Vanessa Mon ês
Mes ado em Química
Depa amen o de Química e Bioquímica
2015
O ien ado
M. João So omayo , FCUP
O ien ado es de Es ágio
Joana Dinis Fonseca, CeNTI
José Poças Gonçal es, CeNTI
Desen ol imen o
e O imização de
Senso es
Ele oquímicos
Imp essos
Todas as co eções de e minadas
pelo jú i, e só essas, o am e e uadas.
O P esiden e do Jú i,
Po o, ______/______/_________
i
Ag adecimen os
A ealização des a ese de Mes ado apenas oi possí el g aças à ajuda de
di e sas pessoas e ins i uições, às quais gos a ia de deixa as minhas pala as de
ag adecimen o:
Ao Depa amen o de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da
Uni e sidade do Po o, po me e acei e como es udan e de Mes ado, pe mi indo-me
a ealização da ese de Mes ado em ambien e emp esa ial.
Ao CeNTI, Cen o de Nano ecnologia e Ma e iais Técnicos, Funcionais e
In eligen es, po me e acei ado e possibili ado a ealização des e abalho de
in es igação e desen ol imen o, colocando odos os meios necessá ios à minha
disposição.
À Dou o a Joana Fonseca e ao Dou o José Gonçal es, meus o ien ado es no
CeNTI, po odo o apoio, o ien ação, dedicação e empo dispensados a ajuda -me
du an e odo o p esen e abalho. Ob igada po odo o apoio nas discussões de
esul ados e possí eis “ ol as a da ”.
À P o esso a Dou o a M. João So omayo , pela ajuda imp escindí el du an e
as di e sas ap esen ações e abalhos esc i os.
Aos meus colegas es agiá ios po odo o apoio du an e es e úl imo ano, an o
em o ma de longas discussões de esul ados ob idos, como de g andes ga galhadas
que se iam pa a le an a os ânimos. Especialmen e ao Roman K upa, pelas longas
discussões de ísica e po me e auxiliado du an e a u ilização de di e en es
equipamen os de ca ac e ização elé ica, ajudando-me na análise dos seus esul ados.
A odos os uncioná ios do CeNTI, que me ize am sen i em casa e que
es a am semp e p on os a ajuda no que e a necessá io.
Ao Rod igo Coelho, po e es ado semp e ao meu lado a apoia -me e p on o a
ou i as minhas inúme as e in e miná eis eo ias du an e o desen ol imen o do
abalho.
Aos meus pais e i mãos um g ande ob igada po odo o apoio e sac i ícios
ei os, po odas as longas con e sas e po oda a ajuda.

iii
Resumo
Es e abalho e e como p incipal obje i o o desen ol imen o e o imização de
senso es ele oquímicos imp essos não modi icados e modi icados, pa a de eção de
pe óxido de hid ogénio e de e anol.
Os senso es ele oquímicos são conhecidos pela sua ele ada sensibilidade e
sele i idade pa a di e sos anali os, não sendo necessá io a u ilização de ele ados
olumes de amos a pa a a ealização das análises. Po sua ez os senso es
imp essos ge almen e êm um baixo cus o de p odução associado, e essa p odução
pode ealiza -se em massa.
Nes e abalho p ocedeu-se à imp essão dos senso es es udados u ilizando-se
a écnica de se ig a ia (sc een p in ing). Após a imp essão, ealiza am-se es udos de
ca ac e ização ele oquímica e elé ica do elé odo de abalho, es udando-se o
p ocesso de oxidação- edução de uma sonda ele oquímica (K3[Fe(CN)6]) à supe ície
do elé odo e de e minando-se a esis ência de olha. Adicionalmen e ambém se
de e minou a espessu a e a ugosidade dos elé odos po pe ilome ia.
Com o obje i o de se ob e um aumen o da e e sibilidade do p ocesso edox
da sonda à supe ície do elé odo, o am ei os es udos de o imização do senso . No
p imei o es udo in es igou-se como o núme o de camadas de ca bono no elé odo de
ca bono a e a o compo amen o ele oquímico, a esis ência de olha e a ugosidade
do p óp io elé odo. No segundo es udo, in es igou-se qual a in luência de p é-
a amen os ele oquímicos, com soluções de H2SO4, e PBS no compo amen o
ele oquímico do elé odo de abalho.
Após a o imização do elé odo de abalho, p ocedeu-se à modi icação da
supe ície desse elé odo com alocianina de cobal o (CoPC), um mediado de
ele ões que pe mi e a de eção do sinal ele oquímico de H2O2.
Foi ambém obje i o do p esen e abalho a imobilização, sob e o elé odo de
abalho do senso , da enzima álcool oxidase, uma enzima que ca alisa a eação de
álcoois p imá ios com oxigénio, sendo um dos p odu os H2O2. Com es a modi icação
p e endia-se ob e senso es pa a a de eção de e anol, senso es com uma as a
aplicação indus ial nomeadamen e na moni o ização dos p ocessos de e men ação
de bebidas alcoólicas e de p odução de e anol pa a biocombus í eis. A imobilização
ealizou-se po deposição po go a, endo-se es ado ês abo dagens dis in as. Com
uma memb ana de ni ocelulose, com uma camada de ága -ága e sem memb ana de
ni ocelulose e/ou camada de ága -ága . Apenas os senso es com a camada de ága -
ága sob e a go a de álcool oxidase ap esen a am sensibilidade ao e anol, no en an o,
es a oi mui o baixa.
i
Pala as-cha e
Senso es ele oquímicos imp essos, Biossenso es, Se ig a ia, F alocianina de
cobal o(II), E anol, Álcool oxidase, Hexaciano e a o(III) de po ássio.
Abs ac
The main aim o his wo k is he de elopmen and op imiza ion o an
elec ochemical p in ed senso , wi hou o wi h modi ica ion, o de ec hyd ogen
pe oxide and e hanol.
Elec ochemical senso s a e known o hei high sensi i i y and selec i i y o
di e en analy es and hey don’ necessa ily need high olume samples. Gene ally
p in ed senso s ha e low p oduc ion cos and a e easily adap ed o mass p oduc ion.
The s udied senso s we e p in ed by he sc een p in ing echnique. A e wa ds,
he wo king elec ode was elec ochemically and elec ically cha ac e ized in o de o
e alua e i s elec ochemical beha io , using an elec ochemical p obe (K3[Fe(CN)6]),
and o de e mine i s shee esis ance. Addi ionally, he hickness and oughness o he
elec ode we e also e alua ed, by su ace p o ilome y.
Fo an inc ease o he e e sibili y o he edox p ocess a he wo king elec ode
su ace, op imiza ion s udies we e pe o med. In he i s s udy he numbe o ca bon
laye s, and i s e ec on he elec ochemical beha io , he shee esis ance and he
oughness o he elec ode, we e analyzed. In he second s udy, he in luence o wo
di e en p e- ea men s, one wi h H2SO4 and he o he wi h PBS, on he
elec ochemical beha io o he elec ode we e in es iga ed.
A e he wo king elec ode op imiza ion, an elec ode su ace modi ica ion was
ca ied ou , wi h cobal phalocyanine (CoPC), an elec on media o which allows he
de ec ion o he elec ochemical signal o H2O2. The modi ied senso showed a linea
elec ochemical esponse wi h he H2O2 concen a ion.
In he p esen wo k we wan ed o immobilize, on o he wo king elec ode o he
senso , he enzyme alcohol oxidase, which ca alyzes he eac ion o he p ima y
alcohols wi h hyd ogen, one o he p oduc s o H2O2 eac ion (an elec ochemical
species wi h high oxida ion po en ial). Wi h his modi ica ion i was in ended o ob ain a
senso , o he de ec ion o e hanol, wi h a wide ange o indus ial applica ions, like he
moni o iza ion o he alcohol e men a ion and he p oduc ion o e hanol o bio uels.
The immobiliza ion was ca ied ou by d op deposi ion, and h ee di e en
app oaches we e es ed: wi h a ni ocellulose memb ane, wi h an aga memb ane and
wi hou a ni ocellulose memb ane and/o an aga memb ane. Only he senso wi h he
aga memb ane on o he alcohol oxidase d op showed sensibili y o e hanol, howe e ,
i was eally small.

xiii
Índice de G á icos
G á ico 1 – Pe ilome ia e e en e ao alinhamen o do elé odo de abalho com
sob eposição de qua o camadas ............................................................................... 38
G á ico 2 – Resul ado do es e inicial do senso de ês elé odos imp essos ............. 41
G á ico 3 – Vol amog amas após p é- a amen o ........................................................ 42
G á ico 4 – Vol amog ama ob ido com elé odo de ca bono imp esso sem
e es imen o, com picos ep esen a i os de me ais .................................................... 44
G á ico 5 - Vol amog ama ob ido com elé odo de ca bono imp esso com
e es imen o. ............................................................................................................. 45
G á ico 6 – Vol amog amas ob idos com a iação do núme o de camadas, de in a
à base de ca bono, do elé odo de abalho imp esso e elé odo de ca bono í eo
come cial. ................................................................................................................... 46
G á ico 7 – Aumen o da espessu a do elé odo de abalho imp esso em unção do
núme o de camadas imp essas. ................................................................................. 47
G á ico 8 – Aumen o da esis ência de olha do elé odo de abalho imp esso em
unção do in e so da espessu a. ................................................................................ 47
G á ico 9 – Va iação da ugosidade do elé odo de abalho imp esso em unção
do núme o de camadas imp essas. ............................................................................ 48
G á ico 10 – Vol amog amas ob idos com sis ema de ês elé odos imp essos
an es e após p é- a amen o ....................................................................................... 50
G á ico 11 – Vol amog amas ob idos com sis ema de ês elé odos imp essos
an es e após p é- a amen o. ...................................................................................... 51
G á ico 12 - Vol amog amas ob idos com solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III)
de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4 po ês senso es di e en es ................................ 52
G á ico 13 – Vol amog amas ep esen a i os de cada conjun o de 100 a imen os,
cada co co esponde a um desses ol amog amas. .................................................. 55
G á ico 14 – Vol amog amas ob idos no es udo ciné ico da solução de 2,5 mM
hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4 a di e en es elocidades de
a imen o. .................................................................................................................. 56
G á ico 15 – Va iação do alo de co en e de pico em unção da aiz quad ada da
elocidade de a imen o ............................................................................................ 56
G á ico 16 – Va iação dos alo es de po encial dos picos anódico e ca ódico em
unção da elocidade de a imen o ........................................................................... 57
G á ico 17 – Vol amog amas ob idos em solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III)
de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. ............................................................................ 60
xi
G á ico 18 – Vol amog amas ob idos em solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III)
de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4 po ês senso es di e en es ................................ 61
G á ico 19 – Vol amog amas ep esen a i os de cada conjun o de 100 a imen os,
cada co co esponde a um desses ol amog amas. .................................................. 64
G á ico 20 – Vol amog amas ob idos com in e alo de uma semana u ilizando o
mesmo senso , que o a subme ido a um p é- a amen o apenas uma ez. ............... 65
G á ico 21 – Vol amog amas ob idos no es udo ciné ico da solução de 2,5 mM
hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4 a di e en es elocidades
de a imen o .............................................................................................................. 66
G á ico 22 – Va iação do alo de co en e de pico em unção da aiz quad ada da
elocidade de a imen o ............................................................................................ 66
G á ico 23 – Va iação dos alo es de po encial dos picos anódico e ca ódico em
unção da elocidade de a imen o ........................................................................... 67
G á ico 24 – De eção de 0,88 mM H2O2 em 0,1 M PBS pH=7,4.................................. 68
G á ico 25 – Sinal ampe omé ico do senso após sucessi as adições pad ão de
H2O2............................................................................................................................ 69
G á ico 26 – Cu a de calib ação do sinal ampe omé ico do senso após
sucessi as adições pad ão de H2O2 ........................................................................... 69
G á ico 27 – Cu a de calib ação do sinal ampe omé ico do senso após
sucessi as adições pad ão de e anol ......................................................................... 72
x
Lis a de Símbolos e Ab e ia u as
A - Á ea do elé odo de abalho
A - Á ea ans e sal
ADH - Álcool desid ogenase
AOX - Álcool oxidase
c - Concen ação
CoPC - F alocianina de cobal o
D - Coe icien e de di usão
E - Po encial do elé odo de abalho
Eϴ - Po encial o mal
EA - Elé odo auxilia
ER - Elé odo de e e ência
ET - Elé odo de abalho
Ep,a - Po encial de pico da co en e anódica
Ep,c - Po encial de pico da co en e ca ódica
e- - Ele ão
∆Ep - Di e ença de po encial en e os picos anódico e ca ódico
F - Cons an e de Fa aday
i - In ensidade de co en e
ic - Co en e capaci i a
i - Co en e a adaica
ip - In ensidade de co en e de pico
ip,a - In ensidade de co en e do pico anódico
ip,c - In ensidade de co en e do pico ca ódico
KM - Cons an e de Michaelis-Men en
l - Comp imen o
n - Quan idade de subs ância (anali o)
n' - Núme o de ele ões ans e idos no passo limi an e da elocidade
NADH - Nico inamida adenina dinucleó ido os a o
NAD+ - Nico inamida adenina dinucleó ido
[O]∞ - Concen ação inicial da espécie oxidan e em solução
PET- Poli e e ala o de e ileno
PVC- Policlo e o de poli inilo
PBS - Phospha e bu e ed saline (Tampão os a o-salino)
Q - Quocien e en e a concen ação das espécies em solução
R - Resis ência
x i
Rs - Resis ência de olha
edox - Redução - oxidação
R2 - Coe icien e de de e minação
R - Cons an e dos gases pe ei os
SPE - Sc een p in ed elec ode (elé odo imp esso)
SPCE - Sc een p in ed ca bon elec ode (elé odo de ca bono imp esso)
[S]o - Concen ação inicial de subs a o
T - Tempe a u a
- Tempo
- Velocidade de a imen o
V0 - Velocidade inicial
VM - Velocidade máxima
αa - Coe icien e de ans e ência de ca ga anódico
αc - Coe icien e de ans e ência de ca ga ca ódico
ρ - Resis i idade
Ø - Diâme o
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
1
1. In odução
1.1. Biossenso es
Um biossenso é um senso de de eção química que na sua cons i uição em
um componen e de econhecimen o biológico, que é o esponsá el pela
biossele i idade, acoplado a um ansdu o , que ans o ma a in o mação ob ida num
sinal de in e esse, sendo des a o ma possí el a de eção de um de e minado
pa âme o bioquímico [2]. A Figu a 1 ap esen a esquema icamen e os elemen os
cons i uin es de um biossenso . O elemen o de econhecimen o biológico pode á se
acoplado ao senso po écnicas de uncionalização, como po exemplo adso ção e
c oss linking.
A á ea dos biossenso es encon a-se em g ande expansão de ido, em
pa icula , à sensibilidade ine en e aos mé odos u ilizados (como po exemplo mé odos
ele oquímicos) em conjun o com a biossele i idade ca ac e ís ica dos componen es
biológicos [2].
Figu a 1 – Esquema de um biossenso com um ansdu o de sinal [2].
Exis em di e sos ipos de biossenso es, podendo a designação a ibuída a
cada um depende do ipo de elemen o de econhecimen o biológico (bioca alí ico ou
po a inidade) ou do géne o de ansdu o u ilizado ( essonan e, é mico, ó ico,
sensí el a iões ou ele oquímico), al como se encon a esquema izado na Figu a 2.
Os biossenso es ap esen am ipicamen e dimensões mui o eduzidas, são de
ácil u ilização e pe mi em uma análise ápida dos mais a iados anali os. Es a análise
pode se con ínua, du an e um longo pe íodo de empo, ou pode se uma análise de
espos a ápida, du an e um cu o pe íodo de empo [3]. Dependendo do obje i o pa a
o qual é idealizado, o senso pode se desca á el ou eu ilizá el.
O acoplamen o de um elemen o de econhecimen o biológico ao ansdu o
con e e uma ele ada especi icidade a es e ipo de senso es e o ansdu o pe mi e
uma ele ada sensibilidade pa a o anali o. Sendo es es senso es especí icos pa a
de e minados compos os, encon am-se o imizados pa a que o seu empo de espos a
seja o mais cu o possí el, o que se de e à manipulação da ciné ica das eações que
oco em no sis ema [3].
Anali o
Elemen o de
Reconhecimen o
Biológico
Sinal
P ocessado de
Sinal
T ansdu o

2
Capí ulo 1
In odução
Tipo de Biossenso
Elemen o Sensí el
T ansdu o
Enzimá ico
Mic obiológico
Imunossenso
Quimio ecep o
Ele oquímico
ímico
Ó ico
Acús ico
Calo imé ico
Baseiam-se na de eção de al e ações
de p op iedades ó icas esul an es da
in e ação en e o anali o e o
componen e de econhecimen o
biológico (ex. di ação da luz), ou nos
alo es de emissão de luz po um
p ocesso luminescen e[4][4][4].
O seu p incípio de uncionamen o
baseia-se em uma ou mais eações
químicas p oduzem ou u ilizam iões e/ou
ele ões que pode ão p o oca
al e ações nas p op iedades elé icas
das amos as.
Quando o anali o en a em con ac o com
o elemen o de econhecimen o biológico
há uma al e ação da massa do sis ema,
o que le a a uma al e ação da
equência de essonância egis ada
pelo ansdu o , sendo essa equência a
g andeza medida.
Baseiam-se na medição do calo
p oduzido ou abso ido du an e a
eação en e o anali o e um de e minado
elemen o de econhecimen o biológico.
O elemen o de econhecimen o
biológico é cons i uído po uma enzima,
que é imobilizada u ilizando écnicas de
uncionalização. Es e elemen o biológico
é especí ico e ex emamen e sele i o.
Baseiam-se na imobilização de mic o-
o ganismos que in e a uam e
econhecem a espécie de in e esse.
G ande especi icidade no
econhecimen o de an igénios de ido
aos an ico pos imobilizados na
supe ície do elé odo, o mando um
complexo es á el.
T a a-se de um sis ema que u iliza
p o eínas que in e agem com espécies
biológicas, ais como ho monas,
esul ando em al e ações
con o macionais.
De aco do com
Figu a 2 – Tabela esumo dos di e sos ipos de biossenso es de aco do com o ipo de elemen o de econhecimen o
biológico ou do géne o de ansdu o u ilizado [4].
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
3
Apesa das inúme as an agens, os biossenso es ap esen am ambém algumas
des an agens. De ido à inco po ação de um agen e biológico no senso , em ge al, a
empe a u a de acondicionamen o de e se con olada, já que quando sob eaquecido
exis e o isco de desna u ação do agen e biológico acoplado. Dessa o ma, a sua
es abilidade é um pa âme o c í ico, exis indo di e sos a o es que pode ão pô-la em
causa, ais como o pH, iões em solução e, como já e e ido, a empe a u a [3].
1.2. Senso es Ele oquímicos
Es a é p o a elmen e a maio classe de senso es químicos, sendo u ilizados
na de eção das mais di e sas moléculas, mic o-o ganismos, en e ou os. O p incípio
ine en e é que uma ou mais eações químicas acabam po p oduzi ou u iliza iões
e/ou ele ões que p o ocam al e ações nas p op iedades elé icas das amos as. Es e
ipo de senso es di ide-se em ês ca ego ias, os senso es condu imé icos,
ampe omé icos e po enciomé icos [4].
Os senso es ele oquímicos condu imé icos baseiam-se em p ocessos
químicos que oco em em solução e que le am a uma al e ação da condu i idade
iónica das soluções. Em ge al a sensibilidade pa a es a a iá el é mui o baixa [4].
Ou a classe de senso es ele oquímicos são os ampe omé icos em que é
medida a in ensidade de co en e após a aplicação de uma di e ença de po encial, que
dá o igem à eação química. Es es senso es êm uma g ande sensibilidade pa a
amos as biológicas e ge almen e de e am com acilidade espécies ele oa i as
p esen es nas amos as [4].Es es senso es ele oquímicos são, po no ma, sis emas
ele oquímicos de ês elé odos, como a célula ele oquímica esquema izada na
Figu a 3. Es e sis ema de ês elé odos consis e na passagem de co en e de um
elé odo de abalho, no qual oco e a eação ele oquímica em es udo, pa a um
elé odo auxilia . O elé odo de e e ência é u ilizado como uma e e ência de po encial
conhecido e cons an e [5].
Po úl imo, em-se os senso es ele oquímicos po enciomé icos, em que é
medida a di e ença de po encial en e um elé odo sensí el ao anali o e o elé odo de
e e ência.
4
Capí ulo 1
In odução
Figu a 3 – Esquema de um sis ema de ês elé odos e espe i os componen es.
Os elé odos dos senso es ele oquímicos podem se imp essos,
nomeadamen e po se ig a ia. A es e sis ema chama-se sis ema de elé odos
imp essos, SPE (Sc een P in ed Elec ode), e exis em sis emas de dois ou ês
elé odos, al como ep esen ado na Figu a 4. Os SPEs com dois elé odos cos umam
se u ilizados pa a de eção sem quan i icação. Os SPEs de ês elé odos são, po sua
ez, mais e sá eis, pe mi indo a ealização de análises quan i a i as. Po se em
sis emas mais complexos, êm associado um maio cus o de ab ico.
Figu a 4 – SPEs e espe i os componen es. A) Esquema de um sis ema de ês elé odos. B) Esquema de um sis ema
de dois elé odos.
A g ande di e ença en e as células ele oquímicas con encionais e os SPEs é
que es es úl imos são mais e sá eis, de meno es dimensões e complexidade, al
como é possí el obse a na Figu a 5 [3]. Tais ca ac e ís icas pe mi em que os SPEs
possam se u ilizados po ope ado es não especializados, não exis indo a necessidade
de p epa a a célula ele oquímica, bas ando p ocede à deposição da amos a sob e o
elé odo de abalho do senso . Apesa des a acilidade adicional na u ilização de
senso es imp essos, as células ele oquímicas con encionais êm a an agem de
Elé odo
Auxilia
Elé odo de
Re e ência
Elé odo de
T abalho
Subs a o
Con ac os
Re es imen o
A
Elé odo
Auxilia
Elé odo de
T abalho
Subs a o
Con ac os
Re es imen o
B
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
5
se em sis emas mais obus os, pe mi indo, a a és do polimen o, limpa o elé odo de
abalho de odas as impu ezas que pode ão es a na sua supe ície, o que possibili a
que o sis ema enha uma maio du abilidade e es abilidade.
Figu a 5 – A – SPE de um sis ema de ês elé odos e espe i os componen es [6]. B – Célula ele oquímica de um
sis ema de ês elé odos.
Exis em senso es ele oquímicos biológicos, a que se dá o nome de
biossenso es ele oquímicos e que podem se classi icados com base no seu
elemen o de econhecimen o biológico, denominando-se de senso es bioca alí icos ou
senso es po a inidade. A g ande di e ença en e ambos é que, no caso dos senso es
bioca alí icos, oco e uma eação en e o anali o e o componen e de econhecimen o
biológico, ha endo a o mação de uma no a espécie química, sendo o sinal da no a
espécie o que é moni o izado. Já no caso dos senso es po a inidade é a ligação en e
o anali o e o componen e biológico que é de e ada.
1.2.1. Senso es Bioca alí icos
Nos senso es bioca alí icos são ge almen e usadas enzimas que são
acopladas ao elé odo de abalho. Es as êm uma g ande a i idade ca alí ica aliada a
uma ele ada especi icidade pa a de e minadas espécies, ca alisando a o mação de
p odu os ele oa i os pa a se em de e ados. Es es p odu os são, em ge al,
moni o izados di e amen e a a és da écnica de ampe ome ia [2].
Pa a além de senso es bioca alí icos baseados em enzimas, exis em ambém
biossenso es em que são inco po ados, no componen e de econhecimen o biológico,
mic o-o ganismos i os. Es e ipo de senso não é mui o u ilizado, pois em o
p oblema de p ecisa de longos pe íodos de empo pa a ecupe a o almen e após
uma análise, ap esen ando longos empos de espos a e pe da de sensibilidade ao
Re es imen o
Elé odo
Auxilia
Elé odo
T abalho
Elé odo de
Re e ência
Conecção
do ET
Conecção
do EA
Conecção
do ER
A
B

FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
13
2. Técnicas
2.1. Fab ico de Senso es Ele oquímicos
2.1.1. Técnicas de Imp essão
Tal como a designação indica, o ab ico de senso es imp essos inclui pelo
menos uma écnica de imp essão. Na á ea dos senso es imp essos, uma das écnicas
de imp essão mais u ilizadas é a se ig a ia (sc een p in ing). No en an o, nos úl imos
anos êm sido u ilizadas ou as écnicas de imp essão pa a desen ol e di e sos
senso es imp essos, ais como a imp essão a ja o de in a, a o og a u a e a
lexog a ia. O ecu so a es as ecnologias de imp essão pe mi e a p odução em massa
de senso es de o ma simples e ápida, pa a além de pe mi i um baixo cus o de
p odução [24, 25].
2.1.1.a. Se ig a ia
A se ig a ia, ou sc een p in ing, é uma écnica mui o e sá il, pe mi indo a
imp essão em subs a os planos. É uma écnica económica e que ap esen a, du an e
a imp essão, pe das de in a esiduais.
As di e enças mais ele an es des a écnica de imp essão ela i amen e a
ou as é a possibilidade de imp imi ilmes de ele ada espessu a. A espessu a do ilme
imp esso é um pa âme o de ácil ajus e e con olo, que depende essencialmen e da
ela u ilizada du an e a imp essão, nomeadamen e do núme o de ios po cen íme o e
do diâme o do io u ilizada na ela. Na Figu a 8 encon a-se um esquema do p ocesso
de se ig a ia.
Figu a 8 – Ilus ação do p ocesso de se ig a ia [27].
Mo imen o
Moldu a
Tin a Imp essa
Tin a
Subs a o
Tela com
emulsão
Á ea abe a que
con ém in a
Racle e
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Capí ulo 2
Técnicas
Nes e p ocesso, o pad ão do senso que se que imp imi encon a-se g a ado
numa ela, de nylon ou poliés e e com moldu a de me al ou alumínio, onde é
deposi ada a in a pa a a imp essão. Du an e o p ocesso a acle e espalha a in a
sob e o pad ão que se encon a na ela e de seguida exe ce uma de e minada
p essão, pe mi indo a ans e ência da in a pa a o subs a o [27].
A ela u ilizada na imp essão obedece a duas eg as. A la gu a mínima de linha
que pode se imp essa é ês ezes o diâme o do io da ela e a la gu a en e os ios
da ela de e e pelo menos ês ezes o amanho de pa ícula da in a/pas a u ilizada
du an e a imp essão. Pa a a escolha da ela, pa a além des as duas eg as, de em se
conside ados o olume e peso eó ico da in a e a p essão ecomendada que pode se
emp egue na ela, ou seja, a p essão necessá ia pa a que a ela es ique o su icien e
pa a a in a passa de um lado pa a o ou o da ela sem a dani ica .
Pa a além das eg as pa a a escolha da ela, ambém é impo an e sabe quais
as unções da acle e du an e a imp essão. Es a em ês unções p incipais:
p essiona a ela con a o subs a o du an e a imp essão, ajuda na passagem da in a
a a és da ma iz da ela pa a o subs a o e, po úl imo, emo e o excesso de in a da
ela após a imp essão. A p essão da acle e sob e a ela é a iá el e, quando maio o
a p essão, mais inos são os ilmes imp essos, pois a ela encon a-se mais p óxima
do subs a o. Es e equipamen o de e á se lexí el de o ma a molda -se a qualque
supe ície, seja ela lisa ou ugosa, exis indo acle es com di e en es g aus de
lexibilidade.
Pa a além do amanho do diâme o do io da ela se impo an e no con olo da
espessu a dos ilmes imp essos, a elocidade da acle e é ou o a o undamen al no
con olo da espessu a. Quando maio o a elocidade da acle e du an e a imp essão,
maio é a espessu a do pad ão imp esso. A azão é mui o semelhan e à e e ida pa a
a a iação da p essão da acle e, ou seja, se a elocidade da acle e o mui o g ande,
a ela não é ão p essionada sob e o subs a o, o que le a a que o pad ão imp esso
enha uma maio espessu a. Es a espessu a ambém é dependen e do ângulo da
acle e, quando maio o o ângulo da acle e ela i amen e à ela, meno é a
espessu a do ilme.
Ou o a o que ambém in luencia a espessu a do ilme é o snap o da ela,
que em uma elação de p opo cionalidade com espessu a do ilme. O snap o é o
espaço en e a ela e o subs a o, que de e e amanho su icien e pa a que, logo após
a passagem acle e, a ela eg esse à posição inicial, não icando demasiado p óxima
do subs a o. Se al acon ece , a ela pode “cola ” no subs a o, dani icando a
imp essão e po ezes o p óp io quad o.
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
15
A écnica de se ig a ia pode exis i em la bed (imp essão usando quad os
planos) e em oll- o- oll ( olo a olo), como ap esen ado na Figu a 9. A u ilização de
se ig a ia olo a olo pe mi e imp essões a elocidades supe io es e em maio escala
do que a se ig a ia la bed, que em ge al p ocessa-se “ olha a olha”, que é uma
e en e da écnica mais u ilizada em in es igação e desen ol imen o. Es a e en e
da écnica pe mi e ambém a u ilização de subs a os ígidos, algo que em olo a olo
não é possí el.
Figu a 9 – Fo og a ias dos apa elhos das écnicas de se ig a ia. A – Folha a olha. B – Rolo a olo.
2.1.1.b. Imp essão a Ja o de Tin a
Apesa da écnica de ja o de in a se u ilizada há alguns anos no ab ico de
senso es, só a ualmen e se em o nado mais p oeminen e nessa á ea de ido ao seu
baixo cus o e po pe mi i a deposição de pequenas quan idades de in a pa a a
imp essão. As p incipais an agens são a ele ada esolução da écnica e se uma
écnica digi al (a imp essão é ei a di e amen e a pa i do compu ado ) [27].
Es a écnica baseia-se na deposição de pequenas go as de in a num
subs a o, com g ande p ecisão e ep odu ibilidade, exis indo pelo menos qua o ipos
dis in os de imp essão a ja o de in a: é mica, piezoelé ica, ele os á ica e acús ica.
Os mais u ilizados são a imp essão a ja o de in a é mica e a imp essão a ja o de in a
piezoelé ica, que se encon am esquema izadas na Figu a 10 [24, 26].
A
B
16
Capí ulo 2
Técnicas
Figu a 10 – Ilus ação do p ocesso de imp essão a ja o de in a. A – Imp essão piezoelé ica [27]. B – Imp essão
é mica [26].
A imp essão a ja o de in a é mica é uma écnica mais simples, não
eque endo um con olo ão p eciso da iscosidade da in a, no en an o, caso sejam
u ilizados componen es biológicos no senso , es es pode ão desna u a , o que não
acon ece com a imp essão a ja o de in a piezoelé ica [26]. Is o po que os
biossenso es con êm como elemen o de econhecimen o biológico, po exemplo,
enzimas, que pode ão desna u a com o calo , le ando a pe das de g ande pa e, ou
mesmo oda, a sua a i idade, o nando o senso in iá el.
Exis em senso es de glucose imp essos pela écnica de ja o de in a, em que
se e idenciam a sua ep odu ibilidade e baixo cus o [8].
2.1.1.c. Ro og a u a
Na écnica de o og a u a, o pad ão que que emos que seja imp esso
encon a-se g a ado num cilind o de imp essão. Ao longo da imp essão, esse pad ão
é p eenchido com in a, seguidamen e é e i ado o excesso dessa in a e po im o olo
é p essionado con a o subs a o, imp imindo assim os pad ões, al como
esquema izado na Figu a 11A [26].
Figu a 11 – Ilus ação de dois p ocessos de olo a olo [26]. A – G a u a. B – Flexog a ia.
A
B
Subs a o
Bocal
Colapso das bolhas
Eje o de in a
Fo mação de bolhas
Remoção da in a
Resis ência é mica
Subs a o
Go as de in a
Di eção da go a
Fo necimen o
de in a
T ansdu o
de p essão
Dados
Ro ação
Ro ação
A
B
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Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
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Tipicamen e, a o og a u a é uma écnica com g ande elocidade de
imp essão, sendo u ilizada pa a a imp essão de ilmes me álicos, plás icos e a é
mesmo no as bancá ias [29]. Também é u ilizada pa a a imp essão de senso es
ele oquímicos de di e en es espécies químicas ais como sul e o de cádmio [32, 33].
2.1.1.d. Flexog a ia
Na lexog a ia o p ocesso de imp essão consis e na aplicação de um ilme
uni o me de in a sob e o pad ão que e es e o olo de imp essão, al como se
encon a ep esen ado na Figu a 11B. Es e olo, com a in a, en a em con ac o com o
subs a o, ans e indo o pad ão do olo pa a esse subs a o [26].
A lexog a ia é assim mui o simila à o og a u a. As p incipais di e enças en e
as duas écnicas são na p essão exe cida, que é maio na lexog a ia, e na elocidade
de imp essão, que é meno na lexog a ia. Po ou o lado, a écnica de o og a u a em
um cus o associado supe io à lexog a ia mas o empo de ida do olo dessa écnica
de imp essão é ipicamen e mui o supe io [32].A lexog a ia é u ilizada, po exemplo,
na imp essão di e a de an ico pos em subs a os lexí eis [33].
2.1.2. Ma e iais
Uma das a iá eis mais impo an es das écnicas de imp essão são as in as
escolhidas. A p epa ação e seleção das in as dependem da aplicação u u a do
senso imp esso, podendo se in as cu á eis po UV, condu o as,
ele oluminescen es, en e ou as. Todas es as in as êm que e ele ada iscosidade,
o que depende do ab ican e e do seu uso especí ico, sendo impo an e conhece a
lexibilidade/ igidez do subs a o e os empos de cu a ecomendá eis da in a [34].
Os ma e iais que ipicamen e cons i uem as in as se ig á icas são: esina
( ambém e e ida como agen e ligan e), que une as pa ículas da in a e pe mi e a sua
ade ência ao subs a o, e sol en es, que se encon am dissol idos na in a e que são
ans e idos pa a a supe ície de imp essão. Em alguns casos, na cons i uição da in a
exis em ambém adi i os, que al e am as p op iedades ísicas da in a, e pigmen os,
esponsá eis pela co da in a e pela sua opacidade [34]. Na Tabela 2 são
ap esen adas algumas das p incipais in as usadas no ab ico de senso es
ele oquímicos e as suas an agens e des an agens.

18
Capí ulo 2
Técnicas
Tabela 2 – Exemplos de algumas das p incipais in as e espe i as an agens e des an agens [32–35].
Ma e iais/
Tin as
Van agens
Des an agens
Ca bono/
G a i e
Baixo cus o; ea i idade ele oquímica a a i a;
biologicamen e ine e.
Possui co en es esiduais;
baixa condu i idade.
Pla ina
Baixa axa de o mação de issu as no pad ão de
imp essão após a cu a; adequado pa a o nos de
al as empe a u as.
Ele adas empe a u as de
cu a; ele ado cus o.
Ou o
Mui o ine e, biologicamen e compa í el.
Ele ado cus o.
P a a/
Clo e o
de P a a
Quimicamen e esis en e; ele ada e e sibilidade;
ele ada densidade de co en e; ele ada
condu i idade; baixas empe a u as de cu a.
Baixa du abilidade.
P a a
Boa condu i idade.
Oxidação em con ac o com
soluções aquosas ou o a .
2.1.3. Subs a os
Os elé odos imp essos consis em em ilmes deposi ados sob e um subs a o
ine e. Os subs a os podem di idi -se em duas g andes ca ego ias: (i) subs a os
lexí eis, ais como ma e iais polimé icos (como po exemplo PET e PVC) e o papel, e
(ii) subs a os ígidos como po exemplo id o e ce âmica [38].
Quando não é necessá io que o subs a o seja lexí el, é p e e í el que a
imp essão seja sob e um subs a o ígido, po no ma o id o, que em um meno cus o
do que a ce âmica e que pe mi e igualmen e ele adas empe a u as de cu a, endo
uma supe ície an o quimicamen e como e micamen e es á el [38]. Apesa de o id o
se mui o u ilizado em de imen o do subs a o de ce âmica, es e úl imo pe mi e, em
ge al, ob e melho es esul ados, maio sensibilidade e sele i idade [38]. Caso seja
possí el, es e acaba semp e po se p e e í el ao id o, mas ambém em um maio
cus o associado. Na Tabela 3 encon am-se alguns dos subs a os mais u ilizados e as
suas an agens e des an agens.
Tabela 3 – Exemplos de alguns dos p incipais subs a os e espe i as an agens e des an agens [36, 37].
Subs a os
Van agens
Des an agens
Ce âmica
Pe mi e ele adas empe a u as de cu a;
supe ície egula ; impe meá el a água e
oxigénio.
Não é lexí el;
impossibilidade de
u ilização nas écnicas olo
a olo; cus o ele ado.
Vid o
Pe mi e ele adas empe a u as de cu a;
anspa en e; supe ície egula ;
quimicamen e e e micamen e es á el;
impe meá el a água e oxigénio. Pode se
conside ado um subs a o lexí el se i e
uma espessu a <200µm.
Impossibilidade de
u ilização nas écnicas olo
a olo. O id o lexí el é
di ícil de u iliza e
ex emamen e ágil.
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Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
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Polimé ico
(PET;
PVC)
T anspa ência; lexibilidade; di e en es
gamas de espessu a; ele ada esis ência
ao sol en e.
De o mação do ma e ial
de ido à cu a.
Papel
Co b anca; g ande compa ibilidade com
amos as biológicas; bas an e lexí el;
di e en es gamas de espessu a.
E ei o indi e o na espessu a
do ilme de ido à ele ada
abso ância do subs a o.
Nes e abalho o am u ilizados subs a os lexí eis, nomeadamen e PET,
de ido ao seu baixo cus o e ele ada esis ência ao sol en e e id o pa a a ealização
de es es de ca ac e ização po pe ilome ia. Como o PET so e de o mação a
ele adas empe a u as de cu a, es e oi sujei o a um p é- a amen o é mico an es de
se u ilizado na imp essão.
Du an e a imp essão do senso sob e o subs a o, é necessá io e alguns
a o es em con a, al como as p op iedades ó icas do ma e ial, pois exis em di e sos
senso es ansmissi os que necessi am de subs a os anspa en es e com supe ície
plana. A ugosidade é ou o pa âme o impo an e da supe ície, sendo que o seu alo
ideal depende mui o do ipo de senso p e endido. Quando nos e e imos a senso es
ele oquímicos, um alo ele ado da ugosidade é ele an e, pois le a a um aumen o
da á ea a i a do senso , aumen ando a espos a do mesmo [39]. Po sua ez, as
p op iedades químicas do subs a o es ão elacionadas com a sua impe meabilidade,
a libe ação de e en uais con aminan es e a capacidade de es e se su icien emen e
ine e a ní el químico de modo a não so e al e ações ao longo de p ocessos
químicos, como po exemplo à uncionalização do elé odo de abalho com
subs âncias biológicas [39].
Ge almen e, a cu a de senso es imp essos é é mica, ou seja, é ei a a al as
empe a u as, sendo po isso impo an e conhece as p op iedades é micas e
e momecânicas dos subs a os. A empe a u a a que se u iliza o senso e a que
oco e a cu a de e se compa í el com a empe a u a máxima de u ilização do
subs a o, caso con á io é necessá io um p é- a amen o do subs a o em ques ão.
2.1.4. Design
A écnica de se ig a ia pe mi e a imp essão de di e sos senso es com as
mesmas ca ac e ís icas e com baixo cus o de ab ico. Mas an es de imp imi os
senso es e a é mesmo de escolhe o subs a o e as in as a u iliza , é impo an e e
de inido o pad ão do senso que se que u iliza . Es e pad ão a ia dependendo da
u ilização do senso [24, 25].
No caso dos senso es com um sis ema de ês elé odos há a o es impo an es
a e em con a quando se escolhe o pad ão, especialmen e a azão en e a á ea do
20
Capí ulo 2
Técnicas
elé odo auxilia e a do elé odo de abalho. É en e o elé odo de abalho e o elé odo
auxilia que exis e passagem de co en e elé ica, sendo impo an e que a á ea do
elé odo auxilia seja supe io à do elé odo de abalho. Tal impede o bloqueio da
supe ície do elé odo, a pola ização e a e en ual passi ação esul an e da o mação
de uma camada p o e o a sob e a supe ície do elé odo, de ido à co en e aplicada
[38, 39]. Na igu a 5A, ap esen ada an e io men e, é possí el obse a um senso com
um sis ema de ês elé odos. Na Tabela 4 são ap esen adas dimensões de di e en es
SPEs de algumas ma cas come ciais.
Tabela 4 – Dimensões de di e en es biossenso es imp essos, po ma ca [4, 41, 42].
Ma ca
Ø ET (mm)
Á ea ER (mm)
Rácio en e
á eas (EA/ ET)
Bio Logic
2
0,5 x 1
4/1
D opSens
4
– a)
– a)
Gwen
2
– a)
– a)
a) In o mação não disponibilizada pelo ab ican e.
Nos exemplos que se encon am na Tabela 4 apenas o o necedo Bio Logic
disponibiliza a azão en e a á ea do elé odo auxilia e a á ea do elé odo de abalho,
sendo a á ea do elé odo auxilia qua o ezes supe io à á ea do elé odo de abalho.
2.1.5. Funcionalização de Elé odos
Exis em di e sos mé odos de imobilização de subs âncias químicas ou
biológicas na supe ície do elé odo de abalho. O obje i o é, no caso das subs âncias
biológicas, consegui es abelece uma ligação en e, po exemplo, a enzima e a
supe ície do ansdu o sem bloquea o cen o a i o da enzima ou al e a a sua
con o mação, o que pode á le a a uma pe da da sua a i idade biológica. Alguns
des es mé odos, indicados na Figu a 12, o am melho ados ao longo do empo pa a
minimiza as al e ações con o macionais da molécula imobilizada.
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Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
21
Figu a 12 – Mé odos de uncionalização de elé odos imp essos biológicos.
No caso da enzima deposi ada di e amen e sob e o senso , es a de e á e
uma ele ada elocidade máxima de eação (VM), o que oco e quando as enzimas
es ão sa u adas, e baixos alo es da cons an e de Michaelis-Men en (KM), que é
equi alen e à concen ação de subs a o necessá io pa a a ingi me ade da elocidade
máxima da eação e que indica a a inidade da enzima pelo subs a o [2]. Quan o
meno o o alo de KM maio é a a inidade da enzima ao subs a o, a ingindo-se com
maio acilidade me ade do alo da elocidade máxima de eação.
O ipo mais comum de deposição, em solução, consis e numa deposição
sequencial de camadas de ma e iais que i ão cons i ui o elé odo de abalho. A
camada do componen e biológico do senso é deposi ada sob e uma camada já
o mada an e io men e que po adso ção ísica, ele opolime alização, imobilização
po c oss linking ou ap isionamen o, como se pode obse a na Figu a 13 [43].
Mé odos de
Funcionalização
do Componen e
Biológico
Deposição po
solução em
mul icamada
Adso ção
C oss Linking
Ap isionamen o Ele opolime alização
Deposição po
in a/pas as
Mul icamada
Único passo
Figu a 13 – Mé odos de imobilização do elemen o de econhecimen o biológico no elé odo imp esso,
aquando da p epa ação de um biossenso [43].
Elé odo imp esso
Biomoléculas
Ma iz (ex. gel,
políme o, pas a
ou in a)
Reagen e de
C oss Linking
P ocesso de
Imobilização
Adso ção
C oss Linking
Ap isionamen o
28
Capí ulo 2
Técnicas
Figu a 17 – E ei o do aumen o da elocidade de a imen o.
–
Reação e e sí el, meno es elocidades de
a imen o.
----
Reação i e e sí el, maio es elocidades de a imen o [5].
Pa a sis emas quasi- e e sí eis e i ica-se que [47],
 |ip| aumen a com 12
⁄, mas não p opo cionalmen e;
 Ep,c a ia in e samen e com o aumen o de ;
 ∆Ep é supe io a 59/n mV, aumen ando p opo cionalmen e com o alo de ;
 Se αc= αa= 0,5, |ip,a/ip,c|=1.
2.2.1.b. C onoampe ome ia
O es udo da a iação da espos a da co en e com o empo denomina-se
c onoampe ome ia, cons i uindo um dos mé odos ele oanalí icos mais u ilizados [5].
A c onoampe ome ia é mui o u ilizada no es udo de senso es, de ido à sua
simplicidade, sendo uma écnica que pe mi e ixa um po encial de in e esse
ca ac e ís ico do anali o, minimizando o uído de undo que pode á a e a o limi e de
de eção. Na Figu a 18 encon a-se um exemplo de um c onoampe og ama, um g á ico
da in ensidade de co en e ao longo do empo.

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Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
29
Figu a 18 – a – Pe il do po encial aplicado ao longo do empo. b – Va iação da in ensidade da co en e ao longo do
empo, c onoampe og ama.
Na c onoampe ome ia a a iação de co en e de ida a um de e minado
p ocesso a adaico pode se desc i a a a és da equação de Co ell [48],
i =nFAD0
1
2 c0
π1
2 1
2
(9)
em que i é in ensidade de co en e, n é o núme o de moles do anali o, F é a cons an e
de Fa aday, A a á ea do elé odo de abalho, D o coe icien e de di usão, c a
concen ação da espécie oxidada e o empo. Sabendo o núme o de moles, pode-se
aplica a equação 9 pa a de e mina o coe icien e de di usão.
2.2.2. Técnicas de Ca ac e ização Elé ica
2.2.2.a. Resis ência de olha
A esis ência elé ica é a capacidade que um ma e ial condu o em de se opo
à co en e elé ica, sendo ep esen ada po [49],
R = ρl
A (10)
em que ρ é a esis i idade, uma cons an e dependen e da na u eza do ma e ial
condu o , l o comp imen o do ma e ial e A a á ea ans e sal desse mesmo ma e ial
[49].
Em ge al, o mé odo de duas pon as é usado pa a medi a esis ência de um
ma e ial [50]. A pa i des a écnica é possí el de e mina a esis ência de olha (Rs) de
uma amos a. A esis ência de olha é uma p op iedade u ilizada em amos as com a
mesma espessu a ao longo de odo o seu comp imen o, sendo mui o u ilizada na
ca ac e ização de ilmes. Vis o a esis ência se um alo dependen e da á ea
30
Capí ulo 2
Técnicas
ans e sal e do comp imen o da amos a, é possí el de e mina a esis ência de olha
u ilizando-se amos as em que a la gu a é igual ao comp imen o, endo-se [50],
Rs = ρ
𝜏 (11)
2.2.2.b. Pe ilome ia
É possí el u iliza a écnica de pe ilome ia pa a quan i ica a espessu a e
ugosidade de di e sos ma e iais, sendo u ilizado um equipamen o chamado
pe ilóme o, que pe mi e analisa a opog a ia da supe ície de uma amos a sólida.
A a és da análise da supe ície, es a écnica pe mi e de e mina o alo da espessu a
e, ob e alo es da ugosidade da supe ície da amos a e pe is dessa mesma
supe ície [51].
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31
3. Execução Expe imen al
Nes e capí ulo se á ei a uma b e e desc ição dos p ocedimen os
expe imen ais da imp essão e ca ac e ização do elé odo de abalho imp esso e do
sis ema de ês elé odos imp essos an es e após as modi icações com CoPC e AOX.
3.1. Sol en es e Reagen es
As in as u ilizadas na imp essão dos senso es o am ob idas come cialmen e e
usadas al como ecebidas, com exceção da in a à base de ca bono, que no ab ico
de senso es modi icados, oi mis u ada com alocianina de cobal o(II), CoPC (Al a
Aesa ). Pa a além da in a à base de ca bono o am usadas in as come ciais à base
de p a a e de p a a/clo e o de p a a.
Pa a ca ac e ização dos senso es com e sem modi icação oi u ilizada uma
sonda ele oquímica, hexaciano e a o(III) de po ássio (Me ck, pa a análise). Em odos
os es udos, a sonda ele oquímica oi u ilizada numa concen ação de 2,5 mM
hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4.
Após a p imei a modi icação, com CoPC, ealiza am-se es udos ele oquímicos
com pe óxido de hid ogénio (Ald ich, 33%) e ampão os a o (Pan eac, os a o
dipo ássio e os a o monopo ássio). Na segunda modi icação do elé odo de abalho
oi usada a enzima álcool oxidase (Sigma, solução aquosa amponada) solubilizada
em 0,1 M PBS pH=7,4, pa a de eção de e anol (Aga, 99,5%).
3.2. Imp essão de senso es
Todo o p ocesso de imp essão oi ealizado eco endo-se à écnica de
se ig a ia, u ilizando uma máquina de se ig a ia RP 2.2., da Roku P in . Inicialmen e,
an es de se inicia a imp essão, oi necessá io alinha , manualmen e, o quad o que
con ém os pad ões pa a a imp essão do senso . Em odas as imp essões, ajus a am-
se os seguin es pa âme os: p essão da acle e no quad o, elocidade da acle e e
dis ância da ela ao subs a o du an e a imp essão (snap o ).
O quad o u ilizado ao longo des e abalho inha uma ela de poliés e , endo
uma mesh de 68 cm-1 e ios de 55 µm. Du an e a imp essão a inclinação da acle e em
elação à ela oi de 25º, e o snap o , ou seja, o espaço en e a ela e o subs a o,
inha alo es comp eendidos en e os 3 - 5 cm.
Usou-se in a à base de ca bono pa a a imp essão do elé odo de abalho e do
elé odo auxilia , in a à base de p a a pa a os con ac os sob os elé odos e in a à
base de p a a/clo e o de p a a pa a o elé odo de e e ência.
32
Capí ulo 3
Execução Expe imen al
En e cada camada, os senso es so e am uma cu a é mica du an e 15
minu os a 130 ºC. No capí ulo 4 se á desc i o com maio de alhe o p ocesso de ab ico
dos senso es.
3.3. Ca ac e ização do Elé odo de T abalho
O elé odo de abalho oi ca ac e izado ele icamen e, de e minando-se a sua
esis ência de olha, e elec oquimicamen e, po ol ame ia cíclica e
c onoampe ome ia. Também se eco eu à écnica de pe ilome ia pa a de e mina a
a iação da espessu a e ugosidade das amos as.
3.3.1. Ca ac e ização Elé ica pelo Mé odo de Duas Pon as
Fo am ealizados es udos elé icos pa a de e minação da a iação da
esis ência de olha com a a iação do núme o de camadas de in a à base de ca bono
que cons i uíam o elé odo de abalho, pelo mé odo de duas pon as, medindo-se a
in ensidade de co en e elé ica pa a as dis in as di e enças de po encial aplicadas.
Nes e es udo oi u ilizado um pico ampe íme o/ on e de ensão Kei hley 6487.
3.3.2. Pe ilome ia
Fo am imp essos ilmes de ca bono, com di e en es espessu as, em lâminas
de id o, cuja supe ície plana e ígida acili ou a de e minação da espessu a e
ugosidade dos ilmes po pe ilome ia.
Foi usado um pe ilome o Alpha-S ep® D-100, de modo a de e mina as
a iações na supe ície opog á ica dos ilmes. O a imen o ealizado pela agulha do
pe ilome o oi desde a supe ície lisa (do id o) a é ce ca de me ade da supe ície
imp essa do elé odo de abalho, endo sido ambém de e minada a ugosidade dos
ilmes.
3.3.3. Ca ac e ização Ele oquímica
Na ca ac e ização ele oquímica, po ol ame ia cíclica e c onoampe ome ia,
u ilizou-se um po enciós a o, modelo Au olab PGSTAT 302N, da Me ohm.
Realiza am-se dois p é- a amen os ele oquímicos dis in os, nos quais o am
usadas soluções de 0,1 M ampão os a o pH=7,4 (PBS) e de 0,2 M ácido sul ú ico
(H2SO4). No p é- a amen o com PBS aplicou-se uma di e ença de po encial de 1,5 V
du an e 60 s [1]. Quando se u ilizou H2SO4, p ocedeu-se a um a imen o de po encial
du an e dois ciclos comple os, com po enciais en e os 0,9-1,5 V e uma elocidade de
a imen o de 100 mV.s-1 [52]. Ve i icou-se que o p é- a amen o com PBS e a mais
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
33
e icaz, endo es e sido aplicado p e iamen e a odos os senso es imp essos sal o
indicação em con á io.
Nos es udos ele oquímicos com elé odos come ciais oi u ilizado um elé odo
de ca bono í eo (BASi, 3 mm Ø), um elé odo de e e ência Ag/AgCl (Me ohm) e um
elé odo auxilia de aço 316. A composição dos elé odos imp essos encon a-se
desc i a na secção 3.2.
Du an e o es udo po ol ame ia cíclica, o in e alo de a imen o nos senso es
não modi icados oi de -1,0 V a 1,0 V e no caso dos senso es modi icados oi
ipicamen e de -0,2 V a 1,0 V. A elocidade de a imen o oi de 10 mV, exce o
indicação em con á io, como po exemplo nos es udos ciné icos.
Du an e os es udos c onoampe omé icos, em que se u ilizou o mé odo da
adição pad ão, oi aplicado um po encial de 0,3 V ao elé odo, sendo usada uma
solução de 0,1 M PBS pH=7,4. Du an e os es udos, com os senso es imp essos, da
de eção de H2O2, o am adicionadas sucessi as alíquo as de 10 µL de 4,85 mM de
H2O2 à solução de PBS. Pa a a de eção de e anol, e na p esença da enzima AOX,
o am adicionadas sucessi as alíquo as de 10 µL de e anol 99,5% (o que equi ale a
uma concen ação de 17 M) à solução de PBS.
3.4. Modi icação do Elé odo de T abalho com CoPC
Foi adicionada CoPC à in a à base de ca bono, numa p opo ção de 5% m/m.
Es a mis u a oi homogeneizada eco endo a um almo a iz, u ilizando-se de seguida a
in a pa a a imp essão de senso es.
U ilizou-se in a à base de ca bono modi icado com CoPC pa a a imp essão do
elé odo de abalho, in a à base de ca bono não modi icado pa a a imp essão do
elé odo auxilia , in a à base de p a a pa a os con ac os sob os elé odos e in a à
base de p a a/clo e o de p a a pa a o elé odo de e e ência.
3.5. Modi icação do Elé odo de T abalho com AOX
Fo am u ilizadas ês abo dagens dis in as pa a a modi icação do elé odo de
abalho com AOX. Na p imei a abo dagem apenas se ealizou a deposição po go a
de uma solução de enzima no elé odo de abalho, na segunda abo dagem, usou-se
uma memb ana de ni ocelulose (Me ck, 0,45 µm, 13 mm Ø) sob e a camada de
enzima, e na úl ima abo dagem oi usada uma solução de ága -ága pa a e es i a
camada de enzima. Segue-se uma desc ição de alhada de cada abo dagem, sendo o
p ocedimen o inicial comum.

34
Capí ulo 3
Execução Expe imen al
Após a imp essão dos senso es, e espe i o p é- a amen o com 0,1 M PBS
pH=7,4, oi deposi ada uma go a com 5 µL de solução de AOX na supe ície do
elé odo. Agua dou-se ce ca de 4 ho as a é o sol en e da solução de enzima e apo a
comple amen e, obse ando-se a o mação de uma película anspa en e e b ilhan e à
supe ície do elé odo de abalho.
No caso da u ilização de uma memb ana de ni ocelulose (Me ck, 0,45 µm, 13
mm Ø), colocou-se a memb ana du an e algum empo numa solução de 0,1 M PBS
pH=7,4 e seguidamen e colocou-se essa memb ana sob e o senso , p o egendo oda
a supe ície do mesmo. Reco eu-se a um ilme plás ico adesi o, al como obse ado
na Figu a 19, pa a ixa a memb ana sob e a supe ície do senso .
Na úl ima abo dagem, p epa ou-se uma solução de ága -ága com 0,1 g de
ága -ága e 10 mL de água, a qual oi aquecida a é ao pon o de ebulição, deixando-se
a solução em agi ação a é o ága -ága se dissol e o almen e. Seguidamen e
coloca am-se algumas go as dessa solução sob e a supe ície do elé odo de abalho
onde an e io men e se ha ia colocado a solução com AOX, deixando-se geli ica .
Figu a 19 – Fo og a ia do senso imp esso após e sido colocada uma memb ana de ni ocelulose sob e o senso e
seguidamen e um ilme plás ico adesi o.
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
35
4. Imp essão de senso es
4.1. Design
Pa a o senso imp esso oi necessá io desenha ês pad ões dis in os pa a a
ela de se ig a ia, eco endo ao p og ama Co elD aw X6. Cada pad ão co esponde a
uma di e en e camada e/ou in a que oi u ilizada du an e a imp essão.
Reco endo às in o mações disponibilizadas po ab ican es de senso es
ele oquímicos imp essos, ap esen adas na Tabela 4, e sabendo que o p incipal
pa âme o a conside a é a azão en e a á ea do elé odo auxilia e a do elé odo de
abalho (secção 2.1.4), o am desenhados di e en es pad ões a pa i do pad ão
p incipal, ambém es e desenhado e ep esen ado na Figu a 20.
Figu a 20 – Desenho écnico do senso e espe i as medidas em milíme os.
Pa a cada uma das in as u ilizadas oi c iado um pad ão di e en e. Um dos
pad ões, que se ia imp esso po in a à base de p a a, oi u ilizado pa a a imp essão
de pis as condu o as sob os elé odos, sendo o esponsá el pelo aumen o da
condu i idade. Ou o dos pad ões oi u ilizado na imp essão do elé odo de e e ência,
u ilizando in a à base de Ag/AgCl. O úl imo pad ão oi u ilizado na imp essão dos
elé odos de abalho e auxilia , eco endo a in a à base de ca bono. O senso inal
e ia ês pad ões, ap esen ados na Figu a 21.
No caso do p esen e abalho, a azão da á ea do elé odo auxilia e do
elé odo de abalho é 1,26:1. Tal como e e ido no capí ulo 2.1.4., o alo da á ea do
elé odo auxilia em que se supe io à do elé odo de abalho.
36
Capí ulo 4
Imp essão de Senso es
Figu a 21 – Design dos pad ões que compõem o senso . P a eado – Con ac os em que se u iliza in a à base de p a a.
La anja – Elé odo de e e ência em que se u iliza in a à base de Ag/AgCl. P e o – Elé odo de abalho e auxilia em
que se u iliza in a à base de ca bono.
Es es pad ões o am imp essos uns sob e os ou os, com a posição ela i a e
o dem esquema izadas na Figu a 22.
Figu a 22 – Design do senso após a sob eposição dos di e en es pad ões, u ilizando uma in a di e en e po pad ão.
4.2. Cons i uição dos senso es imp essos
Tal como e e ido an e io men e, oi necessá io ealiza di e en es imp essões,
pad ão a pad ão, pa a ob e o senso inal. Pa a além disso, dependendo do es udo
que se p e endia ealiza , a in a u ilizada pa a os elé odos de abalho e auxilia oi
in a à base de ca bono come cial, sem modi icação, ou in a à base de ca bono
mis u ada com o complexo de cobal o u ilizado ao longo des e abalho, CoPC, al
como indicado na Tabela 5.
Tabela 5 – Cons i uição dos senso es imp essos.
Con ac os
Elé odo de
T abalho
Elé odo
Auxilia
Elé odo de
Re e ência
Senso não
Modi icado
P a a
Ca bono
Ca bono
Ag/AgCl
Senso
Modi icado
P a a
Ca bono modi icado
com CoPC (5% m/m)
Ca bono
Ag/AgCl
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
37
Os senso es não modi icados o am u ilizados essencialmen e pa a a
o imização do senso . Os senso es modi icados com CoPC e iam como obje i o a
de eção de pe óxido de hid ogénio ou, mais a de, a de eção de e anol, eco endo-se
à enzima AOX.
4.3. Implemen ação da Técnica
Du an e odo o p oje o oi u ilizada a écnica de se ig a ia pa a imp essão dos
senso es desen ol idos e es udados, endo sido necessá io implemen a um no o
mé odo pa a melho amen o desse p ocesso, nomeadamen e, a ní el de alinhamen o.
Um dos g andes p oblemas du an e o alinhamen o da ela, onde se encon am
os pad ões dos senso es, é que ao longo do empo es a acaba po se de o ma ,
le ando a que os pad ões não es ejam semp e na mesma posição, o que di icul a o
seu alinhamen o. Dessa o ma, op ou-se po alinha o quad o de cada ez que se inha
que muda de pad ão e/ou in a.
Após se p ocede ao alinhamen o de um dos pad ões, e a colado à mesa de
imp essão um molde em PET onde se pode iam encaixa as amos as de subs a o, o
que pe mi ia que o pad ão osse imp esso semp e na mesma posição sob e as
di e en es amos as de subs a o, al como ap esen ado na Figu a 23.
Figu a 23 – P ocesso de alinhamen o e imp essão dos senso es, pela écnica de se ig a ia. A – Pad ão escolhido. B –
Encaixe das amos as. C – Fo og a ia an es de imp essão. D – Fo og a ia após imp essão. E – Senso imp esso com
ci cui o de p a a.
Es e mé odo de alinhamen o pe mi iu que se izessem di e sas imp essões no
mesmo senso , pa a aumen a o núme o de camadas de de e minado elé odo,
man endo um alinhamen o sa is a ó io.
A
B
C
D
44
Capí ulo 5
O imização e Ca ac e ização do Elé odo de T abalho
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
E ( s Ag/AgCl) / V
i / A
G á ico 4 – Vol amog ama ob ido com elé odo de ca bono imp esso sem e es imen o, com picos ep esen a i os de
me ais. E1 = 0,11 V. E2 = -0,29 V. Solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4.
Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1.
O ol amog ama ep esen ado no G á ico 4 ap esen a um pico anódico e um
pico ca ódico, ambos ípicos de um p ocesso de oxidação- edução de um me al [54],
apesa de o sis ema de ês elé odos es a me gulhado numa solução de
hexaciano e a o(III) de po ássio. Uma das possí eis azões pa a o apa ecimen o
des es picos se ia a oxidação da p a a, p o enien e da imp essão do pad ão condu o ,
de ido ao seu con ac o com a solução du an e a ol ame ia cíclica.
Pos e io men e o am ei os es es com o mesmo elé odo mas des a ez com a
supe ície condu o a de p a a cobe a po um ilme plás ico adesi o, como ap esen ado
na Figu a 27, pa a impedi o con ac o da solução com a supe ície de p a a. O
esul ado ob ido pode se e i icado no G á ico 5.
Figu a 27 – Elé odo de abalho imp esso com e es imen o.
E2
E1

FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
45
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
-20
-15
-10
-5
0
5
10
E ( s Ag/AgCl) / V
i / A
G á ico 5 - Vol amog ama ob ido com elé odo de ca bono imp esso com e es imen o. E1 = 0,82 V. E2 = -0,70 V.
Solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1.
Ao aze es a al e ação deixou-se de obse a os picos ípicos do p ocesso de
oxidação- edução da p a a, sendo possí el obse a os picos e e en es ao p ocesso
edox da sonda ele oquímica de hexaciano e a o(III) de po ássio.
A pa i des es esul ados oi possí el a i ma que, de o ma a ga an i que a
p a a não in e i a com os ensaios ealizados, é necessá io a exis ência de uma
camada de e es imen o sob e o senso , pa a p o ege a camada condu o a de p a a
que é imp essa sob os elé odos.
5.3. Va iação da Espessu a do Elé odo de T abalho
Ao analisa os esul ados, e sabendo que uma das des an agens da in a de
ca bono é e uma ele ada esis ência de olha que, de aco do com a equação 11, é
in e samen e p opo cional à espessu a do elé odo de abalho do senso , ize am-se
di e sos senso es não apenas com uma, mas com duas, ês e qua o camadas de
ca bono no elé odo de abalho. Fo am ei os es es de ca ac e ização ele oquímica e
elé ica a esses di e en es senso es, a im de e i ica se o sinal ele oquímico
melho a a com o aumen o do núme o de camadas. Também oi analisada a
espessu a e ugosidade da supe ície do elé odo de abalho, eco endo à écnica de
pe ilome ia.
E2
E1
46
Capí ulo 5
O imização e Ca ac e ização do Elé odo de T abalho
5.3.1. Ca ac e ização Ele oquímica
Fo am u ilizados qua o senso es di e en es, que inham á ias espessu as, ou
seja, di e en e núme o de camadas de in a à base de ca bono. U ilizando uma
solução de 2,5 mM de sonda ele oquímica a pH=7,4, o am ob idos os esul ados
ap esen ados no G á ico 6.
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
E ( s Ag/AgCl) / V
i / mA.cm-2
1 camada de ca bono
2 camadas de ca bono
3 camadas de ca bono
4 camadas de ca bono
Ca bono Vi eo
G á ico 6 – Vol amog amas ob idos com a iação do núme o de camadas, de in a à base de ca bono, do elé odo de
abalho imp esso e elé odo de ca bono í eo come cial. Solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1
M PBS pH=7,4. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1.
Os es es ele oquímicos pe mi i am e i ica que, à medida que se aumen a a
o núme o de camadas, o pico anódico desloca a-se pa a po enciais menos posi i os e
o pico ca ódico pa a po enciais menos nega i os, ou seja, o elé odo de abalho de
ca bono com uma maio espessu a ap esen a uma maio e e sibilidade ele oquímica
do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo.
Es e esul ado pe mi iu conclui que o compo amen o do sis ema melho ou
com o aumen o do núme o de camadas. Assim sendo, odos os es udos u u os o am
ei os com senso es com qua o camadas de in a à base de ca bono. Apesa des a
melho ia, os alo es de in ensidade de co en e ob idos com o senso de ês elé odos
imp essos são in e io es compa a i amen e aos alo es ob idos com o sis ema de ês
elé odos não imp essos e come ciais, em que o elé odo de abalho é de ca bono
í eo.
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
47
5.3.2. Ca ac e ização Elé ica
Seguidamen e mediu-se a espessu a das amos as, u ilizando a écnica de
pe ilome ia (secção 3.3.2), endo-se ob ido os esul ados ap esen ados no G á ico 7.
G á ico 7 – Aumen o da espessu a do elé odo de abalho imp esso em unção do núme o de camadas imp essas.
Pelo G á ico 7 oi possí el con i ma -se que a espessu a do ilme aumen a
linea men e com o aumen o do núme o de camadas.
De seguida, oi de e minada a esis ência de olha, u ilizando a écnica de duas
pon as (secção 3.3.1) e, es abelecida a elação dos seus alo es com a a iação da
espessu a das amos as, ob endo-se os esul ados ap esen ados no G á ico 8.
G á ico 8 – Aumen o da esis ência de olha do elé odo de abalho imp esso em unção do in e so da espessu a.
y = (10±1)x - (4±3)
R² = 0,98
0
10
20
30
40
012345
𝜏/ µm
Núme o de Camadas
y = (712±46)x -(1±4)
R² = 0,99
0
20
40
60
80
100
120
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16
Rs/Ω.sq-1
𝜏-1 / µm-1
48
Capí ulo 5
O imização e Ca ac e ização do Elé odo de T abalho
Como se pode obse a no G á ico 8, e i icou-se que a esis ência de olha
a ia linea men e com o in e so da espessu a, ou seja, quando maio a espessu a do
elé odo de abalho meno é o alo da esis ência de olha.
Ao obse a es es esul ados, pode-se coloca a hipó ese de o melho amen o
do sinal ele oquímico, com o aumen o da espessu a do senso , es a elacionado com
a co esponden e diminuição da esis ência de olha, de aco do com a equação 11.
U ilizando a écnica de pe ilome ia, oi ambém analisada a a iação da
opog a ia da supe ície do elé odo, a ugosidade, à medida que se aumen a a o
núme o de camadas do elé odo de abalho, endo-se ob ido os esul ados
ap esen ados no G á ico 9.
G á ico 9 – Va iação da ugosidade do elé odo de abalho imp esso em unção do núme o de camadas imp essas.
Tal es udo oi ealizado po que, quando maio é a ugosidade, maio é a á ea
a i a do senso , o que no caso dos senso es ele oquímicos pode á se uma an agem
(secção 2.1.4), que endo-se e i ica se o aumen o da espessu a le a a a um
aumen o ou diminuição da ugosidade, ou se não es a ia elacionado com es e
pa âme o. Pelo G á ico 9 pode-se a i ma que exis e uma elação de linea idade en e
o aumen o da espessu a do elé odo de abalho e o aumen o da ugosidade.
Após a análise des es esul ados, concluiu-se que exis em dois pa âme os que
pode ão se a causa pa a a melho ia da espos a ele oquímica do senso com o
aumen o da espessu a, nomeadamen e a diminuição da esis ência de olha e o
aumen o da ugosidade.
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
49
5.4. Sis emas de T ês Elé odos Imp essos
Após os es es com o elé odo de e e ência e auxilia come ciais e o elé odo
de abalho imp esso, o am ei os es es com sis emas de ês elé odos imp essos,
ap esen ando-se na Figu a 28 um exemplo. Fo am es udados di e sos senso es com
qua o camadas de in a à base de ca bono no elé odo de abalho e auxilia e apenas
uma camada de in a à base de Ag/AgCl no elé odo de e e ência. Es es senso es
o am e es idos po um ilme plás ico adesi o, de o ma a impedi a oxidação da in a
condu o a de p a a.
Figu a 28 – Sis ema de ês elé odos imp essos.
5.4.1. P é- a amen o
Com o obje i o de ob e um melho compo amen o ele oquímico, o am ei os
es es com senso es imp essos que inham sido subme idos aos p é- a amen os
e e idos na secção 5.1, an o com H2SO4 como com PBS. Os esul ados encon am-
se ap esen ados no G á ico 10.

50
Capí ulo 5
O imização e Ca ac e ização do Elé odo de T abalho
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
i / A
E ( s Ag/AgCl) / V
G á ico 10 – Vol amog amas ob idos com sis ema de ês elé odos imp essos an es e após p é- a amen o. Solução de
2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1.
–
An es do
p é- a amen o.
–
Após p é- a amen o com 0,2 M H2SO4.
–
Após p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4.
Após a análise dos picos anódicos e ca ódicos ap esen ados no G á ico 10, é
possí el e i ica que o senso sem ipo algum de p é- a amen o é o que em o pio
compo amen o ele oquímico. O compo amen o ele oquímico do sis ema, ao e e ua -
se o p é- a amen o com H2SO4, melho a, an o nos alo es de po encial, endo um
compo amen o mais e e sí el, como nos alo es de co en e, endo uma maio
sensibilidade. Ao e e ua o p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4 o sinal
ele oquímico melho a ainda mais. Sendo a eação es udada a mesma pa a os
di e en es senso es (an es e após o p é- a amen o), pode-se conclui que a
e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo do senso
aumen a após o senso se subme ido a um p é- a amen o, especialmen e no caso do
p é- a amen o com PBS.
Pa a obse a o compo amen o dos ol amog amas ob idos pelos senso es
desen ol idos, an es e após os p é- a amen os com H2SO4 e PBS, e compa á-los
com o ol amog ama de um sis ema em que o elé odo de abalho é um elé odo de
ca bono í eo come cial, é ap esen ado o G á ico 11 e a Tabela 7.
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
51
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
-200
-100
0
100
200
i / A.cm-2
E ( s Ag/AgCl) / V
G á ico 11 – Vol amog amas ob idos com sis ema de ês elé odos imp essos an es e após p é- a amen o. Solução de
2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1.
–
An es do
p é- a amen o.
–
Após p é- a amen o com 0,2 M H2SO4.
–
Após p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4.
–
Ca bono í eo.
Tabela 7 – Valo es de co en e ob idos pa a os picos anódico (ip,a) e ca ódico (ip,c) e espe i os alo es de po encial,
e e en es ao G á ico 11.
Ep,a / V
Ep,c / V
ip,a / µA
ip,c / µA
An es do p é- a amen o
0,63
-0,73
15,06
-19,30
Após p é- a amen o
(0,2 M H2SO4)
0,49
-0,23
20,47
-23,40
Após p é- a amen o
(0,1 M PBS)
0,24
0,08
38,56
-40,37
Ca bono Ví eo
0,35
0,12
230,55
-233,48
Pela Tabela 7 é possí el e i ica que o sis ema com um elé odo de abalho
imp esso, após o p é- a amen o com PBS, ap esen a um compo amen o simila ao
sis ema com um elé odo de ca bono í eo come cial, ela i amen e aos seus alo es
de po encial, apesa de e uma meno in ensidade de co en e. Tendo-se e i icado
52
Capí ulo 5
O imização e Ca ac e ização do Elé odo de T abalho
que o compo amen o ele oquímico após o p é- a amen o com PBS aumen a a a
e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo, oi ealizado um
es udo mais ap o undado, pa a con i mação dos esul ados ob idos. Es e es udo
baseou-se na epe ibilidade do sis ema após o p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4.
Nos senso es imp essos é mui o impo an e ga an i a epe ibilidade da
espos a, pa a que os esul ados não a iem de senso pa a senso . Fo am assim
u ilizados ês senso es di e en es que inham sido subme idos ao p é- a amen o com
PBS, a im de e i ica se os esul ados e am epe í eis, endo-se ob ido os
ol amog amas ap esen ados no G á ico 12 e cujos alo es de co en e e de po encial
de pico anódico e ca ódico se encon am na Tabela 8.
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
E ( s Ag/AgCl) / V
i / A
G á ico 12 - Vol amog amas ob idos com solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4
po ês senso es di e en es. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1.
Tabela 8 – Valo es de co en e ob idos pa a os picos anódico (ip,a) e ca ódico (ip,c) e espe i os alo es de po encial,
e e en es ao G á ico 12.
Senso 1
Senso 2
Senso 3
Ep,a / V
0,20
0,23
0,24
Ep,c / V
0,05
0,08
0,08
∆Ep/ V
0,15
0,15
0,16
ip,a / µA
33,88
35,05
38,56
ip,c / µA
-34,06
-36,40
-40,37
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
53
A pa i des es esul ados podemos e i ica que a média do alo de co en e
do pico anódico é 36±2 µA e a do pico ca ódico é 37±3 µA. A média do alo de
po encial do pico anódico é 0,22±0,02 V e do pico ca ódico 0,07±0,02 V, sendo a
média do alo da di e ença de po encial (∆Ep) 0,15±0,01 V.
Reco endo à Tabela 7 e ao alo médio de ∆Ep ob ido após os es udos
explo a ó ios de epe ibilidade do senso imp esso, sabe-se que o alo de di e ença
de po encial do elé odo come cial de ca bono í eo é 230 mV, sendo o alo médio
de ∆Ep do elé odo à base de ca bono imp esso de 150±10 mV. Tal pode á se
indica i o de que e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo
de abalho imp esso é supe io à do elé odo de abalho come cial de ca bono í eo.
Também é possí el compa a o alo ob ido com os alo es ap esen ados po Mo in
e al. [1]. Es e g upo desen ol eu di e sos senso es imp essos e o melho alo de
∆Ep ob ido oi 264 mV, um alo supe io ao ob ido pa a os senso es desen ol idos ao
longo desde abalho.
Po es es esul ados oi possí el con i ma que a e e sibilidade do p ocesso
edox da sonda à supe ície do elé odo é supe io após a aplicação do p é- a amen o
com 0,1 M PBS pH=7,4. Tal como e e ido an e io men e, es es p é- a amen os êm
como obje i o a emoção, da supe ície do senso , de di e sas subs âncias que
pode iam se i de in e e en es e diminui o sinal ele oquímico [1]. Também pode ão
le a a um aumen o da ugosidade da supe ície do elé odo de abalho, exis indo um
aumen o da á ea a i a do elé odo [53]. Podemos con i ma que es es p é- a amen os,
essencialmen e o p é- a amen o com PBS, aumen am a e e sibilidade do p ocesso
edox da sonda à supe ície do elé odo de abalho com qua o camadas de in a à
base de ca bono.
Foi ainda ei o o es udo mic oscópico da supe ície do senso , an es e após a
modi icação com 0,1 M PBS pH=7,4, endo-se ob ido os esul ados ap esen ados na
Figu a 29.
60
Capí ulo 6
Modi icação do Elé odo de T abalho
-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0
-60
-40
-20
0
20
40
E ( s Ag/AgCl) / V
i / A
G á ico 17 – Vol amog amas ob idos em solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4.
Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1. - - - - Sis ema de ês elé odos imp essos an es de se subme ido ao p é-
a amen o
–
Sis ema de ês elé odos imp essos após p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4.
Pa a acili a a compa ação en e os di e en es ol amog amas, os alo es de
co en e e po encial dos picos anódico e ca ódico, o am sin e izados na Tabela 9.
Tabela 9 – Valo es de co en e ob idos pa a os picos anódico (ip,a) e ca ódico (ip,c) e espe i os alo es de po encial,
e e en es ao G á ico 17.
Ep,a / V
Ep,c / V
ip,a / µA
ip,c / µA
An es do p é- a amen o
0,34
-0,15
26,65
-28,76
Após p é- a amen o
(0,1 M PBS)
0,17
-0,01
33,91
-55,37
Ca bono Ví eo
0,35
0,12
230,6
-233,5
Tendo sido e i icado um aumen o da e e sibilidade do p ocesso edox da
sonda à supe ície do elé odo de abalho modi icado após o p é- a amen o, al como
no senso não modi icado, o am ei os es udos explo a ó ios de epe ibilidade com os
senso es modi icados. Nes e es udo u ilizou-se uma sonda ele oquímica de
hexaciano e a o(III) de po ássio e eco eu-se a ês senso es di e en es, a im de
e i ica se após a modi icação da in a, com CoPC e espe i o p é- a amen o,
exis i iam a iações nos alo es de co en e e po encial dos picos anódico e ca ódico
dos di e en es senso es. Os esul ados encon am-se ap esen ados no G á ico 18.

FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
61
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
E ( s Ag/AgCl) / V
i / A
G á ico 18 – Vol amog amas ob idos em solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4
po ês senso es di e en es. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1.
Analisando o G á ico 18, é possí el e i ica uma a iação dos alo es de
co en e dos picos anódico e ca ódico, embo a os espe i os alo es de po encial
sejam idên icos pa a os ês senso es. Na Tabela 10 são ap esen ados os alo es
e e en es aos ol amog amas ob idos.
Tabela 10 – Valo es de co en e ob idos pa a os picos anódico (ip,a) e ca ódico (ip,c) e espe i os alo es de po encial,
e e en es ao G á ico 18.
Senso 1
Senso 2
Senso 3
Ep,a / V
0,17
0,20
0,20
Ep,c / V
-0,01
-0,01
-0,02
∆Ep/ V
0,18
0,21
0,22
ip,a / µA
33,91
30,61
23,17
ip,c / µA
-55,37
-43,00
-35,60
A pa i des es esul ados podemos a i ma que a média do alo de co en e
do pico anódico é 29±6 µA e a do pico ca ódico, em alo absolu o, 45±10 µA. Os
alo es comp o am que o senso modi icado não em uma epe ibilidade ão ele ada
compa a i amen e aos senso es não modi icados, o que p o a elmen e es á
elacionado com o ac o de a mis u a de CoPC não se o almen e uni o me.
P o a elmen e exis e uma meno quan idade de CoPC, pa a se oxidada
ele oquimicamen e, em alguns senso es compa a i amen e com ou os. Se exis i
menos CoPC a in ensidade do sinal pode á se meno . Es e p oblema pode ia se
62
Capí ulo 6
Modi icação do Elé odo de T abalho
ul apassado es udando-se no os mé odos de mis u a de ambos os compos os, como
po exemplo mis u a a alocianina de cobal o(II) du an e a o mulação da p óp ia in a
e não à in a come cial, já o almen e o mulada.
As médias dos alo es de po encial dos picos anódico e ca ódico são,
espe i amen e, 0,19±0,02 V e -0,013±0,006 V. Apesa de g andes a iações no alo
médio de co en e dos picos, os alo es de po encial dos picos são semelhan es,
sendo a média de ∆Ep de 0,20±0,02 V.
Sabendo que pa a os senso es sem modi icação a ∆Ep do p ocesso edox da
sonda é de 150±10 mV e que pa a o senso modi icado es e alo é de 203±20 mV,
podemos a i ma que os sis emas com es es elé odos de abalho, modi icado e não
modi icado, êm um compo amen o semelhan e, ap esen ando uma maio
e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do espe i o elé odo do que o
elé odo de abalho come cial, que em um alo de ∆Ep de 230 mV.
Tal como nos esul ados ap esen ados na secção 5.4.1 pa a o senso não
modi icado, o elé odo de abalho modi icado ambém ap esen a uma maio
e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo após a aplicação
do p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4, podendo exis i a emoção, da supe ície
do senso , de di e sas subs âncias que pode iam se in e e en es e diminui o sinal
ele oquímico [1], e um possí el aumen o da ugosidade da supe ície [53]. Es e p é-
a amen o aumen ou a e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do
elé odo de abalho imp esso com in a à base de ca bono, modi icada com CoPC, no
elé odo de abalho.
Foi ambém ei o um es udo da supe ície do elé odo po mic oscopia ó ica,
cujas imagens se encon am na Figu a 30.
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
63
Po es e es udo é possí el a i ma , al como as imagens de mic oscopia ó ica
do senso não modi icado, que após o p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4, a
supe ície des e senso apa en a uma maio uni o midade, o que possi elmen e é um
indica i o da diminuição do núme o de impu ezas à supe ície do senso [1].
Tal como no senso não modi icado, p o a elmen e os pon os b ancos
ep esen am as impu ezas, que desapa ecem quase na o alidade nas igu as 29C e
29D. Na Figu a 30, as p o á eis impu ezas encon am-se isualmen e mais
condensadas e em meno quan idade compa a i amen e com a Figu a 29 (secção
5.4.1, imagens mic oscópicas da supe ície do elé odo de abalho não modi icado).
Apesa dessas impu ezas exis i em em meno quan idade na Figu a 30,
compa a i amen e com as impu ezas das imagens mic oscópicas da Figu a 29,
exis em com um maio diâme o, o que pode á se de ido ao p ocesso de mis u a da
in a. Pa a mis u a a alocianina de cobal o(II) com a in a u ilizou-se um almo a iz,
que possi elmen e le a a a uma coesão das impu ezas exis en es. Ou a hipó ese é
não es a mos pe an e apenas impu ezas, mas o que es amos a obse a se em
pa ículas de CoPC.
6.1.2. Es udo da Es abilidade
Tal como no senso não modi icado, o am ei os es udos de es abilidade em
que se a e iu quan os ensaios se ia possí el ealiza com o mesmo senso , se não
hou esse al e ações na supe ície dos elé odos du an e esse ensaio (como po
Figu a 30 – Imagens ob idas po mic oscopia ó ica do elé odo de abalho do senso imp esso. A e
B – An es do p é- a amen o. C e D – Após p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4.
A
C
B
D
64
Capí ulo 6
Modi icação do Elé odo de T abalho
exemplo a o mação de no as camadas sob e a supe ície do elé odo). Tal como na
secção 5.4.2, o am ealizados qua o conjun os de es es. Em cada um desses es es
inham-se ob ido 100 ol amog amas e os úl imos ol amog amas de cada um desses
conjun os o am compa ados en e si, al como se obse a no G á ico 19.
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-40
-20
0
20
40
E ( s Ag/AgCl) / V
i / A
G á ico 19 – Vol amog amas ep esen a i os de cada conjun o de 100 a imen os, cada co co esponde a um desses
ol amog amas. 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4 po ês senso es di e en es.
Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1.
Es e es e, consis iu em qua o conjun os de ensaios, ei os no mesmo dia e,
obse ando o G á ico 19, pode-se a i ma que o senso modi icado de e ou o sinal da
sonda pelo menos 400 ezes, não exis indo a iações signi ica i as nos alo es de
po encial e de co en e ao longo des es ensaios.
Po im, pa a e i ica a es abilidade des e ipo de senso es, o am ei os es es
com o mesmo senso , modi icado com CoPC, ao longo de um mês. Inicialmen e es e
senso oi sujei o ao p é- a amen o com PBS e oi ei o de imedia o o seu
ol amog ama, após o a amen o. De seguida o am ei os mais ês ol amog amas,
com uma semana de in e alo en e cada lei u a, es ando os esul ados ob idos
ep esen ados no G á ico 20.
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
65
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-60
-40
-20
0
20
40
E ( s Ag/AgCl) / V
i / A
G á ico 20 – Vol amog amas ob idos com in e alo de uma semana u ilizando o mesmo senso , que o a subme ido a
um p é- a amen o apenas uma ez. Solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4.
Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1.
–
P imei a Semana.
–
Segunda Semana.
–
Te cei a Semana.
–
Qua a Semana.
Pela obse ação do G á ico 20, é possí el conclui que, ao longo das qua o
semanas, apesa de os alo es de po encial anódico e ca ódico não a ia em mui o, o
mesmo não acon ece com a in ensidade de co en e. No p imei o ensaio,
compa a i amen e com os es an es, é isí el uma maio in ensidade de co en e que
diminui pa a ce ca de me ade do seu alo inicial nas semanas seguin es. Apesa
des a diminuição da p imei a pa a a segunda semana, ao longo das es an es
semanas de es udo, o alo de co en e apa en a es abiliza . Tal pode á es a
elacionado com a limpeza do elé odo. No p imei o ensaio o elé odo inha acabado
de se “limpo” ao eco e ao p é- a amen o. O mesmo não ha ia acon ecido du an es
as es an es semanas, em que apenas se coloca a o elé odo em solução, sem p é-
a amen o algum ei o no momen o, de o ma a e i ica se o p imei o p é- a amen o,
ei o p e iamen e à p imei a u ilização do senso , se ia es á el ao longo de um ele ado
pe íodo de empo.
6.1.3. Es udo Ciné ico
Pa a os senso es modi icados com CoPC oi ambém ealizado um es udo
ciné ico, al como na secção 5.4.3, cujos ol amog amas se obse am no G á ico 21.

66
Capí ulo 6
Modi icação do Elé odo de T abalho
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-250
-200
-150
-100
-50
0
50
100
150
200
i / A.cm2
= 2 V.s-1
= 1 V.s-1
= 0,5 V.s-1
= 0,2 V.s-1
= 0,1 V.s-1
= 0,05 V.s-1
= 0,04 V.s-1
= 0,03 V.s-1
= 0,02 V.s-1
= 0,01 V.s-1
E ( s Ag/AgCl) / V
G á ico 21 – Vol amog amas ob idos no es udo ciné ico da solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1
M PBS pH=7,4 a di e en es elocidades de a imen o.
Ao analisa es e g á ico, é possí el a i ma que um aumen o da elocidade de
a imen o le a a um aumen o da in ensidade de co en e e a um deslocamen o linea
do po encial anódico e ca ódico pa a alo es mais posi i os e mais nega i os,
espe i amen e, ap esen ado o mesmo compo amen o que no senso não modi icado.
Pa a p ocede a uma melho análise da espos a do senso pe an e a a iação
da elocidade de a imen o, oi es udada a a iação dos alo es de co en e de pico
em unção da a iação da aiz quad ada da elocidade de a imen o al como
ap esen ado no G á ico 22.
0,0 0,5 1,0 1,5
-200
-100
0
100
200
1/2 / V.s-1
i / A
G á ico 22 – Va iação do alo de co en e de pico em unção da aiz quad ada da elocidade de a imen o. Solução
2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. ■ Pico anódico. × Pico ca ódico.
FCUP
Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
67
Pode-se obse a que, al como no caso do senso não modi icado, a co en e
de pico anódica desloca-se pa a alo es mais posi i os com o aumen o da elocidade
de a imen o e a co en e de pico ca ódico desloca-se pa a alo es mais nega i os
com o aumen o da elocidade de a imen o apesa de não se uma elação
p opo cional, o que co esponde ao compo amen o desc i o po uma eação quasi-
e e sí el [42].
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
/ V.s-1
E ( s Ag/AgCl) / V
G á ico 23 – Va iação dos alo es de po encial dos picos anódico e ca ódico em unção da elocidade de a imen o.
Solução 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. ■ Pico anódico. × Pico ca ódico.
Es e g á ico ap esen a um compo amen o mui o semelhan e ao G á ico 16, ou
seja, a a iação do po encial depende da elocidade de a imen o da eação. Os
alo es de po encial de pico anódico deslocam-se pa a alo es mais posi i os à
medida que se aumen a a elocidade de a imen o e os alo es de po encial de pico
ca ódico deslocam-se pa a alo es mais nega i os, indica i o de que a e e sibilidade
do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo aumen a à medida que se diminui
a elocidade de a imen o.
6.1.4. De eção de H2O2
O obje i o da modi icação da in a à base de ca bono com CoPC se ia o na
possí el a de eção de H2O2 pelo senso imp esso. Is o po que a ciné ica da eação do
pe óxido de hid ogénio é mui o len a, sendo necessá io aplica uma sob e ensão pa a
oco e . Assim, uma opção é a u ilização de mediado es de ele ões al como CoPC. O
H2O2 em solução le a à edução de CoPC, sendo Co(I) um dos p odu os da eação. O
68
Capí ulo 6
Modi icação do Elé odo de T abalho
compos o ob ido é eoxidado elec oquimicamen e, sendo possí el ob e um sinal
ele oquímico, o sinal de in e esse.
Pa a con i ma que o senso , com o elé odo de abalho imp esso com in a à
base de ca bono mis u ada com CoPC, es a a a de e a o H2O2 o am ei os es udos
ele oquímicos com senso es modi icados e não modi icados, analisando a sua
espos a ele oquímica numa solução com H2O2, al como ap esen ado no G á ico 24.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
30
60
90
120
150
180
210
240
E ( s Ag/AgCl) / V
i / A
G á ico 24 – De eção de 0,88 mM H2O2 em 0,1 M PBS pH=7,4.
–
Senso não modi icado em 0,88 mM H2O2 em
0,1 M PBS pH=7,4. …… Senso modi icado em 0,1 M PBS pH=7,4. - - - - - Senso modi icado com CoPC, em 0,88 mM
H2O2 em 0,1 M PBS pH=7,4,com pico anódico a 0,50 V. Velocidade de a imen o = 0,1 V.s-1.
Es e g á ico mos a que an es da modi icação da in a, não é possí el obse a
um sinal ele oquímico bem de inido. Mas após essa modi icação há a de eção de um
pico ele oquímico, esul an e da oxidação ele oquímica de CoPC a um po encial de
0,50 V. Es e esul ado comp o a que a CoPC é um bom mediado edox da eacção
de oxidação do pe óxido de hid ogénio, mediando a ans e ência de ele ões en e o
senso e o anali o.
Tal como e e ido an e io men e, os senso es ele oquímicos são
maio i a iamen e senso es c onoampe omé icos (secção 2.2.1.b), ou seja, são
u ilizados pa a analisa a in ensidade de co en e em unção da concen ação de H2O2.
O obje i o é que a in ensidade do sinal ele oquímico seja di e amen e p opo cional à
concen ação de anali o p esen e na solução, sendo pa a isso necessá io que o
senso enha uma espos a linea a adições sucessi as de H2O2. Dessa o ma, o am
ei os es udos c onoampe omé icos com um dos senso es modi icados
desen ol idos, al como ap esen ado no G á ico 25.
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Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos
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0100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
i / A
/ s
G á ico 25 – Sinal ampe omé ico do senso após sucessi as adições pad ão de H2O2 (10 µL de 4,85 mM) a 30 mL de
0,1 M PBS pH=7,4. Po encial aplicado de 0,3 V s Ag/AgCl.
Em es udos simila es desc i os po M. Bouj i a e al. [24], o po encial
ele oquímico aplicado oi de 400 mV, mas ao ealiza -se o es udo com esse po encial,
e i icou-se um o e decaimen o da in ensidade de co en e ao longo empo, pelo que
o am es ados ou os po enciais, sendo os melho es esul ados aqueles ob idos pa a
300 mV.
Seguidamen e oi açado o g á ico do alo da in ensidade de co en e em
unção da concen ação da H2O2, ap esen ado no G á ico 26.
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
i / A
Concen açao H2O2 / mM
G á ico 26 – Cu a de calib ação do sinal ampe omé ico do senso após sucessi as adições pad ão de H2O2 (10 µL de
4,85 mM) a 30 mL de 0,1 M PBS pH=7,4. Po encial Aplicado de 0,3 V s Ag/AgCl.
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