Design und Charakterisierung von Primoren und Sonden auf dem 18A rRNA-Gen für die molekulare Diagnostik von Mycosen
Christina Fauser
Dr. med. Design und Charakterisierung von Primern und Sonden auf dem 18S rRNA-Gen für die molekulare Diagnose von Mycosen geboren am 12.11.1971 in Ulm Reifeprüfung am 11.6.1991 Studiengang der Fachschule Medizin von WS 1991 bis SS 1998 Physik am 30.8.1993 an der Universität Heidelberg Klinische Studie in Heidelberg
Oligonukleotid-Auswahl ist sensibel und spezifisch. Um die sehr unterschiedliche Gruppe der Mykotikerreger unter einer großen Anzahl opportunistischer Erreger selektiv zu identifizieren, wurde eine Polymerase-Kette-Reaktion mit breitaktiven, fungal-spezifischen Primaren durchgeführt. Vier in der Arbeit detaillierter charakterisierte Primärpaare zeigten sich als geeignet, da sie durch 67 Pilzspezies und 11 Kontrollen weitgehend alle medizinisch relevanten Pilze verstärkt haben, jedoch keine Kreuzreaktionen mit DNA aus Menschen, Bakterien oder Parasiten aufgetreten sind.
Zur Bestätigung der Pilzinfektion und zur Zuordnung der Pilze zu einer der Hauptgruppen Hefe, Schimmel, Dermatophyten und dimorphe Pilze wurden die PCR-Amplifikate mit Pilzgruppen-spezifischen Oligonukleotiden hybridiert. Die vier verwendeten Oligonukleotiden erfüllten die Anforderungen an Gruppen-spezifische Proben, da sie jeweils mit allen wichtigen Vertretern der einzelnen Pilzgruppen hybridierten, jedoch nicht mit Pilzen aus den jeweils anderen Pilzgruppen.
Die Sensitivitätsvergleichung von molekularen und konventionellen Verfahren auf der Grundlage eines
Schmelzungsreihe mit
Candida
-Strahlzellen ergaben, dass die Nachweis von
Candida
-Zellen
die Nachweis durch Antigen-Test durch PCR und Mikroskopie von zwei Zehntelpotenzen
um drei Zehner
Die Kultur hat sich in der Tat als unempfindlicher erwiesen als das kulturelle Beweismittel.
mit dem empfindlichsten Primärpaar lag die Grenze für den Nachweis
Vorbereitet
Candida
-DNA bei etwa 250 Fungalzellen in klinischem Material
Im Vergleich zum Nachweis von Pilzzellen in reinem Wasser oder Kochsalz war es schwierig: PCR-Amplifizierung von DNA aus Pilzreinkulturen ist ohne Vorbehandlung möglich; der Anteil an Zellen, die spontane Blasen und DNA freisetzen, ist jedoch insgesamt gering (< 1%) und bei wenigen Pilzen und im Vorhandensein von Inhibitoren nicht immer ausreichend für die PCR. Durch Protoplastierung der Pilze wird der Anteil an Lytherzellen auf mehr als 90% erhöht.
Es enthält klinisches Material, Enzympuffer und Zellbestandteile der Pilzzelle selbst
Inhibitoren. Bei der Abtrennung von Inhibitoren wird DNA verloren, was zu einem 10-fachen
Empfindlichkeit
Verlust gegenüber einem inhibitorfreien Unbehandelten
Candida
-Suspension
Die Formalisierung, die für die Einbeziehung von Gewebeschnitten in Paraffin erforderlich ist, führt zu Verknüpfungen zwischen DNA und Proteinen, die zu einer Verstärkung bei der anschließenden PCR führen, die je mehr Gewicht verliert, je größer das Verstärkungsprodukt ist.
Im Bereich der Labordiagnostik bleiben - trotz einer Reihe von Vorteilen der PCR - Kultur und Mikroskopie die Goldstandardmethoden. Immunologische und molekularbiologische Verfahren sind in einzelnen Bereichen überlegen gegenüber herkömmlicher Labordiagnostik (z. B. bei der Untersuchung von abgestorbenem Pilzmaterial in Paraffinblöcken oder von Patientenproben, die wenig lebende Pilzzellen enthalten). Für die Anwendung molekularer Methoden in der Routine-Diagnostik, in Form von einfach zu bedienenden Kits, müssen jedoch die bislang sehr aufwendigen DNA-Reparations- und Inhibitor-Abweichungsprozesse, die bei der Verarbeitung von klinischem Material für PCR meist unvermeidlich sind, noch weiter vereinfacht werden.