Einführung der molekularen genetischen Diagnose für das Fragile-X-Syndrom.
Andreas Fritz
Dr. Med. Einführung der molekularen genetischen Diagnose für das Fragile-X-Syndrom. Geboren am 23.02.1967 an der Universität Heidelberg Reifeprüfung am 11.06.1986 in Backnang Studiengang der Fachrichtung Medizin von SS 1989 bis WS 1996 Physik am 03.04.1991 an der Universität Heidelberg Klinische Studie an der Universität Heidelberg Praxisjahr in Durban, Südafrika (1. Tertial) und Bruchsal (2. und 3. Tertial) Staatsuntersuchungen am 06.11.1996 an der Universität Heidelberg Promotion: Humanogenetik Doktorat: Prof. Dr. Med. Dr. h.c. F. Vogel Der Fragile-X-Syndrom wird auch als Marker X-Syndrom oder Martin-B-Syndrom bezeichnet und umfasst eine Verzögerung von 1:4000 und eine Verzögerung von 1.600 m. bei Patienten mit psychischer und psychischer Verzögerung, die sich häufig bei den Frauen mit einer vorgeblichen und vorgeblichen Verzögerung von Mental- und Mental-Retromerkrankungen entwickelt.
Bei cytogenetischen Untersuchungen wurde festgestellt, daß unter bestimmten Kulturbedingungen
Der X-Chromosom hat sich in Xq27.3 in einer schwachen Stelle befinden lassen.
Nicht um einen Chromosomenbruch, sondern um einen Punkt, an dem durch eine veränderte
Die Anordnung der Nukleosomen verändert die Chromatinstruktur und schlechter
Eine Expansion der Trinukleotidsequenz (CGG) im ersten Exon des FMR-1-Gens konnte durch molekulare genetische Methoden entdeckt werden. Bei Personen, die nicht von FXS betroffen sind, gibt es ein Normalallel (S), das 6 bis 51 CGG-Wiederholungen umfasst. Bei 52 bis 200 CGG-Wiederholungen handelt es sich um eine Prämutation (S*), die im Gegensatz zum Normalallel unstabil ist und zu Vollmutation (L) mit 200 bis mehr als 2.000 CGG-Wiederholungen führen kann.
Wahrscheinlich hat dieses Protein die Funktion, RNA zu binden und dieses vom Zellkern zu den Ribosomen zu transportieren. Wahrscheinlich führt dieser Mangel an FMRP zu einer gestörten Aufbauung von Synapsen und Dendriten der Nervenzellen in bestimmten Gehirnregionen, was zu geistiger Verzögerung und neurologischen Defiziten bei Patienten führen könnte.
Die klinische Diagnose dieser Erkrankung ist äußerst schwierig zu stellen, da die Symptome unbeständig und sehr variabel auftreten. Dies gilt insbesondere für Frauen und Kinder, da die Symptome hier weniger ausgeprägt und unspezifisch sind. Bevor diese Arbeit aufgenommen wurde, konnte nur die cytogenetische FXS-Diagnose im Institut für Humanogenetik durchgeführt werden. Nachdem die Leukozyten in einem flüssigen Medium mit Zusatz von FUdR kultiviert wurden, konnten die fragilen Stellen im Karyogramm entdeckt werden. Diese Methode war sehr zeitaufwendig und aufwendig und außerdem unzuverlässig.
Vor allem bei Frauen und bei Prämutationen konnten die schwachen X-Chromosomen häufig
Das Problem ist, daß es sich nicht um die Veröffentlichung von Informationen handelt, was zu falschen negativen Ergebnissen geführt hat.
Das Ziel dieser Arbeit war es, eine einfache, sichere und kostengünstige molekulare genetische Diagnose für das Fragile-X-Syndrom am Institut für Humane Genetik der Universität Heidelberg einzuführen. Es wurde ein PCR-Protokoll entwickelt, mit dem männliche Patienten, die nicht von FXS betroffen sind, identifiziert werden können. Dies funktioniert auch bei Patienten, deren beide Allele eine ausreichend unterschiedliche Anzahl von CGG-Repeats aufweisen.
Anschließend werden die PCR-Produkte elektrophoretisch getrennt, was entweder durch
Die DNA wird durch Ethidiumbromid oder Silber-Ionen gefärbt. Nach dem Fotografieren der Gele kann die Länge der Fragmente graphisch ermittelt werden, wodurch die Diagnose abgeleitet werden kann. Mit dieser Methode gelingt die Diagnose eines Großteils der Patienten.
Die übrigen Fälle werden von einer Southern-Blot-Analyse unterzogen, die zwar teurer und
Es ist jedoch unerlässlich, eine sichere Diagnose zu stellen.
Bei männlichen Patienten reicht es aus, die einzelne Verdauung der genomischen DNA mit
Bei Frauen wird eine doppelte Verdauung durchgeführt.
Das Methylierungssensitive Enzym Ecl XI wird verwendet.
Es ist wichtig, dass eine genaue
Es wird empfohlen, eine Verdauung mit
Restriktionsenzym Pst I. Das verdaute DNA wird durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt,
Dann werden die DNA-Fragmente durch einen südlichen Blatt in eine Nylonmembran verwandelt.
Eine radioaktiv gekennzeichnete DNA-Sonde wird an das betreffende DNA-Fragment hybridiert. Nach Autoradiographie kann die Fragmentlängeanalyse durchgeführt werden, aus der die Diagnose abgeleitet wird. Bei männlichen Probanden wird nach Eco RI-Verdauung bei einem normalen Allel ein Fragment von 5,2 kb erwartet. Bei Frauen nach dem Doppelverdauung findet man einen Band von 2,8 kb, der dem Allel auf dem aktiven X-Chromosom entspricht, sowie einen Band von 5,2 kb, der das Allel des inaktiven X-Chromosoms repräsentiert. Vollmutationen werden bei einer Expansion von mindestens 600 bp erkannt. Bei einer Doppelverdauung fällt die Methode der Vollverdauung auf. Bei Prothesen wird eine unmethylierte und bei CGG eine kleine Expansion auf dem inaktiven X-Chromosom erfolgt.
Weiterführende Experimente zur Ermittlung von Vollmutationen durch PCR oder
Die alleinige FXS-Diagnostik mit Nested PCR wurde abgebrochen, da
Das ist jedoch nicht der Fall für die konstitutionelle Chromosomenanalyse, die bei jedem Patienten mit mentaler Verzögerung, Entwicklungsverzögerung oder körperlicher Dysplasie durchgeführt werden sollte, um andere Chromosomalursachen dieser Symptome nicht zu übersehen.
In dieser Studie wurden insgesamt 152 Patienten untersucht, von denen 99 sowohl cytogenetisch als auch molekular genetisch getestet wurden. Insgesamt konnten 14 FXS-Fullmutationen sowie eine Prämutation entdeckt werden.
In 96 Patienten wurden die cytogenetischen und molekulargenetischen Ergebnisse
Eine Patientin konnte durch eine Southern-Blot-Analyse eine Prämutation
Es ist zu beobachten, dass in der cytogenetischen Untersuchung nicht erkannt wurde, und bei den übrigen
In zwei Fällen konnte die eindeutige Diagnose nur durch molekulare genetische Methoden gestellt werden.
Eine genaue Analyse der klinischen Merkmale der Patienten ergab, dass in vielen Fällen Symptome aufgetreten waren, die für einen FXS völlig untypisch wären. Anschließend wurde eine Checkliste erstellt, die jedoch eine ausführliche klinische Prüfung erfordert, bevor sie als Instrument zur klinischen FXS-Diagnostik eingesetzt werden kann. Mit dieser Checkliste könnte ein fragiler X-Score ermittelt werden, der die Wahrscheinlichkeit für das Vorhandensein eines FXS einschätzen könnte.