Progettazione e caratterizzazione dei primari e delle sonde sul gene 18A rRNA per la diagnosi molecolare delle miocene
Christina Fauser
Dott. medico progettazione e caratterizzazione dei primari e delle sonde sul gene 18S rRNA per la diagnosi molecolare della micosi nato il 12 novembre 1971 a Ulm test di maturità l'11 giugno 1991 corso della facoltà di medicina dal WS 1991 al SS 1998 fisica il 30 agosto 1993 presso l'università di Heidelberg studio clinico a Heidelberg anno pratico a Heidelberg/Houston, Texas Examinamento statale il 15 giugno 1998 presso l'università di Heidelberg corso di laurea: dottorato di ricerca in igiene: Dott.
La selezione degli oligonucleotidi è sensibile e specifica. Per selezionare in modo selettivo tra un gran numero di agenti opportunistici il gruppo molto disunico di agenti micotici, è stata eseguita una reazione a catena di polimerasi con primari specifici di funghi larghi. Quattro coppie di primari caratterizzate più a fondo nel lavoro sono risultate adatte, poiché da 67 specie di funghi e 11 controlli sono state amplificate in gran parte tutte le funghi medicamente rilevanti, ma non sono state verificate reazioni cruciali con DNA umano, batterico o parassita.
Per confermare l'infezione fungina e per classificare il fungo come uno dei principali gruppi di funghi avvelenati, funghi, dermatophytici e dimorfici, gli amplificanti PCR sono stati ibridati con oligonucleotidi fungini specifici, i quattro oligonucleotidi utilizzati soddisfacevano i requisiti per le sonde specifiche del gruppo in quanto ibridano con tutti i principali rappresentanti dei singoli gruppi di funghi, ma non con funghi provenienti dagli altri gruppi di funghi.
Il confronto di sensibilità di metodi molecolari e convenzionali basato su un metodo
Sezione di diluzione con
Candida
-Le cellule staminali hanno rilevato che la prova di
Candida
- Le cellule
con PCR e microscopia a 2 decimal potenze, la prova mediante test antigeno
per tre decimi
La cultura non è più sensibile che la prova culturale.
con la coppia di primari più sensibile era il limite di prova
Preparazione
Candida
-DNA a 250 eg. Il rilevamento di cellule fungine in materiale clinico
la presenza di funghi in acqua pura o in sale di cottura è risultata complicata: l'amplificazione PCR di DNA proveniente da colture di funghi è possibile senza pre-trattamento; tuttavia, la percentuale di cellule che esplodono spontaneamente e rilasciano DNA è relativamente bassa (< 1%) e non è sempre sufficiente per la PCR in pochi funghi e in presenza di inibitori.
contenenti materiale clinico, buffer enzimatici e componenti cellulari della cellula fungina stessa
Gli inibitori. Quando gli inibitori vengono separati, il DNA viene perso, il che significa una perdita di circa 10 volte maggiore.
Sensibilità
perdita rispetto ad un trattamento senza inibitori
Candida
-Sospensione
La formalizzazione necessaria per l'inserimento di incisioni di tessuto in paraffina porta a collegamenti tra DNA e proteine che provocano un abbattimento di amplificazione nella PCR successiva, che si riduce di più in peso più il prodotto di amplificazione è grande.
Per la diagnosi di laboratorio, nonostante i vantaggi della PCR, la cultura e la microscopia continuano ad essere i metodi gold standard. Le procedure immunologiche e molecolari biologiche sono superiori a quelle di laboratorio convenzionali in alcuni settori (ad esempio, nell'esame di materiale fungico morto in blocchi di paraffina o di campioni di pazienti che contengono poche cellule fungine viventi). Per l'applicazione di metodi molecolari nella diagnosi di routine, in forma di kit semplici da gestire, tuttavia, devono essere ulteriormente semplificate le procedure di riparazione del DNA e di separazione degli inibitori, fino ad ora molto complicate, che sono in genere inevitabili nella lavorazione di materiale clinico per la PCR.