Método y kit de diagnóstico para la determinación cuantitativa de la expresión del canal maxi-K

19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Núme o de publicación: 2 296 465 21 Núme o de solici ud: 200502247 51 In . Cl.: C12Q 1/02 (2006.01) C07K 14/47 (2006.01) C12R 1/91 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 22 Fecha de p esen ación: 08.09.2005 43 Fecha de publicación de la solici ud: 16.04.2008 Fecha de la concesión: 23.02.2009 45 Fecha de anuncio de la concesión: 16.03.2009 45 Fecha de publicación del olle o de la pa en e: 16.03.2009 73 Ti ula /es: Uni e sidad de Se illa OTRI-Pabellón de B asil Paseo de las Delicias, s/n 41012 Se illa, ES 72 In en o /es: Na a o An olín, F ancisco Ja ie ; Le i sky, Kons an in; López Ba neo, José; Calde ón Sánchez, E a; O dóñez Fe nández, An onio; Villa López, José; Ca mona Be nal, Ca men y Capo e Gil, F ancisco 74 Agen e: No cons a 54 Tí ulo: Mé odo y ki de diagnós ico pa a la de e minación cuan i a i a de la exp esión del canal maxi-K. 57 Resumen: Mé odo y ki de diagnós ico pa a la de e minación cuan i- a i a de la exp esión del canal maxi-K. La p esen e in ención se e ie e a un mé odo y ki de diag- nós ico pa a la de e minación cuan i a i a en leucoci os de sang e pe i é ica de una mues a de sang e o al de la exp esión de los genes KCNM implicados en la hipe en- sión a e ial humana. En conc e o de la exp esión, de los ni eles de ARNm y/o p o eínas, de las subunidades al a y be a1 del canal iónico maxi-K, es deci , de los genes KCNMA1 y KCNMB1. A iso: Se puede ealiza consul a p e is a po el a . 37.3.8 LP. ES 2 296 465 B1 Ven a de ascículos: O icina Española de Pa en es y Ma cas. Pº de la Cas ellana, 75 – 28071 Mad id 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 296 465 B1 DESCRIPCIÓN Mé odo y ki de diagnós ico pa a la de e minación cuan i a i a de la exp esión del canal maxi-K. La p esen e in ención se e ie e a un mé odo de análisis in i o y ki de diagnós ico, pa a la de e minación cuan- i a i a de la exp esión de los genes KCNM o de sus p oduc os de ansc ipción o exp esión. En conc e o, de los genes KCNMA1 y KCNMB1 que codi ican las subunidades al a y be a1 del canal iónico maxi-K implicados en la hipe ensión a e ial humana. Es ado de la écnica an e io La hipe ensión a e ial es el aumen o de o ma c ónica de la p esión a e ial. Se a a de una en e medad que no da sín omas du an e mucho iempo y dejada a su e olución sin a amien o puede se que el p ime sín oma que de ella se enga sea una complicación se e a como un in a o de mioca dio, una de los p incipales iesgos, ombos o up u as a e iales, pudiendo da luga a hemo agias, daño en las células ne iosas, pé dida de memo ia, pa álisis, e c. El iñón ambién su e las consecuencias de la hipe ensión a e ial y en e los pacien es hipe ensos se p oduce insu iciencia enal con más ecuencia que en e los pacien es no mo ensos. Los pequeños asos del ondo del ojo (que se mi an con el o almoscopio), ambién se en amenazados po la hipe ensión, su o u a p oduce hemo agia llegándose incluso a la pé dida de la isión. Todos es os iesgos se pueden e i a si se a a y con ola la hipe ensión adecuadamen e. Expe imen almen e, se ha demos ado la elación exis en e en e la p esión a e ial y la apnea del sueño obs uc i a (OSA), la hypoxia y de los as o nos en la espi ación ela i os al sueño (c . Da ies, C.W.H. e al., Tho ax 2000, ol. 55, pp. 736-740; Fle che , E.C. J. Appl. Physiol 2001, ol. 90, pp. 1600-1605; G o e e al., J. Hype ens 2000, ol. 18, pp. 679-685). Siendo es e ipo de en e medades un oco de in o mación pa a p oblemas ca dio ascula es y de hipe ensión a e ial. Uno de los a ances sob e la es uc u a y unción de las p o eínas que han su gido de la in es igación en gené ica molecula son los canales iónicos. Es os canales pe enecen a una amilia de p o eínas que o man úneles mac omole- cula es a a és de la memb ana plasmá ica y que se enca gan de con ola el lujo de iónes hacia el ex e io o in e io de las células. Las obse aciones p e ias que elacionan la subunidad be a-1 del canal iónico maxi-K (exp esado po el gen KCNMB1) y la hipe ensión se basa en cambios cuali a i os, como es la no exis encia del gen en el a ón, con un es ado hipe ensi o en el a ón knockou pa a la subunidad be a-1, o como es el cambio de un solo aminoácido mo i ado po una mu ación pun ual en humanos (p o ección en e a la hipe ensión dias ólica en suje os po ado es de dicha mu ación) (c . Fe nández-Fe nández, J.M. e al., J. Clin. In es 2004, ol. 113, pp. 1032-1039). En la ac ualidad pa a hace un es udio de las posibles modi icaciones del ni el de exp esión de genes de in e és ascula , se hace de o ma c uen a, po medio de una biopsia pa a ob ene ejido de la pa ed a e ial. Explicación de la in ención La in ención se en en a, en gene al, con el p oblema de encon a un mé odo de diagnós ico cuan i a i o pa a la de e minación y/o de ección de la hipe ensión a e ial humana, en células cuyo p oceso de ex acción no sea ag esi o pa a el pacien e. La solución p opo cionada se basa en que los au o es de la p esen e in ención han descubie o, so p enden emen e, que la exp esión de los genes KCNM, en pa icula de los genes KCNMA1 y KCNMB1, o de sus p oduc os de ansc ipción o exp esión (ARN o p o eína) en leucoci os de sang e pe i é ica (PBL), se puede cuan i ica pa a la de ección de la hipe ensión a e ial humana. KCNMA1 y KCNMB1 son dos genes que codi ican dos p o eínas las cuales al ensambla se o man el canal iónico maxi-K. En e las posibles aplicaciones de i adas de la p esen e in ención se incluye el p opo ciona un ki de diagnós ico de la hipe ensión a e ial humana en PBL, jun o con el uso de los PBL pa a la cuan i icación de los genes que codi ican canales iónicos de impo ancia en la pa ed ascula y no p opiamen e del leucoci o, pe mi iendo usa los PBL como es igos a dis ancia de la egulación de es os genes, que codi ican canales iónicos ascula es. De acue do con un aspec o de la p esen e in ención, se p opo ciona un mé odo de diagnós ico de la hipe ensión a e ial humana median e la de ección cuan i a i a de los ni eles de exp esión de los genes KCNM en leucoci os de sang e pe i é ica (PBL) de una mues a de sang e o al. Los PBL son ob enidos median e cualquie mé odo adicional, sob adamen e conocido en el es ado de la écnica, como una ex acción de sang e. El mé odo p opo cionado po es a in ención, comp ende la de ección cuan i a i a de los ni eles de exp esión de los genes KCNM, en pa icula los genes KCNMA1 y KCNMB1. Donde es os genes codi ican p o eínas pa a las unidades al a y be a1 del canal iónico maxi-K. El é mino “canal iónico maxi-K”, al y como se u iliza en es a desc ipción debe en ende , en gene al, como un canal compues o po un po o (p o eína llamada subunidad al a) y una subunidad egulado a (p o eína llamada 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 296 465 B1 subunidad be a1), codi icadas espec i amen e po los genes KCNMA1 y KCNMB1, que pe mi e el paso del ión po asio a a és de la memb ana plasmá ica de la célula. “Leucoci os en sang e pe i é ica” al y como se u iliza en es a desc ipción debe en ende se, en gene al, po glóbulos blancos que ci culan en la sang e, y que en su mayo pa e son mononuclea es del ipo de los lin oci os. La exp esión de los genes KCNMA1 y KCNMB1 puede se e aluada po cualquie mé odo con encional ap o- piado, po ejemplo, de e minando el ni el de ARNm co espondien e a los genes KCNMA1 y KCNMB1 (ARNm de KCNMA1 y ARNm de KCNMB1). En el sen ido u ilizado en es a desc ipción, “de e mina el ni el de ARNm de KCNMA1 y el ni el de ARNm de KCNMB1” incluye cualquie mé odo que pe mi a medi o es ima cuali a i a o cuan i a i amen e el ni el de ARNm que se puede aduci en la p o eína KCNMA1 y en la p o eína KCNMB1 en células PBL. En es e caso, el ni el de ARNm de KCNMA1 y de ARNm de KCNMB1 p opo ciona á in o mación ela i a al p onós ico de en e medades ascula es como es la hipe ensión a e ial. La de e minación del ni el ARNm de KCNMA1 y ARNm de KCNMB1 puede de e mina se median e cualquie mé odo con encional ap opiado, po ejemplo, median e análisis No he n blo , mapeo con la nucleasa S1, eacción en cadena de la polime asa (PCR), e o ansc ipción en combinación con la eacción encadena de la polime asa (RT-PCR), e o ansc ipción en combinación con la eacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), hib idación o mic o- a ays. En una ealización del mé odo, la exp esión del ARNm de KCNMA1 y ARNm de KCNMB1 se e alúa median e e o ansc ipción en combinación con la eacción en cadena de la polime asa (RT-PCR). En una ealización p e e ida, es á de e minación se lle a a cabo usando cebado es (“p ime s”) de PCR que ampli ican un agmen o de ADN del gen KCNMA1 seleccionados del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. O a ealización del mé odo de diagnós ico comp ende un pa de cebado es de PCR que ampli ican un agmen o de ADN del gen KCNMB1, seleccionados del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. O a ealización más del mé odo de diagnós ico comp ende un pa de cebado es de PCR que ampli ican un ag- men o de ADN de la egión egulado a del gen 28S del ARN ibosomal, seleccionados del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. El ARNm ibosomal de la subunidad 28S es un gen conside ado “housekeeping”. Y es e é mino “gen housekee- ping” signi ica en es a desc ipción un gen cuyo ni el de exp esión (en es e caso el ni el de su ARNm) no a ía de o ma signi ica i a pa a una misma pe sona a pesa de es a some ida a di e en es condiciones expe imen ales. La in ención ambién p opo ciona un mé odo pa a e alua la exp esión de los genes KCNMA1 y KCNMB1 de- e minando el ni el de exp esión de las p o eínas co espondien e a dichos genes en PBL. Donde la exp esión de las p o eínas co espondien es a los genes KCNMA1 y KCNMB1 se ealiza po cualquie mé odo con encional ap opia- do, po ejemplo, median e écnicas basadas en el empleo de an icue pos, écnicas basadas en el diagnós ico po imagen in i o, ci ome ía de lujo, p o eómica, e c. En ealización p e e ida del mé odo, la e aluación de la exp esión de las p o eínas se ealiza median e ci ome ía de lujo con an icue pos especí icos. Un aspec o de la p esen e in ención comp ende un pa de cebado es de PCR que ampli ican un agmen o de ADN de la egión codi icado a del gen KCNMA1, seleccionado del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. O o aspec o de la p esen e in ención comp ende un pa de cebado es de PCR que ampli ican un agmen o de ADN de la egión codi icado a del gen KCNMB1, seleccionado del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. O o aspec o más de la p esen e in ención p opo ciona un pa de cebado es de PCR que ampli ican un agmen o de ADN de la egión egulado a codi icado a del gen 28S del ARN ibosomal, seleccionado del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. Aún o o aspec o más de la p esen e in ención comp ende un ki de diagnós ico de la hipe ensión a e ial humana en una mues a de sang e o al, que comp ende oligonucleó idos cebado es seleccionados del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6. O o aspec o más de la p esen e in ención comp ende el uso de los leucoci os de sang e pe i é ica humana pa a e alua el e ec o de sus ancias con po encial capacidad modulado a sob e la exp esión de los genes que codi ican canales iónicos de in e és ca dio ascula . El ipo de genes e aluados en el leucoci o son canales iónicos de conocido in e és en el á ea ascula y no p opiamen e del leucoci o. Así, po ejemplo, cambios en moléculas que ci culan po la sang e (como puede se la disminución del oxígeno a e ial) p oducen una disminución de un gen, como puede se 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 296 465 B1 el KCNMB1, en las células de la capa muscula lisa ascula ex aíbles po biopsia, que es idén ica al e ec o que se p oduce sob e es e mismo gen en células ácilmen e ex aíbles y analizables como son los PBL. Una ealización p e e ida de la p esen e in ención es el uso de los PBL pa a cuan i ica la exp esión de los genes de in e és ca dio ascula de ec ados en el músculo liso ascula . O a ealización de la p esen e in ención es el uso de los PBL pa a cuan i ica la exp esión de genes (como po ejemplo los genes KCNM), median e ARNm y/o p o eínas, como ma cado es p onós icos. O a ealización más de la p esen e in ención es el uso de los PBL pa a cuan i ica la exp esión de genes (como po ejemplo los genes KCNM), median e ARNm y/o p o eínas, como dianas e apéu icas. A lo la go de oda la desc ipción y ei indicaciones de la especi icación, la palab a “comp ende” y las a iaciones de la misma, no p e enden exclui o os aspec os de la p esen e in ención, que esul a án e iden es pa a un expe o en la ma e ia a la is a de la desc ipción. La exposición de allada de los modos de ealización y de las igu as que siguen se p opo cionan a modo de ilus a- ción y no p e enden se limi an es de la p esen e in ención. Desc ipción de las igu as La Fig. 1 mues a las ec as de eg esión de la ampli icación de los genes KCNM (KCNMA1 y KCNMB1) y 28S, a pa i de las cuales se calcula la can idad de exp esión de cada gen en la mues a. Se cons uye con can idades ela i as de DNA complemen a io, po diluciones 1/2, 1/4, 1/8 y 1/16 ( / ) pa a los genes KCNM y diluciones 1/20,1/40,1/80 y 1/160 pa a el gen 28S. c.u. es el ciclo umb al, es deci , el ciclo de la PCR cuan i a i a a pa i del cual empieza a de ec a se el gen; y C DNA es la can idad de DNA complemen a io que si e de molde en la eacción de la PCR cuan i a i a. La Fig. 2 mues a la banda de ampli icación del gen KCNMB1, señalado como β1, una ez ampli icado po PCR cuan i a i a en a e ia mama ia humana (AM), en leucoci os humanos (PBL) y lin oci os humanos de una línea clónica umo al (Ju ka ). La Fig. 3 mues a el ni el de exp esión, medido po PCR cuan i a i a, del gen KCMNB1 en los ipos celula es indicados (en PBL y Ju ka ) as incubación du an e 24 ho as en hipoxia del 1%. Al 100% de ni el de exp esión de cada ipo celula iene una no moxia del 21% de oxígeno. PBL son leucoci os en sang e pe i é ica y Ju ka es una línea celula es ablecida de lin oci os humanos umo ales. La Fig. 4 mues a el ni el de exp esión, medido po PCR cuan i a i a, del gen KCMNB1 en los ipos celula es indicados as incubación du an e 24 ho as en hipoxia del 1%. Al 100% de ni el de exp esión de cada ipo celula iene una no moxia del 21% de oxígeno. M son mioci os a e iales, AOR-A7 5 es una línea celula es ablecida de ao a de a a A7 5, AOR-SMC es cul i o p ima io a pa i de ao a de a a, ABR es cul i o p ima io a pa i de a e ia basila de a a y AMH es cul i o p ima io a pa i de a e ia mama ia humana. La Fig. 5 mues a co elaciones bipa amé icas en e la p esión a e ial sis ólica media (P) y la sa u ación a e ial mínima de oxígeno (Sm O2), medidas en pacien es con SAOS. La Fig. 6 mues a co elaciones bipa amé icas en e el ni el del ARN mensaje o (mRNA β1) del gen KCNMB1 y la sa u ación a e ial mínima de oxígeno (Sm O2), medidas en pacien es con SAOS. La Fig. 7 mues a co elaciones bipa amé icas en e el ni el del ARN mensaje o (mRNA β1) del gen KCNMB1 y la p esión a e ial sis ólica media (P), medidas en pacien es con SAOS. Exposición de allada de modos de ealización A con inuación se ilus a á la in ención median e los siguien es ensayos ealizados po los in en o es, que ponen de mani ies o la especi icidad y e ec i idad de mé odo y ki de diagnós ico pa a la hipe ensión a e ial humana. Ejemplo 1 De ección cuan i a i a del ARNm de los genes KCNMA1 y KCNMB1 en PBL Se ealizó el p esen e ejemplo en pacien es con sínd ome de apnea obs uc i a del sueño (SAOS), ambién llamado Sínd ome de apnea/hipopnea del sueño (SAHS) o ambién, del inglés “obs uc i e sleep apnea synd ome” (OSAS). De cada suje o en es udio, y as ob ene el consen imien o in o mado, se ex ajo median e enopunción pe i é ica 1 ml de sang e comple a. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 296 465 B1 El ARNm de los leucoci os humanos ue ob enido en la p ime a ho a as la ex acción de la sang e median e el ki come cial QlAamp®ARN Blood Mini ki (Qiagen) y 0,8 µg de ARN o al se usó pa a la eacción de e o ansc ipción (RT) en el olumen inal de 60 µl , median e Supe sc ip TM Fi s -S and Syn hesis Sys em o RT-PCR (In i ogen), siguiendo las ins ucciones del ab ican e. La PCR cuan i a i a se ealizó con SYBR®G een PCR Mas e mix (Applied Biosys ems) en una mezcla de eac- ción de 30 µl con eniendo: 1 x SYBR®G een PCR Mas e mix (que incluye ROX como luo oc omo de e e encia pasi a), oligonucleó idos cebado es seleccionados de la abla 1 (150-300 nM), y 2 µl de una dilución 1/8 ( / ) (o una dilución 1/80 ( / ) en el caso de la ampli icación de 28S) del olumen inal de la RT. TABLA 1 Oligonucleó idos cebado es (“p ime s”) pa a la ampli icación po PCR Las eacciones de PCR a iempo eal se lle a on a cabo en un apa a o Abip ism 7000 (Applied Biosys ems) usando el siguien e p og ama: •10 min a 95ºC, y a con inuación 40 ciclos de 15 segundos a 95ºC y 1 minu o a 60ºC. El ciclo de la PCR a iempo eal a pa i del cual comienza el aumen o de la señal luo escen e (ciclo umb al) co elaciona con la can idad inicial de ARNm de la mues a. Así había una mayo exp esión del gen cuan o más p ecoz es el ciclo umb al. La no malización de los alo es se ealizó median e la ampli icación simul ánea en pa alelo de un gen conside ado “housekeeping” como es la subunidad 28S del ARN ibosomal. Los p oduc os ampli icados po es a PCR se analiza on median e el p opio so wa e del apa a o Abip ism 7000. El análisis de las cu as de disociación pa a cada gen mos ó un único pico con la empe a u a de disociación espe ada en odas las mues as. La cuan i icación se ealizó median e la in e polación, usando una ec a de eg esión es ánda de los alo es de ciclo umb al ob enidos a pa i de las diluciones se iadas 1/4, 1/8 y 1/16 ( / ) pa a los genes KCNMA1 y KCNMB1 (o 1/40, 1/80 y 1/160 ( / ) pa a el caso del gen no malizado 28S) a pa i del olumen inal de la RT (Fig. 1). Ejemplo 2 Diseño del ki de diagnós ico pa a la hipe ensión a e ial humana En el ki diagnós ico se incluyó las pa ejas de oligonucleó idos cebado es, según la Tabla 1, pa a la ampli icación de cada gen, KCNMA1 (αMaxi-K), KCNMB1 (β1 Maxi-K) y 28S del ARN ibosomal, median e PCR cuan i a i a en iempo eal, y se diseña on con el p og ama P ime Exp ess 2.0 de Applied Biosys ems 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 296 465 B1 Ejemplo 3 Regulación de la exp esión de la subunidad be a1 po la ensión de O2en leucoci os humanos de sang e pe i é ica y es be a1 en pacien es con SAHS Se in es igó en un g upo de en e mos con SAHS, as ob ene el consen imien o in o mado, la co elación en e el ni el de exp esión de la subunidad be a1 del canal maxi-K y la se e idad de la en e medad. Pa a de e mina la exp esión y egulación po hipoxia de la subunidad be a1 del canal maxi-K se usa on los PBL, dado que la ealización de una biopsia pa a ob ene músculo liso a e ial es una écnica c uen a y no exen a de iesgos. Los leucoci os en sang e pe i é ica se ob u ie on sin complicaciones de sang e pe i é ica de los suje os es udiados, es os PBL es án en con ac o di ec o con la ensión de O2y con ienen co ien es de po asio a ibuibles a canales maxi- K (c . B ink, P.R., e al. Pluge s A ch. Eu . J. Physiol 1990, ol. 417, pp. 349-351; Ahluwalia, J e al., Na u e 2004, ol. 427, pp. 853-856). Tan o en PBL como en lin oci os de la línea clónica denominada Ju ka se ampli icó el ARNm de la subunidad be a1 con un amaño de banda adecuado iden i icado po RT-PCR (Fig. 2), que luego se con i mó median e secuen- ciación de los agmen os de la PCR. La p esencia de la p o eína be a1 se con i mó median e inmunoci oquímica usando un an icue po especí ico en e a la subunidad be a1. La exposición a hipoxia indujo en los dos ipos de leucoci os humanos un 50% de disminución de la exp esión del ARNm de la subunidad be a1 (Fig. 3), un e ec o simila al obse ado en células muscula es lisas a e iales (Fig. 4). Basándose en es os esul ados, se de e minó sis emá icamen e el ni el de ARNm de be a1 en PBL de 10 pacien es con SAHS no a ado. Los pacien es ue on a ones, con una media de edad de 45.2±2.9 años y con un índice de masa co po al de 32.8±1.3 kg/m2. Los índices de apnea-hipopnea y de desa u ación ue on de 64.8±6.3 y 65±6.3, espec i amen e. Los alo es medios del es o de a iables medidas du an e el es udio polisomnog á ico indi idual y el es udio de egis o du an e 24 ho as de la p esión a e ial se e lejan en la abla 2. La p esión a e ial sis ólica media de 24 ho as (Fig. 5) y los ni eles de ARNm de be a1 en PBL (Fig. 6, =0.64, p<0.05) se co elaciona on, aunque en sen ido opues o, con el ni el mínimo de la sa u ación de 02 a e ial noc u na (Sm O2). Se de ec ó una ue e co elación ( =0.80; p<0.01) en e los ni eles de ARNm de be a1 y la p esión a e ial sis ólica (Fig. 7). Es os da os sugie en que la hipoxemia in e mi en e c ónica induce una disminución de la exp esión de la subunidad be a1 del canal maxi-K y es e enómeno puede conduci a hipe ensión a e ial. TABLA 2 Pa áme os medidos en pacien es con SAOS du an e el es udio polisomnog á ico y el egis o con inuo du an e 24 ho as de la ensión a e ial (media ±e o es ánda de la media, n=10) La in ención pone de mani ies o no sólo que un pa áme o molecula (ni el de exp esión de be a1) se co elaciona con un ac o e iopa ogénico (como es la hipoxia) y con una a iable biológica de ex emada impo ancia (la ensión a e ial), sino que implica que cambios cuan i a i os en el ni el de exp esión de be a1 condiciona ían las ci as de ensión a e ial en humanos. Es ablece en humanos que una di e encia cuan i a i a en la exp esión de la subunidad be a1 del canal maxi- K se co elaciona con una di e en e ensión a e ial pone de mani ies o no sólo el alo como po encial ma cado diagnós ico, sino el al o in e és e apéu ico que end án los á macos que modulen al alza la exp esión de dicho gen o que di ec amen e ac i en la p o eína que codi ica. 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 296 465 B1 REIVINDICACIONES 1. Mé odo de diagnós ico de la hipe ensión a e ial humana, ca ac e izado po la de ección cuan i a i a de los ni eles de exp esión del gen KCNMB1 en leucoci os de sang e pe i é ica de una mues a de sang e o al. 2. Mé odo según la ei indicación 1, donde la e aluación de la exp esión del gen KCNMB1 se ealiza de e minado el ni el de ARNm co espondien e al gen KCNMB1 (ARNm de KCNMB1). 3. Mé odo según la ei indicación 2, donde la de e minación del ni el de ARNm de KCNMB1 se ealiza median e análisis No he n blo , mapeo con la nucleasa S1, eacción en cadena de la polime asa (PCR), e o ansc ipción en combinación con la eacción encadena dela polime asa (RT-PCR), e o ansc ipción en combinación con la eacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), hib idación o mic oa ays. 4. Mé odo según la ei indicación 3, donde la de e minación de ARNm de KCNMB1 se ealiza median e e o- ansc ipción en combinación con la eacción en cadena de la polime asa (RT-PCR). 5. Mé odo según cualquie a de las ei indicaciones 2 a 4, donde se usan cebado es de PCR que ampli ican un agmen o de ADN del gen KCNMB1, seleccionados del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. 6. Mé odo según cualquie a de las ei indicaciones 2 a 4, donde se usan cebado es de PCR que ampli ican un agmen o de ADN del gen 28S del ARN ibosomal, seleccionados del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. 7. Mé odo según la ei indicación 1, donde la e aluación de la exp esión del gen KCNMB1 se ealiza de e minado el ni el de exp esión de las p o eínas co espondien e a dicho gen. 8. Mé odo según la ei indicación 7, donde la e aluación de la exp esión de las p o eínas se ealiza median e écnicas basadas en el empleo de an icue pos, écnicas basadas en el diagnós ico po imagen in i o, ci ome ía de lujo o p o eómica. 9. Mé odo según la ei indicación 8, donde la e aluación de la exp esión de las p o eínas se ealiza median e ci ome ía de lujo con an icue pos especí icos. 10. Pa de cebado es de PCR que ampli ican un agmen o de ADN de la egión egulado a del gen KCNMB1, seleccionado del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4. 11. Pa de cebado es de PCR que ampli ican un agmen o de ADN de la egión egulado a del gen 28S del ARN ibosomal, seleccionado del g upo o mado po las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. 12. Ki de diagnós ico cuan i a i o de la hipe ensión a e ial humana, ca ac e izado po que comp ende oligonu- cleó idos cebado es según las ei indicaciones 10 u 11. 13. Uso de los leucoci os de sang e pe i é ica humana en la e aluación del e ec o de sus ancias con po encial capacidad modulado a sob e la exp esión del gen KCNMB1. 14. Uso de leucoci os, de sang e pe i é ica humana, pa a cuan i ica la exp esión del gen KCNMB1 y su ex apo- lación a lo que sucede en las células del músculo liso. 15. Uso de los leucoci os, según la ei indicación 14, pa a cuan i ica la exp esión de genes, median e ARNm y/o p o eínas, como ma cado es p onós icos de la hipe ensión a e ial. 16. Uso de los leucoci os, según la ei indicación 14, pa a cuan i ica la exp esión de genes, median e ARNm y/o p o eínas, como dianas e apéu icas de la hipe ensión a e ial. 7 ES 2 296 465 B1 8 ES 2 296 465 B1 9