ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO
DE CEPAS BACTERIANAS
DEGRADADORAS DE FÁRMACOS
PRESENTES EN LODOS DE
DEPURADORA
CARMEN MEJÍAS PADILLA
FACULTAD DE FARMACIA
UNIVERSIDAD DE SEVILLA
INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y
AGROBIOLOGÍA DE SEVILLA
CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
TRABAJO FIN DE MÁSTER
MÁSTER EN ESPECIALIZACIÓN PROFESIONAL
EN FARMACIA: INDUSTRIA FARMACÉUTICA
ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO DE CEPAS BACTERIANAS DEGRADADORAS DE FÁRMACOS
PRESENTES EN LODOS DE DEPURADORA
CARMEN MEJÍAS PADILLA
TIPOLOGÍA DE PROYECTO: EXPERIMENTAL
DEPARTAMENTO DE FARMACIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA
TUTORES:
DOCTOR DON JOSÉ IGNACIO PÉREZ MARTÍNEZ
DOCTORA DOÑA ESMERALDA MORILLO GONZÁLEZ
Luga de p esen ación: Facul ad de Fa macia
Fecha de p esen ación: julio 2020
JOSÉ IGNACIO PÉREZ MARTÍNEZ, P o eso del Depa amen o de Fa macia y Tecnología
Fa macéu ica de la Uni e sidad de Se illa,
INFORMA, que el p esen e abajo i ulado “En iquecimien o y aislamien o de cepas
bac e ianas deg adado as de á macos p esen es en lodos de depu ado a” ha sido ealizado,
bajo mi u o ización y aseso amien o, den o del Depa amen o de Fa macia y Tecnología
Fa macéu ica du an e el cu so académico 2019/20, cons i uyendo la memo ia que p esen a la
Lda. CARMEN MEJÍAS PADILLA como T abajo Fin de Más e del Más e en Especialización
P o esional en Fa macia, especialidad Indus ia Fa macéu ica, y que cumple los equisi os
necesa ios pa a se p esen ado como T abajo Fin de Más e .
Y pa a que cons e, a los e ec os opo unos, se expide el p esen e in o me en Se illa, a 6 de
julio de 2020.
Fdo.: JOSÉ IGNACIO PÉREZ MARTÍNEZ
VºBº
Fdo.: MARÍA LUISA GONZÁLEZ RODRÍGUEZ
Di ec o del Depa amen o
1
RESUMEN
La ges ión de lodos de depu ado as cons i uye un impo an e p oblema medioambien al. G an
pa e se aplica como enmienda o gánica en ag icul u a y los con aminan es o gánicos que
con ienen, en e ellos, á macos como ibup o eno, pa ace amol, ca bamazepina u o loxacino,
se acumulan en los suelos, con aminando aguas supe iciales y sub e áneas, concen ándose
en plan as y animales, y en los se es humanos a a és de la cadena alimen a ia, siendo
undamen al la bio emediación de es os lodos median e di e en es écnicas ales como el
bioaumen o, con bac e ias deg adado as especí icas de cada con aminan e.
Es po ello, que el obje i o del p esen e abajo es la búsqueda y aislamien o de cepas
bac e ianas deg adado as especí icas de los ci ados á macos. Conc e amen e se ob u ie on
median e la écnica de cul i os de en iquecimien o del lodo con dichos á macos el
aislamien o de 3 cepas bac e ianas pa a ibup o eno (I1, I2 e I3), 4 pa a pa ace amol (P1, P2, P3
y P4), 5 pa a ca bamazepina (C1, C2, C3, C4 y C5) y 5 pa a o loxacino (O1, O2, O3, O4 y O5).
La demanda biológica de oxígeno (DBO) es una p ueba pa a de e mina que las cepas
bac e ianas aisladas son capaces de usa los dis in os á macos como única uen e de ca bono
y ene gía. En es a p ueba se obse ó que sólo las cepas bac e ianas C3, C5, P1, P2 y P3 son
po encialmen e deg adado as de ca bamazepina y pa ace amol en solución acuosa,
espec i amen e.
Palab as cla es: biodeg adación, PPCPs, lodo, cepa bac e iana.

2
ABSTRACT
The managemen o sewage sludge cons i u es a big en i onmen al p oblem. The sludge is
usually applied as an o ganic amendmen in ag icul u e and he o ganic pollu an s ha i
con ains, among hem, d ugs such as ibup o en, pa ace amol, ca bamazepine o o loxacin,
accumula e in soils, con amina ing su ace and unde g ound wa e s, concen a ing in plan s
and animals, and in he human h ough he ood chain, being undamen al he bio emedia ion
o hese sludges by di e en echniques such as bioaugmen a ion, wi h speci ic deg ading
bac e ia o each pollu an .
Fo his eason, he objec i e o his wo k is o sea ch and o isola e speci ic bac e ial
deg ading s ains o he men ioned d ugs. Speci ically, we isola ed 3 bac e ial s ains o
ibup o en (I1, I2 and I3), 4 o pa ace amol (P1, P2, P3 and P4), 5 o ca bamazepine (C1, C2,
C3, C4 and C5) and 5 o o loxacin (O1, O2, O3, O4 and O5). These bac e ias we e ob ained
using he sludge en ichmen cul u e echnique wi h hese d ugs.
Biological oxygen demand (BOD) is a es o de e mine ha isola ed bac e ial s ains a e
capable o using he di e en d ugs as he only sou ce o ca bon and ene gy. In his es i was
obse ed ha only he bac e ial s ains C3, C5, P1, P2 and P3 a e po en ially deg ade s o
ca bamazepine and pa ace amol in aqueous solu ion, espec i ely.
Key wo ds: biodeg ada ion, PPCPs, sludge, bac e ial s ain.
3
ÍNDICE
RESUMEN .............................................................................................................................. 1
ABSTRACT .............................................................................................................................. 2
ÍNDICE ................................................................................................................................... 3
LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................................... 5
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................... 5
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................. 6
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 7
1.1. Es aciones Depu ado as de Aguas Residuales (EDARs)………………………………………………….7
1.2. T a amien os de lodos de depu ado a………………………………………………………………………….9
1.3. Con aminan es o gánicos en lodos de depu ado a……………………………………………………..12
1.3.1. P oduc os a macéu icos y de higiene pe sonal (PPCPs) en lodos de
depu ado a…………………………………………………………………………………………………………………..14
1.4. P oblemá ica medioambien al de i ada de la p esencia de PPCPs en lodos de
depu ado a……………………………………………………………………………………………………………………….16
1.5. Bio ecupe ación de lodos de EDARs……………..……………………………………………………………18
1.5.1. Mic oo ganismos po encialmen e deg adado es de PPCPs en lodos de
EDARs………........................................................................................................................20
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................. 22
3. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................................... 23
3.1. Ma e iales ....................................................................................................................... 23
3.1.1. Fá macos ................................................................................................................. 23
3.1.1.1. O loxacino ....................................................................................................... 23
3.1.1.2. Ca bamazepina ................................................................................................ 23
3.1.1.3. Pa ace amol .................................................................................................... 24
3.1.1.4. Ibup o eno…………………………………………………………………………...………………..……....24
3.1.2. Lodo ........................................................................................................................ 25
3.1.3. Cepas bac e ianas.................................................................................................... 26
3.1.4. Solución de nu ien es (SNs) .................................................................................... 26
3.1.5. Medios de cul i o .................................................................................................... 27
3.2. Mé odos ......................................................................................................................... 28
4
3.2.1. En iquecimien o del lodo pa a la ob ención de conso cios mic obianos
deg adado es especí icos .................................................................................................. 28
3.2.2. Aislamien o de cepas bac e ianas deg adado as especí icas .................................... 30
3.2.3. P epa ación de los inóculos de las cepas bac e ianas ............................................... 31
3.2.4. Demanda biológica de oxígeno ................................................................................ 32
3.2.5. Análisis de los á macos ........................................................................................... 35
3.2.6. Ensayos de biodeg adación de á macos en solución en p esencia de cepas
bac e ianas ....................................................................................................................... 36
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................................... 40
4.1. Aislamien o de cepas bac e ianas deg adado as de los dis in os á macos ...................... 40
4.2. Demanda biológica de oxígeno ........................................................................................ 42
4.3. Análisis de los á macos as los expe imen os de DBO .................................................... 45
4.4. Biodeg adación de los á macos en solución en p esencia de cepas bac e ianas .............. 47
5. CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 48
6. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 49
5
LISTA DE ABREVIATURAS
AINE: An iin lama o io no Es e oideo
COX: Ciclooxigenasa
DBO: Demanda Biológica de Oxígeno
EDARs: Es aciones Depu ado as de Aguas Residuales
EPA: Agencia de P o ección Medioambien al de los Es ados Unidos
HPLC: C oma og a ía Líquida de Al a Resolución
LAS: Sul ona os de Alquilbenceno Lineales
LB: Lu ia-Be ani Medium
NPEs: Nonil enole oxilados
MSM: Mine al Sal Medium
PAHs: Hid oca bu os A omá icos Policíclicos
PCBs: Policlo obi enilos
PCDD/Fs: Dioxinas y u anos
POPs: Pe sis en O ganic Pollu an s
PPCPs: Pha maceu ical and Pe sonal Ca e P oduc s
SNs: Solución de Nu ien es
WRF: Whi e Ro Fungi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figu a 1. Esquema de la gene ación y a amien o de lodos…………………………………………..7
Figu a 2. T a amien os a los que son some idos los lodos ob enidos en EDARs……………10
Figu a 3. Biodeg adación ae obia y mine alización…………………………………………………………19
Figu a 4. Bioaumen o y bioes imulación…………………………………………………………………………19
Figu a 5. Es uc u a química de o loxacino………………………………………………………………………23
Figu a 6. Es uc u a química de ca bamazepina………………………………………………………………24
Figu a 7. Es uc u a química de pa ace amol…………………………………………………………………..24
Figu a 8. Es uc u a química de ibup o eno…………………………………………………………………….25
Figu a 9. Esquema del en iquecimien o del lodo…………………………………………………………….29
Figu a 10. Esquema del aislamien o de cepas bac e ianas………………………………………………30
Figu a 11. Esquema del p oceso de p epa ación del inóculo de cada cepa bac e iana……31
Figu a 12. Reacción química en el oxi op………………………………………………………………………….32
Figu a 13. Esquema de la p epa ación del ensayo de DBO con pa ace amol y
o loxacino…………………………………………………………………………………………………………………………33
12
Suelos Con aminados, además de la no ma i a especí ica (RD 1310/1990) que egula la
aplicación de los lodos a los suelos ag ícolas y que inco po a la Di ec i a 86/278 (EC, 1986)
ela i a a la p o ección del medio ambien e y, en pa icula de los suelos, en la u ilización de
los lodos de depu ado a en ag icul u a. La ges ión y a amien o de lodos en España se ealiza
con o me a lo que es ablece la Ley 22/2011, de 28 de julio de esiduos y suelos con aminados.
Es po ello que en Andalucía se ap obó la O den de 6 de agos o de 2018 (BOJA de 13 de agos o
de 2018) de la Conseje ía de Ag icul u a, Pesca y Desa ollo Ru al y de la Conseje ía de Medio
Ambien e y O denación del Te i o io, po la que se egula la u ilización de lodos a ados de
depu ado a en el sec o ag a io. De acue do a dicha O den, po p ime a ez se p ohíbe la
aplicación di ec a de lodos en ag icul u a, y solo se á posible aplica los si p e iamen e han sido
a ados median e algunos de los mé odos que se p oponen. Uno de los cuales es el
compos aje, que es un p oceso de ans o mación biológica ae óbico y e mó ilo. En es e
p oceso, los lodos son mezclados con uno o más ipos de agen es es uc u an es de o igen
o gánico animal o ege al ( i u as de made a, se ín, esiduos de poda, plumas, pelos, huesos
de u a, papel, e c.) y se incuban o mando pilas (pilas ol eadas, pilas es á icas en iladas, en
úneles) po un pe iodo de 21 días o más. T as es e a amien o, el lodo a ado ha de alcanza
una se ie de equisi os pa a se conside ado como enmienda o gánica: con enido mínimo de
ma e ia seca, 60%; elación C/N < 20; ausencia de Salmonella sp.; y Esche ichia coli< 1000
U.F.C/g, además de los pa áme os ag onómicos y mic obiológicos a analiza ecogidos en el
pun o 4 del Anexo IIA del Real Dec e o 1310/1990 y en el Anexo II de la O den
AAA/1072/2013. O os a amien os ap obados po dicha O den son: la es abilización
ae óbica, que se ealiza en eac o es y es más común en pequeñas EDARs, p oduciéndose una
al a biodeg adación de con aminan es o gánicos; ambién se emplea la diges ión anae óbica
mesó ila o e mó ila, cuyo uso se ha inc emen ado no ablemen e debido a su bajo cos e y a la
gene ación de ene gía po la p oducción de biogás, pe o que p esen a una pob e deg adación
de con aminan es. La es abilización alcalina es un p oceso muy ba a o en el que se adicionan
al lodo ma e iales ales como cal, cenizas olan es o pol o de ho nos de cemen o pa a
aumen a el pH a 12 du an e 24 ho as o más, pe o la deg adación de con aminan es o gánicos
no es á muy cla a en algunos casos; y po úl imo, el secado é mico, en el que el lodo debe
alcanza una empe a u a de 80ºC como mínimo du an e 10 minu os o más.
1.3. Con aminan es o gánicos en lodos de depu ado a
En las EDARs, una amplia gama de mic ocon aminan es o gánicos son eliminados de las aguas
du an e los a amien os biológicos y químicos a los que son some idas, pe o una pa e de

13
ellos pe manecen adso bidos sob e los lodos esiduales (Maille e al., 2017). Es o conlle a la
con aminación de dichos lodos po plaguicidas, p oduc os químicos indus iales, p oduc os
a macéu icos y de higiene pe sonal, ho monas y o os con aminan es o gánicos. La ges ión y
a amien o de es os lodos cons i uye un impo an e p oblema medioambien al. Median e los
a amien os mencionados en el apa ado 1.2. de es a memo ia, se p oduce la es abilización
de los lodos, educiéndose los pa ógenos y sólidos olá iles y, e i ando su deg adación
espon ánea, as lo cual, los lodos se con ie en en biosólidos es ables que ya pueden se
eu ilizados o eliminados de mane a más segu a. Los biosólidos ob enidos son icos en ma e ia
o gánica y nu ien es con alo ag onómico (N, P, K, Ca, Mg y o os mic onu ien es esenciales
pa a las plan as). La u ilización de los biosólidos p oceden es de lodos de depu ado a como
enmienda o gánica, mejo ando las p opiedades del suelo (Cla ke y Smi h, 2011), es una opción
sos enible ya que pe mi e la ecupe ación de ecu sos y añade un alo económico a lo que
adicionalmen e se ha conside ado como un p oduc o de desecho (Semblan e e al., 2015),
una p ác ica que se enma ca en los p incipios de ap o echamien o de ecu sos que enuncia la
Economía Ci cula p omo ida po la Unión Eu opea, po lo que puede que en un u u o sea
obliga o io aplica una mayo exigencia en la alo ización ag onómica de lodos en cuan o a
con aminan es o gánicos, pa a ga an iza la segu idad ambien al de es a ía de ges ión.
Sin emba go, has a aho a la concen ación de con aminan es o gánicos en los lodos a ados
no se con empla ni en la legislación andaluza ni a ni el nacional, eniendo en cuen a que los
lodos p oceden es de depu ado as son en p incipio un esiduo ex emadamen e líquido
(con ienen un po cen aje de sólidos en e 0,25 y 12% en peso), y los a amien os a los que
son some idos lo que hacen es concen a no solo los nu ien es y la ma e ia o gánica en los
biosólidos inales, sino ambién odos los con aminan es p esen es en ellos, po encialmen e
pelig osos pa a la salud y el medioambien e, ales como Cd, C , Hg, Ni, Pb, Zn, pa ógenos y
con aminan es o gánicos.
En los lodos aplicables en ag icul u a, a iables ales como la pa ogenicidad, olo o con enido
en me ales pesados es án egulados pa a p o ege el medioambien e y la salud. En pa icula ,
en la di ec i a 86/278 (EC, 1986) modi icada po 91/271/EEC (EC, 1991) se es ablecen alo es
máximos de me ales en lodos que se ayan a aplica en ag icul u a. También es á indicado el
lími e ecomendable de 7 Bi enilos Policlo ados (PCBs) y 3 Hid oca bu os A omá icos
Policíclicos (PAHs). Algunos países (Dinama ca, Suecia, Aus ia y Alemania) ya han impues o
con oles pa a cie os con aminan es o gánicos en los biosólidos (Inglezakis e al., 2011),
conc e amen e aquellos conside ados con aminan es p io i a ios “clásicos” (POPs, del inglés
Pe sis en O ganic Pollu an s), y que apa ecen en el 3e Bo ado de e isión de la Di ec i a
14
86/278/CEE (úl imo documen o disponible) (EC 2010), ales como Nonil enole oxilados (NPEs),
Sul ona os de Alquilbenceno Lineales (LAS), PAHs, PCBs y Dioxinas y Fu anos (PCDD/Fs), pe o
no se ha llegado a ap oba una di ec i a especí ica de la Unión Eu opea pa a egula su
con enido en lodos, a pesa de que la mayo pa e de ellos es án p ohibidos y egulados as la
Con ención de Es ocolmo (S ockholm Con en ion on POPs, 2011). Pa ece se que la no
ap obación de una no ma i a al espec o se debe a la al a de acue do en e los dis in os
países en cuan o a concen aciones lími e, pues, de aplica las concen aciones p opues as po
la Unión Eu opea, la mayo ía de los países no alcanza ían los es ánda es necesa ios pa a que
sus lodos pudie an se empleados en ag icul u a. Cabe espe a po an o, que en un u u o no
muy lejano sea obliga o io aplica una mayo exigencia en los c i e ios de alo ización
ag onómica del lodo en cuan o a con aminan es o gánicos pa a da espues a a la necesidad
de concilia el man enimien o de los bene icios de es a ía de ges ión con la ga an ía de
segu idad ambien al y sani a ia de la misma.
Además de lo expues o an e io men e, ambién es llama i o que en ningún país se han
impues o lími es pa a o as g andes amilias de con aminan es llamados eme gen es, que
siemp e es án p esen es en los lodos de depu ado a aplicados en ag icul u a, como son los
p oduc os a macéu icos y de higiene pe sonal (PPCPs, Pha maceu ical and Pe sonal Ca e
P oduc s en inglés), mic oplás icos y plas i ican es, su ac an es, e a dan es de llama,
p oduc os de desin ección, d ogas, e c., que son cada ez más ampliamen e usados po la
población, gene ando po an o g andes can idades de esiduos que inalmen e llegan a es a
p esen es en los lodos de depu ado a. Además, las plan as de a amien o de aguas esiduales
no es án diseñadas especí icamen e pa a elimina es e ipo de con aminan es, po lo que
impo an es concen aciones quedan emanen e en los lodos (Rod íguez-Rod íguez, 2014).
1.3.1. P oduc os a macéu icos y de higiene pe sonal (PPCPs) en lodos de
depu ado a
El é mino PPCPs comp ende una amplia colección de miles de sus ancias químicas, ales como
á macos de uso humano o e e ina io, agancias y cosmé icos. T as se abso bidos po el
o ganismo, en la mayo ía de los casos, es án suje os a eacciones me abólicas, sin emba go,
una acción signi ican e de ellos (en e un 30-90% de la dosis adminis ada) se elimina sin
me aboliza en o ina o en heces, siendo emi idas a aguas esiduales y es ando p esen e, po
an o, en lodos de depu ado a o en compos . Además, en algunos casos, algunos de los
me aboli os exc e ados pueden se ans o mados al á maco o iginal. Es po an o, que se han
encon ado en los úl imos años cien os de PPCPs di e en es en muy di e sas mues as
15
medioambien ales. Muchos de es os compues os p o ienen del alcan a illado domés ico, de
hospi ales, esiduos indus iales y de aguas esiduales en abas ecimien o de agua municipal.
Pa a hace nos una idea, ac ualmen e más de 15.000 medicamen os es án au o izados po la
Agencia Española de Medicamen os y P oduc os Sani a ios, lo que supone más de 2.000
p incipios ac i os.
Cie os PPCPs se encuen an a ni eles de ec ables en los biosólidos y su lixi iación o
esco en ía desde los suelos ag ícolas a ados con biosólidos se conside an como po enciales
u as de en ada de PPCPs en los dis in os ecosis emas (Eggen e al., 2010; Wang e al., 2018).
Sin emba go, ealizando una búsqueda en SCOPUS u ilizando los é minos PPCP + SLUDGE
(lodo en inglés) se ob ienen solo 661 abajos publicados, de los cuales 557 son pos e io es al
2010, indicando la no edad de es a in es igación y la impo ancia que iene ac ualmen e, ya
que se pe cibe como una p eocupación de la sociedad en gene al. Sin emba go, los es udios
sob e el con enido de con aminan es o gánicos eme gen es ales como los PPCPs en lodos de
depu ado a son oda ía muy escasos compa ados con los es udios sob e con aminan es
p io i a ios ales como PAHs o PCBs (Ca balla e al., 2007; S asinakis e al., 2013; Jones e al.,
2014; Subedi e al., 2014; Ma ín e al., 2015). Jelic e al. obse a on en 2011 que 21 de los 43
á macos acumulados en lodos de es depu ado as es udiadas es aban en concen aciones
supe io es a 100 ng/g. Ve licchi y Zambello ealiza on en 2015 una e isión bibliog á ica pa a
e la concen ación de 152 á macos y 17 p oduc os de higiene pe sonal en lodos que habían
sido some idos a dis in os a amien os de es abilización, y concluye on que los PPCPs que
más ecuen emen e se p esen an en los biosólidos son 27 an ibió icos, lo cual es p eocupan e
debido a la esis encia que es án c eando las bac e ias pa ógenas en e a és os, y lo di ícil que
esul a la búsqueda de nue os compues os con ac i idad an imic obiana. Los an ibió icos más
es udiados son iclosán y icloca bán, aunque las mayo es concen aciones en lodos se han
obse ado en el siguien e o den: icloca bán > onalide > galaxolide > iclosán > o loxacino >
cip o loxacino. En elación a los lodos compos ados, los PPCPs más es udiados son
ca bamazepina y pa ace amol, pe o en cuan o a concen aciones son los siguien es: galaxolida
> iclosán > onalide > pa ace amol > ibup o eno. Aunque es as concen aciones a iaban
según la es ación del año, la zona es udiada y el a amien o lle ado a cabo en la EDAR.
El g an núme o de compues os que se enma can den o de los PPCPs hace que, debido a las
di e encias en sus ca ac e ís icas isicoquímicas, sob e odo en su coe icien e de epa o
oc anol-agua (Kow), és os se compo en en los lodos de di e en e o ma. Po ejemplo, cie os
PPCPs son hid o óbicos y se adhie en a la ma e ia o gánica de los lodos, conside ándose
compues os pseudope sis en es. O os PPCPs, sin emba go, son compues os ionizables, siendo
16
su ca ga dependien e de sus pKa y del pH, in luyendo ambién mecanismos ales como enlaces
de hid ógeno, in e acciones iónicas y complejación con la supe icie de lodos en su adso ción
(Ve licchi y Zambello, 2015).
Dependiendo de las ca ac e ís icas de los con aminan es o gánicos p esen es en los lodos, su
concen ación puede se minimizada median e la aplicación de a amien os que incluyen
p ocesos de oxidación a anzados, como ozonización o a amien o Fen on (Qiang e al., 2013),
median e adiación ul a iole a (Salihoglu e al., 2012), a amien os bas an e e ec i os, pe o
con al os cos es de man enimien o y consumo de ene gía. También se han con emplado
a amien os de ex acción de los con aminan es y de bio ecupe ación, u ilizando el po encial
de cie os mic oo ganismos pa a consegui la biodeg adación de los con aminan es
(Rod íguez-Rod íguez e al., 2014).
1.4. P oblemá ica medioambien al de i ada de la p esencia de PPCPs en lodos de
depu ado a
La p esencia de PPCPs en el medio ambien e se ha con e ido en una c ecien e p eocupación
debido a su impac o nega i o especialmen e sob e o ganismos acuá icos, ales como los
e ec os de eminización de los es ógenos sin é icos en peces (Chen e al., 2013). Los
compues os llamados dis up o es endoc inos, como son los ya mencionados es ógenos
sin é icos, es án implicados en cambios en la e ilidad y la p oducción de i elogenina
(Me cal e e al., 2001; Bu kha d -Holm e al., 2008). Los PPCPs pueden da e ec os biológicos,
como i o oxicidad y oxicidad en suelos y o ganismos acuá icos. Po ejemplo, gem ib ozilo
puede eje ce como dis up o endoc ino en peces y un amplio uso de iclosán puede esul a
en el desa ollo de esis encia bac e iana a an ibió icos (Usyskin e al., 2015). Además, los
an ibió icos pueden ambién al e a la unción y la es uc u a de la comunidad bac e iana. Po
ejemplo, la exposición a 200g/L de cip o loxacino, un an ibió ico común, ha sido asociada a
la al e ación de la composición de la comunidad bac e iana en mues as medioambien ales y a
un descenso de la capacidad de me aboliza pi enos (Nislund e al., 2008). La exposición a
an ibió icos ambién ha demos ado po encial pa a in lui en las unciones cla es del
ecosis ema, ya que concen aciones de 50 g/kg de sul adime oxina educe la ni i icación del
suelo (To h e al., 2011). Dos de los á macos más consumidos, pa ace amol e ibup o eno, han
demos ado oxicidad en concen aciones de nanog amos po li o en e luen es de agua
esiduales y en concen aciones de mic og amos po li o en aguas na u ales. Han sido
desc i os una a iedad de po enciales e ec os nega i os pa a es os ni eles de concen ación,
po ejemplo, daño ep oduc i o, daño al ADN, acumulación en ejidos, es és oxida i o,
17
pe oxidación lipídica y cambios de compo amien o, odo es o se ha obse ado en algas,
mic oc us áceos, moluscos y peces eleós eos. Los e ec os nega i os p oducidos po es os dos
á macos se encuen an ampliamen e desc i os en la e isión bibliog á ica ealizada po Zu e
al. (2018).
O o ejemplo son los e ec os le ales de diclo enaco en bui es (Sump e , 2010), lo que
demues an sus e ec os óxicos a bajas dosis. Además, algunas sus ancias pueden se
ans o madas en o as, siendo incluso más óxicas que la sus ancia o iginal (Radjeno ic e al.,
2009). La abso ción de PPCPs po plan as ha sido ambién documen ada, pe o se educe al
es udio de unos cuan os compues os y cul i os (Wu e al., 2015; Can a e o e al., 2017; Ben-
Mo dechay e al., 2018). Bajas concen aciones de PPCPs puede ene impac o en la ida
acuá ica, incluyendo cambios en el c ecimien o y la mo alidad de algas y an ibios, y cambios
en la es uc u a de la comunidad acuá ica (Wilson e al., 2003; F ake y Smi h, 2004; B ausch y
Rand, 2011), pudiendo a ec a ambién a la supe i encia de la ida acuá ica (F ake y Smi h,
2004).
O os es udios (Zhenhua e al., 2016) han demos ado que algunos PPCPs, ales como,
e aciclina y iclosán, pueden daña el cen o de eacción del o osis ema II de algas po
es és oxida i o e inhibi la sín esis de algunas p o eínas y la o mación de clo oplas os. T azas
de PPCPs en aguas puede a ec a al c ecimien o no mal de plan as y educi el con enido de
ci oc omo y hojas e des. Es o supone la apa ición de obs áculos en el c ecimien o y la
ep oducción de animales.
Un g upo ambién muy pe sis en e en lodos son los il os ul a iole as, como el 4-
me ilbencilideno alcan o , cuya concen ación aumen a conside ablemen e en mues as
ambien ales en e ano (Biel-Maeso e al., 2019), y que es un dis up o endoc ino al posee
ac i idad es ogénica (Schlump e al., 2004).
Además, algunos es udios (Rami ez e al., 2007; Fai e al. 2009; Coogan e al. 2007; Oaks e al.,
2004; Li e al., 2012; Chen e al., 2007; Liu e al., 2011; Ali e al., 2018) han comp obado la
bioacumulación de PPCPs en di e sos ejidos de plan as, peces, algas, mamí e os acuá icos,
c us áceos y bui es.
Es os compues os an acumulándose en suelos a ados con lodos, pudiendo pasa a aguas
supe iciales y sub e áneas, así como a plan as y animales, y en úl ima ins ancia a los se es
humanos a a és de la cadena alimen a ia, causando en e medades c ónicas (cánce , de ec os
de nacimien o, sis ema inmuni a io o ep oduc i o dis uncional, e incluso un cie o
dec ecimien o de la in eligencia se sospecha que es án elacionados con es os con aminan es)

18
(Ci ulski y Fa ahbakhsh, 2010; Cla ke y Smi h, 2011). Sin emba go, el impac o de muchos
compues os pe enecien es a los PPCPs son aún desconocidos. Es po odo es o que es muy
impo an e la búsqueda de cepas bac e ianas con capacidad de deg ada selec i amen e
PPCPs en lodos, las cuales han de se aisladas y su po encial pode biodeg adado de
de e minados con aminan es ca ac e izado pa a su u ilización en EDARs pa a mejo a la
eliminación de PPCPs median e un p oceso llamado bioaumen o.
1.5. Bio ecupe ación de lodos de EDARS
Uno de los mé odos más empleados pa a la eliminación de con aminan es o gánicos en lodos
de depu ado a se basa en la bio emediación, que es el p oceso median e el cual los
mic oo ganismos (endógenos o exógenos) deg adan, me abolizan, ans o man o mine alizan
el compues o con aminan e en cues ión. Se han con emplado di e en es a amien os de
bio ecupe ación del lodo u ilizando el po encial de cie os mic oo ganismos pa a consegui la
biodeg adación de los con aminan es (Rod íguez-Rod íguez e al., 2014).
Según la de inición de la Agencia de P o ección Medioambien al de los Es ados Unidos (EPA),
la biodeg adación de un compues o consis e en aquel p oceso po el cual los mic oo ganismos
ans o man o al e an, po acción me abólica, la es uc u a de dicho compues o. En es e
p oceso, los con aminan es o gánicos son bio ans o mados debido a que, gene almen e, los
mic oo ganismos pueden u iliza los pa a su p opio c ecimien o como uen e de ca bono y
ene gía y, en el caso de que no sean capaces de c ece a pa i de ellos, pueden segui
ans o mándolos si se les apo a un sus a o de c ecimien o al e na i o o cosus a o
(Alexande , 1999). Además de los compues os na u ales, los elemen os eque idos pa a el
c ecimien o celula pueden se apo ados po muchos con aminan es o gánicos. La mayo ía
suelen se ali á icos o a omá icos, y con ienen di e en es g upos uncionales. Es os
compues os o gánicos, ac uando como donan es de elec ones son oxidados du an e el
me abolismo mic obiano pa a p opo ciona ene gía pa a el c ecimien o celula . Aunque el
úl imo me aboli o gene almen e es un compues o de na u aleza o gánica, ambién puede
ob ene se CO2, H2O y/o sales ino gánicas, que es lo que se conoce como mine alización ( igu a
3). En el p oceso de biodeg adación in luyen di e en es ac o es, ales como, la empe a u a, el
pH, la biodisponibilidad, humedad del suelo, disponibilidad de oxígeno, en e o os.
19
Figu a 3. Biodeg adación ae obia y mine alización.
Una al e na i a den o de las écnicas de bio emediación es la bioes imulación ( igu a 4), una
écnica en la cual se adicionan mac o y mic o nu ien es pa a es imula el c ecimien o
mic obiano y aumen a la población de mic oo ganismos. O a al e na i a es el bioaumen o
( igu a 4), que consis e en la adición de mic oo ganismos endógenos o exógenos pa a
aumen a la biodeg adación de los con aminan es.
Figu a 4. Bioaumen o y bioes imulación.
Los p ocesos de a amien o de es abilización de los lodos que se lle an a cabo bajo
condiciones ae óbicas, ales como la diges ión ae óbica o el compos aje, a o ecen la
biodeg adación de con aminan es o gánicos más que los p ocesos anae óbicos, po lo que lo
más lógico se ía aplica la écnica del bioaumen o du an e es os p ocesos pa a aumen a la
pé dida de los con aminan es a la ez que se p oducen dichos p ocesos. Sin emba go, al
adiciona mic oo ganismos exógenos, és os ienen que compe i con la comunidad mic obiana
es ablecida esul ando en una disminución de la can idad de mic oo ganismos inoculados
(Boon e al., 2000), po lo que el bioaumen o puede cambia la composición de la comunidad
mic obiana po compe ición o inhibición, pudiendo esul a en cambios posi i os o nega i os.
La educción de la can idad de mic oo ganismos inoculados ambién puede debe se a la
20
p esencia de bac e ió agos o po una mala adap ación a las condiciones ambien ales. Además,
si los mic oo ganismos se encuen an simul áneamen e con la p esencia de más de un
con aminan e me aboliza á el compues o más ácilmen e deg adable (He e o y S uckey,
2015).
Has a aho a sólo unos pocos es udios han in es igado la eliminación de con aminan es
o gánicos de los biosólidos median e la écnica del bioaumen o empleando an o bac e ias
como hongos o le adu as (Zhou e al., 2013). En el caso de los PPCPs, has a aho a los es udios
sob e a amien os de los lodos de depu ado a pa a log a su descon aminación son bas an e
más escasos (Wang e al., 2018). B iones e al. (2018) obse a on la biodeg adación de
me o mina, un á maco muy u ilizado pa a a a la diabe es ipo 2 pe o que se conside a un
dis up o endoc ino, u ilizando cul i os bac e ianos ob enidos a pa i de lodos de depu ado a.
El g upo de in es igación de Rod íguez-Rod íguez e al. (2010; 2011; 2012a,b; 2014) obse ó
que el bioaumen o con el hongo T ame es e sicolo daba luga a la deg adación de a ios
con aminan es eme gen es (cie os PPCPs como, po ejemplo, el an iin lama o io nap oxeno).
Aydin (2016) ambién u ilizó es e mismo hongo pa a biodeg ada an ibió icos en lodos de
depu ado a p o enien es de aguas esiduales de una indus ia a macéu ica. O o es udio
in es igó el po encial pa a mejo a la eliminación de PPCPs usando el bioaumen o, las
bac e ias ue on p e iamen e aisladas de lodos ac i ados y e an capaces de deg ada los PPCPs
a concen aciones de ng/L. Es e es udio examinó la deg adación del iclosán y bis enol A po
Sphingomonas sp, an o en cul i o pu o como cuando se añaden a lodos ac i ados. Cuando las
bac e ias se añadie on a los lodos ac i ados, la deg adación aumen ó (Zhou e al., 2014).
1.5.1. Mic oo ganismos po encialmen e deg adado es de PPCPs en lodos de
EDARs
Va ios es udios han in o mado de que se de ec a con ecuencia PPCPs como sul ame oxazol,
pa ace amol, iclosán, diclo enaco y ca bamazepina, los cuales pueden se deg adados po
cul i os pu os aislados de lodo. Los cul i os pu os aislados del p oceso de lodos ac i ados
mues an la capacidad de deg ada una amplia gama de PPCPs. Po ejemplo, las bac e ias
deni i ican es como Ach omobac e sp pueden deg ada odas las sul onamidas incluyendo
sul ame oxazol. Además, con un mecanismo de deg adación di e en e, muchos cul i os pu os
pueden u iliza PPCPs especí icos como única uen e de ca bono y ene gía, como pa ace amol,
y puede se deg adado po S eno ophomonas sp, Pseudomonas ae uginosa y Del ia
su uha ensis. La bioso ción juega un impo an e papel en la eliminación del pa ace amol pa a
S eno ophomonas sp mien as que en el caso de Pseudomonas ae uginosa y Del ia
21
su uha ensis desempeña un papel insigni ican e, es o puede debe se a la p esencia de
di e en es enzimas en el p oceso de deg adación. Las enzimas desempeñan un papel
undamen al en la biodeg adación de los PPCPs y su biodeg adación puede de e mina se
median e la p oducción de la enzima especí ica (pa a la descomposición) po el
mic oo ganismo. Po ejemplo, la amonio monooxigenasa puede se p oducida po
Ni osomonas eu opae que puede descompone el iclosán, pe o muchos ecalci an es PPCPs
como la e aciclina, el cip o loxacino y el ime op im no pueden deg ada se adecuadamen e
po los mic oo ganismos, ya que es os á macos no pueden induci a los mic oo ganismos pa a
p oduci la enzima especí ica. Po lo an o, pa a mejo a la biodeg adabilidad de los PPCPs
e ac a ios, el p incipal paso es induci la p oducción de enzimas pa icula es (Daugh on,
2001; Kagle e al., 2009). Respec o al á maco ibup o eno, se ha epo ado su deg adación po
bac e ias ales como, Pseudomonas pu ida, Bacillus hu ingiensis, Sphingomonas sp,
Va io o ax sp, Co ynebac e ium glu amicum, en e o as, odas ellas con mecanismo de
deg adación di e en es (Zu e al., 2018).
Los hongos de pud ición blanca (WRF, de sus siglas en inglés Whi e Ro Fungi) ambién
desempeñan un papel impo an e en el p oceso de deg adación de PPCPs. Po ejemplo, la
deg adación de nap oxeno po WRT u iliza lacasas (enzimas pe enecien es al g upo de las
oxidasas) y ci oc omo P450. En o o es udio, se u ilizan T. e sicolo y P. os ea us pa a la
deg adación de ca bamazepina (Asi e al., 2017).
Asimismo, las mic oalgas ambién han demos ado median e di e sos es udios se
po encialmen e deg adado as de PPCPs, conc e amen e de an ibió icos. Po ejemplo, la
deg adación de le o loxacino po S. obliquus y C. ulga is o ce azidima po C. py enoidosa
(Leng e al., 2020).
Po lo que se ha comp obado que exis en nume osos mic oo ganismos capaces de deg ada
PPCPs, al igual que o os con aminan es o gánicos, inco po ándolos a su me abolismo g acias
a que poseen di e en es enzimas.
28
Tabla 4. Composición de los medios de cul i o empleados.
Componen es
MSM
LB
LB-aga
(NH4)2SO4
0,8 g
KH2PO4
2,0 g
Na2HPO4
4,0 g
MgSO4x 7 H2O
1,6 g
NaCl
10,0 g
10,0 g
T ip ona
10,0 g
10,0 g
Ex ac o de le adu a
5,0 g
5,0 g
Bac o Aga
20,0 g
El medio MSM (Mine al Sal Medium) con iene mic onu ien es (N, P, K, Na, Mg, S) y es el
esul ado de la mezcla de las siguien es disoluciones:
 Disolución I: 2,0 g de KH2PO4 y 4,0 g de Na2HPO4 en 500 mL de agua milliQ.
 Disolución II: 0,8 g de (NH4)2SO4 y 1,6 g de MgSO4x 7 H2O en 500 mL de agua milliQ.
El medio LB (Lu ia-Be ani) es el medio 381 de la lis a de medios pa a mic oo ganismos (Leibniz
Ins i u e DSMZ-Ge man Collec ion o Mic oo ganisms and Cell Cul u es).
Las sales mine ales usadas pa a p epa a el medio MSM ue on suminis adas po GPR
RECTAPU (VWR), y el medio LB ue suminis ado en o ma deshid a ada po BD Di co™ (Fishe
scien i ic).
3.2. Mé odos
3.2.1. En iquecimien o del lodo pa a la ob ención de conso cios mic obianos
deg adado es especí icos
El lodo se en iquece con concen aciones al as de un de e minado con aminan e con la
inalidad de obse a como las bac e ias endógenas se adap an al con aminan e añadido, ya
que es la única uen e de ca bono añadida. Del en iquecimien o se ob iene un conso cio de
mic oo ganismos que se án deg adado es especí icos de dicho con aminan e. De es e
conso cio se aisla án y sepa a án aquellas cepas bac e ianas que hayan c ecido, siendo és as
deg adado as especí icas del p opio con aminan e.
Las cepas bac e ianas se ob u ie on a pa i de la écnica de cul i os de en iquecimien o en
lodo basada en el a ículo de Shahzad-ul-Hussan e al. (2009). En p ime luga , se p epa ó una
suspensión en ubos co ex es é iles con 1 g del lodo esco en 19 mL de medio MSM

29
suplemen ado cada uno con ibup o eno, o loxacino, pa ace amol o ca bamazepina (200 ppm)
y con 1 mL de solución de nu ien es (SNs). En el caso de ca bamazepina e ibup o eno, al
p esen a una baja solubilidad en agua, se añadie on en los ubos co ex es é iles 1 mL de una
solución de 4000 ppm de cada á maco en me anol pa a ene una concen ación inal de los
á macos de 200 ppm, y se dejó e apo a el me anol bajo campana de lujo lamina an es de
añadi el lodo, el medio MSM y la solución de nu ien es. Con los á macos pa ace amol y
o loxacino se añadió el á maco di ec amen e, conc e amen e, se añadie on 4 mg pa a
ob ene una concen ación inal de á maco de 200 ppm al añadi el es o de los componen es
de la suspensión. Se deja on agi ando los ubos du an e 1 semana a 20ºC, as la cual se
ecogie on 5 mL de la suspensión y se añadie on en ubos co ex que ya con enían la can idad
de á macos necesa ia pa a ob ene la misma concen ación de á maco mencionada
an e io men e. A es a suspensión se añadie on 14 mL de medio MSM y 1 mL de SNs. Es e
p oceso se epi ió 4 eces. T as es o, se cen i ugó el úl imo ubo co ex de cada á maco a
7000 pm du an e 10 minu os y se semb a on los conso cios bac e ianos ob enidos en modo
césped. Pa a ello se oma on 100 µL del sob enadan e de cada ubo co ex que se semb a on
en placas Pe i con aga que con enía medio LB diluído (1:40) y el á maco, aunque és e no se
disuel e, y se agi a an es de la p epa ación de la placa, pa a asegu a que hay á maco en las
placas (12 mg en 200 mL en medio LB-aga ). Se dejan c ece 48 ho as y con asa de siemb a
es é il se in oduce la biomasa de cada conso cio de mic oo ganismos a conse a en c io iales
a -80ºC. Todo es e p oceso puede obse a se de o ma esquemá ica en la igu a 9.
Figu a 9. Esquema del en iquecimien o del lodo.
30
3.2.2. Aislamien o de cepas bac e ianas deg adado as especí icas
A pa i de los c io iales conse ados a -80ºC y que con enían conso cios mic obianos
deg adado es especí icos de cada á maco, se p ocedió al aislamien o de bac e ias
deg adado as. Se ealiza on sucesi os aislamien os semb ando los conso cios ob enidos en
placas Pe i con medio LB-aga y con cada á maco (12 mg en 200 mL de medio LB-aga ). 100 µl
del conso cio se inoculan en las placas semb ándolas en césped, y se ponen en es u a a 30°C
du an e dos días. Si las placas ob enidas p esen an con aminación o las colonias bac e ianas
no es án bien aisladas, se siemb an nue amen e en cuad an e. Es a écnica con inúa has a que
se ob ienen cepas bac e ianas aisladas que se dis inguen isualmen e en base a su mo ología,
amaño, colo , ele ación, e c.
Una ez aisladas las dis in as cepas bac e ianas, se in odujo la biomasa de cada una (500µl) en
ubos Falcon es é iles de 15 mL, cogiendo cada colonia bac e iana y añadiendo 5 ml de medio
LB. Se agi a du an e 24h a 30ºC y se conse a en c io iales, que son mic o ubos de 2 mL que
con ienen 20 es e as po osas de 3 mm de diáme o, y 500 L de glice ol al 40%, jun o con los
500 l de cepa bac e iana p o enien e del ubo Falcon. Se conse an los c io iales en el
congelado a -80°C pa a asegu a la disponibilidad de las cepas en u u os ensayos. Es e
p oceso se puede obse a de o ma esquemá ica en la igu a 10.
Figu a 10. Esquema del aislamien o de cepas bac e ianas.
31
3.2.3. P epa ación de los inóculos de las cepas bac e ianas
En es e apa ado se a a explica la p epa ación del inóculo de cada cepa bac e iana aislada
que se u iliza pa a el ensayo de la Demanda Biológica de Oxígeno y pa a la biodeg adación en
solución, explicado pos e io men e en es a memo ia en los apa ados 3.2.4. y 3.2.6.
Pa a comenza , a pa i de los c io iales ob enidos an e io men e, se siemb a en placas Pe i
con medio LB-aga 100µl de cada cepa bac e iana aislada en el en iquecimien o. Ob enida ya
la su icien e biomasa, és a se asladó a ascos de id io es é iles con 100 mL de LB líquido,
dejándolas en es u a a 30ºC du an e 21h con una agi ación de 130 pm. El cul i o pa a la
p epa ación del inóculo debe es a en e el inal de la ase exponencial y el inicio de la ase
es aciona ia de su c ecimien o. Después de es e pe iodo, el olumen comple o de las mues as
se cen i ugó a 7000 pm du an e 10 minu os. Seguidamen e, conse ando el pelle se
p ocedió a su la ado en dos ocasiones con 50 mL MSM pa a ga an iza la pu eza del inóculo.
Después del úl imo la ado, se conse ó el pelle , el cual jun o con un pequeño olumen de
MSM se esuspendió. La can idad de medio MSM con la que se esuspende depende á de la
densidad óp ica que ayamos buscando, y se añade en un ubo Falcon has a el olumen
necesa io, en o no a los 3 mL de cada bac e ia pa a el global del ensayo, es imando una
concen ación de 109 UFC/g en la escala de McFa land. Todo es e p oceso se puede obse a
en la igu a 11.
Figu a 11. Esquema del p oceso de p epa ación del inóculo de cada cepa bac e iana.
32
3.2.4. Demanda biológica de oxígeno
El ensayo de la demanda biológica de oxígeno, espi ome ía, o DBO, concie ne la
de e minación de la deg adación de sus ancias o gánicas po mic oo ganismos. La DBO es un
pa áme o que mide la can idad de oxígeno consumido po una población mic obiana al
deg ada se la ma e ia o gánica de una mues a líquida. Las bac e ias, debido al p oceso de
espi ación, emi i án dióxido de ca bono, que a a eacciona con len ejas de sosa (hid óxido
de sodio) ubicadas en el apón de la bo ella, o mando ca bona o de sodio y agua ( igu a 12).
De es a mane a el dióxido de ca bono p oducido po las cepas bac e ianas que se encuen a
en ase gaseosa, al se con e ido en ca bona o de sodio p o oca un descenso de es a ase y
po lo an o un descenso de p esión que se á medido po el cabezal oxi op. La de e minación
de la DBO se á posible al medi indi ec amen e dióxido de ca bono y el cambio indi ec o de
p esión.
Figu a 12. Reacción química en el oxi op.
Pa a ello se emplea on bo ellas oxi op de id io colo opacio, p e iamen e es e ilizadas en
es u a, especiales pa a el expe imen o. Pa a cada expe imen o se dispuso de dos ensayos
con oles y un inoculado. El ensayo con ol se p epa a igual que el inoculado a excepción del
inóculo bac e iano.
En el caso de pa ace amol y o loxacino, se añade 10 mg de á maco en pol o en una bo ella
es é il de 1L que con iene 900 ml de H2O mili Q, 99 ml de MSM y 1000μl de SNs pa a que la
solución alcance una concen ación inal de 10 mg L-1, ya que p esen an una solubilidad en
agua de 12,8 g/L y 28,3 g/L, espec i amen e. Finalmen e, cuando se p epa a el ensayo a la
bo ella oxi op se le añade 163 mL de la solución que con iene el á maco y 1 mL del inóculo
bac e iano. Todo es e p oceso se obse a de o ma esquema izada en la igu a 13. En el caso
del con ol se añade 164 mL de la solución con el á maco sin añadi inóculo bac e iano.
33
Figu a 13. Esquema de la p epa ación del ensayo de DBO con pa ace amol y o loxacino.
En el caso de ibup o eno y ca bamazepina, debido a su baja solubilidad en agua, 21mg/L y 17,7
mg/L, espec i amen e, se pa e de una solución á maco:me anol 500 mg L-1 de la que se
deposi an 3,28 mL en la bo ella oxi op, y se deja e apo a el me anol bajo campana de lujo
lamina pa a pos e io men e añadi el es o de componen es, con el obje i o de que ambos
á macos es u ie an como pol o muy ino y po an o más ácil de disol e . Finalmen e,
cuando se p epa a el ensayo en la bo ella oxi op con el á maco se añaden 146,6 mL de agua
miliQ p e iamen e es e ilizada en au ocla e, 16,4 mL de MSM, 164 µL de SNs y 1 mL del
inóculo bac e iano, cuya ob ención se explica en el apa ado 3.2.2. de es a memo ia. Todo es e
p oceso se obse a de o ma esquema izada en la igu a 14. En el caso del con ol se añadió
147,7 mL de agua miliQ, 16,4 mL de MSM y 164µL de SNs sin añadi inóculo bac e iano.

34
Figu a 14. Esquema de la p epa ación del ensayo de DBO con ibup o eno y ca bamazepina.
En ambos casos se deposi ó la mezcla de los componen es mencionados en la bo ella, en la
cual se in odujo un imán pa a man ene la solución en agi ación con inua. Se ce a on las
bo ellas con el cabezal oxi op ( igu a 15), dónde se in odujo la sosa en len ejas.
Figu a 15. Cabezal oxi op y cabina e mos á ica.
En dichos cabezales queda on egis ados au omá icamen e los alo es de mg de oxígeno
consumidos (L-1). Las bo ellas se man u ie on du an e 20 días en unas cabinas e mos á icas
( igu a 15), con agi ación a una empe a u a cons an e de 20ºC.
Los alo es ob enidos en el cabezal oxi op, deben se mul iplicados po un ac o de
con e sión pa a ob ene los alo es eales de DBO, es os ac o es es án suje os al olumen del
ensayo ( abla 5). En nues o caso, al habe u ilizado un o al de 164 mL de mues a, debemos
35
mul iplica los esul ados ob enidos po el ac o 10.
Tabla 5. Fac o de con e sión de alo es ob enidos en el expe imen o de DBO según el
olumen de mues a usado.
Can idad de mues a
usada [mL]
Fac o
432
365
250
164*
97
43,5
22,7
1
2
5
10*
20
50
100
*La can idad de mues a usada es de 164 mL, po an o el ac o a u iliza es 10.
Es muy impo an e man ene las condiciones de es e ilidad pa a asegu a nos de que la
mues a no se con amina con o o mic oo ganismo du an e el p oceso el cual pueda deg ada
el con aminan e. Es po ello que se abaja á bajo campana de lujo lamina y con el ma e ial
es é il en los apa ados 3.2.1., 3.2.2., 3.2.3 y 3.2.4.
3.2.5. Análisis de los á macos
T as es os 20 días de du ación del ensayo, se midió la concen ación emanen e de cada
á maco en la bo ella oxi op median e c oma og a ía líquida de al a esolución (HPLC). El
líquido acuoso emanen e en la bo ella se asladó p e iamen e a iales pa a HPLC. Los
c oma og amas se ob u ie on en un equipo de HPLC compac o (Shimadzu LC-2010ª HT Liquid
ch oma og aph) con un de ec o ul a iole a isible, empleando una columna K omasil C18 de
ase e e sa 15 x 0,4 (cm x cm) suminis ada po Teknok oma (España). Pa a la adquisición y
manejo de los da os se empleó el p og ama in o má ico LC Solu ion Analysis. A a és de una
cu a de calib ado de los di e en es á macos, se con i ió el á ea ob enida en unidades de
concen ación. Dichas cu as de calib ado con aban con 6 pun os con las siguien es
concen aciones: 1 ppm, 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, 8 ppm y 10 ppm. Pa a medi dichas mues as
en HPLC-UV se emplean di e en es mé odos según el á maco con las condiciones que se
obse an en la abla 6.
36
Tabla 6. Ca ac e ís icas de los mé odos u ilizados en HPLC-UV pa a cada á maco.
Fá maco
Tempe a u a
(ºC)
Tiempo de
e ención (min)
Longi ud de
onda (nm)
Fase mó il
Pa ace amol
25
1,60
244
900 mL agua
miliQ, 100 mL
me anol y 1 mL
ácido os ó ico
Ca bamazepina
25
1,90
210
700 mL
ace oni ilo y
300 mL agua
miliQ con 0,952
g os a o
po ásico y pH
ajus ado a 2,5
con ácido
os ó ico al 85%
O loxacino
30
3,25
290
900 mL agua
miliQ, 100 mL
me anol y 1 mL
ácido os ó ico
Ibup o eno
33
3,60
220
620 mL agua
miliQ, 380 mL
me anol y 0,5
mL ácido
i luo oacé ico
Flujo isoc á ico (mL/min): 1.000
3.2.6. Ensayos de biodeg adación de á macos en solución en p esencia de cepas
bac e ianas
La biodeg adación del á maco en solución se ealiza con el obje i o de comp oba la
capacidad deg adado a de las cepas bac e ianas aisladas que han mos ado los esul ados más
p ome edo es en los ensayos p elimina es de DBO, pe o a iempos más la gos de a amien o
(90 días). A con inuación, se expond á el p ocedimien o a segui pa a la pues a en ma cha de
los ensayos de biodeg adación en solución. La p ime a e apa del expe imen o adica en la
37
ob ención de biomasa de las cepas bac e ianas que se an a emplea , al y como se explica
p e iamen e en el apa ado 3.2.3. “P epa ación del inóculo de las cepas bac e ianas”. T as
es o, se p ocede á de di e en e mane a según la solubilidad del á maco.
Uno de los ensayos de biodeg adación en solución se ealiza á con las cepas aisladas de
ca bamazepina, conc e amen e C3 y C5, ya que son las que mejo es esul ados han dado en la
DBO. Las cepas bac e ianas C3, C5 y un con ol no inoculado de bac e ias cons i uye on los 3
a amien os que se ealiza on en es a biodeg adación en solución. Tan o el con ol como los
a amien os C3 y C5 se ealiza án po iplicado. Es e ensayo se lle a á a cabo en ubos de
id io es e ilizados con apón, los cuales con end án: 20 μL del inóculo bac e iano p epa ado
(excep o el ensayo con ol), 3 mL de MSM, 3 μL de SNs y 600 μL de una solución de
ca bamazepina en me anol de 50 ppm, pa a pode ene una concen ación inal de
ca bamazepina de 10 ppm en 3 mL. El á maco en me anol se á el p ime componen e en
añadi se pa a que se e apo e el me anol bajo campana de lujo lamina . Finalmen e, as se
añadidos los di e en es compues os, los iales se some e án a agi ación con inua bajo unas
condiciones de 150 pm y 20ºC has a la oma de mues as. En lo que se e ie e a la oma de las
mues as, és as ienen luga dependiendo de los iempos es ablecidos pa a el ensayo (0, 3, 7,
15, 30, 45, 60, 75 y 90 días). El p oceso de p epa ación de es e expe imen o se encuen a
esquema izado en la igu a 16. La me odología pa a la oma de mues as y medida de la
concen ación del á maco po HPLC es la misma ci ada an e io men e en el apa ado 3.2.5 de
es a memo ia.
Figu a 16. Esquema de la p epa ación ensayo de biodeg adación de ca bamazepina en
solución.
44
Figu a 25. Oxígeno consumido (mg/L) a los dis in os iempos del expe imen o de DBO con
pa ace amol.
Asimismo, obse ando la g á ica de ca bamazepina ( igu a 26), se obse a que odas las cepas
bac e ianas son muy simila es espec o al alo inal de mg de oxígeno/L alcanzado, llegando a
alcanza se el alo 60 mg de oxígeno/L po la mayo ía de ellas, aunque di e enciándose en el
iempo en el que se alcanza es e alo .
Figu a 26. Oxígeno consumido (mg/L) a los dis in os iempos del expe imen o de DBO con
ca bamazepina.
Po úl imo, con las cepas bac e ianas ob enidas de o loxacino ( igu a 27), se obse a que O3 es
la única cepa bac e iana con la que se ob ienen alo es muy simila es al g upo con ol, pe o
que las demás cepas bac e ianas alcanzan odas ellas el alo de 60 mg de oxígeno/L en un
pe iodo co o de iempo, p esen ando una ciné ica de consumo de oxígeno muy al a, mucho
mayo que las bac e ias co espondien es a los o os á macos.

45
Figu a 27. Oxígeno consumido (mg/L) a los dis in os iempos del expe imen o de DBO con
o loxacino.
4.3. Análisis de los á macos as los expe imen os de DBO
T as los 20 días de du ación de la DBO, se midió la concen ación de á maco emanen e en las
bo ellas de oxi op pa a comp oba el po encial biodeg adado de cada cepa bac e iana aislada.
Las igu as 28, 29, 30 y 31, mues an las g á icas donde se ep esen a el po cen aje de cada
á maco emanen e en cada bo ella según la cepa bac e iana u ilizada.
T as es os esul ados ob enidos en los que se compa an el ensayo con ol (sin bac e ias) y las
mues as inoculadas, se obse a que, aunque en los esul ados de DBO las bac e ias
mos aban que e an capaces de usa cada á maco como uen e de ca bono, ninguna de las
cepas bac e ianas ob enidas del en iquecimien o con ibup o eno log a deg ada una
concen ación impo an e de ibup o eno ( igu a 28).
Figu a 28. G á ica de po cen aje emanen e de ibup o eno a los 20 días.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% Ibup o eno esidual
Inoculación
46
Asimismo, ocu e simila con las cepas ob enidas del en iquecimien o con o loxacino, ya que
ninguna biodeg ada el á maco en can idades ap eciables ( igu a 29).
Figu a 29. G á ica de po cen aje emanen e de o loxacino a los 20 días.
Sin emba go, en las cepas bac e ianas ob enidas a pa i del en iquecimien o con pa ace amol
( igu a 30) sí se obse a cie a deg adación del á maco, conc e amen e con P1, P2 y P3,
siendo P1 y P2 las cepas con las que mejo es esul ados se ob ienen, llegando a deg ada se la
mi ad de la can idad de á maco añadida (10 mg/L).
Figu a 30. G á ica de po cen aje emanen e de pa ace amol a los 20 días.
Respec o a ca bamazepina ( igu a 31) ambién se obse a la deg adación del á maco con dos
cepas bac e ianas, C3 y C5, llegando a biodeg ada C3 un 85% de la can idad de á maco
añadida.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% O loxacino esidual
Inoculación
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% Pa ace amol esidual
Inoculación
47
Figu a 31. G á ica de po cen aje emanen e de ca bamazepina a los 20 días.
4.4. Biodeg adación de los á macos en solución en p esencia de cepas bac e ianas
T as la de e minación de la DBO de cada cepa bac e iana aislada, se decidió ealiza , en base a
los esul ados ob enidos p e iamen e, un ensayo de biodeg adación en solución explicado
an e io men e, pa a así pode con i ma la capacidad deg adado a de cada cepa bac e iana.
Como se ha comen ado, es e ensayo se ealizó en solución, po lo que el á maco se
encon aba o almen e biodisponible pa a su u ilización po las cepas bac e ianas. Es e ipo de
ensayo es el más adecuado pa a comp oba si la bac e ia u ilizada inco po a el compues o a su
me abolismo y lo deg ada, así como la ciné ica de dicha deg adación a lo la go plazo de iempo
(90 días) ya que el á maco es la única uen e de ca bono p esen e en el medio y, además, no
exis en o os elemen os que puedan e i a la u ilización del á maco po los mic oo ganismos,
ya que si el á maco se hubie a añadido jun o con el lodo, és e pod ía adso be el á maco
encon ándose, po an o, menos biodisponible pa a su biodeg adación.
Sin emba go, lamen ablemen e, debido a ci cuns ancias excepcionales de la pandemia del
i us COVID-19, as p epa a el expe imen o no ha sido posible la ecogida de mues as de
es e ensayo a los iempos p e is os y no han podido ob ene se esul ados. Lo espe ado
hubie a sido que la concen ación emanen e de á maco en los ubos hubie a disminuido
siendo deg adado po las cepas bac e ianas p esen es en el ensayo. Asimismo, as la
ealización del ensayo de biodeg adación en solución, las cepas bac e ianas que con i men su
capacidad deg adado a, debe ían habe sido iden i icadas median e la secuenciación del ARN
16s g acias al labo a o io S ab Vida.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% Ca bamazepina esidual
Inoculación
48
5. CONCLUSIONES
Las EDARs no poseen mé odos e icaces a la ho a de elimina cie os á macos, quedando po
an o g an pa e de ellos p esen es en lodos de depu ado a. Algunos á macos son
conside ados con aminan es eme gen es cuyo e ec o en el medioambien e, y po an o en la
salud humana, es muy nega i o. Se quie e explo a la posibilidad de elimina cie os á macos
de lodos de depu ado a median e el bioaumen o, que consis e en añadi al lodo con aminado
mic oo ganismos que posean la capacidad ca abólica de deg ada pa cial o o almen e dichos
á macos. El p ime paso es pode aisla mic oo ganismos deg adado es especí icos de los
mismos, y es o es lo que se ha lle ado a cabo en el p esen e es udio pa a los á macos
pa ace amol, o loxacino, ibup o eno y ca bamazepina, y las conclusiones alcanzadas son:
1. En los expe imen os de ob ención de cepas bac e ianas deg adado as especí icas de
los á macos seleccionados, se han conseguido aisla del lodo es cepas bac e ianas
capaces de c ece con ibup o eno como única uen e de ca bono (I1, I2, I3), cinco con
ca bamazepina (C1, C2, C3, C4, C5), cua o con pa ace amol (P1, P2, P3, P4), y cinco
con o loxacina (O1, O2, O3, O4 y O5) median e la écnica de cul i os de
en iquecimen o del lodo con dichos á macos.
2. El consumo de oxígeno debido al aumen o de la masa bac e iana du an e la
deg adación de los á macos median e inoculación de las dis in as cepas bac e ianas
aisladas ue medido po DBO (Demanda Biológica de Oxígeno), y apo ó una idea
p elimina de que las cepas bac e ianas I1, I2, C3, C5, P1, P2, O4 y O5 son las que
ienen mayo po encial pa a deg ada su espec i o á maco.
3. La concen ación esidual de cada á maco medida al inaliza los ensayos de DBO
indicó que las cepas C3 y C5 pa a ca bamazepina, y P1, P2 y P3 pa a pa ace amol son
las cepas bac e ianas que p esen a on los mayo es po cen ajes de deg adación de
dichos á macos. Con las es an es cepas in es igadas, la deg adación de los á macos
en medio acuoso no ue signi ica i a.
49
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