Identificação e caracterização genética de vírus entéricos (norovírus, astrovírus e adenovírus) em crianças com diarreia aguda em Angola

n UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DE VÍRUS ENTÉRICOS (NOROVÍRUS, ASTROVÍRUS E ADENOVÍRUS) EM CRIANÇAS COM DIARREIA AGUDA EM ANGOLA CARLA ALEXANDRA DIMAS TAVARES O ien ado a: P o esso a Dou o a Aida Es e es Simões Coo ien ado a: Dou o a Claudia Is a e Disse ação ap esen ada pa a cump imen o dos equisi os necessá ios à ob enção do g au de Mes e em Ciências Biomédicas i Elemen os Bibliog á icos Resul an es da Disse ação Ta a es C., Es e es A., Mendes C., No dg en J., Piedade J., Fo es F., Dimbu P.R, Sa ai a N. e Is a e C. De ec ion and molecula cha ac e iza ion o no o, as o and adeno i uses ci cula ing in child en unde i e yea s o age in se e al egions o Angola. 12 h In e na ional Con e ence on Molecula Epidemiology and E olu iona y Gene ics o In ec ious Diseases, Banguecoque, 11-13 de Dezemb o de 2014 (Ap esen ação O al). ii iii Ag adecimen os A ealização des e abalho só oi possí el de ido ao apoio incondicional de á ias pessoas, às quais desejo mani es a a minha g a idão, nomeadamen e: À minha o ien ado a, P o esso a Dou o a Aida Es e es Simões, P o esso a Associada da Unidade de Ensino e In es igação de Mic obiologia no Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, pela con iança que deposi ou em mim, pelo apoio e o ien ação na ealização des e abalho. Ob igado po me e ajudado a encon a soluções pa a os di e sos obs áculos que o am apa ecendo. À minha coo ien ado a, Dou o a Claudia Is a e, In es igado a Auxilia Con idada da Unidade de Ensino e In es igação de Mic obiologia no Ins i u o de Higiene e Medicina T opical, po e semp e uma pala a de incen i o e po odo o apoio du an e es a e apa. Sin o-me mui o g a a po odas as ecomendações e c í icas que o am semp e mui o cons u i as e bem ecebidas. A odos os elemen os do G upo de Vi ologia, p incipalmen e ao P o esso Dou o João Piedade, ao P o esso Dou o Rica do Pa ei a e Técnica Supe io Ângela Lopes Mendes pela cons an e disponibilidade pa a a espos a a qualque pedido de ajuda. Ao P o esso Dou o Filomeno de Jesus Fo es, esponsá el em Angola pelo p oje o, e ao P o esso Vi gílio E. do Rosá io pelo apoio dado pa a inicia e desen ol e o p oje o em Angola. Aos colabo ado es D . Ped o Ra ael Dimbu e D . Nil on Sa ai a, do Depa amen o do Con olo de Doenças da Di eção Nacional de Saúde Pública de Angola que inanciou o es udo. Também aos p o issionais de saúde Angolanos que, nos cen os de saúde e hospi ais locais, con ibuí am pa a a colhei a das amos as e acompanhamen o dos pais e c ianças, nomeadamen e à D a. Ma ia Cecília de Almeida e D a. Ma iana de Oli ei a. Ag adeço a disponibilidade da pa icipação e consen imen o dado pelos esponsá eis das c ianças incluídas nes e es udo. i Ag adeço ao Dou o Johan No dg en, p o esso e in es igado da Di isão de Vi ologia Molecula na Uni e sidade de Linköping, Suécia, pela sua disponibilidade, auxílio labo a o ial e no a amen o dos dados es a ís icos. À C is ina Mendes e Ru e Ma celino, po odo o apoio e amizade nes a e apa, e po odos os ca és que omámos jun as, pa a da ene gia pa a en en a o dia. Nunca se esqueçam que a semana em semp e de e mina azul. Às minhas colegas de mes ado, em especial à Ana Bolas, Ca la Fe ei a, Cláudia Co oa, Débo a Almeida e Ma iana Fe nandes, sem ocês es a caminhada não e ia sido a mesma. Aos meus amigos e bando, que es i e am semp e p esen es, e semp e com pala as de incen i o, em especial à Inês Fu ado, Má cio Ca doso, Ma iana Galileu, Pa ícia Nunes, Tânia Ma os e Vi o Vaz. Ag adeço ambém à D a. Luísa Pa gana, D a. Paula Mo e e Ven u a e es an e equipa, po pe cebe em a impo ância que inha pa a mim es e abalho, e assim ajus a em es o ços pa a que osse possí el a conc e ização des e ciclo de es udos. Ob igado pela ossa disponibilidade, oi a p o a do lema “Mais do que pala as, GESTUS®”. Po im, gos a ia de ag adece aos meus pais, pelo amo incondicional. Espe o que um dia os possa p o a que es e es o ço aleu a pena. Dedico es a ese aos meus pais. Resumo A gas oen e i e aguda (GEA) é uma das p incipais causas de mo alidade e mo bidade em c ianças com idade in e io a 5 anos, especialmen e nas que i em em países em desen ol imen o. Sabe-se que os o a í us são a p incipal causa de GEA pediá ica, seguidos dos no o í us, adeno í us e as o í us. En e 2012 e 2013, c ianças com idade in e io a 5 anos, com dia eia e que eco e am a unidades de saúde em Angola (p o íncias de Huambo, Zai e, Cabinda e Luanda) o am incluídas num es udo pilo o com o obje i o de iden i ica e ca ac e iza agen es i ais causado es de gas oen e i e. A de eção e ca ac e ização gené ica de adeno í us, as o í us e no o í us o am ealizadas num o al de 222 amos as de ezes, nega i as pa a o a í us. Os as o í us e adeno í us o am de e ados po es e de ELISA e es e ápido imunoc oma og á ico, espe i amen e, enquan o os no o í us o am de e ados po PCR em empo eal com sonda TaqMan®. A geno ipagem oi ealizada po análise ilogené ica de sequências pa ciais do gene do hexão dos adeno í us, e da ORF2 de as o í us e no o í us. Nas amos as ecais, oi possí el iden i ica no o í us, adeno í us e as o í us, com axas de de eção de 17% (37/222), 11% (24/222) e 5% (11/222), espe i amen e. A maio ia dos no o í us de e ados (81%, 30/37) pe encia ao genog upo GII, sendo os genó ipos mais p e alen es GII.6 (9/30), GII.4 (8/30, incluindo duas a ian es Sydney 2012) e GII.7 (6/30). Os genó ipos GII.1, GII.2, GII.3, GII.9, GII.14 e GII.16 o am ambém iden i icados. Os no o í us GI o am classi icados como GI.3 (5/7) e GI.5 (1/7). Quan o aos adeno í us, os ipos mais abundan es o am HAdV-41 (7/24), HAdV- 40 (4/24) e HAdV-1 (4/24). Po ém, o am igualmen e iden i icados HAdV-2, -5, -9, - 15/-29, -18, -26, -27 e -61. Os as o í us o am geno ipados como HAs V-5 (3/7), HAs V-1 (2/7) e HAs V-3 (2/7). Pa a nosso conhecimen o, es e oi o p imei o es udo sob e í us en é icos, pa a além dos o a í us, ealizado em c ianças com GEA em Angola e e ela a p esença de no o í us, adeno í us e as o í us em ce ca de um e ço das amos as es udadas. Ainda, os di e en es í us ap esen am uma g ande di e sidade de es i pes em ci culação, incluindo a ian es menos comuns. Pala as-cha e: gas oen e i e aguda, adeno í us, as o í us, no o í us, c ianças Angola. i Abs ac Acu e gas oen e i is (AGE) is one o he mos common childhood diseases, a ec ing especially he de eloping coun ies. Ro a i us is conside ed he leading cause o paedia ic dia hoea along wi h no o i uses, as o i uses, and adeno i uses. Du ing 2012 and 2013, child en unde 5 yea s diagnosed wi h AGE in heal h ca e uni s o Angola (Huambo, Zai e, Cabinda and Luanda p o inces) we e en olled in a pilo s udy aiming o cha ac e ize i al gas oen e i is e iological agen s. De ec ion and gene ic cha ac e iza ion o no o i uses, as o i uses, and adeno i uses was pe o med in a o al o 222 s ool samples nega i e o o a i us. As o i uses and adeno i uses we e sc eened by ELISA and immunoch oma og aphic apid es , espec i ely, while no o i uses we e de ec ed by in house TaqMan® eal- ime PCR. Geno yping was ca ied ou by phylogene ic analysis o a segmen o he hexon gene o adeno i uses and pa ial ORF2 sequences o no o i uses and as o i uses. No o i uses, adeno i uses, and as o i uses we e iden i ied in aecal specimens wi h de ec ion a es o 17% (37/222), 11% (24/222), and 4% (9/222), espec i ely. The majo i y o he no o i uses (81%, 30/37) belong o he GII genog oup, he mos p e alen geno ypes being GII.6 (9/30), GII.4 (8/30, wi h wo Sydney 2012 a ian s), and GII.7 (6/30). Though a lowe a es, GII.1, GII.2, GII.3, GII.9, GII.14, and GII.16 s ains we e also ecognized. GI no o i uses we e geno yped as GI.3 (5/7) and GI.5 (1/7). The mos p e alen adeno i us ypes we e HAdV-41 (7/24), HAdV-40 (4/24), and HAdV-1 (4/24) bu HAdV-2, -5, -9, 15/29, -18, -26, -27, and -61 we e also iden i ied. As o i uses we e acknowledged as HAs V-5 (3/7), HAs V-1 (2/7), and HAs V-3 (2/7). To ou knowledge, his is he i s epo on i al en e ic pa hogens, o he han o a i uses, in ec ing child en wi h AGE in Angola and demons a es ha al oge he no o i uses, adeno i uses, and as o i uses we e de ec ed in abou one hi d o he samples s udied. In addi ion, indi idual pa hogens show a high di e si y o ci cula ing s ains including unusual ones. Key-wo ds: acu e gas oen e i is, adeno i us, as o i us, no o i us, child en, Angola. ii Índice Ge al Elemen os bibliog á icos Resul an es da Disse ação……………………………………i Ag adecimen os………………………………………………………………………….ii Resumo………………………………………………………………………………….i Abs ac ………………………………………………………………………………….. Índice Ge al…………………………………………………………………………….. i Lis a de Ab e ia u as……………………………………………………………………ix 1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1 1.1 Adeno í us ......................................................................................................... 4 1.1.1 Es u u a do Vi ião ...................................................................................... 5 1.1.2 O ganização genómica ................................................................................ 6 1.1.3 Ciclo Replica i o ........................................................................................ 7 1.1.4 Epidemiologia ........................................................................................... 10 1.2 As o í us ......................................................................................................... 11 1.2.1 Es u u a do i ião .................................................................................... 12 1.2.2 O ganização do genoma ............................................................................ 12 1.2.3 Ciclo Replica i o ...................................................................................... 14 1.2.4 Epidemiologia ........................................................................................... 15 1.3 No o í us.......................................................................................................... 16 1.3.1 Es u u a do Vi ião .................................................................................... 17 1.3.2 O ganização genómica .............................................................................. 18 1.3.3 Ciclo Replica i o ...................................................................................... 19 1.3.4 Epidemiologia ........................................................................................... 21 1.4 Obje i os .......................................................................................................... 24 2. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 25 2.1 População es udada .......................................................................................... 25 2.2 Amos a ............................................................................................................ 26 2.3 Adeno í us ....................................................................................................... 27 In odução 2 Angola é o 15º país com maio axa de mo alidade de ido à dia eia, onde anualmen e mo em ce ca de 19700 c ianças com idades in e io es a cinco anos, í imas des a doença (6). Segundo a OMS, em Angola, a dia eia é esponsá el po 15% das mo es em c ianças com idade in e io a 5 anos, pe cen agem supe io a causas como a malá ia e VIH/SIDA (11). Figu a 1.2 Rep esen ação g á ica da dis ibuição das causas de mo e em Angola, em c ianças com idade in e io a 5 anos (dados de 2010). Adap ado de WHO (2013) (11). Anomalias Congéni as; 7% Ou as Doenças; 19% Lesões; 4% P ema u idade; 13% Sepsia Neona al; 6% Pneumonia; 17% As ixia du an e o pa o; 8% Malá ia; 10% Dia eia; 15% HIV/SIDA; 2% Taxa de Mo alidade po 100 000 c ianças (2008) Figu a 1.1 – Dis ibuição geog á ica das mo es de ido a dia eia em c ianças com idade in e io a 5 anos (po 100000 c ianças). Adap ado de San osham, M., e al. (2010) (202) In odução 3 Um es udo ealizado em 2007 demons ou que mais de 75% dos episódios de dia eia êm o igem i al (12). Exis em mais de 20 í us iden i icados como agen es e iológicos de gas oen e i e em c ianças (13). Po ém, os o a í us (RV) são os que ap esen am maio p e alência, seguidos dos no o í us (NoV), adeno í us (AdV) e as o í us (As V), com axas de de eção de 20-60%, 6-30%, 1-37% e 1-10%, espe i amen e (14) (15) (16) (17) (18) (19). Os p incipais sin omas desc i os em c ianças com GEA são dia eia, eb e, do abdominal, ómi os, aqueza e desid a ação (20) (21) (22). Na in eção po adeno í us, o pe íodo de incubação é de 3 a 10 dias. Es es í us causam dia eias p olongadas que podem du a en e 10 e 14 dias, e com ce ca de 6 a 8 episódios diá ios (21). Casos de mo alidade de ido a GEA po adeno í us o am egis ados não só em indi íduos imunodep imidos como ambém em c ianças e adul os saudá eis (23) (24). Tipicamen e, a in eção po as o í us em um pe íodo de incubação de 3 a 4 dias e os sin omas podem pe sis i en e 2 e 7 dias. Ge almen e, a in eção po as o í us causa dia eia mais ligei a que a p o ocada po o a í us ou no o í us e os ómi os ambém são menos p e alen es, pelo que não conduz a es ados de desid a ação se e a, nem eque hospi alização (25). Os casos de mo alidade associados a gas oen e i e po as o í us são ex emamen e a os (26). Em média, os no o í us ap esen am um pe íodo de incubação mui o cu o (1-2 dias) e os sin omas podem pe sis i en e 1 e 3 dias. A segui aos o a í us, os no o í us são os í us en é icos que ap esen am mais casos com um índice de g a idade ele ado (20). Em indi íduos imunocomp ome idos, a in eção po no o í us pode se p olongada, le ando mesmo a episódios de dia eia c ónica (27). Nos países em desen ol imen o, es ima-se que a in eção po no o í us conduza a ce ca de 200 000 mo es anuais em c ianças com idades in e io es a 5 anos (27). Segundo dados da OMS, a maio ia das doenças dia eicas podem se p e enidas a a és de medidas como o acesso a água po á el e a uma ede de saneamen o básico, melho ia nas condições de higiene pessoal e na manipulação dos alimen os, p omoção da amamen ação exclusi a, pelo menos nos p imei os seis meses de ida da c iança, e p omoção de ações de educação pa a a saúde nas comunidades (6) (28). In e ompe a In odução 4 ansmissão i al é uma medida ex emamen e impo an e, p incipalmen e no âmbi o amilia , hospi ala e em c esces, onde a con aminação pessoa a pessoa oco e com equência. A ualmen e, não exis e e apia an i i al especí ica ou acina licenciada pa a uso público con a os adeno í us, as o í us ou no o í us. Assim, a e apia isa a a a sin oma ologia p o ocada pela doença gas oen é ica. Nos países em desen ol imen o, a OMS e a UNICEF (The Uni ed Na ions Child en’s Fund), ap esen am di e i as pa a o a amen o da dia eia em c ianças. As o ganizações ecomendam que as c ianças omem sais de eid a ação o al de baixa osmola idade, de modo a que haja eposição da água e dos ele óli os pe didos nas ezes. Apesa des es sais se em conside ados a e apia de e e ência no a amen o da dia eia em países em ias de desen ol imen o, em 2012 apenas 1/3 das c ianças que i em nes es países ecebe am a e apêu ica (29). Jun amen e com os sais, é aconselhada a oma de suplemen os de zinco, de modo a eduzi a du ação dos episódios de dia eia. Du an e o episódio, a c iança de e á se alimen ada con inuamen e, de p e e ência com lei e ma e no ou com alimen os icos em nu ien es (10) (28). 1.1 Adeno í us Os adeno í us o am isolados e ca ac e izados pela p imei a ez em 1953 po Wallace Rowe e colabo ado es, na en a i a de iden i ica o agen e e iológico de in eções espi a ó ias agudas e da cul u a de ecido adenóide e de amígdalas de doen es. Os adeno í us, memb os da amília Adeno i idae, são í us de DNA de cadeia dupla, sem in óluc o, que in e am uma la ga gama de hospedei os. Os adeno í us humanos (HAdVs), incluídos no géne o Mas adeno i us, in e am pa a além do sis ema espi a ó io, os sis emas u iná io e gas oin es inal e a conjun i a. De aco do com o ICTV (In e na ional Commi ee on Taxonomy o Vi uses), os HAdVs são classi icados em 7 espécies (A-G), cada uma delas possuindo á ios ipos. Baseados inicialmen e no pe il se ológico e p op iedades hemaglu inan es, os ce ca de 70 ipos de HAdVs desc i os são ago a de inidos com base na sequência do genoma (30). In odução 5 1.1.1 Es u u a do Vi ião Os adeno í us são í us sem in óluc o, com cápside de sime ia icosaéd ica e 70- 100 nm de diâme o, excluindo as ib as. Es as pode ão medi en e 12 a 32nm, dependendo do ipo de adeno í us. A maio ia dos HAdVs codi icam pa a um ipo de ib a, mas os HAdV-F40, -F41 e -G52 codi icam dois ipos de ib as, longas e cu as (31). A cápside é compos a po 252 subunidades p o eicas, das quais, 240 cons i uem os hexões (II), que o mam as 20 aces do icosaed o, e as es an es 12 subunidades o mam os pen ões (III) dos é ices (Fig. 1.3). De cada pen ão sai uma ib a (IV), com um domínio globula e minal, de e minan e do opismo e p op iedades hemaglu inan es do í us (32). A p o eína do hexão con ém duas ansas (loops, L1 e L2). Es as ansas, p oje adas na supe ície do í us, comp eendem as egiões hipe a iá eis 1-3 (HVR 1- 3) cons i uindo epi opos de e minan es do ipo e indu o es de an ico pos neu alizan es (33) (34). No cen o da pa ícula encon a-se o genoma i al condensado a a és da in e ação não co alen e com as p o eínas V, VII e µ. Nas ex emidades 5’ do DNA i al es á ligada a p o eína e minal (Fig. 1.3). Figu a 1.3 Es u u a e composição dos adeno í us. (a) O ganização da cápside i al, (b) P o eínas que se encon am no in e io da cápside. Os esquemas são modelos con uídos a pa i de écnicas de c iomic oscopia elec ónica e c is alog a ia de aios X. Adap ado de Ma ín C.S. (2012) (35). In odução 6 1.1.2 O ganização genómica Os adeno í us são í us de genoma de DNA de cadeia dupla, linea , com 26 a 45 kb de comp imen o. O genoma dos adeno í us ap esen a epe ições e minais in e idas (ITR, de In e ed Te minal Repea s) com amanhos de 36 a 200 pb, consoan e o ipo de adeno í us. As ITR, localizadas nas ex emidades 5’ e 3’, se em de o igem de eplicação do genoma i al e são sequências al amen e conse adas en e os di e en es ipos de adeno í us (36). Todos os adeno í us humanos ap esen am uma o ganização genómica semelhan e (Fig. 1.4). O genoma des es í us es á di idido em ês egiões: p ecoce “E” (do inglês ea ly), in e média e a dia “L” (do inglês la e), que co espondem às ases do ciclo eplica i o em que são exp essas. Na ase p ecoce são ansc i os genes que modulam as unções celula es, acili ando assim a eplicação do DNA i al e pos e io ansc ição dos genes a dios. Na ase a dia, os genes ansc i os codi icam p incipalmen e p o eínas es u u ais, necessá ias à mon agem da pa ícula i al. No genoma i al exis em oi o unidades de ansc ição dependen es da RNA- polime ase II. Cinco unidades de ansc ição p ecoce (E1A, E1B, E2, E3 e E4), duas unidades de ansc ição in e média (pIX e PIVa2), e uma unidade de ansc ição a dia p incipal (MLTU) que é p ocessada em cinco amílias de mRNAs (L1 a L5). Os adeno í us codi icam ambém pequenos segmen os de RNA, VAI e VAII, que são ansc i os pela RNA-polime ase III (37). In odução 7 Figu a 1.4 - O ganização do genoma do HAdV-40. O genoma é ep esen ado pela linha ho izon al cen al ma cada em in e alos de 5kpb. As caixas acima da linha ep esen am as p o eínas que são codi icadas na cadeia de DNA de sen ido posi i o e as caixas abaixo da linha ep esen am as p o eínas que são codi icadas na cadeia de DNA de sen ido nega i o. A di eção da ansc ição é indicada pelas se as nas caixas que indicam as unidades ansc icionais Adap ado de Tiemesse, C.T., e al. (1995) e Jones II, M.S., e al (2007) (36) (38). 1.1.3 Ciclo Replica i o O ciclo eplica i o dos adeno í us ap esen a uma ase inicial que comp eende a en ada do í us na célula hospedei a, a passagem do genoma i al pa a o núcleo, e a ansc ição e adução de genes p ecoces. Es es e en os iniciais p omo em a eplicação do DNA e consequen emen e a ansc ição e adução de genes a dios, que po sua ez le am à mon agem das p o eínas es u u ais e ma u ação da pa ícula i al (Fig. 1.5) (39). Os adeno í us ligam-se a ece o es da célula hospedei a a a és das suas ib as. Os ece o es podem se do ipo CAR (Coxsackie-Adeno í us Recep o ), u ilizado pela maio pa e dos ipos de adeno í us (HAdV-A, -C a -F), MHC-I (Complexo Majo de His ocompa ibilidade Classe I), CD46 (HAdV-B), CD80 e CD86, In eg inas αMβ2 e αLβ2, e ácido siálico (40) (39). Pa a além dos ece o es, a célula ambém em co- ece o es, as in eg inas α β (α β3 e α β5), que in e agem com a base do pen ão. Es as In odução 8 in e ações conduzem à in e nalização da pa ícula i al po mecanismos de endoci ose mediada po cla ina [Fig. 1.5 (A)] (37). A pa ícula i al é ans e ida pa a um compa imen o endossomal in acelula , onde o í us so e al e ações con o macionais de ido ao pH baixo. O pH ácido conduz ambém à a i ação da p o eína VI, que p omo e a pe meabilização da memb ana do endossoma, e consequen e libe ação da subpa ícula i al pa a o ci oplasma [Fig. 1.5 (B)]. As subpa ículas i ais são anspo adas pelos mic o úbulos, po in e médio de p o eínas mo o as como a dineína e a dinac ina a é à memb ana nuclea (37) (39). Figu a 1.5 - Ciclo eplica i o dos adeno í us. Adap ado de Lenae s, L., e al. (2008) (41) A subpa ícula i al liga-se às p o eínas CAN/Nup214 do complexo do po o nuclea (NPC). Es a ligação ec u a his onas nuclea es que, po sua ez, ec u am impo inas e a o es ci oplasmá icos, o que esul a na desmon agem inal da cápside e pos e io en ada do genoma i al no núcleo [Fig. 1.5 (C)]. In odução 9 No núcleo, inicia-se a ansc ição dos genes p ecoces. O gene E1A é o p imei o a se exp esso, e em como unção modela o me abolismo da célula hospedei a, o nando-a mais susce í el à eplicação do í us. O gene E1B codi ica p o eínas que bloqueiam a apop ose, es imulada pelas unções de E1A. A unidade ansc icional E2 codi ica as p o eínas necessá ias à eplicação, como a DNA-polime ase i al, a p o eína de ligação a DNA (DBP, DNA binding p o ein) e a p o eína e minal (TP, e minal p o ein). P o eínas codi icadas pelos genes E3 con ibuem pa a a inibição da apop ose e impedem que as células T ci o óxicas (CTL) econheçam células in e adas pelo í us. Os genes E4, pa a além de es a em en ol idos no bloqueio da apop ose, acili am a adução do mRNA i al a dio [Fig. 1.5 (D)] (37) (39) (42). Como o genoma dos adeno í us ap esen a ITRs, cada uma das cadeias possui uma o igem de eplicação. Na eplicação do DNA i al, os adeno í us u ilizam como p ime pa a inicia o p ocesso a pTP (p ecu so da p o eína e minal), que se encon a co alen emen e ligada à ex emidade 5’ em ambas as cadeias. Com o auxílio dos a o es de eplicação celula es N -1 e Oc -1, a DNA-polime ase i al, liga-se à pTP na o igem de eplicação e inicia o p ocesso de sín ese de uma no a cadeia no sen ido 5’- 3’. À medida que a cadeia ma iz é lida, a cadeia complemen a é deslocada da dupla hélice e e es ida po DBP. Quando a p imei a cadeia acaba de se sin e izada, a cadeia pa en al complemen a deslocada o ma uma es u u a ci cula , a a és do empa elhamen o das ex emidades, o iginando dsDNA com uma o igem de eplicação e pe mi indo que a DNA-polime ase i al inicie a sín ese de uma no a cadeia. Imedia amen e a segui à sín ese do DNA i al, os genes a dios começam a se ansc i os, essencialmen e pa a adução de p o eínas es u u ais. Apesa des as se em sin e izadas no ci ossol, a mon agem da pa ícula i al oco e no núcleo [Fig. 1.5 (E)]. P imei o é o mada uma pa ícula azia com hexões, pen ões e ib as [Fig. 1.5 (F)]. Uma p o eina codi icada pelo mRNA L4 ajuda na ag egação dos hexões. De seguida, p o eínas codi icadas po L1 auxiliam a encapsidação do DNA i al. Numa ase inal da mon agem, oco em co es p o eolí icos que o iginam p o eínas da cápside como a IIIa, TP, VI, VII, e µ [Fig. 1.5 (G)]. A pa ícula i al o na-se assim es á el e in eciosa. A memb ana nuclea da célula hospedei a o na-se pe meá el, o que acili a a saída do In odução 10 i us pa a o ci oplasma. Po sua ez, há uma desin eg ação da memb ana plasmá ica, o que pe mi e a libe ação do í us da célula [Fig. 1.5 (H)]. 1.1.4 Epidemiologia Os HAdVs êm sido associados a uma g ande a iedade de doenças e, apesa de não exis i uma elação es i a en e o ipo de HAdV e a doença p o ocada, é possí el aze gene alizações. Ce ca de 7% das in eções das ias espi a ó ias em c ianças êm como agen e e iológico HAdV-C1, -C2, -C5 e -C6 e, ocasionalmen e, -B3 e -B7. Pa a além des es úl imos, ambém os ipos HAdV-B16, -B21, -B50 e -E4 es ão associados a Doença Respi a ó ia Aguda (DRA) em adul os, especialmen e em ec u as mili a es (42). HAdV-B11 e -B21 êm es ado elacionados com cis i e hemo ágica aguda, enquan o os í us da espécie D, e em pa icula os ipos HAdV-D8, -D19, -D37, -D54 o am iden i icados em casos espo ádicos e su os de que a oconjun i i e epidémica g a e. (38). Os ipos HAdV-F40 e -F41 são os mais equen emen e associados a casos de gas oen e i e aguda, e po isso denominados “adeno í us en é icos”. Es es dois ipos são esponsá eis po 1 a 22% dos episódios de dia eia em c ianças (43) (44) (45) (46) (47). No en an o, os adeno í us causado es de in eções espi a ó ias podem ap esen a exc eção ecal p olongada, mesmo quando já não são de e ados nas mucosas espi a ó ias (48), di icul ando a sua associação a doença en é ica quando de e ados em amos as ecais de indi íduos com dia eia. Assim, além dos adeno í us en é icos, ou os adeno í us como os HAdV-A12, -A18, -A31, -B3, -B7 -C1, -C2, -C5, -D8, -D9, -D10 -D15, -D17 o am iden i icados em casos de dia eia em c ianças (17) (19) (21) (43) (44) (46). Ainda, em consequência da epidemia de SIDA, o am iden i icados em indi íduos imunocomp ome idos com pneumonia e/ou dia eia uma sé ie de no os adeno í us da espécie D, designadamen e HAdV-D20, -D22, -D26, -D28a -D30, -D32, -D37, -D43 a –D49, -D60 e -D62 (49) (50) (51). Num es udo publicado em 2007, num doen e com gas oen e i e oi iden i icado um no o ipo, HAdV-52, e c iada uma no a espécie, HAdV-G (38). Nos dois úl imos anos, o am iden i icados em ezes de c ianças In odução 11 com GEA adeno í us dos ipos HAdV-D65 e -D67 (52) (53). Cu iosamen e, e p o a elmen e de ido à coin ecção com di e en es ipos pode se comum a ní el da mucosa in es inal, a sequenciação e análise ilogené ica de alguns des es í us e elou se em í us ecombinan es en ol endo dois ou mais ipos já conhecidos (51) (52) (53). A in eção po HAdVs oco e globalmen e, e com uma axa de de eção semelhan e en e o sexo masculino e eminino (54). A maio ia dos adeno í us a e a c ianças com idade in e io a 2 anos (20) (43) (44) (55) (56). Es udos longi udinais demons a am que es es í us não ap esen am a iações de de eção ao longo do ano (46) (54) (55) (57). Po ém, alguns es udos de e am ligei os picos no in e no e na p ima e a (12) (43) (44) (45). 1.2 As o í us Os as o í us o am desc i os em 1975, p imei o po Apple on e Higgins e mais a de po Madeley e Cosg o e, quando da obse ação, po mic oscopia ele ónica, de pa ículas i ais em o ma de es ela em amos as de ezes de c ianças com GEA (58) (59). Em 1995, o ICTV c iou a amília As o i dae pa a inclui í us com genoma de RNA de cadeia simples e pola idade posi i a, com sime ia icosaéd ica (28-41 nm de diâme o), sem in óluc o e com o ma de es ela de cinco ou seis pon as. Es a amília inclui dois géne os, A as o i us, de que azem os as o í us que in e am espécies a iá ias e Mamas o i us, que inclui os as o í us que in e am uma la ga a iedade de mamí e os. Segundo o ICTV, cada um dos géne os inclui á ias espécies baseadas na pa ilha de >75% de iden idade da sequência de aminoácidos da p o eína da cápside (ORF2), a egião mais a iá el do genoma. O géne o Mamas o i us, com pelo menos 19 espécies, inclui uma espécie p o ó ipo dos as o í us humanos (HAs V ou mamas o í us 1), al amen e di e sa, cons i uída po oi o genó ipos (HAs V-1 a -8), co esponden es aos oi o se o ipos In odução 18 1.3.2 O ganização genómica O RNA genómico i al es á co alen emen e ligado a uma p o eína i al, VPg, na ex emidade 5’ e possui uma cauda poliadenilada em 3’. Em ambos os ex emos do genoma exis em UTRs, com es u u as secundá ias, e olu i amen e conse adas (100). Figu a 1.8 - O ganização genómica dos no o í us. Rep esen ação esquemá ica da ORF1, -2, e - 3, e p o eínas co esponden es. Adap ado de Hoa T an, T.N., e al. (2013) (101) O genoma da maio ia dos no o í us es á o ganizado em 3 ORFs (ORF1, 2 e 3) (Fig. 1.8). A ORF1 ocupa os dois e ços 5’ do genoma e codi ica uma polip o eína que ai o igina seis p o eínas não es u u ais (p48, NTPase, p22, VPg, p o einase 3C e RdRp) necessá ias à eplicação i al, sendo aduzida di e amen e a pa i do RNA genómico i al. A ORF2 e a ORF3, codi icado as das p o eínas es u u ais, são aduzidas a pa i de um RNA subgenómico de 2,4 kb (78). A ORF2 codi ica a p incipal p o eína da cápside i al, VP1, com os domínios NS e P. Na junção en e a ORF1 e a ORF2 (≈17 nucleó idos) é possí el encon a o e simila idade de sequências den o dos genog upos indi iduais, e como al é a egião de eleição a se analisada quando se p e ende de e mina os genog upos (101). A e cei a ORF codi ica uma p o eína da cápside pouco abundan e, VP2, que p omo e a encapsidação do RNA genómico e a es abilidade de VP1 (27) (101). A ORF2 é aduzida a a és de um mecanismo de e minação/ einiciação (102). In odução 19 1.3.3 Ciclo Replica i o Os no o í us humanos (NoVs) não se eplicam em cul u as celula es e, a é à da a apenas os no o í us mu inos podem se mul iplicados em cul u a. Assim mui o dos dados do ciclo eplica i o esul am da u ilização de no o í us mu ino ou de VLPs de NoVs. A adso ção dos no o í us à célula hospedei a en ol e a ligação do subdomínio P2 da p o eína VP1 a açúca es da supe ície celula que, no caso dos NoVs, são an igénios do g upo de his ocompa ibilidade-sanguíneo (HBGA, his o blood g oup an igens). Es e ac o explica a co elação demons ada en e susce ibilidade à in eção e o es a u o sec e o , co esponden e a um gene FUT2 uncional necessá io pa a a exp essão de HBGA (103). Após ligação a HBGA [Figu a 1.9 (A)] (101), o í us en a na célula po um mecanismo ainda não elucidado, so e descapsidação e consequen e libe ação do RNA genómico i al no ci oplasma [Figu a 1.9 (B)]. VPg, ligada à ex emidade 5’ do genoma, ec u a a o es de iniciação da adução da célula hospedei a que in e agem com as es u u as secundá ias do RNA pa a o ma um complexo de iniciação da adução [Figu a 1.9 (C)] (104). A ORF1 é aduzida numa polip o eína que, po sua ez, é co ada pela p o einase 3C i al em seis p o eínas não es u u ais que i ão pa icipa na eplicação do RNA i al (27). A eplicação do RNA i al deco e em associação com complexos memb ana es pe inuclea es induzidos po p48 e p22 (105). A cadeia de RNA de pola idade posi i a se e como molde à sín ese de um RNA in e mediá io de pola idade nega i a. A eplicação em início na ex emidade 3’ da cadeia ma iz, e pa a al a RdRp u iliza um mecanismo de iniciação de no o [Figu a 1.9 (D)]. Po sua ez, a cadeia de RNA de pola idade nega i a o mada, se e de molde à ansc ição do RNA genómico, de pola idade posi i a, e subgenómico. Nes a ase a RdRp u iliza um mecanismo de iniciação dependen e de VPg, uncionando es a como p ime pa a a sín ese das no as cadeias [Figu a 1.9 (E)] (27) (101). In odução 20 Figu a 1.9 - Ciclo eplica i o dos no o í us. Adap ado de Tho ne , L. G., e al. (2014) (106) Após a sín ese do RNA subgenómico, oco e a adução das p o eínas VP1 e VP2, necessá ias à mon agem do í ião [Figu a 1.9 (F)]. Os mecanismos de mon agem da cápside, encapsidação do genoma e saída dos i ões são la gamen e desconhecidos. Como ou os í us da amília Calici i idae, pensa-se que os no o í us induzem a apop ose da célula, le ando assim a al e ações da memb ana celula e à saída dos i iões [Figu a 1.9(G)] (101). In odução 21 1.3.4 Epidemiologia A ní el global, os no o í us são conside ados uma das p incipais causas de gas oen e i e a e ando indi íduos de odas as idades, an o em países indus ializados como em países em ias de desen ol imen o. De um modo ge al, pode-se dis ingui qua o ca ego ias epidemiológicas pa a os no o í us: i) su os de gas oen e i e p o ocados po alimen os ou água con aminados, ii) in eção de imunocomp ome idos e idosos, iii) casos espo ádicos de gas oen e i e em c ianças com menos de 5 anos de idade e i ) casos espo ádicos de GEA em adul os (101). A segui aos o a í us, os no o í us são a segunda causa de gas oen e i e i al em c ianças com idade in e io a 5 anos. Es ima-se que nes a aixa e á ia, es es í us enham sido esponsá eis po 12%- 17% das hospi alizações po dia eia en e 1990 e 2014 e 200 000 mo es anuais nos países em ias de desen ol imen o. (27) (107) (108) (109). Os no o í us a e am indi íduos de odas as idades, endo uma maio p e alência em c ianças com idades in e io a 2 anos (18) (110) (111). Os no o í us a ingem de igual modo indi íduos do sexo eminino e masculino (18) (112), no en an o exis em es udos que desc e em maio p e alência num dos sexos (113) (114). É possí el iden i ica casos de gas oen e i e po in eção com NoVs du an e odo o ano. Con udo, é possí el gene aliza pad ões de sazonalidade en e os países de clima empe ado e os de clima opical. Nos países de clima empe ado, a gas oen e i e po NoVs é mais comum no ou ono, in e no e início da p ima e a, sendo como al conhecida po win e omi ing disease (115) (116) (117). Nos países de clima opical, os su os são mais equen es du an e a es ação mais ia e seca (18) (111) (113). A a és de es udos de me a-análise, Ahmed e colabo ado es concluí am que os NoVs são esponsá eis po 18% dos casos de gas oen e i e aguda em odo o mundo. O g upo ambém e i icou que os casos de GEA po NoVs são mais comuns na comunidade e em doen es em ambula ó io, do que em doen es hospi alizados (108). Es udos de epidemiologia molecula ela am equen emen e a co-ci culação de á ios genó ipos de no o í us dos genog upos GI e GII, sendo es e úl imo esponsá el po 70-100% dos casos espo ádicos (18) (107) (110). Exis e uma associação In odução 22 signi ica i a en e es es dois genog upos e o modo de ansmissão. Os su os com o igem em GI, compa a i amen e com GII, es ão mais elacionados com ansmissão po ia de água con aminada, o que pode e le i a maio es abilidade de GI na água (118) (119). Po sua ez, os no o í us GII, em compa ação com os GI, es ão mais associados a su os em locais públicos semi echados, como la es, cen os de dia, es au an es, e na ios de c uzei o, onde p edomina a ansmissão po alimen os con aminados e pessoa-a-pessoa (27) (120) (121) (122). Globalmen e, os no o í us GII.4 são esponsá eis po ce ca de 55-85% dos casos de GEA po es es í us (27) (123). Es e é o genó ipo mais i ulen o, uma ez que, pa a além da ele ada p e alência, os indi íduos in e ados com no o í us GII.4 ap esen am uma maio axa de hospi alização e de mo es, compa a i amen e com indi íduos in e ados com no o í us de ou os genó ipos (27) (124). Na úl ima década, depois de GII.4, GII.3 su ge como o segundo mais p e alen e globalmen e, embo a nalguns países es a posição seja ocupada po GII.6. Os genó ipos GI.1, GI.3, GI.4, GI.6, GII.1, GII.2 e GII.7, são equen emen e iden i icados, mas com p e alências in e io es (14) (18) (27) (56) (101) (111) (123) (125). O aumen o global da p e alência de no o í us como agen e e iológico de GEA em sido causado pelo apa ecimen o de no as a ian es de GII.4 à semelhança do que acon ece com o í us da g ipe. Desde o início dos anos 90, no as a ian es êm su gido a cada 2-3 anos. Desde 1995, as a ian es de GII.4 já le a am a pelo menos se e epidemias globais de gas oen e i e. A es i pe GII.4 US95/96 oi p imei o iden i icada em Ingla e a e depois nos EUA, onde oi esponsá el po ce ca de 55% dos su os de no o í us. En e 1995-1997, a es i pe ap esen ou uma ci culação global, endo sido iden i icada no Canadá, Aus ália, Holanda, China e Alemanha (125) (126). En e 2000 e 2004, a es i pe US95/96 oi subs i uída po uma no a a ian e, a GII.4 Fa ming on Hills, esponsá el po ce ca de 45% dos su os de no o í us que oco e am nos EUA em 2002. A p e alência subiu pa a 64% em su os que oco e am em c uzei os (127). Es a a ian e oi ambém de e ada na Aus ália (125). Simul aneamen e, na Ásia, e p incipalmen e na Eu opa, eme giu ou a a ian e, GII.4b (128) (129) (130). In odução 23 Em 2004, su giu uma no a epidemia global, o iginada pela a ian e GII.4 Hun e . Es a a ian e oi de e ada na Aus ália, Ásia, Eu opa e Á ica do No e (125) (130) (131) (132) (133). Dois anos mais a de, a a ian e Hun e oi subs i uída po duas a ian es que co- ci cula am na Ásia, Amé ica do No e e Sul, Eu opa e Aus ália, as a ian es 2006a (GII.4 Lau ens) e 2006b (GII.4 Mine a) (14) (132) (134) (135) (136). Em 2009, eme giu uma no a a ian e, a GII.4 New O leans, que en e 2009-2010 oi esponsá el po 60% dos su os que oco e am nos EUA (137). Es a a ian e oi ambém iden i icada nou os países, como Ingla e a, I ália, Aus ália, Á ica do Sul, Bu kina Faso, Rússia (138) (139) (140). Con udo, en e 2005 e 2010, a a ian e 2006b oi conside ada p edominan e, ep esen ando ce ca de 90% das a ian es GII.4 isoladas em odo o mundo (101). Em 2012, no os su os de no o í us começa am a eme gi em di e sos países, de ido a uma no a a ian e, GII.4 Sydney. Es a a ian e ecombinan e oi iden i icada na cidade aus aliana, onde nesse mesmo ano oi esponsá el po ce ca de 30% dos su os de GEA. En e 2012-2013, a a ian e Sydney oi esponsá el po mais de 55% dos su os que oco e am em Ingla e a e nos EUA, em apenas 4 meses o am epo ados mais de uma cen ena de su os po no o í us GII.4 Sydney (138) (141). A a ian e ambém oi iden i icada em países como I ália, China, Bangladesh, B asil, Á ica do Sul, Ma ocos, en e ou os (139) (142) (143) (144) (145) (146). A ualmen e a a ian e GII.4 Sydney é p edominan e, e segundo uma ede online de labo a ó ios de saúde pública nos EUA, a CaliciNe , en e Se emb o 2013 e Agos o 2014, a a ian e oi esponsá el po 56% dos su os de no o í us que oco e am nos EUA (147). In odução 24 1.4 Obje i os Dados de 2010 e elam que a dia eia oi esponsá el po 15% das mo es em c ianças com idade in e io a 5 anos, em Angola (11). Des a pe cen agem sabe-se que 33% co espondem a mo es elacionadas com a in eção po o a í us, e os es an es 67% a mo es de ido a dia eia p o ocada po ou os agen es e iológicos (148). Em colabo ação com o Minis é io Nacional de Saúde e com a Di eção Nacional de Saúde Pública de Angola, iniciou-se um es udo pilo o com o obje i o p incipal de iden i ica agen es i ais, nomeadamen e adeno í us, as o í us e no o í us, p esen es em ezes de c ianças com idade in e io a 5 anos com dia eia aguda, não p o ocada po o a í us, que eco e am a á ias unidades de saúde das p o íncias de Cabinda, Luanda, Huambo e Zai e em Angola. O es udo e e como obje i os mais especí icos: 1. De e mina a p e alência da in eção po adeno í us, as o í us e no o í us na população acima mencionada; e 2. P ocede à ca ac e ização gené ica das es i pes de e adas pa a a alia a di e sidade de genó ipos daqueles í us ci culan es na população al o. Ma e iais e Mé odos 25 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 População es udada O es udo oi ealizado em Angola, nas p o íncias de Cabinda, Luanda, Huambo e Zai e. A população al o do es udo oi c ianças com idade in e io a cinco anos, de ambos os sexos, e que ap esen assem um quad o de GEA (i.e. com dia eia, de inida po ês ou mais dejeções líquidas ou moles, num pe íodo de 24 ho as, e/ou ómi os). As c ianças o am a endidas na consul a de hospi ais ou cen os de saúde da sua á ea de esidência. As amos as de ezes o am colhidas em duas ases. Numa p imei a ase de Junho a Agos o de 2012, du an e o pe íodo de época seca, localmen e designada po cacimbo, que em Angola se es ende de Maio a Agos o, e numa segunda ase de Se emb o a Ou ub o de 2013, na es ação das chu as, que deco e de Se emb o a Ab il. Nas di e sas unidades de saúde, a a aliação e a iagem clínica das c ianças o am ealizadas pelo en e mei o/médico assis en e, o qual inha a esponsabilidade de e i ica se a c iança p eenchia os c i é ios de inidos pa a a população al o do es udo, explica os obje i os do mesmo e pedi consen imen o ao esponsá el legal/acompanhan e da c iança. Caso conco dasse em colabo a no es udo, o esponsá el pela c iança p eenchia um o mulá io de in o mação e consen imen o in o mado (Anexo 6.1), onde au o iza a a ecolha de uma amos a de ezes da c iança e a u ilização dos dados clínicos da mesma. Os dados clínicos o am ob idos pelo mé odo de inqué i o (Anexo 6.2), p eenchido pelo en e mei o, em colabo ação com o esponsá el da c iança. O p o ocolo de es udo, o ques ioná io e o o mulá io de consen imen o in o mado o am ap o ados pelas Comissões de É ica do Ins i u o de Higiene e Medicina T opical e de Angola. Ma e iais e Mé odos 26 Figu a 2.1 - Mapa de Angola. As unidades de saúde onde oi e e uada a colhei a de amos as es ão assinaladas de 1 a 10, sendo 1 – Hospi al Municipal de Chinga (HMC); 2 - Hospi al Municipal de M'Banza Kongo (HMMK); 3 - Cen o de Saúde Ma e no-In an il de M'Banza Kongo (CSMI); 4 - Cen o de Saúde da Paz (CSP); 5 - Hospi al do Al o-Hama (AH); 6 - Hospi al Municipal de Caála (C); 7 - Cen o de Saúde de Calenga (CAL); 8 - Cen o de Saúde do Casseque III (CIII); 9 - Hospi al Municipal de Bailundo (B) e 10 - Cen o de Saúde Ma e no- In an il de Minei a (M). 2.2 Amos a Num es udo ealizado an e io men e, com o obje i o de de e mina a p e alência da in eção e ca ac e iza os genó ipos de RV ci culan es nas di e en es egiões, 343 amos as o am es adas pa a es e í us, sendo 121 posi i as. As es an es 222, p o enien es de c ianças com idade in e io a 5 anos com gas oen e i e aguda causada po ou o agen e e iológico, o am usadas no p esen e es udo e analisadas pa a HAdVs, HAs Vs e NoVs seguindo, gene icamen e, o luxog ama da Fig. 2.2. 1 3 6 Ma e iais e Mé odos 27 Figu a 2.2 - Fluxog ama do p ocedimen o usado na geno ipagem de adeno í us, as o í us e no o í us. As caixas a acejado ep esen am as e apas de de eção dos í us nas amos as ecais, enquan o as caixas com linha con ínua ep esen am e apas de geno ipagem. 2.3 Adeno í us 2.3.1 De eção de HAdVs po es e ápido De modo a de e a an igénios de HAdVs p esen es nas amos as de ezes, oi u ilizado o ki “Ce Tes Ro a i us-Adeno i us” (Ce Tes Bio ec S.L., Espanha), seguindo as ins uções do ab ican e. O es e quali a i o imunoc oma og á ico de e a simul aneamen e a p esença de an igénios de adeno í us e o a í us. Ma e iais e Mé odos 34 Pa a a eação de ampli icação oi u ilizada a mis u a SensiFAST™ P obe Lo-ROX (2x) (BIOLINE), de aco do com as ins uções do ab ican e. Os p ime s usados na eação o am NVG1F, NVG1R, NVG2F, COG2R (Tabela 2.6), numa concen ação de 0,5 pmol/µl, a que o am ambém adicionadas duas sondas TaqMan®, uma especí ica pa a o genog upo I (NoVG1 [1pmol/µl]), e ou a pa a o genog upo II (NoVG2 [1pmol/µl]) (Tabela 2.6), num olume o al de 20 µl. A eação de PCR em empo eal oi execu ada no e mociclado 7500 Fas Real-Time PCR Sys em (Applied Biosys ems). De modo a ga an i o con olo de qualidade do ensaio, o am u ilizados duplicados de con olos posi i os pa a cada genog upo, e de con olos nega i os. O p ocesso de ampli icação oi iniciado com um passo de a i ação da enzima (95ºC, 10min.), seguindo-se os de desna u ação (95ºC, 15 seg) e hib idação/ex ensão (60ºC, 1min.), epe indo-se ao longo de 45 ciclos. Com base na magni ude do sinal ge ado, oi possí el de e a a p esença de no o í us GI e/ou GII. Tabela 2.6 P ime s e sondas u ilizadas na eação de PCR em Tempo Real (151) Sequência (5’ – 3’) Localização no genoma GI P ime NVG1F CGY TGG ATG CGN TTC CAT GA 5294–53131 P ime NVG1R GTC CTT AGA CGC CAT CA TC 5397–53791 Sonda NoVG1 [6FAM]AG ATY GCG RTC YCC TGT CCA[BHQ1] GII P ime NVG2F ATG TTY AGR TGG ATG AGR TTY TC 5012–50342 P ime COG2R TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA 5100–50812 Sonda NoVG2 [JOE]TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT[BHQ1] Ma e iais e Mé odos 35 1 A localização da sequência no genoma é baseada no no o í us GI.1 ( í us No walk, núme o de acesso GenBank NC 001959); 2 A localização da sequência no genoma é baseada no no o í us GII.1 (núme o de acesso GenBank HCU07611). 2.5.2 Ampli icação po PCR da egião NS dos no o í us A ampli icação da sequência da egião NS de no o í us GI oi e e uada a a és de uma eação de PCR, u ilizando o p ime o wa d NVG1F (Tabela 2.6) e o p ime e e se G1SKR (5’- CCA ACC CAR CCA TTR TAC A-3’ 5652-5671 n ), 0,5 pmol/μl de cada, e a mis u a Sup eme NZYTaq 2x G een Mas e Mix (Nzy ech,Lisboa, PT), de aco do com as indicações do ab ican e. Fo am ealizadas duas eações de PCR sucessi as com o mesmo pa de p ime s, u ilizando-se 1 μl de cDNA na p imei a eação e na segunda 1,5 µl do p odu o ampli icado na p imei a. A ampli icação iniciou-se com um passo de desna u ação (94ºC, 15 min), seguindo-se os passos de desna u ação a 94ºC (30 seg), hib idação a 55ºC (30 seg) e ex ensão a 72ºC (60 seg), epe idos 35 ciclos. O PCR e minou com uma e apa de ex ensão a 72ºC du an e 5 min. Pa a a ampli icação da sequência NS de no o í us GII ambém se u ilizou a mis u a Sup eme NZYTaq 2x G een Mas e Mix (Nzy ech, Lisboa, PT), de aco do com as indicações do ab ican e. Na p imei a eação de hemi-nes ed PCR, os p ime s COG2F (5’ - ATG TTY AGR TGG ATG AGR TTY TC -3’, n 5012-5034) e G2SKR (5’- CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT- 3’, n 5367-5389) o am adicionados pa a uma concen ação inal de 0,5 pmol/μl. U iliza am-se 2 μl de cDNA ma iz, sendo o olume inal de eação de 20 μl. Na segunda eação de hemi-nes ed PCR, o am u ilizados os p ime s G2SKF (5’ - CNT GGG AGG GCG ATC GCA A -3’, n 5046-5064) e GS2KR, na mesma concen ação, e 2 µl do p odu o ampli icado na p imei a eação. Na p imei a eação de hemi-nes ed PCR, a ampli icação iniciou-se com um passo de desna u ação inicial a 95ºC (10 min), seguindo-se os passos de desna u ação a 95ºC (30 seg), hib idação a 57ºC (30 seg) e ex ensão a 72ºC (2 min), epe idos 40 ezes. O PCR e minou com uma e apa de ex ensão inal a 72ºC du an e 5 min. A segunda eação Ma e iais e Mé odos 36 deco eu nas mesmas condições, exce o a empe a u a de hib idação se de 58ºC. Os p odu os de ampli icação o am analisados po ele o o ese em gel de aga ose (2% p/ ). 2.6 Clonagem dos P odu os de PCR no Ve o Plasmídico pGEM®-T Easy Os p odu os de PCR com bandas inespecí icas e/ou quan idade eduzida do agmen o de in e esse o am clonados no plasmídeo pGEM®-T Easy (P omega, EUA) seguindo as ins uções do ab ican e. Resumidamen e, a mis u a de ligação consis iu em 5µl de ampão, 1µl de solução do plasmídeo pGEM®-T Easy (50ng/µl), 1µl de T4 DNA ligase e 3µl do p odu o de PCR a clona . De modo a ob e uma maio axa de ans o man es, as ligações deco e am a 4ºC, du an e a noi e. Pa a a p epa ação e ans o mação de células compe en es, uma cul u a de Esche ichia coli JM109 oi c escida du an e a noi e, a 37ºC, com agi ação (220 pm), em meio líquido de Lu ia Be ani (LB). Na manhã seguin e, ez-se uma diluição 1:100 da cul u a sa u ada, em 20 ml LB. A cul u a oi incubada a 37ºC, com agi ação, a é uma densidade ó ica a 600 nm (DO600) de 0,3-0,5. A cul u a oi en ão cen i ugada a 3000 xg, du an e 10 minu os, a 4ºC. O sob enadan e oi ejei ado e o sedimen o essuspenso cuidadosamen e em 1 ml de TSS io (10% PEG, 5% DMSO, 50 mM MgSO4, em meio LB). A um ubo eppendo de 1,5 ml a e ecido em gelo, o am adicionados 100 μl da suspensão de células e 5 μl da mis u a de ligação. A mis u a man e e-se em gelo du an e 30 min, sendo em seguida subme ida a choque é mico du an e 90 segundos a 42ªC e colocada no amen e em gelo 5 min. Adiciona am-se en ão 900 μl de meio LB líquido à suspensão, seguindo-se uma incubação a 37ºC, com agi ação sua e (100 pm) du an e 90 min. Numa placa de meio LB sólido, i.e. meio LB líquido geli icado com 5% de aga , suplemen ado com X-Gal (80 µg/ml), IPTG (20 µg/ml) e ampicilina (100 µg/ml), Ma e iais e Mé odos 37 p ocedeu-se ao espalhamen o de 100 µl da suspensão bac e iana ans o mada. As placas o am incubadas a 37ºC, du an e a noi e. Repica am-se colónias b ancas, i.e. ans o man es possuindo um plasmídeo com o gene da β-galac osidase in e ompido pela ligação de um inse o, pa a meio LB líquido (3ml) suplemen ado com ampicilina (100 µg/ml) e incuba am-se, a 37ºC, du an e a noi e, com agi ação cons an e. As bac é ias o am colhidas po cen i ugação a 13500 pm, 1 min, o sob enadan e decan ado e o sedimen o essuspenso em 300µl de TE (10mM T is, 1 mM EDTA, pH 7,4) com 10µg/ml de RNAse. A cada amos a o am adicionados 300 µl de solução de lise (NaOH 200mM/1%SDS), que se mis u a am po in e são, seguiu-se a neu alização com 300 µl de 3M NaOAc, pH 5,5, a 4ºC), igualmen e mis u ado po in e são. A suspensão oi cen i ugada a 16000 xg, 15 min, e o sob enadan e ans e ido pa a no os ubos, onde o DNA plasmídico em suspensão oi p ecipi ado, a a és da adição de igual olume de isop opanol e cen i ugação a 16000 xg, 30 min. O sedimen o oi la ado com 500 µl de e anol a 70% ( / ), seco po cen i ugação sob ácuo e essuspenso em 30 µl de água. Pa a a iden i icação dos ans o man es con endo o inse o do amanho p e endido, p ocedeu-se à diges ão enzimá ica dos plasmídeos ex aídos com a enzima de es ição EcoRI (The mo Fishe Scien i ic Inc., Massachuse s, EUA). A mis u a de eação oi ei a de aco do com as indicações do ab ican e. Após diges ão, analisou-se o pe il ele o o é ico dos p odu os em gel de aga ose (1% p/ ). Os plasmídeos com o amanho de inse o co e o o am selecionados pa a sequenciação. 2.7 Pu i icação e Sequenciação dos P odu os de PCR De modo a se possí el sequencia os p odu os ob idos po PCR, mui os deles i e am de se subme idos a um p ocesso de pu i icação após sepa ação elec o o é ica e emoção da a ia de gel com a banda do amanho espe ado. Pa a al, u ilizou-se o ki “Zymoclean™ Gel DNA Reco e y” (Zymo Resea ch, EUA), seguindo indicações do ab ican e. No caso dos adeno í us e as o í us, o DNA oi eluído em 10 µl de DNA Ma e iais e Mé odos 38 Elu ion Bu e . Pa a e i ica o g au de pu i icação dos p odu os ob idos, es es o am analisados po ele o o ese em gel de aga ose. A pu i icação dos p odu os de PCR de no o í us oi ealizada pela emp esa STAB VIDA (Capa ica, Po ugal) di e amen e a pa i da mis u a de eação. A sequenciação dos p odu os ampli icados oi ealizada ambém na STAB VIDA, pelo mé odo de Sange . Pa a al, o am u ilizados os p ime s GT2F pa a os adeno í us, panAV-R1 e Mon69 pa a os as o í us, e NVG1 e G2SKF pa a os no o í us. Pa a a sequenciação dos p odu os clonados em pGEM®-T Easy, oi u ilizado o p ime T7. 2.8 Análise es a ís ica Todos os dados ecolhidos dos ques ioná ios o am u ilizados na cons ução de uma base de dados. Os dados o am analisados com o so wa e SPSS (S a is ical Package o he Social Sciences), e são 17.0 (IBM SPSS, Chicago, USA). Pa a a análise e compa ação das a iá eis eco eu-se a es es de equência, Qui-quad ado (χ2), T- es , es e exa o de Fishe e ANOVA. Nes a análise es a ís ica, o limi e de signi icância es a ís ica conside ado oi de 95% (p<0,05). Os pa âme os an opomé icos o am calculados com ecu so ao p og ama WHO An h o, e são 3.2.2 (WHO, Suíça), disponí el pa a download no si e da OMS (152). No p og ama são in oduzidos dados como a da a de nascimen o, o sexo, o peso, a al u a e a da a em que a c iança eco eu à unidade de saúde. O p og ama calcula assim, o Índice de Massa Co po al (IMC), e os Z-sco es ela i os ao es ado de malnu ição (peso em elação à idade), es ado de nanismo (comp imen o em elação à idade) e es ado de mag eza (peso em elação à al u a). Segundo es e sis ema de classi icação, quando o alo de Z-sco e pa a o es ado de malnu ição o <-2 SD (s anda d de ia ion) ou <-3SD, a c iança é conside ada malnu ida ou g a emen e malnu ida, espe i amen e. Ma e iais e Mé odos 39 A escala do cálculo de g a idade dos episódios de gas oen e i e e e como base o sis ema de 20 pon os, desc i o po Nakagomi e al. (153). A pon uação oi a ibuída segundo a Tabela 6.1, em anexo. 2.9 Análise de sequências nucleo ídicas Os c oma og amas co esponden es às di e sas eações de sequenciação o am en iados pela STAB VIDA. Os mesmos o am analisados, e as sequências nucleo ídicas, se necessá io, co igidas manualmen e a a és do p og ama BioEdi Sequence Alignmen Edi o , e são 7.2.5 (Ibis Biosciences, Cali ó nia, USA), disponí el pa a download no si e (154). Na edição de algumas sequências oi ambém u ilizado o p og ama GeneDoc, e são 2.7 (155). As sequências edi adas dos ês í us o am sujei as a uma pesquisa no p og ama BLAST (Basic Local Alignmen Sea ch Tool), disponí el no si e do NCBI (Na ional Cen e o Bio echnology In o ma ion; h p://blas .ncbi.nlm.nih.go /Blas .cgi) (156). As sequências em es udo o am compa adas com sequências inse idas na base de dados do NCBI, de modo a iden i ica as que ap esen a am maio homologia. A a és da pe cen agem de simila idade, oi possí el de e mina o genó ipo p o á el das sequências dos í us, e iden i ica as sequências de e e ência a u iliza na cons ução de á o es ilogené icas, designadamen e as que ap esen am maio iden idade ou que ci culam em á eas geog a icamen e p óximas. As sequências nucleo ídicas dos no o í us, pa a além de e em sido sujei as a uma análise BLAST, o am ambém analisadas na e amen a RIVM, (do holandês, Rijksins i uu oo Volksgezondheid en Milieu), e são 1.0, disponí el no si e No oNe (h p://www. i m.nl/en/Topics/N/No oNe ) (157). Com es a e amen a oi possí el de e mina o genó ipo p o á el de no o í us, e quais sequências com maio iden idade, ela i amen e a cada uma das sequências em es udo. Pa a con i ma os esul ados de geno ipagem ob idos nas e amen as bioin o má icas, o am cons uídas á o es ilogené icas pa a sequências pa ciais do Ma e iais e Mé odos 40 gene do hexão dos adeno í us, da ORF1b e da ORF2 dos as o í us, e pa a a egião NS da ORF2 dos genog upos I e II dos no o í us. Pa a a cons ução das di e en es á o es ilogené ica, as sequências nucleo ídicas em es udo o am alinhadas com sequências de e e ência co esponden es pa a os di e en es genó ipos de cada í us. Pa a al, oi u ilizada a aplicação Clus alW, do p og ama BioEdi Sequence Alignmen Edi o . Os alinhamen os múl iplos ob idos o am depois u ilizados no so wa e MEGA (Molecula E olu iona y Gene ics Analysis), e são 6, disponí el pa a download no si e (158). O mé odo u ilizado oi o Neighbo -Joining com o modelo de 2 pa âme os de Kimu a. Nas p e e ências de análise oi ambém selecionada a opção de deleção comple a, semp e que no alinhamen o exis iam espaços. A obus ez de in e ência ilogené ica e, consequen emen e, das opologias suge idas oi a aliada a a és do mé odo de boo s apping, com base em 1000 amos agens alea ó ias, conside ando-se es a is icamen e signi ica i os alo es iguais ou supe io es a 75%. As sequências nucleo ídicas ob idas no decu so do abalho encon am-se em ase de submissão à base de dados GenBank. Resul ados 41 3. RESULTADOS 3.1 Ca ac e ização Demog á ica e Clínica da População Es udada No es udo da in eção po adeno í us, as o í us e no o í us o am analisadas 222 amos as de ezes de c ianças com sin oma ologia de GEA, não in e adas po o a í us, que eco e am a unidades de saúde em qua o p o íncias de Angola em 2012 e 2013. A odas as c ianças que pa icipa am no es udo oi ealizado um inqué i o demog á ico e clínico (Anexo 6.2). Con udo, dos 222 inqué i os ealizados, apenas se e e acesso a 108 (48,6% da amos agem) (Tabela 3.1). Tabela 3.1 Dis ibuição do núme o de c ianças com GEA e espe i os inqué i os po ins i uição de saúde Angolana (2012 e 2013) Núme o de C ianças Núme o de Inqué i os Disponí eis Cabinda Hospi al Municipal de Chinga (HMC) 35 34 Zai e Hospi al Municipal de M'Banza Kongo (HMMK) 10 5 Cen o de Saúde Ma e no-In an il de M'Banza Kongo (CSMI) 6 6 Luanda Cen o de Saúde da Paz (CSP) 17 17 Huambo Hospi al do Al o-Hama (AH) 15 4 Hospi al Municipal de Caála (C) 55 14 Cen o de Saúde de Calenga (CAL) 6 6 Cen o de Saúde do Casseque III (CIII) 3 3 Hospi al Municipal de Bailundo (B) 30 10 Cen o de Saúde Ma e no-In an il de Minei a (M) 45 9 To al 222 108 Resul ados 42 Rela i amen e às ca ac e ís icas demog á icas, 55% (57/103) das c ianças inqui idas pe encem ao sexo masculino e 45% (46/103) ao sexo eminino. A idade das c ianças a iou num in e alo de 1 a 51 meses, sendo a média de idades de 12,4 meses. A maio ia das c ianças, 89,8% (97/108), encon a a-se na aixa e á ia de 0 a 24 meses, inclusi e, e apenas 10,2% (11/108) inha mais de 24 meses. Em elação ao local de habi ação, 77% (81/105) das c ianças esidia em meio u bano, e 23% (24/105) em meio u al (Tabela 3.2). A ní el alimen a , 74,8% (80/107) das c ianças es a a a se amamen ada. Des e g upo, 84,3% (43/51) inge ia ou os alimen os pa a além do lei e ma e no, e 15,7% (8/51), e a exclusi amen e amamen ada. Ce ca de 25% (27/107) das c ianças não es a a a se amamen ada (Tabela 3.2). Em e mos de ca ac e ís icas clínicas, odas as c ianças inham dia eia, uma ez que es e e a um dos a o es de inclusão do es udo. Em média, as c ianças inham dia eia du an e 3,4 dias e ce ca de 3,5 episódios po dia. Ce ca de me ade da população em es udo inha ómi os (46/103), com du ação média de 2,5 dias e 2,5 episódios em 24h, espe i amen e. Apenas 11,8% (11/93) das c ianças possuía uma empe a u a axial igual ou supe io a 37,6ºC e mais de me ade das c ianças não ap esen a a desid a ação (53,5%) nem malnu ição (72,2%). O es ado de a i idade das c ianças oi ambém a aliado, e ce ca de 25% (25/103) ap esen a a um es ado de a i idade “ eduzido”. Em média, a população ap esen a a um índice de massa co po al (IMC) de 16,3 e um g au de g a idade de dia eia de 6,71 (Tabela 3.2). A análise do g au de g a idade da dia eia mos ou que as c ianças com idade igual ou in e io a 24 meses ap esen a am um alo médio pa a a g a idade dos sin omas ligei amen e supe io (6,81 pon os), quando compa ado com c ianças com mais de 24 meses (5,85 pon os), con udo, es es esul ados não são es a is icamen e signi ica i os (p- alue 0,392). E e uou-se uma a aliação do es ado nu icional das c ianças e e i icou-se que mais de me ade das c ianças ap esen a a peso e es a u a no mais pa a a idade e um peso no mal pa a a al u a (Z > -2SD). Po ém, 26,2% das c ianças ap esen a a um peso baixo em elação à idade, 36,2% uma es a u a baixa em elação à idade e 26,9% um peso baixo em elação à al u a (-3SD < Z < -2SD). Nenhuma c iança se encon a a em es ado g a e (Z < -3SD) pa a os ês pa âme os a aliados (Anexo 6.4). Resul ados 43 Tabela 3.2 - Ca ac e ís icas da população al o e elação com a in eção po adeno í us, as o í us e/ou no o í us Va á eis Ca ego ias Nº de c ianças inqui idas (%) C ianças in e adas (%) p- alue Ca ac e ís icas Demog á icas Géne o (n=103) Masculino 57 (55,3) 9 (29) 0,001* Feminino 46 (44,7) 22 (71) Idade (n=108) 0-24 97 (89,8) 29 (85,3) 0,317* >24 11 (10,2) 5 (14,7) Local de Residência (n=105) U bano 81 (77,1) 26 (81,3) 0,618* Ru al 24 (22,9) 6 (18,8) Ca ac e ís icas da Alimen ação Amamen ação (n=107) Sim 80 (74,8) 23 (67,6) 0,339* Não 27 (25,2) 11 (32,4) Amamen ação e inges ão de ou os alimen os? (n=51) Lei e ma e no e ou os alimen os 43 (84,3) 12 (92,3) 0,662* Amamen ação exclusi a 8 (15,7) 1 (7,7) Ca ac e ís icas Clínicas Feb e (n=93) <37,6ºC 82 (88,2) 25 (96,2) 0,173* ≥37,6ºC 11 (11,8) 1 (3,8) Se ≥37,6ºC, du ação média (dias) 2,8 2,5 0,645# Dia eia Du ação média (dias) 3,4 3,0 0,193# Nº ezes/24ho as (média) 3,5 3,7 0,396# Vómi os (n=103) Sim 46 (44,7) 14 (42,4) 0,833* Não 57 (52,8) 19 (57,6) Du ação média (dias) 2,5 2 0,155# Nº ezes/24ho as (média) 2,5 2,5 0,842# Desid a ação (n=101) Sim 47 (46,5) 14 (43,8) 0,831* Não 54 (53,5) 18 (56,3) A i idade (n=103) No mal 78 (75,7) 26 (78,8) 0,806* Reduzida 25 (24,3) 7 (21,2) Malnu ição (n=97) Sim 27 (27,8) 8 (26,7) 0,535* Não 70 (72,2) 22 (73,3) Índice de Massa Co po al (média) 16,3 ± 4,5 15 ± 3,6 0,089# G au de G a idade da dia eia a) (média) 6,71 ± 3,7 6,03 ± 2,9 0,187# a) Classi icação segundo a escala de 20 pon os de Nakagomi (153) * Foi u ilizado o es e es a ís ico exa o de Fishe pa a o c uzamen o de dados e pa a de e mina o alo de signi icância dos mesmos # Foi u ilizado o es e es a ís ico T-S uden pa a compa a alo es médios e de e mina o alo de signi icância dos mesmos O limi e de signi icância es a ís ica é de 5%. Os alo es de p<0,05 es ão assinalados a neg i o. Resul ados 50 genó ipos HAdV-1, -2, -5, -9, -15/29, -18, 26, -27, -40, -41 e -61, endo-se con i mado po in e ência ilogené ica os esul ados da pesquisa BLAST. Os onze genó ipos iden i icados co espondem a qua o espécies di e en es, A, C, D e F. Na Fig. 3.6 es á ap esen ada g a icamen e a p e alência dos di e en es genó ipos iden i icados. A maio ia das es i pes de adeno í us Angolanas (n=11) pe ence à espécie F, da qual azem pa e os genó ipos 40 e 41 conhecidos como adeno í us en é icos. Os í us M8, B34, B4 e AH8 ap esen am 100% de simila idade com a es i pe Dugan ci culan e no Japão (AB330121/Hu/AdV-40/Dugan/JPN/2000) e 99,8% com a es i pe Thai15139 da Tailândia (FJ228470/Hu/AdV-40/Thai15139/THA/2003), ambas pe encen es ao genó ipo HAdV-40. Os adeno í us classi icados como HAdV-41 são mais abundan es (n=7). Pela opologia da á o e oi possí el obse a a o mação de dois subg upos de HAdV-41, GTC-1 e GTC-2 (GTC, genome ype clus e ). Em GTC-1, as sequências HMC8, HMC15, HMC27 e HMC28 ap esen am simila idade ≥ 99,2% ela i amen e à es i pe Tak (DQ315364/Hu/AdV-41/Tak/NED/2008). Em GTC-2 su gem as sequências B38 e M57 que es ão es ei amen e elacionadas com uma sequência de adeno í us da Índia (HQ005281/Hu/AdV-41/500860/IND/2008). Nes e clus e a sequência nucleo ídica B25 ap esen a maio simila idade (99,6%) com uma es i pe de o igem Alemã (EF110983/Hu/AdV-41/G-A13/GER/2007). Em elação à espécie A dos adeno í us, onde es ão incluídas apenas duas sequências i ais Angolanas, a sequência CSP5 ag upa-se com as sequências de e e ência do genó ipo 18. Quan o à amos a CAL3, po BLAST oi classi icada como HAdV-8 ou -61. Po análise ilogené ica con i mou-se es a sequência como sendo de HAdV-61, uma ez que es á es ei amen e elacionada com JF964962/Hu/AdV- 61/5082/JPN/2004, única e e ência pa a es e genó ipo nas bases de dados. Pela análise de dis âncias, na egião analisada CAL3 é 98,1% simila a es e í us iden i icado no Japão. Na espécie C de adeno í us, o am iden i icadas no o al sequências des es í us em seis amos as Angolanas, as quais se ag upam com sequências dos genó ipos HAdV-1, - 2 e -5. A amos a HMC2 o ma um g upo mono ilé ico com as sequências de e e ência pa a o genó ipo HAdV-2. Já as amos as geno ipadas como HAdV-1 (CSP21, CIII4, M11, M29) o mam um subg upo, supo ado po um alo de boo s ap de 87%, Resul ados 51 sepa ado das sequências de e e ência. Cu iosamen e es e g upo de sequências ap esen a a um p odu o de PCR com um amanho ligei amen e supe io ao das es an es amos as. CSP9 é a única sequência Angolana classi icada como HAdV-5. Rela i amen e às sequências classi icadas como genó ipos da espécie D, duas ag upa am-se com as sequências de e e ência do genó ipo HAdV-26. Es as amos as o am colhidas em unidades de saúde dis in as, con udo es ão es ei amen e elacionadas en e si. A sequência B39 ag upa-se com as sequências HAdV-27 e a sequência HMC11 o ma um subg upo, supo ado po um alo de boo s ap de 100%, com as sequências nucleo ídicas de e e ência pa a o HAdV-9. A sequência CSP11 em uma simila idade de 100% com as e e ências HAdV-15 e HAdV-29, as quais não o mam amos sepa ados nes a egião analisada. Resul ados 52 Figu a 3.5 Á o e ilogené ica baseada numa egião do gene do hexão de adeno í us (loop 1, 904 n ), que ilus a as elações ilogené icas en e as es i pes p esen es nas amos as de Angola (2012/2013), e as sequências de e e ência p esen es nas bases de dados. De aco do com as sequências de e e ência de Li e al. no genó ipo HAdV-41 es ão ep esen ados dois GTC (Genome Type Clus e s) (159). A á o e ilogené ica oi cons uída pelo mé odo de Neighbo - Joining a pa i de dis âncias es imadas pelo mé odo de Kimu a a dois pa âme os. A obus ez da in e ência ilogené ica oi es ada po boo s aping de 1000 eplicados, sendo ap esen ados apenas os alo es ≥ 75%. Resul ados 53 Figu a 3.6 Rep esen ação g á ica da axa de de eção (%) dos ipos de adeno í us de e minados em c ianças <5 anos, em Angola (2012/2013). 3.5 As o í us: di e sidade de genó ipos ci culan es e po enciais í us ecombinan es Pa a as amos as que nos ensaios de ELISA o am conside adas posi i as pa a as o í us p ocedeu-se à de eção do genoma i al po RT-PCR endo como al o de ampli icação uma sequência pa cial (≈420 n ) do gene de RdRp (ORF1b). Das 11 amos as posi i as po ELISA, oi possí el ob e p odu os de ampli icação com o amanho espe ado pa a oi o (Figu a 3.7). M16 e HMC35 ap esen a am um pad ão ele o o é ico di e en e das es an es amos as. A al e ação das condições de ampli icação, ais como a iação da empe a u a de empa elhamen o dos p ime s, não esul ou na ampli icação de uma banda especí ica com o amanho p e endido. Tal pode á de e -se a deg adação do RNA i al da amos a ou à inadequação dos p ime s usados. 17% 4% 4% 4% 4% 4% 9% 4% 17% 29% 4% HAdV-1 HAdV-2 HAdV-5 HAdV-9 HAdV-15/29 HAdV-18 HAdV-26 HAdV-27 HAdV-40 HAdV-41 HAdV-61 Resul ados 54 Figu a 3.7 P odu os de ampli icação po RT-PCR de uma sequência pa cial do gene de RdRp (ORF1b) de as o í us; M = Ma cado de amanho molecula GeneRule ™ 100bp Plus DNA Ladde , The mo Fishe Scien i ic Inc., Massachuse s, EUA; CN1s = Con olo Nega i o com p odu o de eação p o enien e da 1ª eação; CN2nd = Con olo Nega i o da 2ª eação. Pa a além da egião ORF1b, ambém se ampli icou a egião 5’ da ORF2 codi icado a da p o eína da cápside VP1 dos as o í us Angolanos, uma ez que es a egião ap esen a maio a iabilidade gené ica, sendo consequen emen e mais adequada à geno ipagem des es í us. Na segunda eação de ampli icação de hemi-nes ed PCR ob i e am-se p odu os com mobilidade ele o o é ica compa í el com o amanho espe ado de ≈450pb apenas pa a 7 amos as (Fig. 3.8). As amos as M16 e HMC35, cujo amanho do p odu o de ampli icação da ORF1b não e a compa í el com a p esença de as o í us, e HMC8 não de am o igem a um p odu o de ampli icação especí ico pa a a ORF2. Resul ados 55 Figu a 3.8 Pe il ele o o é ico dos p odu os ampli icados po hemi-nes ed-PCR endo como al o a egião 5’ da ORF2 (450 n ) de as o í us; M = Ma cado de amanho molecula GeneRule ™ 100bp Plus DNA Ladde The mo Fishe Scien i ic Inc., Massachuse s, EUA; CN2nd = Con olo Nega i o da 2ª eação. Os p odu os de RT-PCR pa a os genes codi icado es da ORF1b (n=8) e da ORF2 (n=7) o am sequenciados com os p ime s panAV-R1 e Mon69, espe i amen e. Após edição, as sequências nucleo ídicas ob idas o am sujei as a uma pesquisa de homologia com sequências disponí eis na base de dados NCBI, usando a e amen a Nucleo ide BLAST, cujos esul ados es ão ap esen ados no Anexo 6.8. As sequências em es udo ap esen a am uma iden idade ≥ 94% com as sequências de e e ência, sendo possí el iden i ica , p o iso iamen e, 2 genó ipos de as o í us di e en es pa a a egião da ORF1b, HAs V-1 e HAs V-2. De modo a con i ma os genó ipos ob idos po BLAST, p ocedeu-se à cons ução de uma á o e ilogené ica com as sequências das amos as Angolanas e as sequências de e e ência (Fig.3.9). Globalmen e, es a á o e e ela um baixo g au de in e ência ilogené ica, não ha endo gene icamen e uma sepa ação dis in a de ag upamen os de sequências co esponden es a di e en es genó ipos supo ados po alo es de boo s ap ≥75%. As amos as M36 e HMC8 su gem ag upadas com sequências de e e ência pa a o HAs V-2. No en an o, es as duas sequências su gem em posições bem dis in as da á o e (Fig. 3.9). HMC8 e a sequência de e e ência com a qual ap esen a maio simila idade (KF039910/HAs V-2/Rus-Nsc05-430/RUS/2005) o mam um ag upamen o com HAs V-3, ainda que supo ado po um alo de boo s ap in e io a 75%. De ac o as duas sequências com maio simila idade com HMC8 po BLAST Resul ados 56 (FJ842147 e KF039911) são ecombinan es em que a ORF1b su ge classi icada como HAs V-3 (84) (85). As es an es 6 sequências de as o í us su gem em dois ag upamen os sepa ados den o de um conjun o de es i pes classi icadas como HAs V- 1. Assim, CSP17, M47, C31 e B20 ap esen a am uma simila idade en e 97,3 e 98,3% com uma sequência Indiana (AB308374/Mamas o i us 1/V1347/IND/2004), e as sequências B19 e B23 uma simila idade ≥97% com uma sequência Nepalesa (GQ441163/HAs V-1/NE-3086/NGA/2006). Figu a 3.9 Análise ilogené ica das sequências nucleo ídicas da egião 3’ ORF1b de as o í us (403 n ) p esen es nas amos as de Angola (2012/2013), e das sequências de e e ência p esen es nas bases de dados. A á o e ilogené ica oi cons uída pelo mé odo de Neighbo - Joining a pa i de dis âncias es imadas pelo mé odo de Kimu a a dois pa âme os. A obus ez da in e ência ilogené ica oi es ada po boo s aping de 1000 eplicados, sendo ap esen ados apenas os alo es ≥ 75%. Resul ados 57 A pesquisa BLAST pa a as 7 sequências da ORF2 Angolanas e ela am iden idade ≥ 95% com as sequências de e e ência (Anexo 6.8). A a és des e algo i mo, nes as amos as o am iden i icados p o iso iamen e 3 genó ipos de as o í us, HAs V-1, -3 e - 5. Pa a con i ma es es esul ados de geno ipagem e es abelece elações ilogené icas en e os as o í us Angolanos e des es com ou os as o í us com sequências deposi adas na base de dados NCBI, cons uiu-se a á o e ilogené ica mos ada na Fig. 3.11. Con a iamen e ao obse ado pa a a ORF1b, a á o e ilogené ica da ORF2 ap esen a um ele ado g au de in e ência ilogené ica es ando os ag upamen os de sequências co esponden es aos di e en es genó ipos supo ados po alo es de boo s ap ≥99%. As sequências da ORF2 de as o í us Angolanas dis ibuem-se po ês genó ipos, HAs V-1, -3 e -5, endo con i mado os genó ipos a ibuídos com base na pesquisa BLAST. A Fig. 3.10 ep esen a a p e alência dos di e en es genó ipos da ORF2 dos as o í us de e ados em amos as Angolanas. Figu a 3.10 Rep esen ação g á ica da axa de de eção (%) dos genó ipos de as o í us (ORF2) de e minados em c ianças <5 anos, em Angola (2012/2013). As sequências B20 e C31 o mam um ag upamen o com as sequências nucleo ídicas de e e ência pa a o genó ipo 1 dos as o í us. Ambas as sequências ap esen am 97% de simila idade com a sequência de as o í us Aus aliana (AF175253/HAs V-1/Melb1E/AUS/1999), o mando uma linhagem dis in a da e e ência da es i pe Ox o d. Si uação semelhan e su ge no clus e de HAs V-3, onde as 28,5% 28,5% 43,0% HAs V-1 HAs V-3 HAs V-5 Resul ados 58 sequências das amos as B19 e B23 ap esen am um g au de semelhança ≥ 95% com a sequência do isolado Tunisie e o mando um g upo mono ilé ico sepa ado da es i pe Ox o d pa a es e genó ipo. Figu a 3.11 Á o e ilogené ica baseada na egião 5’ da ORF2 de as o í us (448n ), que ilus a as elações ilogené icas en e as sequências nucleo ídicas de as o í us p esen es nas amos as de Angola (2012/2013), e as sequências de e e ência p esen es nas bases de dados. A sequência co esponden e da es i pe FJ402983 de As V-MLB1 oi usada como ou g oup. A á o e ilogené ica oi cons uída pelo mé odo de Neighbo -Joining a pa i de dis âncias es imadas pelo mé odo de Kimu a a dois pa âme os. A obus ez da in e ência ilogené ica oi es ada po boo s aping de 1000 eplicados, sendo ap esen ados apenas os alo es ≥ 75%. Também no clus e de HAs V-5, pa ece exis i duas linhagens. As amos as CSP17 e M47 ap esen am um g au de simila idade de 97% e 98% com o isolado iden i icado na Rússia em 2010 (JF929196/HAs V-5/isola e 1825/RUS/2010). A sequência da amos a M36 su ge sepa adamen e nou o ag upamen o, sendo 96% idên ica à sequência da es i pe Ox o d (U15136/HAs V-5/Ox o d/1994). Quando compa amos a dis ibuição das sequências de as o í us Angolanas nas duas á o es ilogené icas cons uídas, obse amos uma opologia dis in a, não só na Resul ados 59 o ma como se ag upam en e si como no ag upamen o com sequências de e e ência dos di e en es genó ipos pa a as duas egiões analisadas. Na á o e da ORF1b (Fig. 3.11), CSP17, M47, C31 e B20 es ão es ei amen e elacionadas en e si, o mando um g upo den o do conjun o de sequências de e e ência conside adas HAs V-1, enquan o na á o e da ORF2, CSP17 e M47, embo a man endo-se associadas, su gem no ag upamen o de HAs V-5 (Fig. 3.12), suge indo a a em-se de í us ecombinan es. Po ou o lado, B20 e C31 con inuam a su gi es ei amen e elacionadas e den o dos HAs V-1. Rela i amen e às sequências B19 e B23, man êm-se associadas nas duas á o es mas su gem em ag upamen os de genó ipos di e en es, HAs V-1 pa a a ORF1b e HAs V-3 pa a a ORF2. Es a di e ença de pad ão de dis ibuição ilogené ica suge e no amen e que es amos pe an e í us po encialmen e ecombinan es. Iden icamen e, a sequência M36 classi icada como HAs V-2 pa a a ORF1b, su ge classi icada como HAs V-5 pa a a ORF2. No en an o, na á o e da ORF1b as sequências de HAs V-2 es ão dispe sas sem qualque ipo de ag upamen o mesmo que supo ado po um alo de boo s ap baixo. Po ém, de e-se salien a que nas duas á o es o posicionamen o des a sequência é mui o dis in o ela i amen e às ou as sequências Angolanas. Resumindo, a análise ilogené ica e e uada suge e pu a i as o mas ecombinan es en e HAs V-1 e HAs V-5 pa a os í us CSP17 e M47, en e HAs V-1 e HAs V-3 pa a B19 e B23 e ainda en e HAs V-2 e HAs V-5 pa a M36. 3.6 Genó ipos dos no o í us ci culan es Pa a a de e minação dos genó ipos de no o í us nas amos as es udadas, p ocedeu- se à ampli icação da egião NS do genoma i al, endo como ma iz cDNA com o igem em 37 amos as onde es e í us oi de e ado po RT-PCR em empo eal. Na Fig. 3.12 es á ap esen ado um pad ão de mig ação ípico pa a os p odu os de ampli icação dos no o í us GI. A banda com o amanho espe ado (ce ca de 380 pb) oi obse ada pa a odas as amos as. Igualmen e, as 30 amos as posi i as po RT-PCR em empo eal pa a no o í us GII, ampli ica am po nes ed-PCR uma banda com o amanho espe ado Resul ados 66 amos as de Angola (2012/2013), e as sequências de e e ência p esen es nas bases de dados. A sequência co esponden e da es i pe M87661 de no o í us humano GI.1 oi u ilizada como ou g oup. Á o e ilogené ica cons uída pelo mé odo de Neighbo -Joining a pa i de dis âncias es imadas pelo mé odo de Kimu a a dois pa âme os. A obus ez da in e ência ilogené ica oi es ada po boo s aping de 1000 eplicados, sendo ap esen ados apenas os alo es ≥ 75%. 3.7 Epidemiologia da in eção pelos di e en es genó ipos de adeno í us, as o í us e no o í us De e minados os genó ipos de adeno í us, as o í us e no o í us, p ocedeu-se a um c uzamen o de dados dos mesmos com as in o mações clínicas e demog á icas A ní el de dis ibuição geog á ica dos di e en es genó ipos, oi na egião do Huambo onde se e i icou uma maio di e sidade de adeno í us (Fig. 3.17). Os adeno í us da espécie F, designados como en é icos, o am de e ados apenas nas p o íncias de Cabinda e de Huambo. O genó ipo mais abundan e, HAdV-41 oi iden i icado em amos as de cabinda e do Huambo, sendo os í us do subg upo GTC-2 unicamen e de e ados em Cabinda. Menos equen es, os HAdV-40 o am apenas de e ados no Huambo. Na p o íncia do Zai e oi de e ada apenas uma amos a posi i a pa a adeno í us, co espondendo a HAdV-26 (Figu a 3.17). As c ianças in e adas po HAdV da espécie F, não ap esen a am eb e, inham, em média, 3,71 episódios de dia eia ao longo de 2,71 (±0,76) dias. As in e adas po ou as espécies de adeno í us ap esen a am, em média, dia eias mais p olongadas (3,43 ± 1,13 dias). As c ianças in e adas com HAdV40 e HAdV41 ap esen a am mais episódios diá ios de ómi os, e du an e mais dias, em compa ação com as c ianças in e adas com ou os adeno í us, mas sem signi icado es a ís ico (p= 0,492 e p=0,440). Quando compa ado o g au de g a idade da dia eia en e es es dois g upos, as c ianças in e adas com HAdV espécie F, ap esen a am um g au mais ele ado (7,43 ± 3,10, s 4,50±2,51), e com uma di e ença es a is icamen e signi ica i a (p=0,048) (Anexo 6.10). Resul ados 67 Figu a 3.17 Rep esen ação g á ica da dis ibuição geog á ica dos di e en es ipos de adeno í us em c ianças <5 anos, em Angola (2012/2013). No que espei a à dis ibuição geog á ica dos genó ipos de as o í us (ORF2), no Huambo obse ou-se uma dis ibuição equi a i a dos 3 genó ipos iden i icados (Fig. 3.19). Na egião de Luanda oi iden i icada uma amos a com HAs V-5. Não o am de e ados as o í us na p o íncia do Zai e e em Cabinda oi iden i icada uma es i pe do genó ipo 3 pa a a ORF1b. Quan o a uma análise da associação en e ca ac e ís icas demog á icas e clínicas com os di e en es genó ipos indi iduais de as o í us, es a não oi possí el e e ua de ido ao núme o eduzido de amos as de e adas e geno ipadas (Fig. 3.18). Figu a 3.18 Rep esen ação g á ica da dis ibuição geog á ica dos di e en es ipos de as o í us (pa a a egião genómica ORF2) em c ianças <5 anos, em Angola (2012/2013). 0 1 2 3 4 5 Cabinda Zai e Luanda Huambo HAdV-1 HAdV-2 HAdV-5 HAdV-9 HAdV-15/29 HAdV-18 HAdV-26 HAdV-27 HAdV-40 HAdV-41 HAdV-61 0 1 2 3 Luanda Huambo HAs V-1 HAs V-3 HAs V-5 Resul ados 68 Rela i amen e à dis ibuição geog á ica da in eção po no o í us (Fig. 3.19), obse ou-se uma maio di e sidade de genó ipos ci culan es na egião do Huambo, sendo es a a única egião onde o am de e ados no o í us GI. As es i pes GII.4 o am iden i icadas em odas as egiões es udadas, sendo as únicas de e adas no Zai e. Figu a 3.19 Rep esen ação g á ica da dis ibuição geog á ica dos di e en es ipos de no o í us (pa a a egião NS da ORF2) em c ianças <5 anos, em Angola (2012/2013). Em elação às ca ac e ís icas clínicas das c ianças in e adas com no o í us, nenhuma das c ianças inqui idas in e adas com o í us inha uma empe a u a ≥37,6ºC. En e as c ianças in e adas com NoV GII.4 ou NoV não-GII.4, não se obse ou di e ença ela i amen e ao núme o de episódios de dia eia ou du ação da mesma, bem como pa a o núme o de episódios de ómi os e a du ação (em dias) dos mesmos. A equência de c ianças desid a adas, e o ní el de a i idade das mesmas, oi idên ica en e c ianças in e adas com NoV GII.4 ou NoV não-GII.4. Quan o ao g au de g a idade da dia eia, es e oi semelhan e en e os dois g upos de c ianças in e adas (Anexo 6.10). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Cabinda Zai e Luanda Huambo GI.3 GI.5 GII.1 GII.2 GII.3 GII.4 GII.6 GII.7 GII.9 GII.14 GII.16 Discussão e Conclusões 69 4. DISCUSSÃO e CONCLUSÕES Dados de 2010 e elam que em Angola, a dia eia é a causa de 15% das mo es em c ianças com idade in e io a 5 anos de idade (11). Es ima-se que os o a í us sejam esponsá eis po um e ço das mo es de ido à dia eia, sendo as es an es de idas a ou os í us en é icos, bac é ias, pa asi as, helmin as e p o ozoá ios (1) (148). Nes e es udo p e endemos documen a a epidemiologia das in eções en é icas pediá icas em a ias egiões des e país e a di e sidade gené ica de adeno í us, as o í us e no o í us, conside ados, depois dos o a í us, os p incipais agen es e iológicos i ais de dia eia. Des e es udo ize am pa e 222 amos as de ezes de c ianças com idade in e io a cinco anos e com GEA que eco e am a di e sas unidades de saúde nas p o íncias de Cabinda, Luanda, Huambo e Zai e, em Angola em 2012 e 2013. Ce ca de um e ço das c ianças (29,7%) es a am in e adas com um ou dois dos í us es udados. No conjun o das amos as analisadas com inqué i os disponí eis (n=108) obse ou-se que 85,3% das c ianças in e adas inha uma idade meno ou igual a 24 meses, con i mando-se assim a ele ada p e alência de adeno í us, as o í us e no o í us nos casos de GEA, du an e os dois p imei os anos de ida, desc i a na li e a u a (18) (43) (78). A amamen ação em um papel impo an e na p o eção con a a dia eia nas c ianças de 0-24 meses de idade, sendo supe io nas que inge em exclusi amen e lei e ma e no (160). Es a p o eção conduz a uma diminuição da incidência e da du ação da dia eia. Pela análise dos inqué i os e i icou-se que a maio ia das c ianças in e adas es a a a se amamen ada (67,6%). Po ém, a amamen ação não e a exclusi a, uma ez que 92,3% das c ianças inge ia ou os alimen os. Ao compa a as c ianças alimen adas com lei e ma e no e ou os alimen os, com as c ianças exclusi amen e amamen adas, a média da du ação (em dias) da dia eia é semelhan e (3,95 s. 3,38, p = 0,548). Con udo, a ní el de episódios diá ios de dia eia, a média é de 3,74 e 2,75 episódios (p = 0,059). Apesa da associação não se es a is icamen e signi ica i a, as c ianças exclusi amen e amamen adas i e am menos episódios de dia eia. Ou os sin omas de GEA como a eb e, ómi os e o es ado de desid a ação e de malnu ição o am ambém a aliados na população pediá ica es udada, endo-se Discussão e Conclusões 70 cons a ado que as pe cen agens de c ianças in e adas com es as ca ac e ís icas de GEA o am in e io es às pe cen agens desc i as em es udos an e io es (20) (22). Segundo a escala de Nakagomi, os episódios de dia eia com classi icação maio ou igual a 12, numa escala de 0-20, são ca ego izados como se e os (153). No g upo de c ianças in e adas, o g au de g a idade dos episódios de dia eia oi de 6,03 ±2,9. A escala de Nakagomi oi a selecionada pa a es a classi icação, pois os inqué i os engloba am odos os c i é ios des a escala (Anexo 6.2 e 6.3). Po ém, o alo ob ido pa a o g au de g a idade da dia eia pode á se uma subes ima i a uma ez que alguns dos inqué i os não es a am o almen e p eenchidos, sendo o pa âme o co ado com ze o na ausência de in o mação. No o al, 29,7% (66/222) das c ianças es a am in e adas com pelo menos um dos í us. A axa de de eção oi de 11% (24/222) pa a os adeno í us, 5% (11/222) pa a os as o í us e 17% (37/222) pa a os no o í us. As axas ela i as ob idas es ão de aco do com es udos an e io es, na medida em que a axa de de eção dos no o í us é supe io à dos adeno í us, que po sua ez é supe io à dos as o í us (20) (56) (161). Das 66 c ianças in e adas, 6 ap esen a am in eção mis a. Nes e es udo e i icou-se que não exis e co elação en e a g a idade dos episódios de dia eia e o ac o de se em in eções po um único agen e e iológico ou in eções mis as (5,97 ± 2,93 s. 6,40 ± 3,05, p = 0,763), si uação ambém encon ada num es udo ealizado no Gana (22). Na li e a u a, a axa de de eção de adeno í us em populações pediá icas com GEA é mui o a iá el, podendo oscila en e, po exemplo, ce ca de 37% no Quénia e Ruanda (17) (162); e 2% no Bangladesh e China (21) (163). A p e alência de 11% es imada pa a es a população Angolana é semelhan e à encon ada na Á ica do Sul (9,8%), no Egip o (10,4%) e nos EUA (11,8%) (164) (161) (20). Po ém, pode á se uma subes ima i a uma ez que usámos dois mé odos de as eio, um es e ápido imunoenzimá ico (Ce Tes Ro a i us-Adeno i us) que nos pe mi iu de e a 12 amos as com an igénios de adeno í us num o al de 199 e nes ed-PCR com p ime s uni e sais que e elou a p esença de DNA de adeno í us em 11 de 24 amos as ecais, suge indo di e enças de sensibilidade pa a os dois ensaios, à semelhança do que oi desc i o po ou os au o es (165) (44). Ainda, den o dos es es imunoenzimá icos, a sensibilidade pode a ia de aco do com a gama de se o ipos al o, sendo mais baixa pa a os di igidos Discussão e Conclusões 71 apenas con a HAdV-40/41 (17). O ab ican e do es e ápido usado (Ce Tes Bio ec, Espanha) não desc e e a gama de se o ipos de e ados. No en an o, quando analisamos os genó ipos de e ados po ambos os mé odos não encon amos di e enças es a is icamen e signi ica i as, o que é suges i o de se a a de um es e que de e a, de uma o ma gené ica, adeno í us humanos e não especi icamen e HAdV-40/41. Pa a além das di e enças na sensibilidade dos es es, ou os pa âme os pode ão se esponsá eis pelas g andes di e gências nos alo es de p e alência, designadamen e a se oposi i idade pa a VIH dos indi íduos en ol idos (17). Nes e es udo, a maio ia das c ianças in e adas com adeno í us inha idade igual ou in e io a 24 meses (94,1%), esul ado conco dan e com es udos an e io es ealizados em di e sos con inen es (43) (44) (56) (161). A in eção po adeno í us oi mais equen e nas c ianças do sexo eminino do que nas do sexo masculino, com uma di e ença es a is icamen e signi ica i a (p=0.006). Con a iamen e, ou os es udos demons a am uma in eção p edominan e en e c ianças do sexo masculino (23) (57). Con udo, é di ícil de encon a uma jus i icação pa a es es esul ados, nomeadamen e quando na li e a u a a maio ia dos dados apon am pa a a ausência de associação en e géne o e in eção. A pe cen agem de c ianças in e adas com eb e, desid a adas, malnu idas ou com a a i idade eduzida oi in e io à de e ada em es udos an e io es (21) (23) (166), assim como a média do g au de g a idade da dia eia (20). A pe cen agem de c ianças com ómi os oi semelhan e a alo es an e io men e ela ados (21) (23). Os casos posi i os de adeno í us i e am maio incidência na época das chu as (p = 0.005), como epo ado ambém po Moyo e al. (2014) (166). No en an o, a maio ia dos es udos não mos a um pad ão de sazonalidade especí ico pa a a in eção po adeno í us (19) (55). Uma a aliação con ínua da in eção du an e um pe íodo mais longo, e.g. mensal ao longo de 2 anos, se á necessá ia pa a conclui sob e a sazonalidade da in eção po adeno í us nes as egiões de Angola. A ca ac e ização molecula de sequências nucleo ídicas ab angendo a ansa L1 do hexão pe mi iu iden i ica a ci culação de HAdVs de onze ipos di e en es pe encen es a qua o espécies, A, C, D e F. A espécie F (HAdV-40 e -41), classicamen e conside ada como incluindo os “adeno í us en é icos”, e elou-se p edominan e ela i amen e às ou as espécies (45,8%, 11/24) como se ia expec á el de aco do com o Discussão e Conclusões 72 desc i o na maio ia de es udos simila es ealizados em egiões geog á icas mui o di e sas (165) (167), (17) (20) (43) (44) (47) (168) (169). Po ém, cu iosamen e os adeno í us en é icos o am de e ados apenas nas p o íncias de Cabinda e de Huambo, e HAdV-40 apenas nes a úl ima. Pela simila idade das amos as, e idenciada pelo comp imen o cu o dos amos (Fig. 3.5,) deduz-se que a mesma es i pe de HAdV-40 ci cule na egião de Minei a, Al o-Hama e Bailundo. HAdV-41 oi o ipo de adeno í us en é ico mais equen emen e de e ado (63,6%, 7/11). Na bibliog a ia cons a amos que a p opo ção ela i a de HAdV-40 e -41 a ia de es udo pa a es udo, an o em e mos geog á icos como empo ais. Enquan o nas décadas de 80 e 90 do século passado e am desc i as p e alências ap oximadamen e iguais des es dois se o ipos (170) (171), a endência na úl ima década é pa a um dec éscimo da ci culação de HAdV-40 e concomi an e aumen o de HAdV-41, o nando-se es e o se o ipo p edominan e associado a GEA (167) (165) (20) (44) (159) (168). No en an o, nes e pe íodo, no Gana e no Bangladesh oi desc i o HAdV-40 maio i a iamen e ou exclusi amen e (21) (172). Mais uma ez, es as di e enças podem se de idas a sensibilidade di e encial dos es es de de eção. De ac o, o am desc i as limi ações no uso de ELISAs come ciais pa a de eção de HAdV-41 (159) (173). Pela análise da á o e ilogené ica da Fig. 3.5, é possí el e i ica a inclusão dos í us Angolanos HAdV-41 em dois clus e s genómicos dis in os, GTC-1 e GTC-2, como desc i o inicialmen e po Li e al. (2004) pa a á ios países asiá icos (159) e pos e io men e po Dey e al. (2011) pa a a Índia (44). A exis ência des es dois GTCs e le e a acumulação de mu ações de aminoácidos nas egiões hipe a iá eis do gene do hexão (44) (159). Es a de i a an igénica pode á se esponsá el pelo não econhecimen o po an ico pos monoclonais usados nos es es come ciais. Cu iosamen e, a ci culação de es i pes GTC-1 oi de e ada apenas em Cabinda. HAdV-1, -2 e -5, HAdVs da espécie C, no malmen e associados a in eções do sis ema espi a ó io (37), o am iden i icados num qua o das amos as ecais com adeno í us. Es es ipos o am ambém an e io men e de e ados em casos de GEA (17) (19) (45) (169) (167). As doenças espi a ó ias são uma mani es ação comum da in eção po HAdVs em c ianças e oi demons ado que os HAdVs que in e am as mucosas espi a ó ias podem se exc e ados nas ezes du an e meses ou anos, pelo que a sua p esença nes as amos as pode á não es a di e amen e associada a gas oen e i e (48). Discussão e Conclusões 73 Fo am iden i icadas 5 amos as com adeno í us pe encen es à espécie D (20,8%, 5/24). Os adeno í us des a espécie êm sido associados a uma di e sidade de doenças, nomeadamen e que a oconjun i i e epidémica e gas oen e i e (37). São inclusi amen e a espécie mais equen emen e de e ada nas ezes de doen es in e ados po VIH com gas oen e i e (24). Um es udo ealizado com amos as ecais de populações de qua o países da Á ica subsa iana demons ou uma ele ada p e alência (28%-66%) de HAdV- D, g ande di e sidade de ipos ci culan es e coin ecção com á ios ipos, sem associação a doença (174). Um ou o es udo ealizado no Quénia iden i icou os HAdVs da espécie D como os mais p e alen es (48,6%) em amos as ecais de c ianças com GEA a i e em em ambien e u bano (17). Os ipos HAdV-9 e -10 da espécie D, a amen e e e idos na li e a u a, o am iden i icados em 60% das c ianças com dia eia a ibuída a adeno í us na cidade de Dhaka, Bangladesh (21). HAdV-9 oi iden i icado numa amos a Angolana (HMC11). Cu iosamen e HAdV-67, isolado a pa i de uma c iança com gas oen e i e, é um ecombinan e de á ios ipos da espécie D, sendo classi icado como HAdV-9 na egião L1 e L2 do hexão (53). Se á in e essan e analisa ou as egiões genómicas pa a uma melho ca ac e ização do í us HMC11. A es i pe CSP11 ap esen ou uma simila idade de 100% com as sequências nucleo ídicas de e e ência pa a HAdV-15 e HAdV-29. A incapacidade de dis ingui es es dois ipos com base na análise des a egião do genoma oi igualmen e desc i a po po Madisch e al. (2005) que, a a és da análise ilogené ica das sequências nucleo ídicas das egiões L1 e L2 dos HAdV-15 e o HAdV-29, e i ica am não exis i qualque di e gência en e as sequências des es dois ipos (32). Iden i icámos ainda duas amos as com HAdV-A (8,3%, 2/24) classi icados como HAdV-18 e HAdV-61. HAdV-18 oi igualmen e iden i icado em c ianças com GEA no Quénia (17). Cu iosamen e, a c iança in e ada com HAdV-18 oi a única c iança inqui ida in e ada com eb e. HAdV-31, o adeno í us da espécie A associado a GEA pediá ica na Índia (168) e de e ado nas ezes de indi íduos in e ados com VIH (175), não oi iden i icado nas amos as Angolanas. No en an o, iden i icámos uma es i pe (CAL3) classi icada ilogene icamen e como HAdV-61, um adeno í us ecombinan e en e HAdV-31 e um adeno í us p óximo de HAdV-12. Es e ecombinan e oi isolado de um doen e com gas oen e i e em Quio o, Japão (176). Sendo es a a única e e ência na base de dados do NCBI, p esumimos que es e í us es á aqui a se iden i icado pela Discussão e Conclusões 74 segunda ez e num con inen e di e en e, pelo que se ia in e essan e aze a sequenciação do es an e genoma i al pa a uma classi icação inequí oca. A axa de de eção dos as o í us nas amos as ecais Angolanas oi de 5% (11/222), um alo den o da gama desc i a a ní el global, uma ez que os as o í us es ão associados a 2 - 9% dos casos de GEA, não bac e iana, em c ianças (70) (74). A incidência média a ní el mundial é de 11% com incidências de 7% e 23% em á eas u ais e u banas, espe i amen e (70). A incidência é, ge almen e, mais ele ada nos países em ias de desen ol imen o (70). No en an o, pa adoxalmen e, em Angola e nou os países da Á ica subsa iana a p e alência é baixa: Bo swana, 2,7% (55); Quénia 5,3% (177); Gana 4,8% e 3,3% (22) (172), Ruanda 4,1% (162), Zanziba 2,4% (178). À semelhança dos adeno í us, pode emos es a pe an e um es e imunoenzimá ico com uma sensibilidade baixa e 5% se uma subes ima i a da p e alência. E en ualmen e, es e alo pode á aumen a se o usado no as eio RT-PCR com p ime s uni e sais. A maio ia das c ianças in e adas po as o í us (75%) inha idade igual ou in e io a 24 meses, como desc i o pa a ou os es udos simila es (12) (70) (75). A in eção oi mais comum nas c ianças do sexo eminino, mas sem di e ença es a is icamen e signi ica i a e de aco do com ou os es udos que desc e em uma incidência semelhan e en e géne os (12) (16). Apesa da eb e se um dos á ios sin omas de GEA, nenhuma c iança in e ada com as o í us ap esen a a es e sin oma, como ela ado ambém num es udo an e io (179). Em elação à du ação da dia eia, a in eção po as o í us oi a que ap esen ou maio du ação, compa a i amen e com a in eção po adeno í us e no o í us. Em elação a es udos an e io es, nes e abalho a du ação média da dia eia oi supe io (4,7 dias) e o núme o médio de episódios diá ios semelhan e (20) (25) (26). A pe cen agem de c ianças com ómi os (50%) es á comp eendida no in e alo espe ado (20-70%), mas a du ação média dos ómi os (dias) e o núme o de episódios diá ios oi supe io ao ela ado (20) (26). A pe cen agem de c ianças in e adas po as o í us desid a adas e o alo médio do g au de g a idade da dia eia es á de aco do com dados de ou os au o es. Po ém, es es mos am que as c ianças in e adas ap esen am uma a i idade mais eduzida, e no nosso es udo odas as c ianças inham uma a i idade no mal (20) (26). A maio incidência de as o í us oco eu na época das Discussão e Conclusões 75 chu as, mas sem di e ença es a is icamen e signi ica i a (p = 0,088). Es e esul ado es á de aco do com o e is o po Bosh e al. (2014) pa a os climas opicais (70). Os HAs Vs clássicos são classi icados em oi o se o ipos (HAs V-1 a -8) com base na sua ea i idade se ológica e neu alização (26), cada um deles co espondendo a um genó ipo indi idual com base na sequência nucleo ídica do gene da cápside (ORF2) (150). A análise ilogené ica das sequências da egião 5’ da ORF2 dos as o í us analisados pe mi iu iden i ica a ci culação de ês genó ipos di e en es (HAs V-1, -3 e - 5). Cu iosamen e, HAs V-5 oi o genó ipo p edominan e (43%, 3/7) nes e pequeno núme o de amos as analisadas. A ní el global, HAs V-1 é o genó ipo mais comum iden i icado em c ianças, seguido dos genó ipos 2-5 e, ocasionalmen e, 8 dependendo da egião, enquan o HAs V-6 e -7 são a amen e de e ados (26) (70) (74). Os HAs Vs ap esen am uma ele ada axa e olu i a, de e minada pela acumulação de mu ações (2-4 x 10-3 subs i uições po posição po ano) (180) e pela capacidade de ecombinação do genoma, comum a ou os í us de RNA (181).Cu iosamen e, e apesa da baixa in e ência ilogené ica da á o e cons uída pa a as sequências da ORF1b ela i amen e à da ORF2, e i icámos que apenas pa a dois í us (B20 e C31), classi icados como HAs V-1 nas duas egiões analisadas, o seu posicionamen o se man inha nas duas á o es cons uídas (Fig. 3.9 e 3.11). Pa a as sequências das amos as CSP17, M47, B19, B23 e M36 obse ou-se uma dis ibuição opológica disc epan e nas á o es ilogené icas ge adas, e idenciando genó ipos di e en es pa a as duas egiões genómicas analisadas. As disc epâncias en e as á o es ilogené icas baseadas em di e en es ORFs suge em po enciais e en os de ecombinação nos genomas des as es i pes. Assim e emos pu a i os ecombinan es de HAs V-1/-5 (CSP17, M47), HAs V-1/-3 (B19, B23) e HAs V-2/-5 (M36) pa a HAs V-ORF1b/-ORF2, espe i amen e. Babkin e al. (2014) p ocede am à análise de e en os de ecombinação de genomas comple os de as o í us humanos exis en es nas bases de dados e de isolados ussos endo concluído que os HAs V-2 eme gi am como esul ado de ecombinação e que os genó ipos HAs V-1 e -4 incluem isolados ecombinan es e não ecombinan es, enquan o HAs V-3, -5 e -6 não ap esen am sinais de ecombinação (84). Cu iosamen e, a p imei a e idência de ecombinação en e HAs Vs espei a a um ecombinan e en e HAs V-3 na ORF1b e HAs V-5 na ORF2, isolado de uma c iança Re e ências Bibliog á icas 82 dia hoeal disease in in an s and young child en in de eloping coun ies: a p ospec i e, case-con ol s udy. The Lance . 382: 209-222. 9. Black, E.R., Allen, L.H.A., Bhu a, Z., Caul ield, L.E, Onis, M., Ezza i M., Ma he s, C., Ri e a, J.. 2008. Ma e nal and child unde nu i ion: global and egional exposu es and heal h consequences. The Lance . 371: 243-260. 10. The Uni ed Na ions Child en’s Fund (UNICEF)/Wo ld Heal h O ganiza ion (WHO). 2013. End p e en able dea hs: Global Ac ion Plan o P e en ion and Con ol o Pneumonia and Dia hoea. 11. Wo ld Heal h O ganiza ion, Angola: Heal h p o ile. [Online] Dezemb o 2013. h p://who.in /gho/coun ies/ago.pd ?ua=1. 12. Nguyen, T.A., Yagyu, F., Okame, M., Phan, T.G., T inh, Q.D., Yan, H., Hoang, K.T., Cao, A.T.H., Le Hoang, P., Oki su, S., Ushijima, H. 2007. 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The Lance . 376:63-67. Re e ências Bibliog á icas 102 Anexos 103 6. ANEXOS 6.1 Fo mulá io de In o mação e de Consen imen o In o mado Anexos 104 Anexos 105 6.2 Inqué i o Demog á ico e Clínico Anexos 106 6.3 Escala pa a Cálculo da G a idade dos Episódios de GEA Tabela 6.1 - Escala pa a cálculo da g a idade dos Episódios de Gas oen e i e, segundo a classi icação de Nakagomi e al. (Adap ado de (153)) Sinal Clínico/Sin oma Pon os a ibuídos Dia eia Du ação (dias) <2 1 2-4 2 >4 3 Episódios em 24h 3 1 4-5 2 >5 3 Ausência de ómi os 0 Vómi os Du ação (dias) 1-2 2 ≥3 3 Episódios em 24h 1 1 2 2 ≥3 3 Desid a ação Ausência 0 P esença 2 Feb e <37.6ºC 0 37.6ºC - 38.6ºC 2 ≥38.6ºC 3 A i idade No mal 0 Reduzida 3 Anexos 107 6.4 Indicado es de Malnu ição e Relação com a In eção po Adeno í us, As o í us e No o í us Tabela 6.2 Indicado es de malnu ição e elação com a in eção po adeno í us, as o í us e no o í us, Angola (2012/2013) Indicado es de Malnu ição Nº C ianças n=80 No o í us posi i os n=12 p- alue* G au de G a idade da dia eia p- alue# Adeno í us posi i os N=11 p- alue* G au de G a idade da dia eia p- alue# As o í us posi i os N=4 p- alue* G au de G a idade da dia eia p- alue# Peso Vs. Idade Z › -2SD 59 (73,8%) 8 (67%) 0,723 8 ± 2,93 0,209 10 (91%) 0,272 6,20 ± 3,39 0,625 2 (50%) 0,281 5 ± 1,41 0,493 -3SD ‹ Z ‹ - 2SD 21 (26,2%) 4 (33%) 5,75 ± 2,22 1 (9%) 8 2 (50%) 6,5 ± 2,12 Al u a Vs. Idade Z › -2SD 51 (63,8%) 8 (67%) 1,000 6,63 ± 3,07 0,301 6 (55%) 0,515 6,33 ± 3,14 0,975 4 100% 0,291 5,75 ± 1,71 - -3SD ‹ Z ‹- 2SD 29 (36,2%) 4 (33%) 8,50 ± 2,08 5 (45%) 6,40 ± 3,78 0 (0%) 0 Peso Vs. Al u a a) Z › -2SD 57 (73,1% 7 (64%) 0,475 8,71 ± 2,29 0,066 10 (91%) 0,271 6,20 ± 3,39 0,625 2 (50%) 0,292 5 ± 1,41 0,493 -3SD ‹ Z ‹ - 2SD 21 (26,9%) 4 (36%) 5,75 ±2,22 1 (9%) 8 2 (50%) 6,5 ± 2,12 a) Dos 108 inqué i os, ha ia in o mação de 80 inqué i os pa a os indicado es de malnu ição pesos Vs idade, e al u a Vs idade. Pa a a a iá el peso Vs al u a exis iam 78 inqué i os. *Tes e de Fishe e #T S uden Anexos 114 6.9 Resul ados P elimina es Ob idos po BLAST e RIVM após Sequenciação dos P odu os Ampli icados da egião NS da ORF2 de no o í us Amos a p ime Genó ipo NoV (BLAST) Co e Tamanho (pb) Re . ID Que y Genó ipo No (RIVM) Re . Genog upo I C38 NVG1 GI.3 42-350 309 JN69905 0 95 99 GI.3 U04469 KF3614 41 94 100 GQ85647 3 C56 NVG1 GI.5 37-356 319 KJ40229 5 94 99 GI.5 M87661 JN19136 0 95 92 L23828 C62 NVG1 GI.3 37-349 313 JX41639 2 97 100 GI.3 U04469 HQ2138 44 95 100 GQ85647 3 C83 NVG1 GI.3 40-348 309 JX41639 2 97 100 GI.3 AJ277612 HQ2138 44 96 100 AY03859 8 CAL2 NVG1 GI.3 18-344 327 JX41639 2 97 95 GI.3 AJ277612 HQ2138 44 96 95 AY03859 8 M10 NVG1 GI.3 65-350 269 JX41639 2 97 75 GI.3 EF547396 AB0585 29 97 99 GQ85647 1 Genog upo II AH8 G2SKF GII.6 30-328 298 KF2793 86 94 96 GII.6 AJ277620 JN69904 1 95 97 AB039778 AH14 G2SKF GII.7 27-321 295 AB4537 73 99 92 GII.7 AF414409 KC4956 52 98 96 AJ277608 AH15 G2SKF GII.7 20-335 316 AB4537 73 95 87 GII.7 AF414409 KC4956 52 97 91 AJ277608 B8 G2SKF GII.16 27-310 284 JX41640 0 96 93 GII.16 AY50201 0 GU1387 69 96 88 GQ85647 6 B15 G2SKF GII.2 23-338 316 AB6628 54 96 93 GII.2 X81879 KF2793 85 95 93 AY13474 8 B27 G2SKF GII.3 42-424 306 EU2491 37 97 98 GII.3 EU187437 Anexos 115 KC4956 60 96 98 U02030 B30 G2SKF GII.6 31-310 280 KF4343 05 94 99 GII.6 AJ277620 JN69904 1 96 97 AB039778 C26 G2SKF GII.4 20-312 293 KF4759 35 98 100 GII.4 X76716 KC4956 85 98 99 AB542917 C36 G2SKF GII.4 28-315 288 KJ41579 0 97 100 GII.4 X76716 KC4956 85 97 98 AB542917 C71 G2SKF GII.4 (Sydney_2 012) 23-304 282 KF0082 41 99 98 GII.4 (Sydney_2 012) X76716.1 KF3787 31 99 98 AB542917 C93 G2SKF GII.6 24-315 292 JN69904 1 96 96 GII.6 AJ277620 KF4343 05 95 100 AB039778 C97 G2SKF GII.7 30-418 389 AB4537 73 98 71 GII.7 AF414409 KC4956 52 98 74 AJ277608 CSMI13 G2SKF GII.4 32-336 304 KF2750 24 98 93 GII.4 (Sydney_2 012) X76716 KF0082 41 99 88 AB542917 CSP1 G2SKF GII.9 29-311 283 EF6305 30 97 96 GII.9 AY03859 9 AB5145 99 97 92 DQ37971 5 CSP3 G2SKF GII.4 20-313 293 KF2750 21 99 97 GII.4 (Sydney_2 012) X76716 KF2750 24 99 98 AB542917 CSP11 G2SKF GII.3 21-314 294 KC4956 60 96 100 GII.3 EU187437 KC4956 59 96 100 U02030 HMC25 G2SKF GII.4 (Sydney_2 012) 19-316 298 KF0082 41 99 94 GII.4 (Sydney_2 012) X76716 KF2750 24 98 97 AB542917 HMC40 G2SKF GII.7 19-311 293 KC4956 62 98 100 GII.7 AF414409 AB2583 31 97 94 AJ277608 HMC41 G2SKF GII.6 42-355 313 KF2793 86 95 88 GII.6 AJ277620 AB5391 49 98 79 AB039778 HMC42 G2SKF GII.6 24-311 288 KF2793 86 97 100 GII.6 AJ277620 AB5391 49 98 92 AB039778 HMC43 G2SKF GII.7 23-480 458 AB2583 31 97 74 GII.7 AF414409 KF8465 29 97 74 AJ277608 Anexos 116 M5 G2SKF GII.1 27-311 284 KC9624 59 98 99 GII.1 AJ277606 KF4759 28 97 100 U07611 M11 G2SKF GII.6 48-346 259 JX89889 0 99 100 GII.6 AJ277620 KC4956 84 99 100 AB039778 M17 G2SKF GII.7 25-297 272 AB4537 73 99 98 GII.7 AF414409 JQ75104 3 99 98 AJ277608 M22 G2SKF GII.6 21-302 282 KF4343 05 95 99 GII.6 AJ277620 JN69904 1 94 100 AB039778 M43 G2SKF GII.4 30-366 336 KJ68541 4 99 92 GII.4 X76716 JX98907 4 99 92 AB542917 M46 G2SKF GII.6 28-294 267 JN69904 1 94 100 GII.6 AJ277620 KF4343 05 93 100 AB039778 M47 G2SKF GII.4 31-299 269 KJ68541 4 99 100 GII.4 X76716.1 JX98907 4 99 100 AB542917 M48 G2SKF GII.14 23-304 281 JX89616 1 98 100 GII.14 GQ85646 5 JF90905 4 97 96 AY13076 1 M55 G2SKF GII.6 25-332 308 KC4956 84 99 93 GII.6 AJ277620 JX89889 0 99 89 AB039778 Anexos 117 6.10 Relação das Ca ac e ís icas Alimen a es e Clínicas com a In eção po Adeno í us e No o í us Tabela 6.5 Relação das Ca a e ís icas Alimen a es e Clínicas com a In eção po Adeno e No o í us, em Angola (2012/2013) Va á eis Ca ego ias HAdV-40 e -41 (n=7) HAdV não 40 e -41 (n=10) p- alue NoV GII.4 (n=4) NoV não GII.4 (n=12) p- alue Ca ac e ís icas da Alimen ação Amamen ação Sim 5 2 0,686 4 8 0,272 Não 2 3 0 4 Se sim, du an e a amamen ação inge iu ou os alimen os? Lei e ma e no e ou os alimen os 5 8 0,400 4 7 0,462 Amamen ação exclusi a 2 1 0 2 Ca ac e ís icas Clínicas Feb e <37,6ºC 6 5 0,500 3 8 - ≥37,6ºC 0 1 - - Se ≥37,6ºC, du ação média (dias) - 2 - - - - Dia eia Du ação média (dias) 2,71 ± 0,76 3,43 ± 1,13 0,191 3 ± 1,63 2,73 ± 1,27 0,737 Nº ezes/24ho as (média) 3,71 ± 1,11 3,78 ± 0,83 0,898 3,50 ± 1,29 3,91 ± 1,36 0,736 Vómi os Sim 4 2 0,145 1 5 0,462 Não 3 8 3 6 Du ação média (dias) 2,25 ± 1,26 1 0,440 1 2,20 ± 1,30 0,448 Nº ezes/24ho as (média) 2,25 ± 1,26 1,50 ± 0,71 0,492 4 2,20 ± 1,10 0,208 Desid a ação Sim 2 3 0,686 2 6 0,554 Não 5 7 1 6 A i idade No mal 4 9 0,162 2 9 0,637 Reduzida 3 1 1 3 Malnu ição Sim 2 2 0,594 0 3 0,110 Não 4 6 2 9 Índice de Massa Co po al (média) 15,2 ± 3,66 15,7 ± 1,76 0,787 13,1 ± 0,28 15,1 ± 4,14 0,534 G au de G a idade da dia eia a) (média) 7,43 ± 3,10 4,50 ± 2,51 0,048 6,25 ± 2,06 6,58 ± 3,50 0,861