Introdurre la diagnosi genetica molecolare della sindrome fragile X.

Andreas Fritz

Dott. Med. Introduzione della diagnosi genetica molecolare per la sindrome Fragile-X. Nato il 23.02.1967 a Heidelberg presso l'Università di Heidelberg test di maturità il 11.06.1986 a Backnang corso di specializzazione in medicina da SS 1989 a WS 1996 Fisica dal 03.04.1991 presso l'Università di Heidelberg Studi clinici a Heidelberg anno pratico a Durban, in Sudafrica (1. tertiale) e fracture (2. e 3. tertiale) esami di stato il 06.11.1996 presso l'Università di Heidelberg Promozione: Humenogenetica Dottor: Prof. Dr. Med. Dr. h.c. F. Vogel

Gli studi citogenetici hanno rilevato che, in determinate condizioni culturali,

Il cromosoma X ha avuto un punto fragile a Xq27.3.

Non per una rottura del cromosoma, ma per un punto in cui una mutazione

L'organizzazione dei nucleosomi altera la struttura della cromatina e quindi peggiora

L'espansione della sequenza dei trinucleotidi (CGG) nel primo esone del gene FMR-1 è stata rilevata con metodi geneticamente molecolari. In persone non affette da FXS, esiste un normale espansione (S) che comprende da 6 a 51 ripetizioni CGG. In presenza di 52 a 200 ripetizioni CGG, si parla di una premutazione (S*) che, a differenza della premutazione normale, è instabile e che può espandersi fino alla mutazione completa (L) con da 200 a più di 2.000 ripetizioni CGG.

Probabilmente questa proteina ha la funzione di legare l'RNA e di trasportarlo dal nucleo cellulare ai ribosomi. Probabilmente la mancanza di FMRP provoca un disturbo della struttura delle sinapsi e dei dendriti delle cellule nervose in determinate aree del cervello, che potrebbe causare il ritardo mentale e le carenze neurologiche dei pazienti.

La diagnosi clinica di questa malattia è estremamente difficile da formulare, poiché i sintomi sono in costanti e molto variabili. Questo è particolarmente vero per le donne e i bambini, poiché i sintomi qui sono meno evidenti e non specifici. Prima di iniziare questo lavoro, l'Istituto di Humane Genetics poteva eseguire solo la diagnosi citogenetica FXS. Dopo che i leucitici sono stati coltivati in un medio povero di folsa con l'aggiunta di FUdR, sono stati possibili rilevare i punti fragili nel caryogramma. Questo metodo è stato molto impegnativo e costoso e inoltre poco affidabile.

In particolare nelle donne e nelle pre-mutazioni, i cromosomi X fragili sono stati

In particolare, la Commissione ha proposto che le misure adottate per l'elaborazione di un programma di ricerca non siano state presentate, il che ha portato a conclusioni erroneamente negative.

L'obiettivo di questo lavoro era quello di introdurre all'Istituto di Humanacologia dell'Università di Heidelberg una diagnosi molecolare genetica semplice, sicura e conveniente per la sindrome fragile X. È stato sviluppato un protocollo di PCR che permette di identificare i pazienti maschi non affetti da FXS. Questo funziona anche in pazienti con entrambi gli alleli con un numero sufficientemente diverso di ripetizioni CGG.

I prodotti PCR vengono quindi separati elettroforeticamente, che può essere effettuato mediante

L'ADN può essere colorato da etidiumbromide o da ioni d'argento. Dopo aver fotografato i gelli, si può determinare graficamente la lunghezza dei frammenti, da cui si può concludere la diagnosi. Con questo metodo si riesce a diagnosticare una grande parte dei pazienti.

Gli altri casi sono sottoposti ad un'analisi di Southern Blot, che è più costosa e

La diagnosi è molto più costosa della PCR, ma è indispensabile per una diagnosi sicura.

I pazienti maschi sono sufficienti per la singola digestione del DNA genomico con

L'enzima di restrizione Eco RI.

L'enzima Ecl XI, che è sensibile al metillamento, è utilizzata.

In particolare per l'identificazione delle premutazioni.

Per determinare la lunghezza dei frammenti della premutazione, si consiglia di produrre una digestione

L'enzima di restrizione Pst I. Il DNA digerito viene separato mediante l'agarosio-gelectroporesi,

Poi i frammenti del DNA vengono trasformati in una membrana di nylon attraverso un blocco meridionale

Una sonda di DNA radioattivamente contrassegnata si ibrida al frammento di DNA in questione. L'autaradiografia permette di effettuare l'analisi della lunghezza dei frammenti, da cui deriva la diagnosi.

Esperienze avanzate che consentono di rilevare mutazioni complete mediante PCR o su

le singole diagnosi di FXS effettuate con Nested PCR sono state cancellate perché:

L'analisi dei cromosomi costituzionali, che dovrebbe essere eseguita in ogni paziente con ritardo mentale, ritardo di sviluppo o displasie fisiche, per evitare che altre cause cromosomiche ignorino questi sintomi.

In questo studio sono stati esaminati un totale di 152 pazienti, di cui 99 pazienti sottoposti a test sia citogenetici che molecolari, che hanno rilevato 14 mutazioni complete di FXS e una premutazione.

In 96 pazienti, i risultati sono stati citogenetici e molecolari.

In un paziente, l'analisi del blocco meridionale ha rilevato una premutazione

I test citogenetici non sono stati rilevati e non sono stati rilevati nei test citogenetici.

In due casi, la diagnosi definitiva è stata fatta solo con metodi genetici molecolari.

L'indicazione per la diagnosi di FXS è stata manifestamente generosa da parte dei medici che l'hanno ricondotta. Un'analisi approfondita delle caratteristiche cliniche dei pazienti ha rilevato che, in molti casi, i sintomi erano completamente non tipici per un FXS. In seguito, è stato elaborato un checklist che, tuttavia, richiede un esame clinico approfondito prima di essere utilizzato come strumento per la diagnosi clinica di FXS. Questo checklist potrebbe determinare un fragile X-score che potrebbe valutare la probabilità di esistenza di un FXS.