Desenvolvimento e Otimização de Sensores Eletroquímicos Impressos

Vanessa Mon ês Mes ado em Química Depa amen o de Química e Bioquímica 2015 O ien ado M. João So omayo , FCUP O ien ado es de Es ágio Joana Dinis Fonseca, CeNTI José Poças Gonçal es, CeNTI Desen ol imen o e O imização de Senso es Ele oquímicos Imp essos Todas as co eções de e minadas pelo jú i, e só essas, o am e e uadas. O P esiden e do Jú i, Po o, ______/______/_________ i Ag adecimen os A ealização des a ese de Mes ado apenas oi possí el g aças à ajuda de di e sas pessoas e ins i uições, às quais gos a ia de deixa as minhas pala as de ag adecimen o: Ao Depa amen o de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Uni e sidade do Po o, po me e acei e como es udan e de Mes ado, pe mi indo-me a ealização da ese de Mes ado em ambien e emp esa ial. Ao CeNTI, Cen o de Nano ecnologia e Ma e iais Técnicos, Funcionais e In eligen es, po me e acei ado e possibili ado a ealização des e abalho de in es igação e desen ol imen o, colocando odos os meios necessá ios à minha disposição. À Dou o a Joana Fonseca e ao Dou o José Gonçal es, meus o ien ado es no CeNTI, po odo o apoio, o ien ação, dedicação e empo dispensados a ajuda -me du an e odo o p esen e abalho. Ob igada po odo o apoio nas discussões de esul ados e possí eis “ ol as a da ”. À P o esso a Dou o a M. João So omayo , pela ajuda imp escindí el du an e as di e sas ap esen ações e abalhos esc i os. Aos meus colegas es agiá ios po odo o apoio du an e es e úl imo ano, an o em o ma de longas discussões de esul ados ob idos, como de g andes ga galhadas que se iam pa a le an a os ânimos. Especialmen e ao Roman K upa, pelas longas discussões de ísica e po me e auxiliado du an e a u ilização de di e en es equipamen os de ca ac e ização elé ica, ajudando-me na análise dos seus esul ados. A odos os uncioná ios do CeNTI, que me ize am sen i em casa e que es a am semp e p on os a ajuda no que e a necessá io. Ao Rod igo Coelho, po e es ado semp e ao meu lado a apoia -me e p on o a ou i as minhas inúme as e in e miná eis eo ias du an e o desen ol imen o do abalho. Aos meus pais e i mãos um g ande ob igada po odo o apoio e sac i ícios ei os, po odas as longas con e sas e po oda a ajuda. iii Resumo Es e abalho e e como p incipal obje i o o desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos não modi icados e modi icados, pa a de eção de pe óxido de hid ogénio e de e anol. Os senso es ele oquímicos são conhecidos pela sua ele ada sensibilidade e sele i idade pa a di e sos anali os, não sendo necessá io a u ilização de ele ados olumes de amos a pa a a ealização das análises. Po sua ez os senso es imp essos ge almen e êm um baixo cus o de p odução associado, e essa p odução pode ealiza -se em massa. Nes e abalho p ocedeu-se à imp essão dos senso es es udados u ilizando-se a écnica de se ig a ia (sc een p in ing). Após a imp essão, ealiza am-se es udos de ca ac e ização ele oquímica e elé ica do elé odo de abalho, es udando-se o p ocesso de oxidação- edução de uma sonda ele oquímica (K3[Fe(CN)6]) à supe ície do elé odo e de e minando-se a esis ência de olha. Adicionalmen e ambém se de e minou a espessu a e a ugosidade dos elé odos po pe ilome ia. Com o obje i o de se ob e um aumen o da e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo, o am ei os es udos de o imização do senso . No p imei o es udo in es igou-se como o núme o de camadas de ca bono no elé odo de ca bono a e a o compo amen o ele oquímico, a esis ência de olha e a ugosidade do p óp io elé odo. No segundo es udo, in es igou-se qual a in luência de p é- a amen os ele oquímicos, com soluções de H2SO4, e PBS no compo amen o ele oquímico do elé odo de abalho. Após a o imização do elé odo de abalho, p ocedeu-se à modi icação da supe ície desse elé odo com alocianina de cobal o (CoPC), um mediado de ele ões que pe mi e a de eção do sinal ele oquímico de H2O2. Foi ambém obje i o do p esen e abalho a imobilização, sob e o elé odo de abalho do senso , da enzima álcool oxidase, uma enzima que ca alisa a eação de álcoois p imá ios com oxigénio, sendo um dos p odu os H2O2. Com es a modi icação p e endia-se ob e senso es pa a a de eção de e anol, senso es com uma as a aplicação indus ial nomeadamen e na moni o ização dos p ocessos de e men ação de bebidas alcoólicas e de p odução de e anol pa a biocombus í eis. A imobilização ealizou-se po deposição po go a, endo-se es ado ês abo dagens dis in as. Com uma memb ana de ni ocelulose, com uma camada de ága -ága e sem memb ana de ni ocelulose e/ou camada de ága -ága . Apenas os senso es com a camada de ága - ága sob e a go a de álcool oxidase ap esen a am sensibilidade ao e anol, no en an o, es a oi mui o baixa. i Pala as-cha e Senso es ele oquímicos imp essos, Biossenso es, Se ig a ia, F alocianina de cobal o(II), E anol, Álcool oxidase, Hexaciano e a o(III) de po ássio. Abs ac The main aim o his wo k is he de elopmen and op imiza ion o an elec ochemical p in ed senso , wi hou o wi h modi ica ion, o de ec hyd ogen pe oxide and e hanol. Elec ochemical senso s a e known o hei high sensi i i y and selec i i y o di e en analy es and hey don’ necessa ily need high olume samples. Gene ally p in ed senso s ha e low p oduc ion cos and a e easily adap ed o mass p oduc ion. The s udied senso s we e p in ed by he sc een p in ing echnique. A e wa ds, he wo king elec ode was elec ochemically and elec ically cha ac e ized in o de o e alua e i s elec ochemical beha io , using an elec ochemical p obe (K3[Fe(CN)6]), and o de e mine i s shee esis ance. Addi ionally, he hickness and oughness o he elec ode we e also e alua ed, by su ace p o ilome y. Fo an inc ease o he e e sibili y o he edox p ocess a he wo king elec ode su ace, op imiza ion s udies we e pe o med. In he i s s udy he numbe o ca bon laye s, and i s e ec on he elec ochemical beha io , he shee esis ance and he oughness o he elec ode, we e analyzed. In he second s udy, he in luence o wo di e en p e- ea men s, one wi h H2SO4 and he o he wi h PBS, on he elec ochemical beha io o he elec ode we e in es iga ed. A e he wo king elec ode op imiza ion, an elec ode su ace modi ica ion was ca ied ou , wi h cobal phalocyanine (CoPC), an elec on media o which allows he de ec ion o he elec ochemical signal o H2O2. The modi ied senso showed a linea elec ochemical esponse wi h he H2O2 concen a ion. In he p esen wo k we wan ed o immobilize, on o he wo king elec ode o he senso , he enzyme alcohol oxidase, which ca alyzes he eac ion o he p ima y alcohols wi h hyd ogen, one o he p oduc s o H2O2 eac ion (an elec ochemical species wi h high oxida ion po en ial). Wi h his modi ica ion i was in ended o ob ain a senso , o he de ec ion o e hanol, wi h a wide ange o indus ial applica ions, like he moni o iza ion o he alcohol e men a ion and he p oduc ion o e hanol o bio uels. The immobiliza ion was ca ied ou by d op deposi ion, and h ee di e en app oaches we e es ed: wi h a ni ocellulose memb ane, wi h an aga memb ane and wi hou a ni ocellulose memb ane and/o an aga memb ane. Only he senso wi h he aga memb ane on o he alcohol oxidase d op showed sensibili y o e hanol, howe e , i was eally small. xiii Índice de G á icos G á ico 1 – Pe ilome ia e e en e ao alinhamen o do elé odo de abalho com sob eposição de qua o camadas ............................................................................... 38 G á ico 2 – Resul ado do es e inicial do senso de ês elé odos imp essos ............. 41 G á ico 3 – Vol amog amas após p é- a amen o ........................................................ 42 G á ico 4 – Vol amog ama ob ido com elé odo de ca bono imp esso sem e es imen o, com picos ep esen a i os de me ais .................................................... 44 G á ico 5 - Vol amog ama ob ido com elé odo de ca bono imp esso com e es imen o. ............................................................................................................. 45 G á ico 6 – Vol amog amas ob idos com a iação do núme o de camadas, de in a à base de ca bono, do elé odo de abalho imp esso e elé odo de ca bono í eo come cial. ................................................................................................................... 46 G á ico 7 – Aumen o da espessu a do elé odo de abalho imp esso em unção do núme o de camadas imp essas. ................................................................................. 47 G á ico 8 – Aumen o da esis ência de olha do elé odo de abalho imp esso em unção do in e so da espessu a. ................................................................................ 47 G á ico 9 – Va iação da ugosidade do elé odo de abalho imp esso em unção do núme o de camadas imp essas. ............................................................................ 48 G á ico 10 – Vol amog amas ob idos com sis ema de ês elé odos imp essos an es e após p é- a amen o ....................................................................................... 50 G á ico 11 – Vol amog amas ob idos com sis ema de ês elé odos imp essos an es e após p é- a amen o. ...................................................................................... 51 G á ico 12 - Vol amog amas ob idos com solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4 po ês senso es di e en es ................................ 52 G á ico 13 – Vol amog amas ep esen a i os de cada conjun o de 100 a imen os, cada co co esponde a um desses ol amog amas. .................................................. 55 G á ico 14 – Vol amog amas ob idos no es udo ciné ico da solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4 a di e en es elocidades de a imen o. .................................................................................................................. 56 G á ico 15 – Va iação do alo de co en e de pico em unção da aiz quad ada da elocidade de a imen o ............................................................................................ 56 G á ico 16 – Va iação dos alo es de po encial dos picos anódico e ca ódico em unção da elocidade de a imen o ........................................................................... 57 G á ico 17 – Vol amog amas ob idos em solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. ............................................................................ 60 xi G á ico 18 – Vol amog amas ob idos em solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4 po ês senso es di e en es ................................ 61 G á ico 19 – Vol amog amas ep esen a i os de cada conjun o de 100 a imen os, cada co co esponde a um desses ol amog amas. .................................................. 64 G á ico 20 – Vol amog amas ob idos com in e alo de uma semana u ilizando o mesmo senso , que o a subme ido a um p é- a amen o apenas uma ez. ............... 65 G á ico 21 – Vol amog amas ob idos no es udo ciné ico da solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4 a di e en es elocidades de a imen o .............................................................................................................. 66 G á ico 22 – Va iação do alo de co en e de pico em unção da aiz quad ada da elocidade de a imen o ............................................................................................ 66 G á ico 23 – Va iação dos alo es de po encial dos picos anódico e ca ódico em unção da elocidade de a imen o ........................................................................... 67 G á ico 24 – De eção de 0,88 mM H2O2 em 0,1 M PBS pH=7,4.................................. 68 G á ico 25 – Sinal ampe omé ico do senso após sucessi as adições pad ão de H2O2............................................................................................................................ 69 G á ico 26 – Cu a de calib ação do sinal ampe omé ico do senso após sucessi as adições pad ão de H2O2 ........................................................................... 69 G á ico 27 – Cu a de calib ação do sinal ampe omé ico do senso após sucessi as adições pad ão de e anol ......................................................................... 72 x Lis a de Símbolos e Ab e ia u as A - Á ea do elé odo de abalho A - Á ea ans e sal ADH - Álcool desid ogenase AOX - Álcool oxidase c - Concen ação CoPC - F alocianina de cobal o D - Coe icien e de di usão E - Po encial do elé odo de abalho Eϴ - Po encial o mal EA - Elé odo auxilia ER - Elé odo de e e ência ET - Elé odo de abalho Ep,a - Po encial de pico da co en e anódica Ep,c - Po encial de pico da co en e ca ódica e- - Ele ão ∆Ep - Di e ença de po encial en e os picos anódico e ca ódico F - Cons an e de Fa aday i - In ensidade de co en e ic - Co en e capaci i a i - Co en e a adaica ip - In ensidade de co en e de pico ip,a - In ensidade de co en e do pico anódico ip,c - In ensidade de co en e do pico ca ódico KM - Cons an e de Michaelis-Men en l - Comp imen o n - Quan idade de subs ância (anali o) n' - Núme o de ele ões ans e idos no passo limi an e da elocidade NADH - Nico inamida adenina dinucleó ido os a o NAD+ - Nico inamida adenina dinucleó ido [O]∞ - Concen ação inicial da espécie oxidan e em solução PET- Poli e e ala o de e ileno PVC- Policlo e o de poli inilo PBS - Phospha e bu e ed saline (Tampão os a o-salino) Q - Quocien e en e a concen ação das espécies em solução R - Resis ência x i Rs - Resis ência de olha edox - Redução - oxidação R2 - Coe icien e de de e minação R - Cons an e dos gases pe ei os SPE - Sc een p in ed elec ode (elé odo imp esso) SPCE - Sc een p in ed ca bon elec ode (elé odo de ca bono imp esso) [S]o - Concen ação inicial de subs a o T - Tempe a u a - Tempo - Velocidade de a imen o V0 - Velocidade inicial VM - Velocidade máxima αa - Coe icien e de ans e ência de ca ga anódico αc - Coe icien e de ans e ência de ca ga ca ódico ρ - Resis i idade Ø - Diâme o FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 1 1. In odução 1.1. Biossenso es Um biossenso é um senso de de eção química que na sua cons i uição em um componen e de econhecimen o biológico, que é o esponsá el pela biossele i idade, acoplado a um ansdu o , que ans o ma a in o mação ob ida num sinal de in e esse, sendo des a o ma possí el a de eção de um de e minado pa âme o bioquímico [2]. A Figu a 1 ap esen a esquema icamen e os elemen os cons i uin es de um biossenso . O elemen o de econhecimen o biológico pode á se acoplado ao senso po écnicas de uncionalização, como po exemplo adso ção e c oss linking. A á ea dos biossenso es encon a-se em g ande expansão de ido, em pa icula , à sensibilidade ine en e aos mé odos u ilizados (como po exemplo mé odos ele oquímicos) em conjun o com a biossele i idade ca ac e ís ica dos componen es biológicos [2]. Figu a 1 – Esquema de um biossenso com um ansdu o de sinal [2]. Exis em di e sos ipos de biossenso es, podendo a designação a ibuída a cada um depende do ipo de elemen o de econhecimen o biológico (bioca alí ico ou po a inidade) ou do géne o de ansdu o u ilizado ( essonan e, é mico, ó ico, sensí el a iões ou ele oquímico), al como se encon a esquema izado na Figu a 2. Os biossenso es ap esen am ipicamen e dimensões mui o eduzidas, são de ácil u ilização e pe mi em uma análise ápida dos mais a iados anali os. Es a análise pode se con ínua, du an e um longo pe íodo de empo, ou pode se uma análise de espos a ápida, du an e um cu o pe íodo de empo [3]. Dependendo do obje i o pa a o qual é idealizado, o senso pode se desca á el ou eu ilizá el. O acoplamen o de um elemen o de econhecimen o biológico ao ansdu o con e e uma ele ada especi icidade a es e ipo de senso es e o ansdu o pe mi e uma ele ada sensibilidade pa a o anali o. Sendo es es senso es especí icos pa a de e minados compos os, encon am-se o imizados pa a que o seu empo de espos a seja o mais cu o possí el, o que se de e à manipulação da ciné ica das eações que oco em no sis ema [3]. Anali o Elemen o de Reconhecimen o Biológico Sinal P ocessado de Sinal T ansdu o 2 Capí ulo 1 In odução Tipo de Biossenso Elemen o Sensí el T ansdu o Enzimá ico Mic obiológico Imunossenso Quimio ecep o Ele oquímico ímico Ó ico Acús ico Calo imé ico Baseiam-se na de eção de al e ações de p op iedades ó icas esul an es da in e ação en e o anali o e o componen e de econhecimen o biológico (ex. di ação da luz), ou nos alo es de emissão de luz po um p ocesso luminescen e[4][4][4]. O seu p incípio de uncionamen o baseia-se em uma ou mais eações químicas p oduzem ou u ilizam iões e/ou ele ões que pode ão p o oca al e ações nas p op iedades elé icas das amos as. Quando o anali o en a em con ac o com o elemen o de econhecimen o biológico há uma al e ação da massa do sis ema, o que le a a uma al e ação da equência de essonância egis ada pelo ansdu o , sendo essa equência a g andeza medida. Baseiam-se na medição do calo p oduzido ou abso ido du an e a eação en e o anali o e um de e minado elemen o de econhecimen o biológico. O elemen o de econhecimen o biológico é cons i uído po uma enzima, que é imobilizada u ilizando écnicas de uncionalização. Es e elemen o biológico é especí ico e ex emamen e sele i o. Baseiam-se na imobilização de mic o- o ganismos que in e a uam e econhecem a espécie de in e esse. G ande especi icidade no econhecimen o de an igénios de ido aos an ico pos imobilizados na supe ície do elé odo, o mando um complexo es á el. T a a-se de um sis ema que u iliza p o eínas que in e agem com espécies biológicas, ais como ho monas, esul ando em al e ações con o macionais. De aco do com Figu a 2 – Tabela esumo dos di e sos ipos de biossenso es de aco do com o ipo de elemen o de econhecimen o biológico ou do géne o de ansdu o u ilizado [4]. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 3 Apesa das inúme as an agens, os biossenso es ap esen am ambém algumas des an agens. De ido à inco po ação de um agen e biológico no senso , em ge al, a empe a u a de acondicionamen o de e se con olada, já que quando sob eaquecido exis e o isco de desna u ação do agen e biológico acoplado. Dessa o ma, a sua es abilidade é um pa âme o c í ico, exis indo di e sos a o es que pode ão pô-la em causa, ais como o pH, iões em solução e, como já e e ido, a empe a u a [3]. 1.2. Senso es Ele oquímicos Es a é p o a elmen e a maio classe de senso es químicos, sendo u ilizados na de eção das mais di e sas moléculas, mic o-o ganismos, en e ou os. O p incípio ine en e é que uma ou mais eações químicas acabam po p oduzi ou u iliza iões e/ou ele ões que p o ocam al e ações nas p op iedades elé icas das amos as. Es e ipo de senso es di ide-se em ês ca ego ias, os senso es condu imé icos, ampe omé icos e po enciomé icos [4]. Os senso es ele oquímicos condu imé icos baseiam-se em p ocessos químicos que oco em em solução e que le am a uma al e ação da condu i idade iónica das soluções. Em ge al a sensibilidade pa a es a a iá el é mui o baixa [4]. Ou a classe de senso es ele oquímicos são os ampe omé icos em que é medida a in ensidade de co en e após a aplicação de uma di e ença de po encial, que dá o igem à eação química. Es es senso es êm uma g ande sensibilidade pa a amos as biológicas e ge almen e de e am com acilidade espécies ele oa i as p esen es nas amos as [4].Es es senso es ele oquímicos são, po no ma, sis emas ele oquímicos de ês elé odos, como a célula ele oquímica esquema izada na Figu a 3. Es e sis ema de ês elé odos consis e na passagem de co en e de um elé odo de abalho, no qual oco e a eação ele oquímica em es udo, pa a um elé odo auxilia . O elé odo de e e ência é u ilizado como uma e e ência de po encial conhecido e cons an e [5]. Po úl imo, em-se os senso es ele oquímicos po enciomé icos, em que é medida a di e ença de po encial en e um elé odo sensí el ao anali o e o elé odo de e e ência. 4 Capí ulo 1 In odução Figu a 3 – Esquema de um sis ema de ês elé odos e espe i os componen es. Os elé odos dos senso es ele oquímicos podem se imp essos, nomeadamen e po se ig a ia. A es e sis ema chama-se sis ema de elé odos imp essos, SPE (Sc een P in ed Elec ode), e exis em sis emas de dois ou ês elé odos, al como ep esen ado na Figu a 4. Os SPEs com dois elé odos cos umam se u ilizados pa a de eção sem quan i icação. Os SPEs de ês elé odos são, po sua ez, mais e sá eis, pe mi indo a ealização de análises quan i a i as. Po se em sis emas mais complexos, êm associado um maio cus o de ab ico. Figu a 4 – SPEs e espe i os componen es. A) Esquema de um sis ema de ês elé odos. B) Esquema de um sis ema de dois elé odos. A g ande di e ença en e as células ele oquímicas con encionais e os SPEs é que es es úl imos são mais e sá eis, de meno es dimensões e complexidade, al como é possí el obse a na Figu a 5 [3]. Tais ca ac e ís icas pe mi em que os SPEs possam se u ilizados po ope ado es não especializados, não exis indo a necessidade de p epa a a célula ele oquímica, bas ando p ocede à deposição da amos a sob e o elé odo de abalho do senso . Apesa des a acilidade adicional na u ilização de senso es imp essos, as células ele oquímicas con encionais êm a an agem de Elé odo Auxilia Elé odo de Re e ência Elé odo de T abalho Subs a o Con ac os Re es imen o A Elé odo Auxilia Elé odo de T abalho Subs a o Con ac os Re es imen o B FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 5 se em sis emas mais obus os, pe mi indo, a a és do polimen o, limpa o elé odo de abalho de odas as impu ezas que pode ão es a na sua supe ície, o que possibili a que o sis ema enha uma maio du abilidade e es abilidade. Figu a 5 – A – SPE de um sis ema de ês elé odos e espe i os componen es [6]. B – Célula ele oquímica de um sis ema de ês elé odos. Exis em senso es ele oquímicos biológicos, a que se dá o nome de biossenso es ele oquímicos e que podem se classi icados com base no seu elemen o de econhecimen o biológico, denominando-se de senso es bioca alí icos ou senso es po a inidade. A g ande di e ença en e ambos é que, no caso dos senso es bioca alí icos, oco e uma eação en e o anali o e o componen e de econhecimen o biológico, ha endo a o mação de uma no a espécie química, sendo o sinal da no a espécie o que é moni o izado. Já no caso dos senso es po a inidade é a ligação en e o anali o e o componen e biológico que é de e ada. 1.2.1. Senso es Bioca alí icos Nos senso es bioca alí icos são ge almen e usadas enzimas que são acopladas ao elé odo de abalho. Es as êm uma g ande a i idade ca alí ica aliada a uma ele ada especi icidade pa a de e minadas espécies, ca alisando a o mação de p odu os ele oa i os pa a se em de e ados. Es es p odu os são, em ge al, moni o izados di e amen e a a és da écnica de ampe ome ia [2]. Pa a além de senso es bioca alí icos baseados em enzimas, exis em ambém biossenso es em que são inco po ados, no componen e de econhecimen o biológico, mic o-o ganismos i os. Es e ipo de senso não é mui o u ilizado, pois em o p oblema de p ecisa de longos pe íodos de empo pa a ecupe a o almen e após uma análise, ap esen ando longos empos de espos a e pe da de sensibilidade ao Re es imen o Elé odo Auxilia Elé odo T abalho Elé odo de Re e ência Conecção do ET Conecção do EA Conecção do ER A B FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 13 2. Técnicas 2.1. Fab ico de Senso es Ele oquímicos 2.1.1. Técnicas de Imp essão Tal como a designação indica, o ab ico de senso es imp essos inclui pelo menos uma écnica de imp essão. Na á ea dos senso es imp essos, uma das écnicas de imp essão mais u ilizadas é a se ig a ia (sc een p in ing). No en an o, nos úl imos anos êm sido u ilizadas ou as écnicas de imp essão pa a desen ol e di e sos senso es imp essos, ais como a imp essão a ja o de in a, a o og a u a e a lexog a ia. O ecu so a es as ecnologias de imp essão pe mi e a p odução em massa de senso es de o ma simples e ápida, pa a além de pe mi i um baixo cus o de p odução [24, 25]. 2.1.1.a. Se ig a ia A se ig a ia, ou sc een p in ing, é uma écnica mui o e sá il, pe mi indo a imp essão em subs a os planos. É uma écnica económica e que ap esen a, du an e a imp essão, pe das de in a esiduais. As di e enças mais ele an es des a écnica de imp essão ela i amen e a ou as é a possibilidade de imp imi ilmes de ele ada espessu a. A espessu a do ilme imp esso é um pa âme o de ácil ajus e e con olo, que depende essencialmen e da ela u ilizada du an e a imp essão, nomeadamen e do núme o de ios po cen íme o e do diâme o do io u ilizada na ela. Na Figu a 8 encon a-se um esquema do p ocesso de se ig a ia. Figu a 8 – Ilus ação do p ocesso de se ig a ia [27]. Mo imen o Moldu a Tin a Imp essa Tin a Subs a o Tela com emulsão Á ea abe a que con ém in a Racle e 14 Capí ulo 2 Técnicas Nes e p ocesso, o pad ão do senso que se que imp imi encon a-se g a ado numa ela, de nylon ou poliés e e com moldu a de me al ou alumínio, onde é deposi ada a in a pa a a imp essão. Du an e o p ocesso a acle e espalha a in a sob e o pad ão que se encon a na ela e de seguida exe ce uma de e minada p essão, pe mi indo a ans e ência da in a pa a o subs a o [27]. A ela u ilizada na imp essão obedece a duas eg as. A la gu a mínima de linha que pode se imp essa é ês ezes o diâme o do io da ela e a la gu a en e os ios da ela de e e pelo menos ês ezes o amanho de pa ícula da in a/pas a u ilizada du an e a imp essão. Pa a a escolha da ela, pa a além des as duas eg as, de em se conside ados o olume e peso eó ico da in a e a p essão ecomendada que pode se emp egue na ela, ou seja, a p essão necessá ia pa a que a ela es ique o su icien e pa a a in a passa de um lado pa a o ou o da ela sem a dani ica . Pa a além das eg as pa a a escolha da ela, ambém é impo an e sabe quais as unções da acle e du an e a imp essão. Es a em ês unções p incipais: p essiona a ela con a o subs a o du an e a imp essão, ajuda na passagem da in a a a és da ma iz da ela pa a o subs a o e, po úl imo, emo e o excesso de in a da ela após a imp essão. A p essão da acle e sob e a ela é a iá el e, quando maio o a p essão, mais inos são os ilmes imp essos, pois a ela encon a-se mais p óxima do subs a o. Es e equipamen o de e á se lexí el de o ma a molda -se a qualque supe ície, seja ela lisa ou ugosa, exis indo acle es com di e en es g aus de lexibilidade. Pa a além do amanho do diâme o do io da ela se impo an e no con olo da espessu a dos ilmes imp essos, a elocidade da acle e é ou o a o undamen al no con olo da espessu a. Quando maio o a elocidade da acle e du an e a imp essão, maio é a espessu a do pad ão imp esso. A azão é mui o semelhan e à e e ida pa a a a iação da p essão da acle e, ou seja, se a elocidade da acle e o mui o g ande, a ela não é ão p essionada sob e o subs a o, o que le a a que o pad ão imp esso enha uma maio espessu a. Es a espessu a ambém é dependen e do ângulo da acle e, quando maio o o ângulo da acle e ela i amen e à ela, meno é a espessu a do ilme. Ou o a o que ambém in luencia a espessu a do ilme é o snap o da ela, que em uma elação de p opo cionalidade com espessu a do ilme. O snap o é o espaço en e a ela e o subs a o, que de e e amanho su icien e pa a que, logo após a passagem acle e, a ela eg esse à posição inicial, não icando demasiado p óxima do subs a o. Se al acon ece , a ela pode “cola ” no subs a o, dani icando a imp essão e po ezes o p óp io quad o. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 15 A écnica de se ig a ia pode exis i em la bed (imp essão usando quad os planos) e em oll- o- oll ( olo a olo), como ap esen ado na Figu a 9. A u ilização de se ig a ia olo a olo pe mi e imp essões a elocidades supe io es e em maio escala do que a se ig a ia la bed, que em ge al p ocessa-se “ olha a olha”, que é uma e en e da écnica mais u ilizada em in es igação e desen ol imen o. Es a e en e da écnica pe mi e ambém a u ilização de subs a os ígidos, algo que em olo a olo não é possí el. Figu a 9 – Fo og a ias dos apa elhos das écnicas de se ig a ia. A – Folha a olha. B – Rolo a olo. 2.1.1.b. Imp essão a Ja o de Tin a Apesa da écnica de ja o de in a se u ilizada há alguns anos no ab ico de senso es, só a ualmen e se em o nado mais p oeminen e nessa á ea de ido ao seu baixo cus o e po pe mi i a deposição de pequenas quan idades de in a pa a a imp essão. As p incipais an agens são a ele ada esolução da écnica e se uma écnica digi al (a imp essão é ei a di e amen e a pa i do compu ado ) [27]. Es a écnica baseia-se na deposição de pequenas go as de in a num subs a o, com g ande p ecisão e ep odu ibilidade, exis indo pelo menos qua o ipos dis in os de imp essão a ja o de in a: é mica, piezoelé ica, ele os á ica e acús ica. Os mais u ilizados são a imp essão a ja o de in a é mica e a imp essão a ja o de in a piezoelé ica, que se encon am esquema izadas na Figu a 10 [24, 26]. A B 16 Capí ulo 2 Técnicas Figu a 10 – Ilus ação do p ocesso de imp essão a ja o de in a. A – Imp essão piezoelé ica [27]. B – Imp essão é mica [26]. A imp essão a ja o de in a é mica é uma écnica mais simples, não eque endo um con olo ão p eciso da iscosidade da in a, no en an o, caso sejam u ilizados componen es biológicos no senso , es es pode ão desna u a , o que não acon ece com a imp essão a ja o de in a piezoelé ica [26]. Is o po que os biossenso es con êm como elemen o de econhecimen o biológico, po exemplo, enzimas, que pode ão desna u a com o calo , le ando a pe das de g ande pa e, ou mesmo oda, a sua a i idade, o nando o senso in iá el. Exis em senso es de glucose imp essos pela écnica de ja o de in a, em que se e idenciam a sua ep odu ibilidade e baixo cus o [8]. 2.1.1.c. Ro og a u a Na écnica de o og a u a, o pad ão que que emos que seja imp esso encon a-se g a ado num cilind o de imp essão. Ao longo da imp essão, esse pad ão é p eenchido com in a, seguidamen e é e i ado o excesso dessa in a e po im o olo é p essionado con a o subs a o, imp imindo assim os pad ões, al como esquema izado na Figu a 11A [26]. Figu a 11 – Ilus ação de dois p ocessos de olo a olo [26]. A – G a u a. B – Flexog a ia. A B Subs a o Bocal Colapso das bolhas Eje o de in a Fo mação de bolhas Remoção da in a Resis ência é mica Subs a o Go as de in a Di eção da go a Fo necimen o de in a T ansdu o de p essão Dados Ro ação Ro ação A B FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 17 Tipicamen e, a o og a u a é uma écnica com g ande elocidade de imp essão, sendo u ilizada pa a a imp essão de ilmes me álicos, plás icos e a é mesmo no as bancá ias [29]. Também é u ilizada pa a a imp essão de senso es ele oquímicos de di e en es espécies químicas ais como sul e o de cádmio [32, 33]. 2.1.1.d. Flexog a ia Na lexog a ia o p ocesso de imp essão consis e na aplicação de um ilme uni o me de in a sob e o pad ão que e es e o olo de imp essão, al como se encon a ep esen ado na Figu a 11B. Es e olo, com a in a, en a em con ac o com o subs a o, ans e indo o pad ão do olo pa a esse subs a o [26]. A lexog a ia é assim mui o simila à o og a u a. As p incipais di e enças en e as duas écnicas são na p essão exe cida, que é maio na lexog a ia, e na elocidade de imp essão, que é meno na lexog a ia. Po ou o lado, a écnica de o og a u a em um cus o associado supe io à lexog a ia mas o empo de ida do olo dessa écnica de imp essão é ipicamen e mui o supe io [32].A lexog a ia é u ilizada, po exemplo, na imp essão di e a de an ico pos em subs a os lexí eis [33]. 2.1.2. Ma e iais Uma das a iá eis mais impo an es das écnicas de imp essão são as in as escolhidas. A p epa ação e seleção das in as dependem da aplicação u u a do senso imp esso, podendo se in as cu á eis po UV, condu o as, ele oluminescen es, en e ou as. Todas es as in as êm que e ele ada iscosidade, o que depende do ab ican e e do seu uso especí ico, sendo impo an e conhece a lexibilidade/ igidez do subs a o e os empos de cu a ecomendá eis da in a [34]. Os ma e iais que ipicamen e cons i uem as in as se ig á icas são: esina ( ambém e e ida como agen e ligan e), que une as pa ículas da in a e pe mi e a sua ade ência ao subs a o, e sol en es, que se encon am dissol idos na in a e que são ans e idos pa a a supe ície de imp essão. Em alguns casos, na cons i uição da in a exis em ambém adi i os, que al e am as p op iedades ísicas da in a, e pigmen os, esponsá eis pela co da in a e pela sua opacidade [34]. Na Tabela 2 são ap esen adas algumas das p incipais in as usadas no ab ico de senso es ele oquímicos e as suas an agens e des an agens. 18 Capí ulo 2 Técnicas Tabela 2 – Exemplos de algumas das p incipais in as e espe i as an agens e des an agens [32–35]. Ma e iais/ Tin as Van agens Des an agens Ca bono/ G a i e Baixo cus o; ea i idade ele oquímica a a i a; biologicamen e ine e. Possui co en es esiduais; baixa condu i idade. Pla ina Baixa axa de o mação de issu as no pad ão de imp essão após a cu a; adequado pa a o nos de al as empe a u as. Ele adas empe a u as de cu a; ele ado cus o. Ou o Mui o ine e, biologicamen e compa í el. Ele ado cus o. P a a/ Clo e o de P a a Quimicamen e esis en e; ele ada e e sibilidade; ele ada densidade de co en e; ele ada condu i idade; baixas empe a u as de cu a. Baixa du abilidade. P a a Boa condu i idade. Oxidação em con ac o com soluções aquosas ou o a . 2.1.3. Subs a os Os elé odos imp essos consis em em ilmes deposi ados sob e um subs a o ine e. Os subs a os podem di idi -se em duas g andes ca ego ias: (i) subs a os lexí eis, ais como ma e iais polimé icos (como po exemplo PET e PVC) e o papel, e (ii) subs a os ígidos como po exemplo id o e ce âmica [38]. Quando não é necessá io que o subs a o seja lexí el, é p e e í el que a imp essão seja sob e um subs a o ígido, po no ma o id o, que em um meno cus o do que a ce âmica e que pe mi e igualmen e ele adas empe a u as de cu a, endo uma supe ície an o quimicamen e como e micamen e es á el [38]. Apesa de o id o se mui o u ilizado em de imen o do subs a o de ce âmica, es e úl imo pe mi e, em ge al, ob e melho es esul ados, maio sensibilidade e sele i idade [38]. Caso seja possí el, es e acaba semp e po se p e e í el ao id o, mas ambém em um maio cus o associado. Na Tabela 3 encon am-se alguns dos subs a os mais u ilizados e as suas an agens e des an agens. Tabela 3 – Exemplos de alguns dos p incipais subs a os e espe i as an agens e des an agens [36, 37]. Subs a os Van agens Des an agens Ce âmica Pe mi e ele adas empe a u as de cu a; supe ície egula ; impe meá el a água e oxigénio. Não é lexí el; impossibilidade de u ilização nas écnicas olo a olo; cus o ele ado. Vid o Pe mi e ele adas empe a u as de cu a; anspa en e; supe ície egula ; quimicamen e e e micamen e es á el; impe meá el a água e oxigénio. Pode se conside ado um subs a o lexí el se i e uma espessu a <200µm. Impossibilidade de u ilização nas écnicas olo a olo. O id o lexí el é di ícil de u iliza e ex emamen e ágil. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 19 Polimé ico (PET; PVC) T anspa ência; lexibilidade; di e en es gamas de espessu a; ele ada esis ência ao sol en e. De o mação do ma e ial de ido à cu a. Papel Co b anca; g ande compa ibilidade com amos as biológicas; bas an e lexí el; di e en es gamas de espessu a. E ei o indi e o na espessu a do ilme de ido à ele ada abso ância do subs a o. Nes e abalho o am u ilizados subs a os lexí eis, nomeadamen e PET, de ido ao seu baixo cus o e ele ada esis ência ao sol en e e id o pa a a ealização de es es de ca ac e ização po pe ilome ia. Como o PET so e de o mação a ele adas empe a u as de cu a, es e oi sujei o a um p é- a amen o é mico an es de se u ilizado na imp essão. Du an e a imp essão do senso sob e o subs a o, é necessá io e alguns a o es em con a, al como as p op iedades ó icas do ma e ial, pois exis em di e sos senso es ansmissi os que necessi am de subs a os anspa en es e com supe ície plana. A ugosidade é ou o pa âme o impo an e da supe ície, sendo que o seu alo ideal depende mui o do ipo de senso p e endido. Quando nos e e imos a senso es ele oquímicos, um alo ele ado da ugosidade é ele an e, pois le a a um aumen o da á ea a i a do senso , aumen ando a espos a do mesmo [39]. Po sua ez, as p op iedades químicas do subs a o es ão elacionadas com a sua impe meabilidade, a libe ação de e en uais con aminan es e a capacidade de es e se su icien emen e ine e a ní el químico de modo a não so e al e ações ao longo de p ocessos químicos, como po exemplo à uncionalização do elé odo de abalho com subs âncias biológicas [39]. Ge almen e, a cu a de senso es imp essos é é mica, ou seja, é ei a a al as empe a u as, sendo po isso impo an e conhece as p op iedades é micas e e momecânicas dos subs a os. A empe a u a a que se u iliza o senso e a que oco e a cu a de e se compa í el com a empe a u a máxima de u ilização do subs a o, caso con á io é necessá io um p é- a amen o do subs a o em ques ão. 2.1.4. Design A écnica de se ig a ia pe mi e a imp essão de di e sos senso es com as mesmas ca ac e ís icas e com baixo cus o de ab ico. Mas an es de imp imi os senso es e a é mesmo de escolhe o subs a o e as in as a u iliza , é impo an e e de inido o pad ão do senso que se que u iliza . Es e pad ão a ia dependendo da u ilização do senso [24, 25]. No caso dos senso es com um sis ema de ês elé odos há a o es impo an es a e em con a quando se escolhe o pad ão, especialmen e a azão en e a á ea do 20 Capí ulo 2 Técnicas elé odo auxilia e a do elé odo de abalho. É en e o elé odo de abalho e o elé odo auxilia que exis e passagem de co en e elé ica, sendo impo an e que a á ea do elé odo auxilia seja supe io à do elé odo de abalho. Tal impede o bloqueio da supe ície do elé odo, a pola ização e a e en ual passi ação esul an e da o mação de uma camada p o e o a sob e a supe ície do elé odo, de ido à co en e aplicada [38, 39]. Na igu a 5A, ap esen ada an e io men e, é possí el obse a um senso com um sis ema de ês elé odos. Na Tabela 4 são ap esen adas dimensões de di e en es SPEs de algumas ma cas come ciais. Tabela 4 – Dimensões de di e en es biossenso es imp essos, po ma ca [4, 41, 42]. Ma ca Ø ET (mm) Á ea ER (mm) Rácio en e á eas (EA/ ET) Bio Logic 2 0,5 x 1 4/1 D opSens 4 – a) – a) Gwen 2 – a) – a) a) In o mação não disponibilizada pelo ab ican e. Nos exemplos que se encon am na Tabela 4 apenas o o necedo Bio Logic disponibiliza a azão en e a á ea do elé odo auxilia e a á ea do elé odo de abalho, sendo a á ea do elé odo auxilia qua o ezes supe io à á ea do elé odo de abalho. 2.1.5. Funcionalização de Elé odos Exis em di e sos mé odos de imobilização de subs âncias químicas ou biológicas na supe ície do elé odo de abalho. O obje i o é, no caso das subs âncias biológicas, consegui es abelece uma ligação en e, po exemplo, a enzima e a supe ície do ansdu o sem bloquea o cen o a i o da enzima ou al e a a sua con o mação, o que pode á le a a uma pe da da sua a i idade biológica. Alguns des es mé odos, indicados na Figu a 12, o am melho ados ao longo do empo pa a minimiza as al e ações con o macionais da molécula imobilizada. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 21 Figu a 12 – Mé odos de uncionalização de elé odos imp essos biológicos. No caso da enzima deposi ada di e amen e sob e o senso , es a de e á e uma ele ada elocidade máxima de eação (VM), o que oco e quando as enzimas es ão sa u adas, e baixos alo es da cons an e de Michaelis-Men en (KM), que é equi alen e à concen ação de subs a o necessá io pa a a ingi me ade da elocidade máxima da eação e que indica a a inidade da enzima pelo subs a o [2]. Quan o meno o o alo de KM maio é a a inidade da enzima ao subs a o, a ingindo-se com maio acilidade me ade do alo da elocidade máxima de eação. O ipo mais comum de deposição, em solução, consis e numa deposição sequencial de camadas de ma e iais que i ão cons i ui o elé odo de abalho. A camada do componen e biológico do senso é deposi ada sob e uma camada já o mada an e io men e que po adso ção ísica, ele opolime alização, imobilização po c oss linking ou ap isionamen o, como se pode obse a na Figu a 13 [43]. Mé odos de Funcionalização do Componen e Biológico Deposição po solução em mul icamada Adso ção C oss Linking Ap isionamen o Ele opolime alização Deposição po in a/pas as Mul icamada Único passo Figu a 13 – Mé odos de imobilização do elemen o de econhecimen o biológico no elé odo imp esso, aquando da p epa ação de um biossenso [43]. Elé odo imp esso Biomoléculas Ma iz (ex. gel, políme o, pas a ou in a) Reagen e de C oss Linking P ocesso de Imobilização Adso ção C oss Linking Ap isionamen o 28 Capí ulo 2 Técnicas Figu a 17 – E ei o do aumen o da elocidade de a imen o. – Reação e e sí el, meno es elocidades de a imen o. ---- Reação i e e sí el, maio es elocidades de a imen o [5]. Pa a sis emas quasi- e e sí eis e i ica-se que [47],  |ip| aumen a com 12 ⁄, mas não p opo cionalmen e;  Ep,c a ia in e samen e com o aumen o de ;  ∆Ep é supe io a 59/n mV, aumen ando p opo cionalmen e com o alo de ;  Se αc= αa= 0,5, |ip,a/ip,c|=1. 2.2.1.b. C onoampe ome ia O es udo da a iação da espos a da co en e com o empo denomina-se c onoampe ome ia, cons i uindo um dos mé odos ele oanalí icos mais u ilizados [5]. A c onoampe ome ia é mui o u ilizada no es udo de senso es, de ido à sua simplicidade, sendo uma écnica que pe mi e ixa um po encial de in e esse ca ac e ís ico do anali o, minimizando o uído de undo que pode á a e a o limi e de de eção. Na Figu a 18 encon a-se um exemplo de um c onoampe og ama, um g á ico da in ensidade de co en e ao longo do empo. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 29 Figu a 18 – a – Pe il do po encial aplicado ao longo do empo. b – Va iação da in ensidade da co en e ao longo do empo, c onoampe og ama. Na c onoampe ome ia a a iação de co en e de ida a um de e minado p ocesso a adaico pode se desc i a a a és da equação de Co ell [48], i =nFAD0 1 2 c0 π1 2 1 2 (9) em que i é in ensidade de co en e, n é o núme o de moles do anali o, F é a cons an e de Fa aday, A a á ea do elé odo de abalho, D o coe icien e de di usão, c a concen ação da espécie oxidada e o empo. Sabendo o núme o de moles, pode-se aplica a equação 9 pa a de e mina o coe icien e de di usão. 2.2.2. Técnicas de Ca ac e ização Elé ica 2.2.2.a. Resis ência de olha A esis ência elé ica é a capacidade que um ma e ial condu o em de se opo à co en e elé ica, sendo ep esen ada po [49], R = ρl A (10) em que ρ é a esis i idade, uma cons an e dependen e da na u eza do ma e ial condu o , l o comp imen o do ma e ial e A a á ea ans e sal desse mesmo ma e ial [49]. Em ge al, o mé odo de duas pon as é usado pa a medi a esis ência de um ma e ial [50]. A pa i des a écnica é possí el de e mina a esis ência de olha (Rs) de uma amos a. A esis ência de olha é uma p op iedade u ilizada em amos as com a mesma espessu a ao longo de odo o seu comp imen o, sendo mui o u ilizada na ca ac e ização de ilmes. Vis o a esis ência se um alo dependen e da á ea 30 Capí ulo 2 Técnicas ans e sal e do comp imen o da amos a, é possí el de e mina a esis ência de olha u ilizando-se amos as em que a la gu a é igual ao comp imen o, endo-se [50], Rs = ρ 𝜏 (11) 2.2.2.b. Pe ilome ia É possí el u iliza a écnica de pe ilome ia pa a quan i ica a espessu a e ugosidade de di e sos ma e iais, sendo u ilizado um equipamen o chamado pe ilóme o, que pe mi e analisa a opog a ia da supe ície de uma amos a sólida. A a és da análise da supe ície, es a écnica pe mi e de e mina o alo da espessu a e, ob e alo es da ugosidade da supe ície da amos a e pe is dessa mesma supe ície [51]. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 31 3. Execução Expe imen al Nes e capí ulo se á ei a uma b e e desc ição dos p ocedimen os expe imen ais da imp essão e ca ac e ização do elé odo de abalho imp esso e do sis ema de ês elé odos imp essos an es e após as modi icações com CoPC e AOX. 3.1. Sol en es e Reagen es As in as u ilizadas na imp essão dos senso es o am ob idas come cialmen e e usadas al como ecebidas, com exceção da in a à base de ca bono, que no ab ico de senso es modi icados, oi mis u ada com alocianina de cobal o(II), CoPC (Al a Aesa ). Pa a além da in a à base de ca bono o am usadas in as come ciais à base de p a a e de p a a/clo e o de p a a. Pa a ca ac e ização dos senso es com e sem modi icação oi u ilizada uma sonda ele oquímica, hexaciano e a o(III) de po ássio (Me ck, pa a análise). Em odos os es udos, a sonda ele oquímica oi u ilizada numa concen ação de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Após a p imei a modi icação, com CoPC, ealiza am-se es udos ele oquímicos com pe óxido de hid ogénio (Ald ich, 33%) e ampão os a o (Pan eac, os a o dipo ássio e os a o monopo ássio). Na segunda modi icação do elé odo de abalho oi usada a enzima álcool oxidase (Sigma, solução aquosa amponada) solubilizada em 0,1 M PBS pH=7,4, pa a de eção de e anol (Aga, 99,5%). 3.2. Imp essão de senso es Todo o p ocesso de imp essão oi ealizado eco endo-se à écnica de se ig a ia, u ilizando uma máquina de se ig a ia RP 2.2., da Roku P in . Inicialmen e, an es de se inicia a imp essão, oi necessá io alinha , manualmen e, o quad o que con ém os pad ões pa a a imp essão do senso . Em odas as imp essões, ajus a am- se os seguin es pa âme os: p essão da acle e no quad o, elocidade da acle e e dis ância da ela ao subs a o du an e a imp essão (snap o ). O quad o u ilizado ao longo des e abalho inha uma ela de poliés e , endo uma mesh de 68 cm-1 e ios de 55 µm. Du an e a imp essão a inclinação da acle e em elação à ela oi de 25º, e o snap o , ou seja, o espaço en e a ela e o subs a o, inha alo es comp eendidos en e os 3 - 5 cm. Usou-se in a à base de ca bono pa a a imp essão do elé odo de abalho e do elé odo auxilia , in a à base de p a a pa a os con ac os sob os elé odos e in a à base de p a a/clo e o de p a a pa a o elé odo de e e ência. 32 Capí ulo 3 Execução Expe imen al En e cada camada, os senso es so e am uma cu a é mica du an e 15 minu os a 130 ºC. No capí ulo 4 se á desc i o com maio de alhe o p ocesso de ab ico dos senso es. 3.3. Ca ac e ização do Elé odo de T abalho O elé odo de abalho oi ca ac e izado ele icamen e, de e minando-se a sua esis ência de olha, e elec oquimicamen e, po ol ame ia cíclica e c onoampe ome ia. Também se eco eu à écnica de pe ilome ia pa a de e mina a a iação da espessu a e ugosidade das amos as. 3.3.1. Ca ac e ização Elé ica pelo Mé odo de Duas Pon as Fo am ealizados es udos elé icos pa a de e minação da a iação da esis ência de olha com a a iação do núme o de camadas de in a à base de ca bono que cons i uíam o elé odo de abalho, pelo mé odo de duas pon as, medindo-se a in ensidade de co en e elé ica pa a as dis in as di e enças de po encial aplicadas. Nes e es udo oi u ilizado um pico ampe íme o/ on e de ensão Kei hley 6487. 3.3.2. Pe ilome ia Fo am imp essos ilmes de ca bono, com di e en es espessu as, em lâminas de id o, cuja supe ície plana e ígida acili ou a de e minação da espessu a e ugosidade dos ilmes po pe ilome ia. Foi usado um pe ilome o Alpha-S ep® D-100, de modo a de e mina as a iações na supe ície opog á ica dos ilmes. O a imen o ealizado pela agulha do pe ilome o oi desde a supe ície lisa (do id o) a é ce ca de me ade da supe ície imp essa do elé odo de abalho, endo sido ambém de e minada a ugosidade dos ilmes. 3.3.3. Ca ac e ização Ele oquímica Na ca ac e ização ele oquímica, po ol ame ia cíclica e c onoampe ome ia, u ilizou-se um po enciós a o, modelo Au olab PGSTAT 302N, da Me ohm. Realiza am-se dois p é- a amen os ele oquímicos dis in os, nos quais o am usadas soluções de 0,1 M ampão os a o pH=7,4 (PBS) e de 0,2 M ácido sul ú ico (H2SO4). No p é- a amen o com PBS aplicou-se uma di e ença de po encial de 1,5 V du an e 60 s [1]. Quando se u ilizou H2SO4, p ocedeu-se a um a imen o de po encial du an e dois ciclos comple os, com po enciais en e os 0,9-1,5 V e uma elocidade de a imen o de 100 mV.s-1 [52]. Ve i icou-se que o p é- a amen o com PBS e a mais FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 33 e icaz, endo es e sido aplicado p e iamen e a odos os senso es imp essos sal o indicação em con á io. Nos es udos ele oquímicos com elé odos come ciais oi u ilizado um elé odo de ca bono í eo (BASi, 3 mm Ø), um elé odo de e e ência Ag/AgCl (Me ohm) e um elé odo auxilia de aço 316. A composição dos elé odos imp essos encon a-se desc i a na secção 3.2. Du an e o es udo po ol ame ia cíclica, o in e alo de a imen o nos senso es não modi icados oi de -1,0 V a 1,0 V e no caso dos senso es modi icados oi ipicamen e de -0,2 V a 1,0 V. A elocidade de a imen o oi de 10 mV, exce o indicação em con á io, como po exemplo nos es udos ciné icos. Du an e os es udos c onoampe omé icos, em que se u ilizou o mé odo da adição pad ão, oi aplicado um po encial de 0,3 V ao elé odo, sendo usada uma solução de 0,1 M PBS pH=7,4. Du an e os es udos, com os senso es imp essos, da de eção de H2O2, o am adicionadas sucessi as alíquo as de 10 µL de 4,85 mM de H2O2 à solução de PBS. Pa a a de eção de e anol, e na p esença da enzima AOX, o am adicionadas sucessi as alíquo as de 10 µL de e anol 99,5% (o que equi ale a uma concen ação de 17 M) à solução de PBS. 3.4. Modi icação do Elé odo de T abalho com CoPC Foi adicionada CoPC à in a à base de ca bono, numa p opo ção de 5% m/m. Es a mis u a oi homogeneizada eco endo a um almo a iz, u ilizando-se de seguida a in a pa a a imp essão de senso es. U ilizou-se in a à base de ca bono modi icado com CoPC pa a a imp essão do elé odo de abalho, in a à base de ca bono não modi icado pa a a imp essão do elé odo auxilia , in a à base de p a a pa a os con ac os sob os elé odos e in a à base de p a a/clo e o de p a a pa a o elé odo de e e ência. 3.5. Modi icação do Elé odo de T abalho com AOX Fo am u ilizadas ês abo dagens dis in as pa a a modi icação do elé odo de abalho com AOX. Na p imei a abo dagem apenas se ealizou a deposição po go a de uma solução de enzima no elé odo de abalho, na segunda abo dagem, usou-se uma memb ana de ni ocelulose (Me ck, 0,45 µm, 13 mm Ø) sob e a camada de enzima, e na úl ima abo dagem oi usada uma solução de ága -ága pa a e es i a camada de enzima. Segue-se uma desc ição de alhada de cada abo dagem, sendo o p ocedimen o inicial comum. 34 Capí ulo 3 Execução Expe imen al Após a imp essão dos senso es, e espe i o p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4, oi deposi ada uma go a com 5 µL de solução de AOX na supe ície do elé odo. Agua dou-se ce ca de 4 ho as a é o sol en e da solução de enzima e apo a comple amen e, obse ando-se a o mação de uma película anspa en e e b ilhan e à supe ície do elé odo de abalho. No caso da u ilização de uma memb ana de ni ocelulose (Me ck, 0,45 µm, 13 mm Ø), colocou-se a memb ana du an e algum empo numa solução de 0,1 M PBS pH=7,4 e seguidamen e colocou-se essa memb ana sob e o senso , p o egendo oda a supe ície do mesmo. Reco eu-se a um ilme plás ico adesi o, al como obse ado na Figu a 19, pa a ixa a memb ana sob e a supe ície do senso . Na úl ima abo dagem, p epa ou-se uma solução de ága -ága com 0,1 g de ága -ága e 10 mL de água, a qual oi aquecida a é ao pon o de ebulição, deixando-se a solução em agi ação a é o ága -ága se dissol e o almen e. Seguidamen e coloca am-se algumas go as dessa solução sob e a supe ície do elé odo de abalho onde an e io men e se ha ia colocado a solução com AOX, deixando-se geli ica . Figu a 19 – Fo og a ia do senso imp esso após e sido colocada uma memb ana de ni ocelulose sob e o senso e seguidamen e um ilme plás ico adesi o. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 35 4. Imp essão de senso es 4.1. Design Pa a o senso imp esso oi necessá io desenha ês pad ões dis in os pa a a ela de se ig a ia, eco endo ao p og ama Co elD aw X6. Cada pad ão co esponde a uma di e en e camada e/ou in a que oi u ilizada du an e a imp essão. Reco endo às in o mações disponibilizadas po ab ican es de senso es ele oquímicos imp essos, ap esen adas na Tabela 4, e sabendo que o p incipal pa âme o a conside a é a azão en e a á ea do elé odo auxilia e a do elé odo de abalho (secção 2.1.4), o am desenhados di e en es pad ões a pa i do pad ão p incipal, ambém es e desenhado e ep esen ado na Figu a 20. Figu a 20 – Desenho écnico do senso e espe i as medidas em milíme os. Pa a cada uma das in as u ilizadas oi c iado um pad ão di e en e. Um dos pad ões, que se ia imp esso po in a à base de p a a, oi u ilizado pa a a imp essão de pis as condu o as sob os elé odos, sendo o esponsá el pelo aumen o da condu i idade. Ou o dos pad ões oi u ilizado na imp essão do elé odo de e e ência, u ilizando in a à base de Ag/AgCl. O úl imo pad ão oi u ilizado na imp essão dos elé odos de abalho e auxilia , eco endo a in a à base de ca bono. O senso inal e ia ês pad ões, ap esen ados na Figu a 21. No caso do p esen e abalho, a azão da á ea do elé odo auxilia e do elé odo de abalho é 1,26:1. Tal como e e ido no capí ulo 2.1.4., o alo da á ea do elé odo auxilia em que se supe io à do elé odo de abalho. 36 Capí ulo 4 Imp essão de Senso es Figu a 21 – Design dos pad ões que compõem o senso . P a eado – Con ac os em que se u iliza in a à base de p a a. La anja – Elé odo de e e ência em que se u iliza in a à base de Ag/AgCl. P e o – Elé odo de abalho e auxilia em que se u iliza in a à base de ca bono. Es es pad ões o am imp essos uns sob e os ou os, com a posição ela i a e o dem esquema izadas na Figu a 22. Figu a 22 – Design do senso após a sob eposição dos di e en es pad ões, u ilizando uma in a di e en e po pad ão. 4.2. Cons i uição dos senso es imp essos Tal como e e ido an e io men e, oi necessá io ealiza di e en es imp essões, pad ão a pad ão, pa a ob e o senso inal. Pa a além disso, dependendo do es udo que se p e endia ealiza , a in a u ilizada pa a os elé odos de abalho e auxilia oi in a à base de ca bono come cial, sem modi icação, ou in a à base de ca bono mis u ada com o complexo de cobal o u ilizado ao longo des e abalho, CoPC, al como indicado na Tabela 5. Tabela 5 – Cons i uição dos senso es imp essos. Con ac os Elé odo de T abalho Elé odo Auxilia Elé odo de Re e ência Senso não Modi icado P a a Ca bono Ca bono Ag/AgCl Senso Modi icado P a a Ca bono modi icado com CoPC (5% m/m) Ca bono Ag/AgCl FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 37 Os senso es não modi icados o am u ilizados essencialmen e pa a a o imização do senso . Os senso es modi icados com CoPC e iam como obje i o a de eção de pe óxido de hid ogénio ou, mais a de, a de eção de e anol, eco endo-se à enzima AOX. 4.3. Implemen ação da Técnica Du an e odo o p oje o oi u ilizada a écnica de se ig a ia pa a imp essão dos senso es desen ol idos e es udados, endo sido necessá io implemen a um no o mé odo pa a melho amen o desse p ocesso, nomeadamen e, a ní el de alinhamen o. Um dos g andes p oblemas du an e o alinhamen o da ela, onde se encon am os pad ões dos senso es, é que ao longo do empo es a acaba po se de o ma , le ando a que os pad ões não es ejam semp e na mesma posição, o que di icul a o seu alinhamen o. Dessa o ma, op ou-se po alinha o quad o de cada ez que se inha que muda de pad ão e/ou in a. Após se p ocede ao alinhamen o de um dos pad ões, e a colado à mesa de imp essão um molde em PET onde se pode iam encaixa as amos as de subs a o, o que pe mi ia que o pad ão osse imp esso semp e na mesma posição sob e as di e en es amos as de subs a o, al como ap esen ado na Figu a 23. Figu a 23 – P ocesso de alinhamen o e imp essão dos senso es, pela écnica de se ig a ia. A – Pad ão escolhido. B – Encaixe das amos as. C – Fo og a ia an es de imp essão. D – Fo og a ia após imp essão. E – Senso imp esso com ci cui o de p a a. Es e mé odo de alinhamen o pe mi iu que se izessem di e sas imp essões no mesmo senso , pa a aumen a o núme o de camadas de de e minado elé odo, man endo um alinhamen o sa is a ó io. A B C D 44 Capí ulo 5 O imização e Ca ac e ização do Elé odo de T abalho -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 E ( s Ag/AgCl) / V i / A G á ico 4 – Vol amog ama ob ido com elé odo de ca bono imp esso sem e es imen o, com picos ep esen a i os de me ais. E1 = 0,11 V. E2 = -0,29 V. Solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1. O ol amog ama ep esen ado no G á ico 4 ap esen a um pico anódico e um pico ca ódico, ambos ípicos de um p ocesso de oxidação- edução de um me al [54], apesa de o sis ema de ês elé odos es a me gulhado numa solução de hexaciano e a o(III) de po ássio. Uma das possí eis azões pa a o apa ecimen o des es picos se ia a oxidação da p a a, p o enien e da imp essão do pad ão condu o , de ido ao seu con ac o com a solução du an e a ol ame ia cíclica. Pos e io men e o am ei os es es com o mesmo elé odo mas des a ez com a supe ície condu o a de p a a cobe a po um ilme plás ico adesi o, como ap esen ado na Figu a 27, pa a impedi o con ac o da solução com a supe ície de p a a. O esul ado ob ido pode se e i icado no G á ico 5. Figu a 27 – Elé odo de abalho imp esso com e es imen o. E2 E1 FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 45 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -20 -15 -10 -5 0 5 10 E ( s Ag/AgCl) / V i / A G á ico 5 - Vol amog ama ob ido com elé odo de ca bono imp esso com e es imen o. E1 = 0,82 V. E2 = -0,70 V. Solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1. Ao aze es a al e ação deixou-se de obse a os picos ípicos do p ocesso de oxidação- edução da p a a, sendo possí el obse a os picos e e en es ao p ocesso edox da sonda ele oquímica de hexaciano e a o(III) de po ássio. A pa i des es esul ados oi possí el a i ma que, de o ma a ga an i que a p a a não in e i a com os ensaios ealizados, é necessá io a exis ência de uma camada de e es imen o sob e o senso , pa a p o ege a camada condu o a de p a a que é imp essa sob os elé odos. 5.3. Va iação da Espessu a do Elé odo de T abalho Ao analisa os esul ados, e sabendo que uma das des an agens da in a de ca bono é e uma ele ada esis ência de olha que, de aco do com a equação 11, é in e samen e p opo cional à espessu a do elé odo de abalho do senso , ize am-se di e sos senso es não apenas com uma, mas com duas, ês e qua o camadas de ca bono no elé odo de abalho. Fo am ei os es es de ca ac e ização ele oquímica e elé ica a esses di e en es senso es, a im de e i ica se o sinal ele oquímico melho a a com o aumen o do núme o de camadas. Também oi analisada a espessu a e ugosidade da supe ície do elé odo de abalho, eco endo à écnica de pe ilome ia. E2 E1 46 Capí ulo 5 O imização e Ca ac e ização do Elé odo de T abalho 5.3.1. Ca ac e ização Ele oquímica Fo am u ilizados qua o senso es di e en es, que inham á ias espessu as, ou seja, di e en e núme o de camadas de in a à base de ca bono. U ilizando uma solução de 2,5 mM de sonda ele oquímica a pH=7,4, o am ob idos os esul ados ap esen ados no G á ico 6. -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 E ( s Ag/AgCl) / V i / mA.cm-2 1 camada de ca bono 2 camadas de ca bono 3 camadas de ca bono 4 camadas de ca bono Ca bono Vi eo G á ico 6 – Vol amog amas ob idos com a iação do núme o de camadas, de in a à base de ca bono, do elé odo de abalho imp esso e elé odo de ca bono í eo come cial. Solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1. Os es es ele oquímicos pe mi i am e i ica que, à medida que se aumen a a o núme o de camadas, o pico anódico desloca a-se pa a po enciais menos posi i os e o pico ca ódico pa a po enciais menos nega i os, ou seja, o elé odo de abalho de ca bono com uma maio espessu a ap esen a uma maio e e sibilidade ele oquímica do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo. Es e esul ado pe mi iu conclui que o compo amen o do sis ema melho ou com o aumen o do núme o de camadas. Assim sendo, odos os es udos u u os o am ei os com senso es com qua o camadas de in a à base de ca bono. Apesa des a melho ia, os alo es de in ensidade de co en e ob idos com o senso de ês elé odos imp essos são in e io es compa a i amen e aos alo es ob idos com o sis ema de ês elé odos não imp essos e come ciais, em que o elé odo de abalho é de ca bono í eo. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 47 5.3.2. Ca ac e ização Elé ica Seguidamen e mediu-se a espessu a das amos as, u ilizando a écnica de pe ilome ia (secção 3.3.2), endo-se ob ido os esul ados ap esen ados no G á ico 7. G á ico 7 – Aumen o da espessu a do elé odo de abalho imp esso em unção do núme o de camadas imp essas. Pelo G á ico 7 oi possí el con i ma -se que a espessu a do ilme aumen a linea men e com o aumen o do núme o de camadas. De seguida, oi de e minada a esis ência de olha, u ilizando a écnica de duas pon as (secção 3.3.1) e, es abelecida a elação dos seus alo es com a a iação da espessu a das amos as, ob endo-se os esul ados ap esen ados no G á ico 8. G á ico 8 – Aumen o da esis ência de olha do elé odo de abalho imp esso em unção do in e so da espessu a. y = (10±1)x - (4±3) R² = 0,98 0 10 20 30 40 012345 𝜏/ µm Núme o de Camadas y = (712±46)x -(1±4) R² = 0,99 0 20 40 60 80 100 120 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 Rs/Ω.sq-1 𝜏-1 / µm-1 48 Capí ulo 5 O imização e Ca ac e ização do Elé odo de T abalho Como se pode obse a no G á ico 8, e i icou-se que a esis ência de olha a ia linea men e com o in e so da espessu a, ou seja, quando maio a espessu a do elé odo de abalho meno é o alo da esis ência de olha. Ao obse a es es esul ados, pode-se coloca a hipó ese de o melho amen o do sinal ele oquímico, com o aumen o da espessu a do senso , es a elacionado com a co esponden e diminuição da esis ência de olha, de aco do com a equação 11. U ilizando a écnica de pe ilome ia, oi ambém analisada a a iação da opog a ia da supe ície do elé odo, a ugosidade, à medida que se aumen a a o núme o de camadas do elé odo de abalho, endo-se ob ido os esul ados ap esen ados no G á ico 9. G á ico 9 – Va iação da ugosidade do elé odo de abalho imp esso em unção do núme o de camadas imp essas. Tal es udo oi ealizado po que, quando maio é a ugosidade, maio é a á ea a i a do senso , o que no caso dos senso es ele oquímicos pode á se uma an agem (secção 2.1.4), que endo-se e i ica se o aumen o da espessu a le a a a um aumen o ou diminuição da ugosidade, ou se não es a ia elacionado com es e pa âme o. Pelo G á ico 9 pode-se a i ma que exis e uma elação de linea idade en e o aumen o da espessu a do elé odo de abalho e o aumen o da ugosidade. Após a análise des es esul ados, concluiu-se que exis em dois pa âme os que pode ão se a causa pa a a melho ia da espos a ele oquímica do senso com o aumen o da espessu a, nomeadamen e a diminuição da esis ência de olha e o aumen o da ugosidade. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 49 5.4. Sis emas de T ês Elé odos Imp essos Após os es es com o elé odo de e e ência e auxilia come ciais e o elé odo de abalho imp esso, o am ei os es es com sis emas de ês elé odos imp essos, ap esen ando-se na Figu a 28 um exemplo. Fo am es udados di e sos senso es com qua o camadas de in a à base de ca bono no elé odo de abalho e auxilia e apenas uma camada de in a à base de Ag/AgCl no elé odo de e e ência. Es es senso es o am e es idos po um ilme plás ico adesi o, de o ma a impedi a oxidação da in a condu o a de p a a. Figu a 28 – Sis ema de ês elé odos imp essos. 5.4.1. P é- a amen o Com o obje i o de ob e um melho compo amen o ele oquímico, o am ei os es es com senso es imp essos que inham sido subme idos aos p é- a amen os e e idos na secção 5.1, an o com H2SO4 como com PBS. Os esul ados encon am- se ap esen ados no G á ico 10. 50 Capí ulo 5 O imização e Ca ac e ização do Elé odo de T abalho -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 i / A E ( s Ag/AgCl) / V G á ico 10 – Vol amog amas ob idos com sis ema de ês elé odos imp essos an es e após p é- a amen o. Solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1. – An es do p é- a amen o. – Após p é- a amen o com 0,2 M H2SO4. – Após p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4. Após a análise dos picos anódicos e ca ódicos ap esen ados no G á ico 10, é possí el e i ica que o senso sem ipo algum de p é- a amen o é o que em o pio compo amen o ele oquímico. O compo amen o ele oquímico do sis ema, ao e e ua - se o p é- a amen o com H2SO4, melho a, an o nos alo es de po encial, endo um compo amen o mais e e sí el, como nos alo es de co en e, endo uma maio sensibilidade. Ao e e ua o p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4 o sinal ele oquímico melho a ainda mais. Sendo a eação es udada a mesma pa a os di e en es senso es (an es e após o p é- a amen o), pode-se conclui que a e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo do senso aumen a após o senso se subme ido a um p é- a amen o, especialmen e no caso do p é- a amen o com PBS. Pa a obse a o compo amen o dos ol amog amas ob idos pelos senso es desen ol idos, an es e após os p é- a amen os com H2SO4 e PBS, e compa á-los com o ol amog ama de um sis ema em que o elé odo de abalho é um elé odo de ca bono í eo come cial, é ap esen ado o G á ico 11 e a Tabela 7. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 51 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -200 -100 0 100 200 i / A.cm-2 E ( s Ag/AgCl) / V G á ico 11 – Vol amog amas ob idos com sis ema de ês elé odos imp essos an es e após p é- a amen o. Solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1. – An es do p é- a amen o. – Após p é- a amen o com 0,2 M H2SO4. – Após p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4. – Ca bono í eo. Tabela 7 – Valo es de co en e ob idos pa a os picos anódico (ip,a) e ca ódico (ip,c) e espe i os alo es de po encial, e e en es ao G á ico 11. Ep,a / V Ep,c / V ip,a / µA ip,c / µA An es do p é- a amen o 0,63 -0,73 15,06 -19,30 Após p é- a amen o (0,2 M H2SO4) 0,49 -0,23 20,47 -23,40 Após p é- a amen o (0,1 M PBS) 0,24 0,08 38,56 -40,37 Ca bono Ví eo 0,35 0,12 230,55 -233,48 Pela Tabela 7 é possí el e i ica que o sis ema com um elé odo de abalho imp esso, após o p é- a amen o com PBS, ap esen a um compo amen o simila ao sis ema com um elé odo de ca bono í eo come cial, ela i amen e aos seus alo es de po encial, apesa de e uma meno in ensidade de co en e. Tendo-se e i icado 52 Capí ulo 5 O imização e Ca ac e ização do Elé odo de T abalho que o compo amen o ele oquímico após o p é- a amen o com PBS aumen a a a e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo, oi ealizado um es udo mais ap o undado, pa a con i mação dos esul ados ob idos. Es e es udo baseou-se na epe ibilidade do sis ema após o p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4. Nos senso es imp essos é mui o impo an e ga an i a epe ibilidade da espos a, pa a que os esul ados não a iem de senso pa a senso . Fo am assim u ilizados ês senso es di e en es que inham sido subme idos ao p é- a amen o com PBS, a im de e i ica se os esul ados e am epe í eis, endo-se ob ido os ol amog amas ap esen ados no G á ico 12 e cujos alo es de co en e e de po encial de pico anódico e ca ódico se encon am na Tabela 8. -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 E ( s Ag/AgCl) / V i / A G á ico 12 - Vol amog amas ob idos com solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4 po ês senso es di e en es. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1. Tabela 8 – Valo es de co en e ob idos pa a os picos anódico (ip,a) e ca ódico (ip,c) e espe i os alo es de po encial, e e en es ao G á ico 12. Senso 1 Senso 2 Senso 3 Ep,a / V 0,20 0,23 0,24 Ep,c / V 0,05 0,08 0,08 ∆Ep/ V 0,15 0,15 0,16 ip,a / µA 33,88 35,05 38,56 ip,c / µA -34,06 -36,40 -40,37 FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 53 A pa i des es esul ados podemos e i ica que a média do alo de co en e do pico anódico é 36±2 µA e a do pico ca ódico é 37±3 µA. A média do alo de po encial do pico anódico é 0,22±0,02 V e do pico ca ódico 0,07±0,02 V, sendo a média do alo da di e ença de po encial (∆Ep) 0,15±0,01 V. Reco endo à Tabela 7 e ao alo médio de ∆Ep ob ido após os es udos explo a ó ios de epe ibilidade do senso imp esso, sabe-se que o alo de di e ença de po encial do elé odo come cial de ca bono í eo é 230 mV, sendo o alo médio de ∆Ep do elé odo à base de ca bono imp esso de 150±10 mV. Tal pode á se indica i o de que e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo de abalho imp esso é supe io à do elé odo de abalho come cial de ca bono í eo. Também é possí el compa a o alo ob ido com os alo es ap esen ados po Mo in e al. [1]. Es e g upo desen ol eu di e sos senso es imp essos e o melho alo de ∆Ep ob ido oi 264 mV, um alo supe io ao ob ido pa a os senso es desen ol idos ao longo desde abalho. Po es es esul ados oi possí el con i ma que a e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo é supe io após a aplicação do p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4. Tal como e e ido an e io men e, es es p é- a amen os êm como obje i o a emoção, da supe ície do senso , de di e sas subs âncias que pode iam se i de in e e en es e diminui o sinal ele oquímico [1]. Também pode ão le a a um aumen o da ugosidade da supe ície do elé odo de abalho, exis indo um aumen o da á ea a i a do elé odo [53]. Podemos con i ma que es es p é- a amen os, essencialmen e o p é- a amen o com PBS, aumen am a e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo de abalho com qua o camadas de in a à base de ca bono. Foi ainda ei o o es udo mic oscópico da supe ície do senso , an es e após a modi icação com 0,1 M PBS pH=7,4, endo-se ob ido os esul ados ap esen ados na Figu a 29. 60 Capí ulo 6 Modi icação do Elé odo de T abalho -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -60 -40 -20 0 20 40 E ( s Ag/AgCl) / V i / A G á ico 17 – Vol amog amas ob idos em solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1. - - - - Sis ema de ês elé odos imp essos an es de se subme ido ao p é- a amen o – Sis ema de ês elé odos imp essos após p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4. Pa a acili a a compa ação en e os di e en es ol amog amas, os alo es de co en e e po encial dos picos anódico e ca ódico, o am sin e izados na Tabela 9. Tabela 9 – Valo es de co en e ob idos pa a os picos anódico (ip,a) e ca ódico (ip,c) e espe i os alo es de po encial, e e en es ao G á ico 17. Ep,a / V Ep,c / V ip,a / µA ip,c / µA An es do p é- a amen o 0,34 -0,15 26,65 -28,76 Após p é- a amen o (0,1 M PBS) 0,17 -0,01 33,91 -55,37 Ca bono Ví eo 0,35 0,12 230,6 -233,5 Tendo sido e i icado um aumen o da e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo de abalho modi icado após o p é- a amen o, al como no senso não modi icado, o am ei os es udos explo a ó ios de epe ibilidade com os senso es modi icados. Nes e es udo u ilizou-se uma sonda ele oquímica de hexaciano e a o(III) de po ássio e eco eu-se a ês senso es di e en es, a im de e i ica se após a modi icação da in a, com CoPC e espe i o p é- a amen o, exis i iam a iações nos alo es de co en e e po encial dos picos anódico e ca ódico dos di e en es senso es. Os esul ados encon am-se ap esen ados no G á ico 18. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 61 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 E ( s Ag/AgCl) / V i / A G á ico 18 – Vol amog amas ob idos em solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4 po ês senso es di e en es. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1. Analisando o G á ico 18, é possí el e i ica uma a iação dos alo es de co en e dos picos anódico e ca ódico, embo a os espe i os alo es de po encial sejam idên icos pa a os ês senso es. Na Tabela 10 são ap esen ados os alo es e e en es aos ol amog amas ob idos. Tabela 10 – Valo es de co en e ob idos pa a os picos anódico (ip,a) e ca ódico (ip,c) e espe i os alo es de po encial, e e en es ao G á ico 18. Senso 1 Senso 2 Senso 3 Ep,a / V 0,17 0,20 0,20 Ep,c / V -0,01 -0,01 -0,02 ∆Ep/ V 0,18 0,21 0,22 ip,a / µA 33,91 30,61 23,17 ip,c / µA -55,37 -43,00 -35,60 A pa i des es esul ados podemos a i ma que a média do alo de co en e do pico anódico é 29±6 µA e a do pico ca ódico, em alo absolu o, 45±10 µA. Os alo es comp o am que o senso modi icado não em uma epe ibilidade ão ele ada compa a i amen e aos senso es não modi icados, o que p o a elmen e es á elacionado com o ac o de a mis u a de CoPC não se o almen e uni o me. P o a elmen e exis e uma meno quan idade de CoPC, pa a se oxidada ele oquimicamen e, em alguns senso es compa a i amen e com ou os. Se exis i menos CoPC a in ensidade do sinal pode á se meno . Es e p oblema pode ia se 62 Capí ulo 6 Modi icação do Elé odo de T abalho ul apassado es udando-se no os mé odos de mis u a de ambos os compos os, como po exemplo mis u a a alocianina de cobal o(II) du an e a o mulação da p óp ia in a e não à in a come cial, já o almen e o mulada. As médias dos alo es de po encial dos picos anódico e ca ódico são, espe i amen e, 0,19±0,02 V e -0,013±0,006 V. Apesa de g andes a iações no alo médio de co en e dos picos, os alo es de po encial dos picos são semelhan es, sendo a média de ∆Ep de 0,20±0,02 V. Sabendo que pa a os senso es sem modi icação a ∆Ep do p ocesso edox da sonda é de 150±10 mV e que pa a o senso modi icado es e alo é de 203±20 mV, podemos a i ma que os sis emas com es es elé odos de abalho, modi icado e não modi icado, êm um compo amen o semelhan e, ap esen ando uma maio e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do espe i o elé odo do que o elé odo de abalho come cial, que em um alo de ∆Ep de 230 mV. Tal como nos esul ados ap esen ados na secção 5.4.1 pa a o senso não modi icado, o elé odo de abalho modi icado ambém ap esen a uma maio e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo após a aplicação do p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4, podendo exis i a emoção, da supe ície do senso , de di e sas subs âncias que pode iam se in e e en es e diminui o sinal ele oquímico [1], e um possí el aumen o da ugosidade da supe ície [53]. Es e p é- a amen o aumen ou a e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo de abalho imp esso com in a à base de ca bono, modi icada com CoPC, no elé odo de abalho. Foi ambém ei o um es udo da supe ície do elé odo po mic oscopia ó ica, cujas imagens se encon am na Figu a 30. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 63 Po es e es udo é possí el a i ma , al como as imagens de mic oscopia ó ica do senso não modi icado, que após o p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4, a supe ície des e senso apa en a uma maio uni o midade, o que possi elmen e é um indica i o da diminuição do núme o de impu ezas à supe ície do senso [1]. Tal como no senso não modi icado, p o a elmen e os pon os b ancos ep esen am as impu ezas, que desapa ecem quase na o alidade nas igu as 29C e 29D. Na Figu a 30, as p o á eis impu ezas encon am-se isualmen e mais condensadas e em meno quan idade compa a i amen e com a Figu a 29 (secção 5.4.1, imagens mic oscópicas da supe ície do elé odo de abalho não modi icado). Apesa dessas impu ezas exis i em em meno quan idade na Figu a 30, compa a i amen e com as impu ezas das imagens mic oscópicas da Figu a 29, exis em com um maio diâme o, o que pode á se de ido ao p ocesso de mis u a da in a. Pa a mis u a a alocianina de cobal o(II) com a in a u ilizou-se um almo a iz, que possi elmen e le a a a uma coesão das impu ezas exis en es. Ou a hipó ese é não es a mos pe an e apenas impu ezas, mas o que es amos a obse a se em pa ículas de CoPC. 6.1.2. Es udo da Es abilidade Tal como no senso não modi icado, o am ei os es udos de es abilidade em que se a e iu quan os ensaios se ia possí el ealiza com o mesmo senso , se não hou esse al e ações na supe ície dos elé odos du an e esse ensaio (como po Figu a 30 – Imagens ob idas po mic oscopia ó ica do elé odo de abalho do senso imp esso. A e B – An es do p é- a amen o. C e D – Após p é- a amen o com 0,1 M PBS pH=7,4. A C B D 64 Capí ulo 6 Modi icação do Elé odo de T abalho exemplo a o mação de no as camadas sob e a supe ície do elé odo). Tal como na secção 5.4.2, o am ealizados qua o conjun os de es es. Em cada um desses es es inham-se ob ido 100 ol amog amas e os úl imos ol amog amas de cada um desses conjun os o am compa ados en e si, al como se obse a no G á ico 19. -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -40 -20 0 20 40 E ( s Ag/AgCl) / V i / A G á ico 19 – Vol amog amas ep esen a i os de cada conjun o de 100 a imen os, cada co co esponde a um desses ol amog amas. 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4 po ês senso es di e en es. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1. Es e es e, consis iu em qua o conjun os de ensaios, ei os no mesmo dia e, obse ando o G á ico 19, pode-se a i ma que o senso modi icado de e ou o sinal da sonda pelo menos 400 ezes, não exis indo a iações signi ica i as nos alo es de po encial e de co en e ao longo des es ensaios. Po im, pa a e i ica a es abilidade des e ipo de senso es, o am ei os es es com o mesmo senso , modi icado com CoPC, ao longo de um mês. Inicialmen e es e senso oi sujei o ao p é- a amen o com PBS e oi ei o de imedia o o seu ol amog ama, após o a amen o. De seguida o am ei os mais ês ol amog amas, com uma semana de in e alo en e cada lei u a, es ando os esul ados ob idos ep esen ados no G á ico 20. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 65 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -60 -40 -20 0 20 40 E ( s Ag/AgCl) / V i / A G á ico 20 – Vol amog amas ob idos com in e alo de uma semana u ilizando o mesmo senso , que o a subme ido a um p é- a amen o apenas uma ez. Solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de a imen o = 0,01 V.s-1. – P imei a Semana. – Segunda Semana. – Te cei a Semana. – Qua a Semana. Pela obse ação do G á ico 20, é possí el conclui que, ao longo das qua o semanas, apesa de os alo es de po encial anódico e ca ódico não a ia em mui o, o mesmo não acon ece com a in ensidade de co en e. No p imei o ensaio, compa a i amen e com os es an es, é isí el uma maio in ensidade de co en e que diminui pa a ce ca de me ade do seu alo inicial nas semanas seguin es. Apesa des a diminuição da p imei a pa a a segunda semana, ao longo das es an es semanas de es udo, o alo de co en e apa en a es abiliza . Tal pode á es a elacionado com a limpeza do elé odo. No p imei o ensaio o elé odo inha acabado de se “limpo” ao eco e ao p é- a amen o. O mesmo não ha ia acon ecido du an es as es an es semanas, em que apenas se coloca a o elé odo em solução, sem p é- a amen o algum ei o no momen o, de o ma a e i ica se o p imei o p é- a amen o, ei o p e iamen e à p imei a u ilização do senso , se ia es á el ao longo de um ele ado pe íodo de empo. 6.1.3. Es udo Ciné ico Pa a os senso es modi icados com CoPC oi ambém ealizado um es udo ciné ico, al como na secção 5.4.3, cujos ol amog amas se obse am no G á ico 21. 66 Capí ulo 6 Modi icação do Elé odo de T abalho -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -250 -200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200 i / A.cm2 = 2 V.s-1 = 1 V.s-1 = 0,5 V.s-1 = 0,2 V.s-1 = 0,1 V.s-1 = 0,05 V.s-1 = 0,04 V.s-1 = 0,03 V.s-1 = 0,02 V.s-1 = 0,01 V.s-1 E ( s Ag/AgCl) / V G á ico 21 – Vol amog amas ob idos no es udo ciné ico da solução de 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4 a di e en es elocidades de a imen o. Ao analisa es e g á ico, é possí el a i ma que um aumen o da elocidade de a imen o le a a um aumen o da in ensidade de co en e e a um deslocamen o linea do po encial anódico e ca ódico pa a alo es mais posi i os e mais nega i os, espe i amen e, ap esen ado o mesmo compo amen o que no senso não modi icado. Pa a p ocede a uma melho análise da espos a do senso pe an e a a iação da elocidade de a imen o, oi es udada a a iação dos alo es de co en e de pico em unção da a iação da aiz quad ada da elocidade de a imen o al como ap esen ado no G á ico 22. 0,0 0,5 1,0 1,5 -200 -100 0 100 200 1/2 / V.s-1 i / A G á ico 22 – Va iação do alo de co en e de pico em unção da aiz quad ada da elocidade de a imen o. Solução 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. ■ Pico anódico. × Pico ca ódico. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 67 Pode-se obse a que, al como no caso do senso não modi icado, a co en e de pico anódica desloca-se pa a alo es mais posi i os com o aumen o da elocidade de a imen o e a co en e de pico ca ódico desloca-se pa a alo es mais nega i os com o aumen o da elocidade de a imen o apesa de não se uma elação p opo cional, o que co esponde ao compo amen o desc i o po uma eação quasi- e e sí el [42]. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 / V.s-1 E ( s Ag/AgCl) / V G á ico 23 – Va iação dos alo es de po encial dos picos anódico e ca ódico em unção da elocidade de a imen o. Solução 2,5 mM hexaciano e a o(III) de po ássio em 0,1 M PBS pH=7,4. ■ Pico anódico. × Pico ca ódico. Es e g á ico ap esen a um compo amen o mui o semelhan e ao G á ico 16, ou seja, a a iação do po encial depende da elocidade de a imen o da eação. Os alo es de po encial de pico anódico deslocam-se pa a alo es mais posi i os à medida que se aumen a a elocidade de a imen o e os alo es de po encial de pico ca ódico deslocam-se pa a alo es mais nega i os, indica i o de que a e e sibilidade do p ocesso edox da sonda à supe ície do elé odo aumen a à medida que se diminui a elocidade de a imen o. 6.1.4. De eção de H2O2 O obje i o da modi icação da in a à base de ca bono com CoPC se ia o na possí el a de eção de H2O2 pelo senso imp esso. Is o po que a ciné ica da eação do pe óxido de hid ogénio é mui o len a, sendo necessá io aplica uma sob e ensão pa a oco e . Assim, uma opção é a u ilização de mediado es de ele ões al como CoPC. O H2O2 em solução le a à edução de CoPC, sendo Co(I) um dos p odu os da eação. O 68 Capí ulo 6 Modi icação do Elé odo de T abalho compos o ob ido é eoxidado elec oquimicamen e, sendo possí el ob e um sinal ele oquímico, o sinal de in e esse. Pa a con i ma que o senso , com o elé odo de abalho imp esso com in a à base de ca bono mis u ada com CoPC, es a a a de e a o H2O2 o am ei os es udos ele oquímicos com senso es modi icados e não modi icados, analisando a sua espos a ele oquímica numa solução com H2O2, al como ap esen ado no G á ico 24. 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 E ( s Ag/AgCl) / V i / A G á ico 24 – De eção de 0,88 mM H2O2 em 0,1 M PBS pH=7,4. – Senso não modi icado em 0,88 mM H2O2 em 0,1 M PBS pH=7,4. …… Senso modi icado em 0,1 M PBS pH=7,4. - - - - - Senso modi icado com CoPC, em 0,88 mM H2O2 em 0,1 M PBS pH=7,4,com pico anódico a 0,50 V. Velocidade de a imen o = 0,1 V.s-1. Es e g á ico mos a que an es da modi icação da in a, não é possí el obse a um sinal ele oquímico bem de inido. Mas após essa modi icação há a de eção de um pico ele oquímico, esul an e da oxidação ele oquímica de CoPC a um po encial de 0,50 V. Es e esul ado comp o a que a CoPC é um bom mediado edox da eacção de oxidação do pe óxido de hid ogénio, mediando a ans e ência de ele ões en e o senso e o anali o. Tal como e e ido an e io men e, os senso es ele oquímicos são maio i a iamen e senso es c onoampe omé icos (secção 2.2.1.b), ou seja, são u ilizados pa a analisa a in ensidade de co en e em unção da concen ação de H2O2. O obje i o é que a in ensidade do sinal ele oquímico seja di e amen e p opo cional à concen ação de anali o p esen e na solução, sendo pa a isso necessá io que o senso enha uma espos a linea a adições sucessi as de H2O2. Dessa o ma, o am ei os es udos c onoampe omé icos com um dos senso es modi icados desen ol idos, al como ap esen ado no G á ico 25. FCUP Desen ol imen o e o imização de senso es ele oquímicos imp essos 69 0100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 i / A / s G á ico 25 – Sinal ampe omé ico do senso após sucessi as adições pad ão de H2O2 (10 µL de 4,85 mM) a 30 mL de 0,1 M PBS pH=7,4. Po encial aplicado de 0,3 V s Ag/AgCl. Em es udos simila es desc i os po M. Bouj i a e al. [24], o po encial ele oquímico aplicado oi de 400 mV, mas ao ealiza -se o es udo com esse po encial, e i icou-se um o e decaimen o da in ensidade de co en e ao longo empo, pelo que o am es ados ou os po enciais, sendo os melho es esul ados aqueles ob idos pa a 300 mV. Seguidamen e oi açado o g á ico do alo da in ensidade de co en e em unção da concen ação da H2O2, ap esen ado no G á ico 26. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 i / A Concen açao H2O2 / mM G á ico 26 – Cu a de calib ação do sinal ampe omé ico do senso após sucessi as adições pad ão de H2O2 (10 µL de 4,85 mM) a 30 mL de 0,1 M PBS pH=7,4. Po encial Aplicado de 0,3 V s Ag/AgCl. 76 Capí ulo 8 Bibliog a ia [14] S. I o, T. Ka o, K. Shinpo, C. M. Science, E. M. Mush oom, C. Co, and W. P. C. Indus-, “Oxida ion o y osine esidues in p o eins by y osinase,” ol. 222, pp. 407– 411, 1984. [15] H. B. Yildiz and L. Toppa e, “Biosensing app oach o alcohol de e mina ion using immobilized alcohol oxidase,” ol. 21, pp. 2306–2310, 2006. [16] O. Fa ibello-Filho, K. Lupe i, O. Lei e, and I. Viei a, “Elec ochemical Biosenso s based on ege ables issues and c ude ex ac s o en i onmen al, ood and pha maceu ical analysis,” in Elec ochemical Senso Analysis, 207AD, pp. 357 – 377. [17] S. Yabuki, H. Shinoba a, Y. Ika iyama, and M. Aizawa, “Elec ical ac i i y con olling sys em o a media o -coexis ing alcohol dehyd oogenase -NAD conduc i e memb ane,” ol. 217, pp. 179–187, 1990. [18] T. Nakaminami, S. Kuwaba a, H. Yoneyama, and C. 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