COMPORTAMIENTO DE LA MATERIA
ORGÁNICA Y PLAGUICIDAS EN UN SUELO
AGRÍCOLA SOMETIDO A SEQUÍA SEVERA.
EFECTOS EN LAS PROPIEDADES
QUÍMICAS Y BIOLÓGICAS.
Memo ia que p esen a Luis Miguel F anco And eu
pa a op a al í ulo de Doc o en Química.
Se illa, Ma zo 2017.
Fdo. Luis Miguel F anco And eu
UNIVERSIDAD DE SEVILLA
DEPARTAMENTO DE CRISTALOGRAFIA, MINERALOGIA Y QUIMICA
AGRICOLA
D a. Rosa io Vaz Pa dal, di ec o a del Depa amen o de C is alog a ía, Mine alogía y
Química Ag ícola,
CERTIFICA:
Fi mado:
D a. Rosa io Vaz Pa dal
Se illa, Ma zo 2017
Que el Ldo. D. Luis Miguel F anco And eu ha ealizado bajo la
di ección de los doc o es D. Manuel Tejada Mo al y D. Isido o
Gómez Pa ales el abajo i ulado “COMPORTAMIENTO DE
LA MATERIA ORGÁNICA Y PLAGUICIDAS EN UN
SUELO AGRÍCOLA SOMETIDO A SEQUÍA SEVERA.
EFECTOS EN LAS PROPIEDADES QUÍMICAS Y
BIOLÓGICAS.” Pa a op a al g ado de Doc o po la
Uni e sidad de Se illa, cumpliendo los equisi os de la
legislación igen e.
COMPORTAMIENTO DE LA MATERIA
ORGÁNICA Y PLAGUICIDAS EN UN SUELO
AGRÍCOLA SOMETIDO A SEQUÍA SEVERA.
EFECTOS EN LAS PROPIEDADES
QUÍMICAS Y BIOLÓGICAS
Depa amen o de C is alog a ía, Mine alogía y
Química Ag ícola
Uni e sidad de Se illa
P og ama de doc o ado:
RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
Línea de in es igación:
EDAFOLOGIA AMBIENTAL
Visado en Se illa, Ma zo 2017
LOS DIRECTORES
D . Manuel Tejada Mo al
P o eso Ti ula , Uni e sidad de Se illa
D . Isido o Gómez Pa ales
P o eso Con a ado Doc o , Uni e sidad de Se illa

AGRADECIMIENTOS
(Po que es de bien nacidos se ag adecidos)
En es as líneas quie o exp esa mi más since o y p o undo ag adecimien o a odas
esas pe sonas con las que he con i ido es os es años y que me han aguan ado has a la
inalización de la p esen e esis.
En p ime luga , y muy a mi pesa po el hecho de se bé ico, a la Peña Se illis a
de San José de la Rinconada, po da me abajo, g acias al cual he podido ealiza la
p esen e esis doc o al, en especial a Paqui y An onio, po se an buenos compañe os.
A mis di ec o es de esis, D . Manuel Tejada Mo al y D . Isido o Gómez Pa ales,
po la o ien ación, paciencia, consejos y apoyo du an e es os años.
A Ma ía José Ma ínez de Alba y a José Luis Lozano, po es a en las buenas y las
malas, po anima me cuando lo necesi aba, po echa me una mano y po es a ahí
conmigo desde el p incipio de la p esen e esis doc o al.
A la p o eso a D a. Pa icia Paneque Macías, po deja me da mis p ime os pasos
en la in es igación y po con e i se con el paso de los años en una muy buena amiga.
G acias, Pa i.
A las p o eso as de la Escuela Técnica Supe io de Ingenie ía Ag onómica, D a.
Ma ía Luz Ma o Iglesias y D a. Ma ina del To o Ca illo de Albo noz, po su apoyo
du an e es os es años y po los a os en la máquina de ca é, que hicie on más lle ade a
es a e apa.
Al ca ed á ico Juan Pa ado Rubio, po sus aliosos consejos y po a ende me
siemp e que necesi aba ayuda.
A la gen e del labo a o io del depa amen o de Bioquímica y biología molecula
de la acul ad de Fa macia, en especial a B uno, po deja me hace uso del labo a o io,
ins ui me en aquello que no sabía… y po in i a me a ce ezas siemp e que se podía.
A la p o eso a de in es igación D a. Heike Knike , po p es a me su ayuda en la
esolución de los espec os de RMN.
A odos los alumnos de abajo de in de g ado que han pasado po el labo a o io:
Ma isa, Luis y Ad ián, en especial, a pesa de que no comenzamos con buen pie, a Ma ía
Ma ín Ga cía, po su apoyo, po aguan a nos mu uamen e, po nues as on e ías, y po
hace que el labo a o io ue a un si io menos abu ido.
A mi amilia, muy en especial a mis pad es, mi he mano y mi cuñada, po es a a
mi lado siemp e, po su ca iño y apoyo incondicional; pe o sob e odo po habe su ido
con paciencia la ealización de es a esis.
A mi o a “ amilia”, esas pe sonas que han es ado ahí, incluso desde mucho an es
de la ealización de la p esen e esis: Ángel Luis Na a o, C is ina Lamilla, Amanda
Ma ín, En ique Ma ón, Juan Pablo Ga cía, Paloma Á ila, Alejand o Moya y Ca los
Sales, en especial, a Ja ie Cas o Pozuelos y Luis Albe o Díaz Cas o, quienes han
es ado conmigo desde el p incipio de la ca e a y a los cuales los conside o como si ue an
mis he manos.
INDICE
Índice de ablas
VI
Tabla 10. E olución del Ca bono de ácidos úl icos y ácidos húmicos (media ± e o
es ánda , n = 3) en suelos egados y no egados du an e el pe iodo expe imen al. Los
núme os en la ila seguidos po la misma le a no son signi ica i amen e di e en es
(p>0,05)………………………………………………………………………………62
Tabla 11. E olución de los picos de RMN de 13C en es ado sólido y elación C alquilo/C
O-alquilo (A/O-A) en los a amien os e ilizan es a los 30 y 365 días de iniciado el
expe imen o……………………………………………………………………….….64
Tabla 12. E olución de bac e ias G am+, G am-, bac e ias o ales PLFAs y hongos
PLFAs (ng g-1) (media ± e o es ánda , n = 3) en los a amien os e ilizan es a los 30
y 365 días de iniciado el expe imen o Columnas con la misma le a(s) no p esen an
di e encias signi ica i as (p>0,05)…………………………………………………….70
Tabla 13. E olución de la ac i idad deshid ogenasa (μg INTF g-1 h-1) (media ± e o
es ánda , n = 3) en suelos egados y no egados en p esencia de oxi luo en y clo pi i os
du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no p esen an
di e encias signi ica i as (p>0,05). INTF: 2-p-iodo-3-ni ophenyl o mazan…….…..73
Tabla 14. E olución de la ac i idad u easa (μg NH4+ g-1 h-1) (media ± e o es ánda , n =
3) en suelos egados y no egados en p esencia de oxi luo en y clo pi i os du an e el
pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no p esen an di e encias
signi ica i as (p>0,05)……………………………………………………….….…….76
Tabla 15. E olución de la ac i idad β-glucosidasa (mmol PNP g-1 h-1)(media ± e o
es ánda , n = 3) en suelos egados y no egados en p esencia de oxi luo en y clo pi i os
du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no p esen an
di e encias signi ica i as (p>0,05).PNP: p-ni o enol……………………….…………77
Tabla 16. E olución de la ac i idad os a asa (µmol PNP g-1 h-1) (media ± e o
es ánda , n = 3) en suelos egados y no egados en p esencia de oxi luo en y clo pi i os
du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no p esen an
di e encias signi ica i as (p>0,05). PNP: p-ni o enol………………….………..……78
Tabla 17. E olución de bac e ias G am+, G am-, bac e ias o ales PLFAs y hongos
PLFAs (ng g-1) (media ± e o es ánda , n = 3) en suelos egados y no egados con
oxi luo en du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no
p esen an di e encias signi ica i as (p>0,05)…………………………………….…….80
Tabla 18. E olución de bac e ias G am+, G am-, bac e ias o ales PLFAs y hongos
PLFAs (ng g-1) (media ± e o es ánda , n = 3) en suelos egados y no egados con

Índice de ablas
VII
clo pi i os du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no
p esen an di e encias signi ica i as (p>0,05)………………………………………….81
Tabla 19. E olución de oxi luo en y clo pi i os (media ± e o es ánda , n = 3) en
suelos egados y no egados con clo pi i os du an e el pe iodo expe imen al. Columnas
con la misma le a(s) no p esen an di e encias signi ica i as (p>0,05)………………..83
Índices de igu as
IX
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
In oducción
Figu a 1. E olución de la empe a u a (°C) global media du an e el siglo XX y pa e del
siglo XXI. Da os p opo cionados po GISTEMP Team (2016)………………………....4
Figu a 2. Á eas a ec adas po el e ec o de ecien es e en os de sequía (2000, 2003 y
2006)……………………………………………………………………………………..5
Figu a 3. Consecuencias en suelo y cul i os de la pé dida de agua en suelo……………8
Figu a 4. P ocesos biológicos del suelo ca alizados po enzimas…...............................14
Figu a 5. De alle de la memb ana celula de una bac e ia……………………………...18
Ma e iales y mé odos
Figu a 6. Es uc u a del oxi luo en (C15H11ClF3NO4)…………….…………………30
Figu a 7. Es uc u a del clo pi i os (C9H11Cl3NO3PS)………………………………..31
Figu a 8. Reacción del 2-p-iodo enil-3-p-ni o enil-5- enil e azolio (INT)
ans o mándose a iodoni o e azolio o mazan (INTF)………………………………46
Figu a 9. Esquema de la eacción gene alizada de la o-di enol oxidasa……………….51
Resul ados
Figu a 10. E olución de la humedad (%) (media ± e o es ánda , n = 3) en suelos no
egados du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no p esen an
di e encias signi ica i as (p>0,05)……………………………………………………..59
Figu a 11. E olución del C de la biomasa mic obiana (media ± e o es ánda , n = 3) en
suelos egados y no egados du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma
le a(s) no p esen an di e encias signi ica i as (p>0,05)……………………………….65
Figu a 12. E olución de la ac i idad deshid ogenasa (media ± e o es ánda , n = 3) en
no egados du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no
Índices de igu as
X
p esen an di e encias signi ica i as (p>0,05).INTF: 2-p-iodo-3-ni ophenyl
o mazan………………………………………………………………………..............66
Figu a 13. E olución de la ac i idad u easa (media ± e o es ánda , n = 3) en no
egados du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no p esen an
di e encias signi ica i as (p>0,05)……………………………………………………..67
Figu a 14. E olución de la ac i idad β-glucosidasa (media ± e o es ánda , n = 3) en no
egados du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no p esen an
di e encias signi ica i as (p>0,05).PNP: p-ni o enol………………………………….68
Figu a 15. E olución de la ac i idad os a asa (media ± e o es ánda , n = 3) en no
egados du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no p esen an
di e encias signi ica i as (p>0,05).PNP: p-ni o enol………………………………….69
Figu a 16. E olución de la ac i idad o-di enoloxidasa (media ± e o es ánda , n = 3) en
no egados du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no
p esen an di e encias signi ica i as (p>0,05)…………………………………………..69
Figu a 17. E olución de la humedad (%) (media ± e o es ánda , n = 3) en suelos no
egados y con oxi luo en (A) y clo pi i os (B) du an e el pe iodo expe imen al.
Columnas con la misma le a(s) no p esen an di e encias signi ica i as (p>0,05)…….72

1. INTRODUCCION
1. In oducción
3
En la ac ualidad, di e sos es udios cien í icos, así como las e aluaciones del
G upo In e gube namen al de Expe os sob e el Cambio Climá ico (IPCC), han
demos ado que, debido al aumen o en el consumo de combus ibles ósiles y la
de o es ación, las concen aciones a mos é icas de dióxido de ca bono (CO2) y o os
gases de e ec o in e nade o (p incipalmen e N2O y CH4) es án aumen ando de o ma
p og esi a, p o ocando que el clima de la Tie a es é cambiando sus ancialmen e
(Hough on e al., 2001; IPCC, 2013).
La his o ia nos ha enseñado, que los cambios climá icos de la ie a han sido
p ocesos na u ales que se han p oducido muy len amen e. Sin emba go, en el siglo XVIII
la his o ia comienza a cambia . La población había aumen ado an o que ya ocupaba casi
odos los luga es del plane a y necesi aba cada ez más alimen os, opa, muebles, casas,
e c. Se man enían g andes can idades de cabezas de ganado y se cul i aban g andes
ex ensiones de ie a. Debido a la necesidad de ob ene ecu sos pa a la población
mundial, se p oduce una ans o mación social y económica, iniciada en Reino Unido;
llamada la “Re olución Indus ial”. Con la Re olución Indus ial, el núme o de áb icas
comenzó a aumen a al ededo del mundo, aumen ando de es a o ma la p oducción de
ecu sos y acili ando nue os pues os de abajo.
Debido a oda la inno ación económica y ecnológica p oducida du an e es a
Re olución Indus ial, comenzó la u ilización de combus ibles ósiles pa a la ob ención
de ene gía pa a el uncionamien o de la maquina ia indus ial. Todos es os a ances
p oduje on g andes bene icios, an o a ni el social como a ni el económico. Sin emba go,
la quema con inua y excesi a de es os combus ibles ósiles p odujo g andes can idades
de gases que se emi ían a la a mós e a. Las g andes plan aciones, el man enimien o de
animales y la ala de bosques ambién p oducen g andes can idades es os gases de e ec o
in e nade o.
Desde la e olución indus ial ha habido un d ás ico aumen o de la concen ación
a mos é ica de dióxido de ca bono (CO2) y o os gases de e ec o in e nade o (Lal, 2004).
La concen ación a mos é ica de CO2 ha aumen ado de 280 ppm en 1750 a 367 ppm en
1999 y ac ualmen e es á aumen ando a azón de 1,5 ppm/año o 3,3 Pg C/año (Lal, 2004).
La concen ación de me ano a mos é ico (CH4) ha aumen ado de 700 a 1745 ppb
ap oximadamen e en el mismo pe íodo y es á aumen ando a una asa de 7 ppb/año. Del
mismo modo, la concen ación a mos é ica de óxido ni oso (N2O) ha aumen ado de 270
ppb en 1750 a 314 ppb y aumen ando de o ma p og esi a a la asa de 0,8 ppb/año (Lal,
1. In oducción
10
ecológico, al de ini lo como su capacidad pa a acep a , almacena y ecicla agua,
mine ales y ene gía pa a la p oducción de cul i os, y a la ez p ese a un ambien e sano.
Pa a que es e concep o pueda se uncional es necesa io con a con a iables que
puedan se i pa a e alua la condición del suelo. Así su gen los indicado es de calidad
del suelo.
Los indicado es de la calidad de suelo se conciben como una he amien a de
medición que debe o ece in o mación sob e las p opiedades, los p ocesos y las
ca ac e ís icas. Es os se miden pa a e alua los e ec os del manejo del suelo en un pe iodo
dado (As ie -Calde óne al., 2002).
Uno de los aspec os undamen ales que se p e ende abo da en la p esen e esis,
es el es ablecimien o de índices de calidad del suelo que pe mi an conoce el
compo amien o del suelo al some e lo a un es ado de sequía se e o y p olongado du an e
un la go pe iodo de iempo. Es os indicado es deben cumpli las siguien es condiciones:
 Deben se sensibles a los cambios que su e el suelo
 Debe habe una al a co elación con los p ocesos del ecosis ema.
 Deben in eg a los p ocesos ísicos, químicos y biológicos del suelo.
 Deben se ela i amen e áciles de medi , basados en in o mación obje i a y ácil
de econoce .
 Pe mi i cambios y di e encias en e los sis emas.
 Cen a se en aspec os p ác icos y cla os.
 Re leja el a ibu o de sos enibilidad que se quie e e alua .
 Se áciles de en ende .
La Tabla 1 mues a los dis in os ipos de indicado es ( ísicos, químicos y biológicos)
en el suelo así como su elación con las unciones y condiciones del suelo.
En el p esen e abajo de esis, se ealizó el seguimien o del suelo po dos ipos de
indicado es: químicos y biológicos.

1. In oducción
11
Tabla 1. Indicado es ísicos, químicos y biológicos de la calidad del suelo
Indicado es
Relación con las unciones y condiciones del
suelo
1. FÍSICOS
Tex u a del suelo
Re ención y anspo e de agua y mine ales,
e osión del suelo
P o undidad del suelo
Es imación del po encial p oduc i o y de
e osión
In il ación y densidad apa en e
Po encial de la ado; p oduc i idad y e osi idad
Capacidad de e ención de agua
Relación con la e ención de agua, anspo e, y
e osi idad; humedad ap o echable, ex u a y
ma e ia o gánica
Es abilidad de los ag egados
E osión po encial de un suelo. In il ación de
agua
2. QUÍMICOS
Ma e ia o gánica (C y N o gánico)
De ine la e ilidad del suelo; es abilidad;
e osión
pH
De ine la ac i idad química y biológica, lími es
pa a el c ecimien o de plan as y ac i idad
biológica
Conduc i idad eléc ica
De ine la ac i idad ege al y mic obiana,
lími es pa a el c ecimien o de plan as y
ac i idad biológica
N, P y K ex aíble
Nu ien es disponibles pa a la plan a, pé dida
po encial de N; p oduc i idad e indicado es de
la calidad ambien al
Capacidad de in e cambio ca iónico
Fe ilidad del suelo, po encial p oduc i o
Me ales pesados disponibles
Ni eles de oxicidad pa a el c ecimien o de la
plan a y la calidad del cul i o
3. BIOLÓGICOS
Biomasa mic obiana (C y N)
Po encial ca alizado mic obiano y eposición
de C y N
N po encial mine alizable
P oduc i idad del suelo y apo e po encial de N
Respi ación edá ica
Medición de la ac i idad mic obiana
Núme o de lomb ices
Relacionado con la ac i idad mic obiana
Rendimien o del cul i o
P oducción po encial del cul i o
1.2.1. Indicado es químicos
Den o del g upo de pa áme os que con o man los indicado es químicos (Tabla
1), la ma e ia o gánica del suelo es á conside ada como el indicado más signi ica i o de
1. In oducción
12
calidad (La son y Pie ce, 1991). Do an y Pa kin (1994) la denomina on como el
componen e más impo an e a selecciona en e un g upo de da os mínimos y necesa ios
pa a de ini la calidad del suelo. Sin emba go, es a ma e ia o gánica a ía poco a co o
plazo con el manejo, po lo que se ha suge ido la u ilización de di e en es acciones o
compa imien os uncionales como indicado es de la sos enibilidad de los sis emas
ag ícolas
Es e abajo de esis se ha cen ado en la e aluación de alguna de es as acciones,
como el ca bono soluble en agua y el ca bono de ácidos húmicos y úl icos, los cuales
mues an a iaciones en pe iodos co os de iempo.
Po o a pa e, pa a p o undiza en el conocimien o de la composición molecula
de la ma e ia o gánica, en es e abajo se han empleado écnicas de esonancia magné ica
nuclea (RMN). Es as écnicas, son muy u ilizadas po algunos au o es (Be nse al., 2008;
Knicke , 2011).
La Resonancia Magné ica Nuclea (RMN) es una he amien a analí ica que
p opo ciona in o mación sob e la es uc u a molecula en un iempo asequible. La écnica
no es des uc i a. La Resonancia Magné ica Nuclea (RMN) es udia el compo amien o
de los núcleos a ómicos que poseen spin di e en e de ce o, bajo la in luencia de un campo
magné ico ex e no. Los ins umen os RMN son cada día más po en es y se desa ollan
ecuen emen e ac ualizaciones y piezas complemen a ias pa a sa is ace las necesidades
de los labo a o ios de odas las á eas de la in es igación cien í ica. Si bien es a écnica no
puede se conside ada como no edosa, lo es su aplicación en mues as de suelo sólidas.
Aunque sea posible segui analizando mues as de suelo o de sus acciones
median e RMN en es ado líquido, la escasa solubilidad de esas mues as en los sol en es
comúnmen e u ilizados en RMN, con ie e la RMN de es ado sólido en la elección
p e e ida de muchos in es igado es de la ciencia del suelo. A di e encia del es ado
líquido, en es ado sólido, la mo ilidad es á muy es ingida y se ob ienen señales anchas,
esul ado de la suma de señales de odas las posibles o ien aciones. Se han desa ollado
écnicas que pe mi an ob ene espec os de al a esolución en es ado sólido: gi o con
ángulo mágico (MAS, Magic Angle Spinning), pola ización c uzada (CP, C oss
Pola iza ion) (Simpson e al., 2011) o secuencias mul ipulso especí icas pa a sólidos
(CRAMPS, Combined Ro a ion and Mul iple Pulse Spec oscopy). Un de ec o ecoge
1. In oducción
13
odas las señales emi idas y las as o ma en espec os median e la unción de
T as o mada de Fou ie (Pane ie i, 2013).
1.2.2. Indicado es biológicos
La in es igación y es udio de la biología del suelo se ha ido in ensi icando en los
úl imos años debido a la necesidad de conoce el ol que eje cen los dis in os o ganismos
del suelo sob e las di e en es eacciones químicas que ocu en en dicho suelo.
Los indicado es biológicos in eg an g an can idad de ac o es que a ec an la
calidad del suelo como la abundancia y subp oduc os de mic o y mac oo ganismos,
incluidos bac e ias, hongos, nema odos, lomb ices y a ópodos. Incluyen unciones
como la asa de espi ación, ac i idades enzimá icas, e gos e ol y o os subp oduc os de
los hongos, asas de descomposición de los esiduos ege ales, N y C de la biomasa
mic obiana (Ka len e al., 1997).
Una pa e de es a memo ia de esis doc o al, ha sido el es udio de di e sos
pa áme os bioquímicos, así como de la biodi e sidad mic obiana del suelo que, en los
úl imos años, es á eniendo un g an peso especí ico sob e el es udio de la calidad del
suelo. Es o se debe p incipalmen e a que es os pa áme os biológicos, a di e encia de los
ísicos y químicos, esponden mucho más ápido a la aplicación de cualquie p oduc o al
suelo o cualquie manejo al que se es é some iendo dicho suelo (And eoni e al., 2004;
Tejada e al., 2006; Zabaloy e al., 2008). El hecho de que es os cambios ocu an de o ma
mucho más ápida que los pa áme os químicos y ísicos, se debe p incipalmen e a que
los mic o-o ganismos del suelo son muy sensibles a cualquie cambio,
independien emen e de si el cambio es posi i o o nega i o.
Sin emba go, hay que ene en conside ación un aspec o de suma impo ancia.
Aunque pa a su mejo comp ensión se es udien independien emen e unos indicado es de
o os, en e odos ellos exis e una es echa in e elación y dependencia, que hace que de
la in e p e ación de algunos pueda in e i el compo amien o de los o os (Mo ola y Lupi,
2011).
1. In oducción
14
1.2.2.1. Ac i idades enzimá icas como indicado es de la calidad del suelo
Los mic oo ganismos del suelo, p incipalmen e bac e ias y hongos (A las y
Ba ha, 1998) de e minan la calidad de un suelo a a és de sus ac i idades me abólicas
en muy di e en es condiciones medioambien ales. Po es e mo i o, las ac i idades
enzimá icas, además de se u ilizadas como medida de la ac i idad mic obiana, han sido
u ilizadas como indicado es po enciales de la calidad del suelo, debido a su elación con
la ac i idad biológica del mismo, acilidad de medida, y espues a ápida a los cambios
en el manejo del suelo (Dick e al., 1996; Bení ez e al., 2006). Una enzima se de ine
como una p o eína p oducida po una célula i ien e que unciona como ca alizado de
una eacción química especí ica. Las enzimas po su na u aleza p o eica pueden se
a ec adas po la empe a u a y pH (Alexande , 1980) y du an e las eacciones especí icas
en que ellas ac úan, lo hacen como ca alizado es o gánicos sin expe imen a cambios en
su es uc u a (Coyne, 2000). Un g an po cen aje de los p ocesos que ienen luga en el
suelo (Figu a 4) son eacciones enzimá icas (mine alización, inmo ilización, ijación de
ni ógeno, e c.).
Figu a 4. P ocesos biológicos del suelo ca alizados po enzimas
Las enzimas pueden exis i en el suelo an o en o ma de p o eínas lib es (enzimas
ex acelula es o abió icas) o asociadas con o ganismos i os (enzimas bió icas). Las
p ime as se encuen an ampliamen e dis ibuidas en el suelo y es án p o egidas po las
sus ancias húmicas, coloides y a cillas, lo que hace que su deg adación y
Deg adación de ma e ia o gánica exógena
T ans o mación de la
ma e ia o gánica na i a
Libe ación de nu ien es
Fijación de N2
De oxi icación de xenobió icos
ENZIMAS DEL SUELO
Ni i icación
Desni i icación
1. In oducción
15
desna u alización (Ladd y Bu le , 1975) se ea limi ada y sus ni eles de ac i idad sean
cons an es e independien es de la p oli e ación mic obiana (Ceccan i e al., 1978).
Debido a que las enzimas son muy esis en es a los p ocesos de desna u alización,
su ex acción del suelo es muy di ícil y, po an o, se es udian indi ec amen e midiendo
su ac i idad, y exp esándolas en can idad de p oduc o inal po iempo de incubación y
can idad de suelo.
Según su unción, las enzimas del suelo más es udiadas son las oxido educ asas
(en pa icula , deshid ogenasas y ca alasas) y las hid olasas, que son enzimas elacionadas
con el ciclo del C, N, P y S, den o de las cuales, des acamos β-glucosidasas, p o easas,
u easa, os a asas, y a ilsul a asas. En consecuencia, exis e una ue e co elación en e la
ac i idad bioquímica de los mic oo ganismos de un suelo con la calidad de dicho suelo.
En la Tabla 2 se mues an algunas de las ac i idades enzimá icas más es udiadas.
Tabla 2. Funciones de algunas ac i idades enzimá icas del suelo
Hid olasas:
- In e asa: Saca osa → glucosa + uc osa
- Celulasa: celulosa (c is alina) → celulosa (amo a) → celobiosa
- β-Glucosidasa: celobiosa → glucosa + ROH
- Fos omonoes e asa: Fós o o o gánico → Fós o o ino gánico
- U easa: U ea → CO2 + NH4+
- P o easa: P o eínas y pép idos → NH4
- A ilsul a asa: Azu e o gánico → Azu e ino gánico
Oxido educ asas:
- Deshid ogenasa: XH2 + A → X + AH2
- Fenol oxidasas: mono enol + ½ O2 → Quinona + H2O
- Lacasa: 4(di enol) + O2 → 4(quinona) + 2H2O
- Pe oxidasa: donado e- + H2O2 → donado oxid. + H2O
- Ca alasa: 2H2O2 → 2H2O + O2

1. In oducción
16
1.2.2.2. Biodi e sidad mic obiana como indicado de la calidad del suelo.
El é mino biodi e sidad mic obiana, desc ibe el núme o de especies de
mic oo ganismos di e en es y su abundancia ela i a en una comunidad de e minada en
un hábi a dado (Ga be a e al., 2004). T adicionalmen e, es e núme o se ha es imado
pa a el o al de células p oca io as sob e la ie a en 4-6 x 1030, idea que comp ende en e
106 y 108 genoespecies sepa adas (g upos axonómicos dis in os basados en el análisis
secuencias de genes) (Cowan e al., 2005). Es o ep esen a un eno me po encial biológico
y gené ico que puede se explo ado pa a ecupe a posibles nue os genes, de ini u as
me abólicas en e as y sus p oduc os elacionados (Cowan e al., 2005). Se ha es imado
que la di e sidad mic obiana del suelo es á den o de un ango de 3000 y 11000 genomas
po g amo de suelo (To s ik y Ø eås, 2002). Sin emba go, la inmensa di e sidad
gené ica y eno ípica de bac e ias y hongos hacen de es a comunidad una de las más
di íciles de es udia (Ø eås y To s ik, 1994).
Se ha suge ido que el 99% de las bac e ias obse adas bajo el mic oscopio no son
cul i ables po las écnicas comunes de labo a o io, po lo que se puede supone que el
1% es an e es ep esen a i o de oda la población y que ese 99% es simplemen e un
es ado isiológico que e i a que sean cul i ados en los medios ac uales, o que es posible
que el 99% sean eno ípicamen e y gené icamen e di e en es de ese 1% y solo la mino ía
de la población es á ep esen ada (Michelle e al., 1999). Pa a ence es e obs áculo del
es udio dependien e de cul i o, se han desa ollado a ios mé odos pa a iden i ica y
es udia esos mic oo ganismos, como el análisis de ácidos g asos y mé odos como las
di e en es a iaciones de la Reacción en Cadena de la Polime asa (PCR po sus siglas en
inglés) pa a analiza ADN y ARN (Ki k e al., 2004).
Típicamen e, las egiones de ADN que codi ican pa a el 16S ARN , 18S ARN o
ITS son blancos pa a la cons ucción de iniciado es pa a el es udio de la di e sidad, ya
que es os genes es án p esen es en odos los mic oo ganismos y poseen egiones de inidas
pa a la clasi icación axonómica que no es án suje as a ans e encia ho izon al
(Win zinge ode e al., 1997). Cabe des aca , que la u ilización de iniciado es uni e sales
pa a la ampli icación PCR de di e sos genes 16S del o al del ADN de la comunidad, ha
gene ado una as a can idad de da os ace ca del axa y de especies p esen es en un hábi a ,
ede iniendo la di e sidad p oca io a (S eele y Wol gang, 2005). De es a mane a es e ipo
de es udios han e olucionado la ecología mic obiana: po ejemplo, suelos que han
mos ado se poco di e sos cuando se analizan con écnicas de cul i o adicional, han
1. In oducción
17
mos ado, median e el análisis de 16S, se los hábi a más icos en di e sidad de
p oca io as sob e la ie a (S eele y Wol gang, 2005).
En consecuencia, el es udio de ADN en suelo iene un g an po encial, pe o
ambién ienen g andes incon enien es como la ep oducibilidad de los ácidos nucleicos
o la e elación gené ica mic obiana o al que se ob iene. Pe o las des en ajas que mues a
es a écnica son sol en adas po los esul ados que da la de e minación de los ácidos
g asos ( os olípidos) de memb ana (PLFA) (Zelles, 1999). Es a écnica p opo ciona una
medición amplia de la biodi e sidad del suelo a ni el eno ípico, en con aposición del
ADN, po lo que su u ilización como indicado biológico suele p opo ciona mejo es
esul ados que nos pe mi en comp ende cómo puede e oluciona la comunidad
mic obiana de un de e minado suelo.
El análisis de ácidos g asos se basa en el es udio de es os componen es esenciales
de la memb ana celula de las células i as, que en condiciones na u ales son una
p opo ción ela i amen e cons an e de la biomasa de los o ganismos (Lecha alie , 1977)
(Figu a 5). De es a mane a, es posible ob ene un pa ón ep esen a i o de especies
aisladas o de ecosis ema mic obiano en e os (Zelles, 1999), ya que sólo las células i as
iables poseen memb anas no al e adas, con ácidos g asos como los os olípidos
[denominados en la li e a u a inglesa como PLFA, (phospholipids a y acids, exp esión
en inglés que signi ica, ácido g aso os olipídico)]. El análisis del pa ón de és os ácidos
g asos, que se ealiza a a és de la iden i icación y cuan i icación de sus és e es me ílicos
(denominados en la li e a u a inglesa como FAME ( a y acids me hyl es e s, exp esión
en inglés que signi ica és e es me ílicos de ácidos g asos), median e c oma og a ía
gaseosa o de capa ina; cuyo pa ón es ca ac e ís ico pa a cada géne o y especie (MIDI,
1990; Liu, 1994). Es e ipo de análisis de los ecosis emas mic obianos se ha u ilizado con
es a ian es: (i) aplicación a mic oo ganismos aislados median e écnicas
mic obiológicas adicionales (mé odos FAME-MIDI), donde la iden i icación se ealiza
median e el empleo de una base de da os (MIDI, 1990); (ii) iden i icación de elaciones
en e g upos de mic oo ganismos basado en ácidos g asos ca ac e ís icos de especies o
géne os, como el caso de las e aluaciones de e gos e ol (ácido g aso p opio de hongos)
(Joe gensen, 2000; Ruzicka e al., 2000); y (iii) el análisis de ecosis emas mic obianos
en e os, sin e apas de aislamien o de especies, donde se es udian ácidos g asos que
iden i iquen comunidades u o ganismos especí icos, con ines ambien ales (Tabla 3)
(Nielsen y Pe e sen, 2000; Olsson e al., 1999; Olsson y Pe sson, 1999; Schu e y Dick,
1. In oducción
18
2000). És a úl ima es a egia pe mi e de ini y ag upa suelos con ca ac e ís icas
uncionales de e minadas (ni eles de ca bono, e ilidad, ac i idades enzimá icas, e c.)
(Mai e e al., 1999), así como la iden i icación de las comunidades de mic oo ganismos
(Zelles, 1999).
Figu a 5. De alle de la memb ana celula de una bac e ia
A di e encia del es udio de ADN, en el es udio de PLFAs del suelo no podemos
conoce qué ipos de bac e ias u hongos se encuen an en el suelo (géne o y especie), pe o
sí se puede conoce la e olución de g upos de mic oo ganismos del suelo, ales como los
desc i os en la Tabla 3.
Molécula de glice ol
Ácidos g asos
In e io de la célula
Ex e io de la célula
Bicapa lipídica
Condiciones ambien ales
Célula
1. In oducción
19
Tabla 3. Resumen de los pa ones más impo an es de os olípidos que pueden se
u ilizados pa a de e mina la composición comuni a ia de la mic obio a del suelo (Zelles,
1999).
G upo mic obiano
Pa ón de os olípidos
A chaebac e ia
Residuos g asos con una unión é e a glice ol
Bac e ias Anae óbicas
Con ienen es ingolípidos que es án ausen es en los
ae óbicos
Bac e ias en gene al
Ácidos g asos sa u ados y monoinsa u ados con unión
és e a glice ol
Bac e ias G am nega i a
Con ienen mayo can idad de ácidos g asos
hid oxilados
Bac e ias G am posi i a
Con ienen mayo can idad de ácidos g asos
ami icados
Cyanobac e ia (y euca io as)
Con ienen ácidos g asos poli-insa u ados.
Hongos
P esen an un os olípidos especí ico, como: 18:2 6 ó
e gos e ol.

3. Ma e iales y mé odos
27
Pa a alcanza los obje i os de es e abajo de Tesis, los expe imen os se ealiza on
en labo a o io, bajo condiciones con oladas. Es deci , se usa on dis in os mic ocosmos.
Exis e una amplia bibliog a ía en la que se des acan impo an es c í icas a los
es udios ealizados en mic ocosmos o mesocosmos, ya que los mic oo ganismos en
condiciones na u ales de campo a a ez pueden expe imen a las condiciones óp imas
con las que se abaja en labo a o io (Obu ge y Jones, 2009). Po o a pa e, o os au o es
sugie en que la mayo ía de las incubaciones de labo a o io equie en a amien os
al amen e p ocesados que al e an la es uc u a del suelo na u al, gene ando o a al e ación
de las condiciones de campo (Young y C aw o d, 2004), lo cual iene implicaciones pa a
la dinámica del agua debido a la al e ación de los ag egados es uc u ales (Bea e e al.,
2009), y pa a la dinámica de la comunidad mic obiana.
A pesa de es as c í icas, desde inales los años 70, se ienen acep ando es udios
de mic ocosmos en labo a o io, indicando que los mismos son uncionalmen e simila es
a los ecosis emas na u ales que simulan (D aggan, 1977; Le le , 1978; Gille y Wi ,
1980). Como consecuencia de ello, hoy en día se siguen u ilizando an o los mic ocosmos
como los mesocosmos, p incipalmen e cuando se ealizan expe imen os de
con aminación del medio ambien e. Es o es lógico, pues en ales mic ocosmos solo se
con amina una pa e de suelo y el con aminan e es á o almen e con olado po el
in es igado .
Los mo i os po los que los es udios se lle a on a cabo en mic ocosmos en luga
de ealiza los en campo, son los siguien es:
1) Necesi ábamos es ablece un pe iodo de sequía la go y p olongado de un año. El
es udio di ec o en campo no nos asegu aba que, du an e odo un año, no hubiese
ningún ipo de p ecipi ación.
2) Además de con ola el pe iodo de sequía se con aminó el suelo con dos
plaguicidas. En consecuencia, se conside ó ap opiado el es udio en mic ocosmos
pa a no con amina un suelo de o ma conscien e.
3. Ma e iales y mé odos
28
3.1. CARACTERÍSTICAS DEL SUELO, RESIDUOS ORGÁNICOS Y
PLAGUICIDAS UTILIZADOS
El suelo ag ícola u ilizado pa a el desa ollo de es a memo ia ue un Regosol
a énico calcá ico (FAO, 2014) si uado en el é mino municipal de Dos He manas
(Se illa). Se cogió suelo de los p ime os 25 cm del ho izon e supe icial (Ap). Una ez
asladado al labo a o io, se dejó seca a empe a u a ambien e y pos e io men e se amizó
con un amiz de luz de malla de 2 mm. Po úl imo, las mues as se gua da on en bo es de
plás ico has a su análisis ísico-químico.
Con espec o a los esiduos o gánicos u ilizados, se emplea on es esiduos
o gánicos:
1) Residuo sólido u bano (MSW)
2) Es ié col de aca (CM)
3) Es ié col de o eja (SM)
Los esiduos ue on compos ados hace 5 años, y desde en onces, los mismos se
gua dan en cáma as igo í icas con el obje o de que dicha ma e ia o gánica no se deg ade.
Dichos esiduos ue on compos ados bajo condiciones ae óbicas en una pila apezoidal
(4 m de la go, 2 m de ancho en la base y 1 m de al u a) que con enía ap oximadamen e
5000 kg de cada esiduo o gánico. Las pilas se ol ea on cada dos semanas y se añadió
agua egula men e pa a man ene los ni eles de humedad adecuados. Con el in de e i a
posibles al e aciones en la mic o lo a y las pé didas de NH4+-N, no se pe mi ió que la
empe a u a excedie a de 60-65 ° C. Pa a el MSW, el compos aje du ó unos 6 meses,
mien as que en el caso de CM y SM, el compos aje du ó ap oximadamen e unos 4 meses,
espec i amen e. Es os esiduos o gánicos se emplea on solo en dos de los es
manusc i os publicados.
La Tabla 4 mues a las ca ac e ís icas ísico-químicas del suelo y de los es
esiduos o gánicos u ilizados en es a memo ia de Tesis.
3. Ma e iales y mé odos
29
Tabla 4. Ca ac e ís icas del suelo, esiduos o gánicos expe imen ales y g upos
uncionales ácidos de los ácidos húmicos aislados de los esiduos o gánicos (media ±
e o es ánda , n = 3)
Suelo
MSW
CM
SM
pH (H2O)
7,9 ± 0,2
6,8± 0,2
8,2 ± 0,3
7,7 ± 0,2
A ena g uesa (g kg-1)
486 ± 49
A ena ina (g kg-1)
130 ± 25
Limo (g kg-1)
123 ± 29
A cilla (g kg-1)
260 ± 35
N-Kjeldahl (g kg-1)
0,93 ±0,08
11,8 ± 1,4
6,8 ± 1,8
8,5 ±1,2
Ma e ia o gánica (g kg-1)
17,2 ± 1,8
564 ± 18
251 ± 14
332 ± 21
C ácidos húmicos (mg kg-1)
3250 ± 64
4647 ± 42
6911± 58
9365 ± 75
Acidez o al (cmolc kg-1)
Nd
4,1 ± 0,2
4,4 ± 0,3
4,8 ± 0,3
Ca boxílicos (cmolc kg-1)
Nd
3,1 ± 0,2
3,3 ± 0,3
3,5 ± 0,2
Hid oxilo enólicos (cmolc kg-1)
Nd
1,0 ± 0,1
1,1 ± 0,1
1,3 ± 0,2
C ácidos úl icos (mg kg-1)
2933 ± 22
4115 ± 67
4539 ± 54
7375 ± 57
P (g kg-1)
14,5 ± 2,2
12,3 ± 1,5
21,9 ± 1,6
25,1 ± 1,9
K (g kg-1)
20,3 ± 2,4
11,0 ± 1,8
25,2 ± 2,3
22,8 ± 1,6
Fe (mg kg-1)
13,9 ± 2,8
798 ± 43
355 ± 27
967 ± 24
Cu (mg kg-1)
10,4 ± 2,2
4,2 ± 0,9
21,8 ± 2,4
7,3 ± 1,4
Mn (mg kg-1)
9,7 ± 1,5
20,3 ± 3,5
16,7 ± 3,7
78,9 ± 7,7
Zn (mg kg-1)
6,6 ± 1,9
44,8 ± 6,4
9,2 ± 2,6
68,3 ± 6,9
Cd (mg kg-1)
4,7 ± 1,3
1,3 ± 0,2
0,9 ± 0,2
1,5 ± 0,4
Pb (mg kg-1)
2,4 ± 0,8
1,1 ± 0,2
3,8 ± 1,1
1,3 ± 0,2
Ni (mg kg-1)
1,8 ± 0,3
1,4 ± 0,3
1,7 ± 0,4
2,2 ± 0,5
MSW: Residuo Sólido U bano
CV: Es ié col de Vaca
SM: Es ié col de O eja
Nd: No de e minado
3. Ma e iales y mé odos
30
Po o a pa e, y pa a es udia el e ec o y compo amien o de p oduc os
i osani a ios u ilizados en la ag icul u a en un suelo some ido a sequía se e a se
u iliza on dos ipos de plaguicidas:
1) el he bicida oxi luo en [2-clo o-1-(3-e oxi-4-ni o enoxi)-4-( i luo ome il)
benceno] (C15H11ClF3NO4) que es un di enilé e con ac i idad he bicida esidual
y de con ac o, selec i o, abso bido más ácilmen e po las hojas, especialmen e
po los b o es, que po las aíces, con muy poca anslocación (Figu a 6). Se de ine
como únicamen e de con ac o sin e ec o sis émico. U ilizado en una g an can idad
de cul i os, ales como algodón, cí icos, ho alizas, e c. En nues a egión es muy
u ilizado ambién en el cul i o del oli o pa a la ob ención de acei e de oli a. Pa a
es e abajo, se u ilizó la o mulación come cial Fen en (24% p -1, 240 g l-1) de
Lainco, S.A. (España).
O
Cl
F
FF
O
NO
O
Figu a 6. Es uc u a del Oxi luo en (C15H11ClF3NO4)
2) el insec icida clo pi i os (O,O-die il-O-3,5,6- iclo o-2-pi idil os o o ioa o)
(C9H11Cl3NO3PS) que es un insec icida que posee una acción po con ac o,
inges ión e inhalación en insec os chupado es y mas icado es, a ec ando el
sis ema ne ioso del insec o y p o ocando la mue e del mismo (Figu a 7). Pa a
es e abajo, se u ilizó la o mulación come cial Sena o 48 (48% clo pi i os) de
Baye C opScience (España).
3. Ma e iales y mé odos
31
N
ClCl
Cl O
P
SO
O
Figu a 7. Es uc u a del Clo pi i os (C9H11Cl3NO3PS)
3.2. DISEÑO EXPERIMENTAL
Pa a alcanza los obje i os desc i os an e io men e, se ealiza on dos ipos de
expe iencias de incubación. La p ime a expe iencia de incubación, donde se u iliza on las
dis in as uen es de ma e ia o gánica, se ealizó con la in ención de alcanza los obje i os
1 y 2 an e io men e de inidos. La segunda expe iencia de incubación, donde se u iliza on
los dos plaguicidas, se ealizó con la in ención de alcanza el obje i o 3 p e iamen e
de inido. Po ello, a pa i de aho a habla emos de p ime a expe iencia de incubación y
de segunda expe iencia de incubación.
3.2.1. P ime a expe iencia de incubación
Pa a es udia la e olución de las p opiedades bioquímicas, comunidad mic obiana
y es uc u a de las es uen es de ma e ia o gánica es udiadas bajo condiciones de sequía,
se u iliza on con enedo es de plás ico con una capacidad de 5 L donde se les añadió 2 kg
del suelo expe imen al (secado a empe a u a ambien e y amizado con amiz de 2 mm de
luz de malla). Los con enedo es se enmenda on con las es uen es de ma e ia o gánica
ya mencionadas a una dosis de 30 ha-1 (ma e ia seca) en el caso del MSW, una dosis de
67,41 ha-1 (ma e ia seca) en el caso de CM y una dosis de 52,55 ha-1 (ma e ia seca) en
el caso de SM, con el obje o de aplica en odos los casos la misma can idad de ma e ia
o gánica al suelo expe imen al (16,92 ma e ia o gánica ha-1). Es as dosis ue on
escogidas de o ma alea o ia. De la misma o ma, se u ilizó un suelo con ol sin enmenda .
Se ealiza on dos lo es con es os a amien os e ilizan es. Uno de ellos se ue
egando pe iódicamen e con agua des ilada. Cada 7 días se pesaba el con enedo y se
calculaba la pé dida de agua po di e encia de pesada, es ableciendo pos e io men e
dicha agua. Se man u o la humedad al 40-60% de su capacidad de campo du an e un

3. Ma e iales y mé odos
32
pe iodo de 365 días. El segundo lo e se dejó sin ega du an e odo el pe iodo
expe imen al. De o ma de allada, los a amien os e ilizan es se mues an en la abla 5.
Tabla 5. Nomencla u a de las mues as en la p ime a expe iencia de incubación y el
a amien o al que co esponde.
Nomencla u a
T a amien o aplicado
S
Suelo no abonado o gánicamen e y egado pe iódicamen e du an e
el expe imen o
S+MSW
Suelo abonado con esiduo sólido u bano (MSW) y egado
pe iódicamen e du an e el expe imen o
S+CM
Suelo abonado con es ié col de aca (CM) y egado pe iódicamen e
du an e el expe imen o
S+SM
Suelo abonado con es ié col de o eja (SM) y egado pe iódicamen e
du an e el expe imen o
SD
Suelo no abonado o gánicamen e y no egado du an e el
expe imen o
SD+MSW
Suelo abonado con esiduo sólido u bano (MSW) y no egado
du an e el expe imen o
SD+CM
Suelo abonado con es ié col de aca (CM) y no egado du an e el
expe imen o
SD+SM
Suelo abonado con es ié col de o eja (SM) y no egado du an e el
expe imen o
Cada a amien o se ealizó po iplicado (24 con enedo es de plás ico en o al).
Dichos con enedo es se coloca on de o ma alea o ia en una cáma a de incubación con
empe a u a con olada (25 ± 1ºC). En suelos egados, el con enido de humedad se
con oló g a imé icamen e y la pé dida de humedad se es i uyó con agua des ilada,
según ue a necesa io.
3. Ma e iales y mé odos
33
El pe iodo de incubación ue de un año comple o. Du an e dicho pe iodo se
cogie on 30 g amos de suelo pa a ealiza los pe inen es análisis. Las mues as se
gua da on en congelado a -20 ºC has a su análisis. En es e sen ido, se oma on mues as
de odos los a amien os (24 con enedo es de plás ico en o al) a los 30, 100, 200 y 365
días de habe iniciado dicho expe imen o.
En dichas mues as se ealiza on las siguien es de e minaciones analí icas:
1) P opiedades químicas: de e minación de C soluble en agua, C de ácidos húmicos
y C de ácidos úl icos
2) Composición de la ma e ia o gánica en suelo median e el uso de espec oscopia
de esonancia magné ica nuclea (RMN) de 13C de es ado sólido
3) P opiedades bioquímicas: de e minación de C la biomasa mic obiana y dis in as
ac i idades enzimá icas (deshid ogenasa, u easa, β-glucosidasa, os a asa, O-
di enol oxidasa).
4) Biodi e sidad de la comunidad mic obiana del suelo, median e el análisis de los
ácidos g asos de memb ana (PLFAs).
3.2.2. Segunda expe iencia de incubación
Pa a es udia la e olución de los dos plaguicidas es udiados y su compo amien o
sob e las p opiedades bioquímicas del suelo, se u iliza on con enedo es de c is al con una
capacidad de 5 L donde se les añadió 2 kg del suelo expe imen al (seco a empe a u a
ambien e y amizado con amiz de 2 mm de luz de malla). A di e encia de los
expe imen os an e io es, los con enedo es ue on de c is al, ya que no es ecomendable
en caso de es udios de con aminación el uso de con enedo es de plás ico, ya que el
con aminan e puede adhe i se a algún componen e químico del plás ico que con o ma el
con enedo .
Los con enedo es ue on con aminados con es dosis dis in as de oxi luo en (2,
4 y 8 l ha-1, espec i amen e, siendo 4 l ha-1 la dosis ecomendada po el ab ican e) y es
dosis dis in as de clo pi i os (2,5, 5 y 10 l ha-1, espec i amen e, siendo 5 l ha-1 la dosis
ecomendada po el ab ican e).
También se ealiza on dos lo es con es os a amien os. El p ocedimien o a segui
ambién ue el mismo, es deci , uno de ellos se ue egando pe iódicamen e con agua
des ilada, man eniendo una humedad al 40-60% de su capacidad de campo, du an e un
3. Ma e iales y mé odos
34
pe iodo de 120 días. El segundo lo e, se dejó sin ega du an e dicho pe iodo
expe imen al. El mo i o de no ealiza el expe imen o du an e un año se debió a que la
pe sis encia en suelo de los plaguicidas es in e io a los 365 días. De o ma de allada, los
a amien os se mues an en la abla 6.
Cada a amien o se ealizó po iplicado (42 con enedo es de c is al en o al).
Dichos con enedo es se coloca on de o ma alea o ia en una cáma a de incubación con
empe a u a con olada (25 ± 1ºC). En suelos egados, el con enido de humedad se
con oló g a imé icamen e y la pé dida de humedad se es i uyó con agua des ilada,
según ue a necesa io.
El pe iodo de incubación ue de 120 días. Du an e dicho pe iodo se cogie on 30
g amos de suelo pa a ealiza los pe inen es análisis. Las mues as se gua da on en
congelado a -20 ºC has a su análisis. En es e sen ido, se cogie on mues as de cada
a amien o (24 con enedo es de id io en o al) a los 5, 12, 26, 50, 79, 100 y 120 días de
habe iniciado dicho expe imen o.
En dichas mues as se ealiza on las siguien es de e minaciones analí icas:
1) p opiedades bioquímicas: de e minación de dis in as ac i idades enzimá icas
(deshid ogenasa, u easa, β-glucosidasa, os a asa).
2) biodi e sidad de la comunidad mic obiana del suelo, median e el análisis de los
ácidos g asos de memb ana (PLFAs).
3) de e minación de los plaguicidas expe imen ales
3. Ma e iales y mé odos
35
Tabla 6. Nomencla u a de las mues as en la segunda expe iencia de incubación y el
a amien o al que co esponde.
Nomencla u a
T a amien o aplicado
S
Suelo no con aminado y egado du an e el expe imen o
S+O1
Suelo a ado con oxi luo en (4 l ha-1) y egado pe iódicamen e
du an e el expe imen o
S+O2
Suelo a ado con oxi luo en (2 l ha-1) y egado pe iódicamen e
du an e el expe imen o
S+O3
Suelo a ado con oxi luo en (8 l ha-1) y egado pe iódicamen e
du an e el expe imen o
S+CL1
Suelo a ado con clo pi i os (5 l ha-1) y egado pe iódicamen e
du an e el expe imen o
S+CL2
Suelo a ado con clo pi i os (2,5 l ha-1) y egado pe iódicamen e
du an e el expe imen o
S+CL3
Suelo a ado con clo pi i os (10 l ha-1) y egado pe iódicamen e
du an e el expe imen o
SD
Suelo no con aminado y no egado du an e el expe imen o
SD+O1
Suelo a ado con oxi luo en (4 l ha-1) y no egado du an e el
expe imen o
SD+O2
Suelo a ado con oxi luo en (2 l ha-1) y no egado du an e el
expe imen o
SD+O3
Suelo a ado con oxi luo en (8 l ha-1) y no egado du an e el
expe imen o
SD+CL1
Suelo a ado con clo pi i os (5 l ha-1) y no egado du an e el
expe imen o
SD+CL2
Suelo a ado con clo pi i os (2,5 l ha-1) y no egado du an e el
expe imen o
SD+CL3
Suelo a ado con clo pi i os (10 l ha-1) y no egado du an e el
expe imen o
3. Ma e iales y mé odos
42
Con el in de mejo a la esolución y calidad de los espec os, se ealizó un
p e a amien o con HF 10% a las mues as, desc i o po Goncal es e al. (2003), pa a la
eliminación de odas las especies pa amagné icas que puedan in e e i en el análisis y
concen a el con enido en ma e ia o gánica. P e io a la desmine alización con HF 10%,
ue necesa ia la eliminación del ca bona o cálcico p esen e en los suelos, ya que se
pod ían o ma o os compues os no deseados, como el CaF2. Pa a ello, se a a on los
suelos con HCl 1M, an as eces como ue a necesa io; y pos e io men e la adas con
agua des ilada.
A con inuación, 50 ml de HF al 10% se añadie on a 10 g de suelo y se agi ó la
mezcla du an e dos ho as. Pos e io men e, se cen i uga on a 3000 pm du an e 10
minu os, eliminando cuidadosamen e el sob enadan e median e si onación. Es e p oceso
se lle ó a cabo 4 eces. T as el a aque con HF 10%, el suelo ue la ado con 50 ml de agua
des ilada, an as eces como use necesa io has a alcanza un pH 5-6; y some ido al
p oceso de lio ilización an es de ealiza las medidas de RMN.
Los esul ados de los análisis de RMN se ob u ie on con un equipo B uke DSX
200, a una ecuencia de esonancia de 13C de 50,32 MHz usando o o es de dióxido de
ci conio de 7 mm de diáme o ex e no, con apón de policlo o i luo e ileno (PCTFE o
Kel-F®).
La écnica de pola ización c uzada se aplicó du an e la o ación del ángulo mágico
a 6,8 kHz. El iempo de con ac o ue de 1 ms y el in e alo en e pulsos de 1 Hz de o ma
escalonada, empezando en e el 100% y el 50% de la po encia inicial pa a e i a la
modulación del spin du an e el con ac o Ha mann-Hahn (Pee sen e al., 1993, Cook e
al., 1996). Se acumula on en e 200.00 y 400.000 escáne es, usando un pulso de e a do
de 250 ms. Se aplicó una ampliación de la línea en e 100 y 150 Hz.
Pa a la esolución de los espec os ob enidos, se u ilizó el So wa e Mes ReNo a
e sión 9 (Mes elabResea ch, San iago de Compos ela, España), aplicando una
co ección de línea de base de pun os múl iples y co igiendo la ase, dependiendo de las
ca ac e ís icas de cada espec o. Median e el so wa e, se p ocedió a la de e minación de
la dis ibución ela i a de ca bono, in eg ando la in ensidad de la señal en di e en es
egiones de desplazamien o químico. U ilizando el e ame ilsilano (TMS) como
e e encia, con desplazamien o químico (chemicalshi ) igual a 0 ppm, se es ablecie on

3. Ma e iales y mé odos
43
las di e en es egiones espec ales, asignando a cada una de ellas los compues os
co espondien es, de acue do con Knicke y Lüdemann (1995) (Tabla 7).
Tabla 7. Asignación ípica de los picos de RMN de 13C en es ado sólido a g upos
uncionales p esen es en mues as geoquímicas. (Re e encia e ame ilsilano=0 ppm).
Desplazamien o químico (ppm)
Asignación
220 - 185
Ca bonilos
185 - 160
Ca boxílicos
160 - 110
G upos A omá icos COR o CNR, C-H
A omá icos, C ole inas
110 - 45
O-Alquilo, N-Alquilo
45 – 0
C alquilo
3.3.2.8. De e minación de la dis ibución del peso molecula de las p o eínas
Se siguió la me odología desc i a en Gómez e al. (2014). La ex acción se ealizó
con agua desionizada a pH 9, man eniendo la empe a u a a 55 ºC du an e 3 ho as. La
dis ibución de las p o eínas se de e minó po c oma og a ía de exclusión de amaño
usando un pu i icado AKTA (GE Heal hca e), empleando una columna
Supe dexPep ideTM 10 / 300GL (in e alo óp imo de sepa ación <10 - 50 kDa).
Las mues as se cen i uga on a 12000g du an e 30 min a 4 ° C pa a elimina las
moléculas insolubles y el sob enadan e se pasó a a és de un il o de 0,2 μm y se ca gó
en un bucle de 0,1 ml conec ado a un sis ema pu i icado AKTA. La columna se equilib ó
y se eluyó con ampón T is-HCl 0,25 M (pH 7,0) en modo isoc á ico, a una elocidad de
lujo de 0,5 ml min-1, y se de ec a on p o eínas / pép idos a 280 y 215 nm con un módulo
GE Heal hca e UV900 Acoplado a la columna de elución.
3.3.2.9. De e minación de P asimilable
Pa a la concen ación de P asimilable, se siguió el mé odo de Willians y S ewa
(desc i o po Gui ian y Ca ballas, 1976), basado en una de e minación colo imé ica en
la cual se mide la densidad óp ica de la disolución de colo azul, p oducida al educi el
3. Ma e iales y mé odos
44
complejo os omolíbdico o mado po eacción en e el ácido o o os ó ico y el ácido
molíbdico. Se calcula la concen ación de P po la p opo cionalidad exis en e en e la
in ensidad de colo y la can idad de o o os a o p esen e.
Pa a ello, se emplean 2 g de suelo y se le añaden 100 ml de disolución ex ac o a
(compues a po CaCO3, MgCO3, H2SO4 y agua des ilada a pH 3,2-3,3): Después de agi a
du an e cinco minu os, se il a y se p ocede a la de e minación de P.
Se oman 50 ml del il ado, se diluye has a un olumen ap oximadamen e de 80ml
con agua des ilada y se le añaden 4ml de la disolución de molibda o amónico
((NH4)Mo7O24.4H2O) (2,5g de molibda o amónico disuel os en 100 ml de ácido sul ú ico
10N), se lle a a 90-95 ml con agua des ilada y se añaden 0,8 ml de disolución de clo u o
es annoso (1 g de clo u o es annoso disuel o en 100 ml de ácido clo híd ico al 10%),
en asando a 100 ml y agi ando pos e io men e. Se man iene 30 minu os en la oscu idad,
al cabo de es e iempo se mide la densidad óp ica en un espec o o óme o a 690 nm.
La concen ación de P en la disolución se ob iene po in e polación, a pa i de
una cu a pa ón, ob enida a pa i de soluciones de P de concen ación conocida.
3.3.2.10. De e minación de K asimilable
Se ha seguido el mé odo desc i o po Gui ian y Ca ballas (1976), basado en la
ex acción de dicho elemen o con ace a o amónico, y pos e io de e minación en el
ex ac o. Pa a ello se in oducen 5 g de mues a seca en un bo e de agi ación con 50 ml
de solución ex ac o a de ace a o amónico. Se agi a la mues a du an e 30 minu os y a
con inuación se il a en un asco de polie ileno. El po asio se de e mina po o ome ía
de llama, cons uyendo una cu a pa ón a pa i de disoluciones de concen ación
conocida.
3.3.2.11. De e minación de me ales pesados o ales
Pa a la de e minación de los me ales pesados o ales, las mues as de suelo y
ma e ia o gánica deben se dige idas p e iamen e.
La mues a se debe mine aliza po ía húmeda en mic oondas, pa a ello, se si úa
en el in e io de un aso de e lón de al a p esión debidamen e seco. El peso que se oma
de mues a es de 0,4-0,5 ± 0,0005 g. Una ez añadidos los eac i os de diges ión (1 ml de
3. Ma e iales y mé odos
45
H2O2 y 4 ml HNO3), se in oduce en el mic oondas pe maneciendo du an e un
de e minado pe íodo de iempo. Es e mine alizado, una ez ío, se in oduce en un
ma az a o ado de 25 ml donde se en asa a dicho olumen, y se gua da en bo ella de
polies i eno pa a su almacenamien o en ne e a y pos e io análisis. A pa i del ex ac o
ob enido se de e mina on los me ales pesados po espec ome ía de abso ción a ómica
Pelkin-Elme 5500.
El cálculo de las concen aciones en me ales pesados de las mues as se hace
median e la u ilización de pa ones de concen ación conocida, u ilizando HNO3 diluido.
3.3.3. De e minación de pa áme os biológicos
3.3.3.1. Ca bono de biomasa mic obiana
Se de e minó siguiendo el mé odo de umigación-ex acción (Vance e al.,
1987).Pa a ello, 3 g de suelo amizado y humedecido al 60 % de su capacidad de e ención
híd ica, se incuban en ascos abie os de 150 cm3 en la oscu idad du an e 24 ho as, al
cabo de las cuales, se añaden 0,17 ml de clo o o mo la ado y se man ienen ce ados
du an e 30 minu os; seguidamen e se añaden 12 ml de sul a o po ásico 0,5 M y se agi a
mecánicamen e du an e 1 ho a. A con inuación, se cen i uga a 3400 pm du an e 8 min
y se il a. Pa alelamen e se p epa an ambién con oles sin clo o o mo. Al ex ac o
ob enido, se le pasa ai e du an e 2 minu os pa a elimina el clo o o mo y sob e dicho
ex ac o se mide el ca bono. El ca bono se midió en un analizado de ca bono pa a
mues as líquidas Shimadzu TOC-5050.
C de la biomasa mic obiana=C del ex ac o × 2,64
El ca bono de biomasa mic obiana de la mues a end á dado po la di e encia
en e el ca bono de la mues a umigada con clo o o mo y el de la mues a no umigada.
3. Ma e iales y mé odos
46
3.3.3.2. Ac i idad deshid ogenasa
La ac i idad deshid ogenasa del suelo se de e minó siguiendo el mé odo desc i o
po T e o s e al. (1982) y modi icado po Ga cía e al. (1993), cuyo p incipio se basa en
la es imación del iodoni o e azolio o mazan (INTF) o mado po educción cuando el
suelo es incubado con 2-p-iodo enil-3-p-ni o enil-5- enil e azolio (INT) como acep o
de elec ones, en ausencia de ampón (Figu a 8).
N
N
N
N
I
NO2
Cl N
N
NH
N
I
NO2
Figu a 8. Reacción del 2-p-iodo enil-3-p-ni o enil-5- enil e azolio (INT)
ans o mándose a iodoni o e azolio o mazan (INTF)
Pa a ello, a un g amo de mues a amizada a 2 mm se le añaden 0,4 ml de agua
des ilada y 0,2 ml de INT (al 0,4 % peso- olumen). A con inuación se deja incuba a 20
ºC en comple a oscu idad du an e 20 ho as. Pos e io men e, se adicionan 10 ml de
me anol y se agi a igo osamen e du an e 2 minu os, il ando a con inuación. Se p epa an
pa alelamen e con oles sin INT, en los que a 1 g de suelo se le añade 0,6 ml de agua. El
ex ac o se lee en espec o o óme o de abso ción molecula a 490 nm.
La abso bancia del ins umen o es ans o mada en concen ación median e una
ec a pa ón ob enida con INTF (iodoni o enil o mazan) en dis in as concen aciones.
La ac i idad de la mues a se calcula median e la siguien e ecuación:
ADH= (C x V)
(Pm x G x T)
3. Ma e iales y mé odos
47
donde:
ADH = ac i idad deshid ogenasa (μmoles INTF o mado g-1h-1).
C = can idad de INTF de la mues a, en μg ml-1.
Pm= peso molecula del INTF (471,3 g mol-1).
V = ac o de dilución.
G = g amos de suelo seco.
T = ac o de iempo de incubación; en es e caso 20 ho as.
3.3.3.3. Ac i idad u easa
La ac i idad u easa del suelo se de e minó siguiendo el mé odo desc i o po
Kandele y Ge be (1988), basado en la de e minación del amonio libe ado en la
incubación de una solución de suelo a 37 ºC du an e 2 h. La de e minación del amonio se
ealiza a a és de la eacción de Be helo . En es e mé odo, el amonio p oducido po la
ac i idad u easa eacciona con salicila o y diclo oisocianu o, gene ando un colo e de
azulado. La abso bancia a 690 nm es di ec amen e p opo cional a la concen ación de
ni ógeno amoniacal.
Pa a ello, a 1 g de mues a de suelo se añaden 0,5 ml de u ea 0,48 % y 4 ml de
ampón bo a o pH 10. Pa alelamen e se p epa a pa a cada mues a un con ol con 1 g de
suelo y 4 ml de ampón bo a o pH 10. Además, se p epa a un blanco con eniendo 0,5 ml
u ea 0,48 % y 4 ml de ampón bo a o pH 10. Mues a, con ol y blanco, se incuban en
baño e mos á ico con agi ación a 37 ºC du an e 2 ho as. Te minado es e pe íodo se
añaden 0,5 ml de u ea 0,48 % al con ol.
A con inuación, en ambos casos, se ex ae el amonio libe ado u ilizando 6 ml KCl
7,4 %, agi ando du an e 30 minu os. Seguidamen e, se cen i uga y il a la suspensión de
suelo, esul ando un il ado de ex ac o cla o en el que se de e mina amonio po
colo ime ía como a con inuación se de alla.
Pa a de e mina el amonio, a 0,5 ml de ex ac o se adicionan en el siguien e o den:
4,5 ml de agua des ilada, 2,5 de salicila o de Na/NaOH y 1 ml de diclo oisocianu o de
sodio, y la mezcla se deja eposa 30 min en oscu idad. La abso bancia se mide en

3. Ma e iales y mé odos
48
espec o o óme o de abso ción molecula , después de habe ajus ado el equipo a ce o
con el blanco, a una longi ud de onda de 690 nm.
La abso bancia medida se ans o ma en concen ación median e una ec a pa ón,
ob enida con concen aciones conocidas de amonio. Las unidades p opues as pa a es a
ac i idad enzimá ica son μmoles de N − NH4
+(g suelo seco × h)⁄ . La ac i idad de la
mues a se calcula median e la siguien e ecuación:
AU=(S − B)x V
(Pm x G x T)
donde:
AU = ac i idad u easa (μmoles de N-NH4+ g-1 suelo seco h-1).
S = can idad de N-NH4+ en las mues as (μg de N-N H4+) ob enida de la cu a pa ón.
B = can idad de N-NH4+ (μg de N-N H4+) pa a los blancos.
Pm= peso a ómico del ni ógeno (14 g mol-1).
V = olumen o al del ex ac o de incubación.
G = g amos de suelo seco.
T = ac o de iempo de incubación (ho as).
3.3.3.4. Ac i idad β-glucosidasa
El mé odo u ilizado oma como e e encia el desc i o po Taba abai (1982) y
Ei azi y Taba abai (1988), basado en la de e minación colo imé ica del p-ni o enol
ob enido po la acción de la β-glucosidasa después de incuba el suelo con el subs a o
a i icial p-ni o enil-β-D-glucopi anósido (PNG) en medio amponado a pH 6 y a
empe a u a de 37 ºC, y ex acción del p-ni o enol libe ado po il ación después de la
adición de CaCl2 y ampón THAM pH 12, que en medio básico desa olla un colo
ama illo.
Pa a ello, a 0,5 g de mues a de suelo se le añaden 0,5 ml de sus a o PNG (p-
ni o enil-β-D-glucopi anósido) 0,025 M y 2 ml de ampón MUB-HCl de pH 6.
3. Ma e iales y mé odos
49
Pa alelamen e se p epa a pa a cada mues a un con ol con 0,5 g de suelo y 2 ml de
ampón. Se p epa a un blanco con eniendo 0,5 ml de sus a o y 2 ml de ampón. Mues a,
con ol y blanco, se incuban en baño e mos á ico con agi ación a 37 ºC du an e 1 ho a.
Te minado es e pe íodo se añaden 0,5 ml de sus a o a los con oles.
A con inuación, odos los ubos se en ían a 4 ºC en baño con hielo du an e 15
minu os, pa a ena la eacción enzimá ica. Pasado es e iempo, se adicionan a odos los
ubos, mues a, con ol y blanco, 0,5 ml de CaCl2 0,5 M y 2 ml de disolución THAM-
NaOH 0,1 M, pH 12. Se agi a bien pa a que la suspensión se mezcle comple amen e.
Seguidamen e se cen i ugan los ubos a 3000 pm du an e 10 min. Se diluye
con enien emen e el sob enadan e y se mide su abso bancia en el espec o o óme o,
después de habe ajus ado el equipo a ce o con el blanco, a una longi ud de onda de 400
nm. El CaCl2 se añade pa a bloquea la eacción y pa a p o oca la dispe sión de coloides
que pod ían in e e i en la lec u a espec o o omé ica, y la disolución THAM-NaOH
si e pa a sali ica el p oduc o de eacción ob enido dándole colo ama illo.
La abso bancia medida se ans o ma en concen ación median e una ec a pa ón
ob enida con concen aciones conocidas de PNF. Las unidades p opues as pa a exp esa
es a ac i idad enzimá ica son μmoles PNF g-1 h-1. La ac i idad β-glucosidasa se calcula
usando la siguien e ecuación:
AG=(C x V)
(Pm x G x T)
donde:
AG = ac i idad β-glucosidasa μmol PNF g-1suelo seco h-1
C = concen ación de PNF (μg) en el ex ac o, según la ec a de calib ación ob enida.
V = ac o de dilución.
Pm= peso molecula del p-ni o enol (139 g mol-1).
G = g amos de suelo seco.
T = ac o ela i o al iempo de incubación, en ho as.
3. Ma e iales y mé odos
50
3.3.3.5. Ac i idad os a asa alcalina
Es a ac i idad enzimá ica se de e minó po el mé odo desc i o po Taba abai y
B eme (1969), basado en la de e minación espec o o omé ica del p-ni o enol libe ado
cuando se incuba el suelo a 37 ºC con una disolución amponada (pH 11,5 pa a la alcalina)
del subs a o a i icial p-ni o enil- os a o (PNF). El mé odo colo imé ico pa a medi el
p-ni o enol libe ado se basa en el hecho de que las disoluciones alcalinas de es e
compues o ienen colo ama illo.
Pa a ello, a 0,5 g de mues a de suelo se le añaden 0,5 ml de p-ni o enil os a o
0,025 M y 2 ml de ampón MUB pH 11,5. Pa alelamen e se p epa a pa a cada mues a un
con ol con 0,5 g de suelo y 2 ml de ampón MUB pH 11,5. Además, se p epa a un blanco
con 0,5 ml de sus a o y 2 ml de ampón MUB pH 11,5. Mues a, con ol y blanco, se
incuban en baño e mos á ico con agi ación a 37 ºC du an e 1 ho a. Te minado es e
pe íodo se añaden 0,5 ml de sus a o a los con oles.
A con inuación, odos los ubos se en ían a 4 ºC du an e 15 minu os, pa a ena
la eacción enzimá ica. Pasado es e iempo, se adicionan a odos los ubos, mues a,
con ol y blanco, 0,5 ml de CaCl2 0,5 M y 2 ml de NaOH 0,5 M. Se agi a bien pa a que
la suspensión se mezcle comple amen e. Seguidamen e se cen i ugan los ubos a 3400
pm du an e 10 min. Se diluye con enien emen e el sob enadan e y se mide su
abso bancia, en el espec o o óme o, después de habe ajus ado el equipo a ce o con el
blanco, a una longi ud de onda de 400 nm.
La abso bancia se ans o ma en concen ación median e una ec a pa ón,
ob enida con concen aciones conocidas de p-ni o enol- os a o. Las unidades p opues as
pa a exp esa es a ac i idad enzimá ica son μmoles p-ni o enol libe ado g-1 h-1. La
ac i idad os a asa se calcula usando la siguien e exp esión:
AP=(C x V)
(Pm x G x T)
donde:
AP = ac i idad os a asa (μmoles p-ni o enol libe ado g-1 h-1)
C = can idad p-ni o enol de la mues a en μg.
3. Ma e iales y mé odos
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V = ac o de dilución.
Pm= peso molecula del p-ni o enol (139 g mol-1).
G = g amos de suelo seco.
T = ac o ela i o al iempo de incubación en ho as.
3.3.3.6. Ac i idad o-di enol oxidasa
Es a ac i idad enzimá ica se de e minó po el mé odo desc i o po Pe ucci e al.
(2000). El p oblema más impo an e en el es udio de la oxidación de los compues os
enólicos en los suelos es la baja disponibilidad del sus a o oxidado, causado po la
adso ción de los componen es de suelo en la in e ase con la ca álisis enzimá ica, dado
que se dan eacciones inmedia amen e después del con ac o del ca ecol con el suelo. Las
quinonas o madas po la oxidación de compues os enólicos son al amen e eac i as y
capaces de o ma a ios p oduc os de condensación, especialmen e en p esencia de
compues os con g upos amino lib es, es e mé odo se basa en la o mación de dichos
compues os, a a és de la desa ollo de la oxidación enzimá ica del ca ecol y pos e io
eacción con la p olina (Figu a 9).
HO
HO
R
o-DPO
+ 1/2 O2
RO
O
Figu a 9. Esquema de la eacción gene alizada de la o-di enol oxidasa
Pa a ello, en ubos de ensayo, a 1 g de suelo esco se le añade 1,5 ml de una
solución 0,2 M de ca ecol (p e iamen e disuel a en ampón os a o 0,1 M), 1,5 ml de una
solución de 0,2 M de p olina (p e iamen e disuel a en ampón os a o 0,1 M), y 2 ml de
ampón os a o. Se hace un con ol igual pe o sin la solución de ca ecol 0,2 M.
Una ez que odas las mues as y con oles se incuban du an e 10 minu os a 30 °C
en baño con agi ación, se le añade la solución de ca ecol a los con oles.
La eacción se pa aliza median e en iamien o en baño de hielo du an e 10
minu os, cen i ugando la mues a du an e 10 minu os y en el sob enadan e y se mide su

4. Resul ados
59
4.1. PRIMERA EXPERIENCIA DE INCUBACIÓN
4.1.1. Humedad del suelo
La Figu a 10 mues a la humedad del suelo pa a los a amien os e ilizan es
some idos a sequía se e a du an e el pe iodo expe imen al. En los suelos no
enmendados y some idos a sequía se e a, la humedad disminuyó signi ica i amen e
(p<0,05) du an e odo el pe íodo de incubación, de al o ma que al inal del pe íodo
expe imen al, la humedad del suelo disminuye un 76,9%. Al aplica ma e ia o gánica al
suelo no egado, la humedad su ió una disminución menos d ás ica. Sin emba go, se
obse a on di e encias signi ica i as en e los a amien os o gánicos. En es e sen ido, y
al inal del pe íodo de incubación, el mayo po cen aje de humedad se encon ó en el
suelo enmendado con SM, seguido po CM y MSW (30,1% y 47,4%), espec i amen e.
Figu a 10. E olución de la humedad (%) (media ± e o es ánda , n = 3) en suelos no
egados du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no p esen an
di e encias signi ica i as (p>0,05).
4.1.2. P opiedades químicas del suelo
Como e a de espe a , en los suelos egados la adición de enmiendas o gánicas
aumen ó el C soluble en agua (Tabla 8). Al inal del pe íodo de incubación, es e
aumen o en es e pa áme o químico ue signi ica i amen e mayo en el suelo
enmendado con SM que en los suelos enmendados con CM (55,7%) y MSW (78,7%).
0
20
40
60
80
100
30
100
200
365
Humedad (%)
Días de incubación
SD
SD+MSW
SD+CM
SD+SM
aab
c
b
b
b
c
b
c
d
cc
dd
de
e
4. Resul ados
60
Tabla 8. E olución del Ca bono soluble en agua (µg C g-1) (media ± e o es ánda ,
n=3) en suelos egados y no egados du an e el pe iodo expe imen al. Los núme os en la
ila seguidos po la misma le a no son signi ica i amen e di e en es (p>0,05)
Días de incubación
30
100
200
365
S
477a ± 7
461a ± 13
471a ± 16
465a ± 11
S+MSW
563a ± 23
538a ± 12
581ab ± 19
596b ± 15
S+CM
1282c ± 73
1153c ± 62
1048c ± 58
1243c ± 80
S+SM
2714d ± 82
2636d ± 118
2700d ± 143
2804d ± 82
SD
471a ± 18
493a ± 16
550a ± 24
636b ± 52
SD+MSW
532a ± 20
649b ± 64
734b ± 54
803b ± 83
SD+CM
1304c ± 73
1432c ± 83
1550c ± 64
1711c ± 101
SD+SM
2666d ± 58
3235d ± 117
3732de± 73
4094e ± 122
En los suelos no egados, y a di e encia de los suelos egados, la concen ación
del C soluble en agua aumen ó du an e odo el pe iodo expe imen al. Lógicamen e, es e
pa áme o químico ue mayo en los suelos enmendados o gánicamen e que con
espec o al a amien o SD. Compa ado con el a amien o SD y al inal del pe íodo de
incubación, el C soluble en agua ue un 84,5% mayo en el a amien o SD + SM,
62,8% en el a amien o SD + CM y 84,5% en el a amien o SD + MSW.
La Tabla 9 mues a la e olución de la dis ibución del peso molecula de la
p o eína (kDa) pa a los días 30 y 365 del pe iodo expe imen al. En los suelos egados,
la adición al suelo de las dis in as enmiendas o gánicas, modi icó la dis ibución del
peso molecula de las p o eínas, aumen ando las p o eínas con mayo peso molecula en
los suelos enmendados con MSW, seguido po CM y SM. Al inal del pe íodo
expe imen al, el po cen aje de p o eínas de mayo peso molecula disminuyó,
aumen ando el po cen aje de p o eínas de meno peso molecula . En los suelos no
egados y al inal del expe imen o, el po cen aje de p o eínas de al o peso molecula
ambién disminuyó, pe o es a disminución ue meno que en los suelos egados.
4. Resul ados
61
Asimismo, el po cen aje de p o eínas de bajo peso molecula ambién aumen ó, pe o
nue amen e, es e aumen o ue meno que en los suelos egados.
Tabla 9. E olución de la dis ibución del peso molecula de la p o eína (kDa) (media ±
e o es ánda , n = 3) en suelos egados y no egados du an e el pe iodo expe imen al.
Los núme os en la ila seguidos po la misma le a no son signi ica i amen e di e en es
(p>0,05)
Peso molecula (kDa)
> 50
50-30
30-10
< 10
S30
0a ± 0
0a ± 0
38,3 ± 1,7
61,7g ± 1,3
S+MSW30
2,6c ± 0,5
24,4e ± 1,5
31,9 ± 2,3
41,1 ± 1,6
S+CM30
1,1b ± 0,2
16,6e ± 2,1
34,7 ± 2,8
47,6 ± 2,6
S+SM30
0,7ab ± 0,2
9,4d ± 1,0
37,2 ± 1,3
52,7 ± 3,0
S365
0a ± 0
0a ± 0
41,2 ± 2,0
58,8g ± 2,1
S+MSW365
1,9b ± 0,2
18,0e ± 1,9
34,1 ± 2,4
46,0 ± 2,9
S+CM365
0,8ab ± 0,1
10,1d ± 1,4
37,5 ± 2,6
51,6 ± 3,0
S+SM365
0,2a ± 0,1
6,3d ± 0,9
39,0 ± 3,3
54,5 ± 2,4
SD30
0a ± 0
0a ± 0
37,9 ± 1,3
62,1g ± 2,1
SD+MSW30
2,7c ± 0,6
24,4e ± 1,6
32,6 ± 2,1
40,3 ± 1,8
SD+CM30
1,2b ± 0,3
16,3e ± 1,1
34,3 ± 3,5
48,0 ± 2,2
SD+SM30
0,7ab ± 0,1
9,5d ± 0,8
38,0 ± 1,4
51,8 ± 1,7
SD365
0a ± 0
0a ± 0
39,0 ± 3,1
61,0g ± 3,3
SD+MSW365
2,3c ± 0,5
21,9e ± 2,4
33,0 ± 2,6
42,8 ± 2,2
SD+CM365
1,0b ± 0,2
15,0de ± 1,1
35,2 ± 1,5
48,8 ± 1,6
SD+SM365
0,4a ± 0,1
8,9d ± 0,8
38,4 ± 1,1
52,3 ± 1,6
La Tabla 10 mues a la e olución del Ca bono de ácidos úl icos y húmicos pa a
odos los a amien os ealizados, en ambas condiciones de humedad y pa a los 365 días
de incubación. En ambos es adios de humedad, la aplicación de ma e ia o gánica al
suelo aumen ó la concen ación del Ca bono de ácidos húmicos y úl icos. En los
suelos egados, la e olución del Ca bono de ácidos úl icos ue muy simila a la del
4. Resul ados
62
Ca bono soluble en agua, p esen ando los mayo es alo es al inal del pe iodo
expe imen al en el suelo enmendado con SM, seguido de CM y MSW.
Respec o a la e olución del Ca bono de ácidos húmicos, los esul ados des acan
que no hubo di e encias signi ica i as en cuan o a la e olución de dicho pa áme o en
suelos egados y en suelos no egados (Tabla 10).
Tabla 10. E olución del Ca bono de ácidos úl icos y ácidos húmicos (media ± e o
es ánda , n = 3) en suelos egados y no egados du an e el pe iodo expe imen al. Los
núme os en la ila seguidos po la misma le a no son signi ica i amen e di e en es
(p>0,05)
Días de incubación
30
100
200
365
C ácidos úl icos (mg C kg-1)
S
2,9a ± 0,2
2,9a ± 0,4
3,0a ± 0,4
2,9a ± 0,4
S+MSW
4,1b ± 0,5
4,2b ± 0,7
4,1b ± 0,8
4,3b ± 0,8
S+CM
4,5b ± 0,6
4,4b ± 0,6
4,5b ± 0,7
4,5b ± 0,6
S+SM
9,4c ± 0,2
9,3c ± 0,9
9,5c ± 1,0
10,4c ± 1,1
SD
2,9a ± 0,4
3,1a ± 0,4
2,9a ± 0,3
3,1a ± 0,5
SD+MSW
4,1b ± 0,6
4,0b ± 0,6
4,1b ± 0,5
4,1b ± 0,5
SD+CM
4,5b ± 0,6
4,6b ± 0,7
4,6b ± 0,5
4,5b ± 0,4
SD+SM
9,3c ± 0,8
9,2c ± 0,9
9,3c ± 1,1
9,4c ± 1,3
C ácidos húmicos (mg C kg-1)
S
3,2a ± 0,6
3,2a ± 0,4
3,2a ± 0,4
3,2a ± 0,5
S+MSW
4,6b ± 0,4
4,6b ± 0,3
4,6b ± 0,3
4,6b ± 0,3
S+CM
6,9c ± 0,5
6,9c ± 0,6
6,9c ± 0,4
6,9c ± 0,5
S+SM
9,4d ± 0,4
9,4d ± 0,4
9,4d ± 0,4
9,3d ± 0,4
SD
3,2a ± 0,5
3,2a ± 0,4
3,2a ± 0,3
3,2a ± 0,4
SD+MSW
4,6b ± 0,5
4,6b ± 0,4
4,6b ± 0,5
4,6b ± 0,5
SD+CM
6,9c ± 0,6
6,9c ± 0,5
6,9c ± 0,4
6,9c ± 0,5
SD+SM
9,3d ± 0,5
9,4d ± 0,5
9,3d ± 0,4
9,4d ± 0,4
4. Resul ados
63
En los suelos no egados, y compa ado con el a amien o S, el con enido del
Ca bono de ácidos úl icos al inal del pe iodo expe imen al ue un 17,5% maya en el
a amien o SD (Tabla 10). Respec o a los suelos enmendados o gánicamen e, solo el
a amien o SD+SM ue signi ica i amen e (p<0,05) mayo con espec o al a amien o
S+SM.
Los espec os ob enidos en el análisis de esonancia magné ica nuclea (RMN)
de 13C de es ado sólido pa a los días 30 y 365, se mues an en la Tabla 11. En suelos
egados y pa a odos los a amien os, la egión de desplazamien o químico
co espondien e a CO-alquilo es la dominan e, an o en el día 30 como en el día 365,
ep esen ando ap oximadamen e el 35-40% de la in ensidad o al de la señal. Las
esonancias en las egiones a omá icas C (110-165 ppm) y alquilo C (0-45 ppm),
con ibuyen 10-16% y 26-30% de la in ensidad o al, espec i amen e. Además, se
obse ó una disminución en el con enido del CO-alquilo y un aumen o en C alquilo, C
a omá ico y C ca boxílico du an e odo el pe íodo expe imen al, independien emen e
del ipo de esiduo o gánico aplicado al suelo. Compa ado con el suelo sin enmenda , la
elación C alquilo/C O-alquilo (A/O-A) aumen ó al inal del pe iodo expe imen al en
los suelos enmendados o gánicamen e. En los suelos no egados, los espec os de
e ela on que la egión C O-alquilo s la dominan e (35-44%) al p incipio y al inal del
pe íodo expe imen al, seguido po el C alquilo (24-30 %) y el C a omá ico (10-16%).
En los suelos no egados y al inal del pe íodo expe imen al, el C O-alquilo C aumen ó,
mien as que la elación C alquilo/C O-alquilo (A/O-A) disminuyó a a és del
expe imen o.

4. Resul ados
64
4. Resul ados
65
4.1.3. P opiedades bioquímicas del suelo
La Figu a 11 mues a la e olución del C de la biomasa mic obiana del suelo pa a
odos los a amien os e ilizan es du an e el pe iodo expe imen al. En los suelos
egados, la aplicación de ma e ia o gánica al suelo aumen ó signi ica i amen e (p<0,05)
el C de la biomasa mic obiana. Es e aumen o dependió de la composición química del
esiduo o gánico aplicado. En es e sen ido, y al inal del pe íodo expe imen al, el C de
la biomasa mic obiana ue mayo en el suelo enmendado con SM que en los suelos
enmendados con CM y MSW (9,9% y 23,1%, espec i amen e). En los suelos no
egados, el C de la biomasa mic obiana disminuyó signi ica i amen e (p<0,05) du an e
el pe iodo expe imen al. Es e descenso ue mayo en el suelo no enmendado que en el
suelo enmendado con las dis in as o mas o gánicas expe imen ales. Del mismo modo,
la dis in a composición química de los esiduos o gánicos empleados in luyó en es e
descenso del C de la biomasa mic obiana. Así, coincidiendo con los da os de humedad
encon ados, el C de la biomasa mic obiana ue mayo en el a amien o SD+SM,
seguido de los a amien os SD+CM y SD+MSW.
Figu a 11. E olución del C de la biomasa mic obiana (media ± e o es ánda , n = 3) en
suelos egados y no egados du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma
le a(s) no p esen an di e encias signi ica i as (p>0,05).
La Figu a 12 mues a la e olución de la ac i idad deshid ogenasa pa a odos los
a amien os e ilizan es du an e el pe iodo expe imen al. En suelos egados, y al igual
0
100
200
300
400
500
S
S+MSW
S+CM
S+SM
SD
SD+MSW
SD+CM
SD+SM
C de la biomasa mic obiana
(µg C g-1 suelo seco)
Días de incubación
30
100
200
365
bbbb
b
c
c
c
c
c
cd
b
c
c
d
bc
bab aaab
bbb
bb
bb
bbbb
4. Resul ados
66
que pa a el C de la biomasa mic obiana, la ac i idad deshid ogenasa aumen ó
p og esi amen e du an e odo el pe iodo de incubación. Sin emba go, es e aumen o
ambién dependió del ipo de ma e ia o gánica aplicada al suelo. Compa ado con el
a amien o S, y al inal del pe iodo de incubación, la ac i idad deshid ogenasa aumen ó
un 93,4% en el a amien o S+SM, un 91,3% en el a amien o S+CM y un 88% en el
a amien o S+MSW.
A di e encia de los suelos egados, en los suelos no egados la ac i idad
deshid ogenasa disminuyó de o ma p og esi a du an e odo el pe iodo de incubación.
Es e descenso ue mayo en el suelo no enmendado que con espec o a los suelos
enmendados o gánicamen e. También se encon a on di e encias signi ica i as en e los
dis in os a amien os o gánicos empleados. De es a o ma, compa ado con el
a amien o SD y al inal del pe iodo de incubación, la ac i idad deshid ogenasa
aumen ó un 71,3% en el a amien o S+SM, un 60,9% en el a amien o S+CM y un
38,6% en el a amien o S+MSW.
Figu a 12. E olución de la ac i idad deshid ogenasa (media ± e o es ánda , n = 3) en
no egados du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no
p esen an di e encias signi ica i as (p>0,05).INTF: 2-p-iodo-3-ni ophenyl o mazan
0
5
10
15
20
25
30
35
S
S+MSW
S+CM
S+SM
SD
SD+MSW
SD+CM
SD+SM
Ac i idad deshid ogenasa
(µg INTF g-1 h-1)
Días de incubación
30
100
200
365
bbbbbaa a
bbbab bb
b
ccc
c
c
c
cccd
dd
ee
e
e
4. Resul ados
67
La e olución de la ac i idad u easa ue muy simila a la de la ac i idad
deshid ogenasa (Figu a 13).
Figu a 13. E olución de la ac i idad u easa (media ± e o es ánda , n = 3) en no
egados du an e el pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no p esen an
di e encias signi ica i as (p>0,05).
En los suelos húmedos, la ac i idad u easa signi ica i amen e (p<0,05) aumen ó
en los suelos enmendados con ma e ia o gánica. De nue o, es a ac i idad enzimá ica
ue di e en e dependiendo del ipo de esiduo o gánico aplicado al suelo. En es e
sen ido, compa ado con el a amien o S y al inal del pe iodo de incubación, la
ac i idad u easa aumen ó un 91,7% en el a amien o S+SM, un 87,7% en el a amien o
S+CM y un 83,3% en el a amien o S+MSW.
Compa ado con los suelos egados, en los suelos no egados la ac i idad u easa
disminuyó. Sin emba go, es e descenso ue meno en los suelos enmendados
o gánicamen e que en los suelos no enmendados. Al igual que en la ac i idad
deshid ogenasa, en la ac i idad u easa ambién se encon a on di e encias signi ica i as
en e los dis in os a amien os o gánicos empleados. De es a o ma, compa ado con el
a amien o SD y al inal del pe iodo de incubación, la ac i idad deshid ogenasa
aumen ó un 60,6% en el a amien o SD+SM, un 51,5% en el a amien o SD+CM y un
37% en el a amien o SD+MSW.
0
5
10
15
20
25
S
S+MSW
S+CM
S+SM
SD
SD+MSW
SD+CM
SD+SM
Ac i idad u easa
(µg NH4+g-1 h-1)
Días de incubación
30
100
200
365
bbbab bb
cbbb
c
ccd ccc
ccd cd
ab aaa
ddd
ee
e
e
e
4. Resul ados
74
A pa i del día 26 desde el inicio de la incubación, la inhibición de la enzima
disminuyó p og esi amen e has a el inal del pe íodo expe imen al. Al inal de dicho
pe íodo de incubación, y compa ando el con ol con el a amien o, la ac i idad
deshid ogenasa disminuyó signi ica i amen e (p <0,05) en un 21,7% y 47,8% sólo pa a
los a amien os S+O1 y S+O3, espec i amen e. Aunque los alo es ob enidos pa a el
a amien o S+O2 ue on ambién un 13% in e io es a los ob enidos pa a el a amien o
S, el análisis es adís ico indicó que no se obse a on di e encias signi ica i as en e
ambos a amien os.
Con espec o a los esul ados ob enidos con el insec icida clo pi i os, la
ac i idad deshid ogenasa ambién mos ó una disminución signi ica i a (p<0,05). Una
ez más, es a disminución ue mayo cuando se aplicó la mayo dosis de insec icida al
suelo (10 l ha-1). Es a disminución ue máxima a los 12 días después de aplica el
insec icida al suelo (40%, 56% y 78% pa a los a amien os S+CL2, S+CL1 y S+CL3,
espec i amen e, en compa ación con el a amien o de con ol). A pa i de es a echa,
es a disminución disminuyó has a el inal el pe íodo expe imen al, obse ándose una
disminución signi ica i a (p <0,05) de la ac i idad de la deshid ogenasa has a el día 79
después de la aplicación del clo pi i os en el suelo. Al inal del pe íodo expe imen al, la
ac i idad de la deshid ogenasa en los a amien os S+CL2, S+CL1 y S+CL3 ue simila
al a amien o con S.
A di e encia de los suelos egados pe iódicamen e, cuando se aplicó el he bicida
oxi luo en los suelos no egados, la ac i idad deshid ogenasa p esen ó meno es alo es
al inal de los 120 días de incubación. En es e sen ido, al inal del pe íodo expe imen al
y en compa ación con los a amien os S+O1, S+O2 y S+O3, la ac i idad
deshid ogenasa disminuyó en un 54,3%, 42,1% y 69,2% pa a los a amien os SD+O1,
SD+O2 y SD+O3, espec i amen e. Del mismo modo, as la aplicación de clo pi i os
en los suelos no egados se obse ó un descenso de la ac i idad deshid ogenasa du an e
el pe iodo expe imen al. De nue o, es e descenso ue mayo en los suelos con una
mayo dosis de clo pi i os. Al igual que en el caso del suelo con oxi luo en, los alo es
de la ac i idad deshid ogenasa ue on meno es en suelos no egados que en suelos
egados.
Al igual que ocu e con la ac i idad deshid ogenasa, cuando se aplicó el
he bicida oxi luo en en los suelos egados, la ac i idad u easa disminuyó
signi ica i amen e (p<0,05) y de o ma p og esi a du an e el pe iodo de incubación

4. Resul ados
75
(Tabla 13). De nue o, es e descenso en es a ac i idad enzimá ica ue máximo a los 26
días de iniciado el p oceso de incubación.
Al inal del pe iodo expe imen al, y compa ando con el a amien o con ol, la
ac i idad u easa signi ica i amen e (p<0,05) disminuyó un 47,1%, 55,4% y 75,3% en
los a amien os S+O2, S+O1 y S+O3, espec i amen e.
Cuando se aplicó clo pi i os al suelo egado pe iódicamen e, ambién se p odujo
una inhibición signi ica i a (p<0,05) de dicha ac i idad u easa, siendo máxima es a
inhibición a los 26 días de iniciado el expe imen o. Al inal de los 120 días
expe imen ales, la ac i idad u easa p esen ó unos alo es muy simila es en odos los
a amien os (S, S+CL1, S+CL2 y S+CL3, espec i amen e).
La aplicación del he bicida en el suelo no egado ambién p odujo una ue e
inhibición en la ac i idad u easa (Tabla 13). Al inal del pe iodo expe imen al y
compa ado con el a amien o SD, la ac i idad u easa signi ica i amen e (p<0,05)
disminuyó un 25,6% pa a el a amien o SD+O2, seguido de un 36,7% y 53,3% pa a los
a amien os SD+Ò1 y SD+O2, espec i amen e.
De la misma o ma, cuando el insec icida clo pi i os se aplicó al suelo, se
obse ó un descenso signi ica i o (p<0,05) en la ac i idad u easa del suelo no egado
pe iódicamen e. En es e sen ido, al inal del pe iodo expe imen al y compa ado con el
a amien o SD, la ac i idad u easa disminuyó un 27,8% en el a amien o SD+O2,
seguido de un 37,8% y 45,6% pa a los a amien os SD+Ò1 y SD+O2, espec i amen e.
Las Tablas 14 y 15 mues an la e olución de las ac i idades β-glucosidasa y
os a asa pa a odos los a amien os du an e los 120 días de incubación. En los suelos
egados, la espues a de es as ac i idades enzimá icas ue muy simila a la desc i a
an e io men e cuando se aplicó oxi luo en y clo pi i os al suelo. En es e sen ido, se
obse a una inhibición de las ac i idades β-glucosidasa y os a asa du an e odo el
pe iodo expe imen al cuando se aplicó el he bicida al suelo, mien as que cuando se
aplicó clo pi i os al suelo, es as ac i idades enzimá icas mos a on un máximo de
inhibición a los 12 días de iniciado el expe imen o.
Po úl imo, cuando el suelo ue some ido a sequía se e a du an e los 120 días de
incubación, las ac i idades β-glucosidasa y os a asa mos a on una e olución muy
simila al compo amien o ob enido con las ac i idades deshid ogenasa y u easa en
suelos con los plaguicidas expe imen ales.
4. Resul ados
76
4. Resul ados
77
4. Resul ados
78
4. Resul ados
79
4.2.3. Biodi e sidad mic obiana del suelo
Las Tablas 16 y 17 mues an la e olución de la comunidad mic obiana (bac e ias
y hongos) du an e los 120 días de incubación en p esencia de oxi luo en y clo pi i os,
espec i amen e.
Cuando el he bicida se aplicó al suelo egado pe iódicamen e, la población o al
de bac e ias y hongos signi ica i amen e (p<0,05) disminuyó (Tabla 16). En es e
sen ido y compa ado con el a amien o S, la población o al de bac e ias disminuyó un
10,9%, 20% y 36,5% pa a los a amien os S+O2, S+O1 y S+O3, mien as que la
población o al de hongos signi ica i amen e (p<0,05) disminuyó un 11,6%, 18% y
20,4% pa a los a amien os S+O2, S+O1 y S+O3, espec i amen e.
Cuando clo pi i os se aplicó al suelo egado pe iódicamen e du an e los 120 días
de incubación, la población o al de bac e ias y hongos disminuyó signi ica i amen e
(p<0,05) a los 10 días de iniciado el expe imen o (Tabla 17). Así, a los 10 días del
pe iodo de incubación, y compa ado con el a amien o con ol, en el suelo con el
insec icida, la población de bac e ias G am+ disminuyó un 25,6%, 30,6% y 25,6% en
los a amien os S+CL2, S+CL1 y S+CL3, la población de bac e ias G am- disminuyó
un 11,1%, 35,9% y 43% en los a amien os S+CL2, S+CL1 y S+CL3, y la población
o al de hongos disminuyó un 21,5%, 27,4% y 34,7% en los a amien os S+CL2,
S+CL1 y S+CL3, espec i amen e. Al inal del pe iodo de incubación, la población o al
de hongos y bac e ias en los suelos con el insec icida ue igual a la exis en e con el
suelo sin dicho insec icida.
Cuando el he bicida oxi luo en y el insec icida clo pi i os se aplica on en los
suelos no egados pe iódicamen e, la e olución de la población mic obiana ue di e en e
a cuando el suelo ue egado. En es e sen ido, es a población mic obiana ue simila al
compo amien o bioquímico del suelo, des acando un mayo descenso de población en
condiciones de sequía. En el caso del insec icida, es e e ec o nega i o pe maneció has a
el inal del pe iodo de incubación.

4. Resul ados
80
Tabla 17. E olución de bac e ias G am+, G am-, bac e ias o ales PLFAs y hongos PLFAs (ng
g-1) (media ± e o es ánda , n = 3) en suelos egados y no egados con oxi luo en du an e el
pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no p esen an di e encias signi ica i as
(p>0,05).
bacG am+
bacG am-
Bac e ias o ales
PLFAs
Hongos
PLFAs
S (10 días)
621c ± 34
398b ± 17
1019d ± 53
35,0b ± 3,1
S (50 días)
603c ± 36
411b ± 15
1014d ± 52
34,6b ± 2,7
S (120 días)
611c ± 28
406b ± 26
1017d ± 52
32,8b ± 3,3
S+O1 (10 días)
448b ± 22
276a ± 22
724b ± 43
27,7a ± 2,9
S+O2 (10 días)
503b ± 27
344b ± 28
847c ± 53
29,3a ± 1,8
S+O3 (10 días)
404b ± 30
231a ± 31
635b ± 63
24,8a ± 1,1
S+O1 (50 días)
421b ± 19
259a ± 12
680b ± 30
28,2a ± 2,7
S+O2 (50 días)
499b ± 25
336b ± 15
835c ± 41
27,1a ± 2,0
S+O3 (50 días)
390a ± 21
236a ± 21
626b ± 40
24,2a ± 3,5
S+O1 (120 días)
436b ± 16
273a ± 25
709b ± 43
28,7a ± 1,6
S+O2 (120 días)
546bc ± 37
362b ± 18
908cd ± 51
30,6ab ± 3,3
S+O3 (120 días)
411b ± 30
235a ± 26
646b ± 49
26,1a ± 2,8
SD (10 días)
609c ± 28
387b ± 23
996d ± 52
32,1b ± 3,4
SD (50 días)
580b ± 31
301b ± 24
901cd ± 54
28,3a ± 2,1
SD (120 días)
503b ± 22
277a ± 27
780b ± 50
26,6a ± 2,8
SD+O1 (10 días)
431b ± 17
254a ± 21
685b ± 36
25,3a ± 3,3
SD+O2 (10 días)
495b ± 24
316b ± 35
811c ± 57
26,9a ± 1,6
SD+O3 (10 días)
379a ± 27
201a ± 22
580a ± 47
23,1a ± 2,3
SD+O1 (50 días)
366a ± 14
224a ± 18
590a ± 34
24,4a ± 1,1
SD+O2 (50 días)
422b ± 26
297b ± 24
719b ± 49
25,5a ± 2,5
SD+O3 (50 días)
305a ± 19
189a ± 13
494a ± 31
22,0a ± 1,9
SD+O1 (120 días)
374a ± 20
231a ± 17
605b ± 38
23,7a± 1,6
SD+O2 (120 días)
436b ± 27
293b ± 15
729b ± 44
26,2a ± 2,0
SD+O3 (120 días)
297a ± 15
178a ± 14
475a ± 31
22,7a ± 2,2
4. Resul ados
81
Tabla 18. E olución de bac e ias G am+, G am-, bac e ias o ales PLFAs y hongos PLFAs (ng
g-1) (media ± e o es ánda , n = 3) en suelos egados y no egados con clo pi i os du an e el
pe iodo expe imen al. Columnas con la misma le a(s) no p esen an di e encias signi ica i as
(p>0,05).
bacG am+
bacG am-
Bac e ias o ales
PLFAs
Hongos
PLFAs
S (10 días)
621c ± 34
398b ± 17
1019c ± 53
35,4b ± 3,1
S (50 días)
603c ± 36
411b ± 15
1014c ± 52
33,6b ± 2,7
S (120 días)
611c ± 28
406b ± 26
1017c ± 52
32,8b ± 3,3
S+O1 (10 días)
394b ± 17
255a ± 22
649b ± 41
25,7a ± 2,0
S+O2 (10 días)
462b ± 29
354 ± 26
816b ± 53
26,8a ± 2,7
S+O3 (10 días)
275a ± 14
227a ± 19
502a ± 31
23,1a ± 1,6
S+O1 (50 días)
431b ± 20
288a ± 11
719b ± 32
25,8a ± 2,4
S+O2 (50 días)
483b ± 31
385 ± 22
868c ± 51
28,4a ±2,2
S+O3 (50 días)
376b ± 25
225a ± 18
601b ± 54
25,1a ± 1,9
S+O1 (120 días)
616c ± 37
420b ± 25
1036c ± 60
34,6b ± 2,7
S+O2 (120 días)
624c ± 30
417b ± 16
1041c ± 45
35,2b ± 3,5
S+O3 (120 días)
609c ± 28
398b ± 21
1007c ± 47
34,8b ± 3,0
SD (10 días)
609c ± 28
387b ± 23
996c ± 52
32,1b ± 3,4
SD (50 días)
580b ± 31
301ab ± 24
901c ± 54
28,3a ± 2,1
SD (120 días)
503b ± 22
277a ± 27
780b ± 50
26,6a ± 2,8
SD+O1 (10 días)
386b ± 20
261a ± 25
647b ± 47
27,0a ± 2,2
SD+O2 (10 días)
471b ± 33
346 ± 19
817b ± 50
26,6a ± 2,5
SD+O3 (10 días)
226a ± 19
138a ± 22
364a ± 43
24,6a ± 2,0
SD+O1 (50 días)
318b ± 17
220a ± 22
538b ± 41
24,8a ± 1,7
SD+O2 (50 días)
386b ± 28
258a ± 23
644b ± 50
27,1a ± 2,0
SD+O3 (50 días)
189a ± 16
112a ± 14
301a ± 31
21,2a ± 1,5
SD+O1 (120 días)
274a ± 21
284a ± 26
558b ± 48
28,3a ± 2,1
SD+O2 (120 días)
325b ± 26
348b ± 22
673b ± 49
31,0b ± 2,2
SD+O3 (120 días)
246a± 18
201a ± 27
447a ± 44
22,6a ± 1,8
4. Resul ados
82
4.2.4. E olución de los plaguicidas en suelo
La Tabla 18 mues a la e olución de los dos plaguicidas expe imen ales du an e
el pe iodo de incubación pa a los suelos egados y no egados de o ma pe iódica. En
los suelos egados, los esul ados e elan una disminución p og esi a de ambos
plaguicidas a lo la go del iempo.
La deg adación de dichos plaguicidas es más ápida en el caso de clo pi i os que
en el caso de oxi luo en. Del mismo modo, la dosis ambién juega un papel impo an e,
des acando que dicha deg adación ue mayo cuando la dosis de plaguicida u ilizado ue
meno .
Cuando los plaguicidas se aplica on en condiciones de sequía se e a, la
deg adación de los mismos ue mucho más len a, lo cual hace pensa que en es as
condiciones de humedad, la pe sis encia en el suelo de es os compues os químicos
aumen a. De nue o, la dosis de plaguicida aplicado ambién in luyó en su deg adación
en ales condiciones de sequía se e a.
4. Resul ados
83
5. Discusión
90
puede ep esen a un impo an e es és pa a los mic oo ganismos del suelo, ya que el agua
es un ecu so esencial y necesa io que a ec a la supe i encia y el es ado isiológico de
los mic oo ganismos (Van Mee e en e al., 2008). Según Lame sdo e al. (1998), una
sequía se e a ep esen a una si uación c í ica pa a los mic oo ganismos del suelo y puede
causa un "downshock" que puede a ec a el es ado osmó ico de las células mic obianas
y que pod ía conduci a la mue e celula . Además, Schimel e al. (2007) encon a on que
la disponibilidad de agua puede a ec a la disponibilidad de sus a os, la di usión de gases,
el pH y la empe a u a del suelo y, po an o, pod ía se esponsable de los bajos alo es
encon ados en las ac i idades enzimá icas del suelo y la disminución de la población
bac e iana y úngica del suelo.
Respec o a la comunidad mic obiana, es des acable que, a co o plazo (30 días),
la sequía sólo a ec ó a las poblaciones de bac e ias G am- y hongos, sin a ec a a la
población de bac e ias G am +. Sólo al inal del expe imen o (365 días) la población de
bac e ias G am+ ambién disminuyó en compa ación con la ob enida pa a los suelos
egados. Es os esul ados es án de acue do con los ob enidos po Bé a d e al. (2011),
quien obse ó que, después de 21 días de sequía, la población de bac e ias G am+ no
había cambiado con espec o al suelo que no había sido some ido a sequía, posiblemen e
po que ienen pa edes celula es más ígidas, haciéndolas más esis en es a los p ocesos
de secado (Uhli o a e al., 2005).
Como consecuencia de la disminución en la ac i idad bioquímica de los
mic oo ganismos del suelo, la deg adación de las p o eínas ambién disminuyó, aunque
no a ec ó a la deg adación de los ácidos húmicos y úl icos del suelo. Es os esul ados
es án de acue do con los ob enidos po Van Mee e en e al. (2008) y Muh e al. (2010),
los cuales encon a on una disminución de la mine alización de la ma e ia o gánica del
suelo bajo condiciones de sequía. No obs an e, la disminución en las p opiedades
bioquímicas del suelo o iginó un aumen o p og esi o en el con enido de ca bohid a os
solubles en agua. Es os esul ados coinciden con los ob enidos po Kohle e al. (2009) y
Hueso e al. (2011), quienes obse a on un aumen o en el con enido de ca bohid a os
solubles del suelo bajo condiciones de sequía, que pod ía se como consecuencia de un
aumen o en la p oducción de ca bohid a os po mic oo ganismos como mecanismo de
de ensa con a el bajo po encial de agua ex e na, debido a que es os compues os son
hid o ílicos y pueden man ene un mayo con enido de agua en su mic oambien e.

5. Discusión
91
Los espec os de RMN ob enidos en condiciones de sequía mos a on cambios
pa a odas las egiones analizadas, al inal del pe íodo de incubación y pa a cada
a amien o de e ilizan e. A es e espec o y al inal del pe íodo expe imen al, el O-
alquilo aumen ó y el C alquilo disminuyó, coincidiendo con el aumen o de la
concen ación de ca bohid a os solubles en agua. Asimismo, la elación A/O-A
disminuyó al inal del expe imen o, des acando la meno deg adación del ma e ial
o gánico aplicado al suelo.
La aplicación de ma e ia o gánica al suelo, hizo que la humedad descendie a
menos b uscamen e y uese un descenso más len o y p og esi o a lo la go del iempo.
Además, la composición química de la ma e ia o gánica in luyó no ablemen e en el
con enido de agua du an e el pe íodo expe imen al. En es e sen ido, a ios au o es han
demos ado el papel c ucial de la ma e ia o gánica jun o con la ex u a, en la so ción del
agua y, po consiguien e, en el con enido de humedad del suelo (Rawls e al., 2003; Yang
e al., 2014). Sin emba go, los esul ados ob enidos ambién sugie en, que la composición
química de la ma e ia o gánica aplicada al suelo in luye ue emen e en la humedad del
suelo. Los es udios de so ción de xenobió icos o gánicos e ino gánicos en suelos
enmendados con di e en es uen es de ma e ia o gánica sugie en que la so ción es mayo
cuando el con enido de ácidos húmicos es mayo , posiblemen e debido al mayo núme o
de g upos ca boxílicos y enólicos (Tejada y Mascianda o, 2011; Tejada e al., 2008b,
2010b). La Tabla 4 indica un mayo núme o de g upos ca boxílico y enólico en el
es ié col de o eja, seguido del es ié col de aca y esiduo sólido u bano. Quizás es a es
la azón po la cual el aumen o de e ención de agua en los suelos enmendados ue mayo
en el a amien o SM, seguido po CM y MSW, espec i amen e. Como esul ado de es e
mayo con enido de agua en los suelos enmendados o gánicamen e, las ac i idades
enzimá icas ue on mayo es en compa ación con los suelos no enmendados, mien as que
la población de bac e ias y hongos su ió meno es descensos.
A pesa de la desacele ación en la mine alización de la ma e ia o gánica, el
con enido de ca bohid a os solubles en agua ue mayo en el suelo enmendado con SM
que en el suelo seguido del suelo enmendado con CM y MSW. Es o puede debe se a dos
causas: en p ime luga , la mayo e ención de agua se p odujo en el suelo enmendado
con el es ié col de o eja; y po o o lado, el suelo enmendado con es e esiduo o gánico
mos aba un mayo alo en el ca bono de la biomasa mic obiana y, po lo an o, un mayo
núme o de mic oo ganismos pa a deg ada los compues os o gánicos más lábiles.
5. Discusión
92
Además, hay un aumen o en la p oducción de ca bohid a os po los mic oo ganismos
como un mecanismo de de ensa, como se discu ió an e io men e.
5.2. SEGUNDA EXPERIENCIA DE INCUBACIÓN
5.2.1. Suelos egados
Los esul ados ob enidos pa a los suelos egados pe iódicamen e du an e el
pe iodo expe imen al sugie en que el he bicida oxi luo en y el insec icida clo pi i os
causa on un e ec o óxico sob e las p opiedades bioquímicas del suelo así como en la
biodi e sidad mic obiana de dichos suelos. Es os esul ados coinciden con los ob enidos
po Sheeba Singh e al. (2011), Kadian e al. (2012), Rod íguez-Mo gado e al. (2014),
Gómez e al. (2014), y Tejada e al. (2011, 2014, 2016), los cuales encon a on una
impo an e inhibición an o en las ac i idades enzimá icas del suelo como en su
biodi e sidad cuando se aplicó oxi luo en y clo pi i os debido al e ec o con aminan e de
ambos plaguicidas.
De acue do con Tejada e al., (2015), el e ec o inhibi o io de es os plaguicidas
sob e las ac i idades enzimá icas del suelo es p obablemen e debido a la sup esión de las
poblaciones mic obianas in oluc adas en los ciclos N, P y S; y/o al hecho de que pueden
obs aculiza , modi ica o al e a la in e acción de los si ios sus a o o gánico y enzima.
Es e e ec o óxico a ec a di ec amen e a la inhibición de la mayo ía de las
poblaciones mic obianas del suelo, quedando ac i os algunos g upos mic obianos
(bac e ias y hongos) es an es capaces de adap a se y c ece en p esencia de ambos
plaguicidas. Es os mic oo ganismos ole an es a la oxicidad de es os plaguicidas son los
enca gados de i deg adándolos poco a poco, lo cual conlle a inc emen os an o en la
población mic obiana como en las ac i idades enzimá icas de los suelos. Dichos
mic oo ganismos pueden u iliza los plaguicidas como uen e de ca bono y ene gía pa a
su c ecimien o y desa ollo, ans o mando y deg adando es os compues os o gánicos en
compues os menos óxicos. Es os esul ados ambién es án de acue do con los ob enidos
po Goswami e al. (2013), los cuales es udia on el compo amien o de la biomasa
mic obiana del suelo después de la adición del insec icida cipe me ina. Según es os
in es igado es, es e aumen o pod ía debe se al hecho de que los plaguicidas o sus
p oduc os de descomposición y las células mic obianas pos e io men e ma adas po el
plaguicida, pueden se u ilizados como uen e de ene gía o uen e de ca bono pa a la
5. Discusión
93
p oli e ación celula de los mic oo ganismos supe i ien es. La población mic obiana y
las ac i idades enzimá icas del suelo aumen a on ápidamen e, alcanzando alo es
supe io es a los de suelo no con aminado.
De acue do a los esul ados ob enido po Rod íguez-Mo gado e al. (2014),
Gómez e al. (2014) y Tejada e al. (2011, 2014, 2016), los esul ados ob enidos en es e
es udio mues an una al a pe sis encia en el suelo an o del oxi luo en como de
clo pi i os. Sin emba go, es a pe sis encia dependió de la dosis de los plaguicidas
aplicados.
5.2.2. Suelos no egados
En los suelos no egados pe iódicamen e du an e el pe iodo de incubación, las
dis in as ac i idades enzimá icas y biodi e sidad mic obiana es udiadas ue on meno es
que en el caso de suelo egado du an e el pe iodo expe imen al. Es os esul ados
coinciden con los ob enidos po o os au o es, como Hueso e al. (2011, 2012b) y Acos a-
Ma ínez e al. (2014), quienes encon a on un descenso en las p opiedades biológicas del
suelo bajo condiciones de sequía se e a, lo cual pone de mani ies o que la humedad del
suelo in luyó no ablemen e an o en su ac i idad bioquímica como en la comunidad
mic obiana.
En los suelos medi e áneos, el agua es un ecu so c í ico y esencial pa a el
desa ollo, c ecimien o y supe i encia de los mic oo ganismos del suelo (Hueso e al.,
2011, 2012a, b). Po o o lado, se ha obse ado ambién que la disponibilidad de agua
puede a ec a la disponibilidad de sus a os, la di usión de gases, el pH del suelo y la
empe a u a (Schimel e al., 2007). Todas es as causas pueden se esponsables de los
bajos alo es encon ados an o en las ac i idades enzimá icas del suelo como en la
población mic obiana de dicho suelo.
El compo amien o de los he bicidas en el suelo some ido a sequía se e a ue
di e en e del suelo egado pe iódicamen e. En el suelo some ido a sequía, los he bicidas
mos a on un mayo e ec o óxico sob e las dis in as ac i idades enzimá icas y
biodi e sidad mic obiana es udiadas, p incipalmen e cuando la dosis de plaguicida
u ilizada ue el doble de la dosis ecomendada.
Posiblemen e, es e mayo e ec o de los plaguicidas en condiciones de sequía
se e a pueda se consecuencia del e ec o combinado de es causas:
5. Discusión
94
1) E ec o óxico de los plaguicidas en los mic oo ganismos del suelo,
an e io men e desc i o, y po lo an o al p incipio del expe imen o sólo
los mic oo ganismos ole an es pueden c ece en p esencia de es os
compues os químicos.
2) Una posible disminución en la disponibilidad de sus a os
3) La supe i encia de mic oo ganismos del suelo esis en es a
condiciones de sequía.
Como consecuencia de es os 3 hechos, la deg adación de los plaguicidas en
condiciones de sequía se e a es mucho más len a a lo la go del iempo que en condiciones
de no sequía, pe sis iendo los mismos un mayo pe iodo de iempo y, po an o,
p o ocando una mayo oxicidad de es os plaguicidas en el medio ambien e.
6. CONCLUSIONES

6. Conclusiones
97
Del es udio de cómo a ec a la sequía se e a en las p opiedades químicas y
bioquímicas de un suelo medi e áneo as some e lo a di e sas p ác icas ag ícolas ales
como la aplicación de dis in as uen es de ma e ia o gánica, o de di e en es plaguicidas,
se exponen a con inuación las conclusiones más ele an es:
1. P ime a expe iencia de incubación
1.1. La e olución de la ma e ia o gánica en suelos egados depende p incipalmen e de
su composición química, sugi iendo que la acción lábil de la ma e ia o gánica es
la más suscep ible a la mine alización, ac uando como una uen e de ene gía
inmedia a pa a los mic oo ganismos
1.2. Los esul ados ob enidos en los espec os de RMN de 13C en es ado sólido indican
que la egión O-alquilo disminuyó en suelos enmendados o gánicamen e. Es a
disminución ue mayo en el suelo enmendado con el esiduo sólido u bano,
seguido de los suelos enmendados con es ié col de aca y o eja, espec i amen e.
Es os esul ados son la consecuencia de que el O-alquilo se conside a una o ma
ácilmen e deg adable de ca bono o gánico.
1.3. El agua es un ecu so esencial y necesa io que a ec a la supe i encia y el es ado
isiológico de los mic oo ganismos. Una sequía p olongada de 12 meses iene un
e ec o nega i o signi ica i o an o sob e las ac i idades enzimá icas del suelo
como sob e su biodi e sidad mic obiana, y en consecuencia sob e la
mine alización de la ma e ia o gánica aplicada. Es e hecho se debe al es és al que
pueden es a some idos los mic oo ganismos del suelo en ales condiciones, donde
la disponibilidad de agua puede a ec a la disponibilidad de sus a os, la di usión
de gases, el pH y la empe a u a del suelo y, po an o, pod ía se esponsable de
los bajos alo es encon ados en las ac i idades enzimá icas del suelo y la
disminución de la población bac e iana y úngica.
1.4. La comunidad mic obiana del suelo ue a ec ada de di e en e o ma. A co o
plazo, la sequía solo a ec ó a las poblaciones de bac e ias G am- y hongos, sin
6. Conclusiones
98
a ec a a la población de bac e ias G am +, posiblemen e po que es as bac e ias
ienen pa edes celula es más ígidas, haciéndolas más esis en es a los p ocesos
de secado. En pe iodos de sequía más la gos, an o bac e ias G am+ como G am-
y hongos se encon a on nega i amen e a ec ados.
1.5. La aplicación de ma e ia o gánica al suelo some ido a sequía hace disminui
menos b uscamen e el con enido de humedad de dicho suelo, debido a la so ción
de agua po pa e de la ma e ia o gánica. Es a so ción es mayo cuan o mayo es
el con enido en ácidos húmicos de dicha ma e ia o gánica. En es e caso, los e ec os
nega i os sob e la comunidad mic obiana del suelo y su ac i idad bioquímica
disminuye on signi ica i amen e. En consecuencia, nues o es udio demues a la
impo ancia de la ges ión de la ma e ia o gánica del suelo pa a hace en e a los
p ocesos de sequía climá ica.
2. Segunda expe iencia de incubación
2.1. En condiciones de sequía, la pe sis encia de los plaguicidas en suelo aumen a con
el iempo, y en consecuencia, puede pe sis i un mayo pe iodo de iempo el e ec o
óxico que algunos de es os plaguicidas pueden eje ce en el suelo. Es e mayo
e ec o de los plaguicidas en condiciones de sequía se e a pueda se consecuencia
del e ec o combinado de es causas: (1) e ec o óxico de los plaguicidas en los
mic oo ganismos del suelo que hace que solo se desa ollen los ole an es a dichos
compues os químicos; (2) una posible disminución en la disponibilidad de
sus a os; y (3) la supe i encia de mic oo ganismos del suelo esis en es a
condiciones de sequía.
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