Zellbiologie der Glutathionreduktase: Wirkung des NO-Karriers und Entwicklung eines Indikatorsystems für den zellulären Rdox-Metabolismus
Michael Keese
Dr. med. Zellbiologie der Glutathionreduktase: Wirkung des physiologischen NO-Carriers und Entwicklung eines Indikatorsystems für den zellulären Rdoxmetabolismus Geboren am 19.12.1971 in Heidelberg Reifeprüfung am 10.07.1991 in Nürnberg Studium der Fachrichtung Medizin von SS 1992 bis SS 1998 Physik am 15.03.1994 an der Universität Heidelberg Klinische Studie in Heidelberg Praktische Prüfung am 12.11.1998 in Kapstadt, Murten und Heidelberg Staatliche Prüfungen am 12.11.1998 an der Universität Heidelberg Promotion Fach: Biochemie Doktor: Prof. Dr. med. R. Heiner Schirmer Die Enzyme des Glutathionwechsels stellen einen wichtigen Bestandteil der antioxidativen Mechanismen dar.
In vivo
Veränderungen des Glutathion-Redox-Zyklus durch NO sind beispielsweise bei
Infektionen mit intrazellulären Parasiten von pathophysiologischer Bedeutung.
Die Untersuchung dieser Veränderungen könnte die Möglichkeit einer neuen und milderen Entwicklung eröffnen.
Wird die Einwirkung von Arzneimitteln durch gezieltes Modulieren von Arzneimitteln
A. S-Nitrosoglutathion (GSNO) im Glutathionmetabolismus Die Wirkung von GSNO auf zwei weitere Enzyme des Glutathionmetabolismus wurde nach der Inhibition der Glutathionreduktase durch GSNO (Becker et al., 1995) untersucht.
Glutathion-S-Transferase
-Klasse wird wettbewerbsfähig zu den beiden Substraten
Dies kann nicht bewirkt werden, wenn die Wirkung von Dinitrobenzol und Glutathion verhindert wird.
-Werte für CDNB und GSH mit 168
bzw. 180
M in einem physiologisch sinnvollen Bereich.
Dies gilt auch für Glutathionperoxidase. Reversible Auswirkungen von GSNO auf Glutathionperoxidase sind wahrscheinlich unbedeutend, aber aufgrund der Besonderheiten des Assay-Systems schwer zu quantifizieren.
Glutathionreductase wird bereits bei sehr geringen DNIC Konzentrationen gehemmt.
-Werte sind für DNIC-GSH
bei 1,5
, für DNIC-CYS
bei 16
- Die Hemmung .
Es ist jedoch möglich, dass die Zahl der Menschen, die sich in den letzten Jahren in der Industrie beschäftigt haben, in der Lage ist, sich zu verringern.
Es wurde gezeigt, dass die Aktivierung des Enzyms überlagert wurde.
Die Veränderung ist wahrscheinlich nicht für Flavin, da ApoGR, der Proteinanteil der GR nach Abtrennung von FAD, ebenfalls modifiziert wurde. Ein Vergleich der Inaktivierungskynetik des Wildtyps mit einem GR-Mutanten ohne die ersten 15 N-Terminal-Aminosäuren deutet darauf hin, dass der reaktive Cys2 für die beobachtete Inhibition irrelevant ist. Diese Erkenntnis ist wesentlich, da Cys2 kristallographisch nicht fällig ist.
Um den Hemme-Mechanismus zu klären, wurde das modifizierte Enzym kristallisiert. Die Röntgenabwehranalyse, die von S. Savvides und P.A. Karplus an der Cornell University durchgeführt wurde, ergab eine Elektronendichte Karte mit einer Auflösung von 1,7 Å, die ich eindeutig interpretieren konnte: In der durch DNIC-GSH modifizierten GR wird Cys63 zum Sulfinat oxidiert und Cys58 trägt ein Glutathionmolekül in Disulfidbindung. Die Modifikation von Cys63 erklärt die Irreversibilität der Enzym-Inaktivierung.
Der Einfluss von externen DNICs auf die GR intakte Zellen war erwartungsgemäß gering. Hier konnte unter Inkubationsbedingungen in CHO-Zellen und Erythrozyten selbst bei Konzentrationen von bis zu 100 nur eine Aktivitätsreduktion von 30% festgestellt werden. Das Wachstum von P. falciparum blieb unbeeinflusst durch DNICs im Medium.
Beide DNICs sind GSH-wettbewerbsfähige Glutathion-S-Transferase-Inhibitoren mit
niedrige K
-Werte von ca. 20 nM. Eine irreversible Veränderung des Enzyms wurde
C. Strukturvorhersagen zu Thioredoxinreduktase aus P. falciparum, einem potenziellen Zielmolekül von intrazellulären DNICs, basierend auf der abgeleiteten Aminosäurequenz der Thioredoxinreduktase wurden durch Computermodellierung mit der GR verglichen.
35 Prozent der Aminosäuren waren identisch.
Sie ist jedoch weniger dicht gepackt und weist deutliche Unterschiede bei der Substratbindung auf.
D. Glutathionreductase als quasi-psychologischer Redoxindikator für lebende Zellen 1. Mikro-Injektion von GR-Kristallen Zur Kristallisierung von GR bei geringer Ionstärke wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, mit hoher Wahrscheinlichkeit große, röntgenfähige Kristalle zu gewinnen. Bei diesen Kristallen sind Veränderungen im GR-Absorptionsspektrum abhängig von einer Reduktion des Drucks des umgebenden Kreises selbst als Farbschlag von rotem Milchkolben beobachtet zu werden. Daher sollten makroskuläre GR-Kristalle bei niedriger Ionenstärke für den Einsatz von Röntgenflächen in die Injektion von Röntgenflächen oder durch die Einmischung von Kleinglasen in die Injektion von Röntgenflächen eingesetzt werden.
2. Immunkomplexe endogener GR mit Mikro-Injektions-IgGs
Die cytoplasmatische und die nukleare GR wurden in
HeLa
-Zellen und
Keppler-Fibroblasten
Immunfluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen.
Wenn möglich, wurde das Anti(hGR) Serum mikroinjektiert, Fluoreszenzmarkierung durchgeführt.
Die intracytoplasmatische und intranukleoplasmatische Präsenz des Enzymes
Es wird deutlich nachweisbar, da sich die Immunpräpräzipate als Partikel
Diese Wirkung könnte ebenso wie der Einsatz von
Kristalle werden verwendet, um intrazelluläre Redoxpotenziale zu messen, weil
Immunprezipitierte GR behalten ihre enzymatischen und spektroskopischen Eigenschaften bei. Bei Peroxysomen und Lysosomen konnten erwartungsgemäß keine partikularen GR-IgG-Komplexe nachgewiesen werden. Messungen von intrasellulären GR-Partikeln sind nicht nur für pathophysiologische Fragen wie zum Beispiel die Auswirkungen von NO-Brädern von Interesse. Sie können auch als Qualitätskriterium für Organtransplantationen dienen, für deren Erfolg eine intakte Redoxmilieu der Zellen wahrscheinlich genauso wichtig ist wie die pH- oder ATP-Konzentration.