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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
ESPAÑA
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Núme o de publicación: 2 296 465
21
Núme o de solici ud: 200502247
51
In . Cl.:
C12Q 1/02 (2006.01)
C07K 14/47 (2006.01)
C12R 1/91 (2006.01)
C12Q 1/68 (2006.01)
12
PATENTE DE INVENCIÓN B1
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Fecha de p esen ación: 08.09.2005
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Fecha de publicación de la solici ud: 16.04.2008
Fecha de la concesión: 23.02.2009
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Fecha de anuncio de la concesión: 16.03.2009
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Fecha de publicación del olle o de la pa en e:
16.03.2009
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Ti ula /es: Uni e sidad de Se illa
OTRI-Pabellón de B asil
Paseo de las Delicias, s/n
41012 Se illa, ES
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In en o /es: Na a o An olín, F ancisco Ja ie ;
Le i sky, Kons an in;
López Ba neo, José;
Calde ón Sánchez, E a;
O dóñez Fe nández, An onio;
Villa López, José;
Ca mona Be nal, Ca men y
Capo e Gil, F ancisco
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Agen e: No cons a
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Tí ulo: Mé odo y ki de diagnós ico pa a la de e minación cuan i a i a de la exp esión del canal maxi-K.
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Resumen:
Mé odo y ki de diagnós ico pa a la de e minación cuan i-
a i a de la exp esión del canal maxi-K.
La p esen e in ención se e ie e a un mé odo y ki de diag-
nós ico pa a la de e minación cuan i a i a en leucoci os
de sang e pe i é ica de una mues a de sang e o al de la
exp esión de los genes KCNM implicados en la hipe en-
sión a e ial humana. En conc e o de la exp esión, de los
ni eles de ARNm y/o p o eínas, de las subunidades al a
y be a1 del canal iónico maxi-K, es deci , de los genes
KCNMA1 y KCNMB1.
A iso: Se puede ealiza consul a p e is a po el a . 37.3.8 LP.
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Ven a de ascículos: O icina Española de Pa en es y Ma cas. Pº de la Cas ellana, 75 – 28071 Mad id
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DESCRIPCIÓN
Mé odo y ki de diagnós ico pa a la de e minación cuan i a i a de la exp esión del canal maxi-K.
La p esen e in ención se e ie e a un mé odo de análisis in i o y ki de diagnós ico, pa a la de e minación cuan-
i a i a de la exp esión de los genes KCNM o de sus p oduc os de ansc ipción o exp esión. En conc e o, de los
genes KCNMA1 y KCNMB1 que codi ican las subunidades al a y be a1 del canal iónico maxi-K implicados en la
hipe ensión a e ial humana.
Es ado de la écnica an e io
La hipe ensión a e ial es el aumen o de o ma c ónica de la p esión a e ial. Se a a de una en e medad que no
da sín omas du an e mucho iempo y dejada a su e olución sin a amien o puede se que el p ime sín oma que de ella
se enga sea una complicación se e a como un in a o de mioca dio, una de los p incipales iesgos, ombos o up u as
a e iales, pudiendo da luga a hemo agias, daño en las células ne iosas, pé dida de memo ia, pa álisis, e c. El iñón
ambién su e las consecuencias de la hipe ensión a e ial y en e los pacien es hipe ensos se p oduce insu iciencia
enal con más ecuencia que en e los pacien es no mo ensos. Los pequeños asos del ondo del ojo (que se mi an con
el o almoscopio), ambién se en amenazados po la hipe ensión, su o u a p oduce hemo agia llegándose incluso a
la pé dida de la isión. Todos es os iesgos se pueden e i a si se a a y con ola la hipe ensión adecuadamen e.
Expe imen almen e, se ha demos ado la elación exis en e en e la p esión a e ial y la apnea del sueño obs uc i a
(OSA), la hypoxia y de los as o nos en la espi ación ela i os al sueño (c . Da ies, C.W.H. e al., Tho ax 2000, ol.
55, pp. 736-740; Fle che , E.C. J. Appl. Physiol 2001, ol. 90, pp. 1600-1605; G o e e al., J. Hype ens 2000, ol.
18, pp. 679-685). Siendo es e ipo de en e medades un oco de in o mación pa a p oblemas ca dio ascula es y de
hipe ensión a e ial.
Uno de los a ances sob e la es uc u a y unción de las p o eínas que han su gido de la in es igación en gené ica
molecula son los canales iónicos. Es os canales pe enecen a una amilia de p o eínas que o man úneles mac omole-
cula es a a és de la memb ana plasmá ica y que se enca gan de con ola el lujo de iónes hacia el ex e io o in e io
de las células. Las obse aciones p e ias que elacionan la subunidad be a-1 del canal iónico maxi-K (exp esado po
el gen KCNMB1) y la hipe ensión se basa en cambios cuali a i os, como es la no exis encia del gen en el a ón, con
un es ado hipe ensi o en el a ón knockou pa a la subunidad be a-1, o como es el cambio de un solo aminoácido
mo i ado po una mu ación pun ual en humanos (p o ección en e a la hipe ensión dias ólica en suje os po ado es
de dicha mu ación) (c . Fe nández-Fe nández, J.M. e al., J. Clin. In es 2004, ol. 113, pp. 1032-1039).
En la ac ualidad pa a hace un es udio de las posibles modi icaciones del ni el de exp esión de genes de in e és
ascula , se hace de o ma c uen a, po medio de una biopsia pa a ob ene ejido de la pa ed a e ial.
Explicación de la in ención
La in ención se en en a, en gene al, con el p oblema de encon a un mé odo de diagnós ico cuan i a i o pa a la
de e minación y/o de ección de la hipe ensión a e ial humana, en células cuyo p oceso de ex acción no sea ag esi o
pa a el pacien e.
La solución p opo cionada se basa en que los au o es de la p esen e in ención han descubie o, so p enden emen e,
que la exp esión de los genes KCNM, en pa icula de los genes KCNMA1 y KCNMB1, o de sus p oduc os de
ansc ipción o exp esión (ARN o p o eína) en leucoci os de sang e pe i é ica (PBL), se puede cuan i ica pa a la
de ección de la hipe ensión a e ial humana.
KCNMA1 y KCNMB1 son dos genes que codi ican dos p o eínas las cuales al ensambla se o man el canal iónico
maxi-K.
En e las posibles aplicaciones de i adas de la p esen e in ención se incluye el p opo ciona un ki de diagnós ico
de la hipe ensión a e ial humana en PBL, jun o con el uso de los PBL pa a la cuan i icación de los genes que codi ican
canales iónicos de impo ancia en la pa ed ascula y no p opiamen e del leucoci o, pe mi iendo usa los PBL como
es igos a dis ancia de la egulación de es os genes, que codi ican canales iónicos ascula es.
De acue do con un aspec o de la p esen e in ención, se p opo ciona un mé odo de diagnós ico de la hipe ensión
a e ial humana median e la de ección cuan i a i a de los ni eles de exp esión de los genes KCNM en leucoci os de
sang e pe i é ica (PBL) de una mues a de sang e o al. Los PBL son ob enidos median e cualquie mé odo adicional,
sob adamen e conocido en el es ado de la écnica, como una ex acción de sang e.
El mé odo p opo cionado po es a in ención, comp ende la de ección cuan i a i a de los ni eles de exp esión de
los genes KCNM, en pa icula los genes KCNMA1 y KCNMB1. Donde es os genes codi ican p o eínas pa a las
unidades al a y be a1 del canal iónico maxi-K.
El é mino “canal iónico maxi-K”, al y como se u iliza en es a desc ipción debe en ende , en gene al, como
un canal compues o po un po o (p o eína llamada subunidad al a) y una subunidad egulado a (p o eína llamada
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subunidad be a1), codi icadas espec i amen e po los genes KCNMA1 y KCNMB1, que pe mi e el paso del ión
po asio a a és de la memb ana plasmá ica de la célula.
“Leucoci os en sang e pe i é ica” al y como se u iliza en es a desc ipción debe en ende se, en gene al, po glóbulos
blancos que ci culan en la sang e, y que en su mayo pa e son mononuclea es del ipo de los lin oci os.
La exp esión de los genes KCNMA1 y KCNMB1 puede se e aluada po cualquie mé odo con encional ap o-
piado, po ejemplo, de e minando el ni el de ARNm co espondien e a los genes KCNMA1 y KCNMB1 (ARNm de
KCNMA1 y ARNm de KCNMB1).
En el sen ido u ilizado en es a desc ipción, “de e mina el ni el de ARNm de KCNMA1 y el ni el de ARNm de
KCNMB1” incluye cualquie mé odo que pe mi a medi o es ima cuali a i a o cuan i a i amen e el ni el de ARNm
que se puede aduci en la p o eína KCNMA1 y en la p o eína KCNMB1 en células PBL. En es e caso, el ni el de
ARNm de KCNMA1 y de ARNm de KCNMB1 p opo ciona á in o mación ela i a al p onós ico de en e medades
ascula es como es la hipe ensión a e ial.
La de e minación del ni el ARNm de KCNMA1 y ARNm de KCNMB1 puede de e mina se median e cualquie
mé odo con encional ap opiado, po ejemplo, median e análisis No he n blo , mapeo con la nucleasa S1, eacción
en cadena de la polime asa (PCR), e o ansc ipción en combinación con la eacción encadena de la polime asa
(RT-PCR), e o ansc ipción en combinación con la eacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), hib idación o mic o-
a ays.
En una ealización del mé odo, la exp esión del ARNm de KCNMA1 y ARNm de KCNMB1 se e alúa median e
e o ansc ipción en combinación con la eacción en cadena de la polime asa (RT-PCR). En una ealización p e e ida,
es á de e minación se lle a a cabo usando cebado es (“p ime s”) de PCR que ampli ican un agmen o de ADN del
gen KCNMA1 seleccionados del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.
O a ealización del mé odo de diagnós ico comp ende un pa de cebado es de PCR que ampli ican un agmen o
de ADN del gen KCNMB1, seleccionados del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
O a ealización más del mé odo de diagnós ico comp ende un pa de cebado es de PCR que ampli ican un ag-
men o de ADN de la egión egulado a del gen 28S del ARN ibosomal, seleccionados del g upo o mado po las
secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
El ARNm ibosomal de la subunidad 28S es un gen conside ado “housekeeping”. Y es e é mino “gen housekee-
ping” signi ica en es a desc ipción un gen cuyo ni el de exp esión (en es e caso el ni el de su ARNm) no a ía de
o ma signi ica i a pa a una misma pe sona a pesa de es a some ida a di e en es condiciones expe imen ales.
La in ención ambién p opo ciona un mé odo pa a e alua la exp esión de los genes KCNMA1 y KCNMB1 de-
e minando el ni el de exp esión de las p o eínas co espondien e a dichos genes en PBL. Donde la exp esión de las
p o eínas co espondien es a los genes KCNMA1 y KCNMB1 se ealiza po cualquie mé odo con encional ap opia-
do, po ejemplo, median e écnicas basadas en el empleo de an icue pos, écnicas basadas en el diagnós ico po imagen
in i o, ci ome ía de lujo, p o eómica, e c.
En ealización p e e ida del mé odo, la e aluación de la exp esión de las p o eínas se ealiza median e ci ome ía
de lujo con an icue pos especí icos.
Un aspec o de la p esen e in ención comp ende un pa de cebado es de PCR que ampli ican un agmen o de ADN
de la egión codi icado a del gen KCNMA1, seleccionado del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ
ID NO: 2.
O o aspec o de la p esen e in ención comp ende un pa de cebado es de PCR que ampli ican un agmen o de
ADN de la egión codi icado a del gen KCNMB1, seleccionado del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 3
y SEQ ID NO: 4.
O o aspec o más de la p esen e in ención p opo ciona un pa de cebado es de PCR que ampli ican un agmen o
de ADN de la egión egulado a codi icado a del gen 28S del ARN ibosomal, seleccionado del g upo o mado po
las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
Aún o o aspec o más de la p esen e in ención comp ende un ki de diagnós ico de la hipe ensión a e ial humana
en una mues a de sang e o al, que comp ende oligonucleó idos cebado es seleccionados del g upo o mado po las
secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.
O o aspec o más de la p esen e in ención comp ende el uso de los leucoci os de sang e pe i é ica humana pa a
e alua el e ec o de sus ancias con po encial capacidad modulado a sob e la exp esión de los genes que codi ican
canales iónicos de in e és ca dio ascula . El ipo de genes e aluados en el leucoci o son canales iónicos de conocido
in e és en el á ea ascula y no p opiamen e del leucoci o. Así, po ejemplo, cambios en moléculas que ci culan po
la sang e (como puede se la disminución del oxígeno a e ial) p oducen una disminución de un gen, como puede se
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el KCNMB1, en las células de la capa muscula lisa ascula ex aíbles po biopsia, que es idén ica al e ec o que se
p oduce sob e es e mismo gen en células ácilmen e ex aíbles y analizables como son los PBL.
Una ealización p e e ida de la p esen e in ención es el uso de los PBL pa a cuan i ica la exp esión de los genes
de in e és ca dio ascula de ec ados en el músculo liso ascula .
O a ealización de la p esen e in ención es el uso de los PBL pa a cuan i ica la exp esión de genes (como po
ejemplo los genes KCNM), median e ARNm y/o p o eínas, como ma cado es p onós icos.
O a ealización más de la p esen e in ención es el uso de los PBL pa a cuan i ica la exp esión de genes (como
po ejemplo los genes KCNM), median e ARNm y/o p o eínas, como dianas e apéu icas.
A lo la go de oda la desc ipción y ei indicaciones de la especi icación, la palab a “comp ende” y las a iaciones
de la misma, no p e enden exclui o os aspec os de la p esen e in ención, que esul a án e iden es pa a un expe o en
la ma e ia a la is a de la desc ipción.
La exposición de allada de los modos de ealización y de las igu as que siguen se p opo cionan a modo de ilus a-
ción y no p e enden se limi an es de la p esen e in ención.
Desc ipción de las igu as
La Fig. 1 mues a las ec as de eg esión de la ampli icación de los genes KCNM (KCNMA1 y KCNMB1) y 28S, a
pa i de las cuales se calcula la can idad de exp esión de cada gen en la mues a. Se cons uye con can idades ela i as
de DNA complemen a io, po diluciones 1/2, 1/4, 1/8 y 1/16 ( / ) pa a los genes KCNM y diluciones 1/20,1/40,1/80
y 1/160 pa a el gen 28S. c.u. es el ciclo umb al, es deci , el ciclo de la PCR cuan i a i a a pa i del cual empieza
a de ec a se el gen; y C DNA es la can idad de DNA complemen a io que si e de molde en la eacción de la PCR
cuan i a i a.
La Fig. 2 mues a la banda de ampli icación del gen KCNMB1, señalado como β1, una ez ampli icado po PCR
cuan i a i a en a e ia mama ia humana (AM), en leucoci os humanos (PBL) y lin oci os humanos de una línea clónica
umo al (Ju ka ).
La Fig. 3 mues a el ni el de exp esión, medido po PCR cuan i a i a, del gen KCMNB1 en los ipos celula es
indicados (en PBL y Ju ka ) as incubación du an e 24 ho as en hipoxia del 1%. Al 100% de ni el de exp esión de
cada ipo celula iene una no moxia del 21% de oxígeno. PBL son leucoci os en sang e pe i é ica y Ju ka es una
línea celula es ablecida de lin oci os humanos umo ales.
La Fig. 4 mues a el ni el de exp esión, medido po PCR cuan i a i a, del gen KCMNB1 en los ipos celula es
indicados as incubación du an e 24 ho as en hipoxia del 1%. Al 100% de ni el de exp esión de cada ipo celula
iene una no moxia del 21% de oxígeno. M son mioci os a e iales, AOR-A7 5 es una línea celula es ablecida de
ao a de a a A7 5, AOR-SMC es cul i o p ima io a pa i de ao a de a a, ABR es cul i o p ima io a pa i de a e ia
basila de a a y AMH es cul i o p ima io a pa i de a e ia mama ia humana.
La Fig. 5 mues a co elaciones bipa amé icas en e la p esión a e ial sis ólica media (P) y la sa u ación a e ial
mínima de oxígeno (Sm O2), medidas en pacien es con SAOS.
La Fig. 6 mues a co elaciones bipa amé icas en e el ni el del ARN mensaje o (mRNA β1) del gen KCNMB1 y
la sa u ación a e ial mínima de oxígeno (Sm O2), medidas en pacien es con SAOS.
La Fig. 7 mues a co elaciones bipa amé icas en e el ni el del ARN mensaje o (mRNA β1) del gen KCNMB1 y
la p esión a e ial sis ólica media (P), medidas en pacien es con SAOS.
Exposición de allada de modos de ealización
A con inuación se ilus a á la in ención median e los siguien es ensayos ealizados po los in en o es, que ponen
de mani ies o la especi icidad y e ec i idad de mé odo y ki de diagnós ico pa a la hipe ensión a e ial humana.
Ejemplo 1
De ección cuan i a i a del ARNm de los genes KCNMA1 y KCNMB1 en PBL
Se ealizó el p esen e ejemplo en pacien es con sínd ome de apnea obs uc i a del sueño (SAOS), ambién llamado
Sínd ome de apnea/hipopnea del sueño (SAHS) o ambién, del inglés “obs uc i e sleep apnea synd ome” (OSAS).
De cada suje o en es udio, y as ob ene el consen imien o in o mado, se ex ajo median e enopunción pe i é ica
1 ml de sang e comple a.
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El ARNm de los leucoci os humanos ue ob enido en la p ime a ho a as la ex acción de la sang e median e el ki
come cial QlAamp®ARN Blood Mini ki (Qiagen) y 0,8 µg de ARN o al se usó pa a la eacción de e o ansc ipción
(RT) en el olumen inal de 60 µl , median e Supe sc ip TM Fi s -S and Syn hesis Sys em o RT-PCR (In i ogen),
siguiendo las ins ucciones del ab ican e.
La PCR cuan i a i a se ealizó con SYBR®G een PCR Mas e mix (Applied Biosys ems) en una mezcla de eac-
ción de 30 µl con eniendo: 1 x SYBR®G een PCR Mas e mix (que incluye ROX como luo oc omo de e e encia
pasi a), oligonucleó idos cebado es seleccionados de la abla 1 (150-300 nM), y 2 µl de una dilución 1/8 ( / ) (o una
dilución 1/80 ( / ) en el caso de la ampli icación de 28S) del olumen inal de la RT.
TABLA 1
Oligonucleó idos cebado es (“p ime s”) pa a la ampli icación po PCR
Las eacciones de PCR a iempo eal se lle a on a cabo en un apa a o Abip ism 7000 (Applied Biosys ems) usando
el siguien e p og ama:
•10 min a 95ºC, y a con inuación 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC y 1 minu o a 60ºC.
El ciclo de la PCR a iempo eal a pa i del cual comienza el aumen o de la señal luo escen e (ciclo umb al)
co elaciona con la can idad inicial de ARNm de la mues a. Así había una mayo exp esión del gen cuan o más
p ecoz es el ciclo umb al. La no malización de los alo es se ealizó median e la ampli icación simul ánea en pa alelo
de un gen conside ado “housekeeping” como es la subunidad 28S del ARN ibosomal.
Los p oduc os ampli icados po es a PCR se analiza on median e el p opio so wa e del apa a o Abip ism 7000. El
análisis de las cu as de disociación pa a cada gen mos ó un único pico con la empe a u a de disociación espe ada en
odas las mues as. La cuan i icación se ealizó median e la in e polación, usando una ec a de eg esión es ánda de
los alo es de ciclo umb al ob enidos a pa i de las diluciones se iadas 1/4, 1/8 y 1/16 ( / ) pa a los genes KCNMA1
y KCNMB1 (o 1/40, 1/80 y 1/160 ( / ) pa a el caso del gen no malizado 28S) a pa i del olumen inal de la RT
(Fig. 1).
Ejemplo 2
Diseño del ki de diagnós ico pa a la hipe ensión a e ial humana
En el ki diagnós ico se incluyó las pa ejas de oligonucleó idos cebado es, según la Tabla 1, pa a la ampli icación
de cada gen, KCNMA1 (αMaxi-K), KCNMB1 (β1 Maxi-K) y 28S del ARN ibosomal, median e PCR cuan i a i a
en iempo eal, y se diseña on con el p og ama P ime Exp ess 2.0 de Applied Biosys ems
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Ejemplo 3
Regulación de la exp esión de la subunidad be a1 po la ensión de O2en leucoci os humanos de sang e pe i é ica y
es be a1 en pacien es con SAHS
Se in es igó en un g upo de en e mos con SAHS, as ob ene el consen imien o in o mado, la co elación en e
el ni el de exp esión de la subunidad be a1 del canal maxi-K y la se e idad de la en e medad. Pa a de e mina la
exp esión y egulación po hipoxia de la subunidad be a1 del canal maxi-K se usa on los PBL, dado que la ealización
de una biopsia pa a ob ene músculo liso a e ial es una écnica c uen a y no exen a de iesgos.
Los leucoci os en sang e pe i é ica se ob u ie on sin complicaciones de sang e pe i é ica de los suje os es udiados,
es os PBL es án en con ac o di ec o con la ensión de O2y con ienen co ien es de po asio a ibuibles a canales maxi-
K (c . B ink, P.R., e al. Pluge s A ch. Eu . J. Physiol 1990, ol. 417, pp. 349-351; Ahluwalia, J e al., Na u e 2004,
ol. 427, pp. 853-856).
Tan o en PBL como en lin oci os de la línea clónica denominada Ju ka se ampli icó el ARNm de la subunidad
be a1 con un amaño de banda adecuado iden i icado po RT-PCR (Fig. 2), que luego se con i mó median e secuen-
ciación de los agmen os de la PCR.
La p esencia de la p o eína be a1 se con i mó median e inmunoci oquímica usando un an icue po especí ico en e
a la subunidad be a1. La exposición a hipoxia indujo en los dos ipos de leucoci os humanos un 50% de disminución
de la exp esión del ARNm de la subunidad be a1 (Fig. 3), un e ec o simila al obse ado en células muscula es lisas
a e iales (Fig. 4).
Basándose en es os esul ados, se de e minó sis emá icamen e el ni el de ARNm de be a1 en PBL de 10 pacien es
con SAHS no a ado. Los pacien es ue on a ones, con una media de edad de 45.2±2.9 años y con un índice de
masa co po al de 32.8±1.3 kg/m2. Los índices de apnea-hipopnea y de desa u ación ue on de 64.8±6.3 y 65±6.3,
espec i amen e.
Los alo es medios del es o de a iables medidas du an e el es udio polisomnog á ico indi idual y el es udio
de egis o du an e 24 ho as de la p esión a e ial se e lejan en la abla 2. La p esión a e ial sis ólica media de 24
ho as (Fig. 5) y los ni eles de ARNm de be a1 en PBL (Fig. 6, =0.64, p<0.05) se co elaciona on, aunque en sen ido
opues o, con el ni el mínimo de la sa u ación de 02 a e ial noc u na (Sm O2). Se de ec ó una ue e co elación
( =0.80; p<0.01) en e los ni eles de ARNm de be a1 y la p esión a e ial sis ólica (Fig. 7).
Es os da os sugie en que la hipoxemia in e mi en e c ónica induce una disminución de la exp esión de la subunidad
be a1 del canal maxi-K y es e enómeno puede conduci a hipe ensión a e ial.
TABLA 2
Pa áme os medidos en pacien es con SAOS du an e el es udio polisomnog á ico y el egis o con inuo du an e 24
ho as de la ensión a e ial (media ±e o es ánda de la media, n=10)
La in ención pone de mani ies o no sólo que un pa áme o molecula (ni el de exp esión de be a1) se co elaciona
con un ac o e iopa ogénico (como es la hipoxia) y con una a iable biológica de ex emada impo ancia (la ensión
a e ial), sino que implica que cambios cuan i a i os en el ni el de exp esión de be a1 condiciona ían las ci as de
ensión a e ial en humanos.
Es ablece en humanos que una di e encia cuan i a i a en la exp esión de la subunidad be a1 del canal maxi-
K se co elaciona con una di e en e ensión a e ial pone de mani ies o no sólo el alo como po encial ma cado
diagnós ico, sino el al o in e és e apéu ico que end án los á macos que modulen al alza la exp esión de dicho gen o
que di ec amen e ac i en la p o eína que codi ica.
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REIVINDICACIONES
1. Mé odo de diagnós ico de la hipe ensión a e ial humana, ca ac e izado po la de ección cuan i a i a de los
ni eles de exp esión del gen KCNMB1 en leucoci os de sang e pe i é ica de una mues a de sang e o al.
2. Mé odo según la ei indicación 1, donde la e aluación de la exp esión del gen KCNMB1 se ealiza de e minado
el ni el de ARNm co espondien e al gen KCNMB1 (ARNm de KCNMB1).
3. Mé odo según la ei indicación 2, donde la de e minación del ni el de ARNm de KCNMB1 se ealiza median e
análisis No he n blo , mapeo con la nucleasa S1, eacción en cadena de la polime asa (PCR), e o ansc ipción en
combinación con la eacción encadena dela polime asa (RT-PCR), e o ansc ipción en combinación con la eacción
en cadena de la ligasa (RT-LCR), hib idación o mic oa ays.
4. Mé odo según la ei indicación 3, donde la de e minación de ARNm de KCNMB1 se ealiza median e e o-
ansc ipción en combinación con la eacción en cadena de la polime asa (RT-PCR).
5. Mé odo según cualquie a de las ei indicaciones 2 a 4, donde se usan cebado es de PCR que ampli ican un
agmen o de ADN del gen KCNMB1, seleccionados del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID
NO: 4.
6. Mé odo según cualquie a de las ei indicaciones 2 a 4, donde se usan cebado es de PCR que ampli ican un
agmen o de ADN del gen 28S del ARN ibosomal, seleccionados del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO:
5 y SEQ ID NO: 6.
7. Mé odo según la ei indicación 1, donde la e aluación de la exp esión del gen KCNMB1 se ealiza de e minado
el ni el de exp esión de las p o eínas co espondien e a dicho gen.
8. Mé odo según la ei indicación 7, donde la e aluación de la exp esión de las p o eínas se ealiza median e
écnicas basadas en el empleo de an icue pos, écnicas basadas en el diagnós ico po imagen in i o, ci ome ía de
lujo o p o eómica.
9. Mé odo según la ei indicación 8, donde la e aluación de la exp esión de las p o eínas se ealiza median e
ci ome ía de lujo con an icue pos especí icos.
10. Pa de cebado es de PCR que ampli ican un agmen o de ADN de la egión egulado a del gen KCNMB1,
seleccionado del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
11. Pa de cebado es de PCR que ampli ican un agmen o de ADN de la egión egulado a del gen 28S del ARN
ibosomal, seleccionado del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
12. Ki de diagnós ico cuan i a i o de la hipe ensión a e ial humana, ca ac e izado po que comp ende oligonu-
cleó idos cebado es según las ei indicaciones 10 u 11.
13. Uso de los leucoci os de sang e pe i é ica humana en la e aluación del e ec o de sus ancias con po encial
capacidad modulado a sob e la exp esión del gen KCNMB1.
14. Uso de leucoci os, de sang e pe i é ica humana, pa a cuan i ica la exp esión del gen KCNMB1 y su ex apo-
lación a lo que sucede en las células del músculo liso.
15. Uso de los leucoci os, según la ei indicación 14, pa a cuan i ica la exp esión de genes, median e ARNm y/o
p o eínas, como ma cado es p onós icos de la hipe ensión a e ial.
16. Uso de los leucoci os, según la ei indicación 14, pa a cuan i ica la exp esión de genes, median e ARNm y/o
p o eínas, como dianas e apéu icas de la hipe ensión a e ial.
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