UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE
VALÈNCIA
ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR
D’ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL
MEDI NATURAL
De ección po hib idación molecula de
i us en cul i os de oma e con manejo
con encional, in eg ado y ecológico
TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA
ALUMNO: Fe an Sala e Pamblanco
DIRECTORES: D . Luis Rubio Miguélez y D . Luis Galipienso To eg osa
TUTOR: Ca melo López del Rincón
Cu so Académico 2015-2016
VALENCIA, Julio de 2016
ALUMNO: Fe an Sala e Pamblanco
DIRECTORES: Luis Rubio Miguélez y Luis Galipienso To eg osa
TUTOR: Ca melo López del Rincón
FECHA: Valencia, Julio de 2016
TÍTULO: De ección po hib idación molecula de i us en cul i os de oma e con manejo
con encional, in eg ado y ecológico
RESUMEN
El c ecien e in e és po lle a a cabo p ác icas sos enibles con el medio ambien e, ambién
ha llegado a la ag icul u a, p oduciéndose un inc emen o de las p ác icas ecológicas u
o gánicas en las úl imas décadas. Las en e medades i ales causan g a es daños y
pé didas económicas en cul i os de oma e de odo el mundo, lo que supone una
educción en la p oducción. En e los i us más impo an es es án los i us del mosaico
del oma e (ToMV), del mosaico del pepino (CMV), del b onceado del oma e (TSWV), del
mosaico del pepino dulce (PepMV), del mo eado de la pa ie a ia (PMoV) y del izado
ama illo del oma e (TYLCV). Resul a c ucial dispone de un mé odo de de ección p eciso
y ápido, pa a e alua la incidencia de es os i us y pode aplica los co espondien es
mé odos de con ol de la en e medad.
En es e abajo se puso a pun o la hib idación molecula pa a de ec a es os i us, y se
aplicó pa a es ima cómo a ía la incidencia de los mismos du an e el cul i o de oma e en
campos con un manejo con encional, in eg ado y ecológico.
PALABRAS CLAVE: diagnós ico, hib idación, i us, oma e, cul i o ecológico.
AUTHOR: Fe an Sala e Pamblanco
DIRECTORS: Luis Rubio Miguélez y Luis Galipienso To eg osa
TUTOR: Ca melo López del Rincón
DATE: Valencia, July 2016
TITLE: De ec ion by molecula hyb idiza ion o i uses in oma o c ops unde
con en ional, in eg a ed and o ganic managemen
ABSTRACT
The g owing in e es in ca ying ou sus ainable p ac ices wi h he en i onmen has also
come o ag icul u e, esul ing in an inc ease on he ecological o o ganic p ac ices in he
las decades. The i al diseases cause se ious damage and economical loses in oma o
c ops all o e he wo ld, which is ansla ed in o a educ ion o he p oduc ion. Among he
mos impo an i uses is i possible o ind he Toma o Mosaic Vi us (ToMV), he
Cucumbe Mosaic Vi us (CMV), he Toma o Spo ed Wil Vi us (TSWV), he Pepino Mosaic
Vi us (PepMV), he Pa ie a ia Mo le Vi us (PMoV) o he Toma o Yellow Lea Cu l Vi us
(TYLCV). I is c ucial o ha e a p ecise and as de ec ion me hod, in o de o e alua e he
incidence o hese i uses and o apply he mos sui able con ol me hods o he disease.
In his p ojec , he molecula hyb idiza ion has been se -up o de ec ing hese i uses,
and has been applied o analyze he a ia ions on he i al incidence du ing he oma o
c op in ields unde con en ional, in eg a ed and o ganic managemen s.
KEYWORDS: diagnosis, hyb idiza ion, i us, oma o, o ganic cul u e.
AGRADECIMIENTOS
En p ime luga me gus a ía dedica les es e abajo a mis pad es, he manas y ía;
que me han impedido sali me del camino y me han animado pa a segui y pode es a
aho a mismo esc ibiendo es as palab as. También ag adece odo el apoyo que he enido
po pa e de amigos y amigas más ce canos, que me han dado el úl imo empujón que
necesi aba.
Pa a pode lle a a cabo los ensayos de campo, se han es ablecido dis in as
colabo aciones con pa icula es e ins i uciones. Mención especial me gus a ía hace a una
pe sona que gene osamen e cedió su pa cela pa icula de Vinalesa y se enca gó del
manejo del cul i o siguiendo las di ec ices de es e es udio: Vicen e Llo is, muchas g acias.
También ag adece a la Fundación Cajama Valencia, y más en pa icula a Ca los Baixauli,
di ec o del Cen o de Expe iencias de la undación, po adjudica una pa cela en Paipo a
pa a es e es udio y lle a a cabo los manejos es ipulados del cul i o de oma e.
Finalmen e, ag adece a José Se a y Josep Roselló, de la Es ación Expe imen al de
Ca caixen del Ins i u o Valenciano de In es igaciones Ag a ias, po ealiza el diseño y
seguimien o de los ensayos de Vinalesa, Paipo a y Ca caixen y enca ga se del cul i o y
manejo de la pa cela de Ca caixen . Des aca abién al D . Albe o U baneja y a su equipo,
po su pa icipación y aseso amien o en el con ol biológico
Po úl imo, aunque no menos impo an e, ag adece al Ins i u o Valenciano de
In es igaciones Ag a ias (IVIA) y a odas aquellas pe sonas del labo a o io que me han
ayudado en la ealización del p oyec o. G acias a And és Puchades, que me ha aconsejado
du an e odo el desa ollo expe imen al. Finalmen e, ag adece a mis dos di ec o es, Luis
Rubio y Luis Galipienso, g acias a los cuales ha sido posible la ealización de es e p oyec o.
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................................. 1
1.1. El modelo de cul i o ecológico .............................................................................................................. 1
1.2. Cul i o de oma e en la Comunidad Valenciana y la impo ancia de los i us ................. 3
1.3. In o mación básica ace ca de los i us del es udio ....................................................................... 4
1.3.1. CMV ................................................................................................................................................. 4
1.3.2. PepMV............................................................................................................................................ 5
1.3.3. PMoV .............................................................................................................................................. 6
1.3.4. ToMV .............................................................................................................................................. 7
1.3.5. TSWV .............................................................................................................................................. 8
1.3.6. TYLCV ............................................................................................................................................ 9
1.4. De ección y diagnós ico de i us ....................................................................................................... 10
2. OBJETIVOS .................................................................................................................................................... 12
3. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................................... 13
3.1. Diseño expe imen al y mues eo ....................................................................................................... 13
3.2. Pu i icación de ácidos nucleicos ........................................................................................................ 14
3.3. De ección de los i us po hib idación molecula ...................................................................... 15
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................................................. 19
4.1. Incidencia i al as la hib idación molecula .............................................................................. 19
4.2. Pa icula idades de la in ección i al ................................................................................................ 20
4.2.1. Ensayo 1: Paipo a................................................................................................................. 20
4.2.2. Ensayo 2: Ca caixen ............................................................................................................ 22
4.2.3. Ensayo 3: Vinalesa ................................................................................................................ 22
5. CONCLUSIONES ........................................................................................................................................... 23
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................................... 24

ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Composición de las di e en es soluciones u ilizadas .......................................................... 18
ÍNDICE DE FIGURAS
Figu a 1. E olución del consumo anual de e ilizan e en España .................................................... 2
Figu a 2. E olución de la supe icie des inada a ag icul u a ecológica en España..................... 2
Figu a 3. P oducción de ho alizas en España media de 2008 a 2012 ............................................ 3
Figu a 4. Rep esen ación de la pa ícula i al o i ión de CMV ......................................................... 5
Figu a 5. Rep esen ación de la es uc u a del genoma de los i us del géne o
Cucumo i us ............................................................................................................................................................ 5
Figu a 6. Rep esen ación del i ión de PepMV ......................................................................................... 6
Figu a 7. Rep esen ación de la es uc u a del genoma de PepMV .................................................... 6
Figu a 8. Rep esen ación de la pa ícula i al de PMoV ........................................................................ 7
Figu a 9. Rep esen ación de la es uc u a del genoma de los i us del géne o Ila i us ....... 7
Figu a 10. Rep esen ación del i ión de ToMV ......................................................................................... 8
Figu a 11. Rep esen ación de la es uc u a del genoma de ToMV .................................................... 8
Figu a 12. Rep esen ación del i ión de TSWV ......................................................................................... 9
Figu a 13. Rep esen ación de la es uc u a del genoma de TSWV ................................................... 9
Figu a 14. Rep esen ación del i ión de TYLCV .................................................................................... 10
Figu a 15. Rep esen ación de la la es uc u a del genoma de TYLCV .......................................... 10
Figu a 16. Esquema del p oceso de la hib idación molecula de ácidos nucleicos ................. 11
Figu a 17. Esquema de las plan aciones de oma e usado en los es ensayos localizados en
Paipo a, Ca caixen y Vinalesa ..................................................................................................................... 14
Figu a 18. Rep esen ación de la memb ana de hib idación ............................................................. 16
Figu a 19. Resul ados de las p uebas de eacción c uzada en e las di e en es sondas ...... 16
Figu a 20. Resul ados de incidencia as lle a a cabo la hib idación molecula de los seis
i us de es udio ................................................................................................................................................... 20
Figu a 21. E olución de la incidencia de ToMV a lo la go del iempo en la pa cela bajo
manejo in ensi o y ecológico en las a iedades de oma e Valenciano y Óp ima ................... 21
LISTADO DE ABREVIATURAS
ADN Ácido Desoxi ibonucleico
AMV Al al a Mosaic Vi us
ARN Ácido Ribonucleico
CMV Cucumbe Mosaic Vi us
CP P o eína de cápside
CSPD Quimioluminiscen e
CTAB B omu o de hexadecil ime ilamonio
EDTA Ácido e ilendiamino e aacé ico
F:Cl:AI Fenol:Clo o o mo:Alcohol isoamílico
h ho a(s)
M Mola
mJ miliJulio(s)
MP P o eína de mo imien o
NaCl Clo u o de sodio
N. enuis Nesidioco is enuis
ORF Open Reading F ame
PCR Reacción en cadena de la polime asa
PepMVPepino Mosaic Vi us
PMoV Pa ie a ia Mo le Vi us
PTGS Silenciamien o Génico Pos -T ansc ipcional
PVY Po a o Vi us Y
RdRp ARN polime asa dependiden e de ARN
pm Re oluciones/minu o
RT-PCR Reacción en cadena de la polime asa con ansc ip asa e e sa
SDS Dodecilsul a o sódico
SSC Tampón SSC
TCES T is, NaCl, EDTA, SDS (Tampón ex acción ARN)
TMV Tobacco Mosaic Vi us
ToMV Toma o Mosaic Vi us
TSWV Toma o Spo ed Wil Vi us
TYLCD Toma o Yellow Lea Cu l Disease
TYLCV Toma o Yellow Lea Cu l Vi us
l Mic oli o(s)
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1. El modelo de cul i o ecológico
La ag icul u a es i al pa a nues a sociedad ya que, de la misma, depende en g an
medida la alimen ación de la población mundial, la cual es á en cons an e c ecimien o.
Debido a la c ecien e demanda de alimen os, han eme gido múl iples inno aciones y
a ances ecnológicos, con el in de aumen a la p oduc i idad (P e y e al., 2010).
El modelo ag ícola es ablecido, conocido como con encional, es á basado en el
monocul i o de a iedades ege ales de al o endimien o, y depende de un uso ele ado de
p oduc os ag oquímicos. Pese a que los esul ados a ni el de p oducción que se ob ienen
de su u ilización son muy al os, ambién lo son los e ec os nega i os que de i an de su
pues a en p ác ica: con aminación del medio ambien e po la u ilización de los
ag oquímicos, aumen o de la esis encia de las plagas y las en e medades, e osión y
disminución p og esi a de la e ilidad del suelo, iesgos pa a la salud humana y animal,
e c. Es en es e ma co, es cuando empieza a oma impo ancia la ag icul u a ecológica,
ambién conocida como o gánica. La ag icul u a ecológica se puede de ini como la pues a
en p ác ica de un conjun o de écnicas de conse ación y mejo a de la calidad del suelo,
que a o ecen al ecosis ema, y que pe mi en la ob ención de p oduc os de máxima calidad
nu i i a, sin la u ilización de p oduc os químicos de sín esis, lo que pe mi e man ene la
sos enibilidad del medio ambien e. En los úl imos ein e años se ha p oducido un
inc emen o de su popula idad en odo el mundo (De Pon i e al., 2012). La demanda, po
pa e de los consumido es, de p oduc os “amigables” con el medio ambien e, que
es u ie an p oducidos siguiendo unas pau as de e minadas y es u ie an lib es de
p oduc os químicos, ha pe mi ido la expansión de es e modelo de cul i o (Rigby y Cáce es,
2001).
Pese a es e inc emen o en su popula idad, oda ía sigue siendo bajo el po cen aje
de e eno de cul i o des inado al cul i o ecológico. Se islumb an azones, an o po
pa e de la pe spec i a del consumido , como de la del p oduc o , que condicionan la
pues a en p ác ica de es as écnicas. Po una pa e, aquellos p oduc os gene ados
u ilizando es as écnicas, suelen i acompañados de p ecios más ele ados y, po o a pa e,
se suelen ob ene meno es y más a iables endimien os, a la ez que la demanda de es os
ipos de p oduc os suele se más limi ada (De Pon i e al,. 2012).
Como bene icio de la u ilización de es e ipo de manejo, se encuen a el
en iquecimien o del suelo. Las p ác icas lle adas a cabo, como son la o ación de cul i os,
el cul i o mix o, la u ilización de cul i os de cubie a, e c; bene ician a la auna y lo a del
suelo, al mismo iempo que a la o mación y es uc u ación del mismo, p opiciando
sis emas más es ables. A su ez, se p oduce una mejo a de la capacidad de e ención de
nu ien es y agua, inc emen ándose ambién la ci culación de los mismos y de ene gía, lo
que con luye en una independencia de la u ilización de e ilizan es mine ales. G acias a
es a mejo capacidad de e ención de nu ien es se educe el pelig o de con aminación de
aguas sub e áneas, un p oblema muy acusado en el manejo con encional, debido a la
u ilización de e ilizan es y plaguicidas sin é icos. O o aspec o des acable es la mayo
ijación de ca bono en el suelo, u o de las p ác icas lle adas a cabo en es e manejo, lo
cual aumen a la p oduc i idad y ambién con ibuye a mi iga el e ec o in e nade o. Po
úl imo, se gene a un aumen o de la biodi e sidad, ya que se p opo cionan es uc u as que
o ecen sus en o y no se emplean plaguicidas. Se a o ece el es ablecimien o de di e sas
especies de insec os y a ópodos y de o ganismos bene iciosos pa a el sis ema o gánico,
como pueden se polinizado es o dep edado es de plagas, gene ándose un con ol
biológico na u al (Al ie i, 1995).
2
En el caso de España, la in oducción de es e manejo es á siendo p og esi a,
quedando pa en e en la e olución en el consumo anual de e ilizan es (Figu a 1) y, po
o a pa e, la e olución de la supe icie des inada a la ag icul u a o gánica (Figu a 2):
Figu a 1. E olución del consumo anual de e ilizan e en España (Ma ínez e al., 2013)
Figu a 2. E olución de la supe icie des inada a ag icul u a ecológica en España (Ma ínez e al., 2013)
Un sis ema de p oducción ag a ia a medio camino en e la ag icul u a
con encional y la ecológica es la p oducción in eg ada. Es e ipo de ag icul u a pe mi e el
uso de p oduc os ag oquímicos de sín esis (abonos, pes icidas., e c.), aunque
es ingiéndolos odo lo posible y combinándolos con o os más espe uosos con el medio
ambien e, como los mé odos biológicos.
9
Figu a 12. Rep esen ación del i ión de TSWV (h p:// i alzone.expasy.o g)
Figu a 13. Rep esen ación de la es uc u a del genoma de TSWV (h p:// i alzone.expasy.o g)
1.3.6. TYLCV
El i us del izado ama illo del oma e, ambién conocido como “ i us de la
cucha a”, pe enece al géne o Begomo i us. Fue de ec ado po p ime a ez en Is ael en
1959 y es el causan e de una de las en e medades de plan as más de as ado as en odo el
mundo, la en e medad del izado ama illo del oma e (Toma o yellow lea cu l disease,
TYLCD) (Glick e al., 2009). El i us p o oca pé didas en la p oduc i idad muy al as,
dependiendo del es ado enológico de la plan a en el momen o de la in ección, pudiendo
llega has a un 100%. En el á ea del Medi e áneo, es e i us se ha con e ido en un ac o
limi an e an o pa a la p oducción en campo abie o como pa a los cul i os bajo cubie a.
Aunque se a a de un pa ógeno mayo i a iamen e de oma e, se ha epo ado que induce
en e medades en o os cul i os, como las judías (Loebens ein y Lecoq, 2012). Es e i us es
ansmi ido po la mosca blanca Bemicia abaci (Loebens ein y Lecoq, 2012).
Los i iones es án o mado po dos icosaéd os incomple os (Figu a 14) y
encapsida el genoma o mado po una única molécula de ADN ci cula de simple cadena
(Figu a 15) (Glick e al., 2009) que con ienen los siguien es genes:

10
1. C1 codi ica la p o eína Rep, in oluc ada en la egulación de eplicación y
ansc ipción.
2. C2 codi ica T AP que induce un inc emen o de la exp esión de la CP, a la ez que
pa icipa an o en la sup esión de de ensas del huésped como en la in ección i al
sis émica.
3. C3 codi ica REn, que in e ac úa con Rep y ambién aumen a la acumulación del
ADN i al en la plan a in ec ada.
4. C4 codi ica p oduc os implicados en el mo imien o del i us y en la pa ogenicidad.
5. V1 codi ica la CP.
6. V2 codi ica p oduc os implicados en el mo imien o i al.
Figu a 14. Rep esen ación del i ión de TYLCV (h p:// i alzone.expasy.o g)
Figu a 15. Rep esen ación de la la es uc u a del genoma de TYLCV. Los ORFs es án designados como V
(o ien ación i al) o C (o ien ación sen ido complemen a io) (Glick e al., 2009)
1.4. De ección y diagnós ico de i us
Resul a i al pode dispone de un mé odo que sea e icaz y p eciso pa a la
de ección e iden i icación de los i us, ya que una p on a de ección de la p esencia de los
mismos en una plan a cons i uye una de las mejo es he amien as pa a ena su a ance
(Pallás e al., 1998). Po o a pa e, el con ol de la calidad i osani a ia de la semilla,
ambién es un aspec o muy a ene en cuen a pa a el con ol de las en e medades i ales,
pues o que una ce i icación de que el ma e ial de p opagación ege a i o es á exen o de
i us, pe mi e una p oducción de plan as lib es de los mismos y de las en e medades que
11
es os p oducen (Rangel e al., 2006). También esul a muy impo an e ene una
he amien a pa a de ec a la p esencia i al, pa a e alua la capacidad de esis encia y
ole ancia al i us de a iedades de dis in os cul i os ob enidas po mejo a gené ica.
Los p incipales mé odos de diagnós ico o de ección son: la ca ac e ización
biológica, la obse ación al mic oscopio, el análisis se ológico, el análisis de ARN
bica ena io, la hib idación molecula , la eacción en cadena de la polime asa (PCR), la
ampli icación iso é mica, la di e enciación de a ian es gené icas y la secuenciación
nucleo ídica (Rangel, 2015).
La hib idación de ácidos nucleicos (Figu a 16) es la écnica seleccionada pa a es e
es udio, a ándose de una de las más iables y sensi i as a la ho a de lle a a cabo un
diagnós ico de i us en plan as, y iene la en aja añadida de que pe mi e analiza
simul áneamen e un g an núme o de mues as. Es a écnica molecula se basa en la
capacidad de apa eamien o especí ico en e dos cadenas sencillas de ARN, ADN o ARN –
ADN que engan secuencias complemen a ias o mando una es uc u a de doble cadena
más es able. La sín esis de una molécula de ARN o ADN monoca ena io complemen a ia al
genoma del i us (sonda) ma cada con isó opos adioac i os (como el 32P) o con ma cajes
no- adioac i os (como la molécula digoxigenina o di e en es luo ó o os) y su pos e io
hib idación con ácidos nucleicos (do -blo ) de la plan a ijados en un sopo e sólido
(gene almen e una memb ana) pe mi e de ec a la p esencia del i us (Fe iol e al.,
2015)
Figu a 16. Esquema del p oceso de la hib idación molecula de ácidos nucleicos
(h p://and us-dna- ech-p ojec -2012.wikispaces.com)
12
2. OBJETIVOS
El aumen o de la concienciación po la sos enibilidad del medio ambien e es una
ealidad en nues a sociedad. Es o se e leja en la ho icul u a, en la que se es á
p oduciendo un cambio de men alidad en los úl imos iempos, lo que ha hecho eme ge a
la ag icul u a o gánica. Sin emba go, es a no queda exen a de las en e medades i ales, las
cuales suponen un g an impedimen o pa a la p oducción. Po ello, esul a muy impo an e
el es udio de la incidencia i al en las plan as cul i adas bajo es e ipo de manejo, pa a
pode adop a medidas, siemp e bajo la egulación de es e ipo de cul i os; o pa a a a
de segui de e minadas di ec ices du an e el p oceso de cul i o, que pe mi an ene bajo
con ol la g an can idad de en e medades i ales que a ec an a los cul i os de oma e.
El p incipal obje i o de es e abajo es comp oba si exis en di e encias en la
incidencia i al en plan as cul i adas bajo los manejos con encional, in eg ado y ecológico,
al mismo iempo que analiza las azones que han lle ado a esa posible di e encia en la
asa de in ección. Pa a ello, se es ablecen unos obje i os conc e os:
1. Lle a a cabo el diseño expe imen al de los di e en es ensayos
2. Lle a a cabo la de ección de los di e en es i us median e hib idación molecula
3. Analiza los esul ados de incidencia i al ob enidos
13
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Diseño expe imen al y mues eo
Pa a lle a a cabo el es udio, en el e ano de 2015 se lle a on a cabo es ensayos
independien es en las localidades alencianas de Paipo a, Ca caixen y Vinalesa (Figu a
17). En cada uno de ellos, se dema ca on dos pa celas con iguas, cada una de ellas siendo
des inada a un ipo de manejo ag ícola, pe o in en ando que ue an lo mas simila es
posibles pa a que ue an más compa ables. Cada pa cela se di idió en seis subpa celas, en
es se cul i a on plan as de oma e de la a iedad Op ima y en las o as es la a iedad
Toma e Valenciano. Op ima es un hib ido come cial al que se ha inco po ado uno o más de
un genes de esis encia a ToMV y el oma e Valenciano es una a iedad local sin ningún
ipo de esis encias.
Ensayo 1. En Paipo a se compa ó un sis ema de p oducción in eg ada con uno
ecológico a los que se los que se hicie on un a amien o de con ol biológico basado en la
suel a de ejempla es de Nesidioco is enuis. Se a a de un chinche de la amilia de los
mí idos, que un dep edado gene alis a que se alimen a de mosca blanca, lepidóp e os
(incluida la Tu a absolu a que es una plaga pa a oma e), ips y a aña oja. Cuando no
dispone de p esas se puede alimen a del cul i o. Tan o en el cul i o in eg ado como en el
ecológico se u ilizó un sis ema de semi o zado que consis ió en acolchado neg o y
mic o únel de polip opileno é mico de baja densidad (17g/m2). El obje i o e a mejo a
las condiciones ambien ales en las p ime as ases de desa ollo del cul i o y ac ua de
ba e a ísica impidiendo la llegada de insec os ansmiso es de i osis.
Ensayo 2. En Ca caixen se compa ó un cul i o de oma e con encional con uno
ecológico, lle ándose ambién a cabo un a amien o de con ol biológico basado en la
suel a de ejempla es de N. enuis. No se u ilizó ningún sis ema de semi o zado.
Ensayo 3. En Vinalesa, se compa ó un cul i o de oma e con encional con uno
ecológico. No se ealizó ningún a amien o de con ol biológico, ni se empleó ningún
sis ema de semi o zado.
El manejo in eg ado se ealizó siguiendo las di ec ices del Real Dec e o
1201/2002, de 20 de no iemb e (BOE núm. 287 de sábado 30 no iemb e 2002), y el
manejo ecológico según una no ma i a eu opea, el Reglamen o CE 834/2007 sob e
p oducción y e ique aje de los p oduc os ecológicos, cuyas disposiciones de aplicación
(incluyendo el sis ema de con ol) es án es ablecidas po el Reglamen o CE 889/2008. ol)
es án es ablecidas po el Reglamen o CE 889/2008.
14
Paipo a
In eg ado
+ con ol
biológico
Ecológico
+ con ol
biológico
Ca caixen
Ecológico
+Con ol
biológico
Con encional +
con ol biológico
Vinalesa
EcológicoCon encional
Va iedad Valenciano
Va iedad Op ima
Figu a 17. Esquema de las plan aciones de oma e usado en los es ensayos localizados en Paipo a,
Ca caixen y Vinalesa. Cada cuad ado ep esen a una plan a de oma e.
Se ealiza on seis omas de mues a cada dos semanas, excep o pa a el úl imo
mues eo, el cual se lle ó a cabo es semanas después. En el p ime mues eo (27 mayo
de 2015) se selecciona on alea o iamen e dos plan as po cada subpa cela, llegando a un
o al de 72 plan as en e las es localidades. Es as mismas plan as se u iliza on en los
siguien es mues eos pa a lle a a cabo un análisis longi udinal. De cada una de las plan as
seleccionadas se ecogie on 0,2 g de hojas del me is emo apical, que ue on almacenadas
en ubos eppendo de 1,5 ml. Es os ubos eppendo , con el in de p ese a la in eg idad
del posible ma e ial gené ico i al p esen e en el ma e ial ege al, ue on gua dados en un
ecipien e que con enía ni ógeno líquido. Pos e io men e, odas las mues as ob enidas
as cada mues eo se almacena on en un congelado a -80 C.
3.2. Pu i icación de ácidos nucleicos
Pa a pode ob ene el ma e ial gené ico del i us, se lle ó a cabo la pu i icación de
ácidos nucleicos. Pa a los i us de genoma de ARN (CMV, PepMV, PMoV, ToMV y TSWV) se
siguió el mé odo de Fenol/Clo o omo (Fe iol e al., 2011). Es e consis e en:
1. T i u ado de la mues a en ni ógeno líquido en un apa a o “ issuelyse ”, has a que el
ma e ial quede comple amen e homogéneo.
2. Adición de 500 l de ampón TCES, 500 l de enol:clo o o mo:alcohol isoamílico
(F:Cl:AI) y 2.5 l de 2-me cap oe anol. Homogeneización, empleando un agi ado
ó ex, du an e 1 minu o ap oximadamen e. Cen i ugación a 13000 pm du an e 10
minu os.
3. Recogida de la ase acuosa supe io , e i ando la ase o gánica. Adición de 450 l de
F:Cl:AI. Homogeneización, empleando el ó ex, du an e 1 minu o. Cen i ugación a
13000 pm du an e 5 minu os.

15
4. Recogida de la ase acuosa y pos e io adición de 0,1 olúmenes de ace a o sódico 3M
a pH 5,5 y 2 olúmenes de e anol al 95%.
5. Incubación a -20 ºC, du an e un día, pa a consegui una buena p ecipi ación del
ma e ial gené ico.
6. Cen i ugación de las mues as p ecipi adas a una empe a u a de 4ºC y a una
elocidad de 13000 pm, du an e 30 minu os.
7. Eliminación del sob enadan e y la ado del sedimen o con 400 l de e anol al 70%.
Cen i ugación a una empe a u a de 4 ºC y a una elocidad de 13000 pm, du an e 10
minu os.
8. Finalmen e, secado del sedimen o, median e i as de papel Wha man 3MM, y pos e io
esuspensión del mismo en 20 l de H2O es é il.
Pa a ob ene el ma e ial gené ico de TYLCV, el cual se a a de un i us de ADN, se
lle ó a cabo el mé odo de CTAB:
1. T i u ado de la mues a en ni ógeno líquido en un apa a o “ issuelyse ”, has a que el
ma e ial quede comple amen e homogéneo.
2. Añadi 400 l de CTAB y 5 ml de 2-me cap oe anol. Agi a y ó ex.
3. Calen a 1 ho a a 60 ºC agi ando cada 10 min.
4. Añadi 400 l clo o o mo: isoamílico (24:1). Agi a en ó ex.
5. Cen i uga 5 minu os a 12000 pm a empe a u a ambien e.
6. Recoge ase acuosa supe io .
7. Añadi el mismo olumen de isop opanol. Agi a ol eando la g adilla.
8. Deja a -20 ºC du an e 15 minu os.
9. Cen i uga 10 min. a 12.000 pm a una empe a u a de 4 ºC.
10. La a el pelle con e anol 70%.
11. Cen i uga 5 minu os a una elocidad de 10000 pm a una empe a u a de 4 ºC.
12. Seca el sedimen o al ai e y esuspende con 50 l de H2O es é il.
T as lle a a cabo odos es os pasos, se almacenan las mues as en un congelado a
una empe a u a de -80 C.
3.3. De ección de los i us po hib idación molecula
Po cada i us analizado se p epa ó una memb ana de hib idación. Pa a la
elabo ación de la misma se empleó memb ana de nylon ca gada posi i amen e (Roche),
dejando al ededo de 0,5 cm2 pa a cada mues a, de la cual se puso de 1l de ex ac o de
ma e ial gené ico. Al inaliza la colocación de mues as en la memb ana, es a se ija
median e adiación ul a iole a a 120 mJ/cm2, pa a la p ese ación de la in eg idad del
ma e ial gené ico de cada una de las mues as. La disposición de las mues as en cada
memb ana se mues a en la Figu a 18, donde cada columna hace e e encia a cada una de
las 24 mues as, y cada ila a un mues eo, quedando sepa ados los di e en es ensayos po
una ila sin mues as. La disposición de los con oles posi i o y nega i o, quedan
ep esen ados en la memb ana po los signos “+” y “-”, espec i amen e.
16
Figu a 18. Rep esen ación de la memb ana de hib idación. En la memb ana quedan sepa adas las di e en es
mues as de los di e en es ensayos, pe eneciendo las 24 p ime as al ensayo de Ca caixen , de la 25-48 al de
Vinalesa y, po úl imo, de la 49-72 al ensayo de Paipo a. Las le as A, B, C, D, E y F co esponden a los
mues eos del 1 al 6, espec i amen e.
Las sondas empleadas pa a lle a a cabo la hib idación, las cuales es aban
disponibles en el labo a o io, ue on diseñadas a pa i de la secuencia de la CP de cada
i us y se sin e iza on a pa i de RT-PCR o PCR. Se lle ó a cabo un ensayo de eac i idad
c uzada (Figu a 19), pa a comp oba que las sondas hib idaban únicamen e con con oles
posi i os del i us pa a el que habían sido diseñadas. Los esul ados del ensayo de
eac i idad c uzada indica on que las di e en es sondas e an especí icas únicamen e pa a
el i us pa a el que habían sido diseñadas.
Figu a 19. Resul ados de las p uebas de eacción c uzada en e las di e en es sondas, jun o con el esquema, en
la pa e de echa, de la disposición de los di e en es con oles posi i os pa a cada i us en la memb ana. En las
sub igu as A, B, C, D E y F; se mues an los esul ados de la hib idación con las sondas de PMoV, PepMV,
TYLCV, ToMV, CMV y TSWV, espec i amen e, las cuales eacciona on únicamen e con el con ol posi i o del
i us pa a el que habían sido diseñadas.
17
El p o ocolo seguido pa a lle a a cabo la hib idación molecula , cons a de es pa es:
1. P ehib idación: Se lle a a cabo (con solución de hib idación ) du an e un mínimo
de 1 h y un máximo de 3 h, a la empe a u a de hib idación, la cual es de 50 C pa a
sondas de ADN (TYLCV) y 68 C pa a sondas de ARN (CMV, PepMV, PMoV, ToMV y
TSWV).
2. Hib idación: Si la sonda no ha sido p e iamen e u ilizada, se debe desna u aliza a
una empe a u a de 95 C, du an e 10 minu os. Sin emba go , si es a ya ha sido
u ilizada p e iamen e , solo es necesa ia una desna u alización p e ia a 68 C,
ambién du an e 10 minu os. Finalmen e, se añade la sonda al ubo de hib idación,
jun o con solución de hib idación, y el p oceso se ex iende du an e un pe iodo de
iempo en e 12 y 14 h (o e nigh ).
3. La ados. Cons a de los siguien es pasos:
a) La ado 1: Dos la ados de 15 minu os a empe a u a de hib idación con
solución de la ado 1.
b) La ado 2: Dos la ados de 15 minu os a empe a u a de de hib idación con
solución de la ado 2.
c) Malea o-Tween: Dos la ados de 5 minu os a empe a u a ambien e con
ampón malea o- ween.
d) Malea o: Dos la ados de 5 minu os a empe a u a ambien e con ampón
malea o.
e) Bloqueo: Un la ado de 60 minu os a empe a u a ambien e con solución
bloquean e al 2%.
) Bloqueo-An icue po: Un la ado de 30 minu os a empe a u a ambien e con
una dilución 1:10.000 del an icue po en solución bloquean e al 2 %.
g) Malea o-Tween: Dos la ados de 5 minu os a empe a u a ambien e con
ampón malea o- ween.
h) Malea o: Dos la ados de 5 minu os a empe a u a ambien e con ampón
malea o.
i) Incubación en ampón de de ección: Se ex ae la memb ana del ubo de
hib idación y se man iene du an e 2-3 minu os en un ecipien e con ampón de
de ección.
En la Tabla 1 quedan esumidas las composiciones de las di e en es soluciones
u ilizadas du an e odo el p oceso.
Po úl imo, queda el p oceso de e elado de la memb ana. Pa a ello, se oma la
memb ana, se deposi a en el in e io de una unda de plás ico, y se elimina el exceso de
ampón de de ección. El siguien e paso consis e en añadi un olumen su icien e de la
dilución de CSPD (dilución 1:100 en ampón de de ección), y se incuba en oscu idad
du an e 5 minu os. Seguidamen e, se elimina el exceso de CSPD, pa a e i a una eacción
excesi a, que a o ece ía la p esencia de uido de ondo. Se ella la unda y se in oduce en
un case e, jun o con papel o og á ico. Es e se incuba a 37 C en la es u a, pa a aumen a la
ciné ica de la eacción, du an e 20 minu os si se a a de sondas de ADN, y 40 minu os
pa a las de ARN. Finalmen e, se e elan en un cua o oscu o median e la u ilización de
e elado , agua y ijado , en es e o den.
18
Tabla 1. Composición de las di e en es soluciones u ilizadas
Solución
Composición
TCES
0.2M T is-HCl 1M pH 8
0,1M EDTA 0,5M pH 8
0.2 M NaCl
0,2 M SDS 10%
F:Cl:IA
50 % enol sa u ado
48% clo o o mo
2% alcohol isoamílico
Solución de p ehib idación
25 % SSC x 20
0,02 % SDS 10%
0,1 % sal sódica N-la yl 10%
2% eac i o bloquean e
50 % o mamida
La ado 1
10 % SSC x 20
1 % SDS 10%
La ado 2
0,5 % SSC x 20
1 % SDS 10%
Tampón Malea o
100 mM Ácido Maleico
150 mM NaCl pH 7,5
Tampón Malea o-Tween
100 mM Ácido Maleico
150 mM NaCl pH 7,5
0,3 % Tween 20
Solución de eac i o
bloquean e 10%
Disolución del eac i o bloquean e en
ampón malea o a una concen ación
10g/100mL
Tampón de de ección
100 mM T is-HCl
100 mM NaCl
25
Meshi T, Mo oyoshi F, Adachi A, Wa anabe Y, Takama su N, Okada Y (1988) Two
concomi an base subs i u ions in he pu a i e eplicase genes o obacco mosaic i us
con e he abili y o o e come he e ec s o a oma o esis ance gene, Tm-1. The EMBO
jou nal, 7, 1575-1581.
Pallás V, Más P, Sánchez-Na a o JA (1998) De ec ion o plan RNA i uses by noniso opic
do -blo hyb idiza ion. Plan Vi ology P o ocols: F om Vi us Isola ion o T ansgenic
Resis ance, 461-468.
Palukai is P (2011) The Road o RNA Silencing is Pa ed wi h Plan -Vi us In e ac ions.
Plan Pa hology Jou nal , 27, 197-206.
Pana oni A, Lu isi A, T iolo E (2013) Re iew. Elimina ion o i uses in plan s: wen y
yea s o p og ess. Spanish Jou nal o Ag icul u al Resea ch, 11, 173-188.
Panno S, Da ino S, Rubio L, Rangel E, Da ino M, Ga cía-He nández J, Olmos A (2012)
Simul aneous de ec ion o he se en main oma o-in ec ing RNA i uses by wo mul iplex
e e se ansc ip ion polyme ase chain eac ions. Jou nal o i ological me hods, 186, 152-
156.
P e y J, Su he land WJ, Ashby J, Aubu n J, Baulcombe D, Bell M, Ben ley J, Bicke s e h S,
B own K, Bu ke J (2010) The op 100 ques ions o impo ance o he u u e o global
ag icul u e. In e na ional jou nal o ag icul u al sus ainabili y, 8, 219-236.
A angu en E (2015) Desa ollo de mé odos molecula es de de ección de i us de RNA de
cul i os ho ícolas. Tesis Doc o al en Vi ología. Uni e sidad Poli ècnica de València.
Rangel E, Schmid A, Cen eno F (2006) Implemen ación de la écnica de ELISA pa a la
de ención de i us y o os Pa ógenos en plan as de Venezuela. Re is a Digi al del CENIAP
(Venezuela).
Rigby D, Cáce es D (2001) O ganic a ming and he sus ainabili y o ag icul u al sys ems.
Ag icul u al sys ems, 68, 21-40.
She wood J, Ge man T, Moye J, Ullman D (2009) Toma o spo ed wil . The Plan Heal h
Ins uc o DOI: 101094, is o el 20 de junio de 2016
h p://www.apsne .o g/edcen e /in opp/lessons/ i uses/Pages/Toma oSpo edWil .as
px
Sole S, P ohens J, López C, A ambu u J, Galipienso L, Nuez F (2010) Vi uses In ec ing
Toma o in València, Spain: Occu ence, Dis ibu ion and E ec o Seed O igin. Jou nal o
Phy opa hology, 158, 797-805.
Sole -Aleixand e S, Nuez F (2016) Con ol gené ico de la ole ancia a los aislados del ToMV
que supe an la esis encia del gen Tm-2 2 en oma e, is o el 22 de junio de 2016
h p://www.sech.in o/ACTAS/index.php?d=./Ac a%20n%C2%BA%2054.%20VI%20Cong
eso%20Ib%C3%A9 ico%20de%20Ciencias%20Ho %C3%ADcolas.%20XII%20Cong es
o%20Nacional%20de%20Ciencias%20Ho %C3%ADcolas/Comunicaciones/
Van Regenmo el MH, F aenkel-Con a H (2013) The Plan Vi uses: The Rod-shaped Plan
Vi uses. Sp inge Science & Business Media. Plenum P ess. New Yo k: 181-197.
Win e man el WM, Co ez AA, Anchie a AG, Gula i-Sakhuja A, Hladky LL (2008) Co-
in ec ion by wo c ini i uses al e s accumula ion o each i us in a hos -speci ic manne
and in luences e iciency o i us ansmission. Phy opa hology, 98, 1340-1345.