Gunter H. Scharer
Dr. med.
Molekulargenetische Diagnostik von Enzymdefekten der Steroid 21-Hydroxylase bei
Patienten mit adrenogenitalem Syndrom
Geboren am 22.05.1963 in Niederbühl/Rastatt
Reifeprüfung am 18.05.1982 in Rastatt
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom SS 1989 bis SS 1996
Physikum am 20.09.1991 an der Freien Universität Berlin
Klinisches Studium in Berlin und Heidelberg
Praktisches Jahr in Bad-Mergentheim und New York, USA
Staatsexamen am 04.11.1996 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Pharmakologie
Doktorvater: Prof. Dr. med. Ulrich Schwabe
Enzymdefekte der Steroid-21-Hydroxylase sind die häufigste Ursache (>90 %) für das
adrenogenitale Syndrom (AGS). Das AGS tritt in drei klinischen Formen auf: a) klassisches
AGS mit Salzverlust, b) einfach virilisierendes AGS, c) nichtklassisches (late-onset) AGS.
Die 21-Hydroxylase wird durch das CYP21B-Gen auf dem Chromosom 6 kodiert.
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines molekulargenetischen Diagnoseschemas zum
Nachweis von Defekten des CYP21B-Gens. Das Schema sollte das Screening einer großen
Patientengruppe ermöglichen und in der pränatalen und perinatalen Diagnostik anwendbar
sein. Nach spezifischer Amplifikation des CYP21B-Gens mittels Polymerasekettenreaktion
(PCR) wurden die drei häufigsten Mutationen (Deletionen, splice-site Mutation im Intron-2,
Ile172Asn-Mutation im Exon-4) durch Einzelstrangkonformationspolymorphismen (SSCP),
bzw. Heteroduplexanalyse nachgewiesen. Die Ergebnisse wurden mit der parallel
durchgeführten DNA-Sequenzierung des kompletten CYP21B-Gens verglichen. Für diese
Arbeit wurden 13 Patienten (5 männliche und 8 weibliche) aus dem Patientenkollektiv der
Universitätskinderklinik Heidelberg mit der gesicherten klinischen Diagnose eines
Salzverlust-AGS beziehungsweise eines einfach virilisierenden AGS ausgewählt. Außerdem
wurden die Eltern und Geschwister in die Untersuchung einbezogen.
Alle durch den Deletionsnachweis mittels PCR, bzw. die durch SSCP erhobenen Befunde
konnten durch direkte DNA-Sequenzierung bestätigt werden. Auf 26 untersuchten Patienten-
allelen wurden 6 Deletionen, 12 Intron-2-Mutationen und 7 Ile172Asn-Mutationen nach-
gewiesen. Bei einem Patienten wurde durch die Sequenzanalyse eine weitere seltene Mutation
(Gln318t) gefunden. Mit dem angewandten Untersuchungskonzept wurde eine hohe
Sensitivität (>90 %) und Spezifität (100 %) beim Mutationsnachweis im CYP21B-Gen
erreicht.
Das Diagnoseschema ermöglicht bei geringem Aufwand die schnelle Erfassung (2-3 Tage) der
drei häufigsten Mutationen, die zum Salzverlustsyndrom bei AGS führen, und ist damit auch
für die perinatale Diagnostik geeignet. Um die Sensitivität zu erhöhen, können weitere
Mutationen in das Diagnoseschema einbezogen werden. Durch die relativ geringe Länge des
CYP21B-Gens ist eine komplette DNA-Sequenzierung ebenfalls in kurzer Zeit möglich. Sie
sollte in jedem Fall durchgeführt werden, wenn bei gewünschter oder bestehender
Schwangerschaft und dem Vorliegen von Krankheitsfällen in der Familie ein adrenogenitales
Syndrom ausgeschlossen werden soll. Das gleiche gilt, wenn das angewandte Konzept von
Deletionsnachweis und SSCP-Analysen nur den Nachweis einer Mutation auf einem Allel
erbringt.
Die direkte DNA-Sequenzierung kann seltene oder unbekannte Mutationen auch im Bereich
von regulatorischen Sequenzen des CYP21B-Gens erfassen.
Das Phänomen der „bevorzugten“ Amplifikation, das im Fall des Sequenzpolymorphismus
A→C an der Position der splice-site Mutation im Intron-2 auftrat, kann zum Verlust eines
Allels in der primären PCR führen. Eine allelspezifische Amplifikation ist hier angezeigt.
Als Bestandteil eines Untersuchungskonzeptes zur Diagnostik des AGS ist die SSCP-Analyse
der direkten DNA-Sequenzierung nicht überlegen. Sie eignet sich für ein screening größerer
Patientengruppen hinsichtlich einer oder weniger Mutationen, wie sie zum Beispiel beim
nicht-klassischen AGS auftreten.
