Andreas Fritz
Dr. med.
Einführung der molekulargenetischen Diagnostik für das Fragile-X-Syndrom.
Geboren am 23.02.1967 in Backnang
Reifeprüfung am 11.06.1986 in Backnang
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom SS 1989 bis WS 1996
Physikum am 03.04.1991 an der Universität Heidelberg
Klinisches Studium in Heidelberg
Praktisches Jahr in Durban, Südafrika (1. Tertial) und Bruchsal (2. und 3. Tertial)
Staatsexamen am 06.11.1996 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Humangenetik
Doktorvater: Prof. Dr. med. Dr. h.c. F. Vogel
Das Fragile-X-Syndrom wird auch als Marker-X-Syndrom oder Martin-Bell-Syndrom
bezeichnet und zählt mit einer Prävalenz von 1:4000 bei Männern und 1:6000 bei Frauen zu
den häufigsten Ursachen genetisch bedingter mentaler Retardierung. Im Kindesalter fallen die
männlichen Patienten weiterhin durch psychomotorische Entwicklungsretardierung und
Verhaltensstörungen auf. Die typische klinische Trias, auch Martin-Bell-Phänotyp genannt,
prägt sich meist erst postpubertär aus und umfaßt neben der mentalen Retardierung außerdem
Makroorchidismus sowie faziale Dysplasien mit länglichem Gesicht mit prominenter Stirn
und großen, abstehenden Ohren.
Bei cytogenetischen Untersuchungen fiel auf, daß unter bestimmten Kulturbedingungen auf
dem X-Chromosom bei Xq27.3 eine fragile Stelle auftrat. Genaugenommen handelt es sich
nicht um einen Chromosomenbruch, sondern um eine Stelle, wo durch eine veränderte
Anordnung der Nukleosomen die Chromatinstruktur verändert und deshalb schlechter
anfärbbar ist.
Mit Hilfe von molekulargenetischen Methoden konnte eine Expansion der
Trinukleotidsequenz (CGG)n im ersten Exon des FMR-1-Gens entdeckt werden. Bei
Personen, die nicht vom FXS betroffen sind, liegt ein Normalallel (S) vor, welches 6 bis 51
CGG-Wiederholungen umfaßt. Liegen 52 bis 200 CGG-Repeats vor, so spricht man von einer
Prämutation (S*), die im Gegensatz zum Normalallel instabil ist und die zur Vollmutation (L)
mit 200 bis mehr als 2.000 CGG-Repeats expandieren kann. Man spricht deshalb auch von
„dynamischer Mutation“ oder „triplet repeat mutation“. Wahrscheinlich findet die Transition
von der Prä- zur Vollmutation in einem frühen postzygotischen Stadium statt. Durch einen
Imprinting-Mechanismus expandieren nur die Prämutationen, die vom mütterlichen X-
Chromosom stammen. Vermutlich resultiert aus der CGG-Expansion die Methylierung einer
CpG-Insel der Promotor-Region des FMR-1-Gens, wodurch die Transkription des Gens
unterbunden wird. Dadurch entsteht ein Mangel an FMRP, das durch FMR-1 translatiert wird.
Wahrscheinlich hat dieses Protein die Funktion, RNA zu binden und dieses vom Zellkern zu
den Ribosomen zu transportieren. Vermutlich kommt es durch diesen Mangel an FMRP zu
einem gestörten Aufbau von Synapsen und Dendriten der Nervenzellen in bestimmten
Gehirnbezirken. Daraus könnten die mentale Retardierung sowie die neurologischen Defizite
der Patienten resultieren.
Die klinische Diagnostik dieser Erkrankung ist äußerst schwierig zu stellen, da die Symptome
inkonstant und sehr variabel auftreten. Dies trifft besonders für Frauen und Kinder zu, da die
Symptome hier geringer ausgeprägt und unspezifischer sind. Bevor diese Arbeit
aufgenommen wurde, konnte im Institut für Humangenetik nur die cytogenetische FXS-
Diagnostik durchgeführt werden. Nachdem die Leukozyten in folsäurearmem Medium unter
Zusatz von FUdR kultiviert wurden, konnten die fragilen Stellen im Karyogramm entdeckt
werden. Diese Methode war sehr zeit- und arbeitsaufwendig und außerdem unzuverlässig.
Besonders bei Frauen und bei Prämutationen konnten die Fragile-X-Chromosomen häufig
nicht dargestellt werden, was zu falsch negativen Befunden führte. Andererseits traten die
fragilen Stellen auch auf, wenn kein FXS vorlag.
Ziel dieser Arbeit war, am Institut für Humangenetik der Universität Heidelberg eine einfache,
sichere und kostengünstige molekulargenetische Diagnostik für das Fragile-X-Syndrom
einzuführen. Es wurde ein PCR-Protokoll entwickelt, mit dem männliche Patienten, die nicht
vom FXS betroffen sind, erkannt werden können. Dies funktioniert auch bei Patientinnen,
deren beide Allele eine ausreichend unterschiedliche Anzahl von CGG-Repeats aufweisen.
Anschließend werden die PCR-Produkte elektrophoretisch aufgetrennt, was entweder mittels
Agarosegel oder Polyacrylamidgel erfolgen kann. Die DNA wird durch Ethidiumbromid, bzw.
durch Silberionen angefärbt. Nachdem die Gele fotographiert wurden, kann die Länge der
Fragmente graphisch ermittelt werden, woraus sich die Diagnose ableiten läßt. Mit dieser
Methode gelingt die Diagnostik eines Großteils der Patienten.
Die anderen Fälle werden einer Southern-Blot-Analyse unterzogen, die zwar teurer und
zeitaufwendiger als die PCR, für eine sichere Diagnostik jedoch unumgänglich ist. Bei
männlichen Patienten reicht dabei der Einzelverdau der genomischen DNA mit dem
Restriktionsenzym Eco RI. Bei Frauen wird ein Doppelverdau durchgeführt, wobei zusätzlich
das methylierungssensitive Enzym Ecl XI verwendet wird. Dieser Doppelverdau eignet sich
besonders für die Identifizierung von Prämutationen. Soll eine genaue
Fragmentlängenbestimmung der Prämutation erfolgen, empfiehlt sich ein Verdau mit dem
Restriktionsenzym Pst I. Die verdaute DNA wird mittels Agarose-Gelelektrophorese separiert,
anschließend werden die DNA-Fragmente mittels Southern-Blot an eine Nylonmembran
fixiert. Eine radioaktiv markierte DNA-Sonde hybridisiert an das betreffende DNA-Fragment.
Nach Autoradiographie kann die Fragmentlängenanalyse erfolgen, woraus sich die Diagnose
ableitet. Bei männlichen Probanden erwartet man nach Eco RI-Verdau bei einem Normalallel
ein Fragment von 5,2 kb. Bei Patientinnen findet man nach dem Doppelverdau eine Bande bei
2,8 kb, die dem Allel auf dem aktiven X-Chromosom entspricht sowie eine Bande bei 5,2 kb,
die das Allel des inaktiven X-Chromosoms repräsentiert. Vollmutationen erkennt man an der
Expansion von mindestens 600 Bp. Wurde ein Doppelverdau durchgeführt, fällt zusätzlich die
Methylierung der Vollmutation auf. Prämutationen sind unmethyliert und weisen eine kleinere
CGG-Expansion auf.
Weitergehende Experimente, die auf den Nachweis von Vollmutationen mittels PCR oder auf
die alleinige FXS-Diagnostik mittels Nested PCR abzielten, wurden abgebrochen, da sich
zeigte, daß dadurch die Gefahr von falsch negativen Befunden bestanden hätte.
Mit diesem diagnostischen Konzept wird fast immer auf die cytogenetische FXS-Diagnostik
verzichtet werden können. Dies gilt jedoch nicht für die konstitutionelle
Chromosomenanalyse, die bei jedem Patienten mit mentaler Retardierung,
Entwicklungsverzögerung oder körperlichen Dysplasien durchgeführt werden sollte, um
andere chromosomale Ursachen diese Symptome nicht zu übersehen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden insgesamt 152 Patienten untersucht, von denen 99 Patienten
sowohl cytogenetisch als auch molekulargenetisch getestet wurden. Insgesamt konnten
innerhalb dieser Studie 14 FXS-Vollmutationen sowie eine Prämutation aufgedeckt werden.
Bei 96 Patienten waren die cytogenetischen und die molekulargenetischen Ergebnisse
konkordant. Bei einer Patientin konnte mittels Southern-Blot-Analyse eine Prämutation
nachgewiesen werden, die im cytogenetischen Test unerkannt blieb und bei den verbleibenden
zwei Fällen konnte die eindeutige Diagnose nur mit molekulargenetischen Methoden gestellt
werden.
Bei über 90% der untersuchten Personen konnte der Verdacht auf ein FXS nicht bestätigt
werden. Die Indikation zur FXS-Diagnostik wurde von den überweisenden Ärzten
offensichtlich großzügig gehandhabt. Eine genaue Analyse der klinischen Merkmale der
Patienten ergab, daß in vielen Fällen Symptome, die ganz untypisch für ein FXS wären,
vorgelegen hatten. Daraufhin wurde eine Checkliste erarbeitet, die allerdings einer
ausgiebigen klinischen Prüfung bedarf, bevor sie als Instrument der klinischen FXS-
Diagnostik eingesetzt werden könnte. Mit dieser Checkliste könnte ein Fragile-X-Score
ermittelt werden, womit die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen eines FXS abgeschätzt
werden könnte.
