. 79(3): p. 594-607. 127. Rucker J., Stuken A., Nixdorf B., Fastner J., Chorus I., and Wiedner C., Concentrations of particulate and dissolved cylindrospermopsin in 21 Aphanizomenon-dominated temperate lakes. Toxicon, 2007. 50(6): p. 800-9. 128. Gugger M., Molica R., Le Berre B., Dufour P., Bernard C., and Humbert J.F., Genetic diversity of Cylindrospermopsis strains (cyanobacteria) isolated from four continents. Appl Environ Microbiol, 2005. 71(2): p. 1097-100. 129. Berry J.P. and Lind O., First evidence of "paralytic shellfish toxins" and cylindrospermopsin in a Mexican freshwater system, Lago Catemaco, and apparent bioaccumulation of the toxins in "tegogolo" snails (Pomacea patula catemacensis). Toxicon, 2010. 55(5): p. 930-8. 130. Saker M.L. and Eaglesham G.K., The accumulation of cylindrospermopsin from the cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii in tissues of the Redclaw crayfish Cherax quadricarinatus. Toxicon, 1999. 37(7): p. 1065-77. ____________________________________________________________ Bibliografía 94 131. Saker M.L., Metcalf J.S., Codd G.A., and Vasconcelos V.M., Accumulation and depuration of the cyanobacterial toxin cylindrospermopsin in the freshwater mussel Anodonta cygnea. Toxicon, 2004. 43(2): p. 185-94. 132. Byth S., Palm Island mystery disease. Med J Aust, 1980. 2(1): p. 40, 42. 133. Griffiths D.J. and Saker M.L., The Palm Island mystery disease 20 years on: a review of research on the cyanotoxin cylindrospermopsin. Environ Toxicol, 2003. 18(2): p. 78-93. 134. Hawkins P.R., Runnegar M.T., Jackson A.R., and Falconer I.R., Severe hepatotoxicity caused by the tropical cyanobacterium (blue-green alga) Cylindrospermopsis raciborskii (Woloszynska) Seenaya and Subba Raju isolated from a domestic water supply reservoir. Appl Environ Microbiol, 1985. 50(5): p. 1292-5. 135. Saker M., Thomas A., and Norton J., Cattle mortality attributed to the toxic cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii in an outback region of north Queensland. Environ Toxicol, 1999. 14: p. 179 - 182. 136. Bazin E., Huet S., Jarry G., Hegarat L.L., Munday J.S., Humpage A.R., and Fessard V., Cytotoxic and genotoxic effects of cylindrospermopsin in mice treated by gavage or intraperitoneal injection. Environ Toxicol, 2010. 27(5): p. 277-284. 137. Falconer I.R., Hardy S.J., Humpage A.R., Froscio S.M., Tozer G.J., and Hawkins P.R., Hepatic and Renal Toxicity of the Blue–Green Alga (Cyanobacterium) Cylindrospermopsis raciborskii in Male Swiss Albino Mice. Environ Toxicol, 1999. 14(1): p. 143-150. 138. Hawkins P., Runnegar M., Jackson A., and Falconer I., Severe hepatotoxicity caused by the tropical cyanobacterium (blue-green alga) Cylindrospermopsis raciborskii (Woloszynska) Seenaya and Subba Raju isolated from a domestic water supply reservoir. Appl Environ Microbiol, 1985. 50: p. 1292 - 1295. ____________________________________________________________ Bibliografía 95 139. Terao K., Ohmori S., Igarashi K., Ohtani I., Watanabe M.F., Harada K.I., Ito E., and Watanabe M., Electron microscopic studies on experimental poisoning in mice induced by cylindrospermopsin isolated from blue-green alga Umezakia natans. Toxicon, 1994. 32(7): p. 833-43. 140. Rogers E.H., Zehr R.D., Gage M.I., Humpage A.R., Falconer I.R., Marr M., and Chernoff N., The cyanobacterial toxin, cylindrospermopsin, induces fetal toxicity in the mouse after exposure late in gestation. Toxicon, 2007. 49(6): p. 855-64. 141. Young F.M., Micklem J., and Humpage A.R., Effects of blue-green algal toxin cylindrospermopsin (CYN) on human granulosa cells in vitro. Reprod Toxicol, 2008. 25(3): p. 374-80. 142. Falconer I.R. and Humpage A.R., Cyanobacterial (blue-green algal) toxins in water supplies: Cylindrospermopsins. Environ Toxicol, 2006. 21(4): p. 299-304. 143. Seawright A., Nolan C., Shaw G., Chiswell R., Norris R., Moore M., and Smith M., The Oral Toxicity for Mice of the Tropical Cyanobacterium Cylindrospermopsis raciborskii (Woloszynsk). Environmental Toxicology, 1999. 14(1): p. 135-142. 144. Chong M.W., Wong B.S., Lam P.K., Shaw G.R., and Seawright A.A., Toxicity and uptake mechanism of cylindrospermopsin and lophyrotomin in primary rat hepatocytes. Toxicon, 2002. 40(2): p. 205-11. 145. Humpage A.R., Fontaine F., Froscio S., Burcham P., and Falconer I.R., Cylindrospermopsin genotoxicity and cytotoxicity: role of cytochrome P-450 and oxidative stress. J Toxicol Environ Health A, 2005. 68(9): p. 739-53. 146. Runnegar M.T., Kong S.M., Zhong Y.Z., and Lu S.C., Inhibition of reduced glutathione synthesis by cyanobacterial alkaloid cylindrospermopsin in cultured rat hepatocytes. Biochem Pharmacol, 1995. 49(2): p. 219-25. 147. Froscio S.M., Humpage A.R., Burcham P.C., and Falconer I.R., Cylindrospermopsin-induced protein synthesis inhibition and its dissociation