n
UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA
INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE VÍRUS
ENTÉRICOS (NOROVÍRUS, ASTROVÍRUS E ADENOVÍRUS) EM CRIANÇAS
COM DIARREIA AGUDA EM ANGOLA
CARLA ALEXANDRA DIMAS TAVARES
O ien ado a: P o esso a Dou o a Aida Es e es Simões
Coo ien ado a: Dou o a Claudia Is a e
Disse ação ap esen ada pa a cump imen o dos equisi os necessá ios à ob enção do
g au de Mes e em Ciências Biomédicas
i
Elemen os Bibliog á icos Resul an es da Disse ação
Ta a es C., Es e es A., Mendes C., No dg en J., Piedade J., Fo es F., Dimbu P.R,
Sa ai a N. e Is a e C. De ec ion and molecula cha ac e iza ion o no o, as o and
adeno i uses ci cula ing in child en unde i e yea s o age in se e al egions o
Angola. 12 h In e na ional Con e ence on Molecula Epidemiology and E olu iona y
Gene ics o In ec ious Diseases, Banguecoque, 11-13 de Dezemb o de 2014
(Ap esen ação O al).
ii
iii
Ag adecimen os
A ealização des e abalho só oi possí el de ido ao apoio incondicional de á ias
pessoas, às quais desejo mani es a a minha g a idão, nomeadamen e:
À minha o ien ado a, P o esso a Dou o a Aida Es e es Simões, P o esso a
Associada da Unidade de Ensino e In es igação de Mic obiologia no Ins i u o de
Higiene e Medicina T opical, pela con iança que deposi ou em mim, pelo apoio e
o ien ação na ealização des e abalho. Ob igado po me e ajudado a encon a
soluções pa a os di e sos obs áculos que o am apa ecendo.
À minha coo ien ado a, Dou o a Claudia Is a e, In es igado a Auxilia Con idada
da Unidade de Ensino e In es igação de Mic obiologia no Ins i u o de Higiene e
Medicina T opical, po e semp e uma pala a de incen i o e po odo o apoio du an e
es a e apa. Sin o-me mui o g a a po odas as ecomendações e c í icas que o am semp e
mui o cons u i as e bem ecebidas.
A odos os elemen os do G upo de Vi ologia, p incipalmen e ao P o esso Dou o
João Piedade, ao P o esso Dou o Rica do Pa ei a e Técnica Supe io Ângela Lopes
Mendes pela cons an e disponibilidade pa a a espos a a qualque pedido de ajuda.
Ao P o esso Dou o Filomeno de Jesus Fo es, esponsá el em Angola pelo
p oje o, e ao P o esso Vi gílio E. do Rosá io pelo apoio dado pa a inicia e desen ol e
o p oje o em Angola. Aos colabo ado es D . Ped o Ra ael Dimbu e D . Nil on Sa ai a,
do Depa amen o do Con olo de Doenças da Di eção Nacional de Saúde Pública de
Angola que inanciou o es udo.
Também aos p o issionais de saúde Angolanos que, nos cen os de saúde e
hospi ais locais, con ibuí am pa a a colhei a das amos as e acompanhamen o dos pais
e c ianças, nomeadamen e à D a. Ma ia Cecília de Almeida e D a. Ma iana de Oli ei a.
Ag adeço a disponibilidade da pa icipação e consen imen o dado pelos esponsá eis
das c ianças incluídas nes e es udo.

i
Ag adeço ao Dou o Johan No dg en, p o esso e in es igado da Di isão de
Vi ologia Molecula na Uni e sidade de Linköping, Suécia, pela sua disponibilidade,
auxílio labo a o ial e no a amen o dos dados es a ís icos.
À C is ina Mendes e Ru e Ma celino, po odo o apoio e amizade nes a e apa, e po
odos os ca és que omámos jun as, pa a da ene gia pa a en en a o dia. Nunca se
esqueçam que a semana em semp e de e mina azul.
Às minhas colegas de mes ado, em especial à Ana Bolas, Ca la Fe ei a, Cláudia
Co oa, Débo a Almeida e Ma iana Fe nandes, sem ocês es a caminhada não e ia sido
a mesma.
Aos meus amigos e bando, que es i e am semp e p esen es, e semp e com pala as
de incen i o, em especial à Inês Fu ado, Má cio Ca doso, Ma iana Galileu, Pa ícia
Nunes, Tânia Ma os e Vi o Vaz.
Ag adeço ambém à D a. Luísa Pa gana, D a. Paula Mo e e Ven u a e es an e
equipa, po pe cebe em a impo ância que inha pa a mim es e abalho, e assim
ajus a em es o ços pa a que osse possí el a conc e ização des e ciclo de es udos.
Ob igado pela ossa disponibilidade, oi a p o a do lema “Mais do que pala as,
GESTUS®”.
Po im, gos a ia de ag adece aos meus pais, pelo amo incondicional. Espe o que
um dia os possa p o a que es e es o ço aleu a pena.
Dedico es a ese aos meus pais.
Resumo
A gas oen e i e aguda (GEA) é uma das p incipais causas de mo alidade e
mo bidade em c ianças com idade in e io a 5 anos, especialmen e nas que i em em
países em desen ol imen o. Sabe-se que os o a í us são a p incipal causa de GEA
pediá ica, seguidos dos no o í us, adeno í us e as o í us. En e 2012 e 2013, c ianças
com idade in e io a 5 anos, com dia eia e que eco e am a unidades de saúde em
Angola (p o íncias de Huambo, Zai e, Cabinda e Luanda) o am incluídas num es udo
pilo o com o obje i o de iden i ica e ca ac e iza agen es i ais causado es de
gas oen e i e. A de eção e ca ac e ização gené ica de adeno í us, as o í us e no o í us
o am ealizadas num o al de 222 amos as de ezes, nega i as pa a o a í us. Os
as o í us e adeno í us o am de e ados po es e de ELISA e es e ápido
imunoc oma og á ico, espe i amen e, enquan o os no o í us o am de e ados po
PCR em empo eal com sonda TaqMan®. A geno ipagem oi ealizada po análise
ilogené ica de sequências pa ciais do gene do hexão dos adeno í us, e da ORF2 de
as o í us e no o í us.
Nas amos as ecais, oi possí el iden i ica no o í us, adeno í us e as o í us, com
axas de de eção de 17% (37/222), 11% (24/222) e 5% (11/222), espe i amen e. A
maio ia dos no o í us de e ados (81%, 30/37) pe encia ao genog upo GII, sendo os
genó ipos mais p e alen es GII.6 (9/30), GII.4 (8/30, incluindo duas a ian es Sydney
2012) e GII.7 (6/30). Os genó ipos GII.1, GII.2, GII.3, GII.9, GII.14 e GII.16 o am
ambém iden i icados. Os no o í us GI o am classi icados como GI.3 (5/7) e GI.5
(1/7). Quan o aos adeno í us, os ipos mais abundan es o am HAdV-41 (7/24), HAdV-
40 (4/24) e HAdV-1 (4/24). Po ém, o am igualmen e iden i icados HAdV-2, -5, -9, -
15/-29, -18, -26, -27 e -61. Os as o í us o am geno ipados como HAs V-5 (3/7),
HAs V-1 (2/7) e HAs V-3 (2/7). Pa a nosso conhecimen o, es e oi o p imei o es udo
sob e í us en é icos, pa a além dos o a í us, ealizado em c ianças com GEA em
Angola e e ela a p esença de no o í us, adeno í us e as o í us em ce ca de um e ço
das amos as es udadas. Ainda, os di e en es í us ap esen am uma g ande di e sidade
de es i pes em ci culação, incluindo a ian es menos comuns.
Pala as-cha e: gas oen e i e aguda, adeno í us, as o í us, no o í us, c ianças
Angola.
i
Abs ac
Acu e gas oen e i is (AGE) is one o he mos common childhood diseases,
a ec ing especially he de eloping coun ies. Ro a i us is conside ed he leading cause
o paedia ic dia hoea along wi h no o i uses, as o i uses, and adeno i uses.
Du ing 2012 and 2013, child en unde 5 yea s diagnosed wi h AGE in heal h ca e
uni s o Angola (Huambo, Zai e, Cabinda and Luanda p o inces) we e en olled in a
pilo s udy aiming o cha ac e ize i al gas oen e i is e iological agen s. De ec ion and
gene ic cha ac e iza ion o no o i uses, as o i uses, and adeno i uses was pe o med
in a o al o 222 s ool samples nega i e o o a i us. As o i uses and adeno i uses
we e sc eened by ELISA and immunoch oma og aphic apid es , espec i ely, while
no o i uses we e de ec ed by in house TaqMan® eal- ime PCR. Geno yping was
ca ied ou by phylogene ic analysis o a segmen o he hexon gene o adeno i uses
and pa ial ORF2 sequences o no o i uses and as o i uses.
No o i uses, adeno i uses, and as o i uses we e iden i ied in aecal specimens
wi h de ec ion a es o 17% (37/222), 11% (24/222), and 4% (9/222), espec i ely. The
majo i y o he no o i uses (81%, 30/37) belong o he GII genog oup, he mos
p e alen geno ypes being GII.6 (9/30), GII.4 (8/30, wi h wo Sydney 2012 a ian s),
and GII.7 (6/30). Though a lowe a es, GII.1, GII.2, GII.3, GII.9, GII.14, and GII.16
s ains we e also ecognized. GI no o i uses we e geno yped as GI.3 (5/7) and GI.5
(1/7). The mos p e alen adeno i us ypes we e HAdV-41 (7/24), HAdV-40 (4/24),
and HAdV-1 (4/24) bu HAdV-2, -5, -9, 15/29, -18, -26, -27, and -61 we e also
iden i ied. As o i uses we e acknowledged as HAs V-5 (3/7), HAs V-1 (2/7), and
HAs V-3 (2/7).
To ou knowledge, his is he i s epo on i al en e ic pa hogens, o he han
o a i uses, in ec ing child en wi h AGE in Angola and demons a es ha al oge he
no o i uses, adeno i uses, and as o i uses we e de ec ed in abou one hi d o he
samples s udied. In addi ion, indi idual pa hogens show a high di e si y o ci cula ing
s ains including unusual ones.
Key-wo ds: acu e gas oen e i is, adeno i us, as o i us, no o i us, child en, Angola.
ii
Índice Ge al
Elemen os bibliog á icos Resul an es da Disse ação……………………………………i
Ag adecimen os………………………………………………………………………….ii
Resumo………………………………………………………………………………….i
Abs ac …………………………………………………………………………………..
Índice Ge al…………………………………………………………………………….. i
Lis a de Ab e ia u as……………………………………………………………………ix
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1
1.1 Adeno í us ......................................................................................................... 4
1.1.1 Es u u a do Vi ião ...................................................................................... 5
1.1.2 O ganização genómica ................................................................................ 6
1.1.3 Ciclo Replica i o ........................................................................................ 7
1.1.4 Epidemiologia ........................................................................................... 10
1.2 As o í us ......................................................................................................... 11
1.2.1 Es u u a do i ião .................................................................................... 12
1.2.2 O ganização do genoma ............................................................................ 12
1.2.3 Ciclo Replica i o ...................................................................................... 14
1.2.4 Epidemiologia ........................................................................................... 15
1.3 No o í us.......................................................................................................... 16
1.3.1 Es u u a do Vi ião .................................................................................... 17
1.3.2 O ganização genómica .............................................................................. 18
1.3.3 Ciclo Replica i o ...................................................................................... 19
1.3.4 Epidemiologia ........................................................................................... 21
1.4 Obje i os .......................................................................................................... 24
2. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 25
2.1 População es udada .......................................................................................... 25
2.2 Amos a ............................................................................................................ 26
2.3 Adeno í us ....................................................................................................... 27
In odução
2
Angola é o 15º país com maio axa de mo alidade de ido à dia eia, onde
anualmen e mo em ce ca de 19700 c ianças com idades in e io es a cinco anos, í imas
des a doença (6). Segundo a OMS, em Angola, a dia eia é esponsá el po 15% das
mo es em c ianças com idade in e io a 5 anos, pe cen agem supe io a causas como a
malá ia e VIH/SIDA (11).
Figu a 1.2 Rep esen ação g á ica da dis ibuição das causas de mo e em Angola,
em c ianças com idade in e io a 5 anos (dados de 2010). Adap ado de WHO
(2013) (11).
Anomalias
Congéni as; 7%
Ou as
Doenças; 19%
Lesões; 4%
P ema u idade;
13%
Sepsia Neona al; 6%
Pneumonia;
17%
As ixia du an e
o pa o; 8%
Malá ia; 10%
Dia eia;
15%
HIV/SIDA; 2%
Taxa de Mo alidade po 100 000
c ianças (2008)
Figu a 1.1 – Dis ibuição geog á ica das mo es de ido a dia eia em c ianças com idade in e io
a 5 anos (po 100000 c ianças). Adap ado de San osham, M., e al. (2010) (202)

In odução
3
Um es udo ealizado em 2007 demons ou que mais de 75% dos episódios de
dia eia êm o igem i al (12). Exis em mais de 20 í us iden i icados como agen es
e iológicos de gas oen e i e em c ianças (13). Po ém, os o a í us (RV) são os que
ap esen am maio p e alência, seguidos dos no o í us (NoV), adeno í us (AdV) e
as o í us (As V), com axas de de eção de 20-60%, 6-30%, 1-37% e 1-10%,
espe i amen e (14) (15) (16) (17) (18) (19).
Os p incipais sin omas desc i os em c ianças com GEA são dia eia, eb e, do
abdominal, ómi os, aqueza e desid a ação (20) (21) (22). Na in eção po adeno í us,
o pe íodo de incubação é de 3 a 10 dias. Es es í us causam dia eias p olongadas que
podem du a en e 10 e 14 dias, e com ce ca de 6 a 8 episódios diá ios (21). Casos de
mo alidade de ido a GEA po adeno í us o am egis ados não só em indi íduos
imunodep imidos como ambém em c ianças e adul os saudá eis (23) (24).
Tipicamen e, a in eção po as o í us em um pe íodo de incubação de 3 a 4 dias e
os sin omas podem pe sis i en e 2 e 7 dias. Ge almen e, a in eção po as o í us causa
dia eia mais ligei a que a p o ocada po o a í us ou no o í us e os ómi os ambém
são menos p e alen es, pelo que não conduz a es ados de desid a ação se e a, nem
eque hospi alização (25). Os casos de mo alidade associados a gas oen e i e po
as o í us são ex emamen e a os (26).
Em média, os no o í us ap esen am um pe íodo de incubação mui o cu o (1-2
dias) e os sin omas podem pe sis i en e 1 e 3 dias. A segui aos o a í us, os no o í us
são os í us en é icos que ap esen am mais casos com um índice de g a idade ele ado
(20). Em indi íduos imunocomp ome idos, a in eção po no o í us pode se
p olongada, le ando mesmo a episódios de dia eia c ónica (27). Nos países em
desen ol imen o, es ima-se que a in eção po no o í us conduza a ce ca de 200 000
mo es anuais em c ianças com idades in e io es a 5 anos (27).
Segundo dados da OMS, a maio ia das doenças dia eicas podem se p e enidas
a a és de medidas como o acesso a água po á el e a uma ede de saneamen o básico,
melho ia nas condições de higiene pessoal e na manipulação dos alimen os, p omoção
da amamen ação exclusi a, pelo menos nos p imei os seis meses de ida da c iança, e
p omoção de ações de educação pa a a saúde nas comunidades (6) (28). In e ompe a
In odução
4
ansmissão i al é uma medida ex emamen e impo an e, p incipalmen e no âmbi o
amilia , hospi ala e em c esces, onde a con aminação pessoa a pessoa oco e com
equência.
A ualmen e, não exis e e apia an i i al especí ica ou acina licenciada pa a uso
público con a os adeno í us, as o í us ou no o í us. Assim, a e apia isa a a a
sin oma ologia p o ocada pela doença gas oen é ica. Nos países em desen ol imen o,
a OMS e a UNICEF (The Uni ed Na ions Child en’s Fund), ap esen am di e i as pa a o
a amen o da dia eia em c ianças. As o ganizações ecomendam que as c ianças
omem sais de eid a ação o al de baixa osmola idade, de modo a que haja eposição da
água e dos ele óli os pe didos nas ezes. Apesa des es sais se em conside ados a
e apia de e e ência no a amen o da dia eia em países em ias de desen ol imen o,
em 2012 apenas 1/3 das c ianças que i em nes es países ecebe am a e apêu ica (29).
Jun amen e com os sais, é aconselhada a oma de suplemen os de zinco, de modo a
eduzi a du ação dos episódios de dia eia. Du an e o episódio, a c iança de e á se
alimen ada con inuamen e, de p e e ência com lei e ma e no ou com alimen os icos em
nu ien es (10) (28).
1.1 Adeno í us
Os adeno í us o am isolados e ca ac e izados pela p imei a ez em 1953 po
Wallace Rowe e colabo ado es, na en a i a de iden i ica o agen e e iológico de
in eções espi a ó ias agudas e da cul u a de ecido adenóide e de amígdalas de doen es.
Os adeno í us, memb os da amília Adeno i idae, são í us de DNA de cadeia dupla,
sem in óluc o, que in e am uma la ga gama de hospedei os. Os adeno í us humanos
(HAdVs), incluídos no géne o Mas adeno i us, in e am pa a além do sis ema
espi a ó io, os sis emas u iná io e gas oin es inal e a conjun i a. De aco do com o
ICTV (In e na ional Commi ee on Taxonomy o Vi uses), os HAdVs são classi icados
em 7 espécies (A-G), cada uma delas possuindo á ios ipos. Baseados inicialmen e no
pe il se ológico e p op iedades hemaglu inan es, os ce ca de 70 ipos de HAdVs
desc i os são ago a de inidos com base na sequência do genoma (30).
In odução
5
1.1.1 Es u u a do Vi ião
Os adeno í us são í us sem in óluc o, com cápside de sime ia icosaéd ica e 70-
100 nm de diâme o, excluindo as ib as. Es as pode ão medi en e 12 a 32nm,
dependendo do ipo de adeno í us. A maio ia dos HAdVs codi icam pa a um ipo de
ib a, mas os HAdV-F40, -F41 e -G52 codi icam dois ipos de ib as, longas e cu as
(31). A cápside é compos a po 252 subunidades p o eicas, das quais, 240 cons i uem os
hexões (II), que o mam as 20 aces do icosaed o, e as es an es 12 subunidades o mam
os pen ões (III) dos é ices (Fig. 1.3). De cada pen ão sai uma ib a (IV), com um
domínio globula e minal, de e minan e do opismo e p op iedades hemaglu inan es
do í us (32). A p o eína do hexão con ém duas ansas (loops, L1 e L2). Es as ansas,
p oje adas na supe ície do í us, comp eendem as egiões hipe a iá eis 1-3 (HVR 1-
3) cons i uindo epi opos de e minan es do ipo e indu o es de an ico pos neu alizan es
(33) (34). No cen o da pa ícula encon a-se o genoma i al condensado a a és da
in e ação não co alen e com as p o eínas V, VII e µ. Nas ex emidades 5’ do DNA i al
es á ligada a p o eína e minal (Fig. 1.3).
Figu a 1.3 Es u u a e composição dos adeno í us. (a) O ganização da cápside i al, (b)
P o eínas que se encon am no in e io da cápside. Os esquemas são modelos con uídos a pa i
de écnicas de c iomic oscopia elec ónica e c is alog a ia de aios X. Adap ado de Ma ín C.S.
(2012) (35).
In odução
6
1.1.2 O ganização genómica
Os adeno í us são í us de genoma de DNA de cadeia dupla, linea , com 26 a 45
kb de comp imen o. O genoma dos adeno í us ap esen a epe ições e minais in e idas
(ITR, de In e ed Te minal Repea s) com amanhos de 36 a 200 pb, consoan e o ipo de
adeno í us. As ITR, localizadas nas ex emidades 5’ e 3’, se em de o igem de
eplicação do genoma i al e são sequências al amen e conse adas en e os di e en es
ipos de adeno í us (36).
Todos os adeno í us humanos ap esen am uma o ganização genómica semelhan e
(Fig. 1.4). O genoma des es í us es á di idido em ês egiões: p ecoce “E” (do inglês
ea ly), in e média e a dia “L” (do inglês la e), que co espondem às ases do ciclo
eplica i o em que são exp essas. Na ase p ecoce são ansc i os genes que modulam as
unções celula es, acili ando assim a eplicação do DNA i al e pos e io ansc ição
dos genes a dios. Na ase a dia, os genes ansc i os codi icam p incipalmen e
p o eínas es u u ais, necessá ias à mon agem da pa ícula i al.
No genoma i al exis em oi o unidades de ansc ição dependen es da RNA-
polime ase II. Cinco unidades de ansc ição p ecoce (E1A, E1B, E2, E3 e E4), duas
unidades de ansc ição in e média (pIX e PIVa2), e uma unidade de ansc ição a dia
p incipal (MLTU) que é p ocessada em cinco amílias de mRNAs (L1 a L5). Os
adeno í us codi icam ambém pequenos segmen os de RNA, VAI e VAII, que são
ansc i os pela RNA-polime ase III (37).
In odução
7
Figu a 1.4 - O ganização do genoma do HAdV-40. O genoma é ep esen ado pela linha
ho izon al cen al ma cada em in e alos de 5kpb. As caixas acima da linha ep esen am as
p o eínas que são codi icadas na cadeia de DNA de sen ido posi i o e as caixas abaixo da linha
ep esen am as p o eínas que são codi icadas na cadeia de DNA de sen ido nega i o. A di eção
da ansc ição é indicada pelas se as nas caixas que indicam as unidades ansc icionais
Adap ado de Tiemesse, C.T., e al. (1995) e Jones II, M.S., e al (2007) (36) (38).
1.1.3 Ciclo Replica i o
O ciclo eplica i o dos adeno í us ap esen a uma ase inicial que comp eende a
en ada do í us na célula hospedei a, a passagem do genoma i al pa a o núcleo, e a
ansc ição e adução de genes p ecoces. Es es e en os iniciais p omo em a eplicação
do DNA e consequen emen e a ansc ição e adução de genes a dios, que po sua ez
le am à mon agem das p o eínas es u u ais e ma u ação da pa ícula i al (Fig. 1.5)
(39).
Os adeno í us ligam-se a ece o es da célula hospedei a a a és das suas ib as. Os
ece o es podem se do ipo CAR (Coxsackie-Adeno í us Recep o ), u ilizado pela
maio pa e dos ipos de adeno í us (HAdV-A, -C a -F), MHC-I (Complexo Majo de
His ocompa ibilidade Classe I), CD46 (HAdV-B), CD80 e CD86, In eg inas αMβ2 e
αLβ2, e ácido siálico (40) (39). Pa a além dos ece o es, a célula ambém em co-
ece o es, as in eg inas α β (α β3 e α β5), que in e agem com a base do pen ão. Es as

In odução
8
in e ações conduzem à in e nalização da pa ícula i al po mecanismos de endoci ose
mediada po cla ina [Fig. 1.5 (A)] (37).
A pa ícula i al é ans e ida pa a um compa imen o endossomal in acelula ,
onde o í us so e al e ações con o macionais de ido ao pH baixo. O pH ácido conduz
ambém à a i ação da p o eína VI, que p omo e a pe meabilização da memb ana do
endossoma, e consequen e libe ação da subpa ícula i al pa a o ci oplasma [Fig. 1.5
(B)]. As subpa ículas i ais são anspo adas pelos mic o úbulos, po in e médio de
p o eínas mo o as como a dineína e a dinac ina a é à memb ana nuclea (37) (39).
Figu a 1.5 - Ciclo eplica i o dos adeno í us. Adap ado de Lenae s, L., e al. (2008) (41)
A subpa ícula i al liga-se às p o eínas CAN/Nup214 do complexo do po o
nuclea (NPC). Es a ligação ec u a his onas nuclea es que, po sua ez, ec u am
impo inas e a o es ci oplasmá icos, o que esul a na desmon agem inal da cápside e
pos e io en ada do genoma i al no núcleo [Fig. 1.5 (C)].
In odução
9
No núcleo, inicia-se a ansc ição dos genes p ecoces. O gene E1A é o p imei o a
se exp esso, e em como unção modela o me abolismo da célula hospedei a,
o nando-a mais susce í el à eplicação do í us. O gene E1B codi ica p o eínas que
bloqueiam a apop ose, es imulada pelas unções de E1A. A unidade ansc icional E2
codi ica as p o eínas necessá ias à eplicação, como a DNA-polime ase i al, a p o eína
de ligação a DNA (DBP, DNA binding p o ein) e a p o eína e minal (TP, e minal
p o ein). P o eínas codi icadas pelos genes E3 con ibuem pa a a inibição da apop ose e
impedem que as células T ci o óxicas (CTL) econheçam células in e adas pelo í us.
Os genes E4, pa a além de es a em en ol idos no bloqueio da apop ose, acili am a
adução do mRNA i al a dio [Fig. 1.5 (D)] (37) (39) (42).
Como o genoma dos adeno í us ap esen a ITRs, cada uma das cadeias possui uma
o igem de eplicação. Na eplicação do DNA i al, os adeno í us u ilizam como p ime
pa a inicia o p ocesso a pTP (p ecu so da p o eína e minal), que se encon a
co alen emen e ligada à ex emidade 5’ em ambas as cadeias. Com o auxílio dos a o es
de eplicação celula es N -1 e Oc -1, a DNA-polime ase i al, liga-se à pTP na o igem
de eplicação e inicia o p ocesso de sín ese de uma no a cadeia no sen ido 5’- 3’. À
medida que a cadeia ma iz é lida, a cadeia complemen a é deslocada da dupla hélice e
e es ida po DBP. Quando a p imei a cadeia acaba de se sin e izada, a cadeia pa en al
complemen a deslocada o ma uma es u u a ci cula , a a és do empa elhamen o das
ex emidades, o iginando dsDNA com uma o igem de eplicação e pe mi indo que a
DNA-polime ase i al inicie a sín ese de uma no a cadeia.
Imedia amen e a segui à sín ese do DNA i al, os genes a dios começam a se
ansc i os, essencialmen e pa a adução de p o eínas es u u ais. Apesa des as se em
sin e izadas no ci ossol, a mon agem da pa ícula i al oco e no núcleo [Fig. 1.5 (E)].
P imei o é o mada uma pa ícula azia com hexões, pen ões e ib as [Fig. 1.5 (F)].
Uma p o eina codi icada pelo mRNA L4 ajuda na ag egação dos hexões. De seguida,
p o eínas codi icadas po L1 auxiliam a encapsidação do DNA i al. Numa ase inal da
mon agem, oco em co es p o eolí icos que o iginam p o eínas da cápside como a IIIa,
TP, VI, VII, e µ [Fig. 1.5 (G)]. A pa ícula i al o na-se assim es á el e in eciosa. A
memb ana nuclea da célula hospedei a o na-se pe meá el, o que acili a a saída do
In odução
10
i us pa a o ci oplasma. Po sua ez, há uma desin eg ação da memb ana plasmá ica, o
que pe mi e a libe ação do í us da célula [Fig. 1.5 (H)].
1.1.4 Epidemiologia
Os HAdVs êm sido associados a uma g ande a iedade de doenças e, apesa de
não exis i uma elação es i a en e o ipo de HAdV e a doença p o ocada, é possí el
aze gene alizações. Ce ca de 7% das in eções das ias espi a ó ias em c ianças êm
como agen e e iológico HAdV-C1, -C2, -C5 e -C6 e, ocasionalmen e, -B3 e -B7. Pa a
além des es úl imos, ambém os ipos HAdV-B16, -B21, -B50 e -E4 es ão associados a
Doença Respi a ó ia Aguda (DRA) em adul os, especialmen e em ec u as mili a es
(42). HAdV-B11 e -B21 êm es ado elacionados com cis i e hemo ágica aguda,
enquan o os í us da espécie D, e em pa icula os ipos HAdV-D8, -D19, -D37, -D54
o am iden i icados em casos espo ádicos e su os de que a oconjun i i e epidémica
g a e. (38).
Os ipos HAdV-F40 e -F41 são os mais equen emen e associados a casos de
gas oen e i e aguda, e po isso denominados “adeno í us en é icos”. Es es dois ipos
são esponsá eis po 1 a 22% dos episódios de dia eia em c ianças (43) (44) (45) (46)
(47). No en an o, os adeno í us causado es de in eções espi a ó ias podem ap esen a
exc eção ecal p olongada, mesmo quando já não são de e ados nas mucosas
espi a ó ias (48), di icul ando a sua associação a doença en é ica quando de e ados em
amos as ecais de indi íduos com dia eia. Assim, além dos adeno í us en é icos,
ou os adeno í us como os HAdV-A12, -A18, -A31, -B3, -B7 -C1, -C2, -C5, -D8, -D9,
-D10 -D15, -D17 o am iden i icados em casos de dia eia em c ianças (17) (19) (21)
(43) (44) (46). Ainda, em consequência da epidemia de SIDA, o am iden i icados em
indi íduos imunocomp ome idos com pneumonia e/ou dia eia uma sé ie de no os
adeno í us da espécie D, designadamen e HAdV-D20, -D22, -D26, -D28a -D30, -D32,
-D37, -D43 a –D49, -D60 e -D62 (49) (50) (51). Num es udo publicado em 2007, num
doen e com gas oen e i e oi iden i icado um no o ipo, HAdV-52, e c iada uma no a
espécie, HAdV-G (38). Nos dois úl imos anos, o am iden i icados em ezes de c ianças
In odução
11
com GEA adeno í us dos ipos HAdV-D65 e -D67 (52) (53). Cu iosamen e, e
p o a elmen e de ido à coin ecção com di e en es ipos pode se comum a ní el da
mucosa in es inal, a sequenciação e análise ilogené ica de alguns des es í us e elou
se em í us ecombinan es en ol endo dois ou mais ipos já conhecidos (51) (52) (53).
A in eção po HAdVs oco e globalmen e, e com uma axa de de eção semelhan e
en e o sexo masculino e eminino (54). A maio ia dos adeno í us a e a c ianças com
idade in e io a 2 anos (20) (43) (44) (55) (56). Es udos longi udinais demons a am que
es es í us não ap esen am a iações de de eção ao longo do ano (46) (54) (55) (57).
Po ém, alguns es udos de e am ligei os picos no in e no e na p ima e a (12) (43) (44)
(45).
1.2 As o í us
Os as o í us o am desc i os em 1975, p imei o po Apple on e Higgins e mais
a de po Madeley e Cosg o e, quando da obse ação, po mic oscopia ele ónica, de
pa ículas i ais em o ma de es ela em amos as de ezes de c ianças com GEA (58)
(59).
Em 1995, o ICTV c iou a amília As o i dae pa a inclui í us com genoma de
RNA de cadeia simples e pola idade posi i a, com sime ia icosaéd ica (28-41 nm de
diâme o), sem in óluc o e com o ma de es ela de cinco ou seis pon as. Es a amília
inclui dois géne os, A as o i us, de que azem os as o í us que in e am espécies
a iá ias e Mamas o i us, que inclui os as o í us que in e am uma la ga a iedade de
mamí e os. Segundo o ICTV, cada um dos géne os inclui á ias espécies baseadas na
pa ilha de >75% de iden idade da sequência de aminoácidos da p o eína da cápside
(ORF2), a egião mais a iá el do genoma.
O géne o Mamas o i us, com pelo menos 19 espécies, inclui uma espécie
p o ó ipo dos as o í us humanos (HAs V ou mamas o í us 1), al amen e di e sa,
cons i uída po oi o genó ipos (HAs V-1 a -8), co esponden es aos oi o se o ipos
In odução
18
1.3.2 O ganização genómica
O RNA genómico i al es á co alen emen e ligado a uma p o eína i al, VPg, na
ex emidade 5’ e possui uma cauda poliadenilada em 3’. Em ambos os ex emos do
genoma exis em UTRs, com es u u as secundá ias, e olu i amen e conse adas (100).
Figu a 1.8 - O ganização genómica dos no o í us. Rep esen ação esquemá ica da ORF1, -2, e -
3, e p o eínas co esponden es. Adap ado de Hoa T an, T.N., e al. (2013) (101)
O genoma da maio ia dos no o í us es á o ganizado em 3 ORFs (ORF1, 2 e 3) (Fig.
1.8). A ORF1 ocupa os dois e ços 5’ do genoma e codi ica uma polip o eína que ai
o igina seis p o eínas não es u u ais (p48, NTPase, p22, VPg, p o einase 3C e RdRp)
necessá ias à eplicação i al, sendo aduzida di e amen e a pa i do RNA genómico
i al. A ORF2 e a ORF3, codi icado as das p o eínas es u u ais, são aduzidas a pa i
de um RNA subgenómico de 2,4 kb (78). A ORF2 codi ica a p incipal p o eína da
cápside i al, VP1, com os domínios NS e P. Na junção en e a ORF1 e a ORF2 (≈17
nucleó idos) é possí el encon a o e simila idade de sequências den o dos
genog upos indi iduais, e como al é a egião de eleição a se analisada quando se
p e ende de e mina os genog upos (101). A e cei a ORF codi ica uma p o eína da
cápside pouco abundan e, VP2, que p omo e a encapsidação do RNA genómico e a
es abilidade de VP1 (27) (101). A ORF2 é aduzida a a és de um mecanismo de
e minação/ einiciação (102).

In odução
19
1.3.3 Ciclo Replica i o
Os no o í us humanos (NoVs) não se eplicam em cul u as celula es e, a é à da a
apenas os no o í us mu inos podem se mul iplicados em cul u a. Assim mui o dos
dados do ciclo eplica i o esul am da u ilização de no o í us mu ino ou de VLPs de
NoVs. A adso ção dos no o í us à célula hospedei a en ol e a ligação do subdomínio
P2 da p o eína VP1 a açúca es da supe ície celula que, no caso dos NoVs, são
an igénios do g upo de his ocompa ibilidade-sanguíneo (HBGA, his o blood g oup
an igens). Es e ac o explica a co elação demons ada en e susce ibilidade à in eção e
o es a u o sec e o , co esponden e a um gene FUT2 uncional necessá io pa a a
exp essão de HBGA (103). Após ligação a HBGA [Figu a 1.9 (A)] (101), o í us en a
na célula po um mecanismo ainda não elucidado, so e descapsidação e consequen e
libe ação do RNA genómico i al no ci oplasma [Figu a 1.9 (B)]. VPg, ligada à
ex emidade 5’ do genoma, ec u a a o es de iniciação da adução da célula hospedei a
que in e agem com as es u u as secundá ias do RNA pa a o ma um complexo de
iniciação da adução [Figu a 1.9 (C)] (104). A ORF1 é aduzida numa polip o eína
que, po sua ez, é co ada pela p o einase 3C i al em seis p o eínas não es u u ais que
i ão pa icipa na eplicação do RNA i al (27).
A eplicação do RNA i al deco e em associação com complexos memb ana es
pe inuclea es induzidos po p48 e p22 (105). A cadeia de RNA de pola idade posi i a
se e como molde à sín ese de um RNA in e mediá io de pola idade nega i a. A
eplicação em início na ex emidade 3’ da cadeia ma iz, e pa a al a RdRp u iliza um
mecanismo de iniciação de no o [Figu a 1.9 (D)]. Po sua ez, a cadeia de RNA de
pola idade nega i a o mada, se e de molde à ansc ição do RNA genómico, de
pola idade posi i a, e subgenómico. Nes a ase a RdRp u iliza um mecanismo de
iniciação dependen e de VPg, uncionando es a como p ime pa a a sín ese das no as
cadeias [Figu a 1.9 (E)] (27) (101).
In odução
20
Figu a 1.9 - Ciclo eplica i o dos no o í us. Adap ado de Tho ne , L. G., e al. (2014) (106)
Após a sín ese do RNA subgenómico, oco e a adução das p o eínas VP1 e VP2,
necessá ias à mon agem do í ião [Figu a 1.9 (F)]. Os mecanismos de mon agem da
cápside, encapsidação do genoma e saída dos i ões são la gamen e desconhecidos.
Como ou os í us da amília Calici i idae, pensa-se que os no o í us induzem a
apop ose da célula, le ando assim a al e ações da memb ana celula e à saída dos
i iões [Figu a 1.9(G)] (101).
In odução
21
1.3.4 Epidemiologia
A ní el global, os no o í us são conside ados uma das p incipais causas de
gas oen e i e a e ando indi íduos de odas as idades, an o em países indus ializados
como em países em ias de desen ol imen o. De um modo ge al, pode-se dis ingui
qua o ca ego ias epidemiológicas pa a os no o í us: i) su os de gas oen e i e
p o ocados po alimen os ou água con aminados, ii) in eção de imunocomp ome idos e
idosos, iii) casos espo ádicos de gas oen e i e em c ianças com menos de 5 anos de
idade e i ) casos espo ádicos de GEA em adul os (101). A segui aos o a í us, os
no o í us são a segunda causa de gas oen e i e i al em c ianças com idade in e io a 5
anos. Es ima-se que nes a aixa e á ia, es es í us enham sido esponsá eis po 12%-
17% das hospi alizações po dia eia en e 1990 e 2014 e 200 000 mo es anuais nos
países em ias de desen ol imen o. (27) (107) (108) (109).
Os no o í us a e am indi íduos de odas as idades, endo uma maio p e alência
em c ianças com idades in e io a 2 anos (18) (110) (111). Os no o í us a ingem de
igual modo indi íduos do sexo eminino e masculino (18) (112), no en an o exis em
es udos que desc e em maio p e alência num dos sexos (113) (114).
É possí el iden i ica casos de gas oen e i e po in eção com NoVs du an e odo o
ano. Con udo, é possí el gene aliza pad ões de sazonalidade en e os países de clima
empe ado e os de clima opical. Nos países de clima empe ado, a gas oen e i e po
NoVs é mais comum no ou ono, in e no e início da p ima e a, sendo como al
conhecida po win e omi ing disease (115) (116) (117). Nos países de clima opical,
os su os são mais equen es du an e a es ação mais ia e seca (18) (111) (113).
A a és de es udos de me a-análise, Ahmed e colabo ado es concluí am que os
NoVs são esponsá eis po 18% dos casos de gas oen e i e aguda em odo o mundo. O
g upo ambém e i icou que os casos de GEA po NoVs são mais comuns na
comunidade e em doen es em ambula ó io, do que em doen es hospi alizados (108).
Es udos de epidemiologia molecula ela am equen emen e a co-ci culação de
á ios genó ipos de no o í us dos genog upos GI e GII, sendo es e úl imo esponsá el
po 70-100% dos casos espo ádicos (18) (107) (110). Exis e uma associação
In odução
22
signi ica i a en e es es dois genog upos e o modo de ansmissão. Os su os com
o igem em GI, compa a i amen e com GII, es ão mais elacionados com ansmissão
po ia de água con aminada, o que pode e le i a maio es abilidade de GI na água
(118) (119). Po sua ez, os no o í us GII, em compa ação com os GI, es ão mais
associados a su os em locais públicos semi echados, como la es, cen os de dia,
es au an es, e na ios de c uzei o, onde p edomina a ansmissão po alimen os
con aminados e pessoa-a-pessoa (27) (120) (121) (122).
Globalmen e, os no o í us GII.4 são esponsá eis po ce ca de 55-85% dos casos
de GEA po es es í us (27) (123). Es e é o genó ipo mais i ulen o, uma ez que, pa a
além da ele ada p e alência, os indi íduos in e ados com no o í us GII.4 ap esen am
uma maio axa de hospi alização e de mo es, compa a i amen e com indi íduos
in e ados com no o í us de ou os genó ipos (27) (124). Na úl ima década, depois de
GII.4, GII.3 su ge como o segundo mais p e alen e globalmen e, embo a nalguns países
es a posição seja ocupada po GII.6. Os genó ipos GI.1, GI.3, GI.4, GI.6, GII.1, GII.2 e
GII.7, são equen emen e iden i icados, mas com p e alências in e io es (14) (18) (27)
(56) (101) (111) (123) (125).
O aumen o global da p e alência de no o í us como agen e e iológico de GEA em
sido causado pelo apa ecimen o de no as a ian es de GII.4 à semelhança do que
acon ece com o í us da g ipe. Desde o início dos anos 90, no as a ian es êm su gido
a cada 2-3 anos. Desde 1995, as a ian es de GII.4 já le a am a pelo menos se e
epidemias globais de gas oen e i e. A es i pe GII.4 US95/96 oi p imei o iden i icada
em Ingla e a e depois nos EUA, onde oi esponsá el po ce ca de 55% dos su os de
no o í us. En e 1995-1997, a es i pe ap esen ou uma ci culação global, endo sido
iden i icada no Canadá, Aus ália, Holanda, China e Alemanha (125) (126).
En e 2000 e 2004, a es i pe US95/96 oi subs i uída po uma no a a ian e, a GII.4
Fa ming on Hills, esponsá el po ce ca de 45% dos su os de no o í us que oco e am
nos EUA em 2002. A p e alência subiu pa a 64% em su os que oco e am em
c uzei os (127). Es a a ian e oi ambém de e ada na Aus ália (125). Simul aneamen e,
na Ásia, e p incipalmen e na Eu opa, eme giu ou a a ian e, GII.4b (128) (129) (130).
In odução
23
Em 2004, su giu uma no a epidemia global, o iginada pela a ian e GII.4 Hun e .
Es a a ian e oi de e ada na Aus ália, Ásia, Eu opa e Á ica do No e (125) (130)
(131) (132) (133).
Dois anos mais a de, a a ian e Hun e oi subs i uída po duas a ian es que co-
ci cula am na Ásia, Amé ica do No e e Sul, Eu opa e Aus ália, as a ian es 2006a
(GII.4 Lau ens) e 2006b (GII.4 Mine a) (14) (132) (134) (135) (136).
Em 2009, eme giu uma no a a ian e, a GII.4 New O leans, que en e 2009-2010
oi esponsá el po 60% dos su os que oco e am nos EUA (137). Es a a ian e oi
ambém iden i icada nou os países, como Ingla e a, I ália, Aus ália, Á ica do Sul,
Bu kina Faso, Rússia (138) (139) (140). Con udo, en e 2005 e 2010, a a ian e 2006b
oi conside ada p edominan e, ep esen ando ce ca de 90% das a ian es GII.4 isoladas
em odo o mundo (101).
Em 2012, no os su os de no o í us começa am a eme gi em di e sos países,
de ido a uma no a a ian e, GII.4 Sydney. Es a a ian e ecombinan e oi iden i icada
na cidade aus aliana, onde nesse mesmo ano oi esponsá el po ce ca de 30% dos
su os de GEA. En e 2012-2013, a a ian e Sydney oi esponsá el po mais de 55%
dos su os que oco e am em Ingla e a e nos EUA, em apenas 4 meses o am
epo ados mais de uma cen ena de su os po no o í us GII.4 Sydney (138) (141). A
a ian e ambém oi iden i icada em países como I ália, China, Bangladesh, B asil,
Á ica do Sul, Ma ocos, en e ou os (139) (142) (143) (144) (145) (146). A ualmen e a
a ian e GII.4 Sydney é p edominan e, e segundo uma ede online de labo a ó ios de
saúde pública nos EUA, a CaliciNe , en e Se emb o 2013 e Agos o 2014, a a ian e oi
esponsá el po 56% dos su os de no o í us que oco e am nos EUA (147).

In odução
24
1.4 Obje i os
Dados de 2010 e elam que a dia eia oi esponsá el po 15% das mo es em
c ianças com idade in e io a 5 anos, em Angola (11). Des a pe cen agem sabe-se que
33% co espondem a mo es elacionadas com a in eção po o a í us, e os es an es
67% a mo es de ido a dia eia p o ocada po ou os agen es e iológicos (148).
Em colabo ação com o Minis é io Nacional de Saúde e com a Di eção Nacional de
Saúde Pública de Angola, iniciou-se um es udo pilo o com o obje i o p incipal de
iden i ica agen es i ais, nomeadamen e adeno í us, as o í us e no o í us, p esen es
em ezes de c ianças com idade in e io a 5 anos com dia eia aguda, não p o ocada po
o a í us, que eco e am a á ias unidades de saúde das p o íncias de Cabinda,
Luanda, Huambo e Zai e em Angola.
O es udo e e como obje i os mais especí icos:
1. De e mina a p e alência da in eção po adeno í us, as o í us e no o í us na
população acima mencionada; e
2. P ocede à ca ac e ização gené ica das es i pes de e adas pa a a alia a
di e sidade de genó ipos daqueles í us ci culan es na população al o.
Ma e iais e Mé odos
25
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 População es udada
O es udo oi ealizado em Angola, nas p o íncias de Cabinda, Luanda, Huambo e
Zai e. A população al o do es udo oi c ianças com idade in e io a cinco anos, de
ambos os sexos, e que ap esen assem um quad o de GEA (i.e. com dia eia, de inida po
ês ou mais dejeções líquidas ou moles, num pe íodo de 24 ho as, e/ou ómi os). As
c ianças o am a endidas na consul a de hospi ais ou cen os de saúde da sua á ea de
esidência.
As amos as de ezes o am colhidas em duas ases. Numa p imei a ase de Junho a
Agos o de 2012, du an e o pe íodo de época seca, localmen e designada po cacimbo,
que em Angola se es ende de Maio a Agos o, e numa segunda ase de Se emb o a
Ou ub o de 2013, na es ação das chu as, que deco e de Se emb o a Ab il.
Nas di e sas unidades de saúde, a a aliação e a iagem clínica das c ianças o am
ealizadas pelo en e mei o/médico assis en e, o qual inha a esponsabilidade de
e i ica se a c iança p eenchia os c i é ios de inidos pa a a população al o do es udo,
explica os obje i os do mesmo e pedi consen imen o ao esponsá el
legal/acompanhan e da c iança. Caso conco dasse em colabo a no es udo, o
esponsá el pela c iança p eenchia um o mulá io de in o mação e consen imen o
in o mado (Anexo 6.1), onde au o iza a a ecolha de uma amos a de ezes da c iança e
a u ilização dos dados clínicos da mesma. Os dados clínicos o am ob idos pelo mé odo
de inqué i o (Anexo 6.2), p eenchido pelo en e mei o, em colabo ação com o
esponsá el da c iança. O p o ocolo de es udo, o ques ioná io e o o mulá io de
consen imen o in o mado o am ap o ados pelas Comissões de É ica do Ins i u o de
Higiene e Medicina T opical e de Angola.
Ma e iais e Mé odos
26
Figu a 2.1 - Mapa de Angola. As unidades de saúde onde oi e e uada a colhei a de amos as
es ão assinaladas de 1 a 10, sendo 1 – Hospi al Municipal de Chinga (HMC); 2 - Hospi al
Municipal de M'Banza Kongo (HMMK); 3 - Cen o de Saúde Ma e no-In an il de M'Banza
Kongo (CSMI); 4 - Cen o de Saúde da Paz (CSP); 5 - Hospi al do Al o-Hama (AH); 6 -
Hospi al Municipal de Caála (C); 7 - Cen o de Saúde de Calenga (CAL); 8 - Cen o de Saúde
do Casseque III (CIII); 9 - Hospi al Municipal de Bailundo (B) e 10 - Cen o de Saúde Ma e no-
In an il de Minei a (M).
2.2 Amos a
Num es udo ealizado an e io men e, com o obje i o de de e mina a p e alência da
in eção e ca ac e iza os genó ipos de RV ci culan es nas di e en es egiões, 343
amos as o am es adas pa a es e í us, sendo 121 posi i as. As es an es 222,
p o enien es de c ianças com idade in e io a 5 anos com gas oen e i e aguda causada
po ou o agen e e iológico, o am usadas no p esen e es udo e analisadas pa a HAdVs,
HAs Vs e NoVs seguindo, gene icamen e, o luxog ama da Fig. 2.2.
1
3
6
Ma e iais e Mé odos
27
Figu a 2.2 - Fluxog ama do p ocedimen o usado na geno ipagem de adeno í us, as o í us e
no o í us. As caixas a acejado ep esen am as e apas de de eção dos í us nas amos as ecais,
enquan o as caixas com linha con ínua ep esen am e apas de geno ipagem.
2.3 Adeno í us
2.3.1 De eção de HAdVs po es e ápido
De modo a de e a an igénios de HAdVs p esen es nas amos as de ezes, oi
u ilizado o ki “Ce Tes Ro a i us-Adeno i us” (Ce Tes Bio ec S.L., Espanha),
seguindo as ins uções do ab ican e. O es e quali a i o imunoc oma og á ico de e a
simul aneamen e a p esença de an igénios de adeno í us e o a í us.
Ma e iais e Mé odos
34
Pa a a eação de ampli icação oi u ilizada a mis u a SensiFAST™ P obe Lo-ROX
(2x) (BIOLINE), de aco do com as ins uções do ab ican e. Os p ime s usados na
eação o am NVG1F, NVG1R, NVG2F, COG2R (Tabela 2.6), numa concen ação de
0,5 pmol/µl, a que o am ambém adicionadas duas sondas TaqMan®, uma especí ica
pa a o genog upo I (NoVG1 [1pmol/µl]), e ou a pa a o genog upo II (NoVG2
[1pmol/µl]) (Tabela 2.6), num olume o al de 20 µl. A eação de PCR em empo eal
oi execu ada no e mociclado 7500 Fas Real-Time PCR Sys em (Applied Biosys ems).
De modo a ga an i o con olo de qualidade do ensaio, o am u ilizados duplicados de
con olos posi i os pa a cada genog upo, e de con olos nega i os.
O p ocesso de ampli icação oi iniciado com um passo de a i ação da enzima
(95ºC, 10min.), seguindo-se os de desna u ação (95ºC, 15 seg) e hib idação/ex ensão
(60ºC, 1min.), epe indo-se ao longo de 45 ciclos. Com base na magni ude do sinal
ge ado, oi possí el de e a a p esença de no o í us GI e/ou GII.
Tabela 2.6 P ime s e sondas u ilizadas na eação de PCR em Tempo Real (151)
Sequência (5’ – 3’)
Localização no genoma
GI
P ime NVG1F
CGY TGG ATG CGN TTC CAT GA
5294–53131
P ime NVG1R
GTC CTT AGA CGC CAT CA TC
5397–53791
Sonda NoVG1
[6FAM]AG ATY GCG RTC YCC
TGT CCA[BHQ1]
GII
P ime NVG2F
ATG TTY AGR TGG ATG AGR
TTY TC
5012–50342
P ime COG2R
TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA
5100–50812
Sonda NoVG2
[JOE]TGG GAG GGC GAT CGC
AAT CT[BHQ1]

Ma e iais e Mé odos
35
1 A localização da sequência no genoma é baseada no no o í us GI.1 ( í us No walk, núme o de
acesso GenBank NC 001959); 2 A localização da sequência no genoma é baseada no no o í us
GII.1 (núme o de acesso GenBank HCU07611).
2.5.2 Ampli icação po PCR da egião NS dos no o í us
A ampli icação da sequência da egião NS de no o í us GI oi e e uada a a és de
uma eação de PCR, u ilizando o p ime o wa d NVG1F (Tabela 2.6) e o p ime
e e se G1SKR (5’- CCA ACC CAR CCA TTR TAC A-3’ 5652-5671 n ), 0,5 pmol/μl
de cada, e a mis u a Sup eme NZYTaq 2x G een Mas e Mix (Nzy ech,Lisboa, PT), de
aco do com as indicações do ab ican e. Fo am ealizadas duas eações de PCR
sucessi as com o mesmo pa de p ime s, u ilizando-se 1 μl de cDNA na p imei a eação
e na segunda 1,5 µl do p odu o ampli icado na p imei a. A ampli icação iniciou-se com
um passo de desna u ação (94ºC, 15 min), seguindo-se os passos de desna u ação a
94ºC (30 seg), hib idação a 55ºC (30 seg) e ex ensão a 72ºC (60 seg), epe idos 35
ciclos. O PCR e minou com uma e apa de ex ensão a 72ºC du an e 5 min.
Pa a a ampli icação da sequência NS de no o í us GII ambém se u ilizou a mis u a
Sup eme NZYTaq 2x G een Mas e Mix (Nzy ech, Lisboa, PT), de aco do com as
indicações do ab ican e. Na p imei a eação de hemi-nes ed PCR, os p ime s COG2F
(5’ - ATG TTY AGR TGG ATG AGR TTY TC -3’, n 5012-5034) e G2SKR (5’- CCR
CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT- 3’, n 5367-5389) o am adicionados pa a uma
concen ação inal de 0,5 pmol/μl. U iliza am-se 2 μl de cDNA ma iz, sendo o olume
inal de eação de 20 μl. Na segunda eação de hemi-nes ed PCR, o am u ilizados os
p ime s G2SKF (5’ - CNT GGG AGG GCG ATC GCA A -3’, n 5046-5064) e GS2KR,
na mesma concen ação, e 2 µl do p odu o ampli icado na p imei a eação.
Na p imei a eação de hemi-nes ed PCR, a ampli icação iniciou-se com um passo
de desna u ação inicial a 95ºC (10 min), seguindo-se os passos de desna u ação a 95ºC
(30 seg), hib idação a 57ºC (30 seg) e ex ensão a 72ºC (2 min), epe idos 40 ezes. O
PCR e minou com uma e apa de ex ensão inal a 72ºC du an e 5 min. A segunda eação
Ma e iais e Mé odos
36
deco eu nas mesmas condições, exce o a empe a u a de hib idação se de 58ºC. Os
p odu os de ampli icação o am analisados po ele o o ese em gel de aga ose (2% p/ ).
2.6 Clonagem dos P odu os de PCR no Ve o Plasmídico pGEM®-T
Easy
Os p odu os de PCR com bandas inespecí icas e/ou quan idade eduzida do
agmen o de in e esse o am clonados no plasmídeo pGEM®-T Easy (P omega, EUA)
seguindo as ins uções do ab ican e. Resumidamen e, a mis u a de ligação consis iu em
5µl de ampão, 1µl de solução do plasmídeo pGEM®-T Easy (50ng/µl), 1µl de T4 DNA
ligase e 3µl do p odu o de PCR a clona . De modo a ob e uma maio axa de
ans o man es, as ligações deco e am a 4ºC, du an e a noi e.
Pa a a p epa ação e ans o mação de células compe en es, uma cul u a de
Esche ichia coli JM109 oi c escida du an e a noi e, a 37ºC, com agi ação (220 pm),
em meio líquido de Lu ia Be ani (LB). Na manhã seguin e, ez-se uma diluição 1:100
da cul u a sa u ada, em 20 ml LB. A cul u a oi incubada a 37ºC, com agi ação, a é uma
densidade ó ica a 600 nm (DO600) de 0,3-0,5. A cul u a oi en ão cen i ugada a 3000
xg, du an e 10 minu os, a 4ºC. O sob enadan e oi ejei ado e o sedimen o essuspenso
cuidadosamen e em 1 ml de TSS io (10% PEG, 5% DMSO, 50 mM MgSO4, em meio
LB).
A um ubo eppendo de 1,5 ml a e ecido em gelo, o am adicionados 100 μl da
suspensão de células e 5 μl da mis u a de ligação. A mis u a man e e-se em gelo
du an e 30 min, sendo em seguida subme ida a choque é mico du an e 90 segundos a
42ªC e colocada no amen e em gelo 5 min. Adiciona am-se en ão 900 μl de meio LB
líquido à suspensão, seguindo-se uma incubação a 37ºC, com agi ação sua e (100 pm)
du an e 90 min.
Numa placa de meio LB sólido, i.e. meio LB líquido geli icado com 5% de aga ,
suplemen ado com X-Gal (80 µg/ml), IPTG (20 µg/ml) e ampicilina (100 µg/ml),
Ma e iais e Mé odos
37
p ocedeu-se ao espalhamen o de 100 µl da suspensão bac e iana ans o mada. As
placas o am incubadas a 37ºC, du an e a noi e.
Repica am-se colónias b ancas, i.e. ans o man es possuindo um plasmídeo com o
gene da β-galac osidase in e ompido pela ligação de um inse o, pa a meio LB líquido
(3ml) suplemen ado com ampicilina (100 µg/ml) e incuba am-se, a 37ºC, du an e a
noi e, com agi ação cons an e. As bac é ias o am colhidas po cen i ugação a
13500 pm, 1 min, o sob enadan e decan ado e o sedimen o essuspenso em 300µl de TE
(10mM T is, 1 mM EDTA, pH 7,4) com 10µg/ml de RNAse.
A cada amos a o am adicionados 300 µl de solução de lise (NaOH
200mM/1%SDS), que se mis u a am po in e são, seguiu-se a neu alização com 300 µl
de 3M NaOAc, pH 5,5, a 4ºC), igualmen e mis u ado po in e são. A suspensão oi
cen i ugada a 16000 xg, 15 min, e o sob enadan e ans e ido pa a no os ubos, onde o
DNA plasmídico em suspensão oi p ecipi ado, a a és da adição de igual olume de
isop opanol e cen i ugação a 16000 xg, 30 min. O sedimen o oi la ado com 500 µl de
e anol a 70% ( / ), seco po cen i ugação sob ácuo e essuspenso em 30 µl de água.
Pa a a iden i icação dos ans o man es con endo o inse o do amanho p e endido,
p ocedeu-se à diges ão enzimá ica dos plasmídeos ex aídos com a enzima de es ição
EcoRI (The mo Fishe Scien i ic Inc., Massachuse s, EUA). A mis u a de eação oi ei a
de aco do com as indicações do ab ican e. Após diges ão, analisou-se o pe il ele o o é ico
dos p odu os em gel de aga ose (1% p/ ). Os plasmídeos com o amanho de inse o co e o
o am selecionados pa a sequenciação.
2.7 Pu i icação e Sequenciação dos P odu os de PCR
De modo a se possí el sequencia os p odu os ob idos po PCR, mui os deles
i e am de se subme idos a um p ocesso de pu i icação após sepa ação elec o o é ica e
emoção da a ia de gel com a banda do amanho espe ado. Pa a al, u ilizou-se o ki
“Zymoclean™ Gel DNA Reco e y” (Zymo Resea ch, EUA), seguindo indicações do
ab ican e. No caso dos adeno í us e as o í us, o DNA oi eluído em 10 µl de DNA
Ma e iais e Mé odos
38
Elu ion Bu e . Pa a e i ica o g au de pu i icação dos p odu os ob idos, es es o am
analisados po ele o o ese em gel de aga ose. A pu i icação dos p odu os de PCR de
no o í us oi ealizada pela emp esa STAB VIDA (Capa ica, Po ugal) di e amen e a
pa i da mis u a de eação.
A sequenciação dos p odu os ampli icados oi ealizada ambém na STAB VIDA,
pelo mé odo de Sange . Pa a al, o am u ilizados os p ime s GT2F pa a os adeno í us,
panAV-R1 e Mon69 pa a os as o í us, e NVG1 e G2SKF pa a os no o í us. Pa a a
sequenciação dos p odu os clonados em pGEM®-T Easy, oi u ilizado o p ime T7.
2.8 Análise es a ís ica
Todos os dados ecolhidos dos ques ioná ios o am u ilizados na cons ução de uma
base de dados. Os dados o am analisados com o so wa e SPSS (S a is ical Package o
he Social Sciences), e são 17.0 (IBM SPSS, Chicago, USA). Pa a a análise e
compa ação das a iá eis eco eu-se a es es de equência, Qui-quad ado (χ2), T- es ,
es e exa o de Fishe e ANOVA. Nes a análise es a ís ica, o limi e de signi icância
es a ís ica conside ado oi de 95% (p<0,05).
Os pa âme os an opomé icos o am calculados com ecu so ao p og ama WHO
An h o, e são 3.2.2 (WHO, Suíça), disponí el pa a download no si e da OMS (152).
No p og ama são in oduzidos dados como a da a de nascimen o, o sexo, o peso, a
al u a e a da a em que a c iança eco eu à unidade de saúde. O p og ama calcula assim,
o Índice de Massa Co po al (IMC), e os Z-sco es ela i os ao es ado de malnu ição
(peso em elação à idade), es ado de nanismo (comp imen o em elação à idade) e
es ado de mag eza (peso em elação à al u a). Segundo es e sis ema de classi icação,
quando o alo de Z-sco e pa a o es ado de malnu ição o <-2 SD (s anda d de ia ion)
ou <-3SD, a c iança é conside ada malnu ida ou g a emen e malnu ida,
espe i amen e.
Ma e iais e Mé odos
39
A escala do cálculo de g a idade dos episódios de gas oen e i e e e como base o
sis ema de 20 pon os, desc i o po Nakagomi e al. (153). A pon uação oi a ibuída
segundo a Tabela 6.1, em anexo.
2.9 Análise de sequências nucleo ídicas
Os c oma og amas co esponden es às di e sas eações de sequenciação o am
en iados pela STAB VIDA. Os mesmos o am analisados, e as sequências
nucleo ídicas, se necessá io, co igidas manualmen e a a és do p og ama BioEdi
Sequence Alignmen Edi o , e são 7.2.5 (Ibis Biosciences, Cali ó nia, USA), disponí el
pa a download no si e (154). Na edição de algumas sequências oi ambém u ilizado o
p og ama GeneDoc, e são 2.7 (155).
As sequências edi adas dos ês í us o am sujei as a uma pesquisa no p og ama
BLAST (Basic Local Alignmen Sea ch Tool), disponí el no si e do NCBI (Na ional
Cen e o Bio echnology In o ma ion; h p://blas .ncbi.nlm.nih.go /Blas .cgi) (156). As
sequências em es udo o am compa adas com sequências inse idas na base de dados do
NCBI, de modo a iden i ica as que ap esen a am maio homologia. A a és da
pe cen agem de simila idade, oi possí el de e mina o genó ipo p o á el das
sequências dos í us, e iden i ica as sequências de e e ência a u iliza na cons ução de
á o es ilogené icas, designadamen e as que ap esen am maio iden idade ou que
ci culam em á eas geog a icamen e p óximas.
As sequências nucleo ídicas dos no o í us, pa a além de e em sido sujei as a uma
análise BLAST, o am ambém analisadas na e amen a RIVM, (do holandês,
Rijksins i uu oo Volksgezondheid en Milieu), e são 1.0, disponí el no si e No oNe
(h p://www. i m.nl/en/Topics/N/No oNe ) (157). Com es a e amen a oi possí el
de e mina o genó ipo p o á el de no o í us, e quais sequências com maio iden idade,
ela i amen e a cada uma das sequências em es udo.
Pa a con i ma os esul ados de geno ipagem ob idos nas e amen as
bioin o má icas, o am cons uídas á o es ilogené icas pa a sequências pa ciais do

Ma e iais e Mé odos
40
gene do hexão dos adeno í us, da ORF1b e da ORF2 dos as o í us, e pa a a egião NS
da ORF2 dos genog upos I e II dos no o í us. Pa a a cons ução das di e en es á o es
ilogené ica, as sequências nucleo ídicas em es udo o am alinhadas com sequências de
e e ência co esponden es pa a os di e en es genó ipos de cada í us. Pa a al, oi
u ilizada a aplicação Clus alW, do p og ama BioEdi Sequence Alignmen Edi o . Os
alinhamen os múl iplos ob idos o am depois u ilizados no so wa e MEGA (Molecula
E olu iona y Gene ics Analysis), e são 6, disponí el pa a download no si e (158). O
mé odo u ilizado oi o Neighbo -Joining com o modelo de 2 pa âme os de Kimu a. Nas
p e e ências de análise oi ambém selecionada a opção de deleção comple a, semp e
que no alinhamen o exis iam espaços. A obus ez de in e ência ilogené ica e,
consequen emen e, das opologias suge idas oi a aliada a a és do mé odo de
boo s apping, com base em 1000 amos agens alea ó ias, conside ando-se
es a is icamen e signi ica i os alo es iguais ou supe io es a 75%.
As sequências nucleo ídicas ob idas no decu so do abalho encon am-se em ase
de submissão à base de dados GenBank.
Resul ados
41
3. RESULTADOS
3.1 Ca ac e ização Demog á ica e Clínica da População Es udada
No es udo da in eção po adeno í us, as o í us e no o í us o am analisadas 222
amos as de ezes de c ianças com sin oma ologia de GEA, não in e adas po o a í us,
que eco e am a unidades de saúde em qua o p o íncias de Angola em 2012 e 2013. A
odas as c ianças que pa icipa am no es udo oi ealizado um inqué i o demog á ico e
clínico (Anexo 6.2). Con udo, dos 222 inqué i os ealizados, apenas se e e acesso a
108 (48,6% da amos agem) (Tabela 3.1).
Tabela 3.1 Dis ibuição do núme o de c ianças com GEA e espe i os inqué i os po
ins i uição de saúde Angolana (2012 e 2013)
Núme o de
C ianças
Núme o de Inqué i os
Disponí eis
Cabinda
Hospi al Municipal de Chinga (HMC)
35
34
Zai e
Hospi al Municipal de M'Banza Kongo
(HMMK)
10
5
Cen o de Saúde Ma e no-In an il de
M'Banza Kongo (CSMI)
6
6
Luanda
Cen o de Saúde da Paz (CSP)
17
17
Huambo
Hospi al do Al o-Hama (AH)
15
4
Hospi al Municipal de Caála (C)
55
14
Cen o de Saúde de Calenga (CAL)
6
6
Cen o de Saúde do Casseque III (CIII)
3
3
Hospi al Municipal de Bailundo (B)
30
10
Cen o de Saúde Ma e no-In an il de
Minei a (M)
45
9
To al
222
108
Resul ados
42
Rela i amen e às ca ac e ís icas demog á icas, 55% (57/103) das c ianças
inqui idas pe encem ao sexo masculino e 45% (46/103) ao sexo eminino. A idade das
c ianças a iou num in e alo de 1 a 51 meses, sendo a média de idades de 12,4 meses.
A maio ia das c ianças, 89,8% (97/108), encon a a-se na aixa e á ia de 0 a 24 meses,
inclusi e, e apenas 10,2% (11/108) inha mais de 24 meses. Em elação ao local de
habi ação, 77% (81/105) das c ianças esidia em meio u bano, e 23% (24/105) em meio
u al (Tabela 3.2).
A ní el alimen a , 74,8% (80/107) das c ianças es a a a se amamen ada. Des e
g upo, 84,3% (43/51) inge ia ou os alimen os pa a além do lei e ma e no, e 15,7%
(8/51), e a exclusi amen e amamen ada. Ce ca de 25% (27/107) das c ianças não es a a
a se amamen ada (Tabela 3.2).
Em e mos de ca ac e ís icas clínicas, odas as c ianças inham dia eia, uma ez
que es e e a um dos a o es de inclusão do es udo. Em média, as c ianças inham
dia eia du an e 3,4 dias e ce ca de 3,5 episódios po dia. Ce ca de me ade da população
em es udo inha ómi os (46/103), com du ação média de 2,5 dias e 2,5 episódios em
24h, espe i amen e. Apenas 11,8% (11/93) das c ianças possuía uma empe a u a axial
igual ou supe io a 37,6ºC e mais de me ade das c ianças não ap esen a a desid a ação
(53,5%) nem malnu ição (72,2%). O es ado de a i idade das c ianças oi ambém
a aliado, e ce ca de 25% (25/103) ap esen a a um es ado de a i idade “ eduzido”. Em
média, a população ap esen a a um índice de massa co po al (IMC) de 16,3 e um g au
de g a idade de dia eia de 6,71 (Tabela 3.2). A análise do g au de g a idade da dia eia
mos ou que as c ianças com idade igual ou in e io a 24 meses ap esen a am um alo
médio pa a a g a idade dos sin omas ligei amen e supe io (6,81 pon os), quando
compa ado com c ianças com mais de 24 meses (5,85 pon os), con udo, es es esul ados
não são es a is icamen e signi ica i os (p- alue 0,392).
E e uou-se uma a aliação do es ado nu icional das c ianças e e i icou-se que mais
de me ade das c ianças ap esen a a peso e es a u a no mais pa a a idade e um peso
no mal pa a a al u a (Z > -2SD). Po ém, 26,2% das c ianças ap esen a a um peso baixo
em elação à idade, 36,2% uma es a u a baixa em elação à idade e 26,9% um peso
baixo em elação à al u a (-3SD < Z < -2SD). Nenhuma c iança se encon a a em
es ado g a e (Z < -3SD) pa a os ês pa âme os a aliados (Anexo 6.4).
Resul ados
43
Tabela 3.2 - Ca ac e ís icas da população al o e elação com a in eção po adeno í us,
as o í us e/ou no o í us
Va á eis
Ca ego ias
Nº de c ianças
inqui idas (%)
C ianças
in e adas
(%)
p-
alue
Ca ac e ís icas Demog á icas
Géne o (n=103)
Masculino
57 (55,3)
9 (29)
0,001*
Feminino
46 (44,7)
22 (71)
Idade (n=108)
0-24
97 (89,8)
29 (85,3)
0,317*
>24
11 (10,2)
5 (14,7)
Local de Residência
(n=105)
U bano
81 (77,1)
26 (81,3)
0,618*
Ru al
24 (22,9)
6 (18,8)
Ca ac e ís icas da Alimen ação
Amamen ação (n=107)
Sim
80 (74,8)
23 (67,6)
0,339*
Não
27 (25,2)
11 (32,4)
Amamen ação e inges ão
de ou os alimen os?
(n=51)
Lei e ma e no e
ou os alimen os
43 (84,3)
12 (92,3)
0,662*
Amamen ação
exclusi a
8 (15,7)
1 (7,7)
Ca ac e ís icas Clínicas
Feb e (n=93)
<37,6ºC
82 (88,2)
25 (96,2)
0,173*
≥37,6ºC
11 (11,8)
1 (3,8)
Se ≥37,6ºC, du ação
média (dias)
2,8
2,5
0,645#
Dia eia
Du ação média (dias)
3,4
3,0
0,193#
Nº ezes/24ho as (média)
3,5
3,7
0,396#
Vómi os (n=103)
Sim
46 (44,7)
14 (42,4)
0,833*
Não
57 (52,8)
19 (57,6)
Du ação média (dias)
2,5
2
0,155#
Nº ezes/24ho as (média)
2,5
2,5
0,842#
Desid a ação (n=101)
Sim
47 (46,5)
14 (43,8)
0,831*
Não
54 (53,5)
18 (56,3)
A i idade (n=103)
No mal
78 (75,7)
26 (78,8)
0,806*
Reduzida
25 (24,3)
7 (21,2)
Malnu ição (n=97)
Sim
27 (27,8)
8 (26,7)
0,535*
Não
70 (72,2)
22 (73,3)
Índice de Massa Co po al
(média)
16,3 ± 4,5
15 ± 3,6
0,089#
G au de G a idade da
dia eia a) (média)
6,71 ± 3,7
6,03 ± 2,9
0,187#
a) Classi icação segundo a escala de 20 pon os de Nakagomi (153)
* Foi u ilizado o es e es a ís ico exa o de Fishe pa a o c uzamen o de dados e pa a de e mina o alo de
signi icância dos mesmos
# Foi u ilizado o es e es a ís ico T-S uden pa a compa a alo es médios e de e mina o alo de
signi icância dos mesmos
O limi e de signi icância es a ís ica é de 5%. Os alo es de p<0,05 es ão assinalados a neg i o.
Resul ados
50
genó ipos HAdV-1, -2, -5, -9, -15/29, -18, 26, -27, -40, -41 e -61, endo-se con i mado
po in e ência ilogené ica os esul ados da pesquisa BLAST. Os onze genó ipos
iden i icados co espondem a qua o espécies di e en es, A, C, D e F. Na Fig. 3.6 es á
ap esen ada g a icamen e a p e alência dos di e en es genó ipos iden i icados.
A maio ia das es i pes de adeno í us Angolanas (n=11) pe ence à espécie F, da
qual azem pa e os genó ipos 40 e 41 conhecidos como adeno í us en é icos. Os í us
M8, B34, B4 e AH8 ap esen am 100% de simila idade com a es i pe Dugan ci culan e
no Japão (AB330121/Hu/AdV-40/Dugan/JPN/2000) e 99,8% com a es i pe Thai15139
da Tailândia (FJ228470/Hu/AdV-40/Thai15139/THA/2003), ambas pe encen es ao
genó ipo HAdV-40. Os adeno í us classi icados como HAdV-41 são mais abundan es
(n=7). Pela opologia da á o e oi possí el obse a a o mação de dois subg upos de
HAdV-41, GTC-1 e GTC-2 (GTC, genome ype clus e ). Em GTC-1, as sequências
HMC8, HMC15, HMC27 e HMC28 ap esen am simila idade ≥ 99,2% ela i amen e à
es i pe Tak (DQ315364/Hu/AdV-41/Tak/NED/2008). Em GTC-2 su gem as sequências
B38 e M57 que es ão es ei amen e elacionadas com uma sequência de adeno í us da
Índia (HQ005281/Hu/AdV-41/500860/IND/2008). Nes e clus e a sequência
nucleo ídica B25 ap esen a maio simila idade (99,6%) com uma es i pe de o igem
Alemã (EF110983/Hu/AdV-41/G-A13/GER/2007).
Em elação à espécie A dos adeno í us, onde es ão incluídas apenas duas
sequências i ais Angolanas, a sequência CSP5 ag upa-se com as sequências de
e e ência do genó ipo 18. Quan o à amos a CAL3, po BLAST oi classi icada como
HAdV-8 ou -61. Po análise ilogené ica con i mou-se es a sequência como sendo de
HAdV-61, uma ez que es á es ei amen e elacionada com JF964962/Hu/AdV-
61/5082/JPN/2004, única e e ência pa a es e genó ipo nas bases de dados. Pela análise
de dis âncias, na egião analisada CAL3 é 98,1% simila a es e í us iden i icado no
Japão.
Na espécie C de adeno í us, o am iden i icadas no o al sequências des es í us em
seis amos as Angolanas, as quais se ag upam com sequências dos genó ipos HAdV-1, -
2 e -5. A amos a HMC2 o ma um g upo mono ilé ico com as sequências de e e ência
pa a o genó ipo HAdV-2. Já as amos as geno ipadas como HAdV-1 (CSP21, CIII4,
M11, M29) o mam um subg upo, supo ado po um alo de boo s ap de 87%,

Resul ados
51
sepa ado das sequências de e e ência. Cu iosamen e es e g upo de sequências
ap esen a a um p odu o de PCR com um amanho ligei amen e supe io ao das
es an es amos as. CSP9 é a única sequência Angolana classi icada como HAdV-5.
Rela i amen e às sequências classi icadas como genó ipos da espécie D, duas
ag upa am-se com as sequências de e e ência do genó ipo HAdV-26. Es as amos as
o am colhidas em unidades de saúde dis in as, con udo es ão es ei amen e elacionadas
en e si. A sequência B39 ag upa-se com as sequências HAdV-27 e a sequência HMC11
o ma um subg upo, supo ado po um alo de boo s ap de 100%, com as sequências
nucleo ídicas de e e ência pa a o HAdV-9. A sequência CSP11 em uma simila idade
de 100% com as e e ências HAdV-15 e HAdV-29, as quais não o mam amos
sepa ados nes a egião analisada.
Resul ados
52
Figu a 3.5 Á o e ilogené ica baseada numa egião do gene do hexão de adeno í us (loop 1,
904 n ), que ilus a as elações ilogené icas en e as es i pes p esen es nas amos as de Angola
(2012/2013), e as sequências de e e ência p esen es nas bases de dados. De aco do com as
sequências de e e ência de Li e al. no genó ipo HAdV-41 es ão ep esen ados dois GTC
(Genome Type Clus e s) (159). A á o e ilogené ica oi cons uída pelo mé odo de Neighbo -
Joining a pa i de dis âncias es imadas pelo mé odo de Kimu a a dois pa âme os. A obus ez
da in e ência ilogené ica oi es ada po boo s aping de 1000 eplicados, sendo ap esen ados
apenas os alo es ≥ 75%.
Resul ados
53
Figu a 3.6 Rep esen ação g á ica da axa de de eção (%) dos ipos de adeno í us de e minados
em c ianças <5 anos, em Angola (2012/2013).
3.5 As o í us: di e sidade de genó ipos ci culan es e po enciais í us
ecombinan es
Pa a as amos as que nos ensaios de ELISA o am conside adas posi i as pa a
as o í us p ocedeu-se à de eção do genoma i al po RT-PCR endo como al o de
ampli icação uma sequência pa cial (≈420 n ) do gene de RdRp (ORF1b). Das 11
amos as posi i as po ELISA, oi possí el ob e p odu os de ampli icação com o
amanho espe ado pa a oi o (Figu a 3.7). M16 e HMC35 ap esen a am um pad ão
ele o o é ico di e en e das es an es amos as. A al e ação das condições de
ampli icação, ais como a iação da empe a u a de empa elhamen o dos p ime s, não
esul ou na ampli icação de uma banda especí ica com o amanho p e endido. Tal
pode á de e -se a deg adação do RNA i al da amos a ou à inadequação dos p ime s
usados.
17%
4%
4%
4%
4%
4%
9%
4%
17%
29%
4%
HAdV-1
HAdV-2
HAdV-5
HAdV-9
HAdV-15/29
HAdV-18
HAdV-26
HAdV-27
HAdV-40
HAdV-41
HAdV-61
Resul ados
54
Figu a 3.7 P odu os de ampli icação po RT-PCR de uma sequência pa cial do gene de RdRp
(ORF1b) de as o í us; M = Ma cado de amanho molecula GeneRule ™ 100bp Plus DNA
Ladde , The mo Fishe Scien i ic Inc., Massachuse s, EUA; CN1s = Con olo Nega i o com
p odu o de eação p o enien e da 1ª eação; CN2nd = Con olo Nega i o da 2ª eação.
Pa a além da egião ORF1b, ambém se ampli icou a egião 5’ da ORF2
codi icado a da p o eína da cápside VP1 dos as o í us Angolanos, uma ez que es a
egião ap esen a maio a iabilidade gené ica, sendo consequen emen e mais adequada
à geno ipagem des es í us. Na segunda eação de ampli icação de hemi-nes ed PCR
ob i e am-se p odu os com mobilidade ele o o é ica compa í el com o amanho
espe ado de ≈450pb apenas pa a 7 amos as (Fig. 3.8). As amos as M16 e HMC35,
cujo amanho do p odu o de ampli icação da ORF1b não e a compa í el com a p esença
de as o í us, e HMC8 não de am o igem a um p odu o de ampli icação especí ico pa a
a ORF2.
Resul ados
55
Figu a 3.8 Pe il ele o o é ico dos p odu os ampli icados po hemi-nes ed-PCR endo como
al o a egião 5’ da ORF2 (450 n ) de as o í us; M = Ma cado de amanho molecula
GeneRule ™ 100bp Plus DNA Ladde The mo Fishe Scien i ic Inc., Massachuse s, EUA;
CN2nd = Con olo Nega i o da 2ª eação.
Os p odu os de RT-PCR pa a os genes codi icado es da ORF1b (n=8) e da ORF2
(n=7) o am sequenciados com os p ime s panAV-R1 e Mon69, espe i amen e. Após
edição, as sequências nucleo ídicas ob idas o am sujei as a uma pesquisa de homologia
com sequências disponí eis na base de dados NCBI, usando a e amen a Nucleo ide
BLAST, cujos esul ados es ão ap esen ados no Anexo 6.8. As sequências em es udo
ap esen a am uma iden idade ≥ 94% com as sequências de e e ência, sendo possí el
iden i ica , p o iso iamen e, 2 genó ipos de as o í us di e en es pa a a egião da
ORF1b, HAs V-1 e HAs V-2.
De modo a con i ma os genó ipos ob idos po BLAST, p ocedeu-se à cons ução
de uma á o e ilogené ica com as sequências das amos as Angolanas e as sequências
de e e ência (Fig.3.9). Globalmen e, es a á o e e ela um baixo g au de in e ência
ilogené ica, não ha endo gene icamen e uma sepa ação dis in a de ag upamen os de
sequências co esponden es a di e en es genó ipos supo ados po alo es de boo s ap
≥75%. As amos as M36 e HMC8 su gem ag upadas com sequências de e e ência pa a
o HAs V-2. No en an o, es as duas sequências su gem em posições bem dis in as da
á o e (Fig. 3.9). HMC8 e a sequência de e e ência com a qual ap esen a maio
simila idade (KF039910/HAs V-2/Rus-Nsc05-430/RUS/2005) o mam um
ag upamen o com HAs V-3, ainda que supo ado po um alo de boo s ap in e io a
75%. De ac o as duas sequências com maio simila idade com HMC8 po BLAST

Resul ados
56
(FJ842147 e KF039911) são ecombinan es em que a ORF1b su ge classi icada como
HAs V-3 (84) (85). As es an es 6 sequências de as o í us su gem em dois
ag upamen os sepa ados den o de um conjun o de es i pes classi icadas como HAs V-
1. Assim, CSP17, M47, C31 e B20 ap esen a am uma simila idade en e 97,3 e 98,3%
com uma sequência Indiana (AB308374/Mamas o i us 1/V1347/IND/2004), e as
sequências B19 e B23 uma simila idade ≥97% com uma sequência Nepalesa
(GQ441163/HAs V-1/NE-3086/NGA/2006).
Figu a 3.9 Análise ilogené ica das sequências nucleo ídicas da egião 3’ ORF1b de as o í us
(403 n ) p esen es nas amos as de Angola (2012/2013), e das sequências de e e ência
p esen es nas bases de dados. A á o e ilogené ica oi cons uída pelo mé odo de Neighbo -
Joining a pa i de dis âncias es imadas pelo mé odo de Kimu a a dois pa âme os. A obus ez
da in e ência ilogené ica oi es ada po boo s aping de 1000 eplicados, sendo ap esen ados
apenas os alo es ≥ 75%.
Resul ados
57
A pesquisa BLAST pa a as 7 sequências da ORF2 Angolanas e ela am iden idade
≥ 95% com as sequências de e e ência (Anexo 6.8). A a és des e algo i mo, nes as
amos as o am iden i icados p o iso iamen e 3 genó ipos de as o í us, HAs V-1, -3 e -
5. Pa a con i ma es es esul ados de geno ipagem e es abelece elações ilogené icas
en e os as o í us Angolanos e des es com ou os as o í us com sequências
deposi adas na base de dados NCBI, cons uiu-se a á o e ilogené ica mos ada na Fig.
3.11. Con a iamen e ao obse ado pa a a ORF1b, a á o e ilogené ica da ORF2
ap esen a um ele ado g au de in e ência ilogené ica es ando os ag upamen os de
sequências co esponden es aos di e en es genó ipos supo ados po alo es de
boo s ap ≥99%. As sequências da ORF2 de as o í us Angolanas dis ibuem-se po
ês genó ipos, HAs V-1, -3 e -5, endo con i mado os genó ipos a ibuídos com base na
pesquisa BLAST. A Fig. 3.10 ep esen a a p e alência dos di e en es genó ipos da
ORF2 dos as o í us de e ados em amos as Angolanas.
Figu a 3.10 Rep esen ação g á ica da axa de de eção (%) dos genó ipos de as o í us (ORF2)
de e minados em c ianças <5 anos, em Angola (2012/2013).
As sequências B20 e C31 o mam um ag upamen o com as sequências
nucleo ídicas de e e ência pa a o genó ipo 1 dos as o í us. Ambas as sequências
ap esen am 97% de simila idade com a sequência de as o í us Aus aliana
(AF175253/HAs V-1/Melb1E/AUS/1999), o mando uma linhagem dis in a da
e e ência da es i pe Ox o d. Si uação semelhan e su ge no clus e de HAs V-3, onde as
28,5%
28,5%
43,0%
HAs V-1
HAs V-3
HAs V-5
Resul ados
58
sequências das amos as B19 e B23 ap esen am um g au de semelhança ≥ 95% com a
sequência do isolado Tunisie e o mando um g upo mono ilé ico sepa ado da es i pe
Ox o d pa a es e genó ipo.
Figu a 3.11 Á o e ilogené ica baseada na egião 5’ da ORF2 de as o í us (448n ), que ilus a
as elações ilogené icas en e as sequências nucleo ídicas de as o í us p esen es nas amos as
de Angola (2012/2013), e as sequências de e e ência p esen es nas bases de dados. A sequência
co esponden e da es i pe FJ402983 de As V-MLB1 oi usada como ou g oup. A á o e
ilogené ica oi cons uída pelo mé odo de Neighbo -Joining a pa i de dis âncias es imadas
pelo mé odo de Kimu a a dois pa âme os. A obus ez da in e ência ilogené ica oi es ada po
boo s aping de 1000 eplicados, sendo ap esen ados apenas os alo es ≥ 75%.
Também no clus e de HAs V-5, pa ece exis i duas linhagens. As amos as CSP17
e M47 ap esen am um g au de simila idade de 97% e 98% com o isolado iden i icado
na Rússia em 2010 (JF929196/HAs V-5/isola e 1825/RUS/2010). A sequência da
amos a M36 su ge sepa adamen e nou o ag upamen o, sendo 96% idên ica à
sequência da es i pe Ox o d (U15136/HAs V-5/Ox o d/1994).
Quando compa amos a dis ibuição das sequências de as o í us Angolanas nas
duas á o es ilogené icas cons uídas, obse amos uma opologia dis in a, não só na
Resul ados
59
o ma como se ag upam en e si como no ag upamen o com sequências de e e ência
dos di e en es genó ipos pa a as duas egiões analisadas. Na á o e da ORF1b (Fig.
3.11), CSP17, M47, C31 e B20 es ão es ei amen e elacionadas en e si, o mando um
g upo den o do conjun o de sequências de e e ência conside adas HAs V-1, enquan o
na á o e da ORF2, CSP17 e M47, embo a man endo-se associadas, su gem no
ag upamen o de HAs V-5 (Fig. 3.12), suge indo a a em-se de í us ecombinan es.
Po ou o lado, B20 e C31 con inuam a su gi es ei amen e elacionadas e den o dos
HAs V-1. Rela i amen e às sequências B19 e B23, man êm-se associadas nas duas
á o es mas su gem em ag upamen os de genó ipos di e en es, HAs V-1 pa a a ORF1b
e HAs V-3 pa a a ORF2. Es a di e ença de pad ão de dis ibuição ilogené ica suge e
no amen e que es amos pe an e í us po encialmen e ecombinan es. Iden icamen e, a
sequência M36 classi icada como HAs V-2 pa a a ORF1b, su ge classi icada como
HAs V-5 pa a a ORF2. No en an o, na á o e da ORF1b as sequências de HAs V-2
es ão dispe sas sem qualque ipo de ag upamen o mesmo que supo ado po um alo
de boo s ap baixo. Po ém, de e-se salien a que nas duas á o es o posicionamen o
des a sequência é mui o dis in o ela i amen e às ou as sequências Angolanas.
Resumindo, a análise ilogené ica e e uada suge e pu a i as o mas ecombinan es en e
HAs V-1 e HAs V-5 pa a os í us CSP17 e M47, en e HAs V-1 e HAs V-3 pa a B19 e
B23 e ainda en e HAs V-2 e HAs V-5 pa a M36.
3.6 Genó ipos dos no o í us ci culan es
Pa a a de e minação dos genó ipos de no o í us nas amos as es udadas, p ocedeu-
se à ampli icação da egião NS do genoma i al, endo como ma iz cDNA com o igem
em 37 amos as onde es e í us oi de e ado po RT-PCR em empo eal. Na Fig. 3.12
es á ap esen ado um pad ão de mig ação ípico pa a os p odu os de ampli icação dos
no o í us GI. A banda com o amanho espe ado (ce ca de 380 pb) oi obse ada pa a
odas as amos as. Igualmen e, as 30 amos as posi i as po RT-PCR em empo eal
pa a no o í us GII, ampli ica am po nes ed-PCR uma banda com o amanho espe ado
Resul ados
66
amos as de Angola (2012/2013), e as sequências de e e ência p esen es nas bases de dados. A
sequência co esponden e da es i pe M87661 de no o í us humano GI.1 oi u ilizada como
ou g oup. Á o e ilogené ica cons uída pelo mé odo de Neighbo -Joining a pa i de
dis âncias es imadas pelo mé odo de Kimu a a dois pa âme os. A obus ez da in e ência
ilogené ica oi es ada po boo s aping de 1000 eplicados, sendo ap esen ados apenas os
alo es ≥ 75%.
3.7 Epidemiologia da in eção pelos di e en es genó ipos de
adeno í us, as o í us e no o í us
De e minados os genó ipos de adeno í us, as o í us e no o í us, p ocedeu-se a
um c uzamen o de dados dos mesmos com as in o mações clínicas e demog á icas
A ní el de dis ibuição geog á ica dos di e en es genó ipos, oi na egião do
Huambo onde se e i icou uma maio di e sidade de adeno í us (Fig. 3.17). Os
adeno í us da espécie F, designados como en é icos, o am de e ados apenas nas
p o íncias de Cabinda e de Huambo. O genó ipo mais abundan e, HAdV-41 oi
iden i icado em amos as de cabinda e do Huambo, sendo os í us do subg upo GTC-2
unicamen e de e ados em Cabinda. Menos equen es, os HAdV-40 o am apenas
de e ados no Huambo. Na p o íncia do Zai e oi de e ada apenas uma amos a posi i a
pa a adeno í us, co espondendo a HAdV-26 (Figu a 3.17).
As c ianças in e adas po HAdV da espécie F, não ap esen a am eb e, inham, em
média, 3,71 episódios de dia eia ao longo de 2,71 (±0,76) dias. As in e adas po ou as
espécies de adeno í us ap esen a am, em média, dia eias mais p olongadas (3,43 ±
1,13 dias). As c ianças in e adas com HAdV40 e HAdV41 ap esen a am mais episódios
diá ios de ómi os, e du an e mais dias, em compa ação com as c ianças in e adas com
ou os adeno í us, mas sem signi icado es a ís ico (p= 0,492 e p=0,440). Quando
compa ado o g au de g a idade da dia eia en e es es dois g upos, as c ianças in e adas
com HAdV espécie F, ap esen a am um g au mais ele ado (7,43 ± 3,10, s 4,50±2,51),
e com uma di e ença es a is icamen e signi ica i a (p=0,048) (Anexo 6.10).

Resul ados
67
Figu a 3.17 Rep esen ação g á ica da dis ibuição geog á ica dos di e en es ipos de adeno í us
em c ianças <5 anos, em Angola (2012/2013).
No que espei a à dis ibuição geog á ica dos genó ipos de as o í us (ORF2), no
Huambo obse ou-se uma dis ibuição equi a i a dos 3 genó ipos iden i icados (Fig.
3.19). Na egião de Luanda oi iden i icada uma amos a com HAs V-5. Não o am
de e ados as o í us na p o íncia do Zai e e em Cabinda oi iden i icada uma es i pe do
genó ipo 3 pa a a ORF1b.
Quan o a uma análise da associação en e ca ac e ís icas demog á icas e clínicas
com os di e en es genó ipos indi iduais de as o í us, es a não oi possí el e e ua
de ido ao núme o eduzido de amos as de e adas e geno ipadas (Fig. 3.18).
Figu a 3.18 Rep esen ação g á ica da dis ibuição geog á ica dos di e en es ipos de as o í us
(pa a a egião genómica ORF2) em c ianças <5 anos, em Angola (2012/2013).
0
1
2
3
4
5
Cabinda Zai e Luanda Huambo
HAdV-1
HAdV-2
HAdV-5
HAdV-9
HAdV-15/29
HAdV-18
HAdV-26
HAdV-27
HAdV-40
HAdV-41
HAdV-61
0
1
2
3
Luanda Huambo
HAs V-1
HAs V-3
HAs V-5
Resul ados
68
Rela i amen e à dis ibuição geog á ica da in eção po no o í us (Fig. 3.19),
obse ou-se uma maio di e sidade de genó ipos ci culan es na egião do Huambo,
sendo es a a única egião onde o am de e ados no o í us GI. As es i pes GII.4 o am
iden i icadas em odas as egiões es udadas, sendo as únicas de e adas no Zai e.
Figu a 3.19 Rep esen ação g á ica da dis ibuição geog á ica dos di e en es ipos de no o í us
(pa a a egião NS da ORF2) em c ianças <5 anos, em Angola (2012/2013).
Em elação às ca ac e ís icas clínicas das c ianças in e adas com no o í us,
nenhuma das c ianças inqui idas in e adas com o í us inha uma empe a u a ≥37,6ºC.
En e as c ianças in e adas com NoV GII.4 ou NoV não-GII.4, não se obse ou
di e ença ela i amen e ao núme o de episódios de dia eia ou du ação da mesma, bem
como pa a o núme o de episódios de ómi os e a du ação (em dias) dos mesmos. A
equência de c ianças desid a adas, e o ní el de a i idade das mesmas, oi idên ica
en e c ianças in e adas com NoV GII.4 ou NoV não-GII.4. Quan o ao g au de
g a idade da dia eia, es e oi semelhan e en e os dois g upos de c ianças in e adas
(Anexo 6.10).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Cabinda Zai e Luanda Huambo
GI.3
GI.5
GII.1
GII.2
GII.3
GII.4
GII.6
GII.7
GII.9
GII.14
GII.16
Discussão e Conclusões
69
4. DISCUSSÃO e CONCLUSÕES
Dados de 2010 e elam que em Angola, a dia eia é a causa de 15% das mo es em
c ianças com idade in e io a 5 anos de idade (11). Es ima-se que os o a í us sejam
esponsá eis po um e ço das mo es de ido à dia eia, sendo as es an es de idas a
ou os í us en é icos, bac é ias, pa asi as, helmin as e p o ozoá ios (1) (148). Nes e
es udo p e endemos documen a a epidemiologia das in eções en é icas pediá icas em
a ias egiões des e país e a di e sidade gené ica de adeno í us, as o í us e no o í us,
conside ados, depois dos o a í us, os p incipais agen es e iológicos i ais de dia eia.
Des e es udo ize am pa e 222 amos as de ezes de c ianças com idade in e io a
cinco anos e com GEA que eco e am a di e sas unidades de saúde nas p o íncias de
Cabinda, Luanda, Huambo e Zai e, em Angola em 2012 e 2013. Ce ca de um e ço das
c ianças (29,7%) es a am in e adas com um ou dois dos í us es udados. No conjun o
das amos as analisadas com inqué i os disponí eis (n=108) obse ou-se que 85,3% das
c ianças in e adas inha uma idade meno ou igual a 24 meses, con i mando-se assim a
ele ada p e alência de adeno í us, as o í us e no o í us nos casos de GEA, du an e os
dois p imei os anos de ida, desc i a na li e a u a (18) (43) (78).
A amamen ação em um papel impo an e na p o eção con a a dia eia nas c ianças
de 0-24 meses de idade, sendo supe io nas que inge em exclusi amen e lei e ma e no
(160). Es a p o eção conduz a uma diminuição da incidência e da du ação da dia eia.
Pela análise dos inqué i os e i icou-se que a maio ia das c ianças in e adas es a a a se
amamen ada (67,6%). Po ém, a amamen ação não e a exclusi a, uma ez que 92,3%
das c ianças inge ia ou os alimen os. Ao compa a as c ianças alimen adas com lei e
ma e no e ou os alimen os, com as c ianças exclusi amen e amamen adas, a média da
du ação (em dias) da dia eia é semelhan e (3,95 s. 3,38, p = 0,548). Con udo, a ní el
de episódios diá ios de dia eia, a média é de 3,74 e 2,75 episódios (p = 0,059). Apesa
da associação não se es a is icamen e signi ica i a, as c ianças exclusi amen e
amamen adas i e am menos episódios de dia eia.
Ou os sin omas de GEA como a eb e, ómi os e o es ado de desid a ação e de
malnu ição o am ambém a aliados na população pediá ica es udada, endo-se
Discussão e Conclusões
70
cons a ado que as pe cen agens de c ianças in e adas com es as ca ac e ís icas de GEA
o am in e io es às pe cen agens desc i as em es udos an e io es (20) (22). Segundo a
escala de Nakagomi, os episódios de dia eia com classi icação maio ou igual a 12,
numa escala de 0-20, são ca ego izados como se e os (153). No g upo de c ianças
in e adas, o g au de g a idade dos episódios de dia eia oi de 6,03 ±2,9. A escala de
Nakagomi oi a selecionada pa a es a classi icação, pois os inqué i os engloba am odos
os c i é ios des a escala (Anexo 6.2 e 6.3). Po ém, o alo ob ido pa a o g au de
g a idade da dia eia pode á se uma subes ima i a uma ez que alguns dos inqué i os
não es a am o almen e p eenchidos, sendo o pa âme o co ado com ze o na ausência de
in o mação.
No o al, 29,7% (66/222) das c ianças es a am in e adas com pelo menos um dos
í us. A axa de de eção oi de 11% (24/222) pa a os adeno í us, 5% (11/222) pa a os
as o í us e 17% (37/222) pa a os no o í us. As axas ela i as ob idas es ão de aco do
com es udos an e io es, na medida em que a axa de de eção dos no o í us é supe io à
dos adeno í us, que po sua ez é supe io à dos as o í us (20) (56) (161). Das 66
c ianças in e adas, 6 ap esen a am in eção mis a. Nes e es udo e i icou-se que não
exis e co elação en e a g a idade dos episódios de dia eia e o ac o de se em in eções
po um único agen e e iológico ou in eções mis as (5,97 ± 2,93 s. 6,40 ± 3,05, p =
0,763), si uação ambém encon ada num es udo ealizado no Gana (22).
Na li e a u a, a axa de de eção de adeno í us em populações pediá icas com GEA
é mui o a iá el, podendo oscila en e, po exemplo, ce ca de 37% no Quénia e Ruanda
(17) (162); e 2% no Bangladesh e China (21) (163). A p e alência de 11% es imada
pa a es a população Angolana é semelhan e à encon ada na Á ica do Sul (9,8%), no
Egip o (10,4%) e nos EUA (11,8%) (164) (161) (20). Po ém, pode á se uma
subes ima i a uma ez que usámos dois mé odos de as eio, um es e ápido
imunoenzimá ico (Ce Tes Ro a i us-Adeno i us) que nos pe mi iu de e a 12 amos as
com an igénios de adeno í us num o al de 199 e nes ed-PCR com p ime s uni e sais
que e elou a p esença de DNA de adeno í us em 11 de 24 amos as ecais, suge indo
di e enças de sensibilidade pa a os dois ensaios, à semelhança do que oi desc i o po
ou os au o es (165) (44). Ainda, den o dos es es imunoenzimá icos, a sensibilidade
pode a ia de aco do com a gama de se o ipos al o, sendo mais baixa pa a os di igidos
Discussão e Conclusões
71
apenas con a HAdV-40/41 (17). O ab ican e do es e ápido usado (Ce Tes Bio ec,
Espanha) não desc e e a gama de se o ipos de e ados. No en an o, quando analisamos
os genó ipos de e ados po ambos os mé odos não encon amos di e enças
es a is icamen e signi ica i as, o que é suges i o de se a a de um es e que de e a, de
uma o ma gené ica, adeno í us humanos e não especi icamen e HAdV-40/41. Pa a
além das di e enças na sensibilidade dos es es, ou os pa âme os pode ão se
esponsá eis pelas g andes di e gências nos alo es de p e alência, designadamen e a
se oposi i idade pa a VIH dos indi íduos en ol idos (17).
Nes e es udo, a maio ia das c ianças in e adas com adeno í us inha idade igual ou
in e io a 24 meses (94,1%), esul ado conco dan e com es udos an e io es ealizados
em di e sos con inen es (43) (44) (56) (161). A in eção po adeno í us oi mais
equen e nas c ianças do sexo eminino do que nas do sexo masculino, com uma
di e ença es a is icamen e signi ica i a (p=0.006). Con a iamen e, ou os es udos
demons a am uma in eção p edominan e en e c ianças do sexo masculino (23) (57).
Con udo, é di ícil de encon a uma jus i icação pa a es es esul ados, nomeadamen e
quando na li e a u a a maio ia dos dados apon am pa a a ausência de associação en e
géne o e in eção. A pe cen agem de c ianças in e adas com eb e, desid a adas,
malnu idas ou com a a i idade eduzida oi in e io à de e ada em es udos an e io es
(21) (23) (166), assim como a média do g au de g a idade da dia eia (20). A
pe cen agem de c ianças com ómi os oi semelhan e a alo es an e io men e ela ados
(21) (23). Os casos posi i os de adeno í us i e am maio incidência na época das
chu as (p = 0.005), como epo ado ambém po Moyo e al. (2014) (166). No en an o,
a maio ia dos es udos não mos a um pad ão de sazonalidade especí ico pa a a in eção
po adeno í us (19) (55). Uma a aliação con ínua da in eção du an e um pe íodo mais
longo, e.g. mensal ao longo de 2 anos, se á necessá ia pa a conclui sob e a
sazonalidade da in eção po adeno í us nes as egiões de Angola.
A ca ac e ização molecula de sequências nucleo ídicas ab angendo a ansa L1 do
hexão pe mi iu iden i ica a ci culação de HAdVs de onze ipos di e en es pe encen es
a qua o espécies, A, C, D e F. A espécie F (HAdV-40 e -41), classicamen e
conside ada como incluindo os “adeno í us en é icos”, e elou-se p edominan e
ela i amen e às ou as espécies (45,8%, 11/24) como se ia expec á el de aco do com o

Discussão e Conclusões
72
desc i o na maio ia de es udos simila es ealizados em egiões geog á icas mui o
di e sas (165) (167), (17) (20) (43) (44) (47) (168) (169). Po ém, cu iosamen e os
adeno í us en é icos o am de e ados apenas nas p o íncias de Cabinda e de Huambo, e
HAdV-40 apenas nes a úl ima. Pela simila idade das amos as, e idenciada pelo
comp imen o cu o dos amos (Fig. 3.5,) deduz-se que a mesma es i pe de HAdV-40
ci cule na egião de Minei a, Al o-Hama e Bailundo. HAdV-41 oi o ipo de adeno í us
en é ico mais equen emen e de e ado (63,6%, 7/11). Na bibliog a ia cons a amos que a
p opo ção ela i a de HAdV-40 e -41 a ia de es udo pa a es udo, an o em e mos
geog á icos como empo ais. Enquan o nas décadas de 80 e 90 do século passado e am
desc i as p e alências ap oximadamen e iguais des es dois se o ipos (170) (171), a
endência na úl ima década é pa a um dec éscimo da ci culação de HAdV-40 e
concomi an e aumen o de HAdV-41, o nando-se es e o se o ipo p edominan e
associado a GEA (167) (165) (20) (44) (159) (168). No en an o, nes e pe íodo, no Gana
e no Bangladesh oi desc i o HAdV-40 maio i a iamen e ou exclusi amen e (21) (172).
Mais uma ez, es as di e enças podem se de idas a sensibilidade di e encial dos es es
de de eção. De ac o, o am desc i as limi ações no uso de ELISAs come ciais pa a
de eção de HAdV-41 (159) (173). Pela análise da á o e ilogené ica da Fig. 3.5, é
possí el e i ica a inclusão dos í us Angolanos HAdV-41 em dois clus e s genómicos
dis in os, GTC-1 e GTC-2, como desc i o inicialmen e po Li e al. (2004) pa a á ios
países asiá icos (159) e pos e io men e po Dey e al. (2011) pa a a Índia (44). A
exis ência des es dois GTCs e le e a acumulação de mu ações de aminoácidos nas
egiões hipe a iá eis do gene do hexão (44) (159). Es a de i a an igénica pode á se
esponsá el pelo não econhecimen o po an ico pos monoclonais usados nos es es
come ciais. Cu iosamen e, a ci culação de es i pes GTC-1 oi de e ada apenas em
Cabinda.
HAdV-1, -2 e -5, HAdVs da espécie C, no malmen e associados a in eções do
sis ema espi a ó io (37), o am iden i icados num qua o das amos as ecais com
adeno í us. Es es ipos o am ambém an e io men e de e ados em casos de GEA (17)
(19) (45) (169) (167). As doenças espi a ó ias são uma mani es ação comum da in eção
po HAdVs em c ianças e oi demons ado que os HAdVs que in e am as mucosas
espi a ó ias podem se exc e ados nas ezes du an e meses ou anos, pelo que a sua
p esença nes as amos as pode á não es a di e amen e associada a gas oen e i e (48).
Discussão e Conclusões
73
Fo am iden i icadas 5 amos as com adeno í us pe encen es à espécie D (20,8%,
5/24). Os adeno í us des a espécie êm sido associados a uma di e sidade de doenças,
nomeadamen e que a oconjun i i e epidémica e gas oen e i e (37). São inclusi amen e
a espécie mais equen emen e de e ada nas ezes de doen es in e ados po VIH com
gas oen e i e (24). Um es udo ealizado com amos as ecais de populações de qua o
países da Á ica subsa iana demons ou uma ele ada p e alência (28%-66%) de HAdV-
D, g ande di e sidade de ipos ci culan es e coin ecção com á ios ipos, sem
associação a doença (174). Um ou o es udo ealizado no Quénia iden i icou os HAdVs
da espécie D como os mais p e alen es (48,6%) em amos as ecais de c ianças com
GEA a i e em em ambien e u bano (17). Os ipos HAdV-9 e -10 da espécie D,
a amen e e e idos na li e a u a, o am iden i icados em 60% das c ianças com dia eia
a ibuída a adeno í us na cidade de Dhaka, Bangladesh (21). HAdV-9 oi iden i icado
numa amos a Angolana (HMC11). Cu iosamen e HAdV-67, isolado a pa i de uma
c iança com gas oen e i e, é um ecombinan e de á ios ipos da espécie D, sendo
classi icado como HAdV-9 na egião L1 e L2 do hexão (53). Se á in e essan e analisa
ou as egiões genómicas pa a uma melho ca ac e ização do í us HMC11. A es i pe
CSP11 ap esen ou uma simila idade de 100% com as sequências nucleo ídicas de
e e ência pa a HAdV-15 e HAdV-29. A incapacidade de dis ingui es es dois ipos com
base na análise des a egião do genoma oi igualmen e desc i a po po Madisch e al.
(2005) que, a a és da análise ilogené ica das sequências nucleo ídicas das egiões L1 e
L2 dos HAdV-15 e o HAdV-29, e i ica am não exis i qualque di e gência en e as
sequências des es dois ipos (32).
Iden i icámos ainda duas amos as com HAdV-A (8,3%, 2/24) classi icados como
HAdV-18 e HAdV-61. HAdV-18 oi igualmen e iden i icado em c ianças com GEA no
Quénia (17). Cu iosamen e, a c iança in e ada com HAdV-18 oi a única c iança
inqui ida in e ada com eb e. HAdV-31, o adeno í us da espécie A associado a GEA
pediá ica na Índia (168) e de e ado nas ezes de indi íduos in e ados com VIH (175),
não oi iden i icado nas amos as Angolanas. No en an o, iden i icámos uma es i pe
(CAL3) classi icada ilogene icamen e como HAdV-61, um adeno í us ecombinan e
en e HAdV-31 e um adeno í us p óximo de HAdV-12. Es e ecombinan e oi isolado
de um doen e com gas oen e i e em Quio o, Japão (176). Sendo es a a única e e ência
na base de dados do NCBI, p esumimos que es e í us es á aqui a se iden i icado pela
Discussão e Conclusões
74
segunda ez e num con inen e di e en e, pelo que se ia in e essan e aze a sequenciação
do es an e genoma i al pa a uma classi icação inequí oca.
A axa de de eção dos as o í us nas amos as ecais Angolanas oi de 5% (11/222),
um alo den o da gama desc i a a ní el global, uma ez que os as o í us es ão
associados a 2 - 9% dos casos de GEA, não bac e iana, em c ianças (70) (74). A
incidência média a ní el mundial é de 11% com incidências de 7% e 23% em á eas
u ais e u banas, espe i amen e (70). A incidência é, ge almen e, mais ele ada nos
países em ias de desen ol imen o (70). No en an o, pa adoxalmen e, em Angola e
nou os países da Á ica subsa iana a p e alência é baixa: Bo swana, 2,7% (55); Quénia
5,3% (177); Gana 4,8% e 3,3% (22) (172), Ruanda 4,1% (162), Zanziba 2,4% (178). À
semelhança dos adeno í us, pode emos es a pe an e um es e imunoenzimá ico com
uma sensibilidade baixa e 5% se uma subes ima i a da p e alência. E en ualmen e,
es e alo pode á aumen a se o usado no as eio RT-PCR com p ime s uni e sais.
A maio ia das c ianças in e adas po as o í us (75%) inha idade igual ou in e io a
24 meses, como desc i o pa a ou os es udos simila es (12) (70) (75). A in eção oi mais
comum nas c ianças do sexo eminino, mas sem di e ença es a is icamen e signi ica i a
e de aco do com ou os es udos que desc e em uma incidência semelhan e en e
géne os (12) (16). Apesa da eb e se um dos á ios sin omas de GEA, nenhuma
c iança in e ada com as o í us ap esen a a es e sin oma, como ela ado ambém num
es udo an e io (179). Em elação à du ação da dia eia, a in eção po as o í us oi a
que ap esen ou maio du ação, compa a i amen e com a in eção po adeno í us e
no o í us. Em elação a es udos an e io es, nes e abalho a du ação média da dia eia
oi supe io (4,7 dias) e o núme o médio de episódios diá ios semelhan e (20) (25) (26).
A pe cen agem de c ianças com ómi os (50%) es á comp eendida no in e alo
espe ado (20-70%), mas a du ação média dos ómi os (dias) e o núme o de episódios
diá ios oi supe io ao ela ado (20) (26). A pe cen agem de c ianças in e adas po
as o í us desid a adas e o alo médio do g au de g a idade da dia eia es á de aco do
com dados de ou os au o es. Po ém, es es mos am que as c ianças in e adas
ap esen am uma a i idade mais eduzida, e no nosso es udo odas as c ianças inham
uma a i idade no mal (20) (26). A maio incidência de as o í us oco eu na época das
Discussão e Conclusões
75
chu as, mas sem di e ença es a is icamen e signi ica i a (p = 0,088). Es e esul ado es á
de aco do com o e is o po Bosh e al. (2014) pa a os climas opicais (70).
Os HAs Vs clássicos são classi icados em oi o se o ipos (HAs V-1 a -8) com base
na sua ea i idade se ológica e neu alização (26), cada um deles co espondendo a um
genó ipo indi idual com base na sequência nucleo ídica do gene da cápside (ORF2)
(150). A análise ilogené ica das sequências da egião 5’ da ORF2 dos as o í us
analisados pe mi iu iden i ica a ci culação de ês genó ipos di e en es (HAs V-1, -3 e -
5). Cu iosamen e, HAs V-5 oi o genó ipo p edominan e (43%, 3/7) nes e pequeno
núme o de amos as analisadas. A ní el global, HAs V-1 é o genó ipo mais comum
iden i icado em c ianças, seguido dos genó ipos 2-5 e, ocasionalmen e, 8 dependendo
da egião, enquan o HAs V-6 e -7 são a amen e de e ados (26) (70) (74).
Os HAs Vs ap esen am uma ele ada axa e olu i a, de e minada pela acumulação
de mu ações (2-4 x 10-3 subs i uições po posição po ano) (180) e pela capacidade de
ecombinação do genoma, comum a ou os í us de RNA (181).Cu iosamen e, e apesa
da baixa in e ência ilogené ica da á o e cons uída pa a as sequências da ORF1b
ela i amen e à da ORF2, e i icámos que apenas pa a dois í us (B20 e C31),
classi icados como HAs V-1 nas duas egiões analisadas, o seu posicionamen o se
man inha nas duas á o es cons uídas (Fig. 3.9 e 3.11). Pa a as sequências das amos as
CSP17, M47, B19, B23 e M36 obse ou-se uma dis ibuição opológica disc epan e nas
á o es ilogené icas ge adas, e idenciando genó ipos di e en es pa a as duas egiões
genómicas analisadas. As disc epâncias en e as á o es ilogené icas baseadas em
di e en es ORFs suge em po enciais e en os de ecombinação nos genomas des as
es i pes. Assim e emos pu a i os ecombinan es de HAs V-1/-5 (CSP17, M47),
HAs V-1/-3 (B19, B23) e HAs V-2/-5 (M36) pa a HAs V-ORF1b/-ORF2,
espe i amen e. Babkin e al. (2014) p ocede am à análise de e en os de ecombinação
de genomas comple os de as o í us humanos exis en es nas bases de dados e de
isolados ussos endo concluído que os HAs V-2 eme gi am como esul ado de
ecombinação e que os genó ipos HAs V-1 e -4 incluem isolados ecombinan es e não
ecombinan es, enquan o HAs V-3, -5 e -6 não ap esen am sinais de ecombinação (84).
Cu iosamen e, a p imei a e idência de ecombinação en e HAs Vs espei a a um
ecombinan e en e HAs V-3 na ORF1b e HAs V-5 na ORF2, isolado de uma c iança
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Re e ências Bibliog á icas
102
Anexos
103
6. ANEXOS
6.1 Fo mulá io de In o mação e de Consen imen o In o mado

Anexos
104
Anexos
105
6.2 Inqué i o Demog á ico e Clínico
Anexos
106
6.3 Escala pa a Cálculo da G a idade dos Episódios de GEA
Tabela 6.1 - Escala pa a cálculo da g a idade dos Episódios de Gas oen e i e, segundo
a classi icação de Nakagomi e al. (Adap ado de (153))
Sinal Clínico/Sin oma
Pon os a ibuídos
Dia eia
Du ação (dias)
<2
1
2-4
2
>4
3
Episódios em 24h
3
1
4-5
2
>5
3
Ausência de ómi os
0
Vómi os
Du ação (dias)
1-2
2
≥3
3
Episódios em 24h
1
1
2
2
≥3
3
Desid a ação
Ausência
0
P esença
2
Feb e
<37.6ºC
0
37.6ºC - 38.6ºC
2
≥38.6ºC
3
A i idade
No mal
0
Reduzida
3
Anexos
107
6.4 Indicado es de Malnu ição e Relação com a In eção po Adeno í us, As o í us e No o í us
Tabela 6.2 Indicado es de malnu ição e elação com a in eção po adeno í us, as o í us e no o í us, Angola (2012/2013)
Indicado es
de
Malnu ição
Nº
C ianças
n=80
No o í us
posi i os
n=12
p-
alue*
G au de
G a idade
da dia eia
p-
alue#
Adeno í us
posi i os
N=11
p-
alue*
G au de
G a idade
da dia eia
p-
alue#
As o í us
posi i os
N=4
p-
alue*
G au de
G a idade
da dia eia
p-
alue#
Peso Vs.
Idade
Z › -2SD
59
(73,8%)
8
(67%)
0,723
8 ± 2,93
0,209
10
(91%)
0,272
6,20 ± 3,39
0,625
2
(50%)
0,281
5 ± 1,41
0,493
-3SD ‹ Z ‹ -
2SD
21
(26,2%)
4
(33%)
5,75 ± 2,22
1
(9%)
8
2
(50%)
6,5 ± 2,12
Al u a Vs.
Idade
Z › -2SD
51
(63,8%)
8
(67%)
1,000
6,63 ± 3,07
0,301
6
(55%)
0,515
6,33 ± 3,14
0,975
4
100%
0,291
5,75 ± 1,71
-
-3SD ‹ Z ‹-
2SD
29
(36,2%)
4
(33%)
8,50 ± 2,08
5
(45%)
6,40 ± 3,78
0
(0%)
0
Peso Vs.
Al u a a)
Z › -2SD
57
(73,1%
7
(64%)
0,475
8,71 ± 2,29
0,066
10
(91%)
0,271
6,20 ± 3,39
0,625
2
(50%)
0,292
5 ± 1,41
0,493
-3SD ‹ Z ‹ -
2SD
21
(26,9%)
4
(36%)
5,75 ±2,22
1
(9%)
8
2
(50%)
6,5 ± 2,12
a) Dos 108 inqué i os, ha ia in o mação de 80 inqué i os pa a os indicado es de malnu ição pesos Vs idade, e al u a Vs idade. Pa a a a iá el peso Vs al u a exis iam 78 inqué i os.
*Tes e de Fishe e #T S uden
Anexos
114
6.9 Resul ados P elimina es Ob idos po BLAST e RIVM após
Sequenciação dos P odu os Ampli icados da egião NS da ORF2
de no o í us
Amos a
p ime
Genó ipo
NoV
(BLAST)
Co e
Tamanho
(pb)
Re .
ID
Que y
Genó ipo
No
(RIVM)
Re .
Genog upo I
C38
NVG1
GI.3
42-350
309
JN69905
0
95
99
GI.3
U04469
KF3614
41
94
100
GQ85647
3
C56
NVG1
GI.5
37-356
319
KJ40229
5
94
99
GI.5
M87661
JN19136
0
95
92
L23828
C62
NVG1
GI.3
37-349
313
JX41639
2
97
100
GI.3
U04469
HQ2138
44
95
100
GQ85647
3
C83
NVG1
GI.3
40-348
309
JX41639
2
97
100
GI.3
AJ277612
HQ2138
44
96
100
AY03859
8
CAL2
NVG1
GI.3
18-344
327
JX41639
2
97
95
GI.3
AJ277612
HQ2138
44
96
95
AY03859
8
M10
NVG1
GI.3
65-350
269
JX41639
2
97
75
GI.3
EF547396
AB0585
29
97
99
GQ85647
1
Genog upo II
AH8
G2SKF
GII.6
30-328
298
KF2793
86
94
96
GII.6
AJ277620
JN69904
1
95
97
AB039778
AH14
G2SKF
GII.7
27-321
295
AB4537
73
99
92
GII.7
AF414409
KC4956
52
98
96
AJ277608
AH15
G2SKF
GII.7
20-335
316
AB4537
73
95
87
GII.7
AF414409
KC4956
52
97
91
AJ277608
B8
G2SKF
GII.16
27-310
284
JX41640
0
96
93
GII.16
AY50201
0
GU1387
69
96
88
GQ85647
6
B15
G2SKF
GII.2
23-338
316
AB6628
54
96
93
GII.2
X81879
KF2793
85
95
93
AY13474
8
B27
G2SKF
GII.3
42-424
306
EU2491
37
97
98
GII.3
EU187437

Anexos
115
KC4956
60
96
98
U02030
B30
G2SKF
GII.6
31-310
280
KF4343
05
94
99
GII.6
AJ277620
JN69904
1
96
97
AB039778
C26
G2SKF
GII.4
20-312
293
KF4759
35
98
100
GII.4
X76716
KC4956
85
98
99
AB542917
C36
G2SKF
GII.4
28-315
288
KJ41579
0
97
100
GII.4
X76716
KC4956
85
97
98
AB542917
C71
G2SKF
GII.4
(Sydney_2
012)
23-304
282
KF0082
41
99
98
GII.4
(Sydney_2
012)
X76716.1
KF3787
31
99
98
AB542917
C93
G2SKF
GII.6
24-315
292
JN69904
1
96
96
GII.6
AJ277620
KF4343
05
95
100
AB039778
C97
G2SKF
GII.7
30-418
389
AB4537
73
98
71
GII.7
AF414409
KC4956
52
98
74
AJ277608
CSMI13
G2SKF
GII.4
32-336
304
KF2750
24
98
93
GII.4
(Sydney_2
012)
X76716
KF0082
41
99
88
AB542917
CSP1
G2SKF
GII.9
29-311
283
EF6305
30
97
96
GII.9
AY03859
9
AB5145
99
97
92
DQ37971
5
CSP3
G2SKF
GII.4
20-313
293
KF2750
21
99
97
GII.4
(Sydney_2
012)
X76716
KF2750
24
99
98
AB542917
CSP11
G2SKF
GII.3
21-314
294
KC4956
60
96
100
GII.3
EU187437
KC4956
59
96
100
U02030
HMC25
G2SKF
GII.4
(Sydney_2
012)
19-316
298
KF0082
41
99
94
GII.4
(Sydney_2
012)
X76716
KF2750
24
98
97
AB542917
HMC40
G2SKF
GII.7
19-311
293
KC4956
62
98
100
GII.7
AF414409
AB2583
31
97
94
AJ277608
HMC41
G2SKF
GII.6
42-355
313
KF2793
86
95
88
GII.6
AJ277620
AB5391
49
98
79
AB039778
HMC42
G2SKF
GII.6
24-311
288
KF2793
86
97
100
GII.6
AJ277620
AB5391
49
98
92
AB039778
HMC43
G2SKF
GII.7
23-480
458
AB2583
31
97
74
GII.7
AF414409
KF8465
29
97
74
AJ277608
Anexos
116
M5
G2SKF
GII.1
27-311
284
KC9624
59
98
99
GII.1
AJ277606
KF4759
28
97
100
U07611
M11
G2SKF
GII.6
48-346
259
JX89889
0
99
100
GII.6
AJ277620
KC4956
84
99
100
AB039778
M17
G2SKF
GII.7
25-297
272
AB4537
73
99
98
GII.7
AF414409
JQ75104
3
99
98
AJ277608
M22
G2SKF
GII.6
21-302
282
KF4343
05
95
99
GII.6
AJ277620
JN69904
1
94
100
AB039778
M43
G2SKF
GII.4
30-366
336
KJ68541
4
99
92
GII.4
X76716
JX98907
4
99
92
AB542917
M46
G2SKF
GII.6
28-294
267
JN69904
1
94
100
GII.6
AJ277620
KF4343
05
93
100
AB039778
M47
G2SKF
GII.4
31-299
269
KJ68541
4
99
100
GII.4
X76716.1
JX98907
4
99
100
AB542917
M48
G2SKF
GII.14
23-304
281
JX89616
1
98
100
GII.14
GQ85646
5
JF90905
4
97
96
AY13076
1
M55
G2SKF
GII.6
25-332
308
KC4956
84
99
93
GII.6
AJ277620
JX89889
0
99
89
AB039778
Anexos
117
6.10 Relação das Ca ac e ís icas Alimen a es e Clínicas com a In eção
po Adeno í us e No o í us
Tabela 6.5 Relação das Ca a e ís icas Alimen a es e Clínicas com a In eção po Adeno e
No o í us, em Angola (2012/2013)
Va á eis
Ca ego ias
HAdV-40
e -41
(n=7)
HAdV
não 40
e -41
(n=10)
p-
alue
NoV
GII.4
(n=4)
NoV
não
GII.4
(n=12)
p-
alue
Ca ac e ís icas da Alimen ação
Amamen ação
Sim
5
2
0,686
4
8
0,272
Não
2
3
0
4
Se sim, du an e a
amamen ação inge iu
ou os alimen os?
Lei e ma e no
e ou os
alimen os
5
8
0,400
4
7
0,462
Amamen ação
exclusi a
2
1
0
2
Ca ac e ís icas Clínicas
Feb e
<37,6ºC
6
5
0,500
3
8
-
≥37,6ºC
0
1
-
-
Se ≥37,6ºC, du ação
média (dias)
-
2
-
-
-
-
Dia eia
Du ação média (dias)
2,71 ±
0,76
3,43 ±
1,13
0,191
3 ±
1,63
2,73 ±
1,27
0,737
Nº ezes/24ho as (média)
3,71 ±
1,11
3,78 ±
0,83
0,898
3,50 ±
1,29
3,91 ±
1,36
0,736
Vómi os
Sim
4
2
0,145
1
5
0,462
Não
3
8
3
6
Du ação média (dias)
2,25 ±
1,26
1
0,440
1
2,20 ±
1,30
0,448
Nº ezes/24ho as (média)
2,25 ±
1,26
1,50 ±
0,71
0,492
4
2,20 ±
1,10
0,208
Desid a ação
Sim
2
3
0,686
2
6
0,554
Não
5
7
1
6
A i idade
No mal
4
9
0,162
2
9
0,637
Reduzida
3
1
1
3
Malnu ição
Sim
2
2
0,594
0
3
0,110
Não
4
6
2
9
Índice de Massa Co po al
(média)
15,2 ±
3,66
15,7 ±
1,76
0,787
13,1 ±
0,28
15,1 ±
4,14
0,534
G au de G a idade da
dia eia a) (média)
7,43 ±
3,10
4,50 ±
2,51
0,048
6,25 ±
2,06
6,58 ±
3,50
0,861