COLABORACIONES
Fundamen os del mic oscopio elec ónico
y
su aplicación en la in es igación ex il
po
A.
Naik,
Ing
HISTORIA
El p ime mic oscopio óp ico ue diseñado po An oa Van Leeuwenhock en
el año 1675 y ue conside ado como un jugue e cien í ico al que se le dio el
nomb e de " id io de nlosca" ya que p ima iamen e se usaba pa a obse a insec-
os. Pos e io men e el mic oscopio óp ico ue ecibiendo no ables mejo as.
El
mic oscopio dec ónim es el elsul ado de di e sos expe imen os
y
con-
cepciones eó icas. Tiene su o igen ea 101s expe imen os de Si
J.
J.
Thomson quien
es udió los ayos ca ódicos en ubos con gases en a ecidos
(1).
En el año 1924
de B oghe (2) p opuso su eo ía de la na u aleza ondula o ia
de
las pa ículas ma-
e iales. Después (de unos años Buscih (3) demos ó que
un
ayo de elec ones a a-
esando un campo magné ico o !eléc ico oon e ge al oco y basándose en es o
cons uyó la p ime a len e magné ica en 1926. Da isson y Thomson (4) compa -
ie on el p emio Nobel po el doscub imien o de la di acción del elec ón. Pad e
e hijo
J.
J.
Thomsoa y
G.
P. Thomson (5) juga on
un
papel undamen al
m
la
his o ia del desa! ollo del mic oscopio elec ónico.
Las p opieldadeis de una pa ícula ca gada con elec ones ue on explo adas
po ~inoll y ~uska (6) y cons uye on el p ime mic oscopio elec ónico de len e
magné ica, u ilizando un ayo
de
60.000 d ios y ob eniendo imágenes sob e una
pan alla luo escen e. Las p ime as mic o o og a ías de ma e iales biológicos ue on
conseguidas po Ma oa (7) en 1934. E1 p ime mic oscop~io dec ónico de ans-
misión que ope ó en Es adols Unild~os en 1939 ue cons uido en la Uni e sidad
de To on o po A. P abus y
J.
Hille bajo la di ección de
E.
Bu on. Es e mic os-
copio e a muy simila al ipo desa ollado po Van Bo ies
y
Ruska
(8)
como
ins u~men o colme ciail.
En
la
ac ualidad, se dispone de un núme o conside able de mi~ oscopios,
que pueden clasi ica se undamen almen e en dos g upos:
-
Mic oscopios 6p icos.
-
Mic oscopios elec ónicos de ansmisión y de ba ido.
MICKOSCOPIO OPTICO
El
ojo puelde diso imina dols obje os si es án si uados no más ce ca de
0,l mm., mi anldo desld'e una dis ancia no mal de 25 cm. Elsl e es
un
acao lími e
del ojo humano y cualquie o o de alle más pequeño que és e, debe se aumen ado
pa a se is o. Se puede usa una lupa o un mic oscopio pa a aumen a la imagen.
El obje i o del mic oscopio es el de hace dis ingui los de alles es uc u ales
de
la mues a a obse a . Es a habilida~d las exp esada en é minos de ape u a numé-
ica o
"N.
A.".
Po ape u a numé ica de un sis ema óp ico se en iende, según
Abbé,
el p oducm !da1 índice de e accií n "n" del medio que se encuen a delan e
del sis ema
y
el seno del semiángulo
"a"
de abe u a de es e sis ema.
A
=
n. Sen
u
n
(ai e)
=
1,
a
(agua
=
1,33, n caoei e de inme sión)
=
1,52
Pa a explica es~ e conoep o más de alladamen e podemos da dos ejemplos.
Al
eno ai e en e
d
cub eobje os y la len e oln al del obje i o -cosa dada en
un sis ema seco- en onces es el enómeno de la e lexión o al el que limi a el haz
de ayos cónicos. Pe o si se u iliza en cambio, un medio (de mayo índice
de
e acción como acei e (de inma sión, en onces no exis e ninguna e acción al
sali el haz de sayos del cub eobje os debido a la homogeneidad del media y el
haz
de ayos cónicos, cap ado po el obje i o del mic o~scopio es limi ado po la
abe u a del obje i o. Los obje i os y condensado es del mic oscopio es án seña-
lados con es e alo de
"N.
A.".
El alo máximo de
"N.
A." de un obje i o es 1,4. El pode de esolución
-la dis ancia más eis eoha en e dos pun os que puede obse a se cla amen e en
la imagen de un sis ema óp ico- iene dada pol la ó mula,
siendo
R
la dis ancia en e dos pun os en nanóme os (nm),
h
es la longi ud de
onda de la luz u ilizada pa a la ilumina~ción
en
nm, y
"N.
A." es la ape u a
numé ica indicada sob e el obje i o.
El mínimo pode de esodución pa a un sis ema óp ico se puede consegui
usando la adiación ul a iole a, que iene la meno longi uld de onda aplicable.
En esumen, puede deci se que no iene sen ido inc emen a los aumen os del
mic oscopio u ilizando un ocula más po en e, si la ape u a del obje i o no bas a
pa a esol e la es uc u a del obje o. Más bien debe elegi se el alo , de al mane-
a que el aumen o del mic oscopio ome un alo en e 500 y 1.000 eces mayo
que la ape u a dd obje i o.
MICROSCOPIO ELECTRONICO
Debido al limi ado pode de esolución del mic oscopio óp ico,
se
p oba on
a ias uen es de iluminación ales como ayos
X
de muy pequeña longi ud de
onda (0,5
n n)
sin ene éxi o ya que no pudie on en oca es os ayos. Sin emba go,
las in es igaciones que comenza on en 1923 sob e di acción elec ónica, sen a on
las bases pa a la cons ucción del p ime mic oscopio elec ónico.
Cuando los elec ones son acelle ados median e una di e encia de ~o encial
1,23
de
V
ol ., ienen la ongi ud de onda
h
igual a
.
Así pues un elec ón
VTGLT-
de 50 K . iene
h
=
0,0055 nlm. Si
sus i uimos
es e alo en la b mula de la
esolución
R
=
A
ob end emos
R
=
0,27 nm. Es a esolución es 1.000
2
N.
A.
eoes mayo que la de la luz blanca u ilizada pa a la iluminación en el mic os-
copio 6p ico. Se puede consegui pode de esolución has a
0,l
nm (1 A) con los
nue os diseños del mic oscopio elec ónico. La abla núm.
1
esume las unidades
de longi ud u ilizadals en el mic oscopio.
La dis ancia de en oqu~e del obje i o en el mic oscopio elec ónico de 180 KV
es de
1,1
mlnz. Es e ac o mejo a la p o undidad del campo y os cien os de eces
mayo que la conseguida po el mic oscopio 6p ico. El mic oscopio elec ónico
mode no es á basado en los p incipios gene ales de la len e eilec o~magné ica.
MICROSCOPIO ELECTRONICO
DE
TRANSMISION
(TEM)
Eb
mi c oscopio dec ónim más s~encillo es muy simila
al
mic oscopio óp ico.
A~mbos ienen len es y condemsadol es pa a concen a la iluminación sob e la
mues a. Fig. 1.
Mic oscopio elec onico
~ic oscopio op ico de ansmisión
Puen e de luz
condensado
Ohj
e i o
Ocula
Fuen e de elec on
Condensado no
1
Mues
@
Len e in e medio
imagen inal
+
Figu a
1
.-
Esquema simpli icado.ilus ando la semejanza
en e
mic oscopio
op ico
y
mic oscopio elec onico
de ansmisión.
Los ayos de iluminación a a iesan la mues a y son en ocados po las len es
del obje i o y de p oyección pa a
o ma^
una imagen aumen ada sob e una pan a-
lla luo escen e. Sin amba~go
eil
mic oscopio elec bnico es muoho más co~mpleijo.
Pa a que los elec onles puedan se ace le adols has a la elocidad p e ijada, debe
abaja se en condiciones de al o acío (lo-' a
lo-'
o ;
1
o
=
1 mm de
me cu io a 0°C). El sis ema cen al del mic oscopio elec ónico incluyendo la
pan alla luo escen e y el equipo o olg i iico, lo cons i uye un ubo hueco. El
equipo elés ico que suminis a la co ien e necesa ia se halla gene almen e si uado
a una cie a dis an'cia pa a e i as la in e e encia de los campos magné icos dispe~ -
sadois. La mayo ía de los mic o~scopios es án equipados con dispoisi i os de segu-
idad que no pe mi en conec a el ilamen o de al o ol aje has a que no se ha
conseguido
d
acío ap opiado
(9).
Las len es magné icas del mic oscopio elec ónico es án o madas po iinanes
en o ma de he adu a. El imán puede se pe manen e o de ipo dec omagn6 ico.
Va iando la po encia de la co ien e a la len e se consigue el e ec o de a ia la
dis ancia oca1 de la lien e conj inuamen e, lo cual es muy simila
al
sis ema de
"zo~om" . Sin emlba go, no maJmen@e se p elselecciona la #co ien e deseada. Se
pueden ajus a los ol ajes de acele ación en una gama que incluye 40,
60,
80
y
100 K , e c. Ajus ando K a un ni el in e io , se consigue aumen a
d
con-
als e.
Componen es del mic oscopio elec ónico de ansmisión
(TEM)
Cañón
elec ónico
El
ipo más [usado de cañón elec ónico consis e de un ilamen o de alamb e
de ungs eno (10) doblado en o ma de
V.
El elec odo de con ol se denomina
cilind o de Wehnd , y iene una ape u a ci cula de 1 a
3
mm de diáme o cen-
ada en el ápice del ilamen o. La supe icie cónca a hace las unciones de ánodo,
y u ilizando una supe icie con exa la imagen de la uen e elec ónica puede
educi se en amaño espec o al elec odo cónca o. 1,a in ensidad o al dd haz
de cá odo a ánodo puede se de 10 a 400 mic oampe ios, pe o solamen e una
pequeña acción die és e llega has a la mues a.
Condensado es
Lols idos condensado es son capaces de da una amplia gama de in ensidad
ajus ando el cañón dew ónico. Es o educe el á ea iluminada en la mue's a.
Sin
emba go, o as pa es de la mues a ambién su en los e ec os del haz elec ónico.
El
p ime condensado educe la image~n de la uen e mien as que el segundo
coudensado olb iene la ladeuuada in ensida~d de iluminación.
Pla a o ma pa a la colocación de
la
mues a
La pla a o ma pa a coloca la mues a es á si ualda en en e del obje i o.
Se in oduce la mues a en la coiluimna del mic oscopio a a és de una abe u a.
Obje i o
El obje i o ea la len e más impo an e en eil mic oscopio ellec ónico. La dis-
ancia oca1 de es a len e es á comp endida en e 1 y
5
milíme os, siendo
1,l
mm
la más ecuen e . Cuan o meno 0s la dis ancia ocajl, mayo es la esolución. De-
bido a que el haz de imagen iene la máxima ape u a angula en el p ime obje-
i o, es a len e con ola la calidad de la imagen p oducida. Se puede co egi la
abe ación es é ica usando un "s igma o ", que es un disposi i o que pe mi e
,in oduci me al pa a compensa la inho nogeneidad inhe en e de la len e, y o~b ene
ele ada esolución. O o accesol io impo an e, pe mi e egula la ape u a del
obje i o, la cual limi a la dispe sión de lo's elec ones, e i ando así la deg adación
de la imagen. Es a ape u a mejo a el con as e siendo 20 y
40
mic óme os
(pm)
los más ecuen es.
Len e in e media
La len e in e media puede aumen a o disminui la imagen.
Se
puede conse-
gui es o, alumen ando o disminuyendo la po encia de la co ien e a es a len e.
Len e de p oyección
La len e (de p o~yeccií n co e'sponde al ocula del mic oscopio óp ico.
Su
unción es la de p oyec a la imagen eal sob e la pan alla luo escen e,
y
pe mi e

una amplia gama de aumen os. Se puede a ia la ampliación de 100
X
has a
300.000
X
usando len es in e medias y de p oyección.
Cánia a de obse ación
La cáma a de obse ación y la pan alla luo escen e es án si uadas en el ondo
de
la
cohmna. La i magen se en oca sob e un pun o ma cado y el en oque ino
se consigue con ulnos binocula es de
6
y 20
X.
El
diáme o del pun o de en oque
es de 100
,pm, po 10 an o la imagen debe se mayo que [es e diáme o pa a se
esuel a. La cáma a de obse ación es á p o egida po un id io g ueso de plomo
pa a e i a la emisión de ayos
X.
Cáiiia a o og á ica
La cáma a o og á ica es á si uada debajo de la pan alla luo esoen e. La
pan alla luo escen e es á suje ada po
m
lado,
y
al qui a el paso del haz eleo ó-
nico la imagen se cen a sob e la pdícula o og á ica. Se puaden usa a ios ipos
de pelíciulals y placas de id io.
MICROSCOPIO ELECTRONICO
DE
BARRIDO SEM
El
p ime mic oscopio eleic ónico de ba ido ue desa ollado en 1930 en
Alemania y en 1949 [en Es ados Unidos
y
inalmen e 'en Tngla e a en 1950.
Ei1
p ime modelo come cial ue p esen ado en 1964 po "The Camb idge Scien i ic
Ins umen Company"; pos e io men e muchos o os ab ican es han desa ollado
nue os modelos.
El p incipio del sis ema SEM consis e en que si se hace incidi sobne la
mues a un haz $de dec ones inamen e en ouado, emi e una señd que pude
egis a se en una pan alla median e un ubo de ayos ca ódicos.
Los componen es p incipales del mic oscopio de ba ido SEM son los si-
guien es:
(Fig.
2).
Puen e de ene gía
La uen e de ene gía !del mic oscopio elec ónico de ba ido depende de
a ios ac o es, siendo los más impo an es el ol aje de acele ación, la in ensidad
de la co ien e
y
al
~diám e o de haz. Pa a usos p ác icois debe as egu a se una al a
es abilidad de la co ien e.
En unos pun os el haz de elec ones es des iado 1, 2,
3
...
n eces po los
campos magné icos con olados po
el
gene ado de ba ido. Como] consecuencia
el haz es mo ido sob e la. supe iicie de la mues a y la señd as de ec ada po el
collec ol de eleo ones (1 1). Se puede ajus a el colec o pa a de ec a cualquie
emisión como ayos
X,
luz in a oja, ul a iole a, e c.
Po amues as
La mues a mon ada sob e un sopo e puede mo e se en es di ecciones,
se calen ada, en iada, es i ada, ei c. den o
del
ins umen o. Pa a
d
es udio de
cie ols ipos de mues as ales como, me ales, mine ales, semicoaduc ~ es, &c., se
equie e cale acción de la mues a. La cale acción puede consegui se po medio de
un hilo~incandescen e o calen ando la mues a en un c isol aplicando di ec amen e
a la mues a una co ien e eléc ica (12).
~iiamen o ca ódico
Len e magne ica
len e magne ica
po a mues a
Figu a
2.-
Componen es del Mic oscopio elec onico
de ba ido.
Los mé odos de en iamien o se usan p incipalmen e en la p epa ación de
mues as biológicas.
Pa a Ja dc onmación meicánica en el es udio de mules as ales como mc aks,
políme os o ib as, es necesa io de enmina una escala de umzas ya que la ue za
eque ida a ía conside ablemen e según el ipo de ma e ial.
Sis ema de ainpli icación
El
sis ieima de ampli icación elcoge las señales
y
p ocesa la in o mación p o-
cedm e de la muels a,
al
mismo iempo que el haz de elec ones bme la mues a.
El gene ado de ba ido es á conec ado
al
ubo
de ayos ca ódicos
(CRT)
pa a que
el
haz
de elec ones en es e ubo sea ba ido en la misma o ma que, el
haz
p in-
cipal. Sin emba go, la po encia de la co ien e suminis ada a la columna p incipal
pa a
d
ba ido pulede se a enuada mien as que el ubo de la pan alla es ba ido
sob e una á ea cons an e. Como consecuencia de ello, cualquie educción en el
á ea de la mues a ba ida da luga a un aumen o de la imagen. Es e aumen o iene
de e minado po la elación del á ea de la pan alla del ubo (cons an e) espec o
al á ea de la muesl a ba ida ( a iable).
Ca ac e ís icas de
SEM
Las ca ac e ís icas más impo an es de SEM son: pode de esolución, p o-
undidad del campo y con as e.
Pode de esolución
El pode de esolución en el mic oscopio elec ónico de ba ido (SEM) depen-
de de a ios ac o es, ales colmo la dimensión del haz de eleo oaes, la di usión
del mismo en la mues a an eis de la misión de los elec ones secunda ios,
y
la
co ien e es abilizada de la len e. La dimcnsión del haz puede educi se de muchas
o mas. Se pueden amplea ilamen os apun ados o usando ele aido po encial
de K . Po ejemplo
a
pol encia de
1
K , la esolució~n es 140 nm, mi n as que a
30 K , la esolucii n les 20 nm (200
A).
Se puede p e eni la di usión del haz de eleo ones en la mues a, aumen ando
la po encia de la co ien e. Finalmen e, la alimen ación de co ien e debe se muy
es able, del o den de 1 pa e en 100.000, pa a consegui al a esolución.
P o undidad de canipo
Se u ilizan len es magné icas con sime ía axial con el in de p oduci un ino
haz
de
elec ones.
De
odos modos hay que conside a que la abe ación es é ica
de las len es
magné ica,^
no puede conlsagui se con ningún ipo de l n e de si'me ía
axial. Si se quie e ob ene un ino haz de elec ones, el ángulo de abe u a de la
len e del obje i o (2°C) debe educi se con el in de pe mi i sólo los haces
pa axiaies.
La p o undidad del campo 'de la supe icie de la mues a i ne dada po la
siguien e ó mula:
siendo M la ampli icación de la imagen, d, el diáme o del haz
y
y
la longi ud
mínima diso iminable a simple is a.
El
haz de elec ones mide solamen e 30 mm y se mue e en o ma
de
líneas
pa delas a a és de la mues a. Se puede cambia la ampli icación en
escalones
de 20
X
la 100.000
X
aunque la esolución lde 25 nm es es ingida
a
aumen os de
10.000
X
a 30.000
X.
La g an p o undidad de campo pe mi e obse aciones especiales de la mues-
a. En gene al $la p o undidad del calmpo es an g ande colmo la mi ad de una ca a
del á ela bajo o~bse ación.
Con as e
El
con as e en SEM es log a~do po
eJ
sis ema colliec o . La mues a ecibe
los elec ones del haz de ba ido
y
gene a elec ones secunda ios. Es os elec ones
emi idos son ecogidos po
d
colec a . Los elec ones se desplazan en línea ec a
cuando la mues a es uni o me.
Se
consiguc el con as e óp imo cuando el colec o
puede ecoge
d
máximo de ellec~ onss secunda ios. La (e iciencia de la emisión
de los eleo ones es máxima cuando el plano de la mues a es á inclinado con es-
pe~ o al haz p ima io. Pol es e mo i o las mic o o og a ías ob enidas po SEM
pa e~cen muy na u ales.
PREPAWACION DE LAS MUESTRAS
La p epa ación de lais mues as pa a la obse ación mic oscópica es una de
las écnicas más impo~ an es. Gene almen e la p epa ación de las mues als bioló-
gicas equie e muchas p ecauciones
y
se desa olla en dos
o
más e apas. Po o o
lado la p epa ación de los dis in os eac i os (13) consume mucho iempo. Es e
apa ado es á de alladamen e desc i o en la bibliog a ía especializada
y
se apa a
del obje i o de es e a ículo que se e ie e a ma e ias ex iles.
La p epa ación de las mue~s as ex iles puede di idi se en es g upos:
1.
P epa ación pa a la obse aci6n
en
el mic oscopio óp ico.
11.
P epa acibn pa a Ja o~bse ación en el mic oacopio dec ónico de ansmi-
sión
(TBM).
111.
P epa ación pa a la obse ación en al mic oscopio elec ónico de ba ido
(SEM).
P epa ación pa a la obse ación en el mic oscopio óp ico
Se obse an las ib as ex iles en sección longi udinal o ans e sal. La p epa-
ación de las ib as pa a oibse ación longi udinal es muy 'sencilla. Sob e un
po aobje os se pone una go a de acei e de inme sión
y
con una pinza se coloca
ib a po ib a, co adas en una longi ud de 1 a 1,5 cm. Cuando es p eciso obse a
una longi ud de e minada se u iliza
un
mic o omo manual pa a co a las ib as
a la longi ud deseada. Se pone un cub eobje os sob e la zona de ib as an es de
se obsle adas en el mic oscopio. Pa a e i a la o naci6n de bu bujas de ai e,
es p e e ible molja el cub eobje os con un poco de acei e.
Pa a obse a la ib a en seoción ans e sal se necesi a un mic o omo. Exis-
en di e sos ipos de mic o omos an o sencillas como más so is icados. Pa a el1
mic oscopio óp ico bas a usa un mic o omo sencillo. El g oso del co e debe
se de
8
a
10
mic as.
P epa ación de la mues a pa a la obse ación en el mic oscopio elec ónico de
ansmisión
Pe mi e obse a la seoción ans e sal de las ib as ex iles pa a es udia su
es uo u a In e na.
En p ime luga , se p ocede a la eliminación de la humedad de las ib as
median e secado en una es u a a 40'C du an e
1
ho a. Luego, deben coloca se
en el seno de una esina ipo epoxi, que pueda polime iza se ácilmen e. Exis en
a ias esinas pe o pasa las ib as ex ilcs la más adecuada es la siguien e:
A aIdi B M
-
4
nl.
Endu ecedo 95
6
-
1 nd.
Se u ilizan unas cápsulas de plás ico pa a la polime ización de la esina. Se
pasan las ib as
a
a és de la cápsula, Fig.
3,
y
luego se llena la cápsula con la
esina.