Desenvolvimento e Otimização de Sensores Eletroquímicos Impressos

Vanessa Montês Mestrado em Química Departamento de Química e Bioquímica 2015 Orientador M. João Sottomayor, FCUP Orientadores de Estágio Joana Dinis Fonseca, CeNTI José Poças Gonçalves, CeNTI Desenvolvimento e Otimização de Sensores Eletroquímicos Impressos Todas as correções determinadas pelo júri, e só essas, foram efetuadas. O Presidente do Júri, Porto, ______/______/_________ i Agradecimentos A realização desta tese de Mestrado apenas foi possível graças à ajuda de diversas pessoas e instituições, às quais gostaria de deixar as minhas palavras de agradecimento: Ao Departamento de Química e Bioquímica da Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, por me ter aceite como estudante de Mestrado, permitindo-me a realização da tese de Mestrado em ambiente empresarial. Ao CeNTI, Centro de Nanotecnologia e Materiais Técnicos, Funcionais e Inteligentes, por me ter aceitado e possibilitado a realização deste trabalho de investigação e desenvolvimento, colocando todos os meios necessários à minha disposição. À Doutora Joana Fonseca e ao Doutor José Gonçalves, meus orientadores no CeNTI, por todo o apoio, orientação, dedicação e tempo dispensados a ajudar-me durante todo o presente trabalho. Obrigada por todo o apoio nas discussões de resultados e possíveis “voltas a dar”. À Professora Doutora M. João Sottomayor, pela ajuda imprescindível durante as diversas apresentações e trabalhos escritos. Aos meus colegas estagiários por todo o apoio durante este último ano, tanto em forma de longas discussões de resultados obtidos, como de grandes gargalhadas que serviam para levantar os ânimos. Especialmente ao Roman Krupa, pelas longas discussões de física e por me ter auxiliado durante a utilização de diferentes equipamentos de caracterização elétrica, ajudando-me na análise dos seus resultados. A todos os funcionários do CeNTI, que me fizeram sentir em casa e que estavam sempre prontos a ajudar no que era necessário. Ao Rodrigo Coelho, por ter estado sempre ao meu lado a apoiar-me e pronto a ouvir as minhas inúmeras e intermináveis teorias durante o desenvolvimento do trabalho. Aos meus pais e irmãos um grande obrigada por todo o apoio e sacrifícios feitos, por todas as longas conversas e por toda a ajuda. iii Resumo Este trabalho teve como principal objetivo o desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos não modificados e modificados, para deteção de peróxido de hidrogénio e de etanol. Os sensores eletroquímicos são conhecidos pela sua elevada sensibilidade e seletividade para diversos analitos, não sendo necessário a utilização de elevados volumes de amostra para a realização das análises. Por sua vez os sensores impressos geralmente têm um baixo custo de produção associado, e essa produção pode realizar-se em massa. Neste trabalho procedeu-se à impressão dos sensores estudados utilizando-se a técnica de serigrafia (screen printing). Após a impressão, realizaram-se estudos de caracterização eletroquímica e elétrica do elétrodo de trabalho, estudando-se o processo de oxidação-redução de uma sonda eletroquímica (K3[Fe(CN)6]) à superfície do elétrodo e determinando-se a resistência de folha. Adicionalmente também se determinou a espessura e a rugosidade dos elétrodos por perfilometria. Com o objetivo de se obter um aumento da reversibilidade do processo redox da sonda à superfície do elétrodo, foram feitos estudos de otimização do sensor. No primeiro estudo investigou-se como o número de camadas de carbono no elétrodo de carbono afeta o comportamento eletroquímico, a resistência de folha e a rugosidade do próprio elétrodo. No segundo estudo, investigou-se qual a influência de prétratamentos eletroquímicos, com soluções de H2SO4, e PBS no comportamento eletroquímico do elétrodo de trabalho. Após a otimização do elétrodo de trabalho, procedeu-se à modificação da superfície desse elétrodo com ftalocianina de cobalto (CoPC), um mediador de eletrões que permite a deteção do sinal eletroquímico de H2O2. Foi também objetivo do presente trabalho a imobilização, sobre o elétrodo de trabalho do sensor, da enzima álcool oxidase, uma enzima que catalisa a reação de álcoois primários com oxigénio, sendo um dos produtos H2O2. Com esta modificação pretendia-se obter sensores para a deteção de etanol, sensores com uma vasta aplicação industrial nomeadamente na monitorização dos processos de fermentação de bebidas alcoólicas e de produção de etanol para biocombustíveis. A imobilização realizou-se por deposição por gota, tendo-se testado três abordagens distintas. Com uma membrana de nitrocelulose, com uma camada de ágar-ágar e sem membrana de nitrocelulose e/ou camada de ágar-ágar. Apenas os sensores com a camada de ágarágar sobre a gota de álcool oxidase apresentaram sensibilidade ao etanol, no entanto, esta foi muito baixa. iv Palavras-chave Sensores eletroquímicos impressos, Biossensores, Serigrafia, Ftalocianina de cobalto(II), Etanol, Álcool oxidase, Hexacianoferrato(III) de potássio. v Abstract The main aim of this work is the development and optimization of an electrochemical printed sensor, without or with modification, to detect hydrogen peroxide and ethanol. Electrochemical sensors are known for their high sensitivity and selectivity for different analytes and they don’t necessarily need high volume samples. Generally printed sensors have low production cost and are easily adapted to mass production. The studied sensors were printed by the screen printing technique. Afterwards, the working electrode was electrochemically and electrically characterized in order to evaluate its electrochemical behavior, using an electrochemical probe (K3[Fe(CN)6]), and to determine its sheet resistance. Additionally, the thickness and roughness of the electrode were also evaluated, by surface profilometry. For an increase of the reversibility of the redox process at the working electrode surface, optimization studies were performed. In the first study the number of carbon layers, and its effect on the electrochemical behavior, the sheet resistance and the roughness of the electrode, were analyzed. In the second study, the influence of two different pre-treatments, one with H2SO4 and the other with PBS, on the electrochemical behavior of the electrode were investigated. After the working electrode optimization, an electrode surface modification was carried out, with cobalt phalocyanine (CoPC), an electron mediator which allows the detection of the electrochemical signal of H2O2. The modified sensor showed a linear electrochemical response with the H2O2 concentration. In the present work we wanted to immobilize, onto the working electrode of the sensor, the enzyme alcohol oxidase, which catalyzes the reaction of the primary alcohols with hydrogen, one of the products of H2O2 reaction (an electrochemical species with high oxidation potential). With this modification it was intended to obtain a sensor, for the detection of ethanol, with a wide range of industrial applications, like the monitorization of the alcohol fermentation and the production of ethanol for biofuels. The immobilization was carried out by drop deposition, and three different approaches were tested: with a nitrocellulose membrane, with an agar membrane and without a nitrocellulose membrane and/or an agar membrane. Only the sensor with the agar membrane onto the alcohol oxidase drop showed sensibility to ethanol, however, it was really small. xiii Índice de Gráficos Gráfico 1 – Perfilometria referente ao alinhamento do elétrodo de trabalho com sobreposição de quatro camadas ............................................................................... 38 Gráfico 2 – Resultado do teste inicial do sensor de três elétrodos impressos ............. 41 Gráfico 3 – Voltamogramas após pré-tratamento ........................................................ 42 Gráfico 4 – Voltamograma obtido com elétrodo de carbono impresso sem revestimento, com picos representativos de metais .................................................... 44 Gráfico 5 - Voltamograma obtido com elétrodo de carbono impresso com revestimento. ............................................................................................................. 45 Gráfico 6 – Voltamogramas obtidos com variação do número de camadas, de tinta à base de carbono, do elétrodo de trabalho impresso e elétrodo de carbono vítreo comercial. ................................................................................................................... 46 Gráfico 7 – Aumento da espessura do elétrodo de trabalho impresso em função do número de camadas impressas. ................................................................................. 47 Gráfico 8 – Aumento da resistência de folha do elétrodo de trabalho impresso em função do inverso da espessura. ................................................................................ 47 Gráfico 9 – Variação da rugosidade do elétrodo de trabalho impresso em função do número de camadas impressas. ............................................................................ 48 Gráfico 10 – Voltamogramas obtidos com sistema de três elétrodos impressos antes e após pré-tratamento ....................................................................................... 50 Gráfico 11 – Voltamogramas obtidos com sistema de três elétrodos impressos antes e após pré-tratamento. ...................................................................................... 51 Gráfico 12 - Voltamogramas obtidos com solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4 por três sensores diferentes ................................ 52 Gráfico 13 – Voltamogramas representativos de cada conjunto de 100 varrimentos, cada cor corresponde a um desses voltamogramas. .................................................. 55 Gráfico 14 – Voltamogramas obtidos no estudo cinético da solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4 a diferentes velocidades de varrimento. .................................................................................................................. 56 Gráfico 15 – Variação do valor de corrente de pico em função da raiz quadrada da velocidade de varrimento ............................................................................................ 56 Gráfico 16 – Variação dos valores de potencial dos picos anódico e catódico em função da velocidade de varrimento ........................................................................... 57 Gráfico 17 – Voltamogramas obtidos em solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4. ............................................................................ 60 xiv Gráfico 18 – Voltamogramas obtidos em solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4 por três sensores diferentes ................................ 61 Gráfico 19 – Voltamogramas representativos de cada conjunto de 100 varrimentos, cada cor corresponde a um desses voltamogramas. .................................................. 64 Gráfico 20 – Voltamogramas obtidos com intervalo de uma semana utilizando o mesmo sensor, que fora submetido a um pré-tratamento apenas uma vez. ............... 65 Gráfico 21 – Voltamogramas obtidos no estudo cinético da solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4 a diferentes velocidades de varrimento .............................................................................................................. 66 Gráfico 22 – Variação do valor de corrente de pico em função da raiz quadrada da velocidade de varrimento ............................................................................................ 66 Gráfico 23 – Variação dos valores de potencial dos picos anódico e catódico em função da velocidade de varrimento ........................................................................... 67 Gráfico 24 – Deteção de 0,88 mM H2O2 em 0,1 M PBS pH=7,4.................................. 68 Gráfico 25 – Sinal amperométrico do sensor após sucessivas adições padrão de H2O2............................................................................................................................ 69 Gráfico 26 – Curva de calibração do sinal amperométrico do sensor após sucessivas adições padrão de H2O2 ........................................................................... 69 Gráfico 27 – Curva de calibração do sinal amperométrico do sensor após sucessivas adições padrão de etanol ......................................................................... 72 xv Lista de Símbolos e Abreviaturas A - Área do elétrodo de trabalho At - Área transversal ADH - Álcool desidrogenase AOX - Álcool oxidase c - Concentração CoPC - Ftalocianina de cobalto D - Coeficiente de difusão E - Potencial do elétrodo de trabalho Eϴ - Potencial formal EA - Elétrodo auxiliar ER - Elétrodo de referência ET - Elétrodo de trabalho Ep,a - Potencial de pico da corrente anódica Ep,c - Potencial de pico da corrente catódica e- - Eletrão ∆Ep - Diferença de potencial entre os picos anódico e catódico F - Constante de Faraday i - Intensidade de corrente ic - Corrente capacitiva if - Corrente faradaica ip - Intensidade de corrente de pico ip,a - Intensidade de corrente do pico anódico ip,c - Intensidade de corrente do pico catódico KM - Constante de Michaelis-Menten l - Comprimento n - Quantidade de substância (analito) n' - Número de eletrões transferidos no passo limitante da velocidade NADH - Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato NAD+ - Nicotinamida adenina dinucleótido [O]∞ - Concentração inicial da espécie oxidante em solução PETPolitereftalato de etileno PVCPolicloreto de polivinilo PBS - Phosphate buffered saline (Tampão fosfato-salino) Q - Quociente entre a concentração das espécies em solução R - Resistência xvi Rs - Resistência de folha redox - Redução - oxidação R2 - Coeficiente de determinação R - Constante dos gases perfeitos SPE - Screen printed electrode (elétrodo impresso) SPCE - Screen printed carbon electrode (elétrodo de carbono impresso) [S]o - Concentração inicial de substrato T - Temperatura t - Tempo v - Velocidade de varrimento V0 - Velocidade inicial VM - Velocidade máxima αa - Coeficiente de transferência de carga anódico αc - Coeficiente de transferência de carga catódico ρ - Resistividade Ø - Diâmetro FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 1 1. Introdução 1.1. Biossensores Um biossensor é um sensor de deteção química que na sua constituição tem um componente de reconhecimento biológico, que é o responsável pela biosseletividade, acoplado a um transdutor, que transforma a informação obtida num sinal de interesse, sendo desta forma possível a deteção de um determinado parâmetro bioquímico [2]. A Figura 1 apresenta esquematicamente os elementos constituintes de um biossensor. O elemento de reconhecimento biológico poderá ser acoplado ao sensor por técnicas de funcionalização, como por exemplo adsorção e cross linking. A área dos biossensores encontra-se em grande expansão devido, em particular, à sensibilidade inerente aos métodos utilizados (como por exemplo métodos eletroquímicos) em conjunto com a biosseletividade característica dos componentes biológicos [2]. Figura 1 – Esquema de um biossensor com um transdutor de sinal [2]. Existem diversos tipos de biossensores, podendo a designação atribuída a cada um depender do tipo de elemento de reconhecimento biológico (biocatalítico ou por afinidade) ou do género de transdutor utilizado (ressonante, térmico, ótico, sensível a iões ou eletroquímico), tal como se encontra esquematizado na Figura 2. Os biossensores apresentam tipicamente dimensões muito reduzidas, são de fácil utilização e permitem uma análise rápida dos mais variados analitos. Esta análise pode ser contínua, durante um longo período de tempo, ou pode ser uma análise de resposta rápida, durante um curto período de tempo [3]. Dependendo do objetivo para o qual é idealizado, o sensor pode ser descartável ou reutilizável. O acoplamento de um elemento de reconhecimento biológico ao transdutor confere uma elevada especificidade a este tipo de sensores e o transdutor permite uma elevada sensibilidade para o analito. Sendo estes sensores específicos para determinados compostos, encontram-se otimizados para que o seu tempo de resposta seja o mais curto possível, o que se deve à manipulação da cinética das reações que ocorrem no sistema [3]. Analito Elemento de Reconhecimento Biológico Sinal Processador de Sinal Transdutor 2 Capítulo 1 Introdução Tipo de Biossensor Elemento Sensível Transdutor Enzimático Microbiológico Imunossensor Quimiorreceptor Eletroquímico ímico Ótico Acústico Calorimétrico Baseiam-se na deteção de alterações de propriedades óticas resultantes da interação entre o analito e o componente de reconhecimento biológico (ex. difração da luz), ou nos valores de emissão de luz por um processo luminescente[4][4][4]. O seu princípio de funcionamento baseia-se em uma ou mais reações químicas produzem ou utilizam iões e/ou eletrões que poderão provocar alterações nas propriedades elétricas das amostras. Quando o analito entra em contacto com o elemento de reconhecimento biológico há uma alteração da massa do sistema, o que leva a uma alteração da frequência de ressonância registada pelo transdutor, sendo essa frequência a grandeza medida. Baseiam-se na medição do calor produzido ou absorvido durante a reação entre o analito e um determinado elemento de reconhecimento biológico. O elemento de reconhecimento biológico é constituído por uma enzima, que é imobilizada utilizando técnicas de funcionalização. Este elemento biológico é específico e extremamente seletivo. Baseiam-se na imobilização de microorganismos que interatuam e reconhecem a espécie de interesse. Grande especificidade no reconhecimento de antigénios devido aos anticorpos imobilizados na superfície do elétrodo, formando um complexo estável. Trata-se de um sistema que utiliza proteínas que interagem com espécies biológicas, tais como hormonas, resultando em alterações conformacionais. De acordo com Figura 2 – Tabela resumo dos diversos tipos de biossensores de acordo com o tipo de elemento de reconhecimento biológico ou do género de transdutor utilizado [4]. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 3 Apesar das inúmeras vantagens, os biossensores apresentam também algumas desvantagens. Devido à incorporação de um agente biológico no sensor, em geral, a temperatura de acondicionamento deve ser controlada, já que quando sobreaquecido existe o risco de desnaturação do agente biológico acoplado. Dessa forma, a sua estabilidade é um parâmetro crítico, existindo diversos fatores que poderão pô-la em causa, tais como o pH, iões em solução e, como já referido, a temperatura [3]. 1.2. Sensores Eletroquímicos Esta é provavelmente a maior classe de sensores químicos, sendo utilizados na deteção das mais diversas moléculas, micro-organismos, entre outros. O princípio inerente é que uma ou mais reações químicas acabam por produzir ou utilizar iões e/ou eletrões que provocam alterações nas propriedades elétricas das amostras. Este tipo de sensores divide-se em três categorias, os sensores condutimétricos, amperométricos e potenciométricos [4]. Os sensores eletroquímicos condutimétricos baseiam-se em processos químicos que ocorrem em solução e que levam a uma alteração da condutividade iónica das soluções. Em geral a sensibilidade para esta variável é muito baixa [4]. Outra classe de sensores eletroquímicos são os amperométricos em que é medida a intensidade de corrente após a aplicação de uma diferença de potencial, que dá origem à reação química. Estes sensores têm uma grande sensibilidade para amostras biológicas e geralmente detetam com facilidade espécies eletroativas presentes nas amostras [4].Estes sensores eletroquímicos são, por norma, sistemas eletroquímicos de três elétrodos, como a célula eletroquímica esquematizada na Figura 3. Este sistema de três elétrodos consiste na passagem de corrente de um elétrodo de trabalho, no qual ocorre a reação eletroquímica em estudo, para um elétrodo auxiliar. O elétrodo de referência é utilizado como uma referência de potencial conhecido e constante [5]. Por último, tem-se os sensores eletroquímicos potenciométricos, em que é medida a diferença de potencial entre um elétrodo sensível ao analito e o elétrodo de referência. 4 Capítulo 1 Introdução Figura 3 – Esquema de um sistema de três elétrodos e respetivos componentes. Os elétrodos dos sensores eletroquímicos podem ser impressos, nomeadamente por serigrafia. A este sistema chama-se sistema de elétrodos impressos, SPE (Screen Printed Electrode), e existem sistemas de dois ou três elétrodos, tal como representado na Figura 4. Os SPEs com dois elétrodos costumam ser utilizados para deteção sem quantificação. Os SPEs de três elétrodos são, por sua vez, mais versáteis, permitindo a realização de análises quantitativas. Por serem sistemas mais complexos, têm associado um maior custo de fabrico. Figura 4 – SPEs e respetivos componentes. A) Esquema de um sistema de três elétrodos. B) Esquema de um sistema de dois elétrodos. A grande diferença entre as células eletroquímicas convencionais e os SPEs é que estes últimos são mais versáteis, de menores dimensões e complexidade, tal como é possível observar na Figura 5 [3]. Tais características permitem que os SPEs possam ser utilizados por operadores não especializados, não existindo a necessidade de preparar a célula eletroquímica, bastando proceder à deposição da amostra sobre o elétrodo de trabalho do sensor. Apesar desta facilidade adicional na utilização de sensores impressos, as células eletroquímicas convencionais têm a vantagem de Elétrodo Auxiliar Elétrodo de Referência Elétrodo de Trabalho Substrato Contactos Revestimento A Elétrodo Auxiliar Elétrodo de Trabalho Substrato Contactos Revestimento B FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 5 serem sistemas mais robustos, permitindo, através do polimento, limpar o elétrodo de trabalho de todas as impurezas que poderão estar na sua superfície, o que possibilita que o sistema tenha uma maior durabilidade e estabilidade. Figura 5 – A – SPE de um sistema de três elétrodos e respetivos componentes [6]. B – Célula eletroquímica de um sistema de três elétrodos. Existem sensores eletroquímicos biológicos, a que se dá o nome de biossensores eletroquímicos e que podem ser classificados com base no seu elemento de reconhecimento biológico, denominando-se de sensores biocatalíticos ou sensores por afinidade. A grande diferença entre ambos é que, no caso dos sensores biocatalíticos, ocorre uma reação entre o analito e o componente de reconhecimento biológico, havendo a formação de uma nova espécie química, sendo o sinal da nova espécie o que é monitorizado. Já no caso dos sensores por afinidade é a ligação entre o analito e o componente biológico que é detetada. 1.2.1. Sensores Biocatalíticos Nos sensores biocatalíticos são geralmente usadas enzimas que são acopladas ao elétrodo de trabalho. Estas têm uma grande atividade catalítica aliada a uma elevada especificidade para determinadas espécies, catalisando a formação de produtos eletroativos para serem detetados. Estes produtos são, em geral, monitorizados diretamente através da técnica de amperometria [2]. Para além de sensores biocatalíticos baseados em enzimas, existem também biossensores em que são incorporados, no componente de reconhecimento biológico, micro-organismos vivos. Este tipo de sensor não é muito utilizado, pois tem o problema de precisar de longos períodos de tempo para recuperar totalmente após uma análise, apresentando longos tempos de resposta e perda de sensibilidade ao Revestimento Elétrodo Auxiliar Elétrodo Trabalho Elétrodo de Referência Conecção do ET Conecção do EA Conecção do ER A B FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 13 2. Técnicas 2.1. Fabrico de Sensores Eletroquímicos 2.1.1. Técnicas de Impressão Tal como a designação indica, o fabrico de sensores impressos inclui pelo menos uma técnica de impressão. Na área dos sensores impressos, uma das técnicas de impressão mais utilizadas é a serigrafia (screen printing). No entanto, nos últimos anos têm sido utilizadas outras técnicas de impressão para desenvolver diversos sensores impressos, tais como a impressão a jato de tinta, a rotogravura e a flexografia. O recurso a estas tecnologias de impressão permite a produção em massa de sensores de forma simples e rápida, para além de permitir um baixo custo de produção [24, 25]. 2.1.1.a. Serigrafia A serigrafia, ou screen printing, é uma técnica muito versátil, permitindo a impressão em substratos planos. É uma técnica económica e que apresenta, durante a impressão, perdas de tinta residuais. As diferenças mais relevantes desta técnica de impressão relativamente a outras é a possibilidade de imprimir filmes de elevada espessura. A espessura do filme impresso é um parâmetro de fácil ajuste e controlo, que depende essencialmente da tela utilizada durante a impressão, nomeadamente do número de fios por centímetro e do diâmetro do fio utilizada na tela. Na Figura 8 encontra-se um esquema do processo de serigrafia. Figura 8 – Ilustração do processo de serigrafia [27]. Movimento Moldura Tinta Impressa Tinta Substrato Tela com emulsão Área aberta que contém tinta Raclete 14 Capítulo 2 Técnicas Neste processo, o padrão do sensor que se quer imprimir encontra-se gravado numa tela, de nylon ou poliéster e com moldura de metal ou alumínio, onde é depositada a tinta para a impressão. Durante o processo a raclete espalha a tinta sobre o padrão que se encontra na tela e de seguida exerce uma determinada pressão, permitindo a transferência da tinta para o substrato [27]. A tela utilizada na impressão obedece a duas regras. A largura mínima de linha que pode ser impressa é três vezes o diâmetro do fio da tela e a largura entre os fios da tela deve ter pelo menos três vezes o tamanho de partícula da tinta/pasta utilizada durante a impressão. Para a escolha da tela, para além destas duas regras, devem ser considerados o volume e peso teórico da tinta e a pressão recomendada que pode ser empregue na tela, ou seja, a pressão necessária para que a tela estique o suficiente para a tinta passar de um lado para o outro da tela sem a danificar. Para além das regras para a escolha da tela, também é importante saber quais as funções da raclete durante a impressão. Esta tem três funções principais: pressionar a tela contra o substrato durante a impressão, ajudar na passagem da tinta através da matriz da tela para o substrato e, por último, remover o excesso de tinta da tela após a impressão. A pressão da raclete sobre a tela é variável e, quando maior for a pressão, mais finos são os filmes impressos, pois a tela encontra-se mais próxima do substrato. Este equipamento deverá ser flexível de forma a moldar-se a qualquer superfície, seja ela lisa ou rugosa, existindo racletes com diferentes graus de flexibilidade. Para além do tamanho do diâmetro do fio da tela ser importante no controlo da espessura dos filmes impressos, a velocidade da raclete é outro fator fundamental no controlo da espessura. Quando maior for a velocidade da raclete durante a impressão, maior é a espessura do padrão impresso. A razão é muito semelhante à referida para a variação da pressão da raclete, ou seja, se a velocidade da raclete for muito grande, a tela não é tão pressionada sobre o substrato, o que leva a que o padrão impresso tenha uma maior espessura. Esta espessura também é dependente do ângulo da raclete, quando maior for o ângulo da raclete relativamente à tela, menor é a espessura do filme. Outro fator que também influencia a espessura do filme é o snap off da tela, que tem uma relação de proporcionalidade com espessura do filme. O snap off é o espaço entre a tela e o substrato, que deve ter tamanho suficiente para que, logo após a passagem raclete, a tela regresse à posição inicial, não ficando demasiado próxima do substrato. Se tal acontecer, a tela pode “colar” no substrato, danificando a impressão e por vezes o próprio quadro. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 15 A técnica de serigrafia pode existir em flat bed (impressão usando quadros planos) e em roll-to-roll (rolo a rolo), como apresentado na Figura 9. A utilização de serigrafia rolo a rolo permite impressões a velocidades superiores e em maior escala do que a serigrafia flat bed, que em geral processa-se “folha a folha”, que é uma vertente da técnica mais utilizada em investigação e desenvolvimento. Esta vertente da técnica permite também a utilização de substratos rígidos, algo que em rolo a rolo não é possível. Figura 9 – Fotografias dos aparelhos das técnicas de serigrafia. A – Folha a folha. B – Rolo a rolo. 2.1.1.b. Impressão a Jato de Tinta Apesar da técnica de jato de tinta ser utilizada há alguns anos no fabrico de sensores, só atualmente se tem tornado mais proeminente nessa área devido ao seu baixo custo e por permitir a deposição de pequenas quantidades de tinta para a impressão. As principais vantagens são a elevada resolução da técnica e ser uma técnica digital (a impressão é feita diretamente a partir do computador) [27]. Esta técnica baseia-se na deposição de pequenas gotas de tinta num substrato, com grande precisão e reprodutibilidade, existindo pelo menos quatro tipos distintos de impressão a jato de tinta: térmica, piezoelétrica, eletrostática e acústica. Os mais utilizados são a impressão a jato de tinta térmica e a impressão a jato de tinta piezoelétrica, que se encontram esquematizadas na Figura 10 [24, 26]. A B 16 Capítulo 2 Técnicas Figura 10 – Ilustração do processo de impressão a jato de tinta. A – Impressão piezoelétrica [27]. B – Impressão térmica [26]. A impressão a jato de tinta térmica é uma técnica mais simples, não requerendo um controlo tão preciso da viscosidade da tinta, no entanto, caso sejam utilizados componentes biológicos no sensor, estes poderão desnaturar, o que não acontece com a impressão a jato de tinta piezoelétrica [26]. Isto porque os biossensores contêm como elemento de reconhecimento biológico, por exemplo, enzimas, que poderão desnaturar com o calor, levando a perdas de grande parte, ou mesmo toda, a sua atividade, tornando o sensor inviável. Existem sensores de glucose impressos pela técnica de jato de tinta, em que se evidenciam a sua reprodutibilidade e baixo custo [8]. 2.1.1.c. Rotogravura Na técnica de rotogravura, o padrão que queremos que seja impresso encontra-se gravado num cilindro de impressão. Ao longo da impressão, esse padrão é preenchido com tinta, seguidamente é retirado o excesso dessa tinta e por fim o rolo é pressionado contra o substrato, imprimindo assim os padrões, tal como esquematizado na Figura 11A [26]. Figura 11 – Ilustração de dois processos de rolo a rolo [26]. A – Gravura. B – Flexografia. A B Substrato Bocal Colapso das bolhas Ejetor de tinta Formação de bolhas Remoção da tinta Resistência térmica Substrato Gotas de tinta Direção da gota Fornecimento de tinta Transdutor de pressão Dados Rotação Rotação A B FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 17 Tipicamente, a rotogravura é uma técnica com grande velocidade de impressão, sendo utilizada para a impressão de filmes metálicos, plásticos e até mesmo notas bancárias [29]. Também é utilizada para a impressão de sensores eletroquímicos de diferentes espécies químicas tais como sulfeto de cádmio [32, 33]. 2.1.1.d. Flexografia Na flexografia o processo de impressão consiste na aplicação de um filme uniforme de tinta sobre o padrão que reveste o rolo de impressão, tal como se encontra representado na Figura 11B. Este rolo, com a tinta, entra em contacto com o substrato, transferindo o padrão do rolo para esse substrato [26]. A flexografia é assim muito similar à rotogravura. As principais diferenças entre as duas técnicas são na pressão exercida, que é maior na flexografia, e na velocidade de impressão, que é menor na flexografia. Por outro lado, a técnica de rotogravura tem um custo associado superior à flexografia mas o tempo de vida do rolo dessa técnica de impressão é tipicamente muito superior [32].A flexografia é utilizada, por exemplo, na impressão direta de anticorpos em substratos flexíveis [33]. 2.1.2. Materiais Uma das variáveis mais importantes das técnicas de impressão são as tintas escolhidas. A preparação e seleção das tintas dependem da aplicação futura do sensor impresso, podendo ser tintas curáveis por UV, condutoras, eletroluminescentes, entre outras. Todas estas tintas têm que ter elevada viscosidade, o que depende do fabricante e do seu uso específico, sendo importante conhecer a flexibilidade/rigidez do substrato e os tempos de cura recomendáveis da tinta [34]. Os materiais que tipicamente constituem as tintas serigráficas são: resina (também referida como agente ligante), que une as partículas da tinta e permite a sua aderência ao substrato, e solventes, que se encontram dissolvidos na tinta e que são transferidos para a superfície de impressão. Em alguns casos, na constituição da tinta existem também aditivos, que alteram as propriedades físicas da tinta, e pigmentos, responsáveis pela cor da tinta e pela sua opacidade [34]. Na Tabela 2 são apresentadas algumas das principais tintas usadas no fabrico de sensores eletroquímicos e as suas vantagens e desvantagens. 18 Capítulo 2 Técnicas Tabela 2 – Exemplos de algumas das principais tintas e respetivas vantagens e desvantagens [32–35]. Materiais/ Tintas Vantagens Desvantagens Carbono/ Grafite Baixo custo; reatividade eletroquímica atrativa; biologicamente inerte. Possui correntes residuais; baixa condutividade. Platina Baixa taxa de formação de fissuras no padrão de impressão após a cura; adequado para fornos de altas temperaturas. Elevadas temperaturas de cura; elevado custo. Ouro Muito inerte, biologicamente compatível. Elevado custo. Prata/ Cloreto de Prata Quimicamente resistente; elevada reversibilidade; elevada densidade de corrente; elevada condutividade; baixas temperaturas de cura. Baixa durabilidade. Prata Boa condutividade. Oxidação em contacto com soluções aquosas ou o ar. 2.1.3. Substratos Os elétrodos impressos consistem em filmes depositados sobre um substrato inerte. Os substratos podem dividir-se em duas grandes categorias: (i) substratos flexíveis, tais como materiais poliméricos (como por exemplo PET e PVC) e o papel, e (ii) substratos rígidos como por exemplo vidro e cerâmica [38]. Quando não é necessário que o substrato seja flexível, é preferível que a impressão seja sobre um substrato rígido, por norma o vidro, que tem um menor custo do que a cerâmica e que permite igualmente elevadas temperaturas de cura, tendo uma superfície tanto quimicamente como termicamente estável [38]. Apesar de o vidro ser muito utilizado em detrimento do substrato de cerâmica, este último permite, em geral, obter melhores resultados, maior sensibilidade e seletividade [38]. Caso seja possível, este acaba sempre por ser preferível ao vidro, mas também tem um maior custo associado. Na Tabela 3 encontram-se alguns dos substratos mais utilizados e as suas vantagens e desvantagens. Tabela 3 – Exemplos de alguns dos principais substratos e respetivas vantagens e desvantagens [36, 37]. Substratos Vantagens Desvantagens Cerâmica Permite elevadas temperaturas de cura; superfície regular; impermeável a água e oxigénio. Não é flexível; impossibilidade de utilização nas técnicas rolo a rolo; custo elevado. Vidro Permite elevadas temperaturas de cura; transparente; superfície regular; quimicamente e termicamente estável; impermeável a água e oxigénio. Pode ser considerado um substrato flexível se tiver uma espessura <200µm. Impossibilidade de utilização nas técnicas rolo a rolo. O vidro flexível é difícil de utilizar e extremamente frágil. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 19 Polimérico (PET; PVC) Transparência; flexibilidade; diferentes gamas de espessura; elevada resistência ao solvente. Deformação do material devido à cura. Papel Cor branca; grande compatibilidade com amostras biológicas; bastante flexível; diferentes gamas de espessura. Efeito indireto na espessura do filme devido à elevada absorvância do substrato. Neste trabalho foram utilizados substratos flexíveis, nomeadamente PET, devido ao seu baixo custo e elevada resistência ao solvente e vidro para a realização de testes de caracterização por perfilometria. Como o PET sofre deformação a elevadas temperaturas de cura, este foi sujeito a um pré-tratamento térmico antes de ser utilizado na impressão. Durante a impressão do sensor sobre o substrato, é necessário ter alguns fatores em conta, tal como as propriedades óticas do material, pois existem diversos sensores transmissivos que necessitam de substratos transparentes e com superfície plana. A rugosidade é outro parâmetro importante da superfície, sendo que o seu valor ideal depende muito do tipo de sensor pretendido. Quando nos referimos a sensores eletroquímicos, um valor elevado da rugosidade é relevante, pois leva a um aumento da área ativa do sensor, aumentando a resposta do mesmo [39]. Por sua vez, as propriedades químicas do substrato estão relacionadas com a sua impermeabilidade, a libertação de eventuais contaminantes e a capacidade de este ser suficientemente inerte a nível químico de modo a não sofrer alterações ao longo de processos químicos, como por exemplo à funcionalização do elétrodo de trabalho com substâncias biológicas [39]. Geralmente, a cura de sensores impressos é térmica, ou seja, é feita a altas temperaturas, sendo por isso importante conhecer as propriedades térmicas e termomecânicas dos substratos. A temperatura a que se utiliza o sensor e a que ocorre a cura deve ser compatível com a temperatura máxima de utilização do substrato, caso contrário é necessário um pré-tratamento do substrato em questão. 2.1.4. Design A técnica de serigrafia permite a impressão de diversos sensores com as mesmas características e com baixo custo de fabrico. Mas antes de imprimir os sensores e até mesmo de escolher o substrato e as tintas a utilizar, é importante ter definido o padrão do sensor que se quer utilizar. Este padrão varia dependendo da utilização do sensor [24, 25]. No caso dos sensores com um sistema de três elétrodos há fatores importantes a ter em conta quando se escolhe o padrão, especialmente a razão entre a área do 20 Capítulo 2 Técnicas elétrodo auxiliar e a do elétrodo de trabalho. É entre o elétrodo de trabalho e o elétrodo auxiliar que existe passagem de corrente elétrica, sendo importante que a área do elétrodo auxiliar seja superior à do elétrodo de trabalho. Tal impede o bloqueio da superfície do elétrodo, a polarização e a eventual passivação resultante da formação de uma camada protetora sobre a superfície do elétrodo, devido à corrente aplicada [38, 39]. Na figura 5A, apresentada anteriormente, é possível observar um sensor com um sistema de três elétrodos. Na Tabela 4 são apresentadas dimensões de diferentes SPEs de algumas marcas comerciais. Tabela 4 – Dimensões de diferentes biossensores impressos, por marca [4, 41, 42]. Marca Ø ET (mm) Área ER (mm) Rácio entre áreas (EA/ ET) Bio Logic 2 0,5 x 1 4/1 DropSens 4 – a) – a) Gwent 2 – a) – a) a) Informação não disponibilizada pelo fabricante. Nos exemplos que se encontram na Tabela 4 apenas o fornecedor Bio Logic disponibiliza a razão entre a área do elétrodo auxiliar e a área do elétrodo de trabalho, sendo a área do elétrodo auxiliar quatro vezes superior à área do elétrodo de trabalho. 2.1.5. Funcionalização de Elétrodos Existem diversos métodos de imobilização de substâncias químicas ou biológicas na superfície do elétrodo de trabalho. O objetivo é, no caso das substâncias biológicas, conseguir estabelecer uma ligação entre, por exemplo, a enzima e a superfície do transdutor sem bloquear o centro ativo da enzima ou alterar a sua conformação, o que poderá levar a uma perda da sua atividade biológica. Alguns destes métodos, indicados na Figura 12, foram melhorados ao longo do tempo para minimizar as alterações conformacionais da molécula imobilizada. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 21 Figura 12 – Métodos de funcionalização de elétrodos impressos biológicos. No caso da enzima depositada diretamente sobre o sensor, esta deverá ter uma elevada velocidade máxima de reação (VM), o que ocorre quando as enzimas estão saturadas, e baixos valores da constante de Michaelis-Menten (KM), que é equivalente à concentração de substrato necessário para atingir metade da velocidade máxima da reação e que indica a afinidade da enzima pelo substrato [2]. Quanto menor for o valor de KM maior é a afinidade da enzima ao substrato, atingindo-se com maior facilidade metade do valor da velocidade máxima de reação. O tipo mais comum de deposição, em solução, consiste numa deposição sequencial de camadas de materiais que irão constituir o elétrodo de trabalho. A camada do componente biológico do sensor é depositada sobre uma camada já formada anteriormente quer por adsorção física, eletropolimeralização, imobilização por cross linking ou aprisionamento, como se pode observar na Figura 13 [43]. Métodos de Funcionalização do Componente Biológico Deposição por solução em multicamada Adsorção Cross Linking Aprisionamento Eletropolimeralização Deposição por tinta/pastas Multicamada Único passo Figura 13 – Métodos de imobilização do elemento de reconhecimento biológico no elétrodo impresso, aquando da preparação de um biossensor [43]. Elétrodo impresso Biomoléculas Matriz (ex. gel, polímero, pasta ou tinta) Reagente de Cross Linking Processo de Imobilização Adsorção Cross Linking Aprisionamento 28 Capítulo 2 Técnicas Figura 17 – Efeito do aumento da velocidade de varrimento. – Reação reversível, menores velocidades de varrimento. ---- Reação irreversível, maiores velocidades de varrimento [5]. Para sistemas quasi-reversíveis verifica-se que [47],  |ip| aumenta com v12 ⁄, mas não proporcionalmente;  Ep,c varia inversamente com o aumento de v;  ∆Ep é superior a 59/n mV, aumentando proporcionalmente com o valor de v;  Se αc= αa= 0,5, |ip,a/ip,c|=1. 2.2.1.b. Cronoamperometria O estudo da variação da resposta da corrente com o tempo denomina-se cronoamperometria, constituindo um dos métodos eletroanalíticos mais utilizados [5]. A cronoamperometria é muito utilizada no estudo de sensores, devido à sua simplicidade, sendo uma técnica que permite fixar um potencial de interesse característico do analito, minimizando o ruído de fundo que poderá afetar o limite de deteção. Na Figura 18 encontra-se um exemplo de um cronoamperograma, um gráfico da intensidade de corrente ao longo do tempo. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 29 Figura 18 – a – Perfil do potencial aplicado ao longo do tempo. b – Variação da intensidade da corrente ao longo do tempo, cronoamperograma. Na cronoamperometria a variação de corrente devida a um determinado processo faradaico pode ser descrita através da equação de Cottrell [48], i =nFAD0 1 2 c0 π1 2 t1 2 (9) em que i é intensidade de corrente, n é o número de moles do analito, F é a constante de Faraday, A a área do elétrodo de trabalho, D o coeficiente de difusão, c a concentração da espécie oxidada e t o tempo. Sabendo o número de moles, pode-se aplicar a equação 9 para determinar o coeficiente de difusão. 2.2.2. Técnicas de Caracterização Elétrica 2.2.2.a. Resistência de folha A resistência elétrica é a capacidade que um material condutor tem de se opor à corrente elétrica, sendo representada por [49], R = ρl At (10) em que ρ é a resistividade, uma constante dependente da natureza do material condutor, l o comprimento do material e At a área transversal desse mesmo material [49]. Em geral, o método de duas pontas é usado para medir a resistência de um material [50]. A partir desta técnica é possível determinar a resistência de folha (Rs) de uma amostra. A resistência de folha é uma propriedade utilizada em amostras com a mesma espessura ao longo de todo o seu comprimento, sendo muito utilizada na caracterização de filmes. Visto a resistência ser um valor dependente da área 30 Capítulo 2 Técnicas transversal e do comprimento da amostra, é possível determinar a resistência de folha utilizando-se amostras em que a largura é igual ao comprimento, tendo-se [50], Rs = ρ 𝜏 (11) 2.2.2.b. Perfilometria É possível utilizar a técnica de perfilometria para quantificar a espessura e rugosidade de diversos materiais, sendo utilizado um equipamento chamado perfilómetro, que permite analisar a topografia da superfície de uma amostra sólida. Através da análise da superfície, esta técnica permite determinar o valor da espessura e, obter valores da rugosidade da superfície da amostra e perfis dessa mesma superfície [51]. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 31 3. Execução Experimental Neste capítulo será feita uma breve descrição dos procedimentos experimentais da impressão e caracterização do elétrodo de trabalho impresso e do sistema de três elétrodos impressos antes e após as modificações com CoPC e AOX. 3.1. Solventes e Reagentes As tintas utilizadas na impressão dos sensores foram obtidas comercialmente e usadas tal como recebidas, com exceção da tinta à base de carbono, que no fabrico de sensores modificados, foi misturada com ftalocianina de cobalto(II), CoPC (Alfa Aesar). Para além da tinta à base de carbono foram usadas tintas comerciais à base de prata e de prata/cloreto de prata. Para caracterização dos sensores com e sem modificação foi utilizada uma sonda eletroquímica, hexacianoferrato(III) de potássio (Merck, para análise). Em todos os estudos, a sonda eletroquímica foi utilizada numa concentração de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Após a primeira modificação, com CoPC, realizaram-se estudos eletroquímicos com peróxido de hidrogénio (Aldrich, 33%) e tampão fosfato (Panreac, fosfato dipotássio e fosfato monopotássio). Na segunda modificação do elétrodo de trabalho foi usada a enzima álcool oxidase (Sigma, solução aquosa tamponada) solubilizada em 0,1 M PBS pH=7,4, para deteção de etanol (Aga, 99,5%). 3.2. Impressão de sensores Todo o processo de impressão foi realizado recorrendo-se à técnica de serigrafia, utilizando uma máquina de serigrafia RP 2.2., da Roku Print. Inicialmente, antes de se iniciar a impressão, foi necessário alinhar, manualmente, o quadro que contém os padrões para a impressão do sensor. Em todas as impressões, ajustaramse os seguintes parâmetros: pressão da raclete no quadro, velocidade da raclete e distância da tela ao substrato durante a impressão (snap off). O quadro utilizado ao longo deste trabalho tinha uma tela de poliéster, tendo uma mesh de 68 cm-1 e fios de 55 µm. Durante a impressão a inclinação da raclete em relação à tela foi de 25º, e o snap off, ou seja, o espaço entre a tela e o substrato, tinha valores compreendidos entre os 3 - 5 cm. Usou-se tinta à base de carbono para a impressão do elétrodo de trabalho e do elétrodo auxiliar, tinta à base de prata para os contactos sob os elétrodos e tinta à base de prata/cloreto de prata para o elétrodo de referência. 32 Capítulo 3 Execução Experimental Entre cada camada, os sensores sofreram uma cura térmica durante 15 minutos a 130 ºC. No capítulo 4 será descrito com maior detalhe o processo de fabrico dos sensores. 3.3. Caracterização do Elétrodo de Trabalho O elétrodo de trabalho foi caracterizado eletricamente, determinando-se a sua resistência de folha, e electroquimicamente, por voltametria cíclica e cronoamperometria. Também se recorreu à técnica de perfilometria para determinar a variação da espessura e rugosidade das amostras. 3.3.1. Caracterização Elétrica pelo Método de Duas Pontas Foram realizados estudos elétricos para determinação da variação da resistência de folha com a variação do número de camadas de tinta à base de carbono que constituíam o elétrodo de trabalho, pelo método de duas pontas, medindo-se a intensidade de corrente elétrica para as distintas diferenças de potencial aplicadas. Neste estudo foi utilizado um pico amperímetro/fonte de tensão Keithley 6487. 3.3.2. Perfilometria Foram impressos filmes de carbono, com diferentes espessuras, em lâminas de vidro, cuja superfície plana e rígida facilitou a determinação da espessura e rugosidade dos filmes por perfilometria. Foi usado um perfilometro Alpha-Step® D-100, de modo a determinar as variações na superfície topográfica dos filmes. O varrimento realizado pela agulha do perfilometro foi desde a superfície lisa (do vidro) até cerca de metade da superfície impressa do elétrodo de trabalho, tendo sido também determinada a rugosidade dos filmes. 3.3.3. Caracterização Eletroquímica Na caracterização eletroquímica, por voltametria cíclica e cronoamperometria, utilizou-se um potencióstato, modelo Autolab PGSTAT 302N, da Metrohm. Realizaram-se dois pré-tratamentos eletroquímicos distintos, nos quais foram usadas soluções de 0,1 M tampão fosfato pH=7,4 (PBS) e de 0,2 M ácido sulfúrico (H2SO4). No pré-tratamento com PBS aplicou-se uma diferença de potencial de 1,5 V durante 60 s [1]. Quando se utilizou H2SO4, procedeu-se a um varrimento de potencial durante dois ciclos completos, com potenciais entre os 0,9-1,5 V e uma velocidade de varrimento de 100 mV.s-1 [52]. Verificou-se que o pré-tratamento com PBS era mais FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 33 eficaz, tendo este sido aplicado previamente a todos os sensores impressos salvo indicação em contrário. Nos estudos eletroquímicos com elétrodos comerciais foi utilizado um elétrodo de carbono vítreo (BASi, 3 mm Ø), um elétrodo de referência Ag/AgCl (Metrohm) e um elétrodo auxiliar de aço 316. A composição dos elétrodos impressos encontra-se descrita na secção 3.2. Durante o estudo por voltametria cíclica, o intervalo de varrimento nos sensores não modificados foi de -1,0 V a 1,0 V e no caso dos sensores modificados foi tipicamente de -0,2 V a 1,0 V. A velocidade de varrimento foi de 10 mV, exceto indicação em contrário, como por exemplo nos estudos cinéticos. Durante os estudos cronoamperométricos, em que se utilizou o método da adição padrão, foi aplicado um potencial de 0,3 V ao elétrodo, sendo usada uma solução de 0,1 M PBS pH=7,4. Durante os estudos, com os sensores impressos, da deteção de H2O2, foram adicionadas sucessivas alíquotas de 10 µL de 4,85 mM de H2O2 à solução de PBS. Para a deteção de etanol, e na presença da enzima AOX, foram adicionadas sucessivas alíquotas de 10 µL de etanol 99,5% (o que equivale a uma concentração de 17 M) à solução de PBS. 3.4. Modificação do Elétrodo de Trabalho com CoPC Foi adicionada CoPC à tinta à base de carbono, numa proporção de 5% m/m. Esta mistura foi homogeneizada recorrendo a um almofariz, utilizando-se de seguida a tinta para a impressão de sensores. Utilizou-se tinta à base de carbono modificado com CoPC para a impressão do elétrodo de trabalho, tinta à base de carbono não modificado para a impressão do elétrodo auxiliar, tinta à base de prata para os contactos sob os elétrodos e tinta à base de prata/cloreto de prata para o elétrodo de referência. 3.5. Modificação do Elétrodo de Trabalho com AOX Foram utilizadas três abordagens distintas para a modificação do elétrodo de trabalho com AOX. Na primeira abordagem apenas se realizou a deposição por gota de uma solução de enzima no elétrodo de trabalho, na segunda abordagem, usou-se uma membrana de nitrocelulose (Merck, 0,45 µm, 13 mm Ø) sobre a camada de enzima, e na última abordagem foi usada uma solução de ágar-ágar para revestir a camada de enzima. Segue-se uma descrição detalhada de cada abordagem, sendo o procedimento inicial comum. 34 Capítulo 3 Execução Experimental Após a impressão dos sensores, e respetivo pré-tratamento com 0,1 M PBS pH=7,4, foi depositada uma gota com 5 µL de solução de AOX na superfície do elétrodo. Aguardou-se cerca de 4 horas até o solvente da solução de enzima evaporar completamente, observando-se a formação de uma película transparente e brilhante à superfície do elétrodo de trabalho. No caso da utilização de uma membrana de nitrocelulose (Merck, 0,45 µm, 13 mm Ø), colocou-se a membrana durante algum tempo numa solução de 0,1 M PBS pH=7,4 e seguidamente colocou-se essa membrana sobre o sensor, protegendo toda a superfície do mesmo. Recorreu-se a um filme plástico adesivo, tal como observado na Figura 19, para fixar a membrana sobre a superfície do sensor. Na última abordagem, preparou-se uma solução de ágar-ágar com 0,1 g de ágar-ágar e 10 mL de água, a qual foi aquecida até ao ponto de ebulição, deixando-se a solução em agitação até o ágar-ágar se dissolver totalmente. Seguidamente colocaram-se algumas gotas dessa solução sobre a superfície do elétrodo de trabalho onde anteriormente se havia colocado a solução com AOX, deixando-se gelificar. Figura 19 – Fotografia do sensor impresso após ter sido colocada uma membrana de nitrocelulose sobre o sensor e seguidamente um filme plástico adesivo. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 35 4. Impressão de sensores 4.1. Design Para o sensor impresso foi necessário desenhar três padrões distintos para a tela de serigrafia, recorrendo ao programa CorelDraw X6. Cada padrão corresponde a uma diferente camada e/ou tinta que foi utilizada durante a impressão. Recorrendo às informações disponibilizadas por fabricantes de sensores eletroquímicos impressos, apresentadas na Tabela 4, e sabendo que o principal parâmetro a considerar é a razão entre a área do elétrodo auxiliar e a do elétrodo de trabalho (secção 2.1.4), foram desenhados diferentes padrões a partir do padrão principal, também este desenhado e representado na Figura 20. Figura 20 – Desenho técnico do sensor e respetivas medidas em milímetros. Para cada uma das tintas utilizadas foi criado um padrão diferente. Um dos padrões, que seria impresso por tinta à base de prata, foi utilizado para a impressão de pistas condutoras sob os elétrodos, sendo o responsável pelo aumento da condutividade. Outro dos padrões foi utilizado na impressão do elétrodo de referência, utilizando tinta à base de Ag/AgCl. O último padrão foi utilizado na impressão dos elétrodos de trabalho e auxiliar, recorrendo a tinta à base de carbono. O sensor final teria três padrões, apresentados na Figura 21. No caso do presente trabalho, a razão da área do elétrodo auxiliar e do elétrodo de trabalho é 1,26:1. Tal como referido no capítulo 2.1.4., o valor da área do elétrodo auxiliar tem que ser superior à do elétrodo de trabalho. 36 Capítulo 4 Impressão de Sensores Figura 21 – Design dos padrões que compõem o sensor. Prateado – Contactos em que se utiliza tinta à base de prata. Laranja – Elétrodo de referência em que se utiliza tinta à base de Ag/AgCl. Preto – Elétrodo de trabalho e auxiliar em que se utiliza tinta à base de carbono. Estes padrões foram impressos uns sobre os outros, com a posição relativa e ordem esquematizadas na Figura 22. Figura 22 – Design do sensor após a sobreposição dos diferentes padrões, utilizando uma tinta diferente por padrão. 4.2. Constituição dos sensores impressos Tal como referido anteriormente, foi necessário realizar diferentes impressões, padrão a padrão, para obter o sensor final. Para além disso, dependendo do estudo que se pretendia realizar, a tinta utilizada para os elétrodos de trabalho e auxiliar foi tinta à base de carbono comercial, sem modificação, ou tinta à base de carbono misturada com o complexo de cobalto utilizado ao longo deste trabalho, CoPC, tal como indicado na Tabela 5. Tabela 5 – Constituição dos sensores impressos. Contactos Elétrodo de Trabalho Elétrodo Auxiliar Elétrodo de Referência Sensor não Modificado Prata Carbono Carbono Ag/AgCl Sensor Modificado Prata Carbono modificado com CoPC (5% m/m) Carbono Ag/AgCl FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 37 Os sensores não modificados foram utilizados essencialmente para a otimização do sensor. Os sensores modificados com CoPC teriam como objetivo a deteção de peróxido de hidrogénio ou, mais tarde, a deteção de etanol, recorrendo-se à enzima AOX. 4.3. Implementação da Técnica Durante todo o projeto foi utilizada a técnica de serigrafia para impressão dos sensores desenvolvidos e estudados, tendo sido necessário implementar um novo método para melhoramento desse processo, nomeadamente, a nível de alinhamento. Um dos grandes problemas durante o alinhamento da tela, onde se encontram os padrões dos sensores, é que ao longo do tempo esta acaba por se deformar, levando a que os padrões não estejam sempre na mesma posição, o que dificulta o seu alinhamento. Dessa forma, optou-se por alinhar o quadro de cada vez que se tinha que mudar de padrão e/ou tinta. Após se proceder ao alinhamento de um dos padrões, era colado à mesa de impressão um molde em PET onde se poderiam encaixar as amostras de substrato, o que permitia que o padrão fosse impresso sempre na mesma posição sobre as diferentes amostras de substrato, tal como apresentado na Figura 23. Figura 23 – Processo de alinhamento e impressão dos sensores, pela técnica de serigrafia. A – Padrão escolhido. B – Encaixe das amostras. C – Fotografia antes de impressão. D – Fotografia após impressão. E – Sensor impresso com circuito de prata. Este método de alinhamento permitiu que se fizessem diversas impressões no mesmo sensor, para aumentar o número de camadas de determinado elétrodo, mantendo um alinhamento satisfatório. A B C D 44 Capítulo 5 Otimização e Caracterização do Elétrodo de Trabalho -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -120 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 E (vs Ag/AgCl) / V i / A Gráfico 4 – Voltamograma obtido com elétrodo de carbono impresso sem revestimento, com picos representativos de metais. E1 = 0,11 V. E2 = -0,29 V. Solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de varrimento = 0,01 V.s-1. O voltamograma representado no Gráfico 4 apresenta um pico anódico e um pico catódico, ambos típicos de um processo de oxidação-redução de um metal [54], apesar de o sistema de três elétrodos estar mergulhado numa solução de hexacianoferrato(III) de potássio. Uma das possíveis razões para o aparecimento destes picos seria a oxidação da prata, proveniente da impressão do padrão condutor, devido ao seu contacto com a solução durante a voltametria cíclica. Posteriormente foram feitos testes com o mesmo elétrodo mas desta vez com a superfície condutora de prata coberta por um filme plástico adesivo, como apresentado na Figura 27, para impedir o contacto da solução com a superfície de prata. O resultado obtido pode ser verificado no Gráfico 5. Figura 27 – Elétrodo de trabalho impresso com revestimento. E2 E1 FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 45 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -20 -15 -10 -5 0 5 10 E (vs Ag/AgCl) / V i / A Gráfico 5 - Voltamograma obtido com elétrodo de carbono impresso com revestimento. E1 = 0,82 V. E2 = -0,70 V. Solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de varrimento = 0,01 V.s-1. Ao fazer esta alteração deixou-se de observar os picos típicos do processo de oxidação-redução da prata, sendo possível observar os picos referentes ao processo redox da sonda eletroquímica de hexacianoferrato(III) de potássio. A partir destes resultados foi possível afirmar que, de forma a garantir que a prata não interfira com os ensaios realizados, é necessário a existência de uma camada de revestimento sobre o sensor, para proteger a camada condutora de prata que é impressa sob os elétrodos. 5.3. Variação da Espessura do Elétrodo de Trabalho Ao analisar os resultados, e sabendo que uma das desvantagens da tinta de carbono é ter uma elevada resistência de folha que, de acordo com a equação 11, é inversamente proporcional à espessura do elétrodo de trabalho do sensor, fizeram-se diversos sensores não apenas com uma, mas com duas, três e quatro camadas de carbono no elétrodo de trabalho. Foram feitos testes de caracterização eletroquímica e elétrica a esses diferentes sensores, a fim de verificar se o sinal eletroquímico melhorava com o aumento do número de camadas. Também foi analisada a espessura e rugosidade da superfície do elétrodo de trabalho, recorrendo à técnica de perfilometria. E2 E1 46 Capítulo 5 Otimização e Caracterização do Elétrodo de Trabalho 5.3.1. Caracterização Eletroquímica Foram utilizados quatro sensores diferentes, que tinham várias espessuras, ou seja, diferente número de camadas de tinta à base de carbono. Utilizando uma solução de 2,5 mM de sonda eletroquímica a pH=7,4, foram obtidos os resultados apresentados no Gráfico 6. -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 E (vs Ag/AgCl) / V i / mA.cm-2 1 camada de carbono 2 camadas de carbono 3 camadas de carbono 4 camadas de carbono Carbono Vitreo Gráfico 6 – Voltamogramas obtidos com variação do número de camadas, de tinta à base de carbono, do elétrodo de trabalho impresso e elétrodo de carbono vítreo comercial. Solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de varrimento = 0,01 V.s-1. Os testes eletroquímicos permitiram verificar que, à medida que se aumentava o número de camadas, o pico anódico deslocava-se para potenciais menos positivos e o pico catódico para potenciais menos negativos, ou seja, o elétrodo de trabalho de carbono com uma maior espessura apresenta uma maior reversibilidade eletroquímica do processo redox da sonda à superfície do elétrodo. Este resultado permitiu concluir que o comportamento do sistema melhorou com o aumento do número de camadas. Assim sendo, todos os estudos futuros foram feitos com sensores com quatro camadas de tinta à base de carbono. Apesar desta melhoria, os valores de intensidade de corrente obtidos com o sensor de três elétrodos impressos são inferiores comparativamente aos valores obtidos com o sistema de três elétrodos não impressos e comerciais, em que o elétrodo de trabalho é de carbono vítreo. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 47 5.3.2. Caracterização Elétrica Seguidamente mediu-se a espessura das amostras, utilizando a técnica de perfilometria (secção 3.3.2), tendo-se obtido os resultados apresentados no Gráfico 7. Gráfico 7 – Aumento da espessura do elétrodo de trabalho impresso em função do número de camadas impressas. Pelo Gráfico 7 foi possível confirmar-se que a espessura do filme aumenta linearmente com o aumento do número de camadas. De seguida, foi determinada a resistência de folha, utilizando a técnica de duas pontas (secção 3.3.1) e, estabelecida a relação dos seus valores com a variação da espessura das amostras, obtendo-se os resultados apresentados no Gráfico 8. Gráfico 8 – Aumento da resistência de folha do elétrodo de trabalho impresso em função do inverso da espessura. y = (10±1)x - (4±3) R² = 0,98 0 10 20 30 40 012345 𝜏/ µm Número de Camadas y = (712±46)x -(1±4) R² = 0,99 0 20 40 60 80 100 120 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 Rs/Ω.sq-1 𝜏-1 / µm-1 48 Capítulo 5 Otimização e Caracterização do Elétrodo de Trabalho Como se pode observar no Gráfico 8, verificou-se que a resistência de folha varia linearmente com o inverso da espessura, ou seja, quando maior a espessura do elétrodo de trabalho menor é o valor da resistência de folha. Ao observar estes resultados, pode-se colocar a hipótese de o melhoramento do sinal eletroquímico, com o aumento da espessura do sensor, estar relacionado com a correspondente diminuição da resistência de folha, de acordo com a equação 11. Utilizando a técnica de perfilometria, foi também analisada a variação da topografia da superfície do elétrodo, a rugosidade, à medida que se aumentava o número de camadas do elétrodo de trabalho, tendo-se obtido os resultados apresentados no Gráfico 9. Gráfico 9 – Variação da rugosidade do elétrodo de trabalho impresso em função do número de camadas impressas. Tal estudo foi realizado porque, quando maior é a rugosidade, maior é a área ativa do sensor, o que no caso dos sensores eletroquímicos poderá ser uma vantagem (secção 2.1.4), querendo-se verificar se o aumento da espessura levava a um aumento ou diminuição da rugosidade, ou se não estaria relacionado com este parâmetro. Pelo Gráfico 9 pode-se afirmar que existe uma relação de linearidade entre o aumento da espessura do elétrodo de trabalho e o aumento da rugosidade. Após a análise destes resultados, concluiu-se que existem dois parâmetros que poderão ser a causa para a melhoria da resposta eletroquímica do sensor com o aumento da espessura, nomeadamente a diminuição da resistência de folha e o aumento da rugosidade. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 49 5.4. Sistemas de Três Elétrodos Impressos Após os testes com o elétrodo de referência e auxiliar comerciais e o elétrodo de trabalho impresso, foram feitos testes com sistemas de três elétrodos impressos, apresentando-se na Figura 28 um exemplo. Foram estudados diversos sensores com quatro camadas de tinta à base de carbono no elétrodo de trabalho e auxiliar e apenas uma camada de tinta à base de Ag/AgCl no elétrodo de referência. Estes sensores foram revestidos por um filme plástico adesivo, de forma a impedir a oxidação da tinta condutora de prata. Figura 28 – Sistema de três elétrodos impressos. 5.4.1. Pré-tratamento Com o objetivo de obter um melhor comportamento eletroquímico, foram feitos testes com sensores impressos que tinham sido submetidos aos pré-tratamentos referidos na secção 5.1, tanto com H2SO4 como com PBS. Os resultados encontramse apresentados no Gráfico 10. 50 Capítulo 5 Otimização e Caracterização do Elétrodo de Trabalho -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 i / A E (vs Ag/AgCl) / V Gráfico 10 – Voltamogramas obtidos com sistema de três elétrodos impressos antes e após pré-tratamento. Solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de varrimento = 0,01 V.s-1. – Antes do pré-tratamento. – Após pré-tratamento com 0,2 M H2SO4. – Após pré-tratamento com 0,1 M PBS pH=7,4. Após a análise dos picos anódicos e catódicos apresentados no Gráfico 10, é possível verificar que o sensor sem tipo algum de pré-tratamento é o que tem o pior comportamento eletroquímico. O comportamento eletroquímico do sistema, ao efetuarse o pré-tratamento com H2SO4, melhora, tanto nos valores de potencial, tendo um comportamento mais reversível, como nos valores de corrente, tendo uma maior sensibilidade. Ao efetuar o pré-tratamento com 0,1 M PBS pH=7,4 o sinal eletroquímico melhora ainda mais. Sendo a reação estudada a mesma para os diferentes sensores (antes e após o pré-tratamento), pode-se concluir que a reversibilidade do processo redox da sonda à superfície do elétrodo do sensor aumenta após o sensor ser submetido a um pré-tratamento, especialmente no caso do pré-tratamento com PBS. Para observar o comportamento dos voltamogramas obtidos pelos sensores desenvolvidos, antes e após os pré-tratamentos com H2SO4 e PBS, e compará-los com o voltamograma de um sistema em que o elétrodo de trabalho é um elétrodo de carbono vítreo comercial, é apresentado o Gráfico 11 e a Tabela 7. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 51 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -200 -100 0 100 200 i / A.cm-2 E (vs Ag/AgCl) / V Gráfico 11 – Voltamogramas obtidos com sistema de três elétrodos impressos antes e após pré-tratamento. Solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de varrimento = 0,01 V.s-1. – Antes do pré-tratamento. – Após pré-tratamento com 0,2 M H2SO4. – Após pré-tratamento com 0,1 M PBS pH=7,4. – Carbono vítreo. Tabela 7 – Valores de corrente obtidos para os picos anódico (ip,a) e catódico (ip,c) e respetivos valores de potencial, referentes ao Gráfico 11. Ep,a / V Ep,c / V ip,a / µA ip,c / µA Antes do pré-tratamento 0,63 -0,73 15,06 -19,30 Após pré-tratamento (0,2 M H2SO4) 0,49 -0,23 20,47 -23,40 Após pré-tratamento (0,1 M PBS) 0,24 0,08 38,56 -40,37 Carbono Vítreo 0,35 0,12 230,55 -233,48 Pela Tabela 7 é possível verificar que o sistema com um elétrodo de trabalho impresso, após o pré-tratamento com PBS, apresenta um comportamento similar ao sistema com um elétrodo de carbono vítreo comercial, relativamente aos seus valores de potencial, apesar de ter uma menor intensidade de corrente. Tendo-se verificado 52 Capítulo 5 Otimização e Caracterização do Elétrodo de Trabalho que o comportamento eletroquímico após o pré-tratamento com PBS aumentava a reversibilidade do processo redox da sonda à superfície do elétrodo, foi realizado um estudo mais aprofundado, para confirmação dos resultados obtidos. Este estudo baseou-se na repetibilidade do sistema após o pré-tratamento com 0,1 M PBS pH=7,4. Nos sensores impressos é muito importante garantir a repetibilidade da resposta, para que os resultados não variem de sensor para sensor. Foram assim utilizados três sensores diferentes que tinham sido submetidos ao pré-tratamento com PBS, a fim de verificar se os resultados eram repetíveis, tendo-se obtido os voltamogramas apresentados no Gráfico 12 e cujos valores de corrente e de potencial de pico anódico e catódico se encontram na Tabela 8. -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 E (vs Ag/AgCl) / V i / A Gráfico 12 - Voltamogramas obtidos com solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4 por três sensores diferentes. Velocidade de varrimento = 0,01 V.s-1. Tabela 8 – Valores de corrente obtidos para os picos anódico (ip,a) e catódico (ip,c) e respetivos valores de potencial, referentes ao Gráfico 12. Sensor 1 Sensor 2 Sensor 3 Ep,a / V 0,20 0,23 0,24 Ep,c / V 0,05 0,08 0,08 ∆Ep/ V 0,15 0,15 0,16 ip,a / µA 33,88 35,05 38,56 ip,c / µA -34,06 -36,40 -40,37 FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 53 A partir destes resultados podemos verificar que a média do valor de corrente do pico anódico é 36±2 µA e a do pico catódico é 37±3 µA. A média do valor de potencial do pico anódico é 0,22±0,02 V e do pico catódico 0,07±0,02 V, sendo a média do valor da diferença de potencial (∆Ep) 0,15±0,01 V. Recorrendo à Tabela 7 e ao valor médio de ∆Ep obtido após os estudos exploratórios de repetibilidade do sensor impresso, sabe-se que o valor de diferença de potencial do elétrodo comercial de carbono vítreo é 230 mV, sendo o valor médio de ∆Ep do elétrodo à base de carbono impresso de 150±10 mV. Tal poderá ser indicativo de que reversibilidade do processo redox da sonda à superfície do elétrodo de trabalho impresso é superior à do elétrodo de trabalho comercial de carbono vítreo. Também é possível comparar o valor obtido com os valores apresentados por Morrin et al. [1]. Este grupo desenvolveu diversos sensores impressos e o melhor valor de ∆Ep obtido foi 264 mV, um valor superior ao obtido para os sensores desenvolvidos ao longo desde trabalho. Por estes resultados foi possível confirmar que a reversibilidade do processo redox da sonda à superfície do elétrodo é superior após a aplicação do pré-tratamento com 0,1 M PBS pH=7,4. Tal como referido anteriormente, estes pré-tratamentos têm como objetivo a remoção, da superfície do sensor, de diversas substâncias que poderiam servir de interferentes e diminuir o sinal eletroquímico [1]. Também poderão levar a um aumento da rugosidade da superfície do elétrodo de trabalho, existindo um aumento da área ativa do elétrodo [53]. Podemos confirmar que estes pré-tratamentos, essencialmente o pré-tratamento com PBS, aumentam a reversibilidade do processo redox da sonda à superfície do elétrodo de trabalho com quatro camadas de tinta à base de carbono. Foi ainda feito o estudo microscópico da superfície do sensor, antes e após a modificação com 0,1 M PBS pH=7,4, tendo-se obtido os resultados apresentados na Figura 29. 60 Capítulo 6 Modificação do Elétrodo de Trabalho -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -60 -40 -20 0 20 40 E (vs Ag/AgCl) / V i / A Gráfico 17 – Voltamogramas obtidos em solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de varrimento = 0,01 V.s-1. - - - - Sistema de três elétrodos impressos antes de ser submetido ao prétratamento – Sistema de três elétrodos impressos após pré-tratamento com 0,1 M PBS pH=7,4. Para facilitar a comparação entre os diferentes voltamogramas, os valores de corrente e potencial dos picos anódico e catódico, foram sintetizados na Tabela 9. Tabela 9 – Valores de corrente obtidos para os picos anódico (ip,a) e catódico (ip,c) e respetivos valores de potencial, referentes ao Gráfico 17. Ep,a / V Ep,c / V ip,a / µA ip,c / µA Antes do pré-tratamento 0,34 -0,15 26,65 -28,76 Após pré-tratamento (0,1 M PBS) 0,17 -0,01 33,91 -55,37 Carbono Vítreo 0,35 0,12 230,6 -233,5 Tendo sido verificado um aumento da reversibilidade do processo redox da sonda à superfície do elétrodo de trabalho modificado após o pré-tratamento, tal como no sensor não modificado, foram feitos estudos exploratórios de repetibilidade com os sensores modificados. Neste estudo utilizou-se uma sonda eletroquímica de hexacianoferrato(III) de potássio e recorreu-se a três sensores diferentes, a fim de verificar se após a modificação da tinta, com CoPC e respetivo pré-tratamento, existiriam variações nos valores de corrente e potencial dos picos anódico e catódico dos diferentes sensores. Os resultados encontram-se apresentados no Gráfico 18. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 61 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 E (vs Ag/AgCl) / V i / A Gráfico 18 – Voltamogramas obtidos em solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4 por três sensores diferentes. Velocidade de varrimento = 0,01 V.s-1. Analisando o Gráfico 18, é possível verificar uma variação dos valores de corrente dos picos anódico e catódico, embora os respetivos valores de potencial sejam idênticos para os três sensores. Na Tabela 10 são apresentados os valores referentes aos voltamogramas obtidos. Tabela 10 – Valores de corrente obtidos para os picos anódico (ip,a) e catódico (ip,c) e respetivos valores de potencial, referentes ao Gráfico 18. Sensor 1 Sensor 2 Sensor 3 Ep,a / V 0,17 0,20 0,20 Ep,c / V -0,01 -0,01 -0,02 ∆Ep/ V 0,18 0,21 0,22 ip,a / µA 33,91 30,61 23,17 ip,c / µA -55,37 -43,00 -35,60 A partir destes resultados podemos afirmar que a média do valor de corrente do pico anódico é 29±6 µA e a do pico catódico, em valor absoluto, 45±10 µA. Os valores comprovam que o sensor modificado não tem uma repetibilidade tão elevada comparativamente aos sensores não modificados, o que provavelmente está relacionado com o facto de a mistura de CoPC não ser totalmente uniforme. Provavelmente existe uma menor quantidade de CoPC, para ser oxidada eletroquimicamente, em alguns sensores comparativamente com outros. Se existir menos CoPC a intensidade do sinal poderá ser menor. Este problema poderia ser 62 Capítulo 6 Modificação do Elétrodo de Trabalho ultrapassado estudando-se novos métodos de mistura de ambos os compostos, como por exemplo misturar a ftalocianina de cobalto(II) durante a formulação da própria tinta e não à tinta comercial, já totalmente formulada. As médias dos valores de potencial dos picos anódico e catódico são, respetivamente, 0,19±0,02 V e -0,013±0,006 V. Apesar de grandes variações no valor médio de corrente dos picos, os valores de potencial dos picos são semelhantes, sendo a média de ∆Ep de 0,20±0,02 V. Sabendo que para os sensores sem modificação a ∆Ep do processo redox da sonda é de 150±10 mV e que para o sensor modificado este valor é de 203±20 mV, podemos afirmar que os sistemas com estes elétrodos de trabalho, modificado e não modificado, têm um comportamento semelhante, apresentando uma maior reversibilidade do processo redox da sonda à superfície do respetivo elétrodo do que o elétrodo de trabalho comercial, que tem um valor de ∆Ep de 230 mV. Tal como nos resultados apresentados na secção 5.4.1 para o sensor não modificado, o elétrodo de trabalho modificado também apresenta uma maior reversibilidade do processo redox da sonda à superfície do elétrodo após a aplicação do pré-tratamento com 0,1 M PBS pH=7,4, podendo existir a remoção, da superfície do sensor, de diversas substâncias que poderiam ser interferentes e diminuir o sinal eletroquímico [1], e um possível aumento da rugosidade da superfície [53]. Este prétratamento aumentou a reversibilidade do processo redox da sonda à superfície do elétrodo de trabalho impresso com tinta à base de carbono, modificada com CoPC, no elétrodo de trabalho. Foi também feito um estudo da superfície do elétrodo por microscopia ótica, cujas imagens se encontram na Figura 30. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 63 Por este estudo é possível afirmar, tal como as imagens de microscopia ótica do sensor não modificado, que após o pré-tratamento com 0,1 M PBS pH=7,4, a superfície deste sensor aparenta uma maior uniformidade, o que possivelmente é um indicativo da diminuição do número de impurezas à superfície do sensor [1]. Tal como no sensor não modificado, provavelmente os pontos brancos representam as impurezas, que desaparecem quase na totalidade nas figuras 29C e 29D. Na Figura 30, as prováveis impurezas encontram-se visualmente mais condensadas e em menor quantidade comparativamente com a Figura 29 (secção 5.4.1, imagens microscópicas da superfície do elétrodo de trabalho não modificado). Apesar dessas impurezas existirem em menor quantidade na Figura 30, comparativamente com as impurezas das imagens microscópicas da Figura 29, existem com um maior diâmetro, o que poderá ser devido ao processo de mistura da tinta. Para misturar a ftalocianina de cobalto(II) com a tinta utilizou-se um almofariz, que possivelmente levara a uma coesão das impurezas existentes. Outra hipótese é não estarmos perante apenas impurezas, mas o que estamos a observar serem partículas de CoPC. 6.1.2. Estudo da Estabilidade Tal como no sensor não modificado, foram feitos estudos de estabilidade em que se aferiu quantos ensaios seria possível realizar com o mesmo sensor, se não houvesse alterações na superfície dos elétrodos durante esse ensaio (como por Figura 30 – Imagens obtidas por microscopia ótica do elétrodo de trabalho do sensor impresso. A e B – Antes do pré-tratamento. C e D – Após pré-tratamento com 0,1 M PBS pH=7,4. A C B D 64 Capítulo 6 Modificação do Elétrodo de Trabalho exemplo a formação de novas camadas sobre a superfície do elétrodo). Tal como na secção 5.4.2, foram realizados quatro conjuntos de testes. Em cada um desses testes tinham-se obtido 100 voltamogramas e os últimos voltamogramas de cada um desses conjuntos foram comparados entre si, tal como se observa no Gráfico 19. -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -40 -20 0 20 40 E (vs Ag/AgCl) / V i / A Gráfico 19 – Voltamogramas representativos de cada conjunto de 100 varrimentos, cada cor corresponde a um desses voltamogramas. 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4 por três sensores diferentes. Velocidade de varrimento = 0,01 V.s-1. Este teste, consistiu em quatro conjuntos de ensaios, feitos no mesmo dia e, observando o Gráfico 19, pode-se afirmar que o sensor modificado detetou o sinal da sonda pelo menos 400 vezes, não existindo variações significativas nos valores de potencial e de corrente ao longo destes ensaios. Por fim, para verificar a estabilidade deste tipo de sensores, foram feitos testes com o mesmo sensor, modificado com CoPC, ao longo de um mês. Inicialmente este sensor foi sujeito ao pré-tratamento com PBS e foi feito de imediato o seu voltamograma, após o tratamento. De seguida foram feitos mais três voltamogramas, com uma semana de intervalo entre cada leitura, estando os resultados obtidos representados no Gráfico 20. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 65 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -60 -40 -20 0 20 40 E (vs Ag/AgCl) / V i / A Gráfico 20 – Voltamogramas obtidos com intervalo de uma semana utilizando o mesmo sensor, que fora submetido a um pré-tratamento apenas uma vez. Solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4. Velocidade de varrimento = 0,01 V.s-1. – Primeira Semana. – Segunda Semana. – Terceira Semana. – Quarta Semana. Pela observação do Gráfico 20, é possível concluir que, ao longo das quatro semanas, apesar de os valores de potencial anódico e catódico não variarem muito, o mesmo não acontece com a intensidade de corrente. No primeiro ensaio, comparativamente com os restantes, é visível uma maior intensidade de corrente que diminui para cerca de metade do seu valor inicial nas semanas seguintes. Apesar desta diminuição da primeira para a segunda semana, ao longo das restantes semanas de estudo, o valor de corrente aparenta estabilizar. Tal poderá estar relacionado com a limpeza do elétrodo. No primeiro ensaio o elétrodo tinha acabado de ser “limpo” ao recorrer ao pré-tratamento. O mesmo não havia acontecido durantes as restantes semanas, em que apenas se colocava o elétrodo em solução, sem prétratamento algum feito no momento, de forma a verificar se o primeiro pré-tratamento, feito previamente à primeira utilização do sensor, seria estável ao longo de um elevado período de tempo. 6.1.3. Estudo Cinético Para os sensores modificados com CoPC foi também realizado um estudo cinético, tal como na secção 5.4.3, cujos voltamogramas se observam no Gráfico 21. 66 Capítulo 6 Modificação do Elétrodo de Trabalho -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -250 -200 -150 -100 -50 0 50 100 150 200 i / A.cm2 v = 2 V.s-1 v = 1 V.s-1 v = 0,5 V.s-1 v = 0,2 V.s-1 v = 0,1 V.s-1 v = 0,05 V.s-1 v = 0,04 V.s-1 v = 0,03 V.s-1 v = 0,02 V.s-1 v = 0,01 V.s-1 E (vs Ag/AgCl) / V Gráfico 21 – Voltamogramas obtidos no estudo cinético da solução de 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4 a diferentes velocidades de varrimento. Ao analisar este gráfico, é possível afirmar que um aumento da velocidade de varrimento leva a um aumento da intensidade de corrente e a um deslocamento linear do potencial anódico e catódico para valores mais positivos e mais negativos, respetivamente, apresentado o mesmo comportamento que no sensor não modificado. Para proceder a uma melhor análise da resposta do sensor perante a variação da velocidade de varrimento, foi estudada a variação dos valores de corrente de pico em função da variação da raiz quadrada da velocidade de varrimento tal como apresentado no Gráfico 22. 0,0 0,5 1,0 1,5 -200 -100 0 100 200 v1/2 / V.s-1 i / A Gráfico 22 – Variação do valor de corrente de pico em função da raiz quadrada da velocidade de varrimento. Solução 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4. ■ Pico anódico. × Pico catódico. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 67 Pode-se observar que, tal como no caso do sensor não modificado, a corrente de pico anódica desloca-se para valores mais positivos com o aumento da velocidade de varrimento e a corrente de pico catódico desloca-se para valores mais negativos com o aumento da velocidade de varrimento apesar de não ser uma relação proporcional, o que corresponde ao comportamento descrito por uma reação quasireversível [42]. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 v / V.s-1 E (vs Ag/AgCl) / V Gráfico 23 – Variação dos valores de potencial dos picos anódico e catódico em função da velocidade de varrimento. Solução 2,5 mM hexacianoferrato(III) de potássio em 0,1 M PBS pH=7,4. ■ Pico anódico. × Pico catódico. Este gráfico apresenta um comportamento muito semelhante ao Gráfico 16, ou seja, a variação do potencial depende da velocidade de varrimento da reação. Os valores de potencial de pico anódico deslocam-se para valores mais positivos à medida que se aumenta a velocidade de varrimento e os valores de potencial de pico catódico deslocam-se para valores mais negativos, indicativo de que a reversibilidade do processo redox da sonda à superfície do elétrodo aumenta à medida que se diminui a velocidade de varrimento. 6.1.4. Deteção de H2O2 O objetivo da modificação da tinta à base de carbono com CoPC seria tornar possível a deteção de H2O2 pelo sensor impresso. Isto porque a cinética da reação do peróxido de hidrogénio é muito lenta, sendo necessário aplicar uma sobretensão para ocorrer. Assim, uma opção é a utilização de mediadores de eletrões tal como CoPC. O H2O2 em solução leva à redução de CoPC, sendo Co(I) um dos produtos da reação. O 68 Capítulo 6 Modificação do Elétrodo de Trabalho composto obtido é reoxidado electroquimicamente, sendo possível obter um sinal eletroquímico, o sinal de interesse. Para confirmar que o sensor, com o elétrodo de trabalho impresso com tinta à base de carbono misturada com CoPC, estava a detetar o H2O2 foram feitos estudos eletroquímicos com sensores modificados e não modificados, analisando a sua resposta eletroquímica numa solução com H2O2, tal como apresentado no Gráfico 24. 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 30 60 90 120 150 180 210 240 E (vs Ag/AgCl) / V i / A Gráfico 24 – Deteção de 0,88 mM H2O2 em 0,1 M PBS pH=7,4. – Sensor não modificado em 0,88 mM H2O2 em 0,1 M PBS pH=7,4. …… Sensor modificado em 0,1 M PBS pH=7,4. - - - - - Sensor modificado com CoPC, em 0,88 mM H2O2 em 0,1 M PBS pH=7,4,com pico anódico a 0,50 V. Velocidade de varrimento = 0,1 V.s-1. Este gráfico mostra que antes da modificação da tinta, não é possível observar um sinal eletroquímico bem definido. Mas após essa modificação há a deteção de um pico eletroquímico, resultante da oxidação eletroquímica de CoPC a um potencial de 0,50 V. Este resultado comprova que a CoPC é um bom mediador redox da reacção de oxidação do peróxido de hidrogénio, mediando a transferência de eletrões entre o sensor e o analito. Tal como referido anteriormente, os sensores eletroquímicos são maioritariamente sensores cronoamperométricos (secção 2.2.1.b), ou seja, são utilizados para analisar a intensidade de corrente em função da concentração de H2O2. O objetivo é que a intensidade do sinal eletroquímico seja diretamente proporcional à concentração de analito presente na solução, sendo para isso necessário que o sensor tenha uma resposta linear a adições sucessivas de H2O2. Dessa forma, foram feitos estudos cronoamperométricos com um dos sensores modificados desenvolvidos, tal como apresentado no Gráfico 25. FCUP Desenvolvimento e otimização de sensores eletroquímicos impressos 69 0100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 i / A t / s Gráfico 25 – Sinal amperométrico do sensor após sucessivas adições padrão de H2O2 (10 µL de 4,85 mM) a 30 mL de 0,1 M PBS pH=7,4. Potencial aplicado de 0,3 V vs Ag/AgCl. Em estudos similares descritos por M. Boujtita et al. [24], o potencial eletroquímico aplicado foi de 400 mV, mas ao realizar-se o estudo com esse potencial, verificou-se um forte decaimento da intensidade de corrente ao longo tempo, pelo que foram testados outros potenciais, sendo os melhores resultados aqueles obtidos para 300 mV. Seguidamente foi traçado o gráfico do valor da intensidade de corrente em função da concentração da H2O2, apresentado no Gráfico 26. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 i / A Concentraçao H2O2 / mM Gráfico 26 – Curva de calibração do sinal amperométrico do sensor após sucessivas adições padrão de H2O2 (10 µL de 4,85 mM) a 30 mL de 0,1 M PBS pH=7,4. Potencial Aplicado de 0,3 V vs Ag/AgCl. 76 Capítulo 8 Bibliografia [14] S. Ito, T. Kato, K. Shinpo, C. M. Science, E. M. Mushroom, C. Co, and W. P. C. Indus-, “Oxidation of tyrosine residues in proteins by tyrosinase,” vol. 222, pp. 407– 411, 1984. [15] H. B. Yildiz and L. Toppare, “Biosensing approach for alcohol determination using immobilized alcohol oxidase,” vol. 21, pp. 2306–2310, 2006. [16] O. Fatibello-Filho, K. Lupetti, O. Leite, and I. 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