Christina Fauser
Dr. med.
Design und Charakterisierung von Primern und Sonden auf dem 18S rRNA-Gen zur
molekularen Diagnostik von Mykosen
Geboren am 12. 11. 1971 in Ulm
Reifeprüfung am 11. 06. 1991
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom WS 1991 bis SS 1998
Physikum am 30. 08. 1993 an der Universität Heidelberg
Klinisches Studium in Heidelberg
Praktisches Jahr in Heidelberg/ Houston,Texas
Staatsexamen am 15. 06. 1998 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Hygiene
Doktorvater: Herr Priv.-Doz. Dr. med. R. Kappe
Invasive Mykosen sind lebensbedrohliche Erkrankungen vor allem schwerkranker,
immungeschwächter Patienten. Nur frühzeitige Diagnostik und gezielte antimykotische
Therapie ermöglichen das Überleben der Patienten. Testsysteme sollten sensitiv und
spezifisch für Pilzinfektionen sein, häufige Erreger differenzieren und innerhalb eines
Arbeitstages durchführbar sein. Die mikroskopische Untersuchung von Patientenmaterial, die
kulturelle Anzüchtung der Pilze und serologische Verfahren zum Pilz-Antikörper- und -
Antigen-Nachweis erfüllen diese Anforderungen nur teilweise. Die in der vorliegenden Arbeit
eingesetzten molekularbiologischen Verfahren zur Pilz-Identifizierung sind innerhalb eines
kurzen Zeitraums durchzuführen, nicht auf lebende Pilzzellen angewiesen und bei geeigneter
Oligonukleotid-Wahl sensitiv und spezifisch.
Um unter einer großen Zahl opportunistischer Erreger selektiv die sehr uneinheitliche Gruppe
der mykotischen Erreger abzugrenzen, wurde eine Polymerase-Ketten-Reaktion mit
breitreaktiven, pilzspezifischen Primern durchgeführt. Vier in der Arbeit näher
charakterisierte Primerpaare erwiesen sich als geeignet, da durch sie von 67 Pilzspecies und
11 Kontrollen weitgehend alle medizinisch relevanten Pilze amplifiziert wurden, jedoch keine
Kreuzreaktionen mit DNA aus Mensch, Bakterie oder Parasit auftraten.
Zur Bestätigung der Pilzinfektion und zur Zuordnung des Pilzes zu einer der Hauptgruppen
Hefen, Schimmel, Dermatophyten und dimorphe Pilze wurden die PCR-Amplifikate mit
Pilzgruppen-spezifischen Oligonukleotiden hybridisiert. Die verwendeten vier
Oligonukleotide entsprachen den Anforderungen an gruppenspezifische Sonden, da sie
jeweils mit allen wichtigen Vertretern der einzelnen Pilzgruppen hybridisierten, nicht jedoch
mit Pilzen aus den jeweils anderen Pilzgruppen.
Der Sensitivitätsvergleich molekularer und konventioneller Verfahren anhand einer
Verdünungsreihe mit Candida-Sproßzellen ergab, daß der Nachweis von Candida-Zellen
mittels PCR und Mikroskopie um zwei Zehnerpotenzen, der Nachweis mittels Antigen-Test
um drei Zehnerpotenzen unempfindlicher als der kulturelle Nachweis ist. Die Kultur wies
eine einzige lebende Zelle nach. Mit dem empfindlichsten Primerpaar lag die Nachweisgrenze
präparierter Candida-DNA bei 250 fg. Der Nachweis von Pilzzellen in klinischem Material
zeigte sich gegenüber dem Nachweis von Pilzzellen in reinem Wasser oder Kochsalz als
erschwert:
PCR-Amplifikation von DNA aus Pilz-Reinkulturen ist ohne Vorbehandlung möglich; der
Anteil an Zellen, die spontan platzen und DNA freigeben, ist jedoch insgesamt gesehen gering
(<1%) und reicht bei wenigen Pilzen und bei Anwesenheit von Inhibitoren nicht immer für
die PCR aus. Durch Protoplastierung der Pilze wird der Anteil lysierter Zellen auf über 90 %
erhöht.
Klinisches Material, Enzympuffer und Zellbestandteile der Pilzzelle selbst enthalten
Inhibitoren. Bei der Inhibitoren-Abtrennung geht DNA verloren, was zu einem ca. 10-fachen
Sensitivitätsverlust gegenüber einer inhibitorenfreien unbehandelten Candida-Suspension
führt.
Die für die Einbettung von Gewebeschnitten in Paraffin nötige Formalinfixierung führt zu
Vernetzungen zwischen DNA und Proteinen, die einen Amplifikations-Abbruch bei der
anschließenden PCR zur Folge haben, der um so mehr ins Gewicht fällt, je größer das
Amplifikationsprodukt ist. Mit Primerpaaren, deren Amplifikat kleiner 200 Basenpaare ist,
wurde jedoch in der vorliegenden Arbeit erfolgreich DNA aus Formalin-fixierten und in
Paraffin eingebetteten Pilzmyzelien amplifiziert.
Für die Labor-Diagnostik bleiben - trotz einer Reihe von Vorteilen der PCR - Kultur und
Mikroskopie weiterhin die Goldstandard-Methoden.
Immunologische und molekularbiologische Verfahren sind der konventionellen
Labordiagnostik in einzelnen Teilbereichen überlegen (z.B. bei Untersuchung von
abgestorbenem Pilzmaterial in Paraffinblöcken oder von Patientenproben, die wenig lebende
Pilzzellen enthalten). Für die Anwendung molekularer Methoden in der Routine-Diagnostik,
in Form einfach zu handhabender Kits, müssen jedoch die bis jetzt sehr aufwendigen DNA-
Präparations- und InhibitorenAbtrennungs-Verfahren, die bei der Aufarbeitung von
klinischem Material für die PCR meist unvermeidbar sind, noch weiter vereinfacht werden.
