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GRADO EN FARMACIA
TRABAJO DE FIN DE GRADO
Elabo ación de hid ogeles o álmicos ion sensibles pa a el
a amien o de la cis inosis ocula
P epa a ion o ion sensi i e oph halmic hyd ogels o he ea men
o ocula cis inosis
Ca la Ma ía Ga cía Mazás
Julio 2015
Índice
1. Resumen ....................................................................................................................... 2
2. In oducción ................................................................................................................. 4
2.1 Cis inosis ..................................................................................................................... 4
Fo mas clínicas .............................................................................................................. 5
Diagnós ico .................................................................................................................... 7
T a amien o .................................................................................................................... 9
2.2 Ca ac e ís icas de la ía ocula ...................................................................................12
2.3 Reque imien os de la ía ocula ..................................................................................14
2.4 Hid ogeles ion sensibles o álmicos ............................................................................15
2.5 Ensayos de oxicidad o álmica ...................................................................................17
3. Obje i o ........................................................................................................................19
4. Ma e ial y mé odo ........................................................................................................20
4.1 Elabo ación y ensayo de es abilidad del hid ogel sin á maco.....................................20
4.2 Inco po ación de la cis eamina en el hid ogel .............................................................24
4.3 Es udios de oxicidad ..................................................................................................25
Ensayo in i o de ci o oxicidad celula : .........................................................................25
De e minación de la capacidad de i i ación co neal aguda “The Hen's Egg Tes (HET-
CAM) .............................................................................................................................29
5. Resul ados ...................................................................................................................33
5.1 Elabo ación y ensayo de es abilidad del hid ogel sin á maco.....................................33
5.2 Inco po ación de la cis eamina en el hid ogel .............................................................35
5.3 Es udios de oxicidad ..................................................................................................37
Ensayos in i o de ci o oxicidad celula ........................................................................37
De e minación de la capacidad de i i ación co neal aguda “The Hen's Egg Tes (HET-
CAM) .............................................................................................................................39
6. Discusión .....................................................................................................................42
7. Conclusión ...................................................................................................................44
8. Bibliog a ía ..................................................................................................................46
9. Ag adecimien os .........................................................................................................50
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1. Resumen
La cis inosis ocula es una en e medad a a, ca ac e izada po la acumulación de c is ales
de cis ina en el in e io de los lisosomas de las células, po un de ec o en el anspo ado de
la cis ina, conocido como cis inosina. El único a amien o capaz de de ene la p og esión de
la en e medad, es la cis eamina. Es a es un amino iol, que se combina con la cis ina y
pe mi e su salida de los lisosomas.
En es e abajo se busca a a los sín omas ocula es de la en e medad, median e la
o mulación de un hid ogel ion sensible y demos a su es abilidad y segu idad. Se ha
ealizado un es udio de es abilidad del gel en dos condiciones de conse ación di e en es: a
empe a u a ambien e y en ne e a (4-8˚C). Los pa áme os medidos han sido; pH,
osmolalidad, anspa encia, bioadhesión, es e ilidad y ausencia de pa ículas. También se
han ealizado dos es udios pa a alo a la segu idad de la o mulación, uno que mide la
i i ación aguda (HET-CAM) y o o que analiza la ci o oxicidad median e RTCA ( eal ime cell
analyze ).
No hubo di e encias signi ica i as en la es abilidad del gel con espec o a la medida inicial,
pa a ninguno de los dos almacenamien os. La cis eamina se mos ó ci o óxica pe o no
i i an e, mien as que los políme os que componen el gel, no son i i an es ni ci o óxicos.
El uso de un gel hid ogel ion sensible, a o ece la pe manencia del á maco en el á ea
p eco neal, dando iempo a que pene e en la có nea y disminuye el núme o de aplicaciones
dia ias.
Abs ac
Ocula cys inosis is a a e disease cha ac e ized by he accumula ion o cys ine c ys als
wi hin he lysosomes o cells, by a de ec in he anspo e o cys ine, known as cys inosin.
Cys eamine is he only ea men capable o educing he p og ession o he disease. I is an
amino hiol, which combined wi h cys ine pe mi s he ou pu o lysosomes.
This pape seeks o ea eye symp oms o he disease h ough he o mula ion o an ion-
sensi i e hyd ogel and o demons a e i s s abili y and secu i y. A s abili y s udy wi h wo
di e en s o age condi ions ( oom empe a u e and in a e ige a o 4-8˚C) was conduc ed.
The measu ed pa ame e s ha e been; pH, osmolali y, anspa ency, bioadhesion, s e ili y
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and absence o pa icles. Also wo s udies o assess he sa e y o he o mula ion was
conduc ed, one measu es acu e i i a ion (HET-CAM) and he o he analyzes he cy o oxici y
by RTCA ( eal ime cell analyze ).
Signi ican di e ences in gel s abili y we e no app ecia ed wi h espec o he ini ial
de e mina ion, in any s o age. Cys eamine has demons a ed cy o oxic bu no acu e
i i a ion, while polyme s o he gel a e no cy o oxic nei he acu e i i a i es.
Using an ion sensi i e hyd ogel gel a o s e en ion o he d ug in he p eco neal a ea,
inc easing ime o pene a e he co neal and dec eases he numbe o daily applica ions.
Palab as cla e: Hid ogel o álmico, Op imización, Segu idad, Cis eamina, Cis inosis.
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2. In oducción
2.1 Cis inosis
La cis inosis es una en e medad me abólica a a, que a ec a a 1 de cada 100.000-200.000
niños. Se ca ac e iza po la acumulación excesi a de c is ales de cis ina (un díme o de dos
cis eínas unidas po sus g upos uncionales iol) en el in e io de los lisosomas de las
células.
La cis ina ac úa como ese o io de cis eína, es e aminoácido pa icipa en la sín esis de
nume osas moléculas endógenas como el glu a ión, la insulina o la inmunoglobulina G. Los
esiduos de cis eína ienen una unción impo an e en las p o eínas po que in e ienen en la
es abilidad, plegamien o, ca álisis enzimá ica y egulación de la ac i idad p o eica.
La cis ina se o ma en los lisosomas celula es, después de que las p o easas deg aden las
p o eínas libe ando cis eína, que ápidamen e o ma díme os.
La acumulación de cis ina en los lisosomas, se debe a una dis unción de una p o eína
anspo ado a llamada cis inosina. La cual se exp esa de mane a impo an e en: có nea,
iñón, pánc eas, leucoci os, nódulos lin á icos, i oides, ce eb o, a iculaciones y músculos
(1,2,3). (Figu a 2.1)
Figu a 2.1. Luga es de acumulación de c is ales de
cis ina. (h p://www.guiame abolica.o g)
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La cis inosina se encuen a p incipalmen e en los lisosomas y se enca ga de anspo a la
cis ina desde su in e io hacia el ci oplasma de la célula. Es á asociada a una ATPasa-H+
que se enca ga de acidi ica el in e io de los lisosomas. Los e o es en la sín esis de es a
p o eína, conducen a cambios en su es uc u a que ienen como esul ado la no eliminación
de la cis ina y po an o que se acumule en su in e io (1).
La cis inosina es á o mada po 367 aminoácidos, ag upados en 7 dominios ansmemb ana
(Figu a 2.2). El gen que la codi ica se conoce como CTNS, es á localizado en la egión
17p13 del c omosoma, es e gen iene 23kb de longi ud y se ansmi e de o ma au osómica
ecesi a.
Se han desc ip o más de 50 mu aciones di e en es del gen CTNS siendo las más comunes
las deleciones de amaño a iable, en e 60 y 257 pb, que pueden se ácilmen e de ec adas
po PCR. (3,4,5).
Fo mas clínicas
Podemos clasi ica la en e medad en 3 o mas clínicas en unción de los sín omas y su
g a edad:
Figu a 2.2. Disposición de cis inosina ansmemb ana (4).
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- Cis inosis in an il: Se ca ac e iza po g andes deleciones del gen CTNS, mu aciones
sin sen ido o sin al e ación en el ma co de lec u a. Es la o ma de cis inosis más
se e a, llegando a se le al si no se a a. Tiene dos mani es aciones clínicas
p incipalmen e:
Renal: La acumulación de los c is ales de cis ina en las células ubula es
impide su uncionamien o no mal, p oduce poliu ia al impedi la eabso ción
de agua (se eliminan 2-6 li os de agua al día), iones (sodio, po asio,
bica bona o, os a o, calcio, magnesio), glucosa y aminoácidos. El sínd ome
que p oduce se conoce como Sind ome de Fanconi.
Los p incipales sín omas son acidosis y e aso en el c ecimien o po al a de
ós o o y calcio (6).
El diagnos ico p ecoz de es a o ma clínica es c ucial, pues un a amien o
adecuado, puede educi no ablemen e el cu so de la en e medad. Sin
emba go, en la mayo ía de los casos se necesi a un asplan e enal, po que
el daño p oducido es i e e sible (Figu a 2.3) (1,4).
Figu a 2.3. Mues as omadas pos mo em de un niño de 8 años con
cis inosis ne opá ica. A. Mues a de hígado donde se obse an c is ales de
cis ina que exhiben e ingencia bajo la luz pola izada. B. Mues a de iñón
donde se obse an c is ales de cis ina en el glomé ulo enal. C. Mues a de
ne io óp ico y de la a e ia cen al de la e ina donde se mues an c is ales de
cis ina en los espacios en e los haces de ne ios. D. Mues a de e ina donde
se obse an g an can idad de c is ales de cis ina en la ib a ne iosa y menos
c is ales a ni el de los o o ecep o es. E. Mues a de la unión co neal-
escle al, señalado c is ales de cis ina en el es oma (lado izquie do) y los
c is ales de cis ina con o ma i egula en la conjun i a que cub e la
escle ó ica (4).
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Figu a 2.4. C is ales de cis ina en el epi elio (A) y en el es oma (B)
de la có nea. Imágenes de có neas de pacien es de meno a mayo
po cen aje de depósi o de los c is ales (18).
Ocula : Es común que es os pacien es p esen en de mane a p ema u a
acumulación de c is ales de cis ina en las dis in as capas de la có nea
(endo elio, es oma y epi elio), conjun i a y ambién en o as pa es del ojo
como la escle ó ica y la e ina (Figu a 2.3 y 2.4). La deposición de es os
c is ales en la có nea es muy al a en niños en e mos de 6-10 años.
Es os c is ales ienen o ma hexagonal y se ag egan o mando acículas, son
ca ac e ís icos de es a en e medad (Figu a 2.4).Los sín omas más
p edominan es suelen se : o o obia, lag imeo y ble a ospasmo,
despigmen ación i egula y pe i é ica de la e ina que puede da luga a una
e inopa ía (6,7).
Si no se a an, los pacien es pueden llega a desa olla cegue a. Es e
abajo se cen a en el abo daje e apéu ico de los sín omas ocula es.
O as al e aciones que apa ecen con ecuencia en los en e mos son: hipo i oidismo,
a o ia muscula p og esi a, al e aciones gas oin es inales ( e lujo, ómi os,
hepa omegalia), diabe es melli us, de e io o del SNC o hipogonadismo masculino (8).
- Cis inosis in e media: Es una o ma más le e de la en e medad que la an e io , an o
a ni el enal como a ni el ocula , y no p oduce e aso del c ecimien o. La espe anza
de ida es mayo (1,7).
- Cis inosis asin omá ica: Suele se benigna y la única mani es ación es la o o obia.
Pa a con i ma la en e medad se buscan los depósi os de cis ina en la có nea.
Gene almen e, ampoco es mo al (1,7).
Diagnós ico
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El diagnos ico debe ía hace se an es del p ime año de ida pa a e i a , de es e modo,
complicaciones que pudiesen se i e e sibles. Los es udios bioquímicos son las
he amien as diagnos icas más u ilizadas.
Gene almen e cuando se sospecha de la en e medad, se ealiza una medida de los
elec oli os sé icos (sodio, po asio, os a o y bica bona o que suelen es a disminuidos),
medida de gases espi a o ios (acidosis me abólica de i ada de la en e medad), p esencia
de glucosa y p o eínas en o ina (9).
El diagnós ico se con i ma median e la de e minación de los ni eles de cis ina lib e en los
leucoci os polimo onuclea es o ambién, en ib oblas os cul i ados de la piel o la conjun i a,
siendo es e úl imo mé odo in asi o, po lo que es poco u ilizado (1,10).
La de e minación habi ual de la cis ina se ealiza en los leucoci os, pues o que ienen g an
can idad de lisosomas. La de e minación se ealiza po c oma og a ía de in e cambio iónico.
Es e mé odo es poco sensible, po lo que cuando hay los ecu sos disponibles pa a ello, se
ecu e a uno más especí ico y sensible de ipo ELISA basado en la unión de la cis ina lib e
a una p o eína ijado a de cis ina de E. coli (CBP: cys ine binding p o ein) (4,10,11,12).
La concen ación de cis ina medida en los leucoci os de indi iduos sanos, se encuen a po
debajo de 0,2 nanomoles de cis ina po cada milig amo de p o eína celula , siendo de 5-15
nanomoles en en e mos de cis inosis in an il y en e 3-6 nmoles en pacien es
diagnos icados con la o ma in e media (1,9).
Cuando exis e sospecha po an eceden es amilia es, se puede hace un diagnós ico
p ena al, a a és de los amnioci os, líquido amnió ico o median e una mues a de
ellosidades co iales. Empleándose pa a ello cis ina ma cada con un iso opo de azu e (35S)
o po es udios de ADN e al, cuando la mu ación se conoce en los p ogeni o es (1,4).
En el caso de la a ec ación ocula , se pueden obse a los c is ales de cis ina di ec amen e
en la có nea median e una lámpa a de hendidu a, es a p ueba pe mi e un diagnós ico
con i ma o io de la a ec ación ocula (Figu a 2.5) (6,7).
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La osmola idad de la lág ima es igual a la del plasma (290 mOsm), la supe icie ocula iene
un amplio ma gen de ole ancia a los cambios en es e pa áme o, ole ándose mejo las
o mulaciones lige amen e hipe ónicas. Es a se puede aumen a añadiendo excipien es a la
o mulación, ya que gene almen e las o mulaciones suelen se hipo ónicas.
pH
El pH ideal pa a una o mulación o álmica es de 7.4, igual que el del plasma. Cambios
signi ica i os en es e alo , pueden p o oca i i ación y lag imeo, p o ocando un e ec o de
la ado del ojo y además puede p o oca cambios en la abso ción del á maco. Se pueden
emplea soluciones ampón pa a ajus a el pH.
Es e ilidad
Es impo an e pa a e i a in ecciones ocula es, las o mas de es e ilización más empleadas
son la il ación es e ilizan e, au ocla e o es e ilización po calo seco.
También se pueden elabo a las ó mulas ya en es é il, median e una campana de lujo
lamina y ma e ias p imas es é iles. Se deben ealiza con oles mic obiológicos median e el
cul i o en placas.
Limpidez
La limpidez es la ausencia de pa ículas en suspensión en las o mulaciones o álmicas.
Es e equisi o es impo an e, pues o que las pa ículas pueden p o oca lesiones co neales.
2.4 Hid ogeles ion sensibles o álmicos
Los hid ogeles o álmicos, han sido diseñados pa a aumen a el iempo de con ac o del
á maco con la supe icie del globo ocula , aspec o muy impo an e pa a que el
medicamen o que inco po an, pueda desa olla su acción, bien a ni el supe icial o pene a
y ac ua en el in e io . En la elabo ación de los hid ogeles se emplean sus ancias
iscosizan es como los políme os hid o ílicos, es os ienen capacidad mucoadhesi a y
a o ecen la pe manencia p eco neal del á maco.
Los hid ogeles o álmicos de geli icación in si u, se basan en la o mulación de políme os
con capacidad de expe imen a un cambio de ase en espues a a un es ímulo de su
en o no, como pueden se las a iaciones en el pH, la empe a u a o la p esencia de iones.
Es o a a depende de los políme os que empleemos en la elabo ación del gel.
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Los geles sensibles a los cambios de empe a u a con ienen políme os como po ejemplo:
poloxáme o o plu onic, los sensibles al pH con ienen políme os como: ca bopol o ácido
poliac ílico y los sensibles a los iones eaccionan en con ac o con la lág ima como: el
algina o, ca agena o kappa o la goma gellan (9).
O iginalmen e son líquidos iscosos, pe o cuando expe imen an el cambio de ase, geli ican,
p olongando el iempo de con ac o del á maco con la supe icie del globo ocula , y
pe mi iendo una libe ación con inua del á maco a lo la go del iempo. Po an o, además de
a o ece la pene ación de más can idad de á maco, al aumen a el iempo de con ac o a
pe mi i que es e pene e de mane a con inua, educiendo el núme o de adminis aciones.
Dos políme os ion sensibles ampliamen e empleados son: el ca agena o kappa y la goma
gellan.
El ca agena o es un polisacá ido que se ex ae de algunas especies de algas ojas
(Rhodophyceae), es á o mado po epe iciones de β-D-galac osa y 3,6-anhid o-α-D-
galac osa (Figu a 2.9). Hay a ios ipos y se di e encian en el g ado de sul a ación de la α-D-
galac osa, que a a condiciona las p opiedades geli ican es del mismo: ι-ca agena o
(mono-sul a o), κ-ca agena o (di-sul a o), y λ-ca agenina ( i-sul a o). La λ-ca agenina se
emplea como espesan e y los o os dos en la elabo ación de hid ogeles.
El ca agena o kappa, se ca ac e iza po su capacidad de geli ica en p esencia de iones
mono alen es, como el sodio p esen e en la lág ima. Es e políme o o ma enlaces ísicos
que alen izan la salida del á maco especialmen e si es e es hid o óbico, pudiendo con ola
su libe ación median e el con ol del núme o de enlaces, que es á di ec amen e elacionado
con la concen ación de polisacá ido p esen e en el gel. O os ac o es que in luyen en la
libe ación son: la ca ga de á maco y el agen e que p o oque la e iculación. Sus buenas
ca ac e ís icas eológicas y la ex u a de los hid ogeles que o ma, hacen que sea un
componen e adecuado pa a la elabo ación de hid ogeles (22,26).
La Goma Gellan, se ob iene a pa i de una bac e ia conocida como Sphingomonas elodea.
Es e polisacá ido se compone de 4 ipos de unidades que se epi en: L- amnopi anosil-(α-
1→3), D-glucopi anosil-(β-1→4), D-glucu onopi anosil-(β-1→4), D-glucopi anosil-(β-1) y
sus i uyen es ace ilo o L-glice ilo (Figu a 2.9). Es e políme o adop a una es uc u a
idimensional en o ma de hélice, o ien ando los esiduos ace ilo hacia la ca a ex e na y los
glice ilo y los hid ógenos hacia la ca a in e na, pa a es abiliza la unión. Dependiendo del
g ado de ace ilación de la goma gellan se hacen geles lexibles y elás icos (goma gellan
ace ilada) o ágiles y no elás icos (goma gellan des-ace ilada).
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Exis en muchos es udios que a alan su uso en o mulaciones o álmicas, pues o que es
capaz de geli ica aunque se encuen e en pequeña p opo ción. Es e polisacá ido o ma
geles en p esencia de ca iones mono (Na+ y K+) y di alen es (Ca2+ y Mg2+), como los que se
encuen an en la lág ima, pe o p esen a mayo a inidad po los úl imos (22,26).
2.5 Ensayos de oxicidad o álmica
Uno de los ac o es más impo an es pa a que un medicamen o se pueda come cializa pa a
su uso, es que se haya demos ado su segu idad. Pa a ello se pueden ealiza nume osos
es udios an o in i o como in i o.
Los ensayos in i o p esen an la en aja de que son más ácilmen e ex apolables a la
población eal. En e las des en ajas: son poco é icos po que p oducen su imien o animal,
hay más a iables que en los ensayos in i o y muchas de ellas no se pueden con ola ,
complicando el ensayo.
Los ensayos in i o simpli ican mucho el abajo, po que se pueden con ola algunas
a iables, pe o p esen an como des en aja la al a de ex apolación que pueden ene sus
esul ados.
Po ejemplo, los ensayos de ci o oxicidad, son ensayos in i o que se basan en de e mina
las al e aciones, que una sus ancia p oduce en las células con las que a a es a en
con ac o. Median e la medición de p opiedades de las células como: su ac i idad
me abólica, su mo ología (empleando colo an es), la adhesión o su iabilidad.
También se puede de e mina la i i ación ocula aguda a un medicamen o, an iguamen e la
i i ación ocula se medía median e el es de D aïze, que es un es in i o. Que consis e en
adminis a la sus ancia obje o de es udio en uno de los ojos del conejo, mien as que el o o
Goma
Gellan
Figu a 2.9. Es uc u as químicas de la goma gellan y ca agena o kappa.
18
se emplea como con ol. Después se obse an du an e un iempo a e si hay alguna
eacción. Hoy en día, se es án empezando a emplea ensayos o gano ípicos cuyos
esul ados pa ecen se ex apolables.
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3. Obje i o
El obje i o del p esen e abajo es desa olla un sis ema o álmico pa a la adminis ación
ópica de cis eamina, asegu ando un ni el adecuado de segu idad ocula .
El gel debe á se es able du an e al menos 3 meses de almacenamien o. Se p e ende que
es a o mulación pueda se elabo ada en un Se icio de Fa macia hospi ala ia, ya que la
can idad de en e mos de cis inosis es muy educida y po lo an o no posee in e és
come cial pa a la indus ia a macéu ica.
La o mulación de un gel ion sensible, que geli ique en p esencia de los iones de la lág ima,
es una buena es a egia pa a aumen a el iempo de con ac o del á maco con la supe icie
ocula , pod ía mejo a el a amien o de los sín omas ocula es de la en e medad. Las
p opiedades bioadhesi as de los políme os que o man pa e del gel, pueden llega a
disminui el núme o de adminis aciones dia ias, mejo ando el in e alo de adminis ación.
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4. Ma e ial y mé odo
El p esen e es udio se ha desa ollado en di e en es e apas, inicialmen e se ha cen ado en
el desa ollo de una pa e galénica des inada al desa ollo de un hid ogel o álmico
adecuado pa a su adminis ación ocula , seguido de una segunda e apa cen ada en
asegu a la segu idad oxicológica del mismo.
4.1 Elabo ación y ensayo de es abilidad del hid ogel sin á maco
Como pun o de pa ida, hemos u ilizado un hid ogel desa ollado en un abajo p e io, dadas
sus buenas p opiedades bioadhesi as y de pe manencia en el ojo (27).
En la elabo ación de es a o mulación se han empleado los siguien es políme os:
ca agena o kappa (Genugel® ca ageenan GC-130) y goma gellan (Kelcogel ® CG-LA). El
hid ogel ensayado iene una concen ación de políme o o al de 0,75%, con una p opo ción
de 66% Goma Gellan y 33% Ca agena o Kappa. El p oceso de elabo ación se desc ibe a
con inuación:
Se calien a agua pu i icada (Ellix, Me ck-Millipo e) en un aso de p ecipi ados has a
ap oximadamen e 60˚C. Se añade la goma gellan de mane a p og esi a has a comple a
homogeneización, la disolución se man iene con calo y agi ación magné ica (350 pm).
Cuando el políme o es á comple amen e disuel o, se añade el ca agena o kappa y se e i a
del calo , man eniendo únicamen e la agi ación magné ica has a que no se ap ecien
pa ículas del pol o en el gel, ap oximadamen e 2 ho as (Figu a 4.1).
Una ez elabo ado el gel se p ocedió a su es e ilización y en asado. Pa a ello, se ha
seleccionado la il ación es e ilizan e en campana de lujo lamina a a és de il os de
0,22μm de diáme o S e icup® (Me ck-Millipo e).
Figu a 4.1. Elabo ación del hid ogel.
21
Los geles se en asa on di ec amen e en bo es de id io opacios de 10ml y se almacena on
en dos condiciones de conse ación: unos en ne e a (4-8˚C) y o os a empe a u a
ambien e, pa a es udia si las condiciones de almacenamien o a ec aban a las p opiedades
del hid ogel (Figu a 4.2) (28).
Pos e io men e se midie on las p opiedades du an e 3 meses. Los pa áme os que se
de e mina on ue on: anspa encia, es e ilidad, ausencia de pa ículas, pH, bioadhesión y
osmolalidad. Las medidas se ealiza on los días 0, 7, 15, 30, 60 y 90 del almacenamien o.
Pa a ello, odas las mues as se a empe a on du an e 20 min a empe a u a ambien e an es
de la medición de las p opiedades, de es e modo cuando ealizamos la de e minación
podemos elimina a iaciones debidas a la empe a u a, y una ez agi ados manualmen e se
p ocedió a la de e minación de las sus p opiedades (Figu a 4.1) (29,30,31,32,33,34,35):
- T anspa encia (Espec o o óme o de ed de diodos Hewle Packa d 8452): Se mide
la ansmi ancia en un in e alo de λ en e 300 y 700 nm (zona isible) (Figu a 4.3).
Pa a medi la se empleó un espec o o óme o que es á conec ado a un o denado ,
es e ecoge los da os en una g á ica, que ep esen a el po cen aje de luz ansmi ida
en e a las longi udes de onda a las que se ha medido. Se conside a que la
anspa encia máxima se ob iene cuando los alo es de luz ansmi ida son del cien
po cien. Como blanco se ha empleado agua des ilada.
Figu a 4.2. Es e ilización y en asado del gel.
22
- Es e ilidad y ausencia de pa ículas; la es e ilidad se e i icó median e la siemb a del
gel en aga Columbia y aga Sabou aud. La ausencia de pa ículas se analizó
median e la obse ación del gel con una inspec o a de pa ículas con encional
(Figu a 4.4).
- pH (pHme o WTW inoLab® con un elec odo especial pa a o mulaciones iscosas).
T as la calib ación se midió cada mues a po iplicado, agi ando manualmen e el gel
an es de cada medida (Figu a 4.5).
- Bioadhesión (Analizado de ex u a TA-XT Plus); Se ealizó un ensayo pa a medi la
ue za máxima y el abajo necesa io pa a ompe los enlaces es ablecidos en e el
Figu a 4.4. Con ol mic obiológico y ausencia de pa ículas.
Figu a 4.3. Espec o o óme o de ed de diodos
Hewle Packa d 8452.
Figu a 4.5. De e minación del pH median e pHme o WTW inoLab®.
23
gel y el sus a o (piel cu ida de cab a pakis aní), siendo es os pa áme os los que
de e minan las ca ac e ís icas bioadhesi as del hid ogel.
Pa a ello se adhie e con cin a de doble ca a, un cí culo de piel de cab a al punzón
supe io (mó il) de su mismo diáme o (cub iendo su base) y se cub e la placa
in e io ambién con piel de cab a, de mane a que al baja el punzón coincidan. A
con inuación, se pipe ean 50μL del gel sob e la piel de la placa. Se ealiza un ciclo de
p esión de 0,5N du an e 1 min de con ac o, pa a a con inuación sepa a las dos
mues as de sus a o a una elocidad de 1mm/s. Du an e el ensayo se p ocede al
egis o de la cu a de ue za s de o mación (ex ensión) (Figu a 4.6).
Se ealizan 5 medidas de cada gel, sus i uyendo la piel del punzón y de la placa, en
cada medida.
Es e pa áme o es á elacionado con la capacidad del gel pa a man ene se en la
supe icie del ojo.
La cu a ue za s ex ensión nos pe mi e de e mina la ue za máxima necesa ia
pa a sepa a los dos sus a os, y po lo an o, pa a ompe la unión bioadhesi a que
los man iene unidos.
El abajo de adhesión, que se calcula como el á ea bajo la cu a ue za en e al
desplazamien o, ep esen a la ene gía o el abajo necesa io pa a sepa a los
sus a os.
- Osmolalidad: se de e minó median e un Vapo P essu e Osmome e (VAPRO
5520®) (Figu a 4.7), as la calib ación del apa a o, se p ocedió a la medición de la
osmolalidad del gel. Cada mues a se midió po iplicado.
Figu a 4.6. P ocedimien o pa a medi la bioadhesión.
24
Sólo se de e mina on en la o mulación ecién p epa ada y una ez inalizó el pe iodo
de almacenamien o del hid ogel.
4.2 Inco po ación de la cis eamina en el hid ogel
Una ez comp obada la es abilidad del ehículo du an e los es meses de almacenamien o
se p ocedió a la inco po ación de la cis eamina en el hid ogel. Pa a ello se inco po ó el
á maco a la disolución acuosa an es de la dispe sión de los polisacá idos.
La inco po ación de la cis eamina supuso un aumen o impo an e de la iscosidad del gel
empleado, po lo que se p ocedió a la disminución de las p opo ciones de los políme os.
Pa a ello, inicialmen e se elabo a on geles a di e en es concen aciones de políme o, pe o
man eniendo cons an e la p opo ción 66% goma gellan y 33% ca agena o kappa.
Pos e io men e iendo los esul ados ob enidos, se decidió modi ica la p opo ción de los
políme os, disminuyendo la can idad de ca agena o kappa has a una p opo ción inal del
12% ca agena o kappa y 88% goma gellan.
En odos los casos la elabo ación se ealizó en las siguien es e apas:
1. Se calien a el agua en un aso de p ecipi ados has a ap oximadamen e 60˚C y se le
añadió la cis eamina, se deja agi ando has a comple a disolución.
2. Adicción de goma gellan con calo y agi ación, has a la ob ención de una disolución
anspa en e.
3. Po úl imo, se le añade el ca agena o kappa y se e i a la disolución del calo ,
man eniendo únicamen e la agi ación, has a que no se obse en pa ículas en
suspensión.
Figu a 4.7. Osmóme o VAPRO 5520®.
31
Se han empleado las concen aciones más al as que se an a emplea en la elabo ación de
los geles.
Se obse a si se p oducen enómenos ascula es du an e los 5 min de obse ación.
Además se g aba en ideo pa a que e aluado es independien es con abilicen el iempo de
apa ición de los posibles enómenos, pues o que es un ensayo que p esen a cie a
subje i idad. Pa a ello se emplea una cáma a in eg ada S andalone digi al en un
mic oscopio es e eoscópico Olympus SZ-STN con Full HD Li e Salida de ídeo Leica IC80
HD (Figu a 4.12).
Figu a 4.12. Cáma a digi al conec ada a un mic oscopio
es e eoscópico con salida de ídeo simila a la empleada.
Figu a 4.11. Adicción de las disoluciones al
hue o.
32
In e p e ación:
Los posibles enómenos ascula es que podemos obse a son: Hemo agia, Lisis y
Coagulación (42).
Midiendo el iempo que a dan en apa ece es os enómenos, podemos de e mina el
po encial i i an e de la sus ancia (IS), median e la ó mula:
IS= [(301 - hemo agia)/300) x 5] + [(301 – lisis)/300) x 7] + [(301 – coagulación)/300) x 9]
Dependiendo del IS la clasi ica emos en:
- IS 0-0.9 no i i an e
- IS 1-4.9 lige amen e i i an e
- IS 5-9.9mode adamen e i i an e
- IS 10-21 se e amen e i i an e
33
5. Resul ados
5.1 Elabo ación y ensayo de es abilidad del hid ogel sin á maco
El gel ob enido se compo a como un líquido iscoso que se luidi ica al se agi ado de o ma
in ensa, lo que a o ece su dosi icación.
T anspa encia
De acue do con los esul ados de la igu a podemos a i ma que el gel se man u o
anspa en e du an e el pe iodo de es udio. Además, las dos condiciones de
almacenamien o die on esul ados simila es (Figu a 5.1).
T a n s p a e n c ia
Longi ud de onda ()
T ansm i ancia
0 200 400 600 800
90
95
100
105
110
T ansm i ancia (ne e a)
T ansm i ancia (am bien e)
Es e ilidad y ausencia de pa ículas
El con ol mic obiológico demos ó que odos los geles, an o los almacenados a
empe a u a ambien e como los de ne e a, es aban es é iles. Además, no se obse a on
pa ículas en ninguno de ellos.
pH
Es e pa áme o pe manece inal e ado a lo la go del iempo (Figu a 5.2).
Figu a 5.1. Rep esen ación de la ansmi ancia en e a la longi ud de onda.
34
pH
Días
pH
0 20 40 60 80 100
5
10 pH (am bien e)
pH (ne e a)
Bioadhesión
Los esul ados indican que el gel man iene su capacidad bioadhesi a du an e el
almacenamien o en las dos condiciones ensayadas (Figu a 5.3 y 5.4).
Figu a 5.3. G á ica de bioadhesión donde se ep esen a la
ue za en e al desplazamien o del punzón supe io .
Figu a 5.2. Rep esen ación de la a iación del pH con el iempo de
almacenamien o a empe a u a ambien e o en ne e a.
35
Fue za m áxim a
Días
Fue za (N)
0 20 40 60 80 100
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Fue za (am bien e)
Fue za (ne e a)
T abajo
Días
T abajo (N .m m )
0 20 40 60 80 100
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
T abajo (am bien e)
T abajo (ne e a)
Osmolalidad:
Se ha ealizado dos medidas de la osmolalidad del hid ogel, la inicial y la inal. Las medidas
iniciales ue on 108, 99, 110mOsm/Kg y la medida inal, en el caso del gel almacenado en
la ne e a 116,116 y 109mOsm/Kg y pa a el gel almacenado a empe a u a ambien e 92, 93
y 101mOsm/Kg.
5.2 Inco po ación de la cis eamina en el hid ogel
La inco po ación de la cis eamina al hid ogel p oduce su geli icación p ema u a du an e su
p epa ación, aumen ando la iscosidad de mane a impo an e. La causa puede debe se al
ca ác e iónico de la cis eamina, que debido a su pKa de 9,42 se encuen a ionizada al pH
del gel, pudiendo in e acciona con los g upos sul a o del ca agena o o los ácido de la goma
gellan. Pa a minimiza el aumen o de la iscosidad se p ocedió a adap a la o mulación.
Después de ensaya a ias concen aciones de políme o o al y den o de es as di e en es
p opo ciones de polisacá idos, se llegó a la conclusión de que el g upo amino de la
cis eamina eacciona en mayo medida con el ca agena o y po ello se ha disminuido su
p opo ción en el gel.
Las p ime as concen aciones de políme o o al ensayadas ue on las de 0,75%, el hid ogel
quedaba muy consis en e con apa iencia de sólido, siendo incapaz de econs i ui lo con una
Figu a 5.4. En la p ime a g á ica se ep esen a la ue za máxima en e al iempo de
almacenamien o del gel. En la segunda g á ica se ep esen a el abajo en e al iempo
de almacenamien o del gel.
36
simple agi ación. Tu imos que educi sus ancialmen e las concen aciones de políme o
o al. Como el ca agena o e a el que eaccionaba mayo i a iamen e con la cis eamina,
disminuimos su p opo ción del 33% al 12% de ca agena o, y aumen amos el po cen aje de
goma gellan al 88%. En odos los casos la educción del políme o no modi ica el pH inal del
gel. Los geles con una ex u a adecuada pa a pode medi los es án ecogidos en la Figu a
5.5.
Se ap ecia una educción signi ica i a, sob e odo en la ue za máxima de adhesión, al
educi la can idad de políme o en el gel, si bien el abajo no se e an a ec ado. La
disminución puede es a elacionada con la esis encia de la capa de gel que se o ma en e
los sus a os que es más débil cuan o meno es la p opo ción de políme o y po lo an o más
ágil. Sin emba go, pese a la educción el alo del abajo de adhesión es adecuado pa a
las concen aciones meno es de polisacá idos (Figu a 5.6).
pH
0.0 0.1 0.2 0.3
5
10
Concen ación (%)
pH
Figu a 5.5. La g á ica ep esen a como el pH es independien e de la
concen ación de políme o o al.
37
Bioadhesión
0.0 0.1 0.2 0.3
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5 Fue za (N)
T abajo
(N.mm)
Concen ación (%)
Desde el pun o de is a de su adminis ación, el gel con concen ación o al de políme o de
0,15% ha sido el que ha demos ado mejo es p opiedades. Po su ácil econs i ución y su
aspec o anspa en e.
5.3 Es udios de oxicidad
Ensayos in i o de ci o oxicidad celula
En la Figu a 5.7, 5.8 y 5.9 se mues an los esul ados del es udio de ci o oxicidad de los
componen es del hid ogel.
El ca agena o kappa no ha mos ado signos de ci o oxicidad, sino que incluso a o ece la
p oli e ación de los que a oci os, dando mayo c ecimien o celula que en el caso del con ol.
Es e e ec o es dosis y iempo dependien e y los inc emen os más ma cados ocu en a las
dosis más al as.
No iene sen ido calcula el IC50 pa a es e pa áme o, ya que iene un e ec o p omo o del
c ecimien o, a o ece la p oli e ación de los que a oci os. El índice celula no malizado es
incluso supe io al obse ado con el g upo con ol (Figu a 5.7)
Figu a 5.6. La g á ica ep esen a como la ue za máxima y el abajo son
p opo cionales a la concen ación de políme o o al.
38
La goma gellan p esen a un aumen o del índice celula no malizado po debajo del g upo
con ol, dependien e de la concen ación del políme o. Cuan o mayo es la concen ación
meno es el índice celula no malizado y más se inhibe el c ecimien o no mal de los
que a oci os. Po an o, la p oli e ación de es as células se ha ía más len a de lo no mal as
la adicción del políme o y es e e ec o se man iene cons an e en el iempo (Figu a 5.8).
Tampoco se halla el IC50 de la goma gellan po que no iene e ec o ci o óxico.
Figu a 5.7. Rep esen ación de los índices de c ecimien o no malizados as la
adicción del ca agena o kappa en e al iempo.
Figu a 5.8. Rep esen ación de los índices de c ecimien o no malizados as la
adicción de la goma gellan en e al iempo.
39
La cis eamina p esen a una oxicidad impo an e, du an e las cinco p ime as ho as as la
adicción del á maco el índice celula no malizado disminuye un 50%, mos ándose odas las
concen aciones es adas con simila ci o oxicidad (Figu a 5.9).
Pa a es a sus ancia, calculamos el IC50, concen ación de compues o que hace disminui al
50% el índice celula (Figu a 5.10). Podemos obse a que en las 5 p ime as ho as pasamos
de un IC50 de 1.34mg/ml a 0.5mg/ml y a pa i de ahí se man iene p ác icamen e cons an e.
IC 50 C is eam ina
Tiem p o (ho as)
IC 50 (m g/m l)
0 10 20 30 40 50
0.0
0.5
1.0
1.5
IC 50 = 1,34 m g /m l
IC 50= 0,5 m g/m l
De e minación de la capacidad de i i ación co neal aguda “The Hen's Egg Tes
(HET-CAM)
Figu a 5.9. Rep esen ación de los índices de c ecimien o no malizados as la adicción
de la cis eamina en e al iempo.
Figu a 5.10. Rep esen ación del IC50 pa a la cis eamina.
40
En la Figu a 5.11 se obse a el esul ado del con ol nega i o, as la adicción del NaCl
0,9%. No obse ándose ninguna eacción o cambio que indique i i ación du an e los 5 min
de es udio.
En la igu a 5.12 se obse a el esul ado del con ol posi i o, as la adicción del NaOH 0,1N.
Se obse ó la coagulación ins an ánea de los asos y además cie a hemolisis.
En el caso de los compues os ensayados, no se obse ó ningún indicio de coagulación, lisis
o hemolisis en la memb ana co ioalan oidea de los hue os du an e los 5 min de
obse ación. Los esul ados indican que ninguno de los p oduc os posee capacidad i i an e,
dando luga a índices de i i ación de 0. (Figu a 5.13).
Figu a 5.11. Memb ana co ioalan oidea in ac a as la adicción de 300μl de
NaCl 0.9%.
Figu a 5.12. Memb ana co ioalan oidea con coagulación as la adicción de
300μl de NaOH 0.1N.
47
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50
9. Ag adecimien os
Todo mi ag adecimien o a las pe sonas que han hecho posible es e abajo.
A mi u o , F an, po su dedicación, apoyo y paciencia, po inculca me ese a án de que e
ap ende cada día más y po da me la opo unidad de habe abajado con él.
A Anxo po enseña me la cons ancia y el sac i icio. Po pe mi i me pa icipa en sus
ensayos, pa a exp imi al máximo mi expe iencia en el labo a o io.
A odo el pe sonal del Se icio de Fa macia del CHUS y del IDIS.
A mi amilia, especialmen e a mis pad es y como no, a mi abuela po mos a me siemp e su
apoyo y su in e és en mi abajo.
A odos mis amigos y compañe os po su iempo y ca iño.
