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Christoph Georg Wolfgang Sucker
Dr. med.
Nachweis residualer Tumorzellen bei Patienten mit Multiplem Myelom
durch allelspezifische Polymerase Kettenreaktion
Geboren am 27.02.1970 in Darmstadt.
Reifeprüfung am 18.05.1989 in Darmstadt
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom WS 1989/90 bis zum WS 1996/97
Physikum am 31.08.1992 an der Universität Heidelberg
Klinisches Studium in Heidelberg
Praktisches Jahr in Heilbronn
Staatsexamen am 28.04.1997 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Innere Medizin
Doktorvater: Priv. Doz. Dr. med. H. Goldschmidt
Das Multiple Myelom ist eine klonale B-Zellerkrankung. Unter der
Standardtherapie mit Melphalan und Prednison liegt die mediane
Überlebenszeit bei etwa drei Jahren; Polychemotherapien konnten die
Prognose nicht signifikant verbessern.
Die Hochdosis-Chemotherapie mit oder ohne Ganzkörperbestrahlung stellt eine
neue, erfolgversprechene Therapieoption dar; aufgrund der myeloablativen
Wirkung der Therapie ist eine nachfolgende Transplantation hämatopoetischer
Stammzellen notwendig. Mehrere Studien belegen den signifikanten
Überlebensvorteil für hochdosistherapierte Patienten. Schneller
hämatopoetische Rekonstitution und geringerer Gehalt maligner Zellen sind
entscheidende Vorteile der peripheren Blut-Stammzell-Transplantation
gegenüber der autologen Knochenmark-Transplantation.
Das Erreichen einer kompletten Remission nach konventionellen Kriterien
durch die Hochdosistherapie erfordert neue molekularbiologische Methoden
zum sensitiven und spezifischen Nachweis maligner Zellen. Zu diesem Zweck
sollten im Rahmen dieser Arbeit allelspezifische Oligonukleotide komplementär
zur „Complementarity Determining Region 3“ (CDR3-Region) der Tumorklone
entworfen und zum Nachweis maligner Zellen verwendet werden.
Die CDR3-Region auf Chromosom 14 codiert für die hypervariablen Regionen
der Immunglobulin-Schwerketten; diese tragen zur Antigen-Spezifität der
Antikörper bei. Aufgrund komplexer Rekombinationsvorgänge im Verlauf der B-
Zellentwicklung weist die CDR3-Region eine Sequenz auf, die für jeden B-
Zellklon einzigartig ist. Da die Region von hochkonservierten Sequenzen
flankiert wird, kann sie unter Verwendung von Konsensus-Primern durch
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert (CDR3-PCR) und anschließend
weiter analysiert werden.
Die Amplifikate der CDR3-PCR wurden kloniert. Anschließend wurden die
Sequenzen anhand ihrer C-Muster verglichen. Da identische CDR3-Sequenzen
unter normalen B-Lymphozyten nur mit einer Häufigkeit von 1 : 20000
vorkommen, fanden sich nur die CDR3-Regionen der malignen Klone mehr als
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zweifach. Gegenüber der alleinigen CDR3-PCR zeichnet sich die C-Muster-
Analyse dadurch aus, daß die Monoklonalität direkt anhand der DNA-Sequenz
nachweisbar ist. Die Identifikation des Tumorklons ist daher auch bei geringem
relativen Anteil unter der polyklonalen B-Zell-Population möglich.
Nach Identifizierung der CDR3-Regionen der malignen Klone in der C-Muster-
Analyse wurden die entsprechenden CDR3-Regionen sequenziert.
Komplementär zu den gefundenen Sequenzen wurden allelspezifische
Oligonukleotide (ASO) entworfen und in der ASO-PCR als Gensonden hoher
Spezifität und Sensitivität eingesetzt.
Alle untersuchten DNA-Proben aus peripherem Blut und Knochenmark waren
PCR-positiv. Außerdem konnten mit ASO-Primern in neun von zehn
untersuchten Leukapherese-Produkten eine Kontamination mit Tumorzellen
nachgewiesen werden. Alle CD34+-Fraktionen hämatopoetischer
Progenitorzellen mit Reinheiten zwischen 96,9 - 99,1% waren bei PCR-
Positivität der zugehörigen Leukapheresen PCR-negativ. Diese Ergebnisse
zeigen, daß zirkulierende Myelomzellen das Stammzellantigen CD34 nicht
exprimieren. Hingegen waren alle CD19+-Zellfraktionen PCR-positiv.
Mit der ASO-PCR ist ein Nachweis maligner Zellen mit hoher Sensitivität und
Spezifität möglich. Dies gewinnt besondere Bedeutung bei Patienten, die sich
gemäß konventioneller Kriterien in kompletter Remission befinden. Die
Überwachung minimaler Resterkrankungen (MRD) ist möglich. Mit dem
Kriterium der PCR-Negativität kann eine molekularbiologische Remission
definiert und zum Monitoring der Erkrankung eingesetzt werden. Die
Wirksamkeit künftiger Therapieformen kann daran gemessen werden, inwieweit
sie in der Lage sind, PCR-Negativität von peripherem Blut und Knochenmark
herbeizuführen; hierzu ist die Hochdosistherapie mit peripherer Blut-Stammzell-
Transplantation bisher nicht in der Lage.
Obwohl die Bedeutung reinfundierter Tumorzellen in Autotransplantaten für
eine erneute Krankheitsprogression derzeit nicht bekannt ist, werden
verschiedene Methoden zur Tumorzell-Reduktion erprobt. Nach den
Ergebnissen dieser Arbeit ist die Gewinnung eines PCR-negativen peripheren
Blut-Stammzell-Transplantates durch Anreicherung von CD34+-Zellen möglich
(„Positivpurging“).
Außerdem wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Patient mit der seltenen
Koexistenz von chronisch lymphatischer Leukämie und Multiplem Myelom
untersucht. Durch vergleichende Sequenzanalyse wurde ein gemeinsamer
klonaler Ursprung der beiden B-Zell-Erkrankungen nachgewiesen.
