Comportamiento de la materia orgánica y plaguicidas en un suelo agrícola sometido a sequía severa. Efecto en las propiedades químicas y biológicas

COMPORTAMIENTO DE LA MATERIA ORGÁNICA Y PLAGUICIDAS EN UN SUELO AGRÍCOLA SOMETIDO A SEQUÍA SEVERA. EFECTOS EN LAS PROPIEDADES QUÍMICAS Y BIOLÓGICAS. Memoria que presenta Luis Miguel Franco Andreu para optar al título de Doctor en Química. Sevilla, Marzo 2017. Fdo. Luis Miguel Franco Andreu UNIVERSIDAD DE SEVILLA DEPARTAMENTO DE CRISTALOGRAFIA, MINERALOGIA Y QUIMICA AGRICOLA Dra. Rosario Vaz Pardal, directora del Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola, CERTIFICA: Firmado: Dra. Rosario Vaz Pardal Sevilla, Marzo 2017 Que el Ldo. D. Luis Miguel Franco Andreu ha realizado bajo la dirección de los doctores D. Manuel Tejada Moral y D. Isidoro Gómez Parrales el trabajo titulado “COMPORTAMIENTO DE LA MATERIA ORGÁNICA Y PLAGUICIDAS EN UN SUELO AGRÍCOLA SOMETIDO A SEQUÍA SEVERA. EFECTOS EN LAS PROPIEDADES QUÍMICAS Y BIOLÓGICAS.” Para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla, cumpliendo los requisitos de la legislación vigente. COMPORTAMIENTO DE LA MATERIA ORGÁNICA Y PLAGUICIDAS EN UN SUELO AGRÍCOLA SOMETIDO A SEQUÍA SEVERA. EFECTOS EN LAS PROPIEDADES QUÍMICAS Y BIOLÓGICAS Departamento de Cristalografía, Mineralogía y Química Agrícola Universidad de Sevilla Programa de doctorado: RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE Línea de investigación: EDAFOLOGIA AMBIENTAL Visado en Sevilla, Marzo 2017 LOS DIRECTORES Dr. Manuel Tejada Moral Profesor Titular, Universidad de Sevilla Dr. Isidoro Gómez Parrales Profesor Contratado Doctor, Universidad de Sevilla AGRADECIMIENTOS (Porque es de bien nacidos ser agradecidos) En estas líneas quiero expresar mi más sincero y profundo agradecimiento a todas esas personas con las que he convivido estos tres años y que me han aguantado hasta la finalización de la presente tesis. En primer lugar, y muy a mi pesar por el hecho de ser bético, a la Peña Sevillista de San José de la Rinconada, por darme trabajo, gracias al cual he podido realizar la presente tesis doctoral, en especial a Paqui y Antonio, por ser tan buenos compañeros. A mis directores de tesis, Dr. Manuel Tejada Moral y Dr. Isidoro Gómez Parrales, por la orientación, paciencia, consejos y apoyo durante estos años. A María José Martínez de Alba y a José Luis Lozano, por estar en las buenas y las malas, por animarme cuando lo necesitaba, por echarme una mano y por estar ahí conmigo desde el principio de la presente tesis doctoral. A la profesora Dra. Patricia Paneque Macías, por dejarme dar mis primeros pasos en la investigación y por convertirse con el paso de los años en una muy buena amiga. Gracias, Patri. A las profesoras de la Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Dra. María Luz Mato Iglesias y Dra. Marina del Toro Carrillo de Albornoz, por su apoyo durante estos tres años y por los ratos en la máquina de café, que hicieron más llevadera esta etapa. Al catedrático Juan Parrado Rubio, por sus valiosos consejos y por atenderme siempre que necesitaba ayuda. A la gente del laboratorio del departamento de Bioquímica y biología molecular de la facultad de Farmacia, en especial a Bruno, por dejarme hacer uso del laboratorio, instruirme en aquello que no sabía… y por invitarme a cervezas siempre que se podía. A la profesora de investigación Dra. Heike Kniker, por prestarme su ayuda en la resolución de los espectros de RMN. A todos los alumnos de trabajo de fin de grado que han pasado por el laboratorio: Marisa, Luis y Adrián, en especial, a pesar de que no comenzamos con buen pie, a María Martín García, por su apoyo, por aguantarnos mutuamente, por nuestras tonterías, y por hacer que el laboratorio fuera un sitio menos aburrido. A mi familia, muy en especial a mis padres, mi hermano y mi cuñada, por estar a mi lado siempre, por su cariño y apoyo incondicional; pero sobre todo por haber sufrido con paciencia la realización de esta tesis. A mi otra “familia”, esas personas que han estado ahí, incluso desde mucho antes de la realización de la presente tesis: Ángel Luis Navarro, Cristina Lamilla, Amanda Martín, Enrique Marrón, Juan Pablo García, Paloma Ávila, Alejandro Moya y Carlos Sales, en especial, a Javier Castro Pozuelos y Luis Alberto Díaz Castro, quienes han estado conmigo desde el principio de la carrera y a los cuales los considero como si fueran mis hermanos. INDICE Índice de tablas VI Tabla 10. Evolución del Carbono de ácidos fúlvicos y ácidos húmicos (media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados durante el periodo experimental. Los números en la fila seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (p>0,05)………………………………………………………………………………62 Tabla 11. Evolución de los picos de RMN de 13C en estado sólido y relación C alquilo/C O-alquilo (A/O-A) en los tratamientos fertilizantes a los 30 y 365 días de iniciado el experimento……………………………………………………………………….….64 Tabla 12. Evolución de bacterias Gram+, Gram-, bacterias totales PLFAs y hongos PLFAs (ng g-1) (media ± error estándar, n = 3) en los tratamientos fertilizantes a los 30 y 365 días de iniciado el experimento Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05)…………………………………………………….70 Tabla 13. Evolución de la actividad deshidrogenasa (μg INTF g-1 h-1) (media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados en presencia de oxifluorfen y clorpirifos durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05). INTF: 2-p-iodo-3-nitrophenyl formazan…….…..73 Tabla 14. Evolución de la actividad ureasa (μg NH4+ g-1 h-1) (media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados en presencia de oxifluorfen y clorpirifos durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05)……………………………………………………….….…….76 Tabla 15. Evolución de la actividad β-glucosidasa (mmol PNP g-1 h-1)(media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados en presencia de oxifluorfen y clorpirifos durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05).PNP: p-nitrofenol……………………….…………77 Tabla 16. Evolución de la actividad fosfatasa (µmol PNP g-1 h-1) (media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados en presencia de oxifluorfen y clorpirifos durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05). PNP: p-nitrofenol………………….………..……78 Tabla 17. Evolución de bacterias Gram+, Gram-, bacterias totales PLFAs y hongos PLFAs (ng g-1) (media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados con oxifluorfen durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05)…………………………………….…….80 Tabla 18. Evolución de bacterias Gram+, Gram-, bacterias totales PLFAs y hongos PLFAs (ng g-1) (media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados con Índice de tablas VII clorpirifos durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05)………………………………………….81 Tabla 19. Evolución de oxifluorfen y clorpirifos (media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados con clorpirifos durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05)………………..83 Índices de figuras IX ÍNDICE DE FIGURAS Página Introducción Figura 1. Evolución de la temperatura (°C) global media durante el siglo XX y parte del siglo XXI. Datos proporcionados por GISTEMP Team (2016)………………………....4 Figura 2. Áreas afectadas por el efecto de recientes eventos de sequía (2000, 2003 y 2006)……………………………………………………………………………………..5 Figura 3. Consecuencias en suelo y cultivos de la pérdida de agua en suelo……………8 Figura 4. Procesos biológicos del suelo catalizados por enzimas…...............................14 Figura 5. Detalle de la membrana celular de una bacteria……………………………...18 Materiales y métodos Figura 6. Estructura del oxifluorfen (C15H11ClF3NO4)…………….…………………30 Figura 7. Estructura del clorpirifos (C9H11Cl3NO3PS)………………………………..31 Figura 8. Reacción del 2-p-iodofenil-3-p-nitrofenil-5-feniltetrazolio (INT) transformándose a iodonitrotetrazolio formazan (INTF)………………………………46 Figura 9. Esquema de la reacción generalizada de la o-difenol oxidasa……………….51 Resultados Figura 10. Evolución de la humedad (%) (media ± error estándar, n = 3) en suelos no regados durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05)……………………………………………………..59 Figura 11. Evolución del C de la biomasa microbiana (media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05)……………………………….65 Figura 12. Evolución de la actividad deshidrogenasa (media ± error estándar, n = 3) en no regados durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no Índices de figuras X presentan diferencias significativas (p>0,05).INTF: 2-p-iodo-3-nitrophenyl formazan………………………………………………………………………..............66 Figura 13. Evolución de la actividad ureasa (media ± error estándar, n = 3) en no regados durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05)……………………………………………………..67 Figura 14. Evolución de la actividad β-glucosidasa (media ± error estándar, n = 3) en no regados durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05).PNP: p-nitrofenol………………………………….68 Figura 15. Evolución de la actividad fosfatasa (media ± error estándar, n = 3) en no regados durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05).PNP: p-nitrofenol………………………………….69 Figura 16. Evolución de la actividad o-difenoloxidasa (media ± error estándar, n = 3) en no regados durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05)…………………………………………..69 Figura 17. Evolución de la humedad (%) (media ± error estándar, n = 3) en suelos no regados y con oxifluorfen (A) y clorpirifos (B) durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05)…….72 1. INTRODUCCION 1. Introducción 3 En la actualidad, diversos estudios científicos, así como las evaluaciones del Grupo Intergubernamental de Expertos sobre el Cambio Climático (IPCC), han demostrado que, debido al aumento en el consumo de combustibles fósiles y la deforestación, las concentraciones atmosféricas de dióxido de carbono (CO2) y otros gases de efecto invernadero (principalmente N2O y CH4) están aumentando de forma progresiva, provocando que el clima de la Tierra esté cambiando sustancialmente (Houghton et al., 2001; IPCC, 2013). La historia nos ha enseñado, que los cambios climáticos de la tierra han sido procesos naturales que se han producido muy lentamente. Sin embargo, en el siglo XVIII la historia comienza a cambiar. La población había aumentado tanto que ya ocupaba casi todos los lugares del planeta y necesitaba cada vez más alimentos, ropa, muebles, casas, etc. Se mantenían grandes cantidades de cabezas de ganado y se cultivaban grandes extensiones de tierra. Debido a la necesidad de obtener recursos para la población mundial, se produce una transformación social y económica, iniciada en Reino Unido; llamada la “Revolución Industrial”. Con la Revolución Industrial, el número de fábricas comenzó a aumentar alrededor del mundo, aumentando de esta forma la producción de recursos y facilitando nuevos puestos de trabajo. Debido a toda la innovación económica y tecnológica producida durante esta Revolución Industrial, comenzó la utilización de combustibles fósiles para la obtención de energía para el funcionamiento de la maquinaria industrial. Todos estos avances produjeron grandes beneficios, tanto a nivel social como a nivel económico. Sin embargo, la quema continua y excesiva de estos combustibles fósiles produjo grandes cantidades de gases que se emitían a la atmósfera. Las grandes plantaciones, el mantenimiento de animales y la tala de bosques también producen grandes cantidades estos gases de efecto invernadero. Desde la revolución industrial ha habido un drástico aumento de la concentración atmosférica de dióxido de carbono (CO2) y otros gases de efecto invernadero (Lal, 2004). La concentración atmosférica de CO2 ha aumentado de 280 ppm en 1750 a 367 ppm en 1999 y actualmente está aumentando a razón de 1,5 ppm/año o 3,3 Pg C/año (Lal, 2004). La concentración de metano atmosférico (CH4) ha aumentado de 700 a 1745 ppb aproximadamente en el mismo período y está aumentando a una tasa de 7 ppb/año. Del mismo modo, la concentración atmosférica de óxido nitroso (N2O) ha aumentado de 270 ppb en 1750 a 314 ppb y aumentando de forma progresiva a la tasa de 0,8 ppb/año (Lal, 1. Introducción 10 ecológico, al definirlo como su capacidad para aceptar, almacenar y reciclar agua, minerales y energía para la producción de cultivos, y a la vez preservar un ambiente sano. Para que este concepto pueda ser funcional es necesario contar con variables que puedan servir para evaluar la condición del suelo. Así surgen los indicadores de calidad del suelo. Los indicadores de la calidad de suelo se conciben como una herramienta de medición que debe ofrecer información sobre las propiedades, los procesos y las características. Estos se miden para evaluar los efectos del manejo del suelo en un periodo dado (Astier-Calderónet al., 2002). Uno de los aspectos fundamentales que se pretende abordar en la presente tesis, es el establecimiento de índices de calidad del suelo que permitan conocer el comportamiento del suelo al someterlo a un estado de sequía severo y prolongado durante un largo periodo de tiempo. Estos indicadores deben cumplir las siguientes condiciones:  Deben ser sensibles a los cambios que sufre el suelo  Debe haber una alta correlación con los procesos del ecosistema.  Deben integrar los procesos físicos, químicos y biológicos del suelo.  Deben ser relativamente fáciles de medir, basados en información objetiva y fácil de reconocer.  Permitir cambios y diferencias entre los sistemas.  Centrarse en aspectos prácticos y claros.  Reflejar el atributo de sostenibilidad que se quiere evaluar.  Ser fáciles de entender. La Tabla 1 muestra los distintos tipos de indicadores (físicos, químicos y biológicos) en el suelo así como su relación con las funciones y condiciones del suelo. En el presente trabajo de tesis, se realizó el seguimiento del suelo por dos tipos de indicadores: químicos y biológicos. 1. Introducción 11 Tabla 1. Indicadores físicos, químicos y biológicos de la calidad del suelo Indicadores Relación con las funciones y condiciones del suelo 1. FÍSICOS Textura del suelo Retención y transporte de agua y minerales, erosión del suelo Profundidad del suelo Estimación del potencial productivo y de erosión Infiltración y densidad aparente Potencial de lavado; productividad y erosividad Capacidad de retención de agua Relación con la retención de agua, transporte, y erosividad; humedad aprovechable, textura y materia orgánica Estabilidad de los agregados Erosión potencial de un suelo. Infiltración de agua 2. QUÍMICOS Materia orgánica (C y N orgánico) Define la fertilidad del suelo; estabilidad; erosión pH Define la actividad química y biológica, límites para el crecimiento de plantas y actividad biológica Conductividad eléctrica Define la actividad vegetal y microbiana, límites para el crecimiento de plantas y actividad biológica N, P y K extraíble Nutrientes disponibles para la planta, pérdida potencial de N; productividad e indicadores de la calidad ambiental Capacidad de intercambio catiónico Fertilidad del suelo, potencial productivo Metales pesados disponibles Niveles de toxicidad para el crecimiento de la planta y la calidad del cultivo 3. BIOLÓGICOS Biomasa microbiana (C y N) Potencial catalizador microbiano y reposición de C y N N potencial mineralizable Productividad del suelo y aporte potencial de N Respiración edáfica Medición de la actividad microbiana Número de lombrices Relacionado con la actividad microbiana Rendimiento del cultivo Producción potencial del cultivo 1.2.1. Indicadores químicos Dentro del grupo de parámetros que conforman los indicadores químicos (Tabla 1), la materia orgánica del suelo está considerada como el indicador más significativo de 1. Introducción 12 calidad (Larson y Pierce, 1991). Doran y Parkin (1994) la denominaron como el componente más importante a seleccionar entre un grupo de datos mínimos y necesarios para definir la calidad del suelo. Sin embargo, esta materia orgánica varía poco a corto plazo con el manejo, por lo que se ha sugerido la utilización de diferentes fracciones o compartimientos funcionales como indicadores de la sostenibilidad de los sistemas agrícolas Este trabajo de tesis se ha centrado en la evaluación de alguna de estas fracciones, como el carbono soluble en agua y el carbono de ácidos húmicos y fúlvicos, los cuales muestran variaciones en periodos cortos de tiempo. Por otra parte, para profundizar en el conocimiento de la composición molecular de la materia orgánica, en este trabajo se han empleado técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN). Estas técnicas, son muy utilizadas por algunos autores (Bernset al., 2008; Knicker, 2011). La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) es una herramienta analítica que proporciona información sobre la estructura molecular en un tiempo asequible. La técnica no es destructiva. La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) estudia el comportamiento de los núcleos atómicos que poseen spin diferente de cero, bajo la influencia de un campo magnético externo. Los instrumentos RMN son cada día más potentes y se desarrollan frecuentemente actualizaciones y piezas complementarias para satisfacer las necesidades de los laboratorios de todas las áreas de la investigación científica. Si bien esta técnica no puede ser considerada como novedosa, lo es su aplicación en muestras de suelo sólidas. Aunque sea posible seguir analizando muestras de suelo o de sus fracciones mediante RMN en estado líquido, la escasa solubilidad de esas muestras en los solventes comúnmente utilizados en RMN, convierte la RMN de estado sólido en la elección preferida de muchos investigadores de la ciencia del suelo. A diferencia del estado líquido, en estado sólido, la movilidad está muy restringida y se obtienen señales anchas, resultado de la suma de señales de todas las posibles orientaciones. Se han desarrollado técnicas que permitan obtener espectros de alta resolución en estado sólido: giro con ángulo mágico (MAS, Magic Angle Spinning), polarización cruzada (CP, Cross Polarization) (Simpson et al., 2011) o secuencias multipulso específicas para sólidos (CRAMPS, Combined Rotation and Multiple Pulse Spectroscopy). Un detector recoge 1. Introducción 13 todas las señales emitidas y las trasforma en espectros mediante la función de Trasformada de Fourier (Panettieri, 2013). 1.2.2. Indicadores biológicos La investigación y estudio de la biología del suelo se ha ido intensificando en los últimos años debido a la necesidad de conocer el rol que ejercen los distintos organismos del suelo sobre las diferentes reacciones químicas que ocurren en dicho suelo. Los indicadores biológicos integran gran cantidad de factores que afectan la calidad del suelo como la abundancia y subproductos de micro y macroorganismos, incluidos bacterias, hongos, nematodos, lombrices y artrópodos. Incluyen funciones como la tasa de respiración, actividades enzimáticas, ergosterol y otros subproductos de los hongos, tasas de descomposición de los residuos vegetales, N y C de la biomasa microbiana (Karlen et al., 1997). Una parte de esta memoria de tesis doctoral, ha sido el estudio de diversos parámetros bioquímicos, así como de la biodiversidad microbiana del suelo que, en los últimos años, está teniendo un gran peso específico sobre el estudio de la calidad del suelo. Esto se debe principalmente a que estos parámetros biológicos, a diferencia de los físicos y químicos, responden mucho más rápido a la aplicación de cualquier producto al suelo o cualquier manejo al que se esté sometiendo dicho suelo (Andreoni et al., 2004; Tejada et al., 2006; Zabaloy et al., 2008). El hecho de que estos cambios ocurran de forma mucho más rápida que los parámetros químicos y físicos, se debe principalmente a que los micro-organismos del suelo son muy sensibles a cualquier cambio, independientemente de si el cambio es positivo o negativo. Sin embargo, hay que tener en consideración un aspecto de suma importancia. Aunque para su mejor comprensión se estudien independientemente unos indicadores de otros, entre todos ellos existe una estrecha interrelación y dependencia, que hace que de la interpretación de algunos pueda inferir el comportamiento de los otros (Mortola y Lupi, 2011). 1. Introducción 14 1.2.2.1. Actividades enzimáticas como indicadores de la calidad del suelo Los microorganismos del suelo, principalmente bacterias y hongos (Atlas y Bartha, 1998) determinan la calidad de un suelo a través de sus actividades metabólicas en muy diferentes condiciones medioambientales. Por este motivo, las actividades enzimáticas, además de ser utilizadas como medida de la actividad microbiana, han sido utilizadas como indicadores potenciales de la calidad del suelo, debido a su relación con la actividad biológica del mismo, facilidad de medida, y respuesta rápida a los cambios en el manejo del suelo (Dick et al., 1996; Benítez et al., 2006). Una enzima se define como una proteína producida por una célula viviente que funciona como catalizador de una reacción química específica. Las enzimas por su naturaleza proteica pueden ser afectadas por la temperatura y pH (Alexander, 1980) y durante las reacciones específicas en que ellas actúan, lo hacen como catalizadores orgánicos sin experimentar cambios en su estructura (Coyne, 2000). Un gran porcentaje de los procesos que tienen lugar en el suelo (Figura 4) son reacciones enzimáticas (mineralización, inmovilización, fijación de nitrógeno, etc.). Figura 4. Procesos biológicos del suelo catalizados por enzimas Las enzimas pueden existir en el suelo tanto en forma de proteínas libres (enzimas extracelulares o abióticas) o asociadas con organismos vivos (enzimas bióticas). Las primeras se encuentran ampliamente distribuidas en el suelo y están protegidas por las sustancias húmicas, coloides y arcillas, lo que hace que su degradación y Degradación de materia orgánica exógena Transformación de la materia orgánica nativa Liberación de nutrientes Fijación de N2 Detoxificación de xenobióticos ENZIMAS DEL SUELO Nitrificación Desnitrificación 1. Introducción 15 desnaturalización (Ladd y Butler, 1975) se vea limitada y sus niveles de actividad sean constantes e independientes de la proliferación microbiana (Ceccanti et al., 1978). Debido a que las enzimas son muy resistentes a los procesos de desnaturalización, su extracción del suelo es muy difícil y, por tanto, se estudian indirectamente midiendo su actividad, y expresándolas en cantidad de producto final por tiempo de incubación y cantidad de suelo. Según su función, las enzimas del suelo más estudiadas son las oxidorreductasas (en particular, deshidrogenasas y catalasas) y las hidrolasas, que son enzimas relacionadas con el ciclo del C, N, P y S, dentro de las cuales, destacamos β-glucosidasas, proteasas, ureasa, fosfatasas, y arilsulfatasas. En consecuencia, existe una fuerte correlación entre la actividad bioquímica de los microorganismos de un suelo con la calidad de dicho suelo. En la Tabla 2 se muestran algunas de las actividades enzimáticas más estudiadas. Tabla 2. Funciones de algunas actividades enzimáticas del suelo Hidrolasas: - Invertasa: Sacarosa → glucosa + fructosa - Celulasa: celulosa (cristalina) → celulosa (amorfa) → celobiosa - β-Glucosidasa: celobiosa → glucosa + ROH - Fosfomonoesterasa: Fósforo orgánico → Fósforo inorgánico - Ureasa: Urea → CO2 + NH4+ - Proteasa: Proteínas y péptidos → NH4 - Arilsulfatasa: Azufre orgánico → Azufre inorgánico Oxidoreductasas: - Deshidrogenasa: XH2 + A → X + AH2 - Fenol oxidasas: monofenol + ½ O2 → Quinona + H2O - Lacasa: 4(difenol) + O2 → 4(quinona) + 2H2O - Peroxidasa: donador e- + H2O2 → donador oxid. + H2O - Catalasa: 2H2O2 → 2H2O + O2 1. Introducción 16 1.2.2.2. Biodiversidad microbiana como indicador de la calidad del suelo. El término biodiversidad microbiana, describe el número de especies de microorganismos diferentes y su abundancia relativa en una comunidad determinada en un hábitat dado (Garbeva et al., 2004). Tradicionalmente, este número se ha estimado para el total de células procariotas sobre la tierra en 4-6 x 1030, idea que comprende entre 106 y 108 genoespecies separadas (grupos taxonómicos distintos basados en el análisis secuencias de genes) (Cowan et al., 2005). Esto representa un enorme potencial biológico y genético que puede ser explotado para recuperar posibles nuevos genes, definir rutas metabólicas enteras y sus productos relacionados (Cowan et al., 2005). Se ha estimado que la diversidad microbiana del suelo está dentro de un rango de 3000 y 11000 genomas por gramo de suelo (Torsvik y Øvreås, 2002). Sin embargo, la inmensa diversidad genética y fenotípica de bacterias y hongos hacen de esta comunidad una de las más difíciles de estudiar (Øvreås y Torsvik, 1994). Se ha sugerido que el 99% de las bacterias observadas bajo el microscopio no son cultivables por las técnicas comunes de laboratorio, por lo que se puede suponer que el 1% restante es representativo de toda la población y que ese 99% es simplemente un estado fisiológico que evita que sean cultivados en los medios actuales, o que es posible que el 99% sean fenotípicamente y genéticamente diferentes de ese 1% y solo la minoría de la población está representada (Michelle et al., 1999). Para vencer este obstáculo del estudio dependiente de cultivo, se han desarrollado varios métodos para identificar y estudiar esos microorganismos, como el análisis de ácidos grasos y métodos como las diferentes variaciones de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) para analizar ADN y ARN (Kirk et al., 2004). Típicamente, las regiones de ADN que codifican para el 16S ARNr, 18S ARNr o ITS son blancos para la construcción de iniciadores para el estudio de la diversidad, ya que estos genes están presentes en todos los microorganismos y poseen regiones definidas para la clasificación taxonómica que no están sujetas a transferencia horizontal (Wintzingerode et al., 1997). Cabe destacar, que la utilización de iniciadores universales para la amplificación PCR de diversos genes 16S del total del ADN de la comunidad, ha generado una vasta cantidad de datos acerca del taxa y de especies presentes en un hábitat, redefiniendo la diversidad procariota (Steele y Wolfgang, 2005). De esta manera este tipo de estudios han revolucionado la ecología microbiana: por ejemplo, suelos que han mostrado ser poco diversos cuando se analizan con técnicas de cultivo tradicional, han 1. Introducción 17 mostrado, mediante el análisis de 16S, ser los hábitat más ricos en diversidad de procariotas sobre la tierra (Steele y Wolfgang, 2005). En consecuencia, el estudio de ADN en suelo tiene un gran potencial, pero también tienen grandes inconvenientes como la reproducibilidad de los ácidos nucleicos o la revelación genética microbiana total que se obtiene. Pero las desventajas que muestra esta técnica son solventadas por los resultados que da la determinación de los ácidos grasos (fosfolípidos) de membrana (PLFA) (Zelles, 1999). Esta técnica proporciona una medición amplia de la biodiversidad del suelo a nivel fenotípico, en contraposición del ADN, por lo que su utilización como indicador biológico suele proporcionar mejores resultados que nos permiten comprender cómo puede evolucionar la comunidad microbiana de un determinado suelo. El análisis de ácidos grasos se basa en el estudio de estos componentes esenciales de la membrana celular de las células vivas, que en condiciones naturales son una proporción relativamente constante de la biomasa de los organismos (Lechavalier, 1977) (Figura 5). De esta manera, es posible obtener un patrón representativo de especies aisladas o de ecosistema microbiano enteros (Zelles, 1999), ya que sólo las células vivas viables poseen membranas no alteradas, con ácidos grasos como los fosfolípidos [denominados en la literatura inglesa como PLFA, (phospholipids fatty acids, expresión en inglés que significa, ácido graso fosfolipídico)]. El análisis del patrón de éstos ácidos grasos, que se realiza a través de la identificación y cuantificación de sus ésteres metílicos (denominados en la literatura inglesa como FAME (fatty acids methyl esters, expresión en inglés que significa ésteres metílicos de ácidos grasos), mediante cromatografía gaseosa o de capa fina; cuyo patrón es característico para cada género y especie (MIDI, 1990; Liu, 1994). Este tipo de análisis de los ecosistemas microbianos se ha utilizado con tres variantes: (i) aplicación a microorganismos aislados mediante técnicas microbiológicas tradicionales (métodos FAME-MIDI), donde la identificación se realiza mediante el empleo de una base de datos (MIDI, 1990); (ii) identificación de relaciones entre grupos de microorganismos basado en ácidos grasos característicos de especies o géneros, como el caso de las evaluaciones de ergosterol (ácido graso propio de hongos) (Joergensen, 2000; Ruzicka et al., 2000); y (iii) el análisis de ecosistemas microbianos enteros, sin etapas de aislamiento de especies, donde se estudian ácidos grasos que identifiquen comunidades u organismos específicos, con fines ambientales (Tabla 3) (Nielsen y Petersen, 2000; Olsson et al., 1999; Olsson y Persson, 1999; Schutter y Dick, 1. Introducción 18 2000). Ésta última estrategia permite definir y agrupar suelos con características funcionales determinadas (niveles de carbono, fertilidad, actividades enzimáticas, etc.) (Maire et al., 1999), así como la identificación de las comunidades de microorganismos (Zelles, 1999). Figura 5. Detalle de la membrana celular de una bacteria A diferencia del estudio de ADN, en el estudio de PLFAs del suelo no podemos conocer qué tipos de bacterias u hongos se encuentran en el suelo (género y especie), pero sí se puede conocer la evolución de grupos de microorganismos del suelo, tales como los descritos en la Tabla 3. Molécula de glicerol Ácidos grasos Interior de la célula Exterior de la célula Bicapa lipídica Condiciones ambientales Célula 1. Introducción 19 Tabla 3. Resumen de los patrones más importantes de fosfolípidos que pueden ser utilizados para determinar la composición comunitaria de la microbiota del suelo (Zelles, 1999). Grupo microbiano Patrón de fosfolípidos Archaebacteria Residuos grasos con una unión éter a glicerol Bacterias Anaeróbicas Contienen esfingolípidos que están ausentes en los aeróbicos Bacterias en general Ácidos grasos saturados y monoinsaturados con unión éster a glicerol Bacterias Gram negativa Contienen mayor cantidad de ácidos grasos hidroxilados Bacterias Gram positiva Contienen mayor cantidad de ácidos grasos ramificados Cyanobacteria (y eucariotas) Contienen ácidos grasos poli-insaturados. Hongos Presentan un fosfolípidos específico, como: 18:2 6 ó ergosterol. 3. Materiales y métodos 27 Para alcanzar los objetivos de este trabajo de Tesis, los experimentos se realizaron en laboratorio, bajo condiciones controladas. Es decir, se usaron distintos microcosmos. Existe una amplia bibliografía en la que se destacan importantes críticas a los estudios realizados en microcosmos o mesocosmos, ya que los microorganismos en condiciones naturales de campo rara vez pueden experimentar las condiciones óptimas con las que se trabaja en laboratorio (Oburger y Jones, 2009). Por otra parte, otros autores sugieren que la mayoría de las incubaciones de laboratorio requieren tratamientos altamente procesados que alteran la estructura del suelo natural, generando otra alteración de las condiciones de campo (Young y Crawford, 2004), lo cual tiene implicaciones para la dinámica del agua debido a la alteración de los agregados estructurales (Beare et al., 2009), y para la dinámica de la comunidad microbiana. A pesar de estas críticas, desde finales los años 70, se vienen aceptando estudios de microcosmos en laboratorio, indicando que los mismos son funcionalmente similares a los ecosistemas naturales que simulan (Draggan, 1977; Leffler, 1978; Gillet y Witt, 1980). Como consecuencia de ello, hoy en día se siguen utilizando tanto los microcosmos como los mesocosmos, principalmente cuando se realizan experimentos de contaminación del medio ambiente. Esto es lógico, pues en tales microcosmos solo se contamina una parte de suelo y el contaminante está totalmente controlado por el investigador. Los motivos por los que los estudios se llevaron a cabo en microcosmos en lugar de realizarlos en campo, son los siguientes: 1) Necesitábamos establecer un periodo de sequía largo y prolongado de un año. El estudio directo en campo no nos aseguraba que, durante todo un año, no hubiese ningún tipo de precipitación. 2) Además de controlar el periodo de sequía se contaminó el suelo con dos plaguicidas. En consecuencia, se consideró apropiado el estudio en microcosmos para no contaminar un suelo de forma consciente. 3. Materiales y métodos 28 3.1. CARACTERÍSTICAS DEL SUELO, RESIDUOS ORGÁNICOS Y PLAGUICIDAS UTILIZADOS El suelo agrícola utilizado para el desarrollo de esta memoria fue un Regosol arénico calcárico (FAO, 2014) situado en el término municipal de Dos Hermanas (Sevilla). Se cogió suelo de los primeros 25 cm del horizonte superficial (Ap). Una vez trasladado al laboratorio, se dejó secar a temperatura ambiente y posteriormente se tamizó con un tamiz de luz de malla de 2 mm. Por último, las muestras se guardaron en botes de plástico hasta su análisis físico-químico. Con respecto a los residuos orgánicos utilizados, se emplearon tres residuos orgánicos: 1) Residuo sólido urbano (MSW) 2) Estiércol de vaca (CM) 3) Estiércol de oveja (SM) Los residuos fueron compostados hace 5 años, y desde entonces, los mismos se guardan en cámaras frigoríficas con el objeto de que dicha materia orgánica no se degrade. Dichos residuos fueron compostados bajo condiciones aeróbicas en una pila trapezoidal (4 m de largo, 2 m de ancho en la base y 1 m de altura) que contenía aproximadamente 5000 kg de cada residuo orgánico. Las pilas se voltearon cada dos semanas y se añadió agua regularmente para mantener los niveles de humedad adecuados. Con el fin de evitar posibles alteraciones en la microflora y las pérdidas de NH4+-N, no se permitió que la temperatura excediera de 60-65 ° C. Para el MSW, el compostaje duró unos 6 meses, mientras que en el caso de CM y SM, el compostaje duró aproximadamente unos 4 meses, respectivamente. Estos residuos orgánicos se emplearon solo en dos de los tres manuscritos publicados. La Tabla 4 muestra las características físico-químicas del suelo y de los tres residuos orgánicos utilizados en esta memoria de Tesis. 3. Materiales y métodos 29 Tabla 4. Características del suelo, residuos orgánicos experimentales y grupos funcionales ácidos de los ácidos húmicos aislados de los residuos orgánicos (media ± error estándar, n = 3) Suelo MSW CM SM pH (H2O) 7,9 ± 0,2 6,8± 0,2 8,2 ± 0,3 7,7 ± 0,2 Arena gruesa (g kg-1) 486 ± 49 Arena fina (g kg-1) 130 ± 25 Limo (g kg-1) 123 ± 29 Arcilla (g kg-1) 260 ± 35 N-Kjeldahl (g kg-1) 0,93 ±0,08 11,8 ± 1,4 6,8 ± 1,8 8,5 ±1,2 Materia orgánica (g kg-1) 17,2 ± 1,8 564 ± 18 251 ± 14 332 ± 21 C ácidos húmicos (mg kg-1) 3250 ± 64 4647 ± 42 6911± 58 9365 ± 75 Acidez total (cmolc kg-1) Nd 4,1 ± 0,2 4,4 ± 0,3 4,8 ± 0,3 Carboxílicos (cmolc kg-1) Nd 3,1 ± 0,2 3,3 ± 0,3 3,5 ± 0,2 Hidroxilofenólicos (cmolc kg-1) Nd 1,0 ± 0,1 1,1 ± 0,1 1,3 ± 0,2 C ácidos fúlvicos (mg kg-1) 2933 ± 22 4115 ± 67 4539 ± 54 7375 ± 57 P (g kg-1) 14,5 ± 2,2 12,3 ± 1,5 21,9 ± 1,6 25,1 ± 1,9 K (g kg-1) 20,3 ± 2,4 11,0 ± 1,8 25,2 ± 2,3 22,8 ± 1,6 Fe (mg kg-1) 13,9 ± 2,8 798 ± 43 355 ± 27 967 ± 24 Cu (mg kg-1) 10,4 ± 2,2 4,2 ± 0,9 21,8 ± 2,4 7,3 ± 1,4 Mn (mg kg-1) 9,7 ± 1,5 20,3 ± 3,5 16,7 ± 3,7 78,9 ± 7,7 Zn (mg kg-1) 6,6 ± 1,9 44,8 ± 6,4 9,2 ± 2,6 68,3 ± 6,9 Cd (mg kg-1) 4,7 ± 1,3 1,3 ± 0,2 0,9 ± 0,2 1,5 ± 0,4 Pb (mg kg-1) 2,4 ± 0,8 1,1 ± 0,2 3,8 ± 1,1 1,3 ± 0,2 Ni (mg kg-1) 1,8 ± 0,3 1,4 ± 0,3 1,7 ± 0,4 2,2 ± 0,5 MSW: Residuo Sólido Urbano CV: Estiércol de Vaca SM: Estiércol de Oveja Nd: No determinado 3. Materiales y métodos 30 Por otra parte, y para estudiar el efecto y comportamiento de productos fitosanitarios utilizados en la agricultura en un suelo sometido a sequía severa se utilizaron dos tipos de plaguicidas: 1) el herbicida oxifluorfen [2-cloro-1-(3-etoxi-4-nitrofenoxi)-4-(trifluorometil) benceno] (C15H11ClF3NO4) que es un difeniléter con actividad herbicida residual y de contacto, selectivo, absorbido más fácilmente por las hojas, especialmente por los brotes, que por las raíces, con muy poca translocación (Figura 6). Se define como únicamente de contacto sin efecto sistémico. Utilizado en una gran cantidad de cultivos, tales como algodón, cítricos, hortalizas, etc. En nuestra región es muy utilizado también en el cultivo del olivo para la obtención de aceite de oliva. Para este trabajo, se utilizó la formulación comercial Fenfen (24% p v-1, 240 g l-1) de Lainco, S.A. (España). O Cl F FF O NO O Figura 6. Estructura del Oxifluorfen (C15H11ClF3NO4) 2) el insecticida clorpirifos (O,O-dietil-O-3,5,6-tricloro-2-piridil fosforotioato) (C9H11Cl3NO3PS) que es un insecticida que posee una acción por contacto, ingestión e inhalación en insectos chupadores y masticadores, afectando el sistema nervioso del insecto y provocando la muerte del mismo (Figura 7). Para este trabajo, se utilizó la formulación comercial Senator 48 (48% clorpirifos) de Bayer CropScience (España). 3. Materiales y métodos 31 N ClCl Cl O P SO O Figura 7. Estructura del Clorpirifos (C9H11Cl3NO3PS) 3.2. DISEÑO EXPERIMENTAL Para alcanzar los objetivos descritos anteriormente, se realizaron dos tipos de experiencias de incubación. La primera experiencia de incubación, donde se utilizaron las distintas fuentes de materia orgánica, se realizó con la intención de alcanzar los objetivos 1 y 2 anteriormente definidos. La segunda experiencia de incubación, donde se utilizaron los dos plaguicidas, se realizó con la intención de alcanzar el objetivo 3 previamente definido. Por ello, a partir de ahora hablaremos de primera experiencia de incubación y de segunda experiencia de incubación. 3.2.1. Primera experiencia de incubación Para estudiar la evolución de las propiedades bioquímicas, comunidad microbiana y estructura de las tres fuentes de materia orgánica estudiadas bajo condiciones de sequía, se utilizaron contenedores de plástico con una capacidad de 5 L donde se les añadió 2 kg del suelo experimental (secado a temperatura ambiente y tamizado con tamiz de 2 mm de luz de malla). Los contenedores se enmendaron con las tres fuentes de materia orgánica ya mencionadas a una dosis de 30 t ha-1 (materia seca) en el caso del MSW, una dosis de 67,41 t ha-1 (materia seca) en el caso de CM y una dosis de 52,55 t ha-1 (materia seca) en el caso de SM, con el objeto de aplicar en todos los casos la misma cantidad de materia orgánica al suelo experimental (16,92 t materia orgánica ha-1). Estas dosis fueron escogidas de forma aleatoria. De la misma forma, se utilizó un suelo control sin enmendar. Se realizaron dos lotes con estos tratamientos fertilizantes. Uno de ellos se fue regando periódicamente con agua destilada. Cada 7 días se pesaba el contenedor y se calculaba la pérdida de agua por diferencia de pesada, restableciendo posteriormente dicha agua. Se mantuvo la humedad al 40-60% de su capacidad de campo durante un 3. Materiales y métodos 32 periodo de 365 días. El segundo lote se dejó sin regar durante todo el periodo experimental. De forma detallada, los tratamientos fertilizantes se muestran en la tabla 5. Tabla 5. Nomenclatura de las muestras en la primera experiencia de incubación y el tratamiento al que corresponde. Nomenclatura Tratamiento aplicado S Suelo no abonado orgánicamente y regado periódicamente durante el experimento S+MSW Suelo abonado con residuo sólido urbano (MSW) y regado periódicamente durante el experimento S+CM Suelo abonado con estiércol de vaca (CM) y regado periódicamente durante el experimento S+SM Suelo abonado con estiércol de oveja (SM) y regado periódicamente durante el experimento SD Suelo no abonado orgánicamente y no regado durante el experimento SD+MSW Suelo abonado con residuo sólido urbano (MSW) y no regado durante el experimento SD+CM Suelo abonado con estiércol de vaca (CM) y no regado durante el experimento SD+SM Suelo abonado con estiércol de oveja (SM) y no regado durante el experimento Cada tratamiento se realizó por triplicado (24 contenedores de plástico en total). Dichos contenedores se colocaron de forma aleatoria en una cámara de incubación con temperatura controlada (25 ± 1ºC). En suelos regados, el contenido de humedad se controló gravimétricamente y la pérdida de humedad se restituyó con agua destilada, según fuera necesario. 3. Materiales y métodos 33 El periodo de incubación fue de un año completo. Durante dicho periodo se cogieron 30 gramos de suelo para realizar los pertinentes análisis. Las muestras se guardaron en congelador a -20 ºC hasta su análisis. En este sentido, se tomaron muestras de todos los tratamientos (24 contenedores de plástico en total) a los 30, 100, 200 y 365 días de haber iniciado dicho experimento. En dichas muestras se realizaron las siguientes determinaciones analíticas: 1) Propiedades químicas: determinación de C soluble en agua, C de ácidos húmicos y C de ácidos fúlvicos 2) Composición de la materia orgánica en suelo mediante el uso de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) de 13C de estado sólido 3) Propiedades bioquímicas: determinación de C la biomasa microbiana y distintas actividades enzimáticas (deshidrogenasa, ureasa, β-glucosidasa, fosfatasa, Odifenol oxidasa). 4) Biodiversidad de la comunidad microbiana del suelo, mediante el análisis de los ácidos grasos de membrana (PLFAs). 3.2.2. Segunda experiencia de incubación Para estudiar la evolución de los dos plaguicidas estudiados y su comportamiento sobre las propiedades bioquímicas del suelo, se utilizaron contenedores de cristal con una capacidad de 5 L donde se les añadió 2 kg del suelo experimental (seco a temperatura ambiente y tamizado con tamiz de 2 mm de luz de malla). A diferencia de los experimentos anteriores, los contenedores fueron de cristal, ya que no es recomendable en caso de estudios de contaminación el uso de contenedores de plástico, ya que el contaminante puede adherirse a algún componente químico del plástico que conforma el contenedor. Los contenedores fueron contaminados con tres dosis distintas de oxifluorfen (2, 4 y 8 l ha-1, respectivamente, siendo 4 l ha-1 la dosis recomendada por el fabricante) y tres dosis distintas de clorpirifos (2,5, 5 y 10 l ha-1, respectivamente, siendo 5 l ha-1 la dosis recomendada por el fabricante). También se realizaron dos lotes con estos tratamientos. El procedimiento a seguir también fue el mismo, es decir, uno de ellos se fue regando periódicamente con agua destilada, manteniendo una humedad al 40-60% de su capacidad de campo, durante un 3. Materiales y métodos 34 periodo de 120 días. El segundo lote, se dejó sin regar durante dicho periodo experimental. El motivo de no realizar el experimento durante un año se debió a que la persistencia en suelo de los plaguicidas es inferior a los 365 días. De forma detallada, los tratamientos se muestran en la tabla 6. Cada tratamiento se realizó por triplicado (42 contenedores de cristal en total). Dichos contenedores se colocaron de forma aleatoria en una cámara de incubación con temperatura controlada (25 ± 1ºC). En suelos regados, el contenido de humedad se controló gravimétricamente y la pérdida de humedad se restituyó con agua destilada, según fuera necesario. El periodo de incubación fue de 120 días. Durante dicho periodo se cogieron 30 gramos de suelo para realizar los pertinentes análisis. Las muestras se guardaron en congelador a -20 ºC hasta su análisis. En este sentido, se cogieron muestras de cada tratamiento (24 contenedores de vidrio en total) a los 5, 12, 26, 50, 79, 100 y 120 días de haber iniciado dicho experimento. En dichas muestras se realizaron las siguientes determinaciones analíticas: 1) propiedades bioquímicas: determinación de distintas actividades enzimáticas (deshidrogenasa, ureasa, β-glucosidasa, fosfatasa). 2) biodiversidad de la comunidad microbiana del suelo, mediante el análisis de los ácidos grasos de membrana (PLFAs). 3) determinación de los plaguicidas experimentales 3. Materiales y métodos 35 Tabla 6. Nomenclatura de las muestras en la segunda experiencia de incubación y el tratamiento al que corresponde. Nomenclatura Tratamiento aplicado S Suelo no contaminado y regado durante el experimento S+O1 Suelo tratado con oxifluorfen (4 l ha-1) y regado periódicamente durante el experimento S+O2 Suelo tratado con oxifluorfen (2 l ha-1) y regado periódicamente durante el experimento S+O3 Suelo tratado con oxifluorfen (8 l ha-1) y regado periódicamente durante el experimento S+CL1 Suelo tratado con clorpirifos (5 l ha-1) y regado periódicamente durante el experimento S+CL2 Suelo tratado con clorpirifos (2,5 l ha-1) y regado periódicamente durante el experimento S+CL3 Suelo tratado con clorpirifos (10 l ha-1) y regado periódicamente durante el experimento SD Suelo no contaminado y no regado durante el experimento SD+O1 Suelo tratado con oxifluorfen (4 l ha-1) y no regado durante el experimento SD+O2 Suelo tratado con oxifluorfen (2 l ha-1) y no regado durante el experimento SD+O3 Suelo tratado con oxifluorfen (8 l ha-1) y no regado durante el experimento SD+CL1 Suelo tratado con clorpirifos (5 l ha-1) y no regado durante el experimento SD+CL2 Suelo tratado con clorpirifos (2,5 l ha-1) y no regado durante el experimento SD+CL3 Suelo tratado con clorpirifos (10 l ha-1) y no regado durante el experimento 3. Materiales y métodos 42 Con el fin de mejorar la resolución y calidad de los espectros, se realizó un pretratamiento con HF 10% a las muestras, descrito por Goncalves et al. (2003), para la eliminación de todas las especies paramagnéticas que puedan interferir en el análisis y concentrar el contenido en materia orgánica. Previo a la desmineralización con HF 10%, fue necesaria la eliminación del carbonato cálcico presente en los suelos, ya que se podrían formar otros compuestos no deseados, como el CaF2. Para ello, se trataron los suelos con HCl 1M, tantas veces como fuera necesario; y posteriormente lavadas con agua destilada. A continuación, 50 ml de HF al 10% se añadieron a 10 g de suelo y se agitó la mezcla durante dos horas. Posteriormente, se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos, eliminando cuidadosamente el sobrenadante mediante sifonación. Este proceso se llevó a cabo 4 veces. Tras el ataque con HF 10%, el suelo fue lavado con 50 ml de agua destilada, tantas veces como fuse necesario hasta alcanzar un pH 5-6; y sometido al proceso de liofilización antes de realizar las medidas de RMN. Los resultados de los análisis de RMN se obtuvieron con un equipo Bruker DSX 200, a una frecuencia de resonancia de 13C de 50,32 MHz usando rotores de dióxido de circonio de 7 mm de diámetro externo, con tapón de policlorotrifluoretileno (PCTFE o Kel-F®). La técnica de polarización cruzada se aplicó durante la rotación del ángulo mágico a 6,8 kHz. El tiempo de contacto fue de 1 ms y el intervalo entre pulsos de 1 Hz de forma escalonada, empezando entre el 100% y el 50% de la potencia inicial para evitar la modulación del spin durante el contacto Hartmann-Hahn (Peersen et al., 1993, Cook et al., 1996). Se acumularon entre 200.00 y 400.000 escáneres, usando un pulso de retardo de 250 ms. Se aplicó una ampliación de la línea entre 100 y 150 Hz. Para la resolución de los espectros obtenidos, se utilizó el Software MestReNova versión 9 (MestrelabResearch, Santiago de Compostela, España), aplicando una corrección de línea de base de puntos múltiples y corrigiendo la fase, dependiendo de las características de cada espectro. Mediante el software, se procedió a la determinación de la distribución relativa de carbono, integrando la intensidad de la señal en diferentes regiones de desplazamiento químico. Utilizando el tetrametilsilano (TMS) como referencia, con desplazamiento químico (chemicalshift) igual a 0 ppm, se establecieron 3. Materiales y métodos 43 las diferentes regiones espectrales, asignando a cada una de ellas los compuestos correspondientes, de acuerdo con Knicker y Lüdemann (1995) (Tabla 7). Tabla 7. Asignación típica de los picos de RMN de 13C en estado sólido a grupos funcionales presentes en muestras geoquímicas. (Referencia tetrametilsilano=0 ppm). Desplazamiento químico (ppm) Asignación 220 - 185 Carbonilos 185 - 160 Carboxílicos 160 - 110 Grupos Aromáticos COR o CNR, C-H Aromáticos, C olefinas 110 - 45 O-Alquilo, N-Alquilo 45 – 0 C alquilo 3.3.2.8. Determinación de la distribución del peso molecular de las proteínas Se siguió la metodología descrita en Gómez et al. (2014). La extracción se realizó con agua desionizada a pH 9, manteniendo la temperatura a 55 ºC durante 3 horas. La distribución de las proteínas se determinó por cromatografía de exclusión de tamaño usando un purificador AKTA (GE Healthcare), empleando una columna SuperdexPeptideTM 10 / 300GL (intervalo óptimo de separación <10 - 50 kDa). Las muestras se centrifugaron a 12000g durante 30 min a 4 ° C para eliminar las moléculas insolubles y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,2 μm y se cargó en un bucle de 0,1 ml conectado a un sistema purificador AKTA. La columna se equilibró y se eluyó con tampón Tris-HCl 0,25 M (pH 7,0) en modo isocrático, a una velocidad de flujo de 0,5 ml min-1, y se detectaron proteínas / péptidos a 280 y 215 nm con un módulo GE Healthcare UV900 Acoplado a la columna de elución. 3.3.2.9. Determinación de P asimilable Para la concentración de P asimilable, se siguió el método de Willians y Stewart (descrito por Guitian y Carballas, 1976), basado en una determinación colorimétrica en la cual se mide la densidad óptica de la disolución de color azul, producida al reducir el 3. Materiales y métodos 44 complejo fosfomolíbdico formado por reacción entre el ácido ortofosfórico y el ácido molíbdico. Se calcula la concentración de P por la proporcionalidad existente entre la intensidad de color y la cantidad de ortofosfato presente. Para ello, se emplean 2 g de suelo y se le añaden 100 ml de disolución extractora (compuesta por CaCO3, MgCO3, H2SO4 y agua destilada a pH 3,2-3,3): Después de agitar durante cinco minutos, se filtra y se procede a la determinación de P. Se toman 50 ml del filtrado, se diluye hasta un volumen aproximadamente de 80ml con agua destilada y se le añaden 4ml de la disolución de molibdato amónico ((NH4)Mo7O24.4H2O) (2,5g de molibdato amónico disueltos en 100 ml de ácido sulfúrico 10N), se lleva a 90-95 ml con agua destilada y se añaden 0,8 ml de disolución de cloruro estannoso (1 g de cloruro estannoso disuelto en 100 ml de ácido clorhídrico al 10%), enrasando a 100 ml y agitando posteriormente. Se mantiene 30 minutos en la oscuridad, al cabo de este tiempo se mide la densidad óptica en un espectrofotómetro a 690 nm. La concentración de P en la disolución se obtiene por interpolación, a partir de una curva patrón, obtenida a partir de soluciones de P de concentración conocida. 3.3.2.10. Determinación de K asimilable Se ha seguido el método descrito por Guitian y Carballas (1976), basado en la extracción de dicho elemento con acetato amónico, y posterior determinación en el extracto. Para ello se introducen 5 g de muestra seca en un bote de agitación con 50 ml de solución extractora de acetato amónico. Se agita la muestra durante 30 minutos y a continuación se filtra en un frasco de polietileno. El potasio se determina por fotometría de llama, construyendo una curva patrón a partir de disoluciones de concentración conocida. 3.3.2.11. Determinación de metales pesados totales Para la determinación de los metales pesados totales, las muestras de suelo y materia orgánica deben ser digeridas previamente. La muestra se debe mineralizar por vía húmeda en microondas, para ello, se sitúa en el interior de un vaso de teflón de alta presión debidamente seco. El peso que se toma de muestra es de 0,4-0,5 ± 0,0005 g. Una vez añadidos los reactivos de digestión (1 ml de 3. Materiales y métodos 45 H2O2 y 4 ml HNO3), se introduce en el microondas permaneciendo durante un determinado período de tiempo. Este mineralizado, una vez frío, se introduce en un matraz aforado de 25 ml donde se enrasa a dicho volumen, y se guarda en botella de poliestireno para su almacenamiento en nevera y posterior análisis. A partir del extracto obtenido se determinaron los metales pesados por espectrometría de absorción atómica Pelkin-Elmer 5500. El cálculo de las concentraciones en metales pesados de las muestras se hace mediante la utilización de patrones de concentración conocida, utilizando HNO3 diluido. 3.3.3. Determinación de parámetros biológicos 3.3.3.1. Carbono de biomasa microbiana Se determinó siguiendo el método de fumigación-extracción (Vance et al., 1987).Para ello, 3 g de suelo tamizado y humedecido al 60 % de su capacidad de retención hídrica, se incuban en frascos abiertos de 150 cm3 en la oscuridad durante 24 horas, al cabo de las cuales, se añaden 0,17 ml de cloroformo lavado y se mantienen cerrados durante 30 minutos; seguidamente se añaden 12 ml de sulfato potásico 0,5 M y se agita mecánicamente durante 1 hora. A continuación, se centrifuga a 3400 rpm durante 8 min y se filtra. Paralelamente se preparan también controles sin cloroformo. Al extracto obtenido, se le pasa aire durante 2 minutos para eliminar el cloroformo y sobre dicho extracto se mide el carbono. El carbono se midió en un analizador de carbono para muestras líquidas Shimadzu TOC-5050. C de la biomasa microbiana=C del extracto × 2,64 El carbono de biomasa microbiana de la muestra vendrá dado por la diferencia entre el carbono de la muestra fumigada con cloroformo y el de la muestra no fumigada. 3. Materiales y métodos 46 3.3.3.2. Actividad deshidrogenasa La actividad deshidrogenasa del suelo se determinó siguiendo el método descrito por Trevors et al. (1982) y modificado por García et al. (1993), cuyo principio se basa en la estimación del iodonitrotetrazolio formazan (INTF) formado por reducción cuando el suelo es incubado con 2-p-iodofenil-3-p-nitrofenil-5-feniltetrazolio (INT) como aceptor de electrones, en ausencia de tampón (Figura 8). N N N N I NO2 Cl N N NH N I NO2 Figura 8. Reacción del 2-p-iodofenil-3-p-nitrofenil-5-feniltetrazolio (INT) transformándose a iodonitrotetrazolio formazan (INTF) Para ello, a un gramo de muestra tamizada a 2 mm se le añaden 0,4 ml de agua destilada y 0,2 ml de INT (al 0,4 % peso-volumen). A continuación se deja incubar a 20 ºC en completa oscuridad durante 20 horas. Posteriormente, se adicionan 10 ml de metanol y se agita vigorosamente durante 2 minutos, filtrando a continuación. Se preparan paralelamente controles sin INT, en los que a 1 g de suelo se le añade 0,6 ml de agua. El extracto se lee en espectrofotómetro de absorción molecular a 490 nm. La absorbancia del instrumento es transformada en concentración mediante una recta patrón obtenida con INTF (iodonitrofenil formazan) en distintas concentraciones. La actividad de la muestra se calcula mediante la siguiente ecuación: ADH= (C x V) (Pm x G x T) 3. Materiales y métodos 47 donde: ADH = actividad deshidrogenasa (μmoles INTF formado g-1h-1). C = cantidad de INTF de la muestra, en μg ml-1. Pm= peso molecular del INTF (471,3 g mol-1). V = factor de dilución. G = gramos de suelo seco. T = factor de tiempo de incubación; en este caso 20 horas. 3.3.3.3. Actividad ureasa La actividad ureasa del suelo se determinó siguiendo el método descrito por Kandeler y Gerber (1988), basado en la determinación del amonio liberado en la incubación de una solución de suelo a 37 ºC durante 2 h. La determinación del amonio se realiza a través de la reacción de Berthelot. En este método, el amonio producido por la actividad ureasa reacciona con salicilato y dicloroisocianuro, generando un color verde azulado. La absorbancia a 690 nm es directamente proporcional a la concentración de nitrógeno amoniacal. Para ello, a 1 g de muestra de suelo se añaden 0,5 ml de urea 0,48 % y 4 ml de tampón borato pH 10. Paralelamente se prepara para cada muestra un control con 1 g de suelo y 4 ml de tampón borato pH 10. Además, se prepara un blanco conteniendo 0,5 ml urea 0,48 % y 4 ml de tampón borato pH 10. Muestra, control y blanco, se incuban en baño termostático con agitación a 37 ºC durante 2 horas. Terminado este período se añaden 0,5 ml de urea 0,48 % al control. A continuación, en ambos casos, se extrae el amonio liberado utilizando 6 ml KCl 7,4 %, agitando durante 30 minutos. Seguidamente, se centrifuga y filtra la suspensión de suelo, resultando un filtrado de extracto claro en el que se determina amonio por colorimetría como a continuación se detalla. Para determinar el amonio, a 0,5 ml de extracto se adicionan en el siguiente orden: 4,5 ml de agua destilada, 2,5 de salicilato de Na/NaOH y 1 ml de dicloroisocianuro de sodio, y la mezcla se deja reposar 30 min en oscuridad. La absorbancia se mide en 3. Materiales y métodos 48 espectrofotómetro de absorción molecular, después de haber ajustado el equipo a cero con el blanco, a una longitud de onda de 690 nm. La absorbancia medida se transforma en concentración mediante una recta patrón, obtenida con concentraciones conocidas de amonio. Las unidades propuestas para esta actividad enzimática son μmoles de N − NH4 +(g suelo seco × h)⁄ . La actividad de la muestra se calcula mediante la siguiente ecuación: AU=(S − B)x V (Pm x G x T) donde: AU = actividad ureasa (μmoles de N-NH4+ g-1 suelo seco h-1). S = cantidad de N-NH4+ en las muestras (μg de N-N H4+) obtenida de la curva patrón. B = cantidad de N-NH4+ (μg de N-N H4+) para los blancos. Pm= peso atómico del nitrógeno (14 g mol-1). V = volumen total del extracto de incubación. G = gramos de suelo seco. T = factor de tiempo de incubación (horas). 3.3.3.4. Actividad β-glucosidasa El método utilizado toma como referencia el descrito por Tabatabai (1982) y Eivazi y Tabatabai (1988), basado en la determinación colorimétrica del p-nitrofenol obtenido por la acción de la β-glucosidasa después de incubar el suelo con el substrato artificial p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (PNG) en medio tamponado a pH 6 y a temperatura de 37 ºC, y extracción del p-nitrofenol liberado por filtración después de la adición de CaCl2 y tampón THAM pH 12, que en medio básico desarrolla un color amarillo. Para ello, a 0,5 g de muestra de suelo se le añaden 0,5 ml de sustrato PNG (pnitrofenil-β-D-glucopiranósido) 0,025 M y 2 ml de tampón MUB-HCl de pH 6. 3. Materiales y métodos 49 Paralelamente se prepara para cada muestra un control con 0,5 g de suelo y 2 ml de tampón. Se prepara un blanco conteniendo 0,5 ml de sustrato y 2 ml de tampón. Muestra, control y blanco, se incuban en baño termostático con agitación a 37 ºC durante 1 hora. Terminado este período se añaden 0,5 ml de sustrato a los controles. A continuación, todos los tubos se enfrían a 4 ºC en baño con hielo durante 15 minutos, para frenar la reacción enzimática. Pasado este tiempo, se adicionan a todos los tubos, muestra, control y blanco, 0,5 ml de CaCl2 0,5 M y 2 ml de disolución THAMNaOH 0,1 M, pH 12. Se agita bien para que la suspensión se mezcle completamente. Seguidamente se centrifugan los tubos a 3000 rpm durante 10 min. Se diluye convenientemente el sobrenadante y se mide su absorbancia en el espectrofotómetro, después de haber ajustado el equipo a cero con el blanco, a una longitud de onda de 400 nm. El CaCl2 se añade para bloquear la reacción y para provocar la dispersión de coloides que podrían interferir en la lectura espectrofotométrica, y la disolución THAM-NaOH sirve para salificar el producto de reacción obtenido dándole color amarillo. La absorbancia medida se transforma en concentración mediante una recta patrón obtenida con concentraciones conocidas de PNF. Las unidades propuestas para expresar esta actividad enzimática son μmoles PNF g-1 h-1. La actividad β-glucosidasa se calcula usando la siguiente ecuación: AG=(C x V) (Pm x G x T) donde: AG = actividad β-glucosidasa μmol PNF g-1suelo seco h-1 C = concentración de PNF (μg) en el extracto, según la recta de calibración obtenida. V = factor de dilución. Pm= peso molecular del p-nitrofenol (139 g mol-1). G = gramos de suelo seco. T = factor relativo al tiempo de incubación, en horas. 3. Materiales y métodos 50 3.3.3.5. Actividad fosfatasa alcalina Esta actividad enzimática se determinó por el método descrito por Tabatabai y Bremer (1969), basado en la determinación espectrofotométrica del p-nitrofenol liberado cuando se incuba el suelo a 37 ºC con una disolución tamponada (pH 11,5 para la alcalina) del substrato artificial p-nitrofenil-fosfato (PNF). El método colorimétrico para medir el p-nitrofenol liberado se basa en el hecho de que las disoluciones alcalinas de este compuesto tienen color amarillo. Para ello, a 0,5 g de muestra de suelo se le añaden 0,5 ml de p-nitrofenil fosfato 0,025 M y 2 ml de tampón MUB pH 11,5. Paralelamente se prepara para cada muestra un control con 0,5 g de suelo y 2 ml de tampón MUB pH 11,5. Además, se prepara un blanco con 0,5 ml de sustrato y 2 ml de tampón MUB pH 11,5. Muestra, control y blanco, se incuban en baño termostático con agitación a 37 ºC durante 1 hora. Terminado este período se añaden 0,5 ml de sustrato a los controles. A continuación, todos los tubos se enfrían a 4 ºC durante 15 minutos, para frenar la reacción enzimática. Pasado este tiempo, se adicionan a todos los tubos, muestra, control y blanco, 0,5 ml de CaCl2 0,5 M y 2 ml de NaOH 0,5 M. Se agita bien para que la suspensión se mezcle completamente. Seguidamente se centrifugan los tubos a 3400 rpm durante 10 min. Se diluye convenientemente el sobrenadante y se mide su absorbancia, en el espectrofotómetro, después de haber ajustado el equipo a cero con el blanco, a una longitud de onda de 400 nm. La absorbancia se transforma en concentración mediante una recta patrón, obtenida con concentraciones conocidas de p-nitrofenol-fosfato. Las unidades propuestas para expresar esta actividad enzimática son μmoles p-nitrofenol liberado g-1 h-1. La actividad fosfatasa se calcula usando la siguiente expresión: AP=(C x V) (Pm x G x T) donde: AP = actividad fosfatasa (μmoles p-nitrofenol liberado g-1 h-1) C = cantidad p-nitrofenol de la muestra en μg. 3. Materiales y métodos 51 V = factor de dilución. Pm= peso molecular del p-nitrofenol (139 g mol-1). G = gramos de suelo seco. T = factor relativo al tiempo de incubación en horas. 3.3.3.6. Actividad o-difenol oxidasa Esta actividad enzimática se determinó por el método descrito por Perucci et al. (2000). El problema más importante en el estudio de la oxidación de los compuestos fenólicos en los suelos es la baja disponibilidad del sustrato oxidado, causado por la adsorción de los componentes de suelo en la interfase con la catálisis enzimática, dado que se dan reacciones inmediatamente después del contacto del catecol con el suelo. Las quinonas formadas por la oxidación de compuestos fenólicos son altamente reactivas y capaces de formar varios productos de condensación, especialmente en presencia de compuestos con grupos amino libres, este método se basa en la formación de dichos compuestos, a través de la desarrollo de la oxidación enzimática del catecol y posterior reacción con la prolina (Figura 9). HO HO R o-DPO + 1/2 O2 RO O Figura 9. Esquema de la reacción generalizada de la o-difenol oxidasa Para ello, en tubos de ensayo, a 1 g de suelo fresco se le añade 1,5 ml de una solución 0,2 M de catecol (previamente disuelta en tampón fosfato 0,1 M), 1,5 ml de una solución de 0,2 M de prolina (previamente disuelta en tampón fosfato 0,1 M), y 2 ml de tampón fosfato. Se hace un control igual pero sin la solución de catecol 0,2 M. Una vez que todas las muestras y controles se incuban durante 10 minutos a 30 °C en baño con agitación, se le añade la solución de catecol a los controles. La reacción se paraliza mediante enfriamiento en baño de hielo durante 10 minutos, centrifugando la muestra durante 10 minutos y en el sobrenadante y se mide su 4. Resultados 59 4.1. PRIMERA EXPERIENCIA DE INCUBACIÓN 4.1.1. Humedad del suelo La Figura 10 muestra la humedad del suelo para los tratamientos fertilizantes sometidos a sequía severa durante el periodo experimental. En los suelos no enmendados y sometidos a sequía severa, la humedad disminuyó significativamente (p<0,05) durante todo el período de incubación, de tal forma que al final del período experimental, la humedad del suelo disminuye un 76,9%. Al aplicar materia orgánica al suelo no regado, la humedad sufrió una disminución menos drástica. Sin embargo, se observaron diferencias significativas entre los tratamientos orgánicos. En este sentido, y al final del período de incubación, el mayor porcentaje de humedad se encontró en el suelo enmendado con SM, seguido por CM y MSW (30,1% y 47,4%), respectivamente. Figura 10. Evolución de la humedad (%) (media ± error estándar, n = 3) en suelos no regados durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05). 4.1.2. Propiedades químicas del suelo Como era de esperar, en los suelos regados la adición de enmiendas orgánicas aumentó el C soluble en agua (Tabla 8). Al final del período de incubación, este aumento en este parámetro químico fue significativamente mayor en el suelo enmendado con SM que en los suelos enmendados con CM (55,7%) y MSW (78,7%). 0 20 40 60 80 100 30 100 200 365 Humedad (%) Días de incubación SD SD+MSW SD+CM SD+SM aab c b b b c b c d cc dd de e 4. Resultados 60 Tabla 8. Evolución del Carbono soluble en agua (µg C g-1) (media ± error estándar, n=3) en suelos regados y no regados durante el periodo experimental. Los números en la fila seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (p>0,05) Días de incubación 30 100 200 365 S 477a ± 7 461a ± 13 471a ± 16 465a ± 11 S+MSW 563a ± 23 538a ± 12 581ab ± 19 596b ± 15 S+CM 1282c ± 73 1153c ± 62 1048c ± 58 1243c ± 80 S+SM 2714d ± 82 2636d ± 118 2700d ± 143 2804d ± 82 SD 471a ± 18 493a ± 16 550a ± 24 636b ± 52 SD+MSW 532a ± 20 649b ± 64 734b ± 54 803b ± 83 SD+CM 1304c ± 73 1432c ± 83 1550c ± 64 1711c ± 101 SD+SM 2666d ± 58 3235d ± 117 3732de± 73 4094e ± 122 En los suelos no regados, y a diferencia de los suelos regados, la concentración del C soluble en agua aumentó durante todo el periodo experimental. Lógicamente, este parámetro químico fue mayor en los suelos enmendados orgánicamente que con respecto al tratamiento SD. Comparado con el tratamiento SD y al final del período de incubación, el C soluble en agua fue un 84,5% mayor en el tratamiento SD + SM, 62,8% en el tratamiento SD + CM y 84,5% en el tratamiento SD + MSW. La Tabla 9 muestra la evolución de la distribución del peso molecular de la proteína (kDa) para los días 30 y 365 del periodo experimental. En los suelos regados, la adición al suelo de las distintas enmiendas orgánicas, modificó la distribución del peso molecular de las proteínas, aumentando las proteínas con mayor peso molecular en los suelos enmendados con MSW, seguido por CM y SM. Al final del período experimental, el porcentaje de proteínas de mayor peso molecular disminuyó, aumentando el porcentaje de proteínas de menor peso molecular. En los suelos no regados y al final del experimento, el porcentaje de proteínas de alto peso molecular también disminuyó, pero esta disminución fue menor que en los suelos regados. 4. Resultados 61 Asimismo, el porcentaje de proteínas de bajo peso molecular también aumentó, pero nuevamente, este aumento fue menor que en los suelos regados. Tabla 9. Evolución de la distribución del peso molecular de la proteína (kDa) (media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados durante el periodo experimental. Los números en la fila seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (p>0,05) Peso molecular (kDa) > 50 50-30 30-10 < 10 S30 0a ± 0 0a ± 0 38,3f ± 1,7 61,7g ± 1,3 S+MSW30 2,6c ± 0,5 24,4e ± 1,5 31,9f ± 2,3 41,1f ± 1,6 S+CM30 1,1b ± 0,2 16,6e ± 2,1 34,7f ± 2,8 47,6f ± 2,6 S+SM30 0,7ab ± 0,2 9,4d ± 1,0 37,2f ± 1,3 52,7f ± 3,0 S365 0a ± 0 0a ± 0 41,2f ± 2,0 58,8g ± 2,1 S+MSW365 1,9b ± 0,2 18,0e ± 1,9 34,1f ± 2,4 46,0f ± 2,9 S+CM365 0,8ab ± 0,1 10,1d ± 1,4 37,5f ± 2,6 51,6f ± 3,0 S+SM365 0,2a ± 0,1 6,3d ± 0,9 39,0f ± 3,3 54,5f ± 2,4 SD30 0a ± 0 0a ± 0 37,9f ± 1,3 62,1g ± 2,1 SD+MSW30 2,7c ± 0,6 24,4e ± 1,6 32,6f ± 2,1 40,3f ± 1,8 SD+CM30 1,2b ± 0,3 16,3e ± 1,1 34,3f ± 3,5 48,0f ± 2,2 SD+SM30 0,7ab ± 0,1 9,5d ± 0,8 38,0f ± 1,4 51,8f ± 1,7 SD365 0a ± 0 0a ± 0 39,0f ± 3,1 61,0g ± 3,3 SD+MSW365 2,3c ± 0,5 21,9e ± 2,4 33,0f ± 2,6 42,8f ± 2,2 SD+CM365 1,0b ± 0,2 15,0de ± 1,1 35,2f ± 1,5 48,8f ± 1,6 SD+SM365 0,4a ± 0,1 8,9d ± 0,8 38,4f ± 1,1 52,3f ± 1,6 La Tabla 10 muestra la evolución del Carbono de ácidos fúlvicos y húmicos para todos los tratamientos realizados, en ambas condiciones de humedad y para los 365 días de incubación. En ambos estadios de humedad, la aplicación de materia orgánica al suelo aumentó la concentración del Carbono de ácidos húmicos y fúlvicos. En los suelos regados, la evolución del Carbono de ácidos fúlvicos fue muy similar a la del 4. Resultados 62 Carbono soluble en agua, presentando los mayores valores al final del periodo experimental en el suelo enmendado con SM, seguido de CM y MSW. Respecto a la evolución del Carbono de ácidos húmicos, los resultados destacan que no hubo diferencias significativas en cuanto a la evolución de dicho parámetro en suelos regados y en suelos no regados (Tabla 10). Tabla 10. Evolución del Carbono de ácidos fúlvicos y ácidos húmicos (media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados durante el periodo experimental. Los números en la fila seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (p>0,05) Días de incubación 30 100 200 365 C ácidos fúlvicos (mg C kg-1) S 2,9a ± 0,2 2,9a ± 0,4 3,0a ± 0,4 2,9a ± 0,4 S+MSW 4,1b ± 0,5 4,2b ± 0,7 4,1b ± 0,8 4,3b ± 0,8 S+CM 4,5b ± 0,6 4,4b ± 0,6 4,5b ± 0,7 4,5b ± 0,6 S+SM 9,4c ± 0,2 9,3c ± 0,9 9,5c ± 1,0 10,4c ± 1,1 SD 2,9a ± 0,4 3,1a ± 0,4 2,9a ± 0,3 3,1a ± 0,5 SD+MSW 4,1b ± 0,6 4,0b ± 0,6 4,1b ± 0,5 4,1b ± 0,5 SD+CM 4,5b ± 0,6 4,6b ± 0,7 4,6b ± 0,5 4,5b ± 0,4 SD+SM 9,3c ± 0,8 9,2c ± 0,9 9,3c ± 1,1 9,4c ± 1,3 C ácidos húmicos (mg C kg-1) S 3,2a ± 0,6 3,2a ± 0,4 3,2a ± 0,4 3,2a ± 0,5 S+MSW 4,6b ± 0,4 4,6b ± 0,3 4,6b ± 0,3 4,6b ± 0,3 S+CM 6,9c ± 0,5 6,9c ± 0,6 6,9c ± 0,4 6,9c ± 0,5 S+SM 9,4d ± 0,4 9,4d ± 0,4 9,4d ± 0,4 9,3d ± 0,4 SD 3,2a ± 0,5 3,2a ± 0,4 3,2a ± 0,3 3,2a ± 0,4 SD+MSW 4,6b ± 0,5 4,6b ± 0,4 4,6b ± 0,5 4,6b ± 0,5 SD+CM 6,9c ± 0,6 6,9c ± 0,5 6,9c ± 0,4 6,9c ± 0,5 SD+SM 9,3d ± 0,5 9,4d ± 0,5 9,3d ± 0,4 9,4d ± 0,4 4. Resultados 63 En los suelos no regados, y comparado con el tratamiento S, el contenido del Carbono de ácidos fúlvicos al final del periodo experimental fue un 17,5% mayaren el tratamiento SD (Tabla 10). Respecto a los suelos enmendados orgánicamente, solo el tratamiento SD+SM fue significativamente (p<0,05) mayor con respecto al tratamiento S+SM. Los espectros obtenidos en el análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) de 13C de estado sólido para los días 30 y 365, se muestran en la Tabla 11. En suelos regados y para todos los tratamientos, la región de desplazamiento químico correspondiente a CO-alquilo es la dominante, tanto en el día 30 como en el día 365, representando aproximadamente el 35-40% de la intensidad total de la señal. Las resonancias en las regiones aromáticas C (110-165 ppm) y alquilo C (0-45 ppm), contribuyen 10-16% y 26-30% de la intensidad total, respectivamente. Además, se observó una disminución en el contenido del CO-alquilo y un aumento en C alquilo, C aromático y C carboxílico durante todo el período experimental, independientemente del tipo de residuo orgánico aplicado al suelo. Comparado con el suelo sin enmendar, la relación C alquilo/C O-alquilo (A/O-A) aumentó al final del periodo experimental en los suelos enmendados orgánicamente. En los suelos no regados, los espectros de revelaron que la región C O-alquilo s la dominante (35-44%) al principio y al final del período experimental, seguido por el C alquilo (24-30 %) y el C aromático (10-16%). En los suelos no regados y al final del período experimental, el C O-alquilo C aumentó, mientras que la relación C alquilo/C O-alquilo (A/O-A) disminuyó a través del experimento. 4. Resultados 64 4. Resultados 65 4.1.3. Propiedades bioquímicas del suelo La Figura 11 muestra la evolución del C de la biomasa microbiana del suelo para todos los tratamientos fertilizantes durante el periodo experimental. En los suelos regados, la aplicación de materia orgánica al suelo aumentó significativamente (p<0,05) el C de la biomasa microbiana. Este aumento dependió de la composición química del residuo orgánico aplicado. En este sentido, y al final del período experimental, el C de la biomasa microbiana fue mayor en el suelo enmendado con SM que en los suelos enmendados con CM y MSW (9,9% y 23,1%, respectivamente). En los suelos no regados, el C de la biomasa microbiana disminuyó significativamente (p<0,05) durante el periodo experimental. Este descenso fue mayor en el suelo no enmendado que en el suelo enmendado con las distintas formas orgánicas experimentales. Del mismo modo, la distinta composición química de los residuos orgánicos empleados influyó en este descenso del C de la biomasa microbiana. Así, coincidiendo con los datos de humedad encontrados, el C de la biomasa microbiana fue mayor en el tratamiento SD+SM, seguido de los tratamientos SD+CM y SD+MSW. Figura 11. Evolución del C de la biomasa microbiana (media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05). La Figura 12 muestra la evolución de la actividad deshidrogenasa para todos los tratamientos fertilizantes durante el periodo experimental. En suelos regados, y al igual 0 100 200 300 400 500 S S+MSW S+CM S+SM SD SD+MSW SD+CM SD+SM C de la biomasa microbiana (µg C g-1 suelo seco) Días de incubación 30 100 200 365 bbbb b c c c c c cd b c c d bc bab aaab bbb bb bb bbbb 4. Resultados 66 que para el C de la biomasa microbiana, la actividad deshidrogenasa aumentó progresivamente durante todo el periodo de incubación. Sin embargo, este aumento también dependió del tipo de materia orgánica aplicada al suelo. Comparado con el tratamiento S, y al final del periodo de incubación, la actividad deshidrogenasa aumentó un 93,4% en el tratamiento S+SM, un 91,3% en el tratamiento S+CM y un 88% en el tratamiento S+MSW. A diferencia de los suelos regados, en los suelos no regados la actividad deshidrogenasa disminuyó de forma progresiva durante todo el periodo de incubación. Este descenso fue mayor en el suelo no enmendado que con respecto a los suelos enmendados orgánicamente. También se encontraron diferencias significativas entre los distintos tratamientos orgánicos empleados. De esta forma, comparado con el tratamiento SD y al final del periodo de incubación, la actividad deshidrogenasa aumentó un 71,3% en el tratamiento S+SM, un 60,9% en el tratamiento S+CM y un 38,6% en el tratamiento S+MSW. Figura 12. Evolución de la actividad deshidrogenasa (media ± error estándar, n = 3) en no regados durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05).INTF: 2-p-iodo-3-nitrophenyl formazan 0 5 10 15 20 25 30 35 S S+MSW S+CM S+SM SD SD+MSW SD+CM SD+SM Actividad deshidrogenasa (µg INTF g-1 h-1) Días de incubación 30 100 200 365 bbbbbaa a bbbab bb b ccc c c c cccd dd ee e e f f 4. Resultados 67 La evolución de la actividad ureasa fue muy similar a la de la actividad deshidrogenasa (Figura 13). Figura 13. Evolución de la actividad ureasa (media ± error estándar, n = 3) en no regados durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05). En los suelos húmedos, la actividad ureasa significativamente (p<0,05) aumentó en los suelos enmendados con materia orgánica. De nuevo, esta actividad enzimática fue diferente dependiendo del tipo de residuo orgánico aplicado al suelo. En este sentido, comparado con el tratamiento S y al final del periodo de incubación, la actividad ureasa aumentó un 91,7% en el tratamiento S+SM, un 87,7% en el tratamiento S+CM y un 83,3% en el tratamiento S+MSW. Comparado con los suelos regados, en los suelos no regados la actividad ureasa disminuyó. Sin embargo, este descenso fue menor en los suelos enmendados orgánicamente que en los suelos no enmendados. Al igual que en la actividad deshidrogenasa, en la actividad ureasa también se encontraron diferencias significativas entre los distintos tratamientos orgánicos empleados. De esta forma, comparado con el tratamiento SD y al final del periodo de incubación, la actividad deshidrogenasa aumentó un 60,6% en el tratamiento SD+SM, un 51,5% en el tratamiento SD+CM y un 37% en el tratamiento SD+MSW. 0 5 10 15 20 25 S S+MSW S+CM S+SM SD SD+MSW SD+CM SD+SM Actividad ureasa (µg NH4+g-1 h-1) Días de incubación 30 100 200 365 bbbab bb cbbb c ccd ccc ccd cd ab aaa ddd ee e e e f 4. Resultados 74 A partir del día 26 desde el inicio de la incubación, la inhibición de la enzima disminuyó progresivamente hasta el final del período experimental. Al final de dicho período de incubación, y comparando el control con el tratamiento, la actividad deshidrogenasa disminuyó significativamente (p <0,05) en un 21,7% y 47,8% sólo para los tratamientos S+O1 y S+O3, respectivamente. Aunque los valores obtenidos para el tratamiento S+O2 fueron también un 13% inferiores a los obtenidos para el tratamiento S, el análisis estadístico indicó que no se observaron diferencias significativas entre ambos tratamientos. Con respecto a los resultados obtenidos con el insecticida clorpirifos, la actividad deshidrogenasa también mostró una disminución significativa (p<0,05). Una vez más, esta disminución fue mayor cuando se aplicó la mayor dosis de insecticida al suelo (10 l ha-1). Esta disminución fue máxima a los 12 días después de aplicar el insecticida al suelo (40%, 56% y 78% para los tratamientos S+CL2, S+CL1 y S+CL3, respectivamente, en comparación con el tratamiento de control). A partir de esta fecha, esta disminución disminuyó hasta el final el período experimental, observándose una disminución significativa (p <0,05) de la actividad de la deshidrogenasa hasta el día 79 después de la aplicación del clorpirifos en el suelo. Al final del período experimental, la actividad de la deshidrogenasa en los tratamientos S+CL2, S+CL1 y S+CL3 fue similar al tratamiento con S. A diferencia de los suelos regados periódicamente, cuando se aplicó el herbicida oxifluorfen los suelos no regados, la actividad deshidrogenasa presentó menores valores al final de los 120 días de incubación. En este sentido, al final del período experimental y en comparación con los tratamientos S+O1, S+O2 y S+O3, la actividad deshidrogenasa disminuyó en un 54,3%, 42,1% y 69,2% para los tratamientos SD+O1, SD+O2 y SD+O3, respectivamente. Del mismo modo, tras la aplicación de clorpirifos en los suelos no regados se observó un descenso de la actividad deshidrogenasa durante el periodo experimental. De nuevo, este descenso fue mayor en los suelos con una mayor dosis de clorpirifos. Al igual que en el caso del suelo con oxifluorfen, los valores de la actividad deshidrogenasa fueron menores en suelos no regados que en suelos regados. Al igual que ocurre con la actividad deshidrogenasa, cuando se aplicó el herbicida oxifluorfen en los suelos regados, la actividad ureasa disminuyó significativamente (p<0,05) y de forma progresiva durante el periodo de incubación 4. Resultados 75 (Tabla 13). De nuevo, este descenso en esta actividad enzimática fue máximo a los 26 días de iniciado el proceso de incubación. Al final del periodo experimental, y comparando con el tratamiento control, la actividad ureasa significativamente (p<0,05) disminuyó un 47,1%, 55,4% y 75,3% en los tratamientos S+O2, S+O1 y S+O3, respectivamente. Cuando se aplicó clorpirifos al suelo regado periódicamente, también se produjo una inhibición significativa (p<0,05) de dicha actividad ureasa, siendo máxima esta inhibición a los 26 días de iniciado el experimento. Al final de los 120 días experimentales, la actividad ureasa presentó unos valores muy similares en todos los tratamientos (S, S+CL1, S+CL2 y S+CL3, respectivamente). La aplicación del herbicida en el suelo no regado también produjo una fuerte inhibición en la actividad ureasa (Tabla 13). Al final del periodo experimental y comparado con el tratamiento SD, la actividad ureasa significativamente (p<0,05) disminuyó un 25,6% para el tratamiento SD+O2, seguido de un 36,7% y 53,3% para los tratamientos SD+Ò1 y SD+O2, respectivamente. De la misma forma, cuando el insecticida clorpirifos se aplicó al suelo, se observó un descenso significativo (p<0,05) en la actividad ureasa del suelo no regado periódicamente. En este sentido, al final del periodo experimental y comparado con el tratamiento SD, la actividad ureasa disminuyó un 27,8% en el tratamiento SD+O2, seguido de un 37,8% y 45,6% para los tratamientos SD+Ò1 y SD+O2, respectivamente. Las Tablas 14 y 15 muestran la evolución de las actividades β-glucosidasa y fosfatasa para todos los tratamientos durante los 120 días de incubación. En los suelos regados, la respuesta de estas actividades enzimáticas fue muy similar a la descrita anteriormente cuando se aplicó oxifluorfen y clorpirifos al suelo. En este sentido, se observa una inhibición de las actividades β-glucosidasa y fosfatasa durante todo el periodo experimental cuando se aplicó el herbicida al suelo, mientras que cuando se aplicó clorpirifos al suelo, estas actividades enzimáticas mostraron un máximo de inhibición a los 12 días de iniciado el experimento. Por último, cuando el suelo fue sometido a sequía severa durante los 120 días de incubación, las actividades β-glucosidasa y fosfatasa mostraron una evolución muy similar al comportamiento obtenido con las actividades deshidrogenasa y ureasa en suelos con los plaguicidas experimentales. 4. Resultados 76 4. Resultados 77 4. Resultados 78 4. Resultados 79 4.2.3. Biodiversidad microbiana del suelo Las Tablas 16 y 17 muestran la evolución de la comunidad microbiana (bacterias y hongos) durante los 120 días de incubación en presencia de oxifluorfen y clorpirifos, respectivamente. Cuando el herbicida se aplicó al suelo regado periódicamente, la población total de bacterias y hongos significativamente (p<0,05) disminuyó (Tabla 16). En este sentido y comparado con el tratamiento S, la población total de bacterias disminuyó un 10,9%, 20% y 36,5% para los tratamientos S+O2, S+O1 y S+O3, mientras que la población total de hongos significativamente (p<0,05) disminuyó un 11,6%, 18% y 20,4% para los tratamientos S+O2, S+O1 y S+O3, respectivamente. Cuando clorpirifos se aplicó al suelo regado periódicamente durante los 120 días de incubación, la población total de bacterias y hongos disminuyó significativamente (p<0,05) a los 10 días de iniciado el experimento (Tabla 17). Así, a los 10 días del periodo de incubación, y comparado con el tratamiento control, en el suelo con el insecticida, la población de bacterias Gram+ disminuyó un 25,6%, 30,6% y 25,6% en los tratamientos S+CL2, S+CL1 y S+CL3, la población de bacterias Gramdisminuyó un 11,1%, 35,9% y 43% en los tratamientos S+CL2, S+CL1 y S+CL3, y la población total de hongos disminuyó un 21,5%, 27,4% y 34,7% en los tratamientos S+CL2, S+CL1 y S+CL3, respectivamente. Al final del periodo de incubación, la población total de hongos y bacterias en los suelos con el insecticida fue igual a la existente con el suelo sin dicho insecticida. Cuando el herbicida oxifluorfen y el insecticida clorpirifos se aplicaron en los suelos no regados periódicamente, la evolución de la población microbiana fue diferente a cuando el suelo fue regado. En este sentido, esta población microbiana fue similar al comportamiento bioquímico del suelo, destacando un mayor descenso de población en condiciones de sequía. En el caso del insecticida, este efecto negativo permaneció hasta el final del periodo de incubación. 4. Resultados 80 Tabla 17. Evolución de bacterias Gram+, Gram-, bacterias totales PLFAs y hongos PLFAs (ng g-1) (media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados con oxifluorfen durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05). bacGram+ bacGramBacterias totales PLFAs Hongos PLFAs S (10 días) 621c ± 34 398b ± 17 1019d ± 53 35,0b ± 3,1 S (50 días) 603c ± 36 411b ± 15 1014d ± 52 34,6b ± 2,7 S (120 días) 611c ± 28 406b ± 26 1017d ± 52 32,8b ± 3,3 S+O1 (10 días) 448b ± 22 276a ± 22 724b ± 43 27,7a ± 2,9 S+O2 (10 días) 503b ± 27 344b ± 28 847c ± 53 29,3a ± 1,8 S+O3 (10 días) 404b ± 30 231a ± 31 635b ± 63 24,8a ± 1,1 S+O1 (50 días) 421b ± 19 259a ± 12 680b ± 30 28,2a ± 2,7 S+O2 (50 días) 499b ± 25 336b ± 15 835c ± 41 27,1a ± 2,0 S+O3 (50 días) 390a ± 21 236a ± 21 626b ± 40 24,2a ± 3,5 S+O1 (120 días) 436b ± 16 273a ± 25 709b ± 43 28,7a ± 1,6 S+O2 (120 días) 546bc ± 37 362b ± 18 908cd ± 51 30,6ab ± 3,3 S+O3 (120 días) 411b ± 30 235a ± 26 646b ± 49 26,1a ± 2,8 SD (10 días) 609c ± 28 387b ± 23 996d ± 52 32,1b ± 3,4 SD (50 días) 580b ± 31 301b ± 24 901cd ± 54 28,3a ± 2,1 SD (120 días) 503b ± 22 277a ± 27 780b ± 50 26,6a ± 2,8 SD+O1 (10 días) 431b ± 17 254a ± 21 685b ± 36 25,3a ± 3,3 SD+O2 (10 días) 495b ± 24 316b ± 35 811c ± 57 26,9a ± 1,6 SD+O3 (10 días) 379a ± 27 201a ± 22 580a ± 47 23,1a ± 2,3 SD+O1 (50 días) 366a ± 14 224a ± 18 590a ± 34 24,4a ± 1,1 SD+O2 (50 días) 422b ± 26 297b ± 24 719b ± 49 25,5a ± 2,5 SD+O3 (50 días) 305a ± 19 189a ± 13 494a ± 31 22,0a ± 1,9 SD+O1 (120 días) 374a ± 20 231a ± 17 605b ± 38 23,7a± 1,6 SD+O2 (120 días) 436b ± 27 293b ± 15 729b ± 44 26,2a ± 2,0 SD+O3 (120 días) 297a ± 15 178a ± 14 475a ± 31 22,7a ± 2,2 4. Resultados 81 Tabla 18. Evolución de bacterias Gram+, Gram-, bacterias totales PLFAs y hongos PLFAs (ng g-1) (media ± error estándar, n = 3) en suelos regados y no regados con clorpirifos durante el periodo experimental. Columnas con la misma letra(s) no presentan diferencias significativas (p>0,05). bacGram+ bacGramBacterias totales PLFAs Hongos PLFAs S (10 días) 621c ± 34 398b ± 17 1019c ± 53 35,4b ± 3,1 S (50 días) 603c ± 36 411b ± 15 1014c ± 52 33,6b ± 2,7 S (120 días) 611c ± 28 406b ± 26 1017c ± 52 32,8b ± 3,3 S+O1 (10 días) 394b ± 17 255a ± 22 649b ± 41 25,7a ± 2,0 S+O2 (10 días) 462b ± 29 354 ± 26 816b ± 53 26,8a ± 2,7 S+O3 (10 días) 275a ± 14 227a ± 19 502a ± 31 23,1a ± 1,6 S+O1 (50 días) 431b ± 20 288a ± 11 719b ± 32 25,8a ± 2,4 S+O2 (50 días) 483b ± 31 385 ± 22 868c ± 51 28,4a ±2,2 S+O3 (50 días) 376b ± 25 225a ± 18 601b ± 54 25,1a ± 1,9 S+O1 (120 días) 616c ± 37 420b ± 25 1036c ± 60 34,6b ± 2,7 S+O2 (120 días) 624c ± 30 417b ± 16 1041c ± 45 35,2b ± 3,5 S+O3 (120 días) 609c ± 28 398b ± 21 1007c ± 47 34,8b ± 3,0 SD (10 días) 609c ± 28 387b ± 23 996c ± 52 32,1b ± 3,4 SD (50 días) 580b ± 31 301ab ± 24 901c ± 54 28,3a ± 2,1 SD (120 días) 503b ± 22 277a ± 27 780b ± 50 26,6a ± 2,8 SD+O1 (10 días) 386b ± 20 261a ± 25 647b ± 47 27,0a ± 2,2 SD+O2 (10 días) 471b ± 33 346 ± 19 817b ± 50 26,6a ± 2,5 SD+O3 (10 días) 226a ± 19 138a ± 22 364a ± 43 24,6a ± 2,0 SD+O1 (50 días) 318b ± 17 220a ± 22 538b ± 41 24,8a ± 1,7 SD+O2 (50 días) 386b ± 28 258a ± 23 644b ± 50 27,1a ± 2,0 SD+O3 (50 días) 189a ± 16 112a ± 14 301a ± 31 21,2a ± 1,5 SD+O1 (120 días) 274a ± 21 284a ± 26 558b ± 48 28,3a ± 2,1 SD+O2 (120 días) 325b ± 26 348b ± 22 673b ± 49 31,0b ± 2,2 SD+O3 (120 días) 246a± 18 201a ± 27 447a ± 44 22,6a ± 1,8 4. Resultados 82 4.2.4. Evolución de los plaguicidas en suelo La Tabla 18 muestra la evolución de los dos plaguicidas experimentales durante el periodo de incubación para los suelos regados y no regados de forma periódica. En los suelos regados, los resultados revelan una disminución progresiva de ambos plaguicidas a lo largo del tiempo. La degradación de dichos plaguicidas es más rápida en el caso de clorpirifos que en el caso de oxifluorfen. Del mismo modo, la dosis también juega un papel importante, destacando que dicha degradación fue mayor cuando la dosis de plaguicida utilizado fue menor. Cuando los plaguicidas se aplicaron en condiciones de sequía severa, la degradación de los mismos fue mucho más lenta, lo cual hace pensar que en estas condiciones de humedad, la persistencia en el suelo de estos compuestos químicos aumenta. De nuevo, la dosis de plaguicida aplicado también influyó en su degradación en tales condiciones de sequía severa. 4. Resultados 83 5. Discusión 90 puede representar un importante estrés para los microorganismos del suelo, ya que el agua es un recurso esencial y necesario que afecta la supervivencia y el estado fisiológico de los microorganismos (Van Meeteren et al., 2008). Según Lamersdorf et al. (1998), una sequía severa representa una situación crítica para los microorganismos del suelo y puede causar un "downshock" que puede afectar el estado osmótico de las células microbianas y que podría conducir a la muerte celular. Además, Schimel et al. (2007) encontraron que la disponibilidad de agua puede afectar la disponibilidad de sustratos, la difusión de gases, el pH y la temperatura del suelo y, por tanto, podría ser responsable de los bajos valores encontrados en las actividades enzimáticas del suelo y la disminución de la población bacteriana y fúngica del suelo. Respecto a la comunidad microbiana, es destacable que, a corto plazo (30 días), la sequía sólo afectó a las poblaciones de bacterias Gramy hongos, sin afectar a la población de bacterias Gram +. Sólo al final del experimento (365 días) la población de bacterias Gram+ también disminuyó en comparación con la obtenida para los suelos regados. Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos por Bérard et al. (2011), quien observó que, después de 21 días de sequía, la población de bacterias Gram+ no había cambiado con respecto al suelo que no había sido sometido a sequía, posiblemente porque tienen paredes celulares más rígidas, haciéndolas más resistentes a los procesos de secado (Uhlirova et al., 2005). Como consecuencia de la disminución en la actividad bioquímica de los microorganismos del suelo, la degradación de las proteínas también disminuyó, aunque no afectó a la degradación de los ácidos húmicos y fúlvicos del suelo. Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos por Van Meeteren et al. (2008) y Muhr et al. (2010), los cuales encontraron una disminución de la mineralización de la materia orgánica del suelo bajo condiciones de sequía. No obstante, la disminución en las propiedades bioquímicas del suelo originó un aumento progresivo en el contenido de carbohidratos solubles en agua. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Kohler et al. (2009) y Hueso et al. (2011), quienes observaron un aumento en el contenido de carbohidratos solubles del suelo bajo condiciones de sequía, que podría ser como consecuencia de un aumento en la producción de carbohidratos por microorganismos como mecanismo de defensa contra el bajo potencial de agua externa, debido a que estos compuestos son hidrofílicos y pueden mantener un mayor contenido de agua en su microambiente. 5. Discusión 91 Los espectros de RMN obtenidos en condiciones de sequía mostraron cambios para todas las regiones analizadas, al final del período de incubación y para cada tratamiento de fertilizante. A este respecto y al final del período experimental, el Oalquilo aumentó y el C alquilo disminuyó, coincidiendo con el aumento de la concentración de carbohidratos solubles en agua. Asimismo, la relación A/O-A disminuyó al final del experimento, destacando la menor degradación del material orgánico aplicado al suelo. La aplicación de materia orgánica al suelo, hizo que la humedad descendiera menos bruscamente y fuese un descenso más lento y progresivo a lo largo del tiempo. Además, la composición química de la materia orgánica influyó notablemente en el contenido de agua durante el período experimental. En este sentido, varios autores han demostrado el papel crucial de la materia orgánica junto con la textura, en la sorción del agua y, por consiguiente, en el contenido de humedad del suelo (Rawls et al., 2003; Yang et al., 2014). Sin embargo, los resultados obtenidos también sugieren, que la composición química de la materia orgánica aplicada al suelo influye fuertemente en la humedad del suelo. Los estudios de sorción de xenobióticos orgánicos e inorgánicos en suelos enmendados con diferentes fuentes de materia orgánica sugieren que la sorción es mayor cuando el contenido de ácidos húmicos es mayor, posiblemente debido al mayor número de grupos carboxílicos y fenólicos (Tejada y Masciandaro, 2011; Tejada et al., 2008b, 2010b). La Tabla 4 indica un mayor número de grupos carboxílico y fenólico en el estiércol de oveja, seguido del estiércol de vaca y residuo sólido urbano. Quizás esta es la razón por la cual el aumento de retención de agua en los suelos enmendados fue mayor en el tratamiento SM, seguido por CM y MSW, respectivamente. Como resultado de este mayor contenido de agua en los suelos enmendados orgánicamente, las actividades enzimáticas fueron mayores en comparación con los suelos no enmendados, mientras que la población de bacterias y hongos sufrió menores descensos. A pesar de la desaceleración en la mineralización de la materia orgánica, el contenido de carbohidratos solubles en agua fue mayor en el suelo enmendado con SM que en el suelo seguido del suelo enmendado con CM y MSW. Esto puede deberse a dos causas: en primer lugar, la mayor retención de agua se produjo en el suelo enmendado con el estiércol de oveja; y por otro lado, el suelo enmendado con este residuo orgánico mostraba un mayor valor en el carbono de la biomasa microbiana y, por lo tanto, un mayor número de microorganismos para degradar los compuestos orgánicos más lábiles. 5. Discusión 92 Además, hay un aumento en la producción de carbohidratos por los microorganismos como un mecanismo de defensa, como se discutió anteriormente. 5.2. SEGUNDA EXPERIENCIA DE INCUBACIÓN 5.2.1. Suelos regados Los resultados obtenidos para los suelos regados periódicamente durante el periodo experimental sugieren que el herbicida oxifluorfen y el insecticida clorpirifos causaron un efecto tóxico sobre las propiedades bioquímicas del suelo así como en la biodiversidad microbiana de dichos suelos. Estos resultados coinciden con los obtenidos por Sheeba Singh et al. (2011), Kadian et al. (2012), Rodríguez-Morgado et al. (2014), Gómez et al. (2014), y Tejada et al. (2011, 2014, 2016), los cuales encontraron una importante inhibición tanto en las actividades enzimáticas del suelo como en su biodiversidad cuando se aplicó oxifluorfen y clorpirifos debido al efecto contaminante de ambos plaguicidas. De acuerdo con Tejada et al., (2015), el efecto inhibitorio de estos plaguicidas sobre las actividades enzimáticas del suelo es probablemente debido a la supresión de las poblaciones microbianas involucradas en los ciclos N, P y S; y/o al hecho de que pueden obstaculizar, modificar o alterar la interacción de los sitios sustrato orgánico y enzima. Este efecto tóxico afecta directamente a la inhibición de la mayoría de las poblaciones microbianas del suelo, quedando activos algunos grupos microbianos (bacterias y hongos) restantes capaces de adaptarse y crecer en presencia de ambos plaguicidas. Estos microorganismos tolerantes a la toxicidad de estos plaguicidas son los encargados de ir degradándolos poco a poco, lo cual conlleva incrementos tanto en la población microbiana como en las actividades enzimáticas de los suelos. Dichos microorganismos pueden utilizar los plaguicidas como fuente de carbono y energía para su crecimiento y desarrollo, transformando y degradando estos compuestos orgánicos en compuestos menos tóxicos. Estos resultados también están de acuerdo con los obtenidos por Goswami et al. (2013), los cuales estudiaron el comportamiento de la biomasa microbiana del suelo después de la adición del insecticida cipermetrina. Según estos investigadores, este aumento podría deberse al hecho de que los plaguicidas o sus productos de descomposición y las células microbianas posteriormente matadas por el plaguicida, pueden ser utilizados como fuente de energía o fuente de carbono para la 5. Discusión 93 proliferación celular de los microorganismos supervivientes. La población microbiana y las actividades enzimáticas del suelo aumentaron rápidamente, alcanzando valores superiores a los de suelo no contaminado. De acuerdo a los resultados obtenido por Rodríguez-Morgado et al. (2014), Gómez et al. (2014) y Tejada et al. (2011, 2014, 2016), los resultados obtenidos en este estudio muestran una alta persistencia en el suelo tanto del oxifluorfen como de clorpirifos. Sin embargo, esta persistencia dependió de la dosis de los plaguicidas aplicados. 5.2.2. Suelos no regados En los suelos no regados periódicamente durante el periodo de incubación, las distintas actividades enzimáticas y biodiversidad microbiana estudiadas fueron menores que en el caso de suelo regado durante el periodo experimental. Estos resultados coinciden con los obtenidos por otros autores, como Hueso et al. (2011, 2012b) y AcostaMartínez et al. (2014), quienes encontraron un descenso en las propiedades biológicas del suelo bajo condiciones de sequía severa, lo cual pone de manifiesto que la humedad del suelo influyó notablemente tanto en su actividad bioquímica como en la comunidad microbiana. En los suelos mediterráneos, el agua es un recurso crítico y esencial para el desarrollo, crecimiento y supervivencia de los microorganismos del suelo (Hueso et al., 2011, 2012a, b). Por otro lado, se ha observado también que la disponibilidad de agua puede afectar la disponibilidad de sustratos, la difusión de gases, el pH del suelo y la temperatura (Schimel et al., 2007). Todas estas causas pueden ser responsables de los bajos valores encontrados tanto en las actividades enzimáticas del suelo como en la población microbiana de dicho suelo. El comportamiento de los herbicidas en el suelo sometido a sequía severa fue diferente del suelo regado periódicamente. En el suelo sometido a sequía, los herbicidas mostraron un mayor efecto tóxico sobre las distintas actividades enzimáticas y biodiversidad microbiana estudiadas, principalmente cuando la dosis de plaguicida utilizada fue el doble de la dosis recomendada. Posiblemente, este mayor efecto de los plaguicidas en condiciones de sequía severa pueda ser consecuencia del efecto combinado de tres causas: 5. Discusión 94 1) Efecto tóxico de los plaguicidas en los microorganismos del suelo, anteriormente descrito, y por lo tanto al principio del experimento sólo los microorganismos tolerantes pueden crecer en presencia de estos compuestos químicos. 2) Una posible disminución en la disponibilidad de sustratos 3) La supervivencia de microorganismos del suelo resistentes a condiciones de sequía. Como consecuencia de estos 3 hechos, la degradación de los plaguicidas en condiciones de sequía severa es mucho más lenta a lo largo del tiempo que en condiciones de no sequía, persistiendo los mismos un mayor periodo de tiempo y, por tanto, provocando una mayor toxicidad de estos plaguicidas en el medio ambiente. 6. CONCLUSIONES 6. Conclusiones 97 Del estudio de cómo afecta la sequía severa en las propiedades químicas y bioquímicas de un suelo mediterráneo tras someterlo a diversas prácticas agrícolas tales como la aplicación de distintas fuentes de materia orgánica, o de diferentes plaguicidas, se exponen a continuación las conclusiones más relevantes: 1. Primera experiencia de incubación 1.1. La evolución de la materia orgánica en suelos regados depende principalmente de su composición química, sugiriendo que la fracción lábil de la materia orgánica es la más susceptible a la mineralización, actuando como una fuente de energía inmediata para los microorganismos 1.2. Los resultados obtenidos en los espectros de RMN de 13C en estado sólido indican que la región O-alquilo disminuyó en suelos enmendados orgánicamente. Esta disminución fue mayor en el suelo enmendado con el residuo sólido urbano, seguido de los suelos enmendados con estiércol de vaca y oveja, respectivamente. Estos resultados son la consecuencia de que el O-alquilo se considera una forma fácilmente degradable de carbono orgánico. 1.3. El agua es un recurso esencial y necesario que afecta la supervivencia y el estado fisiológico de los microorganismos. Una sequía prolongada de 12 meses tiene un efecto negativo significativo tanto sobre las actividades enzimáticas del suelo como sobre su biodiversidad microbiana, y en consecuencia sobre la mineralización de la materia orgánica aplicada. Este hecho se debe al estrés al que pueden estar sometidos los microorganismos del suelo en tales condiciones, donde la disponibilidad de agua puede afectar la disponibilidad de sustratos, la difusión de gases, el pH y la temperatura del suelo y, por tanto, podría ser responsable de los bajos valores encontrados en las actividades enzimáticas del suelo y la disminución de la población bacteriana y fúngica. 1.4. La comunidad microbiana del suelo fue afectada de diferente forma. A corto plazo, la sequía solo afectó a las poblaciones de bacterias Gramy hongos, sin 6. Conclusiones 98 afectar a la población de bacterias Gram +, posiblemente porque estas bacterias tienen paredes celulares más rígidas, haciéndolas más resistentes a los procesos de secado. En periodos de sequía más largos, tanto bacterias Gram+ como Gramy hongos se encontraron negativamente afectados. 1.5. La aplicación de materia orgánica al suelo sometido a sequía hace disminuir menos bruscamente el contenido de humedad de dicho suelo, debido a la sorción de agua por parte de la materia orgánica. Esta sorción es mayor cuanto mayor es el contenido en ácidos húmicos de dicha materia orgánica. En este caso, los efectos negativos sobre la comunidad microbiana del suelo y su actividad bioquímica disminuyeron significativamente. En consecuencia, nuestro estudio demuestra la importancia de la gestión de la materia orgánica del suelo para hacer frente a los procesos de sequía climática. 2. Segunda experiencia de incubación 2.1. En condiciones de sequía, la persistencia de los plaguicidas en suelo aumenta con el tiempo, y en consecuencia, puede persistir un mayor periodo de tiempo el efecto tóxico que algunos de estos plaguicidas pueden ejercer en el suelo. Este mayor efecto de los plaguicidas en condiciones de sequía severa pueda ser consecuencia del efecto combinado de tres causas: (1) efecto tóxico de los plaguicidas en los microorganismos del suelo que hace que solo se desarrollen los tolerantes a dichos compuestos químicos; (2) una posible disminución en la disponibilidad de sustratos; y (3) la supervivencia de microorganismos del suelo resistentes a condiciones de sequía. 7. BIBLIOGRAFIA 7. Bibliografía 106 Goswami, M.R., Pati, U.K., Chowdhury, A., Mukhopadhyay, A. 2013. Studies on the effect of cypermethrin on soil microbial biomass and its activity in an alluvial soil. International Journal of Agricultural and Food Science 3, 1-9. Gregorich, E. G., Monreal, C. 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