Michael Keese
Dr. med.
Zur Zellbiologie der Glutathionreduktase: Wirkung physiologischer NO-Carrier
und Entwicklung eines Indikatorsystems für den zellulären Rdoxmetabolismus
Geboren am 19.12.1971 in Heidelberg
Reifeprüfung am 10.07.1991 in Nürnberg
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom SS 1992 bis SS 1998
Physikum am 15.03.1994 an der Universität Heidelberg
Klinisches Studium in Heidelberg
Praktisches Jahr in Kapstadt, Murten und Heidelberg
Staatsexamen am 12.11.1998 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Biochemie
Doktorvater: Prof. Dr. med. R. Heiner Schirmer
Die Enzyme des Glutathionstoffwechsels stellen einen bedeutsamen Bestandteil der zellulären
antioxidativen Mechanismen dar. Enge Verbindungen bestehen zum Stickoxid-Metabolismus.
In vivo Veränderungen im Glutathion-Redoxzyklus durch NO sind beispielsweise bei
Infektionen mit intrazellulären Parasiten von pathophysiologischer Bedeutung. Biochemische
Untersuchungen dieser Veränderungen könnten die Möglichkeit neuer und schonender
pharmakologischer Einflußnahmen durch eine gezielte Modulation körpereigener
Mechanismen bieten.
A. S-Nitrosoglutathion (GSNO) im Glutathionmetabolismus
Ausgehend von der Inhibition der Glutathionreduktase durch GSNO (Becker et al., 1995)
wurde die Wirkung des GSNO auf zwei weitere Enzyme des Glutathionstoffwechsels
untersucht.
Glutathion-S-Transferase der π-Klasse wird kompetitiv zu den beiden Substraten Chlor-
dinitrobenzol und Glutathion inhibiert. Die Ki-Werte liegen für CDNB und GSH mit 168 µΜ
bzw. 180 µM in einem physiologisch sinnvollen Bereich. Eine irreversible Modifikation des
Enzyms durch GSNO findet nicht statt. Dies gilt auch für die Glutathionperoxidase.
Reversible Effekte des GSNO auf Glutathionperoxidase sind wahrscheinlich unbedeutend,
wegen der Besonderheiten des Assay-Systems aber schwer zu quantifizieren.
B. Dinitrosyldithioleisenkomplexe (DNICs) und Enzyme des Glutathionstoffwechsels
DNICs sind reaktive NO-Trägersubstanzen, die einen bedeutsamen Anteil des EDRF
ausmachen. Im Rahmen meiner Dissertation wurden zwei niedermolekulare Vertreter (DNIC-
GSH2 und DNIC-CYS2) dieser Komplexklasse untersucht.
Die Glutathionreduktase wird schon bei sehr geringen DNIC-Konzentrationen inhibiert. Die
IC50-Werte liegen für DNIC-GSH2 bei 1.5 µΜ, für DNIC-CYS2 bei 16 µΜ. Die Hemmung
zeigte einen kompetitiven Anteil, der jedoch durch eine extrem schnelle kovalente In-
aktivierung des Enzyms überlagert wurde. Absorptionsspektroskopisch wurde nachgewiesen,
daß im modifizieren Enzym der CT-Komplex zwischen Cys63 und dem Flavin nicht mehr
aufgebaut werden kann. Die Modifikation betrifft wahrscheinlich nicht das Flavin, da ApoGR,
der Proteinanteil der GR nach Abtrennung des FAD, ebenfalls modifiziert wurde. Der
Vergleich der Inaktivierungskinetik beim Wildtyp und einer GR-Mutante ohne die ersten 15
N-terminalen Aminosäuren legte nahe, daß das reaktive Cys2 für die beobachtete Inhibierung
irrelevant ist. Dieser Befund ist wesentlich, da Cys2 kristallographisch nicht faßbar ist.
Zur Klärung des Hemmechanismus wurde das modifizierte Enzym kristallisiert. Die von S.
Savvides und P.A. Karplus an der Cornell University durchgeführte Röntgenbeugungsanalyse
ergab eine Elektronendichtekarte bei 1.7 Å Auflösung, die ich eindeutig interpretieren konnte:
In der durch DNIC-GSH2 modifizierten GR ist das Cys63 zum Sulfinat oxidiert und Cys58
trägt in Disulfidbindung ein Glutathionmolekül. Die Modifikation an Cys63 erklärt die
Irreversibilität der Enzym-Inaktivierung.
Der Einfluß externer DNICs auf die GR intakter Zellen war erwartungsgemäß gering. Hier
konnten unter den Inkubationsbedingungen in CHO-Zellen und Erythrozyten selbst bei
Konzentrationen von bis zu 100 µΜ nur 30 % Aktivitätsminderung festgestellt werden. Das
Wachstum von P. falciparum blieb durch DNICs im Medium unbeeinflußt.
Beide DNICs sind zu GSH kompetitive Inhibitoren der Glutathion-S-Transferase mit auffällig
niedrigen Ki-Werten von ca. 20 nM. Eine irreversible Modifikation des Enzyms wurde
ebensowenig beobachtet wie bei der Glutathionperoxidase.
C. Strukturvorhersagen zu Thioredoxinreduktase aus P. falciparum, eines potentiellen
Zielmoleküls intrazellulärer DNICs
Basierend auf der abgeleiteten Aminosäurensequenz der Thioredoxinreduktase wurde durch
Computermodelling ein Strukturvergleich mit der GR erstellt.
35 % der Aminosäuren erwiesen sich als identisch. Die Thioredoxinreduktasestruktur ist
jedoch weniger dicht gepackt und zeigt deutliche Unterschiede an den Substratbindungsstel-
len. Große Ähnlichkeit zur GR besitzen dagegen die für die FAD-Bindung und die Katalyse
wichtigen Aminosäuren.
D. Glutathionreduktase als quasi-pysiologisches Redoxindikatorsystem für lebende Zellen
1. Mikroinjektion von GR-Kristallen
Zur Kristallisation der GR bei niedriger Ionenstärke wurde eine Methode entwickelt, die es
ermöglicht, mit hoher Wahrscheinlichkeit große röntgentaugliche Kristalle zu gewinnen. Bei
diesen Kristallen sind die Veränderungen im GR-Absorptionsspektrum in Abhängigkeit vom
Reduktionsdruck des umgebenden Milieus selbst makroskopisch als Farbumschlag von gelb
nach rot zu beobachten. Daher sollten sich intrazelluläre GR-Kristalle als Indikatoren für den
Zustand des intrazellulären Redoxmilieus von Zellkompartimenten eignen. Mit der Mikro-
injektion gelang es, kleine immunfluoreszenzmikroskopisch nachweisbare Kristallfragmente
von < 1 µm3 Größe ins Cytoplasma von Fibroblasten zu injizieren. Größere Fragmente
konnten durch Partikelbombardement oder unter Verwendung von Laserpinzetten in die
Zellen manipuliert werden. Die intrazelluläre Rotverfärbung der Kristalle wurde
dokumentiert.
2. Immunkomplexe endogener GR mit mikroinjizierten IgGs
Die cytoplasmatische und die nukleäre GR wurden in HeLa-Zellen und Kepplerfibroblasten
immunfluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen. Da eine normale Fluoreszenzfärbung nicht
möglich war, wurde das Anti(hGR)-Serum mikroinjiziert, die Fluoreszenzmarkierung erfolgte
erst im Anschluß. Die intracytoplasmatische und intranukleoplasmatische Präsenz des Enzyms
wird deutlich nachweisbar, da sich die Immunpräzipitate als Partikel klar vom
Umgebungshintergrund abheben. Dieser Effekt könnte ebenso wie Verwendung von GR-
Kristallen für die Messung intrazellulärer Redoxpotentiale genutzt werden, weil
immunpräzipitierte GR ihre enzymatischen und spektroskopischen Eigenschaften beibehält.
In Peroxysomen und Lysosomen ließen sich erwartungsgemäß keine partikulären GR-IgG-
Komplexe nachweisen. Messungen an intrazellulären GR-Partikeln sind nicht nur für
pathophysiologische Fragestellen wie beispielsweise die Effekte von NO-Trägern von
Interesse. Sie können auch als Qualitätskriterium vor Organtransplantationen dienen, für deren
Erfolg ein intaktes Redoxmilieu der Zellen wahrscheinlich ebenso bedeutsam ist wie das pH
oder die ATP-Konzentration.
