UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA
ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERIA AGRONÓMICA Y
DEL MEDIO NATURAL
Ca ac e ización p o eómica de enenos de
se pien es de in e és biomédico
TRABAJO DE FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA
CURSO 2015-2016
AUTOR: JOSE MUNUERA MORA
DIRECTOR: JUAN JOSÉ CALVETE CHORNET
TUTOR: MARÍA PILAR LÓPEZ GRESA
VALENCIA, JULIO 2016
Da os del abajo
Tí ulo: Ca ac e ización p o eómica de enenos de se pien es de in e és biomédico
Au o : Jose Munue a Mo a
Localidad y echa: Valencia, Julio de 2016
Di ec o : Juan José Cal e e Cho ne
Tu o : Ma ía Pila López G esa
Tipo de licencia: Licencia C ea i e Commons. “Reconocimien o no Come cial Sin Ob a
De i ada”.
Resumen
Ac ualmen e las se pien es enenosas es án ex endidas po p ác icamen e odo el
mundo p o ocando que los p oblemas de i ados po las mo dedu as de es as se pien es sean
de g an impo ancia. No obs an e, es e p oblema se acen úa mayo i a iamen e en países
subdesa ollados y zonas u ales con pocos ecu sos económicos, con lo que se con ie e en
un p oblema in a alo ado en las zonas más desa olladas y con mayo capacidad de
in es igación en es e ámbi o. Po ello es impo an e segui in es igando en es e campo pa a
desa olla los únicos a amien os e icaces con a las mo dedu as de se pien es enenosas,
los an i enenos.
En es e abajo se busca ca ac e iza enenos de se pien es del géne o Naja, la
mayo ía de ellas conocidas comúnmen e como cob as, con el in de consegui una mayo
in o mación sob e las p o eínas p esen es y la abundancia ela i a de es as, pa a pe mi i el
desa ollo de an i enenos más especí icos y, po an o, más e icaces. Se analizan los enenos
de se pien es de di e en es especies y de especies iguales pe o encon adas en di e sas zonas
geog á icas, con el obje i o de es udia an o la a iación in e especí ica, como la a iación
in aespecí ica de ca ác e geog á ico de los enenos, median e la u ilización de écnicas
p o eómicas.
Palab as cla e: eneno de se pien e, p o eómica, enómica, an i eneno, a iación
in e especí ica, a iación in aespecí ica.
Abs ac
Cu en ly enomous snakes a e sp ead all o e he wo ld making he p oblems caused
by snake bi es a e y impo an issue. Howe e , ha p oblem a ec s mainly unde de eloped
coun ies and u al zones wi h ew economic esou ces, and consequen ly i becomes an
unde es ima ed in de eloped coun ies wi h g ea e economic esou ces which a e mo e
capable o esea ch in his a ea. Due o ha , i is impo an o keep esea ching in his ield o
de elop mo e speci ic and e icien an i enoms o ea snake en enoming.
In his s udy he aim is o make a p o eomic cha ac e iza ion o snakes’ enoms o he
Naja genus, commonly known as cob as, o ge mo e in o ma ion abou he p o eins o hese
enoms and hei ela i e abundance. Venoms o di e en snake species we e analyzed and
also, enoms o same species bu loca ed on di e en coun ies, o de e mine he in e speci ic
and in aspeci ic geog aphic a ia ion h ough he use o p o eomic echniques.
Key wo ds: snake enom, p o eimics, enomics, an i enom, in e speci ic a ia ion,
in aspeci ic a ia ion.
Índice
1. In oducción………………………………………………………………………………… 1
1.1. Las se pien es………………………………………………………………………………………………….. 1
1.2. Veneno………………………………………………………………………………………………………....... 4
1.3. Composición........................................................................................................ 6
1.4. Técnicas ómicas……………………………………………………………………………………………….. 9
2. Obje i os……………………………………………………………………………………. 12
3. Ma e iales y mé odos………………………………………………………………… 13
3.1. C oma og a ía………………………………………………………………………………………………... 14
3.2. Elec o o esis……………………………………………………………………………………………....... 15
3.3. Diges ión………………………………………………………………………………………………………… 16
3.4. Espec ome ía de masas (MS)........................................................................ 16
3.5. Cálculo de la abundancia ela i a de las oxinas…………………………………………… 18
4. Resul ados y discusión………………………………………………………………. 19
4.1. Análisis de los enenos………………………………………………………………………………….. 19
4.2. Compa ación de los enenos…………………………………………………………………………. 24
4.3. Va iación in e especí ica…………………………………………………………………………........ 26
4.4. Va iación in aespecí ica geog á ica................................................................ 28
5. Conclusiones……………………………………………………………………………… 31
6. Re e encias……………………………………………………………………………….. 32
7. Anexos………………………………………………………………………………………. 37

1
1. In oducción
1.1. Las Se pien es
Las se pien es son animales que se encuen an den o de la clase Rep ila. A su ez,
den o de es a clase, pe enecen al o den de los Squama a y al subo den Se pen es. Exis en
al ededo de 3150 especies de se pien es de las cuales ap oximadamen e 600 son
pelig osamen e enenosas pa a los humanos (WHO, 2010). No obs an e, exis en algunas
especies de las llamadas “non- on - anged colub oid snkaes” (colúb idos sin colmillos
on ales) que habi ualmen e no se clasi ican como enenosas pa a los humanos, aunque se ha
demos ado que p oducen eneno que en ocasiones p esen a e ec os clínicos signi ican es
pa a nues a especie (Weins ein, 2013). Den o del subo den Se pen es, el clade Colub oidea
incluye a la mayo pa e de las se pien es que exis en ac ualmen e, de en e las cuales, las
enenosas pe enecen mayo i a iamen e a las amilias Vipe idae y Elapidae (Cal e e, 2014).
Es a úl ima (Elapidae) es á compues a a su ez po dos sub amilias Elapinae e Hyd ophiinae.
Figu a 1. Resumen del á bol ilogené ico de las se pien es del clade Colub oidea. Imagen ob enida de (Py on e al.,
2011)
2
Las se pien es que pe enecen a la amilia Elapidae son enenosas y se encuen an en
egiones opicales y sub opicales de Asia, Aus alia, Amé ica y Á ica. Además ambién
exis en elápidos (especies de la amilia Elapidae) acuá icos que habi an en los océanos Pací ico
e Índico pe enecien es a la sub amilia Hyd ophiinae. De en e los elápidos, se dis inguen 361
especies ag upadas en 55 géne os, las cuales son muy di e sas en cuan o a su amaño, que a
desde los 18 cm en algunas especies del géne o D ysdalia, has a 5,6 me os que puede llega a
medi la cob a eal (Ophiophagus hannah).
Las se pien es enenosas se encuen an epa idas po casi odo el mundo
excep uando climas muy íos, algunas islas y en algunas zonas con al i udes ele adas (Figu a
2).
Es a amplia dis ibución de se pien es enenosas p o oca que el a aque po mo dedu a de
se pien e sea un p oblema médico impo an e. Donde más se acen úa es e p oblema es en
zonas u ales de países en ías de desa ollo de Á ica sub-Saha iana, Asia y Amé ica La ina,
causando, en nume osas ocasiones, mo bilidad y mo alidad en las íc imas ( igu a 3). Es o es
debido p incipalmen e a 2 causas:
 Mayo con i encia con las se pien es pelig osas a causa de la ocupación de los
ecosis emas habi ados po és as, bien po los abajos humanos ealizados en zonas
u ales o bien po la deg adación e in asión de dichos ecosis emas. Además, los
desechos p oducidos en egiones pobladas a aen a las a as, que a su ez a aen a las
se pien es que se alimen an de és as.
 Meno acceso a se icios de sanidad, y los que ienen acceso, suelen se de meno
calidad y no lo su icien emen e p epa ados pa a a ende con e icacia episodios de
en enenamien o. O o p oblema añadido en es os cen os médicos es la al a de
an i enenos e icaces, los cuales son los únicos a amien os especí icos pa a a a
episodios de en enenamien o.
Figu a 2. Dis ibución de las zonas donde se han encon ado se pien es enenosas. Imagen ob enida de
(Kas u i a ne e al., 2008)
3
Figu a 3. Figu a explica i a de como a ec a el p oblema de las mo dedu as de se pien es al ededo del mundo.
Figu a ob enida de (Gu ié ez e al. 2010)
Los p ime os es udios pa a conoce la incidencia global del p oblema de las
mo dedu as de se pien es se basa on en los da os ob enidos de los cen os sani a ios. A pa i
de es os da os ob u ie on que la incidencia global de es e p oblema e a de unos 2.5 millones
de episodios de mo dedu a de se pien e anuales que de i aban en 250.000 íc imas con
secuelas as el en enenamien o y 85.000 mue es (Chippaux e. al., 1991).
No obs an e, la incidencia eal de episodios de en enenamien o po mo dedu a de
se pien e y su impac o en las di e en es egiones se desconoce, ya que en muchas zonas
u ales, las íc imas no acuden a hospi ales y mue en ce ca del luga de la mo dida o en casa,
sin que el acciden e quede egis ado en los da os sani a ios o iciales. Es a es la causa po la
cual la es imación eal se si uaba muy po encima de es os esul ados.
Es udios más ecien es han es imado que, anualmen e, se p oducen en e 1.2 y 5.5
millones mo dedu as de se pien e en odo el mundo y que e minan con la ida de en e
25.000 y 125.000 pe sonas. Además, es os es udios es iman que al ededo de 400.000
íc imas más quedan con secuelas pe manen es (Gu ié ez, 2015). En España, los acciden es
de mo dedu a de se pien e no son muy comunes, si uándose en ap oximadamen e 130 casos
anuales. De odos los casos egis ados en e 1997 y 2009, en odo el país, solamen e un 1% de
es os de i ó en la mue e del pacien e, ap oximadamen e 1 caso po año, aunque en di e sos
años no se egis ó ninguna íc ima mo al (Saz-Pa kinson e al., 2012).
A pesa de la incidencia a ni el mundial, el p oblema de las mo dedu as no ecibe la
su icien e a ención po pa e de las au o idades de la salud pública y la indus ia a macéu ica.
De hecho, la OMS (O ganización Mundial de la Salud) en Ab il de 2009 inco po ó los acciden es
po mo dedu a de se pien e en la lis a de condiciones descuidadas den o del conjun o de
en e medades opicales descuidadas (NTDs en inglés Neglec ed T opical Diseases).
4
1.2. Veneno
El eneno se de ine según la RAE como “sus ancia que, inco po ada a un se i o en
pequeñas can idades, es capaz de p oduci g a es al e aciones uncionales, e incluso la
mue e”. En é minos más cien í icos, el eneno se puede de ini como una sec eción o mada
po compues os bioac i os, p oducido en unas glándulas especializadas e inyec ado median e
un apa a o inoculado , que in e ie e en p ocesos isiológicos o bioquímicos no males de la
p esa. Den o de es e cóc el de compues os que es el eneno, la mayo pa e, al ededo de un
90%, es á compues o po unas pocas amilias de p o eínas y pép idos, mien as que el 10%
es an e se compone po di e en es compues os an o o gánicos como ino gánicos, como sal,
azúca es, poliaminas y neu o ansmiso es. La capacidad de sin e iza eneno la ap o echan
al ededo de 170.000 especies epa idas po casi odo el mundo. Tan o es así que a día de hoy
es casi imposible encon a un ecosis ema donde no exis a algún ipo de o ganismo enenoso
(WHO, 2010, F y, 1999, U kin, 2015).
Figu a 4. Á bol esquemá ico de las especies enenosas a lo la go del eino animal. El á bol demues a la elación
en e la e olución de los di e en es linajes y la p esencia de o ganismos enenosos. Los colo es des acan los linajes
en los cuales se han encon ado o ganismos con sis emas enenosos. El colo ojo indica que la unción p incipal del
eneno es la p eda o ia, el colo azul la unción de ensi a y el colo e de la unción de a ma de compe ición
in aespecí ica. Imagen ob enida de (Casewell e al., 2013).
11
exis en es en el gel de poliac ilamida que deben a a esa las p o eínas, siendo más ácil pa a
las p o eínas de meno peso molecula (Sociedad Española de P o eómica, 2014).
La combinación de es as dos écnicas pe mi e una buena sepa ación p o eica, con la
que pos e io men e se pueden analiza los pép idos ob enidos median e espec ome ía de
masas. En es a écnica se p oduce una agmen ación de las moléculas que conduce a la
o mación de iones, que se sepa a án en el espec óme o de masas en unción de su elación
masa/ca ga. G acias a es o, se pueden conoce las masas molecula es de los pép idos
in oducidos en el espec óme o de masas. Ac o seguido, se in e p e an los espec os de
masas, ya sea median e búsquedas en bases de da os, en caso de que se encuen en
agmen os pep ídicos simila es a los ob enidos, o manualmen e, median e la écnica de
secuenciación de no o. En es a écnica se in e p e a el espec o de un de e minado pép ido,
con el in de secuencia lo (iden i ica la secuencia de aminoácidos).

12
2. Obje i os
El obje i o de es e es udio ue consegui una ca ac e ización p o eómica de los enenos de las
se pien es Naja haje (de Mali y de Ma uecos), Naja annuli e a, Naja niglicollis nig icinc a y
Naja melanoleuca melanoleuca (de Uganda). Es a ca ac e ización enía como in:
 Conoce con la mayo exac i ud posible la composición p o eica de los enenos y la
abundancia ela i a de las oxinas p esen es en es os, con el obje i o de apo a
in o mación pa a pos e io es es udios y pa a el desa ollo de an i enenos más
especí icos y po an o, más e icaces.
 Es udia las di e encias en la composición del eneno y en la abundancia ela i a de
sus oxinas a ni el:
o In e especí ico, es deci , en e di e en es especies de se pien es del géne o
Naja.
o In aespecí ico geog á ico, es deci , en e se pien es de la misma especie pe o
que habi an en di e en es zonas geog á icas. Es e es el mo i o po el cual con
la especie Naja haje se analiza on sus enenos en se pien es encon adas en
países di e en es (Mali y Ma uecos).
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3. Ma e iales y mé odos
G acias al a ance de las écnicas p o eómicas, el es udio de los enenos de se pien e
ha e olucionado ápidamen e, pe mi iendo una ca ac e ización p o eómica p o unda de los
enenos. Pa a la ealización de es e abajo se siguie on los pasos explicados en el siguien e
esquema ( igu a
Figu a 8. Esquema de los pasos seguidos pa a la ca ac e ización p o eómica de los enenos en es e es udio.
La ex acción del eneno se lle a a cabo en cen os especializados y el eneno llega al
labo a o io en o ma lio ilizada. Una ez en el labo a o io, el eneno ue esuspendido con
200µl de PBS (Phospha e Bu e Solu ion) y cen i ugado pa a desca a los p ecipi ados. Pa a
ob ene su icien e can idad de p o eína pa a analiza , pe o sin sa u a la columna
c oma og á ica, se decidió ca ga 2mg o ales de eneno. Con el obje i o de conoce la
concen ación que se enía en la mues a, se u ilizó espec o o ome ía a 280nm (longi ud de
onda a la que abso be el enlace pep ídico) y se u ilizó la ley de Lambe y Bee . Es a ley explica
que hay una elación exponencial en e la ansmisión de luz a a és de una sus ancia y la
concen ación de la sus ancia, así como ambién en e la ansmisión y la longi ud del cue po
que a a iesa la luz. La ó mula que ep esen a es a ley es:
𝐴 = 𝜀 ∗ 𝑐 ∗ 𝑙
Ecuación 1. Ecuacnión de Lambe y Bee . Donde: A es la abso bancia, ε el coe icien e de ex inción mola y l la
longi ud de la celda.
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Una ez conocida la concen ación de la mues a, se calculó el olumen necesa io pa a
ob ene los 2mg de p o eína que se u iliza on en la sepa ación c oma og á ica y se añadió el
olumen es an e has a llega a los 300µl, con la solución de inicio del p og ama de
c oma og a ía (5% ace oni ilo + 0.1% de ácido i luo oacé ico en agua MilliQ).
3.1. C oma og a ía
La c oma og a ía RP-HPLC se ealizó u ilizando una columna Teknok oma Eu opa
P o ein 300 con una ma iz C18. Es a columna iene unas dimensiones de 0.4cm de diáme o
po 25cm de longi ud, con un amaño de pa ícula de 5µm y un amaño de po o de 300Å.
La c oma og a ía ue lle ada a cabo con un g adien e linea de 0.1% TFA (ácido
i luo oacé ico) en agua MilliQ (solución A) y 0.1% de ace oni ilo ambién en agua MilliQ
(solución B), aumen ando p og esi amen e la solución B y disminuyendo la A de mane a
au oma izada, siguiendo los siguien es pasos:
 Del minu o 0 al 5: condiciones isoc á icas con un 5% de la solución B.
 Del minu o 5 al 15: aumen o de la solución B desde el 5% has a el 25%.
 Del minu o 15 al 75: del 25% al 45% p og esi amen e de solución B.
 Del minu o 75 al 85: del 45% has a el 70% de B.
Cada pico ep esen a a un g upo de p o eínas que, en unción de su pola idad, ue on
e enidas un iempo de e minado. Cada uno de es os picos, se ecogió po sepa ado pa a
pode ealiza pos e io men e una sepa ación más especí ica, u ilizando elec o o esis. El á ea
bajo la cu a de los picos depende de la can idad de p o eína de ec ada po el c oma óg a o.
Figu a 9. C oma og ama de Naja haje de Mali con el g adien e de la solución B.
15
Una ez e minada la c oma og a ía, las mues as ecogidas se seca on u ilizando una
cen í uga de acío (Sa an ), con el obje i o de elimina el líquido p esen e en la mues a y así
ob ene solo las p o eínas. Pos e io men e, las mues as ue on esuspendidas con agua MilliQ
pa a se ca gadas en el gel y que es u ie an odas igual de concen adas.
3.2. Elec o o esis
Como se ha dicho an e io men e, el ipo de elec o o esis usado ue el llamado SDS-
PAGE donde se u iliza on geles de poliac ilamida con un po cen aje del 15%, ealizados en el
labo a o io manualmen e, con los p oduc os que se de allan en el anexo I. Se u ilizó un gel con
un po cen aje del 15% en ac ilamida ya que se conocía que la mayo ía de las p o eínas
p esen es en los enenos e an pequeñas, y con un po cen aje al o se consigue una buena
sepa ación de las p o eínas de meno amaño. Los geles se diseña on con una pa e
empaque ado a o s acking en la pa e supe io de és os, ealizando lo que se llama una
elec o o esis discon inua. En es a pa e la esolución del gel es meno , ya que el po cen aje
de ac ilamida u ilizado ue del 4% en es e caso, lo que se aduce en un amaño de po o
mayo , que pe mi e a las p o eínas a a esa la más ácilmen e. Con ello, se consigues un
apilamien o jus o al inicio de la pa e sepa ado a del gel, es deci , la de esolución mayo . El
ol aje aplicado en la elec o o esis ue de 80V en el gel empaque ado y de 120V en el
sepa ado . El ol aje usado en el empaque ado es meno pa a da iempo a que odas las
p o eínas se concen en en una banda disc e a al inicio del gel sepa ado , ya que al ca ga , se
usó un olumen al o y, sin gel s acking, se gene a ían bandas anchas.
Además de p epa a los geles, se p epa a on las mezclas de ca ga o madas po 10µl
de cada mues a p o eica ecogida en la c oma og a ía, a las cuales se le añadie on 2µl de los
ampones de ca ga que se desc iben en el anexo II. Es as mezclas se calen a on a 99°C du an e
5 minu os p o oca la desna u alización de las p o eínas an es de some e las a la
elec o o esis.
Figu a 10. Geles de SDS-PAGE de Naja haje de Mali después de co a las bandas.
16
En es e caso, la elec o o esis se ealizó po duplicado, pe o añadiendo β-
me cap oe anol en las mezclas de ca ga de uno de es os duplicados. És e es un agen e
educ o que disocia los puen es disul u o, ompiendo así enlaces disul u o e cia ios y
cua e na ios y desplegando a las p o eínas o almen e en su es uc u a p ima ia.
La SDS-PAGE se dejó co e con olando isualmen e, has a que el en e del ampón
de ca ga eco ie a odo el gel, pa a e i a que las p o eínas se salie an. Una ez e minada la
elec o o esis, se eco a on las bandas p esen es en el gel, como se puede e en la igu a 10,
pa a pos e io men e se dige idas y lle adas al espec óme o de masas.
3.3. Diges ión
Una ez eco adas las bandas elec o o é icas, se debe ex ae la pa e p o eica
p esen e en és as. Pa a ello se ealizó una in-gel diges ion con el diges o au oma izado
P oGes P o ein Diges ion Wo ks a ion. Es e diges o ealiza p ime o una educción de las
p o eínas con 10mM de di io ei ol (DTT), seguida de una alquilación con 50mM de
iodoace amida y po úl imo una diges ión con ipsina du an e oda la noche (25ng de ipsina
po mues a).
Al día siguien e, se ecogie on los pép idos esul an es de la diges ión y se lle a on a la
cen í uga de acío Sa an (la misma que se u ilizó después de la c oma og a ía), pa a seca las
mues as. Una ez secas, an es de lle a las al espec óme o de masas, se esuspendie on con
un olumen de e minado de 0.1% de ácido ó mico en MilliQ, en unción de la can idad de
p o eína que se obse ó en cada banda del gel, pa a in en a ene odas las mues as en la
misma concen ación.
3.4. Espec ome ía de masas (MS)
Pa a el análisis de las masas o ales y los dige idos íp icos, se u ilizó un nano UPLC-
ESI-QUAD-TOF (nano-Acqui y Ul a Pe o mance Liquid C oma og aphy acoplado a un
espec óme o de masas SYNAPT G2 High De ini ion Mass Spec ome y Sys em de Wa e s
Co po a ion). La columna u ilizada en la c oma og a ía ue una BEH130 de 100µm x 100mm y
p esen a un amaño de pa ícula de 1.7µm, y se abajó a un lujo de 0.6ul/min.
En p ime luga , se calcula on las masas o ales de las p o eínas a pa i de las
acciones ecogidas di ec amen e del HPLC. Pa a ello se in oduje on dichas acciones en el
espec óme o de masas, donde ue on ionizadas median e elec osp ay (ESI) y
pos e io men e sepa adas en unción de su elación masa-ca ga median e la écnica
quad upolo (QUAD). Una ez sepa adas las p o eínas se u ilizó la siguien e ó mula pa a
calcula sus masas:
𝑀1= 𝑀2
Ecuación 2. Donde M es igual a:
𝑀 = (𝑚𝑧
⁄ ) ∗ 𝑧 − 𝑧
Ecuación 2.1. Donde: (m/z) es la elación masa-ca ga del pép ido y z la ca ga de és e.

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Pa a calcula las masas es necesa io sabe la ca ga que p esen a cada pép ido y pa a
ello, se asignó la ca ga n a uno de los iones y en o den ascendien e hacia la de echa y
descenden e hacia la izquie da como se puede e en la igu a 11.
Figu a 11. Espec o de Naja haje de Mali, con las ca gas asociadas a los iones en modo de incógni a en unción de n.
En es e ejemplo el cálculo se ía:
1116.93 ∗ 𝑛 − 𝑛 = 977.44 ∗(𝑛 + 1)− (𝑛 + 1)
Ecuación 2.1. Desa ollada con los alo es del ejemplo.
Despejando el esul ado es que n=7, quedando po an o las ca gas de la siguien e
mane a:
Figu a 11.1. Espec o de la Figu a 11 pe o con las ca gas conocidas.
Po úl imo se calcula la masa de la p o eína u ilizando la ecuación con la ecuación 2, a
pa i de cualquie a de los pép idos, que en es e caso se ía:
𝑀 = 1116.93 ∗ 7 − 7 = 7811.51 𝐷𝑎
Ecuación 2. Desa ollada con los da os del ejemplo.
El o o análisis que se lle ó a cabo ue la iden i icación de los agmen os pep ídicos
de i ados de las p o eínas iniciales. Pa a ello, se u iliza on las mues as que ue on some idas
a odo el p o ocolo (HPLC, SDS-PAGE e in-gel diges ión). Al igual que en el análisis an e io ,
an es de analiza las en el espec óme o, se ealizó una UPLC pa a sepa a las p o eínas
p esen es en las mues as. En es e caso, se u ilizó la llamada espec ome ía de masas en
ándem o MS/MS, en la que después de la ionización po ESI los iones ca gados con 2, 3 y 4
ca gas posi i as ue on seleccionados en el quad upolo y pasa on a una celda de colisión
inducida (CID), donde se agmen a on en iones más pequeños. Una ez agmen ados se
sepa a on median e la écnica iempo de uelo (TOF), y se ob u ie on espec os que
pos e io men e si ie on pa a la iden i icación p o eica.
18
Es os espec os del MS/MS ue on in e p e ados usando el p og ama online MASCOT,
pa a ealiza la búsqueda en la base de da os del NCBI (h p://www.ma ixscience.com). En los
casos en los que la búsqueda no dio esul ados, se analiza on los espec os manualmen e
median e secuenciación de no o, hallando la secuencia aminoacídica de los pép idos. En es e
segundo caso, las secuencias ob enidas ue on compa adas con las p esen es en la base de
da os del NCBI u ilizando el p og ama BLAST. El obje i o de ambas búsquedas (con MASCOT y
BLAST) ue iden i ica las amílias p o eicas a las que pe enecen las p o eínas analizadas en el
espec óme o de masas.
3.5. Cálculo de la abundancia ela i a de las oxinas
Una ez iden i icadas las amilias p o eicas de las oxinas, se es ima on sus
abundancias ela i as en cada eneno es udiado. Pa a ello se suma on las á eas de los picos
c oma og á icos pe enecien es a la misma amilia p o eica pa a ob ene el 100% y después se
calculó el po cen aje que ep esen aba cada pico. No obs an e, debido a que la mayo ía de
picos es aban ep esen ados po más de una banda en la SDS-PAGE, se ealizó una
densi ome ía de los geles u ilizando el p og ama Me a Imaging Se ies 7.1, con el que se
asignó la p opo ción de cada banda espec o al po cen aje o al del pico.
En algunas de las bandas de la elec o o esis, al ealiza la búsqueda en bases de da os,
se encon a on esul ados de di e en es amilias p o eicas den o de la misma banda. Pa a
esol e es e p oblema, la abundancia ela i a de cada amilia p o eica p esen e en la banda
ue es imada basándose en la in ensidad ela i a de los es iones más abundan es en el
análisis de espec ome ía de MS/MS, es deci , se obse a on es os es iones, a que amilia
p o eica pe enecían, se suma on sus in ensidades y se ealizó el p omedio de la in ensidad de
cada ion espec o a la in ensidad o al. En base a dicho p omedio, se asignó la pa e po cen ual
co espondien e a cada amilia p o eica p esen e en la banda de la SDS-PAGE.
19
4. Resul ados y discusión
Se ealizó odo el p oceso expe imen al de allado an e io men e pa a los enenos de
las se pien es Naja haje (de Ma uecos y de Mali), Naja annuli e a, Naja nig icollis nig icinc a y
Naja melanoleuca melanoleuca (de Uganda) y se ob u ie on las ca ac e izaciones p o eómicas
de és os enenos. En dichas ca ac e izaciones p o eicas, no sólo se iden i ica on las p o eínas,
sino que además se de e mina on las masas molecula es de las p o eínas iden i icadas y se
ealiza on ablas in o ma i as (anexo III) donde se desc iben el pico donde se ha encon ado la
p o eína, el po cen aje del o al de p o eínas del eneno que ep esen a, la masa molecula
además de la elación masa ca ga de la p o eína con la que iden i icó, su ca ga, la secuencia
con lo que se encon ó simili ud, el sco e y la especie en la que se encon ó. Con es as ablas
se p e endió da el máximo de in o mación an o pa a es e es udio como pa a la ealización de
pos e io es es udios. Pa a la nomencla u a de las di e en es amilias p o eicas en la
cons ucción de los g á icos se u iliza on las ab e ia u as que se de allan en el anexo IV.
4.1. Análisis de los enenos
Naja haje (Ma uecos)
En los co ma og amas de los enenos se pueden di e encia p incipalmen e 2 g upos:
p o eínas más pola es y más apola es. El p ime g upo es á compues o en es e caso
p incipalmen e po las 3FTx, Kuni z, NGF y PLA2, y ocupa an desde el pico 1 al 17 en es e caso,
mien as que el segundo des acan las SVMP y las CRISP (más apola es) y se ían el es o de
picos. Visualmen e se puede obse a como p edominan las p o eínas del p ime g upo, de
hecho, el po cen aje de las á eas de los picos 1-17 es del 86.23%. De es e po cen aje el 68.08%
co esponde a 3FTx y es que del pico 1 al 9, la o alidad de las p o eínas iden i icadas
pe enecen a es a amilia y además, son las más des acadas en los picos 14 y 15 (los que más
á ea ep esen an).
Po o o lado, los picos 18,19 y 20 ep esen an la o alidad de las CRISP, además de
cie o po cen aje de las me alop o einasas (PIII-SVMP) encon adas, mien as que los úl imos
es picos son iden i ican p ác icamen e en su o alidad con el es o de las me alop o einasas y
el 0.6% co espondien e a las LAAO.
20
Naja haje (Mali)
En es e eneno, los 7 p ime os picos, excep o el 5 ue on ecogidos pe o no se ealizó
el es o del p oceso expe imen al po p oblemas écnicos. No obs an e, a la is a de los
esul ados ob enidos a pa i de los o os enenos y del pico 5 de es e eneno, se espe a que
el po cen aje co espondien e a dichos picos (el 12.10% asignado a p o eínas no iden i icadas),
es é compues o po oxinas de la amilia 3FTx, ya que son las más pola es y po an o, con un
iempo de e ención meno . No obs an e, pa a la con inuación de es e es udio se co e á de
nue o el eneno y se iden i ica án las p o eínas p esen es en es os picos.
En cuan o a las p o eínas sí iden i icadas, se puede e la di isión de los dos g upos de
amilias p o eicas, mencionados en el an e io eneno, a los 50 minu os ap oximadamen e
(en e el pico 19 y 20). En el p ime g upo son muy p edominan es las oxinas de la amilia
h ee inge oxins, ya que los po cen ajes de las o as amilias mayo i a ias de es e g upo,
como son NGF, PLA2 y Kuni z, ue on in e io es al 2% e incluso no se llegó a iden i ica
ninguna Kuni z.
Figu a 12. C oma og ama del eneno de Naja haje de Ma uecos con los picos nume ados. Además, se mues a el
g á ico de las amilias p o eicas iden i icadas y el po cen aje espec o al o al de p o eínas que ep esen a cada
amilia.
27
Como se ha mencionado, o a de las di e encias signi ica i as en e los enenos es la
g an di e encia po cen ual de las p o eínas de la amilia PLA2 en los enenos de Naja n.
nig icin a y N. m. melanoleuca espec o a las o as dos especies, siendo incluso in e io al 1%,
el alo de su abundancia ela i a en la N. annuli e a.
Po o o lado, o o esul ado signi ica i o es la p esencia de me alop o einasas (SVMP)
en los enenos es udiados. Las SVMP son ca ac e ís icas de los ipé idos debido a su
impo an e e ec o hemo ágico y po ello se encuen an en un mayo po cen aje. No obs an e,
como se puede e en la igu a 17, son amilias de oxinas ela i amen e abundan es en las
Najas es udiadas. De hecho, en los enenos de la N. annuli e a y la N. haje llega a se el
segundo g upo más abundan e después de las 3FTx ep esen ando al ededo del 12% y el 8%
del o al de las p o eínas. Es os esul ados demues an que a pesa del ca ác e neu o óxico
del eneno de las cob as, ambién exis e un impo an e e ec o hemo ágico que aumen a los
p oblemas de i ados de los en enenamien os.
En el caso de las CRISP, esul a in e esan e el hecho de que man ienen un alo de
abundancia ela i a ela i amen e simila en odas las especies es udiadas menos en la N. n.
nig icinc a, donde es p ác icamen e inexis en e. Con las Kuni z ocu e un algo similia , aunque
en es e caso llega incluso a no se inden i icada en es a especie. Cabe des aca que, aunque
apa ece ambién en el eneno la N. annuli e a compone solo el 0.4% del o al de p o eínas en
de és e, muy lejos del 4% en el eneno de la N. m. melanoleuca.
Además, con la in e p e ación de los c oma og amas ealizada con an e io idad, se
pueden iden i ica las di e encias de abundancias ela i as en e enenos en los
c oma og amas.
En p ime luga se deben iden i ica los dos g andes g upos de amilias p o eicas
mencionados du an e es e apa ado, que se si úan en e el minu o 10 y el 50-55
ap oximadamen e, el p ime g upo y del 50-55 has a el inal el segundo. En es e segundo
g upo, el de las p o eínas más apola es, se puede además hace una subdi isión en dos g upos
más, ya que al ededo del minu o 60 se obse a siemp e una zona con unos 3 o 4 picos y a
pa i de los 70-75 minu os se obse a o a zona de picos. En el g upo de p o eínas e enidas
60 minu os las dos amilias más abundan es son las PIII-SVMP y las CRISP, aunque
no malmen e p edominan las CRISP ya que son más pola es que las me alop o einasas. Se
puede obse a como la in ensidad de los picos en esa zona es á elacionada con la can idad
de oxinas de la amilia CRISP p esen es en los enenos. De hecho en la N. n. nig icinc a los
picos son muy pequeños y el po cen aje de CRISP es de an solo 0.04% de las p o eínas o ales,
mien as que en el es o de enenos es udiados, la in ensidad de los picos en esa zona es
mayo , y se aduce en un mayo po cen aje de oxinas de es a amilia.
Po o o lado, en el g upo de las p o eínas más pola es y que, po an o, son
de ec adas más p on o (en los 25 p ime os minu os ap oximadamen e), siemp e pe enecen a
la amilia de las 3FTx. No obs an e, has a el minu o 50-55 no dejan de iden i ica se es as
oxinas, aunque a pa i de esos 25 minu os se combinan con o as, p incipalmen e PLA2 y
algunas NGF y Kuni z. De es as o as es amilias, la PLA2 ep esen a una pa e impo an e
del eneno en las N. n. nig icinc a y N. m. melanoleuca. En el c oma og ama, es as p o eínas se
asocian p ác icamen e en su o alidad con los picos de al a in ensidad que se de ec a on
al ededo de los 35 minu os, como son el pico 14 en la N. n. nig icinc a y el 12 en la N. m.
melanoleuca. No obs an e, obse ando los c oma og amas, en los o os dos enenos ambién
se obse an picos in ensos en esa zona que después no se aducen en un al o po cen aje de
PLA2. Es o se debe a que es as oxinas se encuen an no malmen e en esos picos, pe o no

28
implica que sean las únicas, ya que en esa zona ambién se de ec an muchas oxinas de la
amilia 3FTx.
4.4. Va iación in aespecí ica geog á ica
En es e es udio, se analiza on los enenos de dos Naja haje de países di e en es con el
obje i o de es udia posibles di e encias en la composición p o eica de es os enenos
asociadas a sus localizaciones geog á icas. La Naja haje o cob a egipcia ue muy impo an e en
la mi ología egipcia, siendo el símbolo de sobe anía pa a los a aones, quien las inco po aban
en sus diademas.
Po lo que espec a a su hábi a , se pueden encon a an o en es epas como en
sabanas o egiones semidesé icas con algo de agua y ege ación y además, son e es es y
noc u nas. Habi an en nume osos luga es del no e de Á ica y Á ica occiden al
p incipalmen e, aunque ambién se encuen an en Sudán y Sudán del su y algunos pun os del
Á ica O ien al ( igu a 19). En es e abajo los enenos es udiados ue on de Najas haje de
Ma uecos y de Mali.
Después de ealiza la ca ac e ización de ambos enenos se pueden obse a algunas
di e encias. No obs an e, es as di e encias son ob iamen e meno es que las di e encias
encon adas al compa a enenos de di e en es especies ( igu a 20).
Figu a 18. C oma og amas nume ados de los enenos de las especies a compa a
29
El alo de las 3FTx en el eneno de la se pien e de Mali es meno que en la de
Ma uecos, aunque como se ha mencionado con an e io idad, en los p ime os picos de es e
eneno no se pudie on iden i ica sus p o eínas, con lo que se espe a que el alo po cen ual
de ambos enenos pa a la amilia de las 3FTx sea más simila .
O o da o in e esan e, es la mayo abundancia de las p o eínas más pola es en el
eneno de la se pien e de Ma uecos, mien as que en Mali, abundan más las p o eínas con
ca ác e más apola . En el p ime caso se obse a que, aunque no de mane a signi ica i a, el
alo de PLA2 en el eneno de la N. haje de Ma uecos es mayo que en el de la de Mali, y
sucede lo mismo con las p o eínas de la amilia NGF. El da o que sí p esen a mayo
impo ancia, es la ausencia de p o eínas de la amilia Kuni z en el eneno de Mali, mien as
que en el de Ma uecos ep esen a casi el 3% del o al de p o eínas.
Figu a 20. G á icos de las abundancias ela i as de las p o eínas de los enenos de las dos Naja haje es udiadas.
Figu a 19. Iden i icación de las zonas del con inen e a icano donde se han
encon ado se pien es de la amilia Naja haje. Se esal an los dos países de los
cuales p o ienen las dos se pien es es es a especie es udiadas en es e abajo.
30
En cuan o al g upo de p o eínas más apola es, las es mayo i a ias (PIII-SVMP, CRISP y
LAAO) son más abundan es en el eneno es udiado de la cob a de Mali. Es o se aduci ía en
más e ec os de ca ác e hemo ágico en la íc ima con el en enenamien o de és a Naja haje.
Es as di e encias de composición del eneno se deben p incipalmen e a las di e encias
en las condiciones geog á icas en e ambos países. Mien as que en Mali p edominan las zonas
desé icas y de sabana y con poca ege ación, en Ma uecos exis en cua o co dille as
mon añosas. Po o o lado, ambién exis en di e encias climá icas, ya que Ma uecos p esen a
un clima Medi e áneo mien as que en Mali el clima es sub opical, con muy pocas
p ecipi aciones y ecuen es pe iodos de sequía. Además, a causa de es as di e encias los
ecosis emas no son los mismos, y las especies que los habi an ampoco, con lo que las p esas
que si en de alimen o pa a es as cob as pod ían a ia en mayo o meno medida.
No obs an e, se debe segui in es igando en es a línea pa a iden i ica pa ones
geog á icos que puedan in lui en la composición inal del eneno de las Naja haje y de hecho,
ac ualmen e es e es udio se es á ampliando.
31
5. Conclusiones
 Se ha comp obado que los enenos de las Najas es udiadas p esen an un
p edominan e ca ác e neu o óxico, aunque ambién es án compues os po p o eínas
que p oducen e ec os hemo ágicos.
 Las p o eínas más abundan es en odos los enenos es udiados son de la amilia 3FTx,
des acando así su impo ancia en los enenos de las cob as.
 Exis en nume osas di e encias in e especí icas en las abundancias ela i as de las
amilias p o eicas en los enenos de las especies Naja haje, Naja annuli e a, Naja
melanoleuca melanoleuca y Naja nig icollis nig icinc a.
 Se encon a on di e encias in aespecí icas de ca ác e geog á ico en e los enenos
de las Naja haje de Ma uecos y de Mali.
32
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