Jochen Schmidt
Dr. sc. hum.
Untersuchungen zu wachstumsregulatorischen Genen bei der
Entstehung von Ösophaguskrebs
Geboren am 11.09.1966
Reifeprüfung am 14.06.1985
Vordiplom am 26.6.1990 an der Technischen Hochschule Darmstadt
Diplom am 24.02.1994 an der Technischen Hochschule Darmstadt
Promotionsfach: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ)
Doktorvater: Prof. H. Bartsch
Eine Besonderheit bei der Entstehung von squamösen Karzinomen des Ösophagus stellt die
offensichtliche Abwesenheit von Mutationen des ras-Onkogens in Primärtumoren und aus
Tumoren etablierten Zellinien dar. Als alternativer Angriffspunkt für mögliche Mutationen
bietet sich das raf- Onkogen an, welches für die Raf-Kinase kodiert, die direkt mit Ras
interagiert und bei der Vermittlung von mitogenen Signalen eine wichtige Rolle spielt.
Hinweise auf die Beteiligung von raf an kanzerogenen Prozessen liefern eine Vielzahl an
Untersuchungen aus tierexperimentellen Studien. Dazu gehört auch eine Studie, die in
induzierten Lungentumoren der Maus Punktmutationen in der konservierten Region 3 der raf-
Gens fanden (Storm et al., 1993). Das Vorkommen von Punktmutationen in humanen
Tumoren konnte dagegen bis heute nicht gefunden werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden 78 Biopsie-Proben von Ösophaguskrebs-Patienten und
Patienten mit hepatozellulären Karzinomen (HCC) auf Veränderungen in einem Teil der
konservierten Region 3 des raf-Gens mit Hilfe der direkten Sequenzierung von PCR-
Produkten analysiert. Bei beiden Krebsarten wurden bisher keine bzw. selten Veränderungen
des ras-Onkogens gefunden. In keiner der untersuchten Proben konnten Veränderungen in
dem untersuchten Bereich detektiert werden.
Im zweiten Teil der Arbeit sollten vier etablierte Ösophaguskrebs-Zellinien der TE-Serie auf
Veränderungen in einer Reihe von Genen untersucht werden, die bei der Kontrolle des
Zellwachstums eine Rolle spielen und die bei der Entstehung vieler Krebsarten beteiligt sind.
Hierzu wurden die Zellen zunächst auf Mutationen in Exon 1 (Kodons 12 und 13) und Exon 2
(Kodon 61) der beiden Proto-Onkogen-Isoformen Harvey (H)- und Kirsten (K)-ras
untersucht. Hier wurden keine Mutationen gefunden. Die Zellinie TE 1 wies in Kodon 27,
Exon 1 des H-ras-Gens eine stille Mutation auf (CAT→CAC). Die gewonnenen Ergebnisse
stehen im Widerspruch zu älteren Untersuchungen, bei denen in drei tumorigenen Zellinien
der TE-Serie Mutationen in Exon 1 von K-ras (TE 1, TE 2) bzw. H-ras (TE 8) gefunden
wurden (Galiana et al., 1993).
Die Sequenzierung der Exons 6-8 des Tumorsupressorgens p53 lieferte in allen vier Zellinien
unterschiedliche Ergebnisse. TE 1 und TE 11 zeigten „Missense“-Mutationen in den Exons 8
(TE 1, G→A) und 7 (TE 11, G→T), während TE 15 eine heterozygote Mutation in der
„Splice acceptor site“ von Intron 5 (Austausch G→A) aufwies. Der daraus resultierende
Phänotyp wies im Westernblot neben dem Wildtyp auch ein verkürztes P53-Protein (ca. 45
kDa) in unterschiedlichen Mengenverhältnissen auf. TE 13 zeigte in den untersuchten
Bereichen keine Veränderungen auf der Ebene des Gens. Mit Hilfe des Westernblots wie auch
durch die immunzytochemische Analyse ließ sich hier kein P53-Protein nachweisen. Diese
Ergebnisse entsprechen denen von Barnas et al. (1997) und widerlegen frühere Studien, in
denen in den TE-Zellen keine Veränderungen des p53-Gens gefunden wurden (Yamada et al.,
1991).
Weiterhin konnte eine erhöhte Expression des Zellzyklus-Regulators Cyclin D1 in TE 13
sowie des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) in TE 11 mittels Westernblot-
Analyse gefunden werden. Durch die Behandlung der TE-Zellen mit TPA,
Zigarettenrauchlösung und γ-Strahlung ließ sich die Phosphorylierung von MAPK (ERK2)
induzieren. TE 1, TE 11 und TE 13 zeigte bei allen drei Behandlungen eine Veränderung des
Phosphorylierungsstatus von MAPK (ERK2), während TE 15 nur auf die Behandlung mit
TPA reagierte. Die mechanistischen Ursachen für das abweichende Verhalten von TE 15
sollten Gegenstand weiterer Untersuchungen der TE-Zellinien sein.
