Detección de mamitis en el ganado bovino

¡>KPARTAMENT() D MICROBIOLOGIA Y PARASITOl (X.ÍA
UNIVERSIDAD DE SANI lAGO DE COiMPOSTELA
DETECCION DE MAMM IS EN EL GANADO BOVINO
Memo ia que pa a opia al j» ado
do l>íx o p esen a
MANI El. VA/QL'J / BK. ÑAS
Saniiajjo. sep iemb e !996
El D . JAIME FABRCGAS CASAL, P o eso Ti ula del Depa amen o de Mic obiología y
Paiasi oÍog*!a de la UnKe sidad de San iago
INFORMA:
Que el licenciado en Ciencias Biológicas y alumno de l'e ce Ciclo del P og ama
de Doc o ado A ances n Mic oNolo (ía y Pa asi ología, D. MANUEL VAZOl^l*^ BR- ÑAS.
ha ealizado bíijo mi di ección y la del Je e de la Sección de Sanidad Animal del Cen o de
In es igaciones Ag a ias de Mabegoo io íCIAM). D EUGENIO REY FERNANDEZ, en el
Depanamen o de Mic obiología y Pa askologia y en el labo a o io de En e medades In ecciosas
dd CIAM d abajo con el imlo DET CCION DF MAMITIS EN FL GANADO BO INO,
que. una ez concluido. AUTORI/O pa a su p esc*n acíón pa a op a ai g ado de Doc o .
Y pa a que así cons e, se i ma la p esen e en San iago. ? ein icua o de sep iemb e de
mil no ecien o> no en a seis
Fdo Jaime Fáb e^as Casal
./ •>■• '/ ; ;-_ " .. .- ^ al
Dedicada
A mi muj
A mi hija
INDICE
ÍNTRODUCCION
* Concep os gene ales sob e mami is
* Agen es e iológicos de U mami is
* Co ^cep os epidem ologic(<s básicos de la mami is
* Técnicas de de ección de IMIs p oduc o as de ma^ni is
= Análisis mic obiológico
^ Pnieba» üc okigicas
- Tesis de biología moleciila . p uebas de ADN
- Recuen o de cé uias somá icas en anque
= P uebas ñaco-qumncas conduc Kióad. NACiasa.
0B JIT Í 0S
MATFKIAL Y M TODOS
* Meiodologia de mues co
* Mé odo de ecogida de da os epidemiológicos
= Na u aleza de las a iables es udiadas
* Análisis de los da os
* P ocesamien o de las mue^ as y écnicas de nnalisis
- Análisis bac e iológico
= Recuen o de cékiLis somá icas
= ELISA
^ Análisis es adis lc'^
PAG
1
I
4
6
10
n
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18
21
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34
35
36
37
37
38
39
39
44
44
4Q
RESULTADOS
DISCUSION
CONCLUSIONES
AGRADECIMIENTOS
BIBLIOGRAFIA
ANEXOS
Tabla 1.2 Y 3.
Figu as 1.2 > 3.
Análisis es adis ico: ablas
Hojas de cálculo EXCEL 2.xls. 3.xls y 4 ls

ABREVIATURAS YÜLOSARIO
BTSCC: Recues o de céhilis so Rá icis en anque de mczcli
CAMP: Fac o o eacc óo que indica la capacidad y el ipo de hemolisis de una cepa de
es ep ococo. No malmen e se aplica en los g upos se olój icos B y C.
CM : Tes CaUíbmia de Mami is
DaB; I> amii3oben/idina
D.O.. Densidad óp ica
Du ació i de una iMI: NT de días en e U p ime a y la úhima lac aciones con in ección más I áL.
FI.ISA: Siglas de enz ine linked inmunoso hen assay
IgG; Inmimoglohulina (
IMI Iníección in amamana en la »ca
IndLe de una IMI. Can idad de nue as IMIs de ec adas du an e un icinno «ic inido
Incidencia: Concep o epidemiológico que !»eñala el po cen aje de cua e ones de (a ub e c Mi un
aislado bac e iano de e minado ai nicnos una ez du an e la lac ación
{QR: a io o cocien e in e cua e ón en la ub e de la aca
MIC; Concen ación mínima inhibi o ia de un an imic obiano
NAGasa; N-ace il glucosiminidasa
PBS: Tampón os a o salino
PEC. Pobe ileng icol
PMN. i^coci ON pobmo onuclea es
P e aleoc a: Concep o epidemiológico que señala el po cen aje de mues as on >jn aislado
bac e iano dado.
OFM. P ime a leche de cua e ón en un o deño.
SCC; Recuen o de cchilas somá icds
SDS-PAG£; Ekc o o sis cc gei de í olñc ilamkli coa Uiiiíil sul a o sódico
Sepkac >l; Gel que aaúa coa» m^i iz en c oma og aña de exclusión
Sepha ose: Ma iz en c oma og a ía de a inidad
TBS: Tampó i is salmo
IBS-i; Tampón is :^i ino con T ^een 20
u e; l enidades oinudo a*; d¿ colonias
i M; Le he o al de la uh e en un o deño
WOA Aghj miua de «cn ?^ de igo
WMT; Tes de VViscoshi pa a mami is (análogo ai CMD
INTRODUCCION
Cooccp os gcnc aks sob e m iai is
L¿ mjunkis es U eniénnedad más cos osa que a ec a al ganado bo ino. Va ios es udios
(’anzen 1970. Na zke el al l*?72; Wood and Boo h. 1983; Dcluyie e al. I9Q1) han
demos ado las pé didas gene adas en la p oducción leche a debidas a ia mami is Luce ¿nd
Ro wlai)da desc ibie on en !^S4 una écnis^a que alo aba la educción en el i ,,'ndimien o
leche o los cambios en la ibima de la cun a de lac ación asociado > a la mami is ciinica
Las in ecciones in amama ias que desembocan en una mami is son pa e de un
comp^eio e iologico de en e medad mul i acio ial csuhado de conib nación de dKe sos
agen es con el hospedado (la aca lecne a) bajo di e en es si uaciones amliien ales (Pea son e
al, 1972) (S o lbaek-Pede sen. 1975) Además, la ecuencia de la en e medad con inúa
inc emen ándose en espues a a la selección gené ica eaUiada pa a mejo a la p oducción,
debido a una co elación gené ica posi Ka en e p oducción y mami is (Shook. 1985:
Fmanueison. 1987; Sy ája i e ai. ¡986)
La mami is se ha de inido clásicamen e como una inílaiilación de la glándula mama ia,
no malmen e a causa de algún mic:oo ganismo. si bien se han desc i o mami is asép icas y
subchnicas. s n e idencia de in lamación Es a in lamación ieneuna especial impo ancia po su
nnpac o socio-económico, en la explo ación del ganado aciino leche o en egimen in ensi o.
Es un p oceso ampbamen e ex endido (has:a un 10** o del global de ia cabaña bo ina po
é mino n edio). de al modo que a as eces una aca cualquie a no expe imen a un episodio
de mami is Tan o U manmLs chnica conu) bs o mas subclícicas, más ecueu es que la
p ime a, suponen anualmen e cuac iosas pé didas económicas (Bandinand. 1978).
Y en 1978, Bsdmand omnila la exis encia de di e sos ac o es a conside a en el
es udio de la p edisposición a la mami is bo ina (ic ínse€Os(mo ología de la mama,
p oducción leche a, edad, es adio de lac ación, inmunidad, equilib io ho monal) y ex ínsecos
ges ación del aüo, desequilib io en la alimen ación, higiene de la explo ación, ipo de manqo y
o deño) ocasicnales ( e encio de leche, cambios b uscos de alimen ación, auma ismos del
pezón y bajada de la> empe i u as). Asimismo se enía que conside a la espcci ícidad,
p« o ¡enscidad y ecuencia del ge men asociado al p oceso mami ico
De acue do con ía sin oma ologia. puede . di e encia se 2 o mas de mami is: clínica y
subclinica ( sJa e oluciona sin signos in lama o ios ex emos, con aumen o del SCC y
p esencia de m c.oo ganismos ca’isales en la ub e. Son la oniu p edominan e (de 20 a 50
eces más que las clínicas). Pueden con e i se en cíinicas (agudas o c ónicas) (en ello es iba
su im^icnancia). lina a iedad de b mami is subclínica es la ¿he ación de la sec eción (üiami is
asiá ica) cuya causa no es b in ección po gé menes, sino b in luencia de ac o es
ambien ales
l^s mami is clínicas p esen an una sin ouia ología a iada, desde a iaciones disc e as
de b no ji de calidad leche a has a la desapa ición comple a de los ca ac e es p opios de b
leche, pé dida o al de p oducción y as o nos g a es del es ado gene al ('s a a su cu ación
espon anea De aciie do con el cu so e olu Ko de la en e medad y el g ado de sin oma ologia.
pueden di e encb se mami is clínicas iuba|;ud«s« «{sudis y c ónicas. L^s agudas
e olucionan con acusados sín omas de in lamación, ap eciándose en b uh e hinchazón,
en ojecimien o, aumen o de b empe a u a basal. dolo a la palpación y endu ecimien o de los
ejidos mama ios. La leche, en pequeña can idad, p esen a ake aciones o ganolép icos isibles
Casi siemp e b en e medad da higa a una lesión pe manen e de la ub e con pé dida de mi Ka
2
pa ógenos ambico ales y la dinámica de ias m ecdones que p oducen en k>s ebaños. Tal
b o mac ón puede den a en el eslablecimien o de mé odos más e icaces de con ol. Las ÍMIs
se diagnos ican en c aos casos oiaiKlo: l ) se ecoj^e e^ mismo pa ógeno de 2 o más mues as
consecu i as de leche de los cua e ones zniéc ados: 2) el mismo pa ógeno es ecogido de 2
nues as de leche de cua e ón en 30 días y 3) se hace un aislamien o de un pa ógeno en un
cuane c l coq niamkis clmica Cada pa ógeno se sigue como una IMI indi idua) pa a ei
anahsis de ios da os (Pa a diagnos ica un cua e ón ccmo a ec ado po na^ni is clínica se
alo a un SCC de !0'’ célm] como mínimo. Se u ill an ios esuhados de los cul Kos de las
mues as pa a de e mina el o igen de las IMI).
El po cen aje de cua i ones in ec ado se de e mina e ospec K ámen e una ez se
iden i ican odas las IMI y es unción an o del índice de IMI como de su du ación Es e
po cen aje se alo a po día de lac aciim y día de! año. Los esul ados indican una endencia
es adonal de la mami is clmica. Los SCC u la leche de mezcla en anque e lejan ei modelo
gene al de incidencia baja y aha de la mami is clínica du an e el ano. La mayo ía de los casos
hnicos se asocian con el aislamien o de 2 g andes g upos de pa ógenos.
La mayo ía de ios es udios sob e la apa íción de la mami is en las acas se en ocan
sob e la píesencia/ausencia sin conside a el n*" de episodios (Dish e al, 1989; E b e al, 1985;
Ci óhn e al 1986) Se conside a la incidencia a nací ebaño.
I^s écnicas epidemiológicas o i ecen impo an es he amien as pa a es udia los
indicado es de nesgo de ebaño (Ro hman, 1986). La iden i icación de es os indicado es en el
ebaño con ibuye a la onnulación de la pa ogéneás de la mami is clínica con bajos SCC en
ebaño y se acili an así las mejo as en los p og amas de con ol
Pa a el diagnós ico de la mami is clínica y/o subclínica, la ía p incipal ha sido siemp e
9

d cuki ‘0 mic olño ógico de la« ames s de !edie (Ebe k e al 19S2; Me Domk 1989)
pan d aislamien o de los paiógesos p ácipales y/o secunda ios (en a ios es udios del
diagnós ico de U manñ is cUnica. en e d 12 y el Í8^< de ias mue^ as de acas con mami is
u ie on cukKos nega Kos al u iliza el mé odo es ánda de cul i o (Ande son e al 1982;
Danid e il 1982; HiH 1986; Pea son y McKie. 1979). Pa a mqo a el iiidice de cukKo
p>jS{ Ko de m es as de leche con una baja concen ación de bacne ias. se h¿j} suge ido
ohíí íenes mayo es de inoculación en placa e mocnilación de a mues a (B oun e al l9gl)
(González e al 1987. 1989 y 1990)
Se u ilbu on écnicas de cul Ko de e icacia "aumen ada" pa a inc emen a la ecogida
o de ec a b p esencia de pa ógenos en leche de casos con mami i» clínica ([>msmo c e al
1992). Los esuhados de las naies as consecu Kas po encian la p obabihdad de un
diagnós ico adecuado y pueden usa se pa a gene a es ánda es pa a compa ación de mé odos
de anahsis No obs an e, b economía y b p ac icidad ecomiendan que se use una sola mues a
en in es igaciones de caa:po de b mami is
TécDÍcas de de cc iÓD d IMb p odac o os de mani is.
Los mé odos y écnicas desa* oUados pa a diagnós ico es án basados en b
conside ación de las siguien es ca ac e is icas délos pa ogénos p incipales:
1) Son capaces de se ácil y epe i Kamen e cukKados esos ge menes de 0.01 mi de
leche semb ada en agai sang «; con o sin escuhna.
2) No son esul ado de la coo anmiación de una mues a de leche.
3) P oducen (Mis de b ga du iición en ausencia de an 9>io e apia.
Taies ca ac e ís icas no se cumple» con los pa ógenos ambien ales y su diagnós ico es
más di ícil po que las IMI son de co a du scsós Las u c/ml de leche en cua e ones
10
in ec ados son ecues emea e nicoos de 100. El isiamien o de es os gé menes en im cul Ko
de leche pod ía se esuhado de la con anánaciÓD de la mues a.
El papd del cul Ko bac e iano es p imo dial incluso en ebaños en los que los ; ignos
chmcos y o pc iiíes de SCC sugie en una imp obabilidad de mami is
La mayona de bs ebaños se clasi ican, a e ec os epidemiobgicos. en 4 ca ego ias
(Sischo e al i ^3). 1) lib e de pj ógenos p incipales: 2) p esencia de es a ilococos coagulasa
posi Kos pe o no S. s ^aUc iae aislado de al menos I mues a de leche): 3) p e.scnci? de S.
aiisbic ae pe o no de S. au eus. ai.siado de al menos ¡ mues a y 4) aislados S. a ¡alac iae y
S. a eus en una niues ia al menos El de ebaños con el «oipues o 4 es bajo, po lo sin o,
es os ebaños se ag upan con aqueibs donde se aísla sob S. agalac iae pa a la e ahiaciiSn de
p ac icas de con ol de mami is eiacionadas con el es a us de pa ógenos del ebaño
1^ sensibilidad y especiñcidad de de ección de S. agabc ijie y S. au eus depende del
mé odo j>o el qu'; se es ablece el diagnós ico de ini Ko (Sea s e al W l) (Pos ie. l%8.
Cioodkin e al 1<W)) (ya que el uso de la leche de anque pa a delec a !a p esencia de bs
pa ógenos p ima ios no es un es pe ec o)
Los es -uemas de con ol de S. au eus y S. a|;aliic !ae se plan ea on después del
desa oib de bs mé odos de iden iñcacion e ica/ y es udios epidemiológicos de in Kos
(B amley and Dodd. 1^84; Dcdd. I98(>). Ei con ol de los oí os es ep ococcs hs sido más
di ícil debido a su ampha dis ibución. Cambios ecien es (Collms e al 1983. 1984; De iese
e al 198»>, Dodd. 1986; Fa ow e al l*^^83, 1984) en la axonomía de ia amilia
S ep ococcaceac pe milie on el desa ollo de as emas d^ iden i icación mejo ados, median e
ei uso de écnicas de hib idación de ADN y de p uebas de oligonucleó idos
El aislamien o pa a su kieo i icación de los cme oco^^« es muy a iable en su
II
p opo ción de unos esiudioá o os. La di e ndi en d índice de liskineiiCo pu^e debe se a
di e encias en b mues a de la población, desciipción de nue as especies, disponibilidad de
más cá s de diagnós ico, e c....Las écnicas de c d i o "mi adas" (incubacióo de p cculli o.
aumen o dd olumen de inoculo y congeU:,iói) del p xuhKo) inc emen an sig iiüca K ámen e
la sensibilidad dd cul i o espec o al mé odo es ánda (in »€ulj ión de placas ¿ a^a -sang e
coa 0.01 mi de leche e incuba a 3TC du an e 24-48 ho ai ) (Dinsmo e e ai.
ya que a ios es udios dd dugnós ico mic obiologico de ^iami is clínica ci aban poicen ajes
de en e el 12 y el 38 po cien o en mues as de leche de acas mamí icas que daban cahi os
oega Ko^ con el mé odo es ánda (Ande son e al. Danid el al. ¡982. Hill 1Q86.
Pea son y Mckie. 1979). El mé odo aumen ado'mejo ado que p oducía un inc emen o de la
sensibilidad sm aumen o signiücai K o del índice de con aminación e a ia siemb a de 0.1 mi de
leche incubada a 4 ho as.
Se u iliza el es de la chi-cuad ado de McNema pa a conoce que especie bac e iano
inc emen a su sensibilidad de aislamien o( s¿ e i ica que son los coii o mes y los
es ep ococos ambien ales (Dinsmo e e al. 1990))
Va ios in es igado es han señalado ohimenes ela K ámen e g andes de casos cbnicos
de mami is bo ina en I .s cuales no pudo demos a se un agen e e iologico en el cuhKo
(Pea son y Mckie, 1979; Daniel y o os. 1982)
Los mé odos ecomendados pam la idcd ükación de S. au eus y S. agaiac íae., como
pa ógenos mamkicos p incipales, aislados en IMIs bo inas, en a izan el empleo del es de la
:^aguiasa y d es de* CAMP(B own e: al, ¡981; Pede sen e al !981).
12
13
Pa a ios eslañlococos coagu^sa posi i os (S. au ea , S. hykiis y S. in e medias)
p oduc o es de mami is bo ina (L^gk>is e al. I<>83) (Wa s e ai. 1^83) la u üización ún*ca
dd sis ema API STAPH no mos a ía un 100% de e icacia en iden i ica ules cepas i
c ecimien o en a)sa P saplemen Jido y ei esul ado del es de b B-^sala osidasa
pe mi ían una ácil di e enciación de lo^ e« es a ilococos (Kobc son e aL 1^2). con un
I00®o de eñcacia
hl Na ional Mas i is í euncü. en l '^ . ecomendó u ih/i el de id ace oína ío
Vogis-P oskaue , VP) como med» adicional pa a di e encia S. au eas.FI Subcomi é de
Taxonomía de Fs a ilococos y Mic ococos. en l%5. (amh en ecomendaba usa ia
e men ación anae óbica ael mani ol pa a di e encia S. au eus de les o os es a ilococo>
coagulasa posiíKos
Además de las écnicas minia u izadas bioquímicas (API STAPH. API 20 SÍRFP).
exis en sis emas de diagnós ico ápido pa a iden i icación de ios pa ógenos mami icos de
ma o p e alencía incidencia Pueden ^e mé odos se ológicos (como ei de coagiu inación en
lá ex en po a) y eadmá icos (como los ennmoinmunoensayo. que pueden es a ligados a un
componen e c omogénico que ac úa d*; $ub:4 a o pa a la eacción enzimá ica (ELISA) y que
iene dKe sas a ian es cap u a, sandwich, compe ición. ..
Loí^ es s de aglu insción en lá ex pa a la ideik i icación de S. au eus y S. a)»aüic iae
son ya ampliameme acep ados y u ilizados en labo a o ios clínicos con ai.sJados de humanoN
En 1^88, se u ilizó el RAPID MASTITIS TEST (RMT) (un si.s ema de aglu inación en lá ex
pa a la iden iíicacion de S. lu eus y S. agabc u en aislados bminos (Wa s and Ouens.
}988). FJ RjXTT es ú il pa a hace un sc cen ng de g andes olúmenes de aislados de S.
u eus (Ws s snd Oweas. I<>88): no obia s e. los c^lámenes pequeños equie en el es de ia
coagulasa pa a la de ección de cie as ca ac e is ic^as cla es. TI RMT no es an e icaz con» el
es de ia coagulas? EN 24 HORAS, pe o es compa able en sensibilidad al es del ac o
cum*)li ig y el de la coagulasa en 4 ho as, con^áudos.
Ademas, ei KMT es á diseñado especiñcamen e pa a su U!»o en bac e iología mamí ica
Fn 1984, los ensa -os que ya se ealizaban de aglu inación especi ica de las c^pas de S.
agaUc iae de o igen IMIs bo ina> indicaban una posH^le elación en e la capacidad de esai
cepas ps a aglu ina se en p esencia de leche bo ina ^Wange and Dunn , W84) y su capacidad
pa a adh^se a las céhila,s de 1a glanduia mama ia, ya que es un pa ási o in s^nama io
obligado (Me Donaki. I^T7). lo que podna in hiii en ia de e minación de su ol e;:o!ógico ^
la glándula bo ina y en que medida ei enómeno de adhe encia in luye en h pa ogcnicidad de
S. aisalic iae pa a la ub e
En 198o se ensa ó un es de aghi inacion en láiex pa a la de ección de an igenos de S.
j^aljc iac de LMls bo inas (ÍJaniel and Bamum. 1986). Todas las mues as coo e iiendo S.
• alac iae ñie on posi Kas a es e es bien an es o bien después de 18 ho as, nicubando a
37°C. Los esul ados ob enidos sugie en que donde un cua e ón Ikga a se in ec ado con S.
•g lac ÍM el es de aghi inación se ha á po^i o en 24 ho as, en los casos donde se
desa olk manii is clÉiica puede pe manece pos i o 1 a 3 dias después de que el o ganismo
ha>n desapa ecido de la sec eción lác ea. El es de lá ex pod ía jupa un cieno papel en
de cc x acas in ec adas y ebaños es ando k>s sue os de nues as de leche de anque de
mezcla, ya que ales mues as pueden con ene muchos con aminan es que hagan la
in e p e ación di ícil.
14

Yi «n 1993 se apÜa on i»s lécoicas ELISA pa a la de ección de an igenos h icie iancs
en scc eck nes ac eas con cukKos nega Kos. con k> qi*e se podía demo«; a ia p esencia del
OBc oo ganismo p odu io de la IMI en un momen o de e minado del cu so de la mami is
{Zo ah, 1993). La écnicc u>ada se ba:^ en la doble écnica «aad ^ic a desc ka po Voile e al
(1980)
O os desa olla on un ELISA diseñado pa a de ec a an*icue po$ í en e a S. au euii
(Adams e al. 1900).) O as in es igaciones han mos ado una pob e con elación en e los
esuhado< del FLISA y el cuhKo mic obiológko de las i7iues a> (Hicks. C R e al, |9O0) Se
s íi^ ó combina los esul ados del FLIS.A en mues as consecu i as con la de e minació dei
SCC pa a mejo a la sensibilidad y la especi icidad (Cosíello e il, 19^^))
Se compa a on el cullKo micn'biológico, el El ISA la de e minación del SCC
«ahzada en mues aN de leche como mé odos pa a iden i ica las acas con IMI po S. au eus
(Hicks e aL 19<M). El uso de c-ubi o epe idos podía n>ejo a la e icacia del diagnós ico de la
mami is po pa óg^os ambien ales
15
Se cakuia oQ la sensibilidad, especi icidad y a io de p obabibdad ambién pa a ealiza
el ELISA en mues as consec'u i as. y de e mina b S.CC en esas mues as y combina los
esul ados del ELISA con los SCC (Hicks e al. 1994)
l,os dacos de las acas se inchiian solo si es aban disponibles los esul ados del ELISA
y del cul i o n ic obiológico ob enidos en 3 mues as consecu Kas. Las acas se conside a on
posi i as a ¡M! po S. au eus si los esul ados del cuhi o e an posi i os en 2 de 3 m;«es 3s
consecu K as p ime as ecogidas de cad2 aca
h
Li ^sdñbdad se calcubha como d n° de acas con uc esuh do del <es posimo
di idido po el n** de aca^ eos TMi especi icidad se caic laba como el n"* de aca^ coa un
esul ado de es negaiKo dKidido po el n'^ de acas que no u ie on iMI. F! a io de
p obabilidad pa a un es po^á i o se cakulabs conK> la elación en e sensibilidad y I-
especiík'id^d. > pa a un es nega i o como I-sensibilidad espec o a especi icidad (Ssci^e e
al, IW l)
lA q)e?ib !)dad de bs esul ados del FLISA y el cui Ko mk obiológico se de e minó
calculando el po cen aje de acas que u ie on esul ados de es consis en es pa s dos y pa a
es mues as consecu i as i.a p e alencia >e calculó sob e la base de! cuhKo micTobiológico
de las p ime as mues as ecogidas de acas de las cuales nunca se aisló S. au eus. calculo
ambién el a io de p e alenda de densidades óp icas (Ro hman. 1^86) pa a de e mina el
iesgo de un esul ado posi i o po ILíSA pa a acas con IM! po S. agalac iac,
esu ilococcs coa^uiAsa nega i os, coli o ne^ o C. bo is.
l oi e.ukados del FLISA coinciden con el es a us de IMI mis ecuen e en acas con
ele ados SCC pe o la inchuáón de acas con bajos SCC no jus i icabi el pob e endimien o
del ELISA, los esul ados del es udio de Hicks e al ;I9Q4) indicaban que el cuhi o
mic obiológico oda ía es el mejo mé odo pa a iden i ica casos indKidualizados de acas con
(Mi po pa ógeuüs mamí icos p incipales (S. ao cua, S. »g !ac iic, S. dys^ibic ije^).
Las decisiones pa a usa un mé odo de diagnós ico u o o debían inclui una
e aluación de la can idad y ipo de in o macióo ob enida de lo , esul ados de cada es Fl
FUSA enía un blanco especi ico, no malmen e un solo pa ógeno, y sus esul ados no
p opo donaban in o mación sob e o os pa ógenos po endales. El CTihi o mic obiológico
coii!> iiuia un es! ela Hime i e BcspecuV>> que p opo cío uiha mío au ión sob e una implu
‘« añedid de pa ógenos i^sccp iMes de p oduci IMI
Uüa abcmaiKa a mé inlo J.ISA an ecksdo se desa opo median e una écnica pa a
de ec a an icue pos especí icos que < i una ncción an géoica pu i icada de S.
ao e s. Fl lea u o un* e icada del de de ecció . cuando se compa o con k» mé cnlos
de cuhKo bac e iano. Tu o una !icn.sib iidad dd ^2** pa a cukHos poshKos y una
especi icidad del 100® pa a los nega i os (Ci o e and Jo les. l*><)2M cl I^A PROSFAPH»
l os expe imen os se dis^ ña on pa a compa a el e^a 11 iSA PROSI APH co bs
mé odos con iíncionales pa a la iden i icación conec»a de aca^ con IMI po S. au m« pa a
e alua la e icacia de las medidas de higiene en eí o deño, que pi^i mn de eni en la
p e ención de nue as IMIs. de e mina la ulüidad de hace un íc eenmg de bs ebaño> pa a
ide« i ica acas con in ecdoni.* po S. aa cus usa esa in o mación pa a implemcn a
p áclicas de manejo que a aden a p e eni la dispe sión de IMI. de e mina I2 p.e alencia de
las ÍMI con más ebaño> y deíin la elación en e bs an icue pos en e a S. au eus en la
leche cánida de anque y la p e alencia de IMI po S. ao ea«.
Pa iendo de la p ei ása de que algunos bi e^igado es han señalad«> m incdK:u>n
del n® de PMN en la leche mami ica p .po ciona un indicado especi ico dei ni el d^
in lamación y la in ección (Cullen. !9(; >: Ru To. l%8, Sciiabn e al 1^71). se diseñó un es
ELISA que de ec ase ese ipo cehila es^K^cílicamen e pa a de ec a la mami is suhc íni a con
p on i ud (O* Sulii an e aL 1992). El ELISA, de ipo sandwich de cap u a, se usó pa a es a
la p esencia de ecuen os de PMN ele ados en .nuci ás de leche ecolec adas semanzlmen e
du an e un pe iodo d ^ semanas en un ensayo y en mu 's as oK;midas de aca di ec amec e
en un 2° ensayo. La sensibilidad, espedñddad y e icacia se calcula on de acue do ,on lo
17
expues o po H«i en En o% esukados do bubo di e encia «ágni k:s Ka en e las 5>CC
p edicbo^ y los eaie . oK^ando que las ahüo bancia^ oh enidaN usamio e! FLiSA de cap u a
se coneiaciona o i mu bien con el SC í. F>(os esuHado o mue^ an que ei ensayo es capa/ de
medi al n enos codcen acione;» celula es an haja^ como 100.000 cél mi
s ; iden e que d FLISA de cap u a se co elaciona inejo con d SCC que con
cuak uie o o es<. in hj endo «as medidas de N AGa^a. sodio. co^duc Kidad eiéc íca. BSA.
ac i idad de la es e asa y de o as enyiinas
I os esul ados mues an que las ah^o encias ob enida» en e! M ISA pueden usa se
c'uan i a K ámen e pa a de en áia si un^ mues a de leche es nuns ica o no mal, y ambién
pa a p edeci adecuadamen e una mues a con un SCC de umb al an bajo conK> 100.000
cel nú Asi. d Fl ISA de cap u a delec a a ia n iamación ^ausad;! po? lodos los pa ógeno^ que
exci an la iiiig aci<«n de los PMN. Ll ELISA especí ico en e a PMN lieue u « po encial
sígiéíka Ko como al es de uso ^mpk pa a chequea aca*, o cus e c»es con numki^^
subciwca MÍaí a p oenc b i ami i> cimica. U di:»pc sión de la in x ion po aislamien o de
la.s acas in ec adas con nunúis. iden i ica los cua e ones de la ub e indK duaii/ados con
p oblemas y se eccionjií y eiimnii leche manmica del anque, así como man ene el SC( del
anque bajo y b calidad de la leche aha Fl es pod ia usa se ambién pa a n Hwhonza la
eikacia de k> » a amien os an ^bio e ápicos
Las écnicas de diagnós ico de b maim is más a anzadas se basan en la biobgia
oolecub y d uso de hib idación de ADN y sondas de ácidos nucleicos pa a b de ección de
mic oo ganismos Fsio comenzó en los ano«. 80, y su p mcipio de abajo se basa en b
de ección cuah a i a de secuencias de ADN Saae iano ^ico y po lo an o o ece b en aja
de su al a especi icidad, manep imple y segu idad m i ad a du an e el p o ocolo de esiaje
18
El mccinismo ac Ko ñus impo a i e de de ensa con a la in ección y po ende la
mami is po pa e de la aca es la agoci osis de los pa ógenos mediada po PMN y
mac ó ages (Poui el, 1983- C a en and Wi3iams, 1^85; Raina d e aL 1988). siendo los
mac ó agos los mas abundan es en leche, y po lo an o en el SCC, de acas sanas, y los PMN
en la leche de las acas manc ica >.
Se han ealizado nume osos ensayo*i pa a aunien a el n° de células agoc a íss en la
ub *? (inmuiioes imulación) (C a eo and Hill l9Xb. Hus on and Heald. 1983: Ke hli c al
1989; Nicke son e al !9S8: Owens and Nicke son. 1989b; Paape e al I^SS) Se han
u ilizado ambién acunas incspecííicas que con ienen pa ógei^os secunda ios pa a p e eni las
IMIs ocasionados po pa ógenos p in .-^ales (O cns and Nicke son. l^H^a: Wood a d e al.
1988)
l a comp ensión de los me anisTH>s de de ensa especi ica de ia ub e quí es án basados
&i ac o es humo ales y celula es se ha inc emen ado ma cadai?Kn e en los uhimos ^,os
(Coldi / and Wa soo. 198?. C a en and Wiiliam.s. 198?, lohuis el al I9‘M). Pa k ci al W 2;
Pe sson e al. ^ 2 . Raina d and Boula d. 19Q2)
E eximen de la ac Kidad hinciona de os PMN. el ipo p edominan e, ha mos ado
que su aciKidad agoc ica y bac e icida disminuye a !o la go del pe íodo seco y el p e io a
pa o y du an e la in ección, asi como se p oduce una eacción concomi an e en la espues a
p ob eia Ka de im oci os T a los ac Kido es policlonales y los pa ógenos du an e es os
penodc:^. i^s mecanismos que mk en la disminución de la ac i idad imcional de los ieucochos
en las sec eciones mama ias y la lelacióu con el aumen o de L suscep ibilidad a las IMI
oda ía se desconoce. Ia)s esuhados de algunos es udios mues an que los lin oci os T
ac K idos es a án p ese i es en odos los es adios del ciclo de lac ación de la aca en ia leche y
25

I í
q)ie*ícnian uua clc ida p upo c Ni de lo)i lÍD oci Oü o aic« cu odo m; i ic cn c i ? U mcídc icia
de b m ecc ó i, o que podna ju/|[a se com» que dc icmpe lan un papel üigní hja Ko en la
egulacioi de la e«pue«iia niiiunc a os paio^cno> en la ^Undula mama ia (Pa i c al 1^2)
n cuan o a os *MW, la e ec Rídad de su ai^cimi inniuni a ia depende de la pnni i ud
magni ud de ia les Miesia mig a o ia y «ai aaK dad agocilica y bac e icida (( a en and
Wil ianu Hill, 1*^81, Hilí e a . I^K4: Paape eí a , l*^7«) n i^ iponancia de la ap da
i ñg ación de os PMN cii el lumen de la üandula mama ia pa a la clmñnacion de in ecí ii'n
ha sido c'4ahkcida
*n elación on c papel de la espues a inmune huí MF a se ci a L unción de las Igs.
la lac o e ina y os ac o e-, del complemen o en el p iíceso in lanu o io de ado de una IMI.
con p opiedades an ihac e ian as (po ops4Mii/acion y neu ali/ación) (Pe ssim i a I^W2.
Raina d I^^Híi. Raina d e Boula d I***í2). así co i«) mducen quimio axis de l<»s PMN
p onM>cionan ia agoci osis (Banks a id au e . ( ’heu el al. I‘>*^1. No c oss, l‘W |) Se
ha podido medi la ac i idad agoci ica de los I^IN en e a pa c^gcnos ales co u> S. au cu«,
po medio de iin enca o de hi^uiK omo (Ande son e al. i ^^2) o mic osc(>p a de
hio e oicia (S ox c al l*>87>
OIRAS n ( NK AS 1)1 í>IA( NOSII( C) CM MAM MS ya ci adas c-n ia
li e a u a son la ni di ión de Is ciHiccn ación d lac oiM (R nn , d inc cm ii n d
la oBc ii a ióo d dom o (Scedc , d eaiudio de la oiidu % idad dée ica d
U Ic bc (Ich y I991V), Ia cunc nl acióo de en/imai lác m Ul * como
c iUiaM (Sha ahi ( al* l*^K NA<9»i4 < Kjiji iii i and .leasm, I9A8), o a «»aii,
UcU MÍcahid o ( iia ji« ... (ki cKeii e al, Njaunja and lunke, I9K9; Bal! c al,
19S9; %li( iia '»iid F o i» C'ooiio aad Kckmali, 1 ^ ) . No 4ih^an(e c«mi íci»c ene
en cucnu que en es e ipo de c í e íos i idicado es de in i a is los nKeles eo2Ín?i icos pueden
cambia en la gUndiUa mama ia en unción del es ado dd animal y que alguna» de es as
p o eínas qe cen un e ec o indi ec o sob e el nKel de la in ección (Smi h anü Schsubache .
IQ79; Sau l el aL 1977; Ko honen. 1980. C ii en and Williams, 1985: Nicke son. 1985) Se
p opuso el es udio del nKel de NACiasa po cua e ón como ensayo pa a el es udio de á
in lamación mamhica pos - e apeúiica con an ibió icos (P o ala. |988).
An e Ig s p oblemas de in e p e ación que p esen aban esos diagnós icos, ia IDF
ecomendó u ili/a habi ualmen e pa a la de e>:c¡ón de mami is subclmica una combinación de
mé odos bac enok)gico^> y una p ueba pa a eseb la espues a in lama o ia Los indicado es
de mami is mdi ec os má > comunmen e usado> son ia medición de la c mduc Kidad eléc ica
b de la concen ación de NACiasa
i alo p edic ho ue un es posi i o de conduc Kidad eléc ica peimanece bajo en un
ni el de baja p e aicncia en Í2 población ( ebaño), con 4na sendbilidad global del y una
especi icidad, ambién global del 94®e (Nielen e aL W 2) Las medidas de conduc Kidad
elec ice on-line se haii in oducido ecien emen e (Maa jc el al (19^2). con el obje i o de
ayuda a moni o iza la salud de la ub e en un ebaño leche o, conduc Kidad ipica de ia
leche no mal es á en e 4 y 5.5 núbSiemens, cm a 25X la dis ibución de las medidas es
no malmen e loga í mica. Fs a de e minada po 'i concen acioiies de aniones (p incipalmen e
clo u os) y ca iones (sodio y po a.sio p incipalmen e) Ias concen aciones de ión po asio (K*)
disminuyen y se inc emen an bs de ión clo u o (CI ) e ión sodio (Na") en la mami is La
concen ación de iones sn b leche mimi ica cambia debido al inc enxm o en b pe meabilidad
de los capib es sanguíneos, b des ucción de las áKubs de con ol de hijo y de los sis emas
de anspo e ac Ko de iones. La conccn ación al e ada de sodio, po asio y clo u os p oduce
27
el mc emcnio de la conduc Kidid sin cambios en ia p esión osmó ica. Pa a dis mgui en e
Icc'he no mal y mamhica usando U conduc Kidad elccn ica. se han in es igado ano» ine odos
Se ilizji d índice en e cua e ones de la ub e (IQR) pa a ma ca las di e encias de
conduc Kidad eni e cua e ones y que pod ía señala la exis encia de mami is en un cua e ón
en pa icui^ . Se han p opues o a iaciones en el ¡QR y una cdc inición pa a mejo a los
anahsis es adís icos del lni^2no: además del K)R se han usado umb ales pa a alo a la
di e encia en e el cua e ón con a!o más ele ado y con más bajo Pa ece que la combinación
del alo absohi o y el IQR. sm usa umb ales. ci ^ a amien o es adís ico de un análisis de
eg esión logís ica p opo ciona el mejo modelo.
bn gene al. Ion in on ies sob e la u ihdad de la conduc i idad pa a de ec a mami is
o ecen esul ados con adic o ios l'na de Us g andes di e encias ob enidas en esos es udios
e a la deñnicion de acas sanas y en e mas (es ánda ideal) que se usaba en ia in es igación de
la conduc Kidad 1^ baja >ensibibdad de es e c i eno de diagnós ico de la mami is pod ía es a
causada po el uso de un es anda ideal "inco ec o” mas que po el uso de la conducnKidad en
sí pa a de ec a poó i os a mami is l>a conduc Kidad se a mqo pa a de ec a nega Kos que
el e^ánda ideal
La de inición de es e es ánda y que inchiye SC'C, C'MT, cuhKo bac e iológico, solos
o en comb lacHón: anahsis de la sm oma ologia chnic y^o conduc Kidad y concen ación de
laaosa en leche) pa a la mami is subclinica no ep esen a un es ánda pe ec o, debido i que
se ecomiendan medidas epe idas y combinación de es s. Quizá deba í iclui ambién la
p oducción lác e? que se e a ec ada po la mami is. Debido a que la conduc Kidad es a
elacionada con el dado ai epi elio co ppo aL es o pod ía p opo ciona una de inición más
e icaz de mami is subchnicx. Se ha encon ado que la pé dida de p oducción es á
2?
coi dicionAda con la conduc í idad.
E! uso de la conduc i idad como un sis enu de bi 'zs igación o diagnós ico depende á
no solo de h sensibilidad y la especi icidad sino ambién de la p e aiencia de mami is
lina en uja de los sis emas on line es que es posible una in es igación pdu a eíieua
la ausencia p esencia de mami is subclínica después de cada o desio. Los sis emab on linc
podnan alcanza una aha sensibilidad pa a mami is subchnica o usa se pa a la de ección
p ecoz de la mami is cijiica. dependiendo de la secuencia de hechos en mami is Cuando se
use la conduc i idad como p ime es de selección, podn'an usa se o os da os del sis ema on
bne subsiguieniemcn e pa a encon a ^cas ano males en la población posi Ka según la
conduc ixidad
Algunos in es igado es e ahu on la compa ación in e cua e ón de dK e sos
indicado s de mami is subclínica. aba cando la NACiasa y la conduc * idad en e o as (iensen
and Knudsen. 1^1) Filos obse a on que los diagnós icos d; mami is basados en las
mues as de leche de cua e ón ecogidas cada ez es a án in luidas solo le emen e po la
a iación biológica al aza , y que las mi.smas di e encias ela i as que exis en en los nK eles de
los indicado es en e los 4 cua e ones de una aca se e ela án independien emen e de! día de
mues eo. Las co elaciones de los cocien e^j en e los indicado es e lejan con más p ecisión
las elaciones eales in e cua e ón de diagnos ico de los dK c sos indicado es
Iji p esencia de NAGasa en leche de aca ha ecibido una pa icula a ención debido a
la in ima elación en e la ac Kidad de esa en/ima en leche y e! SCC en esa niisma leche
du an e la lac ación (Ki chen e al 1980; Kaa inen and Jensen. 1988) La ac i idad de la
NAGasa de bs sec eciones mama ias se mc emen a du an e la IMl (Ki chen e al. 1980) y
du an e la in ohición mama ia (Timms&Schuhz, |985) y declina ápidamen e después del
29
pa o y es bija en leche de acas no in ec adas
Se de e mnió la elacióo en e la concen ación de NACiasa en leche y e es ado de
iní cción de los cua e ones de la ub e Aunque los ak> «;s de NAGssa di e ían en e los
cua e ones in ec ados o no. Us di e encias e an solo signi ica i as en e aquellos m ec ados
con S agalac iae y o os es ep ococos No se encon a on alo es base de NAGasa que
pe mi iesei! clasi ica el es ado de m ección de mas del 65% de los '.ua e ones K1 es de
NAGasa dic solo esuhados iables pa a los cua e ones in ec ados c ónicamen e con S.
agalac iae y eíkjó ei daño cau.^do en el epi elio sec e o (C o bellini el al. Tí87).
F1 ensayo pa a NAGasa eah/ado po Bemi ig el al (1^93) ue e^cialmcn c como el
desc i o po Hu ley and Ci ie e en 1987. l a concen ación media de la ac i idad de la enzima
cambió s gni ica K ámen e con d iempo, disminuyendo du an e la p íme a semana de lac ación
y pe maneció cons an e a lo la go dei e^o de la lac ación l a ac i idad de la NAGasa en
leche de aca es aba ahamen e elacionada con los SCC en leche íCallie i e al. 1987).
habiéndose p opues o como es de diagnós ico pa a es ima el SCC en leche y jl daño isula
mama ío e Aihan e de la in lamación (Kkchen e al 1980) l os esuhados de es e es udio
sugie en que el uso de la acihidad de la NAGasa como indicado de mami is debe ene en
cuen a el ápido decli e en la ac i idad en/imi ica que se p oduce du an e ios p íme os dias
pos -pa o y que coincide con el pe iodo de máxima suscep ibilidad a una iMI (Me
Donald&Mc Donald. 1975)
Se examina on las ins o maciones ahema has de la NAGasa pa a mejoia su e icacia
en el diagnós ico de la mami is (Be aing e al 1993). Se mejo ó su sensibilidad con una
dis ibución de i^ecuencias de Gauss y a íanzas de subclases uni o incs. El anáhsis de
U’ans o mación de la NAGasa se desc ibió de acue do con Box y Cox (1964) y .se aplicó el
30

SCC según Aii&Shook ( Í980). El sná isis de los da os se hizo po el p ocedimien o SAS de
níKKielos lineales (1900). Los p incipales esuhados de es e es udio son la cons a ación de la
dis 7ibución de ecuenci^s ex emadamen e sesgada en la acnHídad de !a NAGasa en leche, lo
que equie e una aiis o mación loganiinica an es del análisis es adís ico y que se mos ó
como ahamen e e ecnKa oomo indicado de mami is* y la ahdación de hipó esis
O os indicado es de mann is con base isicoquímica c ados en la Ihe a u a son la
de e minación de sodio y po asio en leche y se elación con la SCC pa a i?ioni o ización de
mamhis subclínica El sodio e a el pa áme o más esi echainen e ebcionado con el SCC y se
ecomendaba pa a usa en p og amas de in es igación de mam is (Co bellini e al. 1984)
31
ANEXO I: ANAIJSIS DE COSTE DE LA MAMITIS Y SI' PREVENCION EN REBAÑOS
LECHEROS
Muchos ni es igado es han es imado el cos e de los e ec os clínicos y subclínicos de !a
nuimi is (Blosse , Í979; Jaspe e aL *982. Janzen, 1970) mien as que o os se han dedicado
p incipalmen e solo a los e ec os clínicos de la ¿nami iN (Mille and Sem. 1990) La>
di e encias ci adas en los cos e> de componen es de !a mam is pueden explica se, en pane,
po la di e sidad de mé odos de es ima y de en oque Se in en a on es ima los cos es de los
componen es de la p e ención de la mamhis; de la mami is po año aca pa a odos ios casos
clínicos, ipo de o ganismo e m *cciones mix as: de los componen es de un episodio clínico de
mami is global y la incidencia de la mami ii« clínica po ipo de o ganismo y po in ecciones
mix as: ambién alo a on el amaño del ebaño sob e ios cos es de los componen es (Müle e
al. í9<)3)
32
En los cos es de p e ención incluye on bs ca ego ías de abajo del ganade o,
p oduc os p c en K'0s y se icios e e ina ios. Las es imas á ca ego ía de cos e de
componen e pa a mami is chnica ue on po acas nme as. des ucción del cáda e , acas
lle adas al ma ade o ( anspo e), se icios y p oduc os e e Lia íos, abajo del ganade o y
pé dida de leche. Los mé odos pa a es ima los cos es anuales po aca-año de una mues a ya
se u ih/a on en es udios p e io> (Milie and De n. IOQO)
I.a p e ención de la nuimi is con.s i uyo el 48% de los cos es e e idos a la p e ención
de odas as en e medades bo ^s íji mami is p oducida po in ecciones mix as ue la más
cos osa sob e la base de sca>año. suponiendo el 35.5®o de los cos es gene ados a los
ganade os po casos cbnicos. seguido po casos de mami is po E. coli (el 21.3%). po
es ep ococos esculin-po^i Kos p ínc^ahnen c S.ube b) (el 6 4**o), po klebsiella spp (el
5.7®o), es ep ococos escuHn-nega Kos CAMP nega i os (S. dysgalac úie p incipalmen e),
po Ln e obac e spp ( i 4.8%^ los es a ilococos coaguUsa nega Kos (el 4. I^o)^ los
es a ilococos coagulasa po«á Kos (el 3*^0), S. agalac iae (el 2.5”o). Baciiius spp (el 1.2%) y
cul Kos nega Kos (no aislados) (el 8 6®o) Los cos es po aca-año ue on los más ele ados
po mami is causadas po E.coli como único pa ogeno
Ln gene al, los cos es mayo es po aca-año a ia on en unción del es a o pobíacióii
del ebaño y del agen e eiiológico de la mami is: no obs an e, la mami is causada po
mic oo ganismos ambien ales iie la más cos osa. Los cos es po episodio chnico ambién
a ia on según el es a o población Los mami is po es a ilococos ue on cla amen e cos osas
en ebaños g andes, mien as que pa a ebaños medios ue mucho meno el cos e.
El exanKn de la inc de c a de ininmis chnica e eló que el ipo más común ue de la^
in eccioces mix as. Los g andes alo es ob enidos pa a los cos es de las mami is p oducidos
po ales in ecciones sugi ie on una subes ima de los cos es pa a los pa ógenos especí icos
índKíduJes de mami is
33
1^ pe dida de p oduccióii lác ea se es imó e i un klo mucho meno al del b5>70%
suge ido po Blosse (1979) y Jaspe e al (1^82). Es a disc epancia sugi.ió que el bajo alo
de pé dida de p oducción puede e leja una subes ima de los co^es de la mami is clínica Se
equie en es udios de campo cx!ensi os a g an escala pa a es ima los cos es de ia mami is
(Mille and [>em. 1990: Hu d e al, 1991; Kanccne and Hu d. 1990). Es impo an e econoce
que no lodos los cos es g a ados en los ganade os debido a ia mami is clínica M>n p exenibíes
hay Hmi es sob e el bene icio que puede slcan/a se con la p e ención
Iji e icacia-cos e del con ol de mami is no se discu e, pe o los da os ob enidos de
es os es udios hab án de ap o echaise pa a p oyec a los in ac os de los episodios clínicos en
nue os p og amas
u
OBJETIVOS:
1) E ihiacióo de la disinbuc ó i empo al de los pa ógenos manmícns ipo y su
p e alenda.'incidnicia
2) De ección de p esun os es ados de in eccioii mamí ica subchnica. con absohiia ñahibdad y
en un penodo b e e ae iempo, median e el desa ollo de lui ki de diagnós ico po ELISA
sandwich de cap u a en e a S. agjibc ise. uno de io : p incipales pa ogenos mami icos, pa a
u ihi -iHo .-o no écnica de in es igación en es udios de campo a g an escaía
3) Coi , ación de !a en abilidad de los dK e sos Es e nas de diagnós ico clásicos en e a las
nue as he amien as de diagnos ico ápido y su a io es ue zo in es igado mqo a de la
iabibdad has a p esunción absolu a de iden i ícación del pa ógeno.
4) Realiza un diseño que pe mi a analiza los da os median e un anáhás muhi a ian e de
ac o es pa a esumi la in onnación de una ma iz de da os de X a iables y educi la a un
pequeño g upo de ac o es A pa i de ahí se alo a ían las pun uaciones ac o iales Los
a o es ep esen an a las a iables, con una pé dida mhi ma de in o mación Las a iables son
X gé menes iden iñcados, dos medidas Je ecuen o de céhilas somá icas en leche y la
de e minación de p esencia ausencia de en e medad en las acas de los es ablos maes eados
Algunos aislados de es a ilococos ue on con i mados medUn e un sis ema si aiU , el
Slidex Siaph kk 2.
Pa a U ca acie izaciÓD po el sis ema API 20 STREP y API STAPH. se siguió d
p o ocolo ma ccdo po d ab icau e. y los pe iles nunK^ncos ob e idos a pa i de la
conclusión de posi Ko nega ixo de la lec ^ a d las eaccico ^s enzimá icas ob enidas después
de incubación de la galena del API a 3“^ ' du an e 24 ho as ( API STAPH) o a 4 ho as
(p esun i a)-24 hoíasiconíi ma haX.API 20 STRFP) ue on compa ados con la base de ¿aios
exis en e Pa a Sos es a ilococos e ensaya on Us siguie i es eacci mes bioquinúcas
eímcn ación de glucosa, hic csa. mañosa, mal osa, laaosa. ehalo^a. mani ol. xyb oL
mehl’ iosa. a inosa. ilosa. saca osa, al a mc il ghicosido y N-ace il ghicosamina. educccion
de ni a os, hid óhsis de la a ginina y la u ea. £c i i(*ad de la 'os a asa y o mación de ace oína
del pi u a o ( eacción del VP). eacción de la oxidasa y eacción a la LSTR.
Pa a los es ep ococos las eacciones bioquimicas ensayadas ue on eacción de VP.
hid óhsis del hip a o y de U esciJina. p oducción de B>ghicosidasa. PYR. al a-galac osidasa.
B-ghicu onidasa. B-galaaosidasa, osia asa alcalina, leucina a iamidasa. hid ólisis de la
a ginina. y u ilización de la íbi>sa. L-a abinosa. mani ol so bi ol. laaosa. chalosa. mulina.
a inos?. ah edón y glicógeoo. La hcmóHsis .se de e minó sob e aga .^ang e. El es de CAMP
se eabzó segím lo es ablecido po B own e al (1^81 >. Todos os es s que no supusie on la
iden i icación especi ica iic on obje o de una segunda lec u a despues de o as 24 ho >is de
incubación y se some ie oQ ambién al análisis con el sis ema API ZYM pa a con i mación de!
uso de ca bohid a os.
4 :

Los bsciios G am oegüi 'os se iden ilica i^n de onn análoga a la de lo» cocos y
cocobacílcs G am poskKos. Los aislados en p ánocul í o en aga McCookey ue on
iden i icados po ca ac e izacÍGn bioquimica (sis emas API 20E y API 20NE). Se oma on 1-2
colonias de cad« placa bien aisladas y se p epa ó un inócu«o en agu» des ilada q e ue
inoculado en la galena dd API siguiendo las ins ucciones dei ab ican e. Los aislados se
some ie on a las siguien es eacciones bioquimicas 3-galac osidasa. hid ólids de ia a ginina
(ADH). de la bsina (LDH). y la omi ina (ODHK la u ib^^cion dei ci*ja o. eacción de la
u easa. la o mación de ácido sul híd ico y la de ección de la p esencia de ip ó ano
desanúnasa. la p ue >a del indoL la eacción de VF. la gelibiosa. !« e men ación de ia glucosa,
d manñol ei inosi oL d so bi ol. ia bamnosa. ia saca osa, b n :lihiosa. la anngdaHna. la
a ab nosa y el esul ado del es de ia oxidasa CLa do los pe iles numé icos ob enidos
después de la lec u a y compai ación de la base de da os, de modo análogo a los o os sis emas
APL ue on de e minan es de iden i icación especi ica, se complemen ó és a con d ensayo de
la educción de ni i cs. d es de mo ilidad y la eacción de oxidación, e men ación en medio
(>F
La p esencia de o os bacilos (co ínebac e ias. .) se es imó po el siguien e mé odo;
iden i icación de la mo ología coloni^ ! po mic oscopía (p esencia ausencia de espo as,
o ma, amaño y disposición del bacilo.. .} y obse ación de bs ca ac e ís icas cul u ales, en
medios solidos L-S (pa a Lac obadlhis). ATSS y aga Tinsdale (pa a Co ynebac e ium).
medio L cA (pa a IJs e ia). e c...,; con ^macion de los esukdos de las p uebas de U ca alasa y
oxidasa y dd ambien e de cuJ Ko (anae obio es ic o, anae obio acul a i o o ae obio) Pa a
los bacilos G am nega Kos no penenecieo es a las en e obac e iaceas. como Ae omonas y
V3) io. aislamienio en medios especí icos (medio TCBS y medio Ae omonas (Oxoid)) y
43
coDÍiniiadóa hioquíimca po d API 20NE.
La posbk p esencia de hongos dd gno Candida se alo ó po la obse ación de los
ca ac e es ino ológicos po nec oscopia y ca ac e ís icas de cul i o en el medio selec i o
OG E
El anahsis mic ob ologico pen a M) de ec a^ la posible p esencia de IMl a pa i de las
noes as de leche c uda eínge ada omadas de! anque, siguiendo un esquema d^ 4
ca ego ías' i maes a líb e de pa ój;eaos mamí cos p incipales; b) p esncia de !
p^i ó^eno p incipal en c^l i^o pu o (S. au eus/S . agalac iae); c) p esencia de a nbo^
ipos de pa ó^eaos p incipales: d) p esencia de una in ección mii a. 1.a odas las
ca ego ías se pa e dei aaálisis d al meno^ dos mues as de iecke consecu i as dd
aaqu donde se bebiesen idea i Kado cla amen e al ^ún pa óy;eno p esen e
ocasionalmen e en una IMl bo ina po e e encia.
EL RECUENTO DE SCC se ealizó ^ ni el !d anque (BTSCC) pa a odas las
mues as omadas de aiwos es ablos y se compa ó con los egis os de BTSCC de o o
es ablo (FM) que si ió como con ol posi i o, y los egis os de un labo a o io de e e encia
ob enidos en el mismo penodo. Los HTSC'C ue on de e minados u Ui/ando un Couhe
Coun e (Couhe L d. Ingla e a), es ableciendo como alo umb al límhe de ausencia de IMl
los 50ü.(X)0 cdulas po mí. Se ob u ie on las medias geomé ica y a i mé ica y se ealizó la
ans o mación loga í mica en ba^ 10 y se alo ó con uií es ANOVA
EL ELISA. Se u ihzó la écnica exphci anien e pa a de ección de an igenos de S.
agiljK ijic en hu de anque de aaezcla de un es ablo. El mé odo ELISA ñie eseociahnen e
simila ai desa ollado pe Raina d e al (1991) y Zo ah c al (1993) adap ado al p e&eaie
es udio.
44
con innación b^uimica po d API 20NE
La posible p esencia de bongos del gno Candida se alo ó po la obse ación de los
ca ac e es nso o ógicos po mic oscopia y ca ac e ís icas de cuhKo en ei medio sclec Ko
OGY
El análisis mic cbiológico pe mi ió de ec a la posible p esencia de IMI a pa i de las
mues a*^ de leche c uda e hge ada omadas del anque, siguiendo un esquem;*. de 4
ca ego ías a) mues a lib e de pa ó);eno9 mamí icos p incipales; b) p esscia de 1
pa ó^eoo p incipal n cul i o pa o (S, au eos/S . agalac iae); c) p esencij d ambos
ipos de pa ógenos p incipales; d) p esencia de una in ección mix a. En odas las
ca {*o as se pa e dei análisis de al meno^ dos mues as de leche consecu i as dd
anque donde se iiubiesen iden i KJido cla amen e aisún pa ó jeno p esen e
ocasionalmen e en una IMl bo ina po e e encia.
EL RECUENTO DE SCC se ealizó a ai d dd anque (BISCO pa a enias las
mues as omadas de ambos Pablos y se compa ó con los egis os de BTSCC d o o
csublo (FM) que si ió como con ol posi i o, y los egis os de un labo a o io de e e encia
ob enidos en ei mismo pe íodo Les BTSCC ue on de*e minados u ilizando u Couhe
Coun e (Couhe L d. Ingla e a), es ableciendo como alo umb al hmi e de ausencia de IMI
los 500.0(Xy cdulas po mi Se ob u ie on as medias geomé ica y a i mé ica y se eahzo la
ans o mación loga í mica en ba.se 10 y se alo ó con un es ANOVA.
EL ELISA. Se u ilizó la écnica exphci am ai e pa a de ección de an ígenos de S.
agaUc iac eo leche de inque de mezcla de un esublo El mé odo ELISA iie esenciabnen e
smila al desa ollado po Rjinan^ e al (1991) y Zo ah e «I (1993) adap ado al p esen e
es udio.
44
Se aisla on cepas naú as de S. a (iilA€ i«c en nmicsi as de leche del es ablo
colabo ado es ablecido como con ol poskí o. y se compa a on espec o a las cepas de
e e encia ob enidas de ía NC FB (Na ional Collec ion o Food Bac e ia, íngia ena) (NCTC
1348 1521 y !523) y de ia C CT (Colección Fspano a de CuhKos Tipo. Valencia^ (NCR
8181, ATCC !3813, MRD ’%1) aislados de casos de mami is bos^a. y se ca zae iza on
h oquímicameme con un API 20 S IRi P (pa a conñ macion)
Pa a aisla el aii igeno p incipaí esponsable de la pa ogenicidad de S. ij^aiac ije en
casos de IMIS, se u iliza on los co ioc*mienios p e ios sob e el papel inmunogénico de una
p o eína localizada en la pa ed celula de la bac e ia, denominada p o eína X. p esen e
ecuen emen e en Us cepas Je S a^aUc a causan es de mami is bo ina > ú il en el ip^do de
es35 ?pas. Se u ilizó como an igc*no pa a ob ene un an isue o en aca scn>]bilizado a dicha
p o eína Dicho ‘^^e o si ió como sue o de e e encia pa a la li ubción del EIJSA sandwich
(median e un FLISA indi ec o)
Pa a ob ene d an iseno ue ne esa io pun ica la p o eína. p oceso que se hi/o como
sigue P e ia lisis enzin'iá ic« de la bac e ia con hso/ima (según el p o ocolo de Penla a y
Saba. I‘)82) y ceni i igacion (a 3000 g du ame 20 minu os) se elimina on los pelle s ob enidos
po p ecipi ación con sul a o amónico y se decan o el sob enadan e, concen ándolo como
solución p o dc.1 mix a po diihsis en e s PBS (BBF) y pos e io men e uh acen i iigando {»
40.(XK) g du an e 10 minu os en una uk acen iíliga BecWman) Se cuan i ico el Loncen ado
p o eico poT el mé odo de Lowiy modi icado po Pe e s*>n. u ih/ando BSA (Sigma. MOí
como es ánda p o eico con un ki ¿e Sigma Fl com pl^ se pu i icó a su ez en dos c ipas
p ime a, en c oma ogsa ia de exclusión en gd Sephac y^ S-300 ^Flia macia LKB. Suecia),
segunda, una c oma og a ía de a inidad (es udios p e ios (l^u ou e ai. I9<)i) demos a on
45
46
po SDS-page e immmobicc iag b es uc u a de la p o esia X. coq una banda p incipal con
peM) n okcuia de 200 KDa ONmie oa un an icue po mmocloaal d mablUBS. especi ico
de las cepa)^ de S. a aliK ije que po aban la p o ema X. a pa i de la inmunización con ese
iQ i icuo cíi 2cas y el p ocesamien o del an isue o co e^>oodieb e n nues o es udio, se
u ilizó es e an icue po, en ; ai ex *^ac o c udo de la p o eina X pa ciahnen e n6cada po
c oma og aíia de e chisión en gel pasado a a és de ina coiunnj de aíniidad. acopUlo a la
ma i' p o ema A-Scpho oiie-í i (Pbamiacia) La cohimna ue la^ .^da con a npón 1 5 M
ghcina-C l Na. con pH 8 la í acción íw’^ida ehiida con ampón de acido cí ico 0.1 M (pH
3) Se le>e on Us abso encia^ de la> Ñiiccioncs oh i^idaN a una den-ódad óp ica de 280 om.
en cube a de cua zo en un eí^yecn o oióme o Beckman Se caícu ó la concen ación de la
p o ema X así pu i icada a pa i de !0i abM> *ncia. me*^ijn e la ío mula A:»- c 1)
^endo I el paso op im o de ia cube a del espec o aHoine o e igual a l cm (l,e> de Bcc -
Lainbe ). 1 2» el coe icien e de ex inción mola de la p o em a a 2S0 nm de D O (densidad
óp ica) y b concen ación de b p > eo a X
a ca ac e ización del an ígeno se cahzó po una SDS'PAG , al como ue desc i a
po Laemli ( IVTQ) en un gd de p4>h^ üaniida dd 6% y unción de las p o eínas ^ada> coa
azul Coomassic (>-250 Los pesos mi*lecula e'^ ue on es imados usando una cu^ a de
cal^ ación cons uida con bs siguien es ma cado es es ánda es p o eicos (ci ocTomo c.
anhid asa ca bónica. BSA, íoslónlasa B. Igli y n H>sina (p esen en en un k.il come cial de
Sisma)) Se comple ó d p o ocolo con un mmunoblo ing ealizado según b écnica de
Toubin e al (I<í84) y b adap ación de Lau ou e al (1^1). Se c i ica on los blo s
( ans e encias) y se bc hzi on k» ma cado es de pe^ molecub . Se e eló el au igeno
u dizindo una écnica de acopbnnen o con an icue pos p ima io Og<» bo ina) y secunda io

- -
(^isue o de a cn an i-bo iic) cos^igado coo pc oxida» (Sijma, MO), mcubasdo en
ampoD bS-T, con un 4% de PEG 6000. poslíno cs la ados w TBS y ne ebicióii con uc
umpon subs a o que u ilizó como c oioogcoo la diannnobciiTidina
Fl ELISA ussdo pa a de ección d ias cepa^ po ado as de p o cúia X x ba:>ó en b
écnica doble sandwich desc i a po VoRc e al ( W80) y modi icada:
Se lapiza on las placas m c o i e de ^ pocilios con ondo ec U (Nunc. Dñuma ca).
p exi-micn e sensi izadas con agJu inina de gen ien de igo (WGA) (Siema. MO). po su
g an ;<iTnidad pe los an igcüos ipo de S . agalac ias, con céUilas en e as de S l agaiac iae
ínac KadaN po expos^ión a baiio Ma ía a bOX, y qu^ se suspend^on en PBS< modi icación
de I>u beccoMBBl K se di.^)ensa on en ohimenes de 100 nHc o^ os pocilio en bs pbca^ y
posce ionnenie se bcuba on a 4X du an e una noche. Ijis pbcas asi apizadas se la a on e
incuba on du an e 30 minu es a 3"^' í:on P3S con 0.5% de geb ina (Signia. MO) pa a
educi la adso ción ine^eci ica de p o eí is
Después de cada e apa de inc*ibación se b a on las placas 3 eces con P6S-T ( ampón
de b ado) Se añadien^n 100 ^' oik os pocilio de sue o bo ino a es a p e iamenie dihikio
! 10 en ampón di dihidón concen ado 2X ^concen ación inaJ dd ampón 2X: 200
mic oh os de PBS I0 a pH 7.4.4C mi de lime osai al 0.5®o: 10 g . de 3SA: 2 Jil de Tween
20; iOO i ^ de (^o enol: 2 M de CINa. dihiidos en "^bG mi de agua des ib<lá. y odo ajus ado
a ph 8) ’ el an isue o de concjo z Ig bo ina seoáibiÜzado. Pa a ob ene b seña! especi ica, se
añadie on 5u nác ob oi^/pociik} de una susípensica dd ampón de incubació’.i (?BS coii O. ,
de Tween 20, a pH 7.4) con cnioido c i düuc ón 1/250 en pUci dd conjugado (compues o
po m an icue po mooocloiial an i lg bo ina en a ón coi^jgado con osík asa aloüma
(.Sigma^ MO), s^ún p o ocolo p eesUbS cido) Las plicas se incuba on du an e 2 ho as a
47
empc i u mbúni e y se la oo 4 eces coo umpón de la ado 0.1 X ( odos los
co aponen es del ampón 2X dihikios 1/20 en agua de Silada (890 mi) y con ime osal al 0.5%
(20 mi)) y agua des ilada, snadiéndúles 100 mic oli o&pocilk} de a pón sub<^ a o iX (13 g .
de ácido cí ico. 28 g de ci a o sódico, 20 mi de ime osal al 0.5V i mi de pe óxido d .
hid ógeno, odo diluido en 1 1. de agua des ilada y ajus ado a pH^4.8) que con enía diluido
como c omógeno p-ni o enil os a o (pNPT) (concen ación l mg.mJ) (Sigma. MO). Ls
CACción enzima ica colo eada desa ollada se pa o después ó': 30 minu os a i ambien e con
50 mic ob o^pocilio de sosa 3N. I^s esul ados se leye on en un espec o o óme os
T e ek Mol iskan a 3 longi udes de onda (450, 414 y í>20 nm). l a abso encia a í>20nm se
midió pa a co egi las posibles a iaciones en e pocilios en la lec u a de cada mic opbca.
Todas las mues as ue on p ocesadas po duplicado y de los alo es leídos se calculó la media
y la des iación ípica. 1^ abso bancia a 450 um si ió pa a calcula los alo es de abso bancia
a 414 nm mayo es o iguales a 2 po ap oximación, que son los que die on una señal más ue e
en b placa Los pocilios que ecibie on PBS solo en luga de sue o bo ino se u iliza on como
blancos. La media de las abso encias de las nnies as duplicadas se compa ó coo un alo
p ede e minado de cu o pa a de e mina si la mues a e a posi i a al in igeno usado o no.
Es e punco de cu oí se omó a una densidad óp ica cuya lec u a daba 0.227, que e a el ^lo
medio de ELISA niás 3 des iaciones es ánda pa a el n° de mues as anah/ado (con cuhi*«o
nega i o y/o SCC meno de 500.000 cél(ml). Asi, d 99% de las mues as no males (SCC
meno de 500.000) p odujo alo es de de&sídad óp ica meno es a 0.227, cuando se es a on
po ELISA pa a de ec a d an igeno ao eci ado
La sensibilidad, la esp<iíc icidad y d a io de p obabilidad se calculó pa a el cul ^o
48
nócTobioió^o y el SCC de l«s mues es que ue on es adas po ELISA.
4^)
Anilbis es adís ico. Tu o dos pa es. I) ob ención de da os de medias a i mé icas y
geomé icas. asi como des iación y e o es ánda de l«s SCC en los es ablos LP y LSC.
2)EÍ ANOVA. el análisis 'aclo ial y el análisis de componen es p incipales (PC ) pa a un
modelo de o ación ipo a imax, u ilizando el es de es e icidad de Ba le y el índice KMO,
de adecuación de ía mues a, al como se senaU en las ablas de esul ados en el apa ado de
ANEXOS, con los SCC ( ac o es SCC o ales y SCCpico) en ambos e^s ablos como a iable
cuan i a i a y la iden i icación de los g * menes p esen es en ias mues as de leche como
V a íable cualna K a.
El ANOVA se hi/o de acue do con el siguien e m >delo:
Y,Al = l ’ ^ H ' A. • B, ♦ C * (ABK, * (AC),k - (BC),i * c,,ki, siendo Y = log decimal de SCC,
IJ = media espe ada. H e ec o J: ebaño abs > bido. A.B y C = m luencia de las clases de
e apa de lac ación, (AB), (AC) y (BC) = in e acciones de 2 ac o es y e = é mino de e o
Pa a ealiza el análisis ac o ial, se u ie on en cuen a los siguien es pasos:
1) Se calculó la ma iz de co elaciones en e odas las a iables. a pa i de la ma iz de da os
o iginaos Se examino esa ma iz y se calcula on el es de Bai ie y el índice KMO.
2) Ex acción de los ac o es necesa ios pa a ep esen a los da os.
3) Se ealizó la o ación de ac o es con el mé odo a ii <ax pa a acili a su in e p e ación.
4) Se calcula on las pun uaciones ac o iales pa a cada mues a y que se u ili/.a on en análisis
pos e io es
50
R :S LIADOS
Los esuhados ob enidos con el anihsis mic obiológico y el SCC de Us mues as de los
es ablos LSC y LP a lo la go del pe íodo de mues eo se chan en la Tabla I. Se han aislado
nume osos casos de cocos G am posi i os an o en las mues as de leche de anque de ambos
es ablos como en la leche de las acas, suponiendo un o al de 121 aislados en e los dos
es ablos sob e un mon an e de 67 mues as de leche de anque (27 en el LSC y 40 en el LP), lo
que signi ca una ue e p e alenda de es os ge menes y -.|ue en casi odas las mues as de leche
se de ec a on aislados de dKe sas especies. lo que diücuhó la búsqueda dd agen e causal
p ima io en aquellos casos donde se de ec a on SCC an dexados que se co espondían con
pe íodos de IMIs. os aislados se desglosa on eu cepas de es a ilococos, es ep ococos,
coli onnes. co ínebac e ías y una miscelánea de badlos G am posi Kos y nega Kos
En los es a ilxKOcos p edomina on los coagulaba nega i os (S. epide midis y S.
xy osus (en o al 33 aislados) seguida en p opo ción po coagulasa posi Kos (siemp e se
de edó S. au cus) (24 casos) con escasa a íabilidad eno pica en su ca ac e ización
También se aisla 3n I caso de ^ len us.
Hubo algunos aiiJados de los gene es Mic ococcus y S ep ococcus que no se llega on
a iden i ica a ni el de especie.
I.os es ep ococos iie on aislados en la mayo :? de las mues as, bien en o ma de
en e ococos (En c ococcus aecalis/E. aecium) (en o a] se de ec a on 9 ai.slados en el
es ablo LP (40 naies as de leche) y 5 aislados en el es ablo LSC (sob e 27 mues as de leche).
Los es e i ococo l coa igioso (S. dyigiliic Me) apa ede oa ca 2 casos, uno en cada
es ablo, que p o oca os sendas IMIs en ei mes de junio-julio, con un BTSCC co elamo de
1.32 . I0*"cél/Dil pa a d caso dd en ablo LP y más de 3 i allones pa el del es ablo LSC.
Lok e Kococo» anbieauücs (ce e ococos* S. bo is y S. acédomiBinas) Los
en e ococos pe enecie on a 2 especies; Ca c ococms aeciam y ÍL aecaib De U aecium
se egis a oo !4 aislados, odos ellos p esen es es las mues as de los es ablos LP y LSC
jun o con o os gé menes Sob m 8 casos se p odujo una ¡MI en ambos esubios. en b que
es uxiesen impbcadas es as especies, localizadas en los mes^ de junio, julio, no iemb e y
didemb e en d en ablo LP y jubo en ei LSC En ningún caso ue d agen e c iológico p incipal
y es u o asociado a pa ógeno> mann icos p ^nc^ales como S. au e is y/o E. coli. Los BTSCC
egis ados p esen a on una media de 1.6 . 10^ célml De II. iecai s se egis a on 5 aislados,
p esen es en ambos e^ablo jumo con o os ge menes y en ningún caso ampoco ñie ei
ágeme e iologico de las IMis p oducidas (solo en 2 casos se pudo habla de sin oma oloeía
clkiica manu ica. el es o íúc on mami is subcimicas) Ls os aislados apa ecie on en los meses
de junio y en odo d in iemo l.o<; BTSCC egis ados p esen a o^i una media de i 2 .10'’
cdml
57
S. bo is se locah á en 3 casos (2 en el es ablo LP y 1 en d LSC) asociados a o os
gemcnes (es ep ococosw esia iloco »» coagulasa cu a i os y E, coii) y en ningún caso ue el
agec e e iologico de una IMl (solo hubo una ¡ju d aes de oc ub e y localizada en d es ablo
LSC). El BTSCC medio ue <>28 000 cd^nd
L. lac ii se conside ó como es ep ococo ac ieún e de b io a de los pezones de ia

4?-«..JjBP
58
ub e y ea ooiskmes comaioioó as iniesi as de eche Su p esencia ue abundan e y se iden icó
eo 20 aislados De odos eOos. solo 13 coo ^ye oo a la apa ición de una IM! en ambos
es ablos (p indpalnien e el LP) y se locaüza on en os meses de ab il, junio, juHo. no iemb e y
dkSem ne en ei es ablo IJ* y en junio, jubo, sep iemb e y oc ub e en el LSC El BTSCC medio
egis ado ca acas con IMis iie de 1.74. lO^celml.
Como da e es adís icamen e no signi íca Ko se egis ó un aisiado de S. p>oj(eB&*.
asociado con .bo is y apa ecido m ei Ties de junk> en ei es ablo l.S i. El BTSCC egis ado
L j2 4.IO 'élml
Ei análisb Lac c ioiójsc o e ec uado e i mues as de leche omadas de les
cua e ones de las acas de ambos es ablos, al inicio dei pe íodo de mues en, a ojó os
s^Kuieii es esal ados:
Los aisiadí>s pe encdan a las especies (es ablo LSC) S. au eus, S. epide midis.
C'o nebac e ium bo is, Ba yius subiUis, E i e ococcus aecium/E. aecal s, 1^ lac is,
Lac obaciU^ spp. Ea e oba !e cloacae > Candida albicans. Los po cen ajes de incidencia
ñie on como sigue (sob e d global de acas y po especies bscie iana de meno a mayoi
incidencia): S. a ciis (el 12.5% l aislado), Bac us sub d s (el i2^*^9). iJic obaciSus spp
(H 12 5*0), E. doacae (el l2.5®o): C‘. albicans (ei 12.5%); i bo is (el 25®o); E. aecalis/E.
a cium (el 25%). S. epi :^cnBÍdis y 1. lac is (el 87 5^*0).
(Eaablo LP) S. aii e i ^ E. coli, S. epidemiidis, M. Su eus, L. lac is, l^c obaciU s spp, S.
xylosBs, Ea oocoecus aecalis, Co ynebac e ium bo is, Sc a ia lique aciens.
Ea c obac e sakazakii y P o eus mc abüís Lx)s po cen ajes de mcidencia se alo a on de
igual modo que en el o o es ablo: S. xyWsus (el 8.25%' I aislado): En e ococcus aecalis (ei
8 25%); Se s ia líquc aciens (el 8.25%); Co yacbac e ium bo is (el 8.25%);
5<)
Ea c obiüc c ««kaxiikH (el 8.25%) y P o cus wi jb b (d 8.25%K E. cdi (el 16%: 2
aislados); S. • « ‘eos (el Í6%); Ijic obacüiis spp (el 16%): L. lac ís y M. lu eus (el 25%: 3
aislados): S. epédennidis (el 75%: 9 aislados).
F.xaminindo el cuad o co espocdicn e a la hoja de cálculo 4.XLS, se obse a que el
n*’ de aca» en e mas con signos clmicos de mami is hie mayo en el es ablo LSC en é minos
absolu os y en p opo ción al umaño de la población de cada es ablo que en el LP y que esa
mami is ue p edominaii e du an e el e ano.
Las acas se econocie on en e ma.s mas po la obse ación chnica de la
sBi oma abgia y b de e minación de los ecuen os celub cs que po su asociación con la
p esencia de pa ógenos man nicos con agiosos (hubo p esencia p edominan e de pa ógenos
ambien ales en esos casos) (excep o en el caso de S.dys|»alac iae) (según se deduce del
análisis ac o ial y de componen es p incipales, con la o acSón a ímax que se ci a en
ANEXOSi
De ios da os de iden iñcación mic obiológica se deduce que. coincidiendo con b
bailado po o os in es igado es, los es añlococos coaguiasa ncga Kos son los p incipales
ge menes hallados en IMls subclínicas y cbnicas ' que la con aminación an^ien al con
ed ep ococos y coli o mes puede media iza las concesiones sob e la e ahiación sani an^ de
un ebano.
Cab2 ciia que en el es ablo con ol colabo ado (el l'M) se ob u o un BTSCC medio
du an e el pe iodo de mues eo po debajo de 400.000 c«l^ml, es deci , no hube IMl y que el
ecuen o de lo a ae obia o al inchjyendo los pác ó^ o os, osciló en e 30.000 u e po mi po
é mino medie* ca io ícnio y 90.000 u e en e ano.
El culPí o micTobioiógico de las mues as sin]^les consecu Kas de leche u o
una dc ada especi icidad y sensAnlidad, méoi ss que es os misinos pa áme os al ealiza ei
ELISA o al de e mm d B SCC ue ca nwcho meno es Los esul ados mejo aban
combinando los de a ias mues as con^ecu í as. en cuan o a iabilidad y sensibilidad Los
esul ados combmados de a ias mues as se usa on pa a clasi ica los es ablos co no con
ele ados o bajos SCC en un pe iodo dado de nmes eo ( l mes).
La especi icidad de la espues a de ec ada po EiJSA en cada es ablo es u o
es ingida a un se de di ^en es cepas de S. Kgalac iae que po aban p o e na X. 1^ ‘:^eñal ije
ue e, sendu la sensibilidad úl ima del ensa o capa/ de de ec a desde a 0.7 nanog amos de
an ígeno mi con el an ísue o diluido l 250 has a l/IO(K), a imdo en e abso bancias a 405 nm
con lec u as de 0.7 has a 0.15 de densidad óp ica El coe icien e de a iación ii aen^ayo de la
abso bacicia de los es ánda es a ió en e el 3 y el 10% y el ango in e cn^a o dependió de la
concen ación del an igeno. Pa a de ini el cu oiT en e mues as posi i a^ y negamos, se
ensaya on homogenados de a ias mues as de sue o de acas con y sin IMIs po el mismo
ELISA. Los alo es que indicaban concen aciones de menos de 10^ uí‘c mi de homogenado o
ex aao se conside a on nega i os De odas las cepas p ocesadas po ELISA y po cuhKo
mic obiológico al iempo, se ob u o un 74*o mínimo de esul ados consis en es con el ELISA
al compa a con eí suhado del cul i o espec e al ohm en o al de mues as No obs an e, ei
esul ado más sensible pa a el ELISA iie del 85^«. obse ándose que la sensibilidad disminuia
y aumen aba el backg ound cuan o meno e a la dihición del homogenado. y si se combinaban
los esuhados aumen aba la especi icidad del ensayo.
«)
61
DISCl’SION
La p incipal conchisioii que se ob u o dd análisis de los dalos ci ados en la Tabla 1 n
que Un o en un esüibio como en d o o k» esul idos dd ansiáis mic obioló ^ico
indkai on in ecciones m ii js donde no ib ía un p^ ó ^eno p incipal cb o,
co dacionándose con ecuen os cduia es bajos, » bien eiis ia un agen e e iológico
con agioso au eus« S. d sgalac iae, pe o d ecuen o i eia ñaaien e ba;o (no
indicaba una IMl con sin oma ología clínica), o bien eiis ian ecuen os mu> de ados
asociados a hallazgos mic ob ológicos de pa ógenos anibien a<es (no con agiosos).
Fs c enómeno se p esen ó a lo la go de odo el pe iodo de mues eo y ue
independien e del es adio de lac ación, la die a, la époc<i del ¿no. el es ado isiológico de las
acas y o os ac o es ambien ales F.n lo e e en e a las >acas. aunque d mues eo iie único y
al inicio del pe íodo, la incidencia de pa ógenos con agiosos iie baja y su p cxalencia nula
(solo a ec aba a una aca de un es ablo) l.as especies bac e ianas más p e alen es o maban
p? e de la Ho a de la pid de los pe/ones en cada aca
Lx>$ dijimos es s disgnos icos u ibzados ^ es e es udio se compa a on espec o z su
capacidad pa a p edeci el es a us de IMl de! ebaño a pa i de la leche del onque eo un
momen o dado, pa a cada ebaño es ablo. La capacidad p edic K a se ^ahio a pa i de los
alo es dd anáhás ac o ial.
Los indicado es es de IM!s se e.alua on como alo es sbsohi os como
62
índice/cocien e en e mues as de anque de cads cs abio y las mues as de bs acas de esos
es ablos El índice se usó pa a elsnmia la a iación causada po los ac o es no pa ológicos
que a ec a on a odas las acas po igual
Un pun o c í ico en la e aluación de los es s de selección u ili/ados ñ e como decidi
sob e d es a us saniu io e dade o dei ebano de ada es ablo, aducido n la calidad
higiénica de la leche del anque. Aunque el aislamien o de las dKe sas especies bac e ians en
leche no es sinon mo necesa iamen e de ¡MI y mami is, ue el c i cno aplicado en es e abajo
Hubo una p obable a iación en los ndicado es de mai o is den o de cada mues a de leche
clasi icada como mami ica (suhclmica o clínica) o no. ya que la ecues a puede se más
pe sis en e que con la p esencia eal de bac e ias el momenio de la oma de cada mues a
L¿ *'cspues a eal de hs aca< y po ende el anque a un lujo de en ada de bac e iaN pod ía
di en ambién debido, po ejemplo, a di e encias en la i ulencia den í» Je cada especie
bac e iana
Los esuhados de los anabsis es adís icos mos a on di e encias en la capacidad de los
dis in os indicado es pa a p edeci la p esencia de m pa ógeno con agioso. Es o pa ex
indica que el anahsis mic obiológico po sí solo es incapaz de diagnos ica una mami is,
po que el analisis ac o ial nos indico que les alo es umb al ob enidos espec o a lo^
pa ogenos secunda ios o ambien ales iden i icados e an nucho mayo e:: que los espec K os de
los llamados pa o>{enos p incipales, suscep ibles de causa po sí mi.smo mami is, con «ágnos
clínicos y ecuen os cehila es im:y ele ados I>as acas deben exai cna se y ene en cuen a los
ac o es asociados a una IMI (endu ecimien o de pe/ones, coagulación de la leche,
ume acción, ubo y calo en la glándula numa ía. ...) pa a con lemen a lo< esuhados del
BTSCC y dd anábsis mu obiologico ^a a emi i un diagnós ico cla o de mami is, según se

desp ende de es;e es udio. Los indicado es se pod ían combina de ^-ias o ma» dependiendo
de si ei p opósko e a mc emen a la sensibilidad o la especi icidad pa a p edeci la p esencia
de un pa ógeno mainí ico con agioso.
i.os c i eRos de in e p e ación de los esuhados del cuHKo a ían con la iden idad del
aislado. El! el caso de los gé menes opo unL^as ambien ales (como coli o mes) el signi icado
cul u al se de e mina sob e la base del n‘* de núcoo ganismos ecogido, la pu eza de b cepa, la
[MI p oducida (ea su caso) (de e minada po el BTSC'C) la ep oducibibdad po cuhKos
se iados La ide i i icación de 1 u e mi de es a ilococos coagula.sa pos Kos y S. dys);aljc ije
se conside ó no malmen e como e idencia p esun i a de la in ección Tales in e p e aciones se
elacíona oQ con la e en ual aplicación de los esul ados del cul Ko. Ln el sen ido más
smplis a. la sensibilidad mic obioíógica puede ap oxima se como el p oduc o del olumen del
inóciik} (en es e caso 0.5 mi) y la concen ación bac e iana en cada mues a Hs ac ible que la
sensibilidad pueda po encia se bien inc emen ando el olumen del inóciilo o inc enien ando la
concen ación de bac e íis iables ecogidas en placa de cada mues a.
i.a ecogida numé ica de u e. no obs an e, no puede se in e p e ada e^ ic amen e
como una medida de la sensibilidad del diagnós ico. Debido a que se le da la misma
impo ancia d aislamien o de pocas o iHicnas u e (el es udio ío u o un en oque c'uan i a Ko)
U iden i icación de las especies y las mues as in ec adas p esen ó un esul ado siniila en su
dis ibución a una cu a de Poi:»son con sob edi^spe sión. posi i idad en el c'uhi o iic
ep esen a K a de la manáis clínica y o subcímica, así como es adios a iables de la p og esión
na u al de las IMI
Los esuhados de es e es udio adica on que los es a ilococos coagulasa posi i os
63
podían isU se epe kUinec e de ebaños con bajos SCC. Las posibles exp ic&cioQes paia esa
baja espues a a una in ección cia a podiu^ inclui la du ación de la ói ección, su localización,
el e ec o de la dilución de la leche en el anque, el es a us inmunológico del ebaúo y las
p obables di e encias nie abóKcas y de pa ogenicidad en las cepa« aisladas de S. au eus.
F1 examen bacne iológico de las mues aN de leche pan: cada ebaño p opo cionó
lec u as de ecuen os de u e con un p omedio de 10’ es epiococos ambien ales y lO'
es a ilococos coagulasa nega K os y coli o mes. po mi de leche
l^s iníecciones p oducidas po los pa ógenos p ima ios no ue on comunes du an e el
pe iodo de mues eo, excep uando aquellas po S. au eus 1^ baja incidencia de la mamhis
cíclica a’ como se deducc de los cb i ámen e bajos SCC en la mayo ía de Us mues as
demos ó la e icacia de los p og amas de con ol le mainhis ealizados en esos es ablos pa a
p e eni la apa ición de pa ógenos con agioso> El análisis de las mues as de leche omadas
mmedia amen e después del econocimien o de una IMI clínica indicó que los p íncipales
p oduc o es de IMIs no e an los pa ógenos con agiosos sino mas bien los amlicn ^les. su
dis ibución no e a al aza en el pe íodo de mues eo.
El mayo núme o de acas con IMIs que p oduje on ele ados SCC en las mues as de
leche de ambos es ablos po pa ogenos ambien ales p esen a on una acusada que encia
es acional a la in ccciun ai los meses de e ano. Es e inc emen o de la in ección apa eció
e asado si e a p o ocado po es ep ococos ambien ales especio al oca.sionado po
cob omies (pudo de ec a se una in ección pe si<i en e po E. coli en el es ablo LP median e un
mues eo epe ido de U leche) (no obs an e, el mdice y la du ación de las m ecciones na u ales
po ese pa ógeno di i ie on a medida que e ohicionaba el es a us úncionel de las ub es de las
acas en ?jni^os ebaños, del e^dio de lac ación a! de secado (la suscep ibilidad a ios
64
podían aisla se q>c kiiinsii e de ebaños con bajos SCC. íjis poples expiicadones pa a e>a
baja espues a a una ín ección cla a pod ían inclui la du ación de la in ección, su locahzación.
el e ec o de la dilución de la leche en el anque, el es a us inmunológico dcl ebaño y las
p obables di e encias meiabóbcas y de pa ogenicidad en las cepas aisladas de S. au eus.
!l examen bac e iológico de las mues as de leche pa a cada ebaño p opo cionó
lec u as de ecuen o*: de u e con un p omedio de lo' es ep ococos ambien ales !0'
es a ilococos coagulosa nega K os y coh o mes, po mi de leche.
las iníecciones p oducidas po los pa ógenos p ima io no ue on comunes du an e d
pe íodo de mues eo. excep uando zqueilas po S. au eu» la baja incidencia de la mami is
cHnica ai como se deduce de los ?la i ámen e bajos SC'C en la ma om de bs mues a>
de os ó la e icacia de los p og amas de con ol de mamiiis ealizados en esos es ablos pa a
p e eni la apa ición de pa ógenos con agi<>sos F-l anáhsis de las mues as de leche omadas
inniedia amen e después del econiK*mieo o de una IMl clínica indicó que los p incipales
pioduc c es de IMIs no e an los pa ógenos con agiosos sino n'iás bien los smbien aie y su
dis ibución no e a al a/a en el pe íodo de mues eo
Fl mayoi núme o de acas con IMIs que p oduje on ele%ados SCC en la?; Tnues as de
leche de ambos es ablos po pa ógenos ambien ales p esen a on una acusada que encia
es acional a la in ección en los meses de e ano. Es e i lc cmen o de la in ección apa eció
e asado si e a p o ocado po es ei> ococos aiT^ien aics especno al ocasionado po
coh o mcs (pudo de ec a se una in ección pe sis en e po E, co í en el es al lo I.P medi¿nie un
mues eo q)e ido de la leche) «no obs an e, el índice y la du ación de las m ecciones na u ales
po ác pa ógeno diñnaon a medida que e ohicionaba el es a us uncional de las ub es de las
acas en ambos ebaños, del e.s adio de lac ación al de secado (la suscep ibilidad a los
64
En ei pnisc e es udio, d API STAPH iden i icó co ec ameme o d o s los S. a u c u s
aislados y oóos ios es a ilococos coagulasa Dcju H o s (S. e p id c m id is y S. x y io siu ) aun<]ue
hubo diñcuhadcs es algunos aishidos debido a su a iabilidad eno ípica ¿iqi esadii en los
p e & s oumc icos ob enidos, como ya se señalo en ei apa ado de HESUl.TADOS No hu bo
eac Kidad cni/ada e e los es a ilococos coaguiasa negamos q u e iníluyCNC en ^
iden i icación Como no se iden i ica on cepas á c S. w a n ic i y S. h o n iu is . no nc pu d o
con i ma la baja e icacia del sis ema en su ca ac e i/^ción. al como su cedió con el SI APll-
/YM
i sis ema API STAPII u ili/ado u o ma o iabiMad que ios sis cnu> STAPH-
TRAC y STAPH-lí>FNT. compa ando los esul ados de iden i icación olnenidos en es e
es udio y los a ados po Wias NR-ke son en a que los po cen ajo de iden i icacii>n
de esia ilociKOs ue on del lOí)** wompa and«>Íos con sus esul ados «ob enidos ciw el S FAPII-
TRAC'. Además no ue ^w necesa ios es s bioquiinicos T^leme iU ios
Los esul ados oNenidos po Wa s en con el R. PII) STRi P SYSÍIM
(equKaien c ai API 20 STR P) indicaban un po cen aje de iden i icacid«i co ec a de los
es ep ococos ambien ales dei en una p ime a íec u a (a las 4 ho as ) y del 83®o (a las 24
ho as) y sni llega ai nKd de especie Sin emí^a go. en es e es udio, odos ios aislados, excep o
es, ue on iden i icados a ni ei de especie como En ococcys acc um/E. aecalis, S.
bo isK... y la coo ínnacion )ioquimica se p odujo a las 24 ho as de incubación de la gale ía
API
!ln lo e e en e a ios bacilos (i am nega i os, los cob o mes iie on iden i bados con el
API 20E con un lOO^s de e icacia a las 24 ho as de incubación, ai igual que en ei es udio de
Todhun e c al (19*^) pe o a di e encia de és e, aqui !a dis ibución de coli o mes ue muy
6í>
aáso cio i m e sp e d k a po e ec o camullaje co o a s p o emas ^c icas esiduales q u e
ocupaban apa e k emen e cpkopos de la inmunogiobu ina bo ina combinada po a acción de b
WGA y po eJIo no pe mi ían la unión de lo^ an igenos de S. «s«kec iae con ella aplicación
de eslos ELISA empleando eac Kos es able^ p ^iamen e op imizados, ios bajos alo es de
backe ound ob enidos y la ue e y espcci ka combinacicSn en e el conjugado y ei complejo
en/ima-subs a o hicie on es e mé o lo ácilmen e ep oduciblc
n

74
CONCLlSIO^i S
I. H! úlisis mubKa ían e de ac o es sugie e que únicamen e el ecuen o de cchüas <«má icas
o ales (CELT) y cehilas somá icas pico (C l.P), jun o con b p esencia de S ep c coccu^
(h^gaiacnoi' en la leche, eüiu ie on asociados a la apa ición de en e medad po manmis en las
acas de kM¿ es ablos mues eados F.l es o de los pa ógenos con agiosos iden ! i ,ados en b>
RMies as no dei ni se u ilizado como indicado de indicio de IMIs. a di e encia de lo que se
indica en b li e a u a, y de ccue do con d anáhsis es adís ico ealizado en e ^ e es udio
2 Ei BTSCC cons á'jyo un imodo e kaz eo b moniiL iza ión de b salud dei ebaño espec o
a b mami i?, pe mi iendo una de ección p ecoz de IMIs
3 Cuando el snaksis de iiwio :- ^ eaii/a eniendo en cuen a odos los nHc:oo7ganismo>
aisbdos pa ogenos con agiosos y ambien ales, ca^la bc o sc sa uio únicamen e con
TBc oo ganismos coo asicsos o con mic oo ganismos ambien ales, en ningún caso se p odujo
mezcla !-sio sugie e que bs duc uaciones de los nnc oo ganiómos con agiosos e an
independien es de b<i de los n c oo ganismos ambien ales
75
AGRADECIMIENTOS
El au o de.<a exp esa su más s ace a g a i ud ai p o eso D . JAÍME FABRFCiAS
C AS.A1. í. D ElíGFNK) RFV FERNANDEZ. a( di eao del CIAM du an í d desa oüo dcl
p o ocolo de abajo íD CARI OS DANS GARaTT). po aah a d uso de la> ins alaciones
del Cen o pa a es a esU aa como a á e sos in es ig3do ¿s del CIAM po sus cooscjo . >
apmo lécoico
Asn esmc ag adece la 3 uda pa a la ob ención de la> mu s ias que co is i u e on b
ba?>e pa a «es udio po pa e de ic:> p opie a ios de los es ablos OHies eado^ > al di ec o
ge en e del I.IGAl po e! p ocesamien o desíD eTesado de las mues as que hxe on anaíi/adas
químicanienie.
í an^ién ag adece el apo>o inancie o del Minijíc io de Educación y Ciencia a axés
de la concesion de una beca de pe eccionamicn o de pe sonal in es iga^o en
BIBLI(K;iU iA
1 Adamsu Di»*; Hincock^D.: I'oi, L. and McDonald, JJ>. (1992^ F equenc o eisoia ion oí
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En o ococcu
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Figu a I. Ciné ica de la espues a
da an icue pos en el sueco de las
es acas (n2 560^601 y 603) inmu
nizadas con p o eína X pu i icada,
p oceden e de cepas de S ep ococcus
agalac iae po ado as de la p o e^
na. El sue o se es ó con un ELISA
El é mino SC se e ie e a que la
inoculación del an ígeno ue sabcu
ánea.
co
(U
7C 210 2ÍC 350
Días iHT.u .izacic!
9?’.4
66.2
Figu a 2. A .áli*?is po 5jS-?aGE dei ex
ac o m . p o eína X e la ceca cié la
que se ob u e.
Columna 1, p o eína X pu i icada co
c oma og a ía de a inidad.
Cclunna 2. ex ac o c udo po ando ia
p o eína X, an es de c oma og a ía.
Los núme os indican ei peso aclecula -
en KDa.
45

i-
F iiju a 3. A n á lis is po inouncbIo in<3
d« la p o eína.X .
Les nú*¿ o2 indican los pesos «olecu-
la es en KDa-
?G5-
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