Charakterisierung und Funktionalisierung von Filmen aus rekombinanten Spinnenseidenproteinen

CHARAKTERISIERUNG UND
FUNKTIONALISIERUNG VON FILMEN AUS
REKOMBINANTEN SPINNENSEIDENPROTEINEN
DISSERTATION
zu E langung des G ades
- Dok o de Na u wissenscha en -
de Fakul ä ü Biologie, Chemie und Geowissenscha en
de Uni e si ä Bay eu h
o geleg on
Diplom-Biologin
K is ina Spieß
Bay eu h 2012
Die o liegende A bei wu de on Ok obe 2005 bis Dezembe 2007 am Leh s uhl ü
Bio echnologie de TU München in de A bei sg uppe on D . Thomas Scheibel begonnen
und on Janua 2008 bis Ap il 2011 am Leh s uhl ü Bioma e ialien de Uni e si ä Bay eu h
un e de Lei ung on P o . D . Thomas Scheibel o ge üh .
Volls ändige Abd uck de on de Fakul ä ü Biologie, Chemie und Geowissenscha en de
Uni e si ä Bay eu h genehmig en Disse a ion zu E langung des akademischen G ades eines
Dok o s de Na u wissenscha en (D . e . Na .).
Disse a ion einge eich am: 10. Ap il 2012
Zulassung du ch die P ü ungskommission: 18. Ap il 2012
Tag des wissenscha lichen Kolloquiums: 15. Juni 2012
Am ie ende Dekan: P o . D . Bea e Lohne
P ü ungsausschuss:
P o . D . Thomas Scheibel (Gu ach e )
P o . D . F anz X. Schmid (Gu ach e )
P o . D . And eas Fe y (Vo si z)
P o . D . Jü gen Senke
.
Inhal s e zeichnis
i
Inhal s e zeichnis
1 Einlei ung ..................................................................................................... 1
1.1 P o ein-basie e Ma e ialien .......................................................................................... 1
1.1.1 Anwendungsbeispiele und Fo schungsak i i ä en ..................................................... 2
1.1.2 S uk u elle G undlagen mechanische Eigenscha en .............................................. 2
1.1.2.1 β-Schlei en: elas ische S uk u gezeig am Beispiel Elas in .............................................. 4
1.1.2.2 Coiled-coil S uk u : En halpie-elas isches Ve hal en gezeig an In e mediä ilamen en .. 5
1.1.2.3 β-Fal bla - eiche P o eine .................................................................................................. 6
1.2 Spinnenseide .................................................................................................................... 7
1.2.1 Au bau und S uk u on d agline Seide ................................................................... 8
1.2.2 Hie a chische Au bau als G undlage mechanische Eigenscha en ....................... 10
1.2.3 Fadenassemblie ung – de na ü liche Spinnp ozess ................................................ 11
1.3 Rekombinan e Spinnenseidenp o eine ........................................................................ 14
1.3.1 Assemblie ung des ekombinan en Spinnenseidenp o eins eADF4(C16) in
e schiedene Mo phologien ..................................................................................... 16
1.3.2 Seiden ilme .............................................................................................................. 17
1.4 Zielse zung ..................................................................................................................... 20
2 Ma e ial und Me hoden ............................................................................ 23
2.1 Ma e ial .......................................................................................................................... 23
2.1.1 Oligonukleo ide, Pep ide und Linke ....................................................................... 23
2.1.1.1 Oligonukleo ide ................................................................................................................ 23
2.1.1.2 Pep ide und Linke ............................................................................................................ 23
2.1.2 Plasmide ................................................................................................................... 23
2.1.3 O ganismen .............................................................................................................. 24
2.1.3.1 Bak e ien ........................................................................................................................... 24
2.1.3.2 euka yo ische Zelllinie...................................................................................................... 24
2.1.4 Enzyme und An ikö pe ........................................................................................... 24
2.1.5 G ößens anda ds und Ki s ........................................................................................ 24
2.1.6 Chemikalien und Biochemikalien ............................................................................ 25
2.1.7 Sons ige Ma e ialien/Ve b auchsma e ialien ........................................................... 26
2.1.8 Ge ä e und echnische Hil smi el ............................................................................ 26
2.1.9 Compu e p og amme ............................................................................................... 28
2.2 Molekula biologische Me hoden.................................................................................. 28
2.2.1 Anzuch on Esche icia coli .................................................................................... 28

Inhal s e zeichnis
ii
2.2.2 P äpa a ion, Reinigung und Sequenzie ung on Plasmid-DNA ............................. 28
2.2.3 T ans o ma ion chemisch kompe en e E. coli ........................................................ 29
2.2.4 Aga ose-Gelelek opho ese ..................................................................................... 29
2.2.5 Hyb idisie ung syn he ische Oligonukleo ide ........................................................ 30
2.2.6 Ampli ika ion on DNA mi els PCR ..................................................................... 30
2.2.7 Enzyma ische Modi ika ion on DNA .................................................................... 31
2.2.7.1 Spal ung mi els Res ik ionsendonukleasen..................................................................... 31
2.2.7.2 Dephospho ylie ung de 5`-Enden de Vek o en .............................................................. 31
2.2.7.3 Liga ion ............................................................................................................................. 31
2.2.7.4 Klonie ung ekombinan e Spinnenseidenp o eine ........................................................... 32
2.2.8 Exp ession syn he ische Spinnenseidengene in E. coli und Reinigung ekombi-
nan e Spinnenseidenp o eine .................................................................................. 33
2.2.8.1 Exp essionskine ik und Löslichkei sbes immung ............................................................. 33
2.2.8.2 Fed ba ch-Fe men a ion .................................................................................................... 33
2.2.8.3 Reinigung ekombinan e Spinnenseidenp o eine ............................................................ 34
2.3 P o einanaly ische Me hoden ...................................................................................... 35
2.3.1 Polyac ylamid-Gelelek opho ese (PAGE) ............................................................. 35
2.3.1.1 SDS-PAGE ....................................................................................................................... 35
2.3.1.2 Na i -PAGE ...................................................................................................................... 35
2.3.1.3 Silbe ä bung ..................................................................................................................... 36
2.3.1.4 Fluo eszenz-Imaging ......................................................................................................... 36
2.3.2 Immunoblo (Wes e n Blo ) .................................................................................... 36
2.3.3 G ößenausschlussch oma og aphie (SEC) .............................................................. 37
2.3.4 Lich s euung ........................................................................................................... 37
2.3.4.1 S a ische Lich s euung ..................................................................................................... 38
2.3.4.2 Dynamische Lich s euung ............................................................................................... 39
2.3.5 Hochleis ungs lüssigkei sch oma og aphie (HPLC) ............................................... 39
2.3.6 MALDI-TOF Massenspek ome ie ........................................................................ 40
2.4 P o einp äpa a i e Me hoden ..................................................................................... 40
2.4.1 Dialyse ..................................................................................................................... 40
2.4.2 Reduk ion und Ca boxyme hylie ung ..................................................................... 40
2.4.3 Bes immung eie Thiolg uppen mi Ellmans Reagens (DTNB) ........................... 41
2.4.4 Redox i a ion .......................................................................................................... 41
2.4.5 Filmp äpa a ion ....................................................................................................... 42
2.4.6 Kopplung an Thiole de Cys-Va ian en on eADF4(C16) ..................................... 43
2.4.6.1 Kopplung in Lösung ......................................................................................................... 44
Inhal s e zeichnis
iii
2.4.6.2 Kopplung an assemblie e Filme ...................................................................................... 45
2.5 Spek oskopische Me hoden ........................................................................................ 46
2.5.1 UV-Vis Abso p ionsspek oskopie .......................................................................... 46
2.5.2 Fluo eszenzspek oskopie ........................................................................................ 47
2.5.3 Zi kula dich oismus (CD)-Spek oskopie ............................................................... 48
2.5.4 Fou ie ans o mie e In a o - (FTIR-) Spek oskopie ........................................... 48
2.5.4.1 Fou ie -Selbs dekon olu ion (FSD) ................................................................................. 49
2.5.4.2 Pola isie e FTIR-Spek oskopie ...................................................................................... 50
2.5.4.3 Auswe ung ....................................................................................................................... 51
2.5.4.4 Tempe a u abhängige FTIR-Messungen .......................................................................... 52
2.6 Mik oskopische Me hoden ........................................................................................... 53
2.6.1 Lich mik oskopie ..................................................................................................... 53
2.6.2 Ras e k a mik oskopie (AFM) ............................................................................... 53
2.6.3 T ansmissionselek onenmik oskopie (TEM) ......................................................... 54
2.6.4 Ras e elek onenmik oskopie (REM) ...................................................................... 54
2.7 Ma e ialanaly ische Me hoden .................................................................................... 55
2.7.1 The mog a ime ische Analyse (TGA) ................................................................... 55
2.7.2 Dynamische Di e enzkalo ime ie (DSC) .............................................................. 56
2.7.3 Zugmessung ............................................................................................................. 56
2.7.4 Dynamisch mechanische Analyse (DMA) ............................................................... 58
2.7.5 Kon ak winkelanalyse .............................................................................................. 59
2.8 Zellkul u echniken ...................................................................................................... 60
2.8.1 Au auen, Kul i ie ung und Ein ie en on Zellen .................................................. 60
2.8.2 Vi ali ä s-Tes WST (wa e soluble e azonium)-1 ................................................ 61
2.8.2.1 Filmp äpa a ion ................................................................................................................ 61
2.8.2.2 Adhäsions es .................................................................................................................... 62
2.8.2.3 P oli e a ions es ............................................................................................................... 62
3 E gebnisse .................................................................................................. 63
3.1 Cha ak e isie ung on eADF4(C16) Filmen .............................................................. 63
3.1.1 Analyse de Sekundä s uk u .................................................................................. 64
3.1.1.1 Ein luss e schiedene Lösungsmi el .............................................................................. 64
3.1.1.2 Ein luss e schiedene Nachbehandlungsme hoden ......................................................... 68
3.1.1.3 Ein luss de ela i en Lu euch igkei ............................................................................. 71
3.1.2 The mische S abili ä ............................................................................................... 74
3.1.2.1 The mog a ime ische Analyse ........................................................................................ 74
Inhal s e zeichnis
i
3.1.2.2 Analyse mi els dynamische Di e enzkalo ime ie ........................................................ 76
3.1.2.3 Ein luss de Tempe a u au die Sekundä s uk u ........................................................... 78
3.1.3 Mechanische Cha ak e isie ung .............................................................................. 80
3.1.3.1 Zugbelas ung ..................................................................................................................... 80
3.1.3.2 Dynamisch mechanisches Ve hal en................................................................................. 82
3.1.3.3 O ien ie ung de Moleküle un e Zugbelas ung ................................................................ 84
3.1.4 Cha ak e isie ung de Filmobe läche ..................................................................... 88
3.1.4.1 Topog aphie ...................................................................................................................... 88
3.1.4.2 Bene zba kei /Hyd ophobizi ä ......................................................................................... 92
3.2 Modi izie ung und Funk ionalisie ung on eADF4(C16) ......................................... 93
3.2.1 He s ellung und Cha ak e isie ung on Cys ein-Va ian en on eADF4(C16) ....... 93
3.2.1.1 Design, Exp ession und Reinigung ................................................................................... 93
3.2.1.2 Analyse de Sekundä s uk u ........................................................................................... 96
3.2.1.3 Cha ak e isie ung des Dime isie ungs e hal ens .............................................................. 96
3.2.2 Kopplung in Lösung ................................................................................................ 99
3.2.2.1 Kopplung on Fluo escein-Maleimid ............................................................................... 99
3.2.2.2 Modi ika ion mi zyklischem RGD-Pep id c(RGD K) ................................................... 100
3.2.3 Modi ika ion und Funk ionalisie ung on Filmen aus Cys ein-Va ian en on
eADF4(C16) .......................................................................................................... 102
3.2.3.1 S uk u elle Cha ak e isie ung de Filme ........................................................................ 102
3.2.3.2 Filmmodi ika ion ............................................................................................................ 103
3.3 Un e suchung po en ielle Anwendungen on (modi izie en) eADF4(C16)-
Filmen .......................................................................................................................... 107
3.3.1 Analyse de Biokompa ibili ä in Zellkul u -Un e suchungen .............................. 107
3.3.1.1 Gene elle Pa ame e de Filmp äpa a ion und Zellkul i ie ung ..................................... 108
3.3.1.2 Ein luss des Lösungsmi els ............................................................................................ 108
3.3.1.3 Ein luss de Nachbehandlung ......................................................................................... 110
3.3.1.4 Modi ika ion mi c(RGD K)-Maleimid .......................................................................... 113
3.3.2 eADF4(C16) Filme als Obe lächenbeschich ung – Ein luss des Subs a s au
die Obe lächeneigenscha en ............................................................................... 115
3.3.2.1 Hyd ophobizi ä .............................................................................................................. 115
3.3.2.2 Topog aphie .................................................................................................................... 116
3.3.2.3 Sekundä s uk u ............................................................................................................. 117
4 Diskussion ................................................................................................. 119
4.1 Ein luss e schiedene Pa ame e au die eADF4(C16) Sekundä s uk u in
Filmen .......................................................................................................................... 120
4.1.1 Ein luss des Lösungsmi els .................................................................................. 120
Inhal s e zeichnis
4.1.2 Ein luss chemische und physikalische Nachbehandlungsme hoden ................... 121
4.2 Beein lussung mak oskopische Eigenscha en ....................................................... 124
4.2.1 Chemische und he mische Bes ändigkei ............................................................. 124
4.2.2 Topog aphie ........................................................................................................... 124
4.2.3 Mechanische Eigenscha en und Rückschlüsse au molekula e Ano dnung ......... 125
4.3 Modi izie ung und Funk ionalisie ung on Spinnenseiden ilmen ......................... 129
4.4 Eins ellen de inie e Obe lächeneigenscha en ..................................................... 133
4.5 Biokompa ibili ä on eADF4(C16) Filmen – in i o Zellkul u expe imen e ...... 136
4.6 Eigenscha en und Po en ial de un e such en Spinnenseiden ilme im Ve gleich
zu B. mo i Seiden ib oin-Filmen bzw. ande en Ma e ialien ................................... 140
5 Zusammen assung ................................................................................... 145
6 Summa y .................................................................................................. 149
7 Li e a u ................................................................................................... 151
8 Abkü zungen ........................................................................................... 169
9 Publika ionen ........................................................................................... 171
10 Anhang ..................................................................................................... 173
10.1 Spannung bei sch i weise Dehnung on eADF4(C16)-Filmen ............................. 173
10.2 REM Au nahmen de Filmobe läche ...................................................................... 174
10.3 Massenspek en ........................................................................................................... 176
10.4 Vek o ka en ............................................................................................................... 178
10.5 P o einsequenzen ........................................................................................................ 180
10.6 Hyd opa hizi ä sblo ................................................................................................... 181
Einlei ung
6
MD Simula ionen des mechanischen Ve hal ens on Vimen in un e Zugbelas ung zeigen in
Übe eins immung mi expe imen ellen Da en d ei Abschni e (K eplak e al., 2008; Qin e al.,
2009a; Qin e al., 2009b). Ex e n angeleg e Zugk a üh zunächs zu Aus ich ung und
Dehnung de coiled-coil Segmen e, wobei ein linea e K a ans ieg beobach e wi d. Die
supe helikale Qua ä s uk u e möglich dabei eine Dehnung um as das doppel e als bei
eine einzelnen α-Helix (Qin e al., 2009a). Anschließend e olg du ch Au b echen on
in ahelikalen Wasse s o b ücken (meis in Clus e n on 3-4) eine sch i weise En al ung de
α-helikalen Segmen e, wodu ch Ene gie dissipie wi d (Ackba ow e al., 2007). Die
S eckung de Helixwindungen is hie bei die G undlage ü die beobach e e Dehnba kei au
übe 100 %. Im Fall on Vimen in und Ke a in konn e gezeig we den, dass die mechanisch
induzie e En al ung supe helikale Be eiche zu anschließenden Ausbildung on
in e molekula en β-Fal blä e n üh , was einen en scheidenden Gewinn an Fes igkei im
Ve gleich zu isolie en α-Helices da s ell (Qin e al., 2009a; Fudge e al., 2003; K eplak e
al., 2004). Bei wei e e Dehnung schließlich glei en die zu Te ame en angeo dne en Dime e
aneinande be o das Ma e ial e sag (Qin e al., 2009a).
1.1.2.3 β-Fal bla - eiche P o eine
Fase n aus S uk u p o einen mi hohem β-Fal bla -An eil zeichnen sich du ch auße -
gewöhnlich hohe Zug es igkei und einen hohen E-Modul sowie S abili ä gegenübe
Umwel ak o en aus, besi zen da ü abe nu beg enz e Dehnba kei (Smi h e al., 2006;
Smi h, 2010; Ke en & Buehle , 2008a). Beispiele hie ü sind Amyloid(-ähnliche)
P o ein ase n, im Muskel o kommende Ti in ase n ode Seiden äden. Beme kenswe is
dabei, dass die Fes igkei diese Fase n die on S ahl e eichen kann (Smi h e al., 2006),
obwohl die Molekülin e ak ion au Wasse s o b ücken be uh , eine mi e wa 8-20 kJ/mol
(Sheu e al., 2003; Xu & Buehle , 2010) pe se schwachen, nich -ko alen en Bindung. Einen
wich igen Bei ag lie e alle dings die Aniso opie des Ma e ials (B ockwell e al., 2003):
Die zu En al ung eines an ipa allelen Fal bla s aus zehn Alanin es en benö ig e K a
a iie um eine Zehne po enz zwischen longi udinale und o hogonale Belas ung (Rohs e
al., 1999).
Die auße gewöhnlichs e Kombina ion on mechanischen Eigenscha en weisen Seiden ase n,
und insbesonde e de on einigen Spinnen p oduzie e Abseil aden (d agline Seide), au
(Tabelle 1.2). Die Fäden sind eine sei s seh zug es , dabei jedoch noch bis zu e wa 30 %
dehnba , wodu ch eine Zähigkei e eich wi d, welche die on echnischen Hochleis ungs-
ase n wie Ke la soga übe i (Gosline e al., 1999).

Einlei ung
7
Tabelle 1.2: Ve gleich mechanische Eigenscha en ausgewähl e Ma e ialien (nach Gosline e al., 1999). LF:
ela i e Lu euch igkei
Ma e ial
Dich e
Zug es igkei
E-Modul
(S ei igkei )
Dehnba kei
Zähigkei
g/cm3
GPa
GPa
%
MJ/m3
Abseil aden
(A. diadema us)
1,3
1,1
10
27
160
Kokon-Seide
(B. mo i)
1,3
0,6
7
18
70
Elas in
1,3
0,002
0,001
150
1,6
Wolle (bei 100 % LF)
1,3
0,2
0,5
50
60
Kollagen
1,3
0,15
1,5
12
7,5
Ke la 49
1,4
3,6
130
2,7
50
Hoch es e S ahl
7,8
1,5
200
0,8
6
Ca bon ase
1,8
4
300
1,3
25
Im Ve gleich zu ande en β-Fal bla - eichen P o ein ase n weisen Seiden einige Besonde -
hei en au . Zum einen sind die β-Fal bla -Be eiche hie in eine lexible e „amo phe“ Ma ix
eingebe e (s. Kapi el 1.2.1, Abb. 1.3), zum ande en un e lieg ih e Assemblie ung einem
komplexen Spinn o gang.
1.2 Spinnenseide
Als Seiden we den gene ell P o eine mi hoch epe i i e Aminosäu esequenz ( eich an
Glycin, Alanin und Se in) bezeichne , welche in lüssige Fo m gespeiche we den und du ch
Ex udie en ode Ve spinnen, d. h. un e Au wenden on Sche k ä en, zu Fase n
assemblie en (C aig, 1997). Seidenp o eine we den on e schiedenen Klassen de
A h opoda (Gliede üße ) p oduzie (C aig, 1997). Am um assends en cha ak e isie
wu den bishe zwei Seidena en: 1. Die Seide des Maulbee spinne s B. mo i, welche aus eine
schwe en (Mw ~390 kDa) und eine leich en Ke e (Mw ~26 kDa) des Seiden ib oins sowie
dem P o ein P25 (Mw 25 kDa) zusammengese z is (Vepa i, 2007; Inoue e al., 2000). De
da aus gebilde e Doppel aden is zudem on eine Hülle aus Se in- eichen P o einen, den
Se icinen, umgeben (Inoue e al., 2000; Shao & Voll a h, 2002; Takasu e al., 2002). 2. De
Abseil aden (d agline Seide) on Radne z-bildenden Spinnen. Neben seine Rolle als Abseil-
und Re ungs aden dien e zu Fe igung de Rahmenkons uk ion sowie de Speichen eines
Radne zes (Voll a h, 2000). En sp echend seine Funk ion weis e die g öß e mechanische
Belas ba kei (Zähigkei ) un e den bekann en Seiden ypen au .
Einlei ung
8
1.2.1 Au bau und S uk u on d agline Seide
Ein d agline-Seiden aden zeig einen hie a chischen Au bau (Abb. 1.3) (Heim e al., 2010).
Mak oskopisch läss sich eine Hülle und ein Ke nbe eich un e scheiden (F ische e al., 1998;
Li e al., 1994), wobei die Hülle aus eine Lipidschich , Glykop o einen sowie de in de
kleinen Ampullend üse (mino ampulla e) gebilde en Seide bes eh . Diese Hülle bie e Schu z
gegen Aus ocknung sowie gegen Be all mi Mik oo ganismen (Liu e al., 2005; Sponne e
al., 2007). Im Ke nbe eich inden sich – e gleichba zu ande en S uk u p o einen –
Fib illen, die en lang de Fase ich ung ausge ich e sind und aus mindes ens zwei P o einen
bes ehen (Augs en e al., 2000; an Beek e al., 2002). Typische weise we den Spinnen-
seidenp o eine als Spid oine (abgekü z du ch Sp) bezeichne , wobei sich de Name on de
D üse ablei e , in de sie gebilde we den. Die beiden P o eine de d agline Seide, welche in
de g oßen Ampullend üse (majo ampulla e gland) gebilde we den, we den dahe MaSp1
und MaSp2 genann . Beide P o einklassen un e scheiden sich in ih e Hyd ophobizi ä sowie
ih em P olin-Gehal . Gemäß de Ein eilung bezüglich des P olin-Gehal s s ellen die en -
sp echenden P o eine de Eu opäischen Ga enk euzspinne A aneus diadema us (hie ADF3
und ADF4 genann , en sp echend A. diadema us Fib oin) mi e wa 16 % P olin beide MaSp-2
ähnliche Ve e e da (Ga esy e al., 2001; Gue e e e al., 1996). Alle dings weisen sie
Un e schiede in ih e Hyd ophobizi ä au (Huemme ich e al., 2004b). Mögliche weise
s ellen wei e e P o eine, wie e wa das bislang de Kokonseide on A. diadema us zugeo dne e
ADF2, ein MaSp1-Homolog da (Hayashi e al., 1999).
Neben diesen Un e schieden weisen MaSp1 und MaSp2 cha ak e is ische Gemeinsamkei en
au . Ih Molekula gewich lieg bei e wa 250-350 kDa (Hinman & Lewis, 1992; Ayoub e al.,
2007), sie bes ehen zu übe 50 % aus den Aminosäu en Glycin und Alanin und sie zeigen den
Au bau eines Mul iblock-Copolyme s (Heim e al., 2009; Humenik e al., 2011; Hayashi e
al., 1999). Dabei wi d eine hoch epe i i e Ke n egion on ku zen, 100-140 Aminosäu en
um assenden, nich - epe i i en Te mini lankie , welche hochkonse ie sind (Rising e al.,
2006; Eisold e al., 2011; Challis e al., 2006; Mo iuk-Smi h e al., 2005). Die 3D-S uk u
diese Te mini wu de kü zlich au geklä (Hagn e al., 2010; Aska ieh e al., 2010; Hagn e
al., 2011). Bei beiden Te mini handel es sich um globulä e Domänen, bes ehend aus ün
α-Helices. Beide e minalen Domänen können dime isie en, wobei die ca boxy e minale
Domäne zusä zlich du ch Ausbildung eine in e molekula en Disul idb ücke s abilisie wi d
(Eisold e al., 2011; Huemme ich e al., 2004a).
Die epe i i e Ke ndomäne se z sich aus ku zen Modulen on e wa 20-40 Aminosäu en
zusammen, welche sich bis zu hunde Mal wiede holen können (Ayoub e al., 2007; Hinman
Einlei ung
9
& Lewis, 1992; Gue e e e al., 1996). Die da in wiede keh enden Konsensusmo i e
um assen Alanin- eiche Regionen (meis Polyalanin (An mi n=4-12), sel ene in Kombina ion
mi Glycin (GA)n), sowie die Mo i e GGX (mi X=Y,L,Q) und GPGXX (mi X=Q,G,Y)
(Hayashi e al., 1999; Gosline e al., 1999). NMR- und Rön genbeugungsanalysen e gaben,
dass die Polyalanin-Sequenzen be o zug β-Fal bla -S uk u bilden, die sich eilweise zu
hochgeo dne en Nanok is allen aus an ipa allel angeo dne en β-S ängen zusammenlage n
(Riekel e al., 1999; Pa khe e al., 1997; Simmons e al., 1994; Simmons e al., 1996;
Kumme len e al., 1996; G ubb & Jelinski, 1997). Das GPGXX-Mo i hingegen bilde
e mu lich β-Schlei en, welche sich – ähnlich wie ü Elas in angenommen – zu Spi alen
ano dnen (Hayashi & Lewis, 2001; Hayashi e al., 1999). Die S uk u des Mo i s GGX is
nich eindeu ig geklä . Au g und on NMR-S udien wi d jedoch on wenige geo dne en,
helikalen S uk u en ausgegangen, wie e wa 31-Helices (S uk u en mi d ei Aminosäu en p o
Windung, welche keine in a-molekula en H-B ücken ausbilden, wie e wa Polyp olin II- ode
Polyglycin II-Helices) (Jenkins e al., 2010; Holland e al., 2008a; an Beek e al., 2002).
Abb. 1.3: Hie a chische Au bau eines d agline Seiden adens. (a) D agline Seide dien als Abseil aden sowie
zu Kons uk ion on Rahmen und Speichen eines Radne zes. Mak oskopisch gliede sie sich in eine Hülle,
bes ehend aus Lipiden, Glykop o einen und Seidenp o einen de kleinen Ampullend üse (mino ampulla e
Spid oin, MiSp), sowie den Ke nbe eich. Diese zeig Fib illen, welche aus (mindes ens) zwei P o einen de
g oßen Ampullend üse (MaSp1 und MaSp2) au gebau sind. Au mik oskopische Ebene inden sich
Nanok is alle aus dich gepack en β-Fal blä e n, die in eine Ma ix aus lexible en S uk u en eingebe e sind.
(b) Schema ische Da s ellung des modula en Au baus on MaSp1 bzw. MaSp2. Eine hoch epe i i e
Ke ndomäne wi d an beiden Te mini on nich - epe i i en Domänen (NRN und NRC) lankie . Die Ke ndomäne
um ass bis zu 100- ach au e ende Wiede holungseinhei en, welche wiede um aus ku zen Aminosäu enmo i en
zusammengese z sind. Einzelnen Mo i en konn en bes imm e Sekundä s uku en zugeo dne we den (s. Tex ).
Einlei ung
10
1.2.2 Hie a chische Au bau als G undlage mechanische Eigenscha en
Im Seiden aden liegen die hochgeo dne en, k is allinen Be eiche aus dich gepack en β-
Fal bla -S uk u en in eine Ma ix aus wenige o ien ie en, lose e sch änk en/ e wobenen
P o einke en o (Abb. 1.3) ( an Beek e al., 2002; Te monia, 1994). Diese Ano dnung
lie e einen wich igen Bei ag zum auße gewöhnlichen mechanischen Ve hal en de Seiden-
ase n. Rön genbeugungsanalysen e gaben eine G öße de K is alle on e wa 2 x 5 x 7 nm
(Riekel e al., 1999; G ubb & Jelinski, 1997). Ih An eil am Gesam olumen des Fadens
be äg 15-35 % (G ubb & Jelinski, 1997; Jenkins e al., 2010; Le e e e al., 2007b). Wie bei
ande en semik is allinen Ma e ialien wi ken die s a en K is alle als physikalische
Que e ne zung, was dem Faden mechanische S abili ä e leih (Xiao e al., 2009; Rie e al.,
1997; Eom e al., 2003; Buehle & Yung, 2009). De G ad de S ei igkei (E-Modul) a iie
dabei in Abhängigkei des An eils k is alline S uk u en sowie de en Aus ich ung (Du e al.,
2006; Rousseau e al., 2007; Sinsawa e al., 2002; Teulé e al., 2011). Auch ü ande e β-
Fal bla - eiche P o eine (z. B. Ti in) wu de besch ieben, dass in e molekula e β-Fal bla -
Regionen den Zusammenhal zwischen e schiedenen Molekülke en e mi eln, diese
e s ä ken und bei Beansp uchung zu Ve eilung de K a üh en (Ke en e al., 2010; Rie e
al., 1997). De Zusammenhal inne halb de Fal blä e is dabei du ch Wasse s o b ücken
gegeben. MD Simula ionen e gaben, dass un e homogene Sche belas ung bis zu ie
Wasse s o b ücken koope a i au b echen, was zu dem Schluss üh e, dass dies de
maximalen S abili ä eines β-Fal bla s en sp ich und ein Zugewinn an (Zug-)Fes igkei nich
du ch länge e β-S änge, sonde n ehe du ch Kombina ion iele ku ze β-Fal bla -Be eiche
e eich we den kann (Ke en e al., 2010; Ke en & Buehle , 2008a). Somi bie e die
Ano dnung iele äumlich beg enz e β-Fal bla -S uk u en inne halb des Seiden adens die
Vo ausse zung ü hohe Reiß es igkei . Zudem e laub die d eidimensionale Ano dnung de
K is alle eine wesen lich besse e Dissipa ion on Ene gie als beispielsweise amyloide
S uk u en, da die Ablei ung in den K is allen in ans e sale Rich ung e olgen kann (Xu &
Buehle , 2010).
Einen wei e en en scheidenden Bei ag zu den mechanischen Eigenscha en, welche neben
eine hohen Fes igkei auch eine gu e Dehnba kei beinhal en (Tabelle 1.2), lie e die Ma ix
aus ungeo dne en S uk u en, Helices und β-Spi alen. Wie be ei s ü Elas in besch ieben,
e leihen le z e e hohe Elas izi ä (Hayashi & Lewis, 2001). Auch 31-Helices gel en als
lexible S uk u en, die jedoch gleichzei ig eine e gleichsweise höhe e S abili ä als ein
amo phe Ke en bie en (Jelinski e al., 1999; Kushne & Guan, 2011). Zum Ve s ändnis de
Eigenscha en de amo phen Ma ix wu den basie end au dem sog. wo m-like chain-Modell,
Einlei ung
11
welches zu Besch eibung iso ope , lexible Moleküle angewende wi d, Simula ionen
du chge üh . Mi diesem Modell konn e eilweise gu e Übe eins immung des mechanischen
Ve hal ens mi expe imen ellen Da en e eich we den, jedoch nu in einem beg enz en
K a be eich. Dies wu de dadu ch e klä , dass bei höhe e angeleg e K a H-B ücken
au b echen, was in dem e wende en Modell nich be ücksich ig wi d (Ke en & Buehle ,
2008b). Ve schiedene S udien zeig en, dass die Ma ix Be eiche un e schiedliche
O ien ie ung au weis und eilweise übe H-B ücken que e ne z is ( an Beek e al., 2002;
Jelinski e al., 1999). Da aus lei e sich ein D eiphasen-Modell de hie a chischen Zusammen-
se zung on d agline Seide ab, welches neben den hoch-o ien ie en β-Fal bla -K is allen
eine ela i ungeo dne e Ma ix sowie eilweise o ien ie e Polypep idke en um ass ( an
Beek e al., 2002; Simmons e al., 1996; Papadopoulos e al., 2009b). Aus de aillie en, zei -
au gelös en FTIR-Analysen wu de zudem abgelei e , dass einige de Ke en (en sp echend
eine Gauss-Ve eilung) un e Vo spannung s ehen (Papadopoulos e al., 2009b; Ene e al.,
2009).
1.2.3 Fadenassemblie ung – de na ü liche Spinnp ozess
Die P o eine de d agline Seide (MaSp) we den in de g oßen Ampullend üse on
hochspezialisie en Epi helzellen gebilde und mi Hil e on Vesikeln in das Lumen de D üse
sek e ie (Plazaola & Candelas, 1991). Eine en sp echende Sek e ionssequenz konn e in den
amino e minalen nich - epe i i en Domänen nachgewiesen we den (Rising e al., 2006). Im
Lumen we den die P o eine als hoch iskose Spinnlösung mi P o einkonzen a ionen on bis
zu 50 % (w/ ) gespeiche , be o sie bei Beda du ch einen S- ö migen Spinnkanal zum
Ausgang des Spinnappa a es, de Spinnwa ze, gelangen (Hiji ida e al., 1996; Voll a h &
Knigh , 2001). Im Ve lau de d ei Abschni e des Kanals e olg du ch Zusammenwi ken
e schiedene physikalische und chemische T igge de Übe gang on eine hoch
konzen ie en Lösung in einen es en Faden (Abb. 1.4) (zusammenge ass in Heim e al.,
2009; Humenik e al., 2011).
Un e suchungen de Sekundä s uk u de MaSp in de D üse e gaben andom coil- sowie
dynamische helikale Kon o ma ionen, da un e Polyp olin II-Helix-ähnliche S uk u en
(Le e e e al., 2007a). Le z e e zeigen die Eigenscha , dass sie die Löslichkei de P o eine
du ch ex ensi e Ausbildung on Wasse s o b ücken zu umgebenden Lösungsmi elmole-
külen e höhen (Hiji ida e al., 1996). Zum ande en e möglichen die dabei eingenommenen
Diede winkel eine ene ge isch güns i ge Umlage ung in β-Fal bla -S uk u en (Blanch e al.,
2004), welche einen g oßen An eil de S uk u (e wa 50 %) im e igen Faden da s ellen
(Simmons e al., 1996) .

Einlei ung
12
Es wi d e mu e , dass sich die MaSp au g und ih e amphiphilen Eigenscha en in de D üse
Mizellen-a ig a angie en (Jin & Kaplan, 2003). Dies wi d ges ü z du ch die Beobach ung
öp chen ö mige S uk u en in de D üse (Knigh & Voll a h, 1999) sowie du ch in i o
Un e suchungen an ekombinan en, on MaSp abgelei e en P o einen (Rammensee e al.,
2008; Exle e al., 2007; Hagn e al., 2010). Wie auch ü ande e Biopolyme e bei en -
sp echend hohen Konzen a ionen wu den de Spinnlösung Eigenscha en lüssig-k is alline
Sys eme zugesch ieben (Voll a h & Knigh , 2001; Willcox e al., 1996; Knigh & Voll a h,
2002). Dazu gehö die Fließ ähigkei de Lösung, welche du ch e leich e en T anspo
en lang de Fließ ich ung inne halb des Spinnkanals gekennzeichne is . Gleichzei ig weis de
Flüssigkei s ilm eine e höh e S abili ä au , die ein Reißen des S omes e hinde . Du ch die
Geome ie des sich s e ig e jüngenden Spinnappa a s wi d bis zum E eichen des le z en
Abschni s ein gleichmäßige Elonga ions luss e zeug , welche die Aus ich ung de Moleküle
un e s ü z (Knigh e al., 2000; Le e e e al., 2008; Knigh & Voll a h, 1999).
Abb. 1.4: Schema ische Da s ellung des Spinnp ozesses zu He s ellung eines Spinnenseiden adens
(Abseil aden). Die Spid oine we den in das Lumen de g oßen Ampullend üse seze nie und do als
hochkonzen ie e Spinnlösung gespeiche . Du ch e schiedene physiko-chemische Pa ame e en s eh
inne halb des Spinnkanals bis zum Aus i an de Spinnwa ze ein es e Faden.
(nach Spiess e al., 2010a, mi Genehmigung des Ve lags John Wiley & Sons)
Im Ve lau des Kanals wi d du ch e schiedene Fak o en eine Phasensepa a ion induzie ,
welche schlussendlich zu Bildung eines es en Fadens üh . Ein Fak o is dabei de
kon ollie e Aus ausch on Na ium- und Chlo id-Ionen gegen kosmo ope e Kalium- und
Phospha -Ionen, wodu ch hyd ophobe Wechselwi kungen e s ä k we den können (Knigh
& Voll a h, 2001). Einen wei e en Bei ag s ell die Ansäue ung des Milieus mi Hil e on
P o onenpumpen da , was e mu lich in e molekula e In e ak ionen du ch P o onie ung
nega i geladene Aminosäu e-Sei enke en e leich e (Chen e al., 2002; Dicko e al., 2004).
Zusä zlich e en du ch eine e ände e Geome ie des Spinnkanals (Knigh & Voll a h, 1999)
Sche k ä e au , welche die Ausbildung on P o ein-P o ein-Kon ak en und in e molekula en,
dich gepack en β-Fal bla -Be eichen ö de n (Chen e al., 2002; Knigh e al., 2000).
Einlei ung
13
Ve olls ändig wi d de Spinnp ozess du ch Wasse en zug. Diese e olg ak i du ch
Epi helzellen im inalen Teil des Spinnkanals, sowie passi du ch Abs ei en am Ausgang
und le z endlich T ocknung des Fadens an Lu (Voll a h & Knigh , 2001).
Eine wich ige Rolle bei de ge ich e en Assemblie ung äll dabei den nich - epe i i en
Te mini zu. Dies wu de o ab e mu e (I ah e al., 2007), jedoch e s kü zlich anhand
e kü z e , ekombinan he ges ell e P o eine sowohl ü den Amino- als auch ü den
Ca boxy e minus gezeig (Aska ieh e al., 2010; Land eh e al., 2010; Eisold e al., 2010;
Hagn e al., 2010; Hagn e al., 2011). Die lange epe i i e Sequenz de P o eine e schwe
de en Sequenzie ung, so dass die komple e Sequenz de Amino e mini nu ü einige
Spinnena en bekann is . Au g und de beobach e en hohen Konse ie ung de bishe
bekann en Sequenzen zwischen e schiedenen Spinnen- und Seidena en is es jedoch
wah scheinlich, dass sich die Funk ionen bei un e schiedlichen A en en sp echen (Rising e
al., 2006).
Eine sei s s abilisie en beide Te mini die P o eine bei den in de D üse o liegenden
Bedingungen in Lösung und e hinde n so une wünsch e Agg ega ion. Ande e sei s
e möglichen sie du ch de inie e Dime isie ungsobe lächen die ge ich e e Ano dnung de
P o eine (Hagn e al., 2010). Agg ega ionsanalyse ekombinan e Seidenp o eine mi bzw.
ohne den Ca boxy-Te minus e gab, dass nu bei Anwesenhei des Te minus Fib illen gebilde
we den, wäh end sons amo phe Agg ega e au a en (Hagn e al., 2010). Beide Te mini
eagie en zudem sensi i au die physiko-chemischen Ände ungen wäh end des Spinn-
p ozesses. So wi d de Ca boxy-Te minus un e Sche k ä en und bei sinkende Salzkon-
zen a ion (NaCl) des abilisie (Eisold e al., 2010; Hagn e al., 2010). Ve mu lich we den
dadu ch hyd ophobe Aminosäu esei enke en exponie und molekula e Umlage ungen
e leich e , wodu ch inne halb de epe i i en Ke ndomäne β-Fal blä e ausgebilde we den
können. Zudem üh das Absenken des pH-We es (au den beobach e en We on 6,3) zu
Dime isie ung de amino e minalen Domäne, welche bei dem neu alen pH (6,9) im Lumen
de Spinnd üse monome o lieg (Aska ieh e al., 2010; Hagn e al., 2011). Wäh end ü den
Ca boxy-Te minus eine pa allele Aus ich ung des Dime s besch ieben wu de (Hagn e al.,
2010), e olg die Dime isie ung de amino e minalen Domäne in an ipa allele Aus ich ung
(Aska ieh e al., 2010). Dies gil als Vo ausse zung zu Ausbildung ge ich e e , höhe -
molekula e Oligome e.
De Spinnp ozess s ell einen en scheidenden Fak o ü die Eigenscha en des gebilde en
Fadens da . So a iie en die mechanischen Eigenscha en beispielsweise mi de Geschwin-
digkei , mi de de Faden gezogen wi d (Rousseau e al., 2007). Ein als Re ungsleine im
Einlei ung
14
eien Fall ode bei e ikalem Abs ieg gebilde e Faden is zug es e als ein zum Ne zbau
e wende e Faden (Pe ez-Riguei o e al., 2005). Au molekula e Ebene wu den Un e -
schiede in de G öße und Ausdehnung de o handenen k is allinen β-Fal blä e sowie in
de en Aus ich ung en lang de Fadenachse beobach e (Riekel e al., 2000). Zusä zlich
beein lussen passi e Pa ame e , wie die Umgebungs empe a u , Lu euch igkei ode
E näh ung, die Quali ä des Fadens (Madsen e al., 1999; Voll a h & Po e , 2006).
Aus eichend hohe Lu euch igkei ode de Kon ak des Fadens mi Wasse üh zu eine ü
Seiden ypischen Reak ion, de Supe kon ak ion (Pe ez-Riguei o e al., 2003; Shao e al.,
1999; Liu e al., 2005). Hie bei komm es zu eine deu lichen Ve kü zung des Fadens, die bei
d agline Seide am s ä ks en ausgep äg is und bis zu 50 % e eichen kann. Gleichzei ig s eig
de Fadendu chmesse . De zug undeliegende Mechanismus be uh au Wechselwi kung de
Wasse moleküle mi de in e molekula en Ve ne zung de Seidenp o eine in den amo phen
Be eichen, wodu ch de en Ve ne zung und Vo spannung gelös wi d und so en opisch
ge iebene Umlage ungen e möglich we den (Ene e al., 2009; Ene e al., 2011; Liu e al.,
2005). Dies wu de . a. au P olin- eiche Ke enabschni e zu ückge üh , da eine di ek e
Ko ela ion zwischen P olin-Gehal und Supe kon ak ions e hal en bei un e schiedlichen
Spinnen-und Seiden ypen es ges ell wu de (Liu e al., 2008; Sa age & Gosline, 2008b;
Sa age & Gosline, 2008a). Diese Be eiche wü den on einem me as abilen, eilweise
geo dne en Zus and in ungeo dne e e Kon o ma ionen übe gehen. Als wei e e Fak o wu den
kü zlich molekula e Relaxa ions o gänge besch ieben, welche du ch e höh en Wasse gehal
induzie wu den und einem Glasübe gang en sp echen (Guan e al., 2011). Molekula e
G undlage sind hie e mu lich GGX- eiche Mo i e. Die dich gepack en β-Fal bla -K is alle
hingegen we den on den einge e enen Wasse molekülen wei es gehend nich beein luss
(Holland e al., 2008b; Ene e al., 2010; Holland e al., 2004).
1.3 Rekombinan e Spinnenseidenp o eine
Im Gegensa z zu Seide des Maulbee spinne s B. mo i, dessen Kokonseide du ch Hal ung de
Raupen au iesigen Fa men gewonnen wi d, ges al e sich die Gewinnung on Spinnenseiden
in g oßem Maßs ab schwie ig. Die meis en Spinnen sind au g und ih es e i o ialen und
kannibalischen Ve hal ens nich zu Züch ung geeigne (Fox, 1975). Zudem müss e de Faden
en wede aus Ne zen gesammel we den, die abe un e schiedlichs e Zusammense zung an
Seiden au weisen, ode du ch di ek es Melken de Spinnen gewonnen we den, was in g oßem
Maßs ab nich zu ealisie en is .
Einlei ung
15
Dahe wu den e schiedene Ansä ze en wickel , um die gewünsch en Spinnenseidenp o eine
ekombinan he zus ellen (Vend ely & Scheibel, 2007; Heim e al., 2009; Rising e al., 2010).
Die na ü lichen Gene – ode Teile da on – wu den in un e schiedlichen Wi so ganismen, wie
E. coli, Tabakp lanzen, Insek enzellen ode Säuge ie -Zelllinien exp imie . Euka yo ische
Sys eme gal en au g und de ansp uchs ollen Molekülg öße, de epe i i en Zusammen-
se zung sowie de e wende en Codons de kodie enden Gene als iel e sp echende (Rising
e al., 2010). Als dem na ü lichen Sys em ähnlichs e Va ian e wu den ansgene B. mo i
he ges ell , de en Kokons neben Seiden ib oin auch Spinnenseidenp o eine (MaSp1)
en hiel en (Wen e al., 2010). Eine e olg eiche P oduk ion in einem p oka yo ischen Sys em
(E. coli) gelang o ku zem du ch Co-Exp ession bes imm e RNAs, welche au g und des
ungewöhnlich hohen Glycin- und Alanin-An eils einen limi ie enden Fak o da s ellen (Xia e
al., 2010).
Wei aus meh S a egien be assen sich jedoch mi de He s ellung neue , on den bekann en
P o einen abgelei e e P o eine. Au g und des epe i i en Au baus aus ku zen, sich
wiede holenden Aminosäu emo i en kann da ü ein modula e Ansa z e olg we den
(Rising e al., 2010; Vend ely & Scheibel, 2007; Teule e al., 2009). Du ch e e se T ans-
la ion wi d das gewünsch e Mo i un e Be ücksich igung de codon usage des jeweiligen
Exp essionssys ems in eine Oligonukleo idsequenz übe se z , welche syn he isch he ges ell
wi d. Du ch Kombina ion un e schiedliche Sequenzmo i e und geziel e Mul ime isie ung
können hie du ch un e schiedliche Gene und somi P o eine gene ie we den, die en wede
di ek bes imm en Abschni en de na ü lichen P o eine en sp echen ode abe öllig neue
Kombina ionen en hal en.
Das in diese A bei e wende e Spinnenseidenp o ein eADF4(C16) (enginee ed ADF4)
wu de mi els solche S a egie en wickel und kann in E. coli in hohe Ausbeu e p oduzie
und anschließend da aus ge einig we den (Huemme ich e al., 2004a). Es s ell eine e-
kombinan e Va ian e de epe i i en Konsensussequenz des d agline Seidenp o eins ADF4
da . Das 35 Aminosäu en um assende Konsensusmo i wu de als Modul C bezeichne ,
welches in eADF4(C16) 16- ach wiede hol wi d. Somi en sp ich es eine e kü z en
Va ian e (Mw 47,7 kDa) on ADF4 ohne nich - epe i i e Te mini (Abb. 1.5) (Huemme ich e
al., 2004a).

Ma e ial und Me hoden
23
2 Ma e ial und Me hoden
2.1 Ma e ial
2.1.1 Oligonukleo ide, Pep ide und Linke
2.1.1.1 Oligonukleo ide
In diese A bei wu den syn he ische Oligonukleo ide (he ges ell on MWG-Bio ech AG,
Ebe sbe g) e wende , die sowohl als Ma izen zum Assemblie en eines DNA-Doppels angs
(n agCys- wd, n agCys- e ) als auch in de Polyme aseke en eak ion (pCSmu - wd, pCS-CS25C-
e ) eingese z wu den. Fü die Sequenzie ung wu den S anda dp ime eingese z (GATC,
Kons anz).
Oligonukleo id
Basensequenz (5`→3`)
Beme kung
n agCys- wd
GATC CATG GGT TGC GGT GGC TCT GGT GGT GGC
GGG TCC GGA GGC GGT GGC TAA TGA A
codie ü AS-Sequenz
MGCGGSGGGGSGGGG
(n agCys):
n agCys- e
AGCTT TCA TTA GCC ACC GCC TCC GGA CCC GCC
ACC ACC AGA GCC ACC GCA ACC CATG
pCSmu - wd
CACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGA
e zeug Modul C*
(mi S25C)
pCS-CS25C- e
CTCTTAAGCTTTCATTAGCCTGGACCACCTGGACCG
TAGCCGCCCGGGCCGCAAGGACCCTGG
2.1.1.2 Pep ide und Linke
Name
Besch eibung
Quelle
c(RGD K)
(s. Abb. 3.23)
Die Aminosäu e es e sind du ch den Einbuchs abencode da ges ell ,
wobei G oßbuchs aben L- und Kleinbuchs aben D-Aminosäu en
kennzeichnen (Kan lehne , Scha ne e al., 2000). Zusä zlich wu de
übe den Linke SMCC eine Maleimid-Funk ionali ä angeb ach .
Zu De ek ion wu de zusä zlich Fluo escein ange üg .
AG P o . Kessle , TU
München
(D . Monica Lopez)
SMCC
Succinimidyl ans-4-(maleimidylme hyl)cyclohexan-1-ca boxyla
In i ogen GmbH,
Da ms ad ,
Deu schland
NHS-PEO12-
Maleimide
He e obiunk ionelle C osslinke , Space -Länge: 5,34 nm
Pie ce, IL, USA
2.1.2 Plasmide
Im Rahmen diese A bei wu de de Vek o pAZL in Kombina ion mi dem on
D. Hümme ich e ablie en Klonie ungssys em e wende (Huemme ich e al., 2004a). Als
Ausgangs ek o wu de dabei pAZL-C eingese z , welche be ei s die ü ein C-Modul
kodie ende Gensequenz en häl . Zu Genexp ession wu den die Vek o en pET21a sowie
pET29a e wende , je nach gewünsch e Resis enz gegenübe Ampicillin (AmpR) bzw.
Ma e ial und Me hoden
24
Kanamycin (KanR). Eine Subklonie ung in pET29a e olg e ausgehend on pET21a, so dass
alle in diese A bei e zeug en Kons uk e einen amino e minalen T7- ag ugen.
pAZL-C
pFas bac1 mi zusä zliche
Klonie ungskasse e und einem C-Modul
(Huemme ich e al., 2004a)
pET21a
AmpR, T7, His-Tag (N), T7-Tag (N), 1
o i, lacI
No agen, Madison, WI, USA
pET29a
KanR, T7, His-Tag (C), S·Tag (N), 1
o i, lacI
No agen, Madison, WI, USA
2.1.3 O ganismen
2.1.3.1 Bak e ien
Zu Klonie ung und Ve meh ung on Plasmid-DNA wu de de Bak e iens amm Esche ichia
coli DH10B e wende , zu P o einp oduk ion de S amm HMS174(DE3).
E. coli DH10B
F- mc A Δ(m -hsdRMS-mc BC)
φ80dlacZΔM15 lacX74 ecA1 endA1
a aD139 Δ(a aleu) 7697 galU galK psL
nupG λ- onA
In i ogen GmbH, Da ms ad ,
Deu schland
E. coli HMS174(DE3)
F- ecA1 hsdR( K12- mK12+) (DE3) (Ri R)
No agen, Madison, WI, USA
2.1.3.2 euka yo ische Zelllinie
MC3T3-E1
(DSMZ: ACC 210)
Mu ine ib oblas ena ige Zellen (aus de
Cal a ia eine C57BL/6 Maus (Emb yo))
Deu schen Sammlung on
Mik oo ganismen und
Zellkul u en GmbH (DSMZ),
B aunschweig, Deu schland
2.1.4 Enzyme und An ikö pe
Res ik ionsenzyme
NEB, F ank u a. M., Deu schland
T4 DNA Ligase
P omega, Madison, WI, USA
Lysozym
AppliChem, Da ms ad , Deu schland
SAM (S-Adenosylme hionin)
NEB, F ank u a. M., Deu schland
Humanes Se um Albumin (HSA)
Sigma-Ald ich, Seelze, Deu schland
sh imp alkaline phospha ase, SAP
Roche, Mannheim, Deu schland
α-T7- ag An ikö pe (monoklonal, Maus)
No agen, Madison, WI, USA
α-Maus-IgG-HRP (ho se adish pe oxidase) Konjuga (Ziege)
Sigma, S . Louis, MO, USA
S ep a idin-AP (Alkalische Phospha ase) Konjuga
Sigma, S . Louis, MO, USA
2.1.5 G ößens anda ds und Ki s
P ecision Plus P o ein S anda ds Dual Colo
BioRad, München, Deu schland
Colo Plus P es ained P o ein Ma ke (7-175 kDa)
NEB, F ank u a. M., Deu schland
DNA-Längens anda d (1 kb Ladde )
NEB, F ank u a. M., Deu schland
DNA-Längens anda d (100 bp Ladde )
NEB, F ank u a. M., Deu schland
Ma e ial und Me hoden
25
Wiza d Plus SV Minip ep DNA Pu i ica ion Sys em
P omega, Madison, WI, USA
Wiza d SV Gel and PCR Clean-Up Sys em
P omega, Madison, WI, USA
ECL-Wes e n Blo De ek ionssys em
Ame sham Biosciences,Pisca away, NJ,
USA
2.1.6 Chemikalien und Biochemikalien
Subs anz
Fi ma
1,1,1,3,3,3 Hexa luo -2-P opanol (HFIP)
Me ck, Da ms ad , Deu schland
2-Amino-2-hyd oxyme hyl-1,3-p opandiol (TRIS)
Ro h, Ka ls uhe,Deu schland
2-Me cap oe hanol
Me ck, Da ms ad , Deu schland
Ac ylamidlösung Ro hipho ese Gel 40
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
Ammoniumpe oxodisul a (APS), p. a
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
Ampicillin Na iumsalz, >99 %
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
B illan Blau G 250
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
di-Kaliumhyd ogenphospha
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
Dulbecco’s Modi ied Eagle Medium
Bioch om, Be lin, Deu schland
Dulbecco’s Phospha e Bu e ed Saline
Sigma-Ald ich, S einheim, Deu schland
Ein ie medium
Gibco/In i ogen, Da ms ad , Deu schland
E hanol
VWR, Da ms ad , Deu schland
E hylendiamin e aessigsäu e (EDTA)
Me ck, Da ms ad , Deu schland
Fö ales Kälbe se um
Bioch om, Be lin, Deu schland
Fluo escein 5-Maleimid
Pie ce/The mo Scien i ic, Rock o d, IL,
USA
Fo maldehyd, 37 %, p. a.
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
Glycin
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
Glyze in
Sigma-Ald ich, S einheim, Deu schland
GoldenhanceTM-EM
Nanop obes, Yaphank, NY, USA
Guanidinium hiocyana
Me ck, Da ms ad , Deu schland
HCl
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
Humanes Se um Albumin (HSA)
Sigma-Ald ich, S einheim, Deu schland
Kanamycinsul a
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
Kaliumdihyd ogenphospha
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
L-Lysin
Sigma-Ald ich, S einheim, Deu schland
Maleimid PEO2-Bio in
Pie ce/The mo Scien i ic, Rock o d, IL,
USA
Me hanol
Sigma-Ald ich, S einheim, Deu schland
Monomaleimido Nanogold
Nanop obes, Yaphank, NY, USA
N-(2-Hyd oxye hyl)-pipe azin-N'-2- e hansul onsäu e (HEPES)
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
N,N,N´,N´- Te ame hyle hylendiamin (TEMED)
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
Na iumchlo id
Me ck, Da ms ad , Deu schland
Na iumdodecylsul a (SDS), > 85 %
Me ck, Da ms ad , Deu schland
Penicillin (10000 U/ml) /S ep omycin (10 mg/ml)–Lösung
Sigma-Ald ich, S einheim, Deu schland
T i luo essigsäu e (TFA)
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
T is(2-ca boxye hyl)phosphine hyd ochlo id (TCEP-HCl)
Sigma-Ald ich, S einheim, Deu schland
T ypsin-EDTA (0,05 %)
In i ogen, Da ms ad , Deu schland
Tween 20, molecula biology g ade
Me ck, Da ms ad , Deu schland
WST-1 (wa e soluble e azonium)
Roche, Mannheim, Deu schland
Ma e ial und Me hoden
26
Wei e e e wende e Chemikalien s ammen, alls nich ande s e me k , on de Fi ma Me ck
in Da ms ad ode Fi ma Ro h in Ka ls uhe und ha en den Reinhei sg ad p.a.. Alle Lösungen
und Pu e wu den mi ul a einem Wasse aus eine Milli-Q-Anlage on Millipo e (Bille ica,
MA, USA), he ges ell .
2.1.7 Sons ige Ma e ialien/Ve b auchsma e ialien
Aluminiumoxid-Tiegelchen ü TGA
Me le Toledo, Gießen, Deu schland
Aluminium iegel ü DSC
Me le Toledo, Gießen, Deu schland
Neubaue Zählkamme
Lo Labo op ik, F ied ichsdo , Deu schland
Pe ischalen
Sa s ed , Nümb ech , Deu schland
Mul iwell-Pla en (96-well, 24-well) - NunclonTM
Nunc, Roskilde, Dänema k
Mul iwell-Pla en (96-well, 24-well) – ü Suspensionszellen
Sa s ed , Nümb ech , Deu schland
Zellkul u laschen
Co ning Li esciences, NY, USA
Qua zglas Supa asil Kü e en (un e schiedliche Aus üh ungen)
Hellma, Mühlheim, Deu schland
Gel il a ionssäule Supe dex 200 10/300 GL
GE Heal hca e, München, Deu schland
Memb an il e (0, 22 μm und 0,45 μm)
Ro h, Ka ls uhe, Deu schland
Memb an il e (0,1 µm)
Millipo e, Bille ica, MA, USA
Mic o Can ile e OMCL – AC 160 TS-W2
Olympus, Tokyo, Japan
Lei silbe
Plano, We zla , Deu schland
Plas ik Modellbauklebe
UHU GmbH & Co. KG, Bühl, Deu schland
REM-P obenhal e
Aga Scien i ic L d., Essex, UK
TEM-Ne zchen (g ids, e golde , 400 mesh)
Plano, We zla , Deu schland
The manox® plas ic co e slips
Nalge Nunc In ., Roches e , NY, USA
SERVAGel™ T G 4-20
SERVA Elec opho esis GmbH, Heidelbe g,
Deu schland
2.1.8 Ge ä e und echnische Hil smi el
Ge ä
Modell
Fi ma
Abso p ionsspek opho ome e
Ca y 50 Bio
Va ian, Da ms ad , Deu schland
Blo appa a u
Fas blo B44
Biome a, Gö ingen, Deu schland
B echungsindexde ek o
RI-71
Shodex, Tokyo, Japan
B u sch ank
He acell 150i
The mo Scien i ic, Wal ham, MA,
USA
WB 560 K
my on Bio- und Sola echnik GmbH,
Heilbad Heiligens ad , Deu schland
CD-Spek ome e
J-715
Jasco, Tokyo, Japan
Dynamisch mechanische Analyse
TA DMA 2980
TA Ins umen s, Newcas le, DE, USA
Fed-Ba ch Reak o
Mini o s
In o s HT, Bo mingen, Schweiz
Fluo eszenz-Image
E an DIGE
GE Heal hca e, München,
Deu schland
Fluo eszenzspek ome e
FP-6500
Jasco, Essex, UK
FTIR-Spek ome e
FTS6000
De ek o : MCT
Mik oskop: UMA 500
Fil e : ZnSe-Pola isa ions il e
(mo o be ieben)
Klimakamme : ZnSe-Fens e ,
Tempe a u und RF-Kon olle
K a senso : Bu s e 8411-10
Va ian, Da ms ad , Deu schland
Bu s e , Ge nsbach, Deu schland
Ma e ial und Me hoden
27
FTIR-Spek ome e
Tenso 27 IR-Spek ome e
De ek o : MCT
Messeinhei : MIRacle
Ge manium-ATR-K is all
B uke , Rheins e en, Deu schland
Geldokumen a ion
GelDoc XR‐Sys em
BioRad, München, Deu schland
Hochd uckhomogenisa o
M‐110S
Ni o Soa i, Lübeck, Deu schland
HPLC Sys em
Se ies 1100
(Pumpe, En gase , UV-De ek o ,
P obengebe , Tempe ie einhei )
Agilen Technologies, Palo Al o, CA,
USA
HPLC Sys em
PU 2080Plus
UV 2075Plus
FP 2020Plus
Jasco, Tokyo, Japan
Kalo ime e (DSC)
SDTA 821e Sys em
Me le Toledo, Gießen, Deu schland
Klimakamme
Eigenbau (G ego Lang)
Lu be euch e Modell 5462
Uni e si ä Bay eu h, Deu schland
e s®, Glenside, PA, USA
Kon okales Lase -Scanning-
Mik oskop
LSM 710
Zeiss, Jena, Du schland
Kon ak winkelmessung
OCA Sys em
Da aphysics In umen s GmbH,
Filde s ad Deu schland
Lich mik oskop
DMIL LED mi DFC 295 Fa b-
kame a
Leica Mic osys ems GmbH, We zla ,
Deu schland
Lich s eude ek o
DAWN EOS (s a ische LS)
QELS (dynamische LS)
Wya Technology Eu ope, De nbach,
Deu schland
Lyophylle
Alpha 1-2 LD plus
Ch is , Os e ode, Deu schland
Massenspek ome e
B uke Re lex III
B uke , B emen, Deu schland
O en
He aeus Func ion Line UT 20
The mo Scien i ic Inc., Wal ham,
MA, USA
pH Me e
Lab 860
Scho AG, Mainz, Deu schland
Pla e eade
Mi h as LB 940
Be hold Technologies, Sp endlingen,
Deu schland
Ras e elek onenmik oskop
1540EsB C oss Beam
Zeiss, Obe kochen, Deu schland
Ras e k a mik oskop
DimensionTM 3100
ausges a e mi Nanoscope IV
SPM Con olle
Veeco Ins umen s Inc., Plain iew,
NY, USA
S e ilwe kbank
HERAsa e KS
The mo Scien i ic, Wal ham, MA,
USA
The mocycle
P imus
MWG Bio ech AG, Ebe sbe g,
Deu schland
The mog a ime e (TGA)
SDTA 861e
Me le Toledo, Gießen, Deu schland
The momixe
The mo Compac /com o
Eppendo , Hambu g, Deu schland
T ansmissionselek onen-
mik oskop
100 CX
Jeol, Tokyo, Japan
Übe kop schü le
Heidolph, Schwabach, Deu schland
Ul zen i uge
Op ima MAX-XP
Ro o : TLA-55
Beckmann Coul e Inc., B ea, CA,
USA
Waagen
CPA 225D (Feinwaage)
Acculab ALC‐3100.2
Acculab ALC-4100.1
Sa o ius, Gö ingen, Deu schland
Zen i ugen
He aeus p imo R
He aeus F esco 17
He aeus Pico 17
So all RC 6 plus
Op ima MAX-XP
The mo Scien i ic, Wal ham, MA,
USA
Beckman-Coul e , B ea, CA, USA
Zugmaschine
Uni e sal Tes e 5565
Ins on, No wood, MA, USA

Ma e ial und Me hoden
28
2.1.9 Compu e p og amme
As a 5.3.4.14
Wya Technology Eu ope, De nbach, Deu schland
ExPASy - SIB Bioin o ma ics Resou ce Po al
h p://expasy.o g/
GEN le
Magnus Manske, Köln, Deu schland
Nanoscope 6.14 1
Veeco Ins umen s Inc. N.Y., USA
Opus 6.5
B uke Op ics Co p., Bille ica, MA, USA
O iginP o 8.1G
O iginLab Co po a ion, No hamp on, MA, USA
Swiss-PdB-Viewe Deep View 4.0.4
Swiss ins i u e o bioin o ma ics,
h p://www.expasy.o g/spdb , (Guex & Pei sch, 1997)
Ad an age Uni e sal Analysis 5.4
TA Ins umen s, Newcas le, DE, USA
Vec o NTI Ad ance 10
In i ogen, Ca lsbad, CA, USA
2.2 Molekula biologische Me hoden
2.2.1 Anzuch on Esche icia coli
Auss ichkul u en on E. coli au LB-Aga pla en wu den übe Nach (ÜN) bei 37 °C ode
2-3 Tage bei RT inkubie . Zum Animp en on Flüssigkul u en wu den Einzelkolonien
e wende , bei Volumina g öße als 50 ml dien en en sp echende Vo kul u en zu
Inokula ion. Sowohl den Aga pla en als auch dem Flüssigmedium wu den en sp echende
An ibio ika zu Selek ion des jeweiligen Plasmids zugese z . Volumina bis zu 4 ml wu den im
Reagenzglas olle inkubie , Kul u en übe 10 ml im Umlu schü elinkuba o . Das Wachs um
de Bak e ien wu de pho ome isch übe die op ische Dich e de Kul u bei 600 nm (OD600)
e olg . Nach (Samb ook & Russell, 2001) e geben e wa 8 x 108 Zellen p o ml eine OD600
on 1.
Zu lang is igen Lage ung on Bak e iens ämmen wu den 700 µl eine sich in de
exponen iellen Wachs umsphase be indlichen Bak e ienkul u mi 300 µl Glyce in (50 %)
e se z , in lüssigem S icks o schockge o en und bei -80 °C gelage .
LB0‐Medium:
10
5
5
g/l
g/l
g/l
Bac o T yp on
He eex ak
NaCl
ü LB0‐Pla en: Zugabe on 15 g/l Bac o‐Aga
An ibio ikum:
100
35
μg/ml
μg/ml
Ampicillin (Amp)
Kanamycin (Kana)
2.2.2 P äpa a ion, Reinigung und Sequenzie ung on Plasmid-DNA
Zu Isolie ung und Reinigung on Plasmid-DNA aus E. coli wu de de Wiza d Plus SV
Minip ep Ki lau He s elle angaben e wende , welche au dem P inzip de alkalischen Lyse
und selek i e Adso p ion on DNA e schiedene G öße be uh . Die Reinigung on DNA-
F agmen en aus Aga osegelen sowie die Reinigung on PCR-Ampli ika en e olg e mi els
Wiza d SV Gel and PCR clean-up Sys em nach Angaben des He s elle s.
Ma e ial und Me hoden
29
Die Sequenzie ung de e hal enen Plasmide wu de du ch die Fi ma GATC Bio ech
(Kons anz, Deu schland) du chge üh . Wenn möglich, wu den dazu S anda dp ime on
GATC Bio ech e wende , sons wu den en sp echende P ime be ei ges ell .
2.2.3 T ans o ma ion chemisch kompe en e E. coli
Zu T ans o ma ion wu den 50-100 µl chemisch kompe en e Zellen (nach Mania is e al.,
1982) mi 1 µl Plasmid-DNA bzw. 20 µl Liga ionsansa z e misch . Nach 15-minü ige
Inkuba ion au Eis olg e ein einminü ige Hi zesch i bei 42 °C. Anschließend wu de de
Ansa z ku z au Eis abgekühl , mi 200-500 µl LB0 e se z , und 1 h bei 37 °C inkubie . Im
Anschluss wu de die Bak e iensuspension au en sp echenden Selek ionspla en ausges ichen
und ÜN bei 37 °C kul i ie .
Die T ans o ma ion e olg e dabei ü die Ve iel äl igung on Plasmid-DNA in den
Klonie ungss amm DH10B bzw. zu Exp ession in HMS174(DE3).
2.2.4 Aga ose-Gelelek opho ese
Zu Analyse bzw. anschließende P äpa a ion wu den DNA-P oben eine Aga ose-
Gelelek opho ese un e zogen. Die Au ennung e schiedene F agmen e e olg dabei in
Abhängigkei de Länge des F agmen s, de Fo m de DNA, de Po eng öße des Gels, sowie
de angeleg en Spannung. Ein gleichzei ig au ge agene DNA-G ößens anda d, bes ehend
aus doppels ängigen linea en DNA-F agmen en de inie e Länge, e möglich die
Abschä zung de G öße de un e such en P obe.
Zu He s ellung 1-2 %-ige (w/ ) Aga osegele wu de die en sp echende Menge Aga ose in
TAE-Pu e du ch Au kochen gelös . Vo dem Gießen des Gels wu de de au e wa 60 °C
abgekühl en Aga oselösung 0,04 % ( / ) E hidiumb omid bzw. 0,01 % ( / ) Syb Sa e
zugese z . Beide Agenzien e möglichen eine De ek ion de au ge enn en DNA-Banden
mi els An egung mi UV-Lich (An egung: 302 nm, Emmission: > 500 nm).
Die DNA-P oben wu den o dem Au ag mi 10x Au agspu e e se z , die Au ennung
e olg e bei 120 V ü 30-45 min. Fü p äpa a i e Ansä ze e olg e eine anschließende
Reinigung des DNA-F agmen s mi els Wiza d SV Gel and PCR clean-up Sys em (s. 2.2.2)
50 x TAE:
2 M
50 mM
T is/Ace a , pH 8,0
EDTA
10 x Au agspu e :
50 % ( / )
10 mM
0,2 % (w/ )
0,2 % (w/ )
Glyce in
EDTA
B omphenolblau
Xylencyanol
Ma e ial und Me hoden
30
2.2.5 Hyb idisie ung syn he ische Oligonukleo ide
Um ku ze, doppels ängige DNA-F agmen e zu e hal en, wu den zwei komplemen ä e,
syn he isch he ges ell e Oligonukleo ide hyb idisie . Eine Lösung mi 50 pmol/µl je
Oligonukleo id in 10 mM T is pH 8,5 wu de 5 min bei 95 °C inkubie . Anschließend wu de
mi eine Ra e on 0,1 °C/s au 20 °C abgekühl . Zu Op imie ung de Hyb idisie ung wu den
e en uell ehlgepaa e Doppels änge ü 1 min bei 70 °C dena u ie . Die Lösung wu de wie
oben besch ieben abgekühl . Diese Zyklus e olg e je zehnmal bei eine Tempe a u on
70 °C, 65 °C sowie 60 °C.
2.2.6 Ampli ika ion on DNA mi els PCR
Die Polyme ase-Ke en eak ion (polyme ase chain eac ion, PCR) e möglich die
Ampli ika ion eine doppels ängigen DNA-Ma ize du ch eine he mos abile DNA-
Polyme ase. Ein zugegebenes spezi isches P ime paa de inie dabei den zu ampli izie enden
Abschni und s ell mi den 3`OH-Enden die S a punk e ü die Anhe ung de
Desoxynukleo ide da . In diese A bei wu de du ch Ve wendung des P ime paa es pCS-
CS25C- e (63 Basen) und pCSmu - wd (28 Basen) die Mu a ion S25C in de ü das Modul C
kodie enden Sequenz e zeug . Als Ma ize dien e das Plasmid pAZL-C, welches die ü ein
C-Modul kodie ende DNA-Sequenz äg . Um die Ausbildung s abile Sekundä s uk u en
des langen P ime s pCS-CS25C- e zu minimie en, wu den zudem einige s ille Mu a ionen im
Be eich de P ime sequenz e zeug . De e wende e Reak ionsansa z sowie das
Dena u ie ung, P ime -Anlage ung sowie DNA-Syn hese um assende Ampli ika ions-
p og amm sind im Folgenden zusammenge ass .
Reak ionsansa z:
empla e DNA
100
ng
dNTP-Mix (10 mM/Base)
2
µl
Vo wä sp ime (100 pmol/µl)
1
µl
Rückwä sp ime (100 pmol/µl)
1
µl
Reak ionspu e (10 x, inkl. 2 mM MgCl2)
5
µl
Pwo-Polyme ase (2,5 U/µl)
0,5
µl
H2O
ad 50
µl
Ma e ial und Me hoden
31
Tempe a u p og amm:
Tempe a u
Zei
Zyklen
Vo gang
95 °C
5 min
1
ini iale Dena u ie ung
95 °C
30 s
Dena u ie ung
65 °C
45 s
35
P ime -Anlage ung
72 °C
70 s
Elonga ion
72 °C
7 min
1
e länge e Ex ension
4 °C
gehal en
Lage ung
2.2.7 Enzyma ische Modi ika ion on DNA
2.2.7.1 Spal ung mi els Res ik ionsendonukleasen
Mi Hil e on Res ik ionsendonukleasen kann DNA sequenzspezi isch an Res ik ions-
schni s ellen gespal en we den. De Ve dau e olg e mi om Enzymhe s elle angegebenen
Reak ionspu e und Enzymkonzen a ion s anda dmäßig in einem 50 µl-Ansa z. Die Inkuba-
ionsdaue ich e e sich dabei nach dem jeweiligen Enzym bzw. Ansa z und a iie e on 1 h
bis ÜN. Ve dau-Ansä ze mi meh e en Enzymen wu den bei gleichen Reak ionsbedingungen
simul an du chge üh , ansons en e olg en sie sequen iell.
2.2.7.2 Dephospho ylie ung de 5`-Enden de Vek o en
Um wäh end de sich anschließenden Liga ion eine Religa ion de Vek o enden nach einem
Res ik ions e dau zu e hinde n, wu den die eien 5`-Enden mi els alkalischen Phospha ase
aus Ga nelen (sh imp alkaline phospha ase, SAP) nach He s elle angaben dephospho ylie .
2.2.7.3 Liga ion
Liga ion on DNA-F agmen en e möglich die ko alen e Ve knüp ung eie
5`-Phospha enden mi 3`OH-Enden. Dazu wu den ca. 100 ng Vek o -DNA in einem 20 µl-
Ansa z eingese z . Die Menge des zugegebenen Inse s a iie e je nach G öße on 1-10 x
mola em Übe schuss. S anda dmäßig wu den Liga ionen mi de T4-Ligase ü 15 min bei RT
in Quick Liga ion Bu e du chge üh . Anschließend e olg e die T ans o ma ion chemisch
kompe en e E. coli-Zellen (DH10B).
Quick Liga ion Bu e (2x)
132 mM
T is-HCl, pH 7,6
20 mM
MgCl2
2 mM
DTT
15 %
PEG 6000
2 mM
ATP ( isch zuse zen)
Ma e ial und Me hoden
38
2.3.4.1 S a ische Lich s euung
S a ische Lich s euung e möglich die Bes immung de absolu en mola en Masse und des
absolu en mi le en quad a ischen Radius (T äghei s adius) ohne den Einsa z on S anda ds
(Zimm, 1948a). Die Menge des S eulich es, ode genaue das Rayleigh-Ve häl nis Rθ ( ü
θ → 0) is dabei p opo ional dem P oduk aus mola e Masse und Konzen a ion.
(Gl. 2-1)
mi Iθ: S eulich in ensi ä bei Winkel θ
IθLS: S eulich in ensi ä des Lösungsmi els bei Winkel θ
I0: In ensi ä des einges ahl en Lich s
: Abs and zwischen S euzen um und De ek o
V: Volumen de Messzelle
MW: mola e Masse
Die Bes immung de mola en Masse e olg nach de Zimm-Gleichung des Rayleigh-Debeye-
Gans-Modells de Lich s euung e dünn e Polyme lösungen (Zimm, 1948b):
(Gl. 2-2)
mi K = 4π2(dn/dc)2n02NA-1λ0-4 (n0: B echungsindex des Lösungsmi els, NA: A ogad o-Kons an e,
λ: Wellenlänge des einges ahl en Lich s)
c: Konzen a ion des Polyme s (g/ml)
: Rayleigh-Ve häl nis
MW: mola e Masse
A2: zwei e Vi ialkoe izien
: Fo m ak o (s. un en)
Aus de Winkelabhängigkei de Lich s euung läss sich zudem ein Fo m ak o ode
S eu unk ion P(θ) bes immen (Abb. 2.1). Aus diese wi d de mi le e quad a ische Radius
be echne , welche du ch Gleichung (2-3) besch ieben wi d. Eine Winkelabhängigkei de
S euung i alle dings nu bei sog. aniso open S eue n, d. h. e s ab eine bes imm en
Pa ikelg öße, au . Die G enze is dabei abhängig on de e wende en Wellenlänge und lieg
bei dem hie e wende en Lase (λ = 690 nm) bei e wa 10 nm.
Abb. 2.1: S eu unk ion P(θ) de
Winkelabhängigkei de S eulich in ensi ä
on dem absolu en mi le en quad a ischen
Radius < g2>.
∑
(Gl. 2-3)

Ma e ial und Me hoden
39
Die benö ig e P o einkonzen a ion wu de mi Hil e des angeschlossenen UV-De ek o s bzw.
Re ak ome e s un e Ve wendung de jeweiligen heo e ischen mola en Ex ink ions-
koe izien en (s. 2.5.1) bzw. des B echungsindex-Ink emen s (dn/dc) e mi el . Als übliche
We on P o einen in wäss ige Lösung wu de ein dn/dc on 0,185 angenommen.
2.3.4.2 Dynamische Lich s euung
Im Gegensa z zu s a ischen Lich s euung wi d du ch dynamische ode quasi-elas ische
Lich s euung de hyd odynamische Radius on Molekülen e mi el . Dies be uh au de
Messung de Bewegung de Teilchen im Rahmen de B aunschen Molekula bewegung.
Abhängig on de Di usionsgeschwindigkei de Teilchen we den In e e enzen, und dami
Un e schiede in de In ensi ä des S eulich s, e zeug . Da aus läss sich un e Kenn nis de
Viskosi ä des Lösungsmi els de hyd odynamische Radius bes immen (S okes-Eins ein-
Gleichung).
(Gl. 2-4)
mi k: Bol zmann-Kons an e
T: absolu e Tempe a u
η: Viskosi ä de Lösung
D: Di usionskoe izien
2.3.5 Hochleis ungs lüssigkei sch oma og aphie (HPLC)
Die Hochleis ungs lüssigkei sch oma og aphie (HPLC) is ein Flüssigch oma og aphie-
Ve ah en, bei de eine mobile Phase un e hohem D uck übe die s a ionä e Phase
anspo ie wi d. Die T ennung e olg du ch die Ve eilung de Analy en zwischen mobile
und s a ionä e Phase. In de o liegenden A bei wu de eine Umkeh phasench oma og aphie
du chge üh , d. h. es wu de eine unpola e Säulenma ix, sowie eine pola e mobile Phase
e wende . Du ch G adien enelu ion mi s eigendem Gehal an o ganischem Lösungsmi el
we den die Wechselwi kungen de P obe mi dem Säulenma e ial geschwäch und die P obe
bei Übe sch ei en eine k i ischen Konzen a ion on de Ma ix abgelös .
Die Messung e olg e an einem JASCO HPLC Sys em (PU 2080Plus, UV De ek o
UV 2075Plus und Fluo eszenzde ek o FP 2020Plus) mi eine Phenomenex Säule (Jupi e 5u
C-4 300A, 250x4.6 mm). Eluie wu de mi eine Fluss a e on 1 ml/min ü 5min mi 2 %
Pu e B, ge olg on einem linea en G adien en on 2-50 % Pu e B übe 20 min. Die
De ek ion e olg e mi els Abso p ionsmessung bei 280 nm, sowie Messung de Fluo eszenz
(Fluo escein-ma kie e P o eine) bei eine An egungswellenlänge on 490 nm und eine
Emissionswellenlänge on 530 nm.
Pu e A: 0,1 % ( / ) T i luo essigsäu e in H2O
Pu e B: 0,1 % ( / ) T i luo essigsäu e in 90 % Ace oni il
Ma e ial und Me hoden
40
2.3.6 MALDI-TOF Massenspek ome ie
Zu massenspek oskopischen Analyse on P o einen eigne sich das MALDI-TOF
Ve ah en. Es se z sich zusammen aus de Ionisie unga MALDI (ma ix-assis ed lase
deso p ion and ioniza ion) und de Massenanalyse mi els ime-o - ligh (TOF). Die P o eine
we den dabei in eine Ma ix eingebe e . Du ch An egung mi Lase s ahlung ( e wende wu de
ein S icks o -Lase mi eine Wellenlänge on 337 nm, Beschleunigungsspannung 20 kV) e olg
ein Phasenübe gang, bei dem Moleküle de Ma ix, sowie des da in eingebe e en P o eins
explosionsa ig he ausgelös we den (Lo speich & Zo bas, 1998). Du ch die in de Ma ix
o handene Säu e we den P o einionen gebilde , welche nach de ini ialen Beschleunigung in
einem elek ischen Feld ohne Anlegen wei e e K ä e d i en. Die Flugzei de Ionen is
p opo ional zu dem Quo ien en aus Masse/Ladung, was die Bes immung de Masse de Ionen
e möglich .
Fü die Analyse mi els MALDI-TOF wu den die ekombinan en Spinnenseidenp o eine
gegen 5 mM T is-HCl pH 8 dialysie und mi de Ma ixlösung (20 mg/ml Sinapinsäu e,
50 % Ace oni il, 0,1 % T i luo essigsäu e) e misch (Endkonzen a ion des P o eins:
20 µM).
2.4 P o einp äpa a i e Me hoden
2.4.1 Dialyse
Da die in diese A bei he ges ell en P o eine nach Reinigung und Ge ie ocknung nich
di ek in wäss igen Pu e n löslich sind, wu den die P o eine in 6 M Guanidinuim hiocyana
dena u ie und anschließend du ch Dialyse in den gewünsch en Pu e übe üh . Die dazu
e wende en Dialyseschläuche (Spec a/Po , MWCO 6000-8000 Da) wu den in Wasse
au gekoch , in 20 % E hanol au bewah und o Benu zung meh mals mi H2OMQ gespül .
Dialysie wu de gegen 1000-3000- aches Volumen des gewünsch en Pu e s ü 3 h bei RT
(wobei de Pu e d eimal e neue wu de), bzw. ÜN (mi zweimaligem Pu e wechsel). De
le z e Dialysesch i wu de hie bei 4 °C du chge üh . Je nach Anwendung wu den
e schiedene Pu e e wende , z. B. 10 mM T is/HCl pH 8 ( ü Analysen), 10 mM HEPES
pH 7 ü Thiol-Kopplung bzw. 5 mM NH4HCO3 zum Gießen on Filmen aus wäss ige
Lösung.
2.4.2 Reduk ion und Ca boxyme hylie ung
Zu Reduk ion de eilweise Disul id- e b ück o liegenden Cys-P o eine (n agCysC16,
C*C16 und C16C*) wu de sowohl DTT als auch TCEP e wende . Die op imalen
Reak ionsbedingungen wu den empi isch e mi el , wobei jeweils 10- ache bzw. 100- ache
Ma e ial und Me hoden
41
mola en Übe schuss an Reduk ionsmi el (in Pu e mi pH 7-8) zugese z und ü
e schiedene Zei bei RT inkubie wu de. De E olg de Reduk ion wu de mi els SDS-
PAGE ohne Zusa z on β-Me cap oe hanol übe p ü .
Um das (Wiede -)Ausbilden on Disul idb ücken unabhängig om Redoxpo en ial de
Umgebung zu e hinde n, wu den eie Thiolg uppen ca boxyme hylie . Hie zu wu de
Iodace amid e wende (Gu d, 1972). Du ch nukleophile Subs i u ion des Iod du ch ein
Thiola ion wi d dabei ein Thioe he ausgebilde , welche un e neu alen Bedingungen s abil
is . Nach e olg e Reduk ion (meis ü 1 h mi 10x Übe schuss an TCEP bzw. 20x
Übe schuss DTT) wu den 100 mM Iodace amid zugegeben. Die Reak ion e olg e ü 1 h bei
RT. Je nach sich anschließende Anwendung bzw. Analyse wu den die zugese z en Agenzien
gegebenen alls du ch Dialyse en e n .
2.4.3 Bes immung eie Thiolg uppen mi Ellmans Reagens (DTNB)
Zu Bes immung eie Thiolg uppen nach Reduk ion de Cys-P o eine wu de das
Reduk ionsmi el du ch eine En salzungssäule (PD-10, GE Heal hca e) en e n . 750 µl de
e hal enen P o einlösung (0,75-1 mg/ml in 20 mM HEPES, pH 7) wu den mi 30 µl DTNB-
Lösung (4 mg/ml DTNB (5,5`-Di hio-bis(2-ni obenzoesäu e)) in 100 mM T is/HCl pH 8,
1 mM EDTA) e se z und 15 min bei RT inkubie . Anschließend wu de die Abso p ion bei
412 nm bes imm und um den Abso p ionswe des Kon ollansa zes ohne P o ein (10 mM
HEPES pH 7 mi DTNB-Lösung) ko igie .
Die Anzahl eie Thiolg uppen p o P o einmolekül e gab sich aus Gl. 2-5:
(Gl. 2-5)
mi c: P o einkonzen a ion (mol/l)
ε412nm (DTNB-SH): 13 600 M-1 cm-1; ε276nm (n agCysC16): 47 680 M-1 cm-1
2.4.4 Redox i a ion
Mi Hil e eine Redox i a ion wu de das Redoxpo en ial de Cys ine de Cys-Va ian en on
eADF4(C16) abgeschä z . In Anlehnung an das ü die Cys ine de NR-Regionen on ADF3
und ADF4 en wickel e P o okoll (Huemme ich, 2004) wu de dazu ein au DTT basie endes
Redox-Pu e sys em e wende . Das S anda dpo en ial bei pH 7 (E0‘) lie g dabei bei -332 mV
(Cleland, 1964). In eine zweis u igen Reak ion wi d das Cys in (übe die Zwischens u e
eines gemisch en Disul ids) du ch DTT zu 2 Cys einen eduzie , wobei de zwei e
Reak ionssch i mi eine um den Fak o 104 höhe en Gleichgewich skons an e abläu
(Cleland, 1964). Dadu ch e läu die Reduk ion quan i a i , was die Auswe ung de
Redox i a ion e leich e , da mögliche Zwischenp oduk e e nachlässig we den können.
Ma e ial und Me hoden
42
Die P o eine wu den in eine Konzen a ion on 0,5 mg/ml in en gas en Lösungen mi
e schiedenen Redoxpo en ialen ü 1 h bei RT inkubie . Das Po en ial de Lösung
be echne e sich dabei aus dem Mischungs e häl nis on DTTox ( ans-4,5-Dihyd oxy-1,2-
di hian) und DTT ed (Di hio h ei ol) nach de Ne ns schen Gleichung (s. un en). Anschließend
wu den eie Thiole ca boxyme hylie , die P oben mi Hil e eines 4-20 %-igen T icine Gels
(Se aGelTM) au ge enn und die P o einbanden du ch Silbe ä bung sich ba gemach .
Aus de Ne ns -Gleichung abgelei e en sp ich das Po en ial de jenigen Lösung, in de die
P o eine zu gleichen Teilen als Monome und Dime o lagen, dem S anda d-Redoxpo en ial
ih es Cys ins.
Ne ns -Gleichung:
(Gl. 2-6)
mi E’: Redoxpo en ial bei pH 7
E0’: S anda dpo en ial bei pH 7
R: Gaskons an e
T: absolu e Tempe a u
n: Anzahl de Elek onen
F: Fa adaykons an e
[ ed], [ox]: Konz. de eduzie en bzw. oxidie en Spezies
Ti ie lösung (en gas ):
0,5 mg/ml
100 mM
1 mM
20 mM
P o ein
MOPS pH 7
EDTA
DTT (oxidie bzw. eduzie )
Tabelle 2.1: Mischungs e häl nisse on on DTTox ( ans-4,5-Dihyd oxy-1,2-di hian) und DTT ed
(Di hio h ei ol) sowie das da aus esul ie ende Redoxpo en ial
DTT ed
DTTox
Redoxpo en ial [V]
0.18
99.82
-0.25
0.39
99.61
-0.26
0.86
99.14
-0.27
1.87
98.13
-0.28
4.04
95.96
-0.29
8.51
91.49
-0.30
17.03
82.97
-0.31
31.18
68.82
-0.32
50.00
50.00
-0.33
68.82
31.18
-0.34
2.4.5 Filmp äpa a ion
P o ein ilme wu den du ch Gießen eine P o einlösung au ein Subs a und anschließendes
Abdamp en des Lösungsmi els he ges ell . Bei Wahl geeigne e Pa ame e en s eh dabei aus
ekombinan en Spinnenseidenp o einen ein s abile , anspa en e Film, de , je nach
e wende em Subs a und Filmdicke, on dem Subs a abgezogen we den kann. Die Dicke
Ma e ial und Me hoden
43
des en s ehenden Films kann dabei übe die e wende e P o einkonzen a ion bzw. die
P o einmenge p o Fläche einges ell we den.
In diese A bei wu den Filme aus eADF4(C16) sowie de Cys-P o eine n agCysC16, C16C*
und C*C16 aus Lösungen in HFIP, Ameisensäu e und Pu e he ges ell . Die
P o einkonzen a ion be ug dabei in Pu e 3 mg/ml (0,3 % (w/ )), in den o ganischen
Lösungsmi eln wu de sie je nach Ve wendungszweck und Subs a a iie . Zu He s ellung
dicke Filme (≥ 1 mg/cm2) wu den 3-4 %-ige (w/ ) Lösungen e wende , ü dünne Filme
(z. B. 0,15 mg/cm2) 0,3-1 %-ige (w/ ) Lösungen. Um e en uell wäh end de Dialyse in
wäss igen Pu e en s andene Agg ega e aus de Lösung zu en e nen, wu den wäss ige
P o einlösungen di ek o Gießen des Filmes ü 1 h bei 10 °C mi 55.000 pm zen i ugie .
In den o ganischen Lösungsmi eln wa en alle P o eine di ek löslich.
Als Subs a e kamen Polys y ol – in Fo m on Pe ischalen und Zellkul u pla en – sowie
Te lon und Glas zum Einsa z.
Um die Bedingungen de Filmhe s ellung, - ocknung sowie -lage ung möglichs kons an
und ep oduzie ba zu hal en, wu den die Filme in eine Kamme mi kon ollie ba e
Lu euch igkei he ges ell . Sowei nich ande s angegeben, wu de die ela i e
Lu euch igkei (LF) bei 30 % gehal en. Die T ocknung de Filme e olg e ü mindes ens
4 h, meis ÜN.
Zu (op ionalen) Nachbehandlung wu den die Filme ÜN mi de en sp echenden Lösung
(Me hanol ode E hanol abs. bzw. 70 % ode 1 M Kaliumphospha pH 8) übe schich e und
ÜN bei kon ollie e LF inkubie . Um ein o zei iges Ve damp en des Alkohols zu
e meiden, wu den die übe schich e en Filme leich abgedeck .
2.4.6 Kopplung an Thiole de Cys-Va ian en on eADF4(C16)
Zu Modi izie ung de Cys eine in n agCysC16, C16C* sowie C*C16 wu den Maleimid-
unk ionalisie e Agenzien e wende . Die Reak ion on Maleimid mi Thiolen is sowohl
spezi isch als auch e ek i (Hei z e al., 1968; Pa is e al., 1983), wobei die Spezi i ä de
Reak ion pH-We abhängig is . Bei pH 7 beispielsweise is die Reak i i ä gegenübe Thiolen
e wa 1000- ach höhe als gegenübe p imä en Aminen (B ewe & Riehm, 1967). Bei
E höhung des pH-We s s eig die Nukleophilie des Amins, und die Spezi i ä de Reak ion
ü Thiole sink demen sp echend. De Reak ionsmechanismus bes eh in eine Addi ion des
Thiols an das α,β-ungesä ig e Sys em des Maleimids un e Ausbildung eines s abilen
Thioe he s (Michael-analoge Addi ion), wie im Folgenden ü die Reak ion on n agCysC16
mi Fluo escein-5-Maleimid gezeig is .

Ma e ial und Me hoden
44
Abb. 2.2: Reak ion on Fluo escein-5-Maleimid mi n agCysC16
Rekombinan e Cys-P o eine wu den sowohl in Lösung als auch nach Assemblie ung zu
Filmen mi els Reak ion mi Maleimid-G uppen modi izie .
2.4.6.1 Kopplung in Lösung
In Lösung wu de Fluo escein-5-Maleimid sowie mi SMCC (Succinimidyl ans-4-
(maleimidylme hyl)cyclohexan-1-ca boxyla und Fluo escein modi izie es RGD-Pep id
c(RGD K) (Abb. 3.23 a und 2.1.1.2) an n agCysC16 ange üg . Analog dazu e olg e die
Kopplung des analogen, Fluo escein- eien, zyklischen RGD-Pep ids.
Nach Dialyse und Reduk ion des P o eins (2 mg/ml in 10 mM HEPES pH 7) mi 10- achem
mola em Übe schuss an TCEP ü 1 h wu de das zu koppelnde Maleimid aus eine 20 mM
S ammlösung in DMF in 10-15- achem mola en Übe schuss zugegeben und un e Lich -
ausschluss ü 2 h bei RT inkubie . Um das (modi izie e) P o ein on übe schüssigem
Maleimid zu ennen, wu de es du ch Zugabe on Kaliumphospha pH 8 (Endkonzen a ion
1 M) ge äll . Bei diese quan i a i en Fällung bilden eADF4(C16), sowie seine Cys-Va ian en
β-Fal bla - eiche, wasse unlösliche Mik okugeln (Slo a e al., 2008). Diese wu den du ch
d eimaliges Waschen (Zen i uga ion jeweils 15 min bei 13300 pm) mi H2OMQ on
es lichem Reagens abge enn . Anschließend konn e das P o ein lyophilisie und gelage
we den ode wu de zu wei e en Analyse in 6 M Guanidinum hiocyana gelös und gegen
10 mM T is/HCl pH 8 dialysie .
Die Kopplungse izienz wu de aus de Abso p ion bei 280 nm und 493 nm nach Gleichung
2-7 be echne :
(Gl. 2-7)
mi P o einkonzen a ion
; Ko ek u ak o
ε276nm (n agCysC16): 47 680 M-1 cm-1; ε493nm (Fluo escein-Maleimid): 70 000 M-1 cm-1
n agCysC16
Ma e ial und Me hoden
45
2.4.6.2 Kopplung an assemblie e Filme
Zu Modi ika ion be ei s zu Filmen assemblie e Cys-eADF4(C16)-P o eine wu den die
Filme s anda dmäßig aus eine 1 % (w/ ) P o einlösung in HFIP he ges ell . Je nach wei e e
Ve wendung wu den sie in 24-well Pla en (Fläche de Ka i ä 1,1 cm2, Ma e ial: Polys y ol)
bzw. 96-well Pla en (Fläche 0,33 cm2, Ma e ial: Polys y ol) gegossen. Du ch Me hanol abs.-
Behandlung wu den die Filme wasse unlöslich gemach . Zu Reduk ion de Disul ide wu de
TCEP-Lösung (4 mM in 100 mM HEPES pH 7) zugegeben. Nach 1,5 h bei RT wu de das zu
koppelnde Maleimid-Konjuga aus eine S ammlösung (bei Fluo escein in DMF, ansons en
im jeweiligen Pu e ) in die TCEP-Lösung pipe ie (10 x mola e Übe schuss) und 2-4 h bei
RT ode ÜN bei 4 °C au eine Schwenkpla e inkubie . Um ungebundene Agenzien zu
en e nen, wu den meh e e Waschsch i e du chge üh (2 x 0,1 M HEPES pH 7, 0,1 % ( / )
Tween 20; 1 x 0,1 M HEPES pH 7; 1 x 0,1 M HEPES pH 7, 1 M NaCl; 2 x 0,1 M HEPES
pH 7; 2 x H2OMQ). Du ch Tween 20 we den hie bei hyd ophobe und du ch Na iumchlo id
elek os a ische Wechselwi kungen un e bunden.
Zu Analyse wu de die e olg e Kopplung en wede di ek au den Filmen ode nach Lösen in
6 M Guanidinium hiocyana und anschließende Dialyse un e such . Fluo escein (Flo escein-
X5-Maleimid sowie Fluo escein-ma kie es c(RGD K)) wu de mi els eines Fluo eszenz-
Image s (E an DIGE, GE Heal hca e; An egung: 480 nm, Emission: 530 nm) ode im
Fluo eszenzspek ome e (Jasco FP-6500; s. 2.5.2) de ek ie . Gebundenes Maleimid-PEO2-
Bio in wu de sowohl au dem Film als auch nach Au lösen des Films und Du ch üh en eines
Wes e nblo s übe die spezi ische Reak ion mi S ep a idin-AP nachgewiesen. Nach
Waschen (s. oben) wu de gebundene alkalische Phospha ase (AP) du ch Zugabe eine
BCIP/NBT-Subs a lösung isualisie , wobei ein bläulich-lila Niede schlag gebilde wi d.
Kopplung on Nanogold
Zu Kopplung on Goldpa ikeln (Monomaleimido-Nanogold, Nanop obes) wu den dünne e
Filme aus 5 µl 0,1 % (w/ ) P o einlösung in HFIP di ek au unbeschich e e TEM-Ne zchen
(400 mesh, e golde , Plano) gegossen. Bei dicke e P o einschich konn en die Goldpa ikel
im TEM au g und de hohen Abso p ion des P o eins nich selek i de ek ie we den. Die
Kopplung e olg e di ek au den Ne zchen, wobei diese au Ge äße mi de jeweiligen
Inkuba ionslösung mi de Obe läche nach un en au geleg wu den. Nach Vo behandlung de
Filme wie oben besch ieben e olg e die Kopplungs eak ion in 2 mM Na iumphospha
pH 6,5, 0,1 mM EDTA, 15 mM NaCl, 1 mM TCEP bei 4 °C. Wiede um wu de g ündlich
gewaschen, um ungebundenes Nanogold zu en e nen. Immobilisie e Pa ikel wu den du ch
Inkuba ion mi GoldenhanceTM (Nanop obes) nach He s elle angaben e s ä k . Je nach
Ma e ial und Me hoden
46
Inkuba ionsdaue lage sich dabei eine un e schiedlich dicke Goldschich spezi isch an den
Goldpa ikeln ab. Ve s ä kung ü 2 min lie e e beispielsweise Pa ikel mi 2-5 nm
Du chmesse . Die Analyse de modi izie en Filme e olg e mi els T ansmissions-
elek onenmik oskopie (s. 2.6.3).
Kopplung on β-Galak osidase
Das Enzym β-Galak osidase wu de übe einen he e obi unk ionellen C osslinke (NHS-
PEO12-Maleimid, s. 2.1.1.2) an Spinnenseiden ilme gebunden. N-Hyd oxysuccinimid-Es e
eagie en un e F eise zung on N-Hyd oxysuccinimid haup sächlich mi p imä en Aminen.
Dabei bilden sich s abile Amidbindungen aus. Um s e ische Hinde ungen bei de Kopplung
zu minimie en, wu de mi PEO12 ein lange Space gewähl .
In einem e s en Reak ionssch i wu de β-Galak osidase (10 mg/ml in PBS pH 7,5) ü 2 h bei
4 °C un e Ro ie en mi 2 µl C osslinke inkubie . Übe schüssige Linke wu de anschließend
mi els eine En salzungssäule (Sephadex G25, GE Heal hca e) en e n . Zu Elu ion des
Enzyms wu de 100 mM HEPES pH 7 e wende . Diese Lösung wu de au be ei s eduzie e
Filme gegeben und un e Zusa z on 2 mM TCEP ÜN bei 4 °C geschwenk . Die
nach olgenden Waschsch i e e olg en analog zu den oben besch iebenen. Um die
Enzymak i i ä de β-Galak osidase nachzuweisen, wu de X-Gal (5-B om-4-chlo -3-indoxyl-
β-D-galac o-py anosid) in Inkuba ionspu e (s. un en) als Subs a zugegeben. Du ch
enzyma ische Spal ung wi d da aus das ie blaue 5,5‘-Dib om-4,4‘-dichlo -indigo gebilde .
Inkuba ionspu e ü X-Gal:
100 mM
10 mM
1 mM
50 mM
0,2 mg/ml
Na iumphospha pH 7
KCl
MgSO4
β-Me cap oe hanol
X-Gal (aus S ammlösung in DMSO)
2.5 Spek oskopische Me hoden
2.5.1 UV-Vis Abso p ionsspek oskopie
Die Me hode de UV-Vis-Abso p ionsspek oskopie wu de zu Konzen a ionsbes immung
de P o eine in Lösung sowie on Fluo escein e wende . De Zusammenhang zwischen
Konzen a ion, wellenlängenabhängigem Ex ink ionskoe izien en und gemessene Ex ink ion
is im Lambe -Bee schen Gese z besch ieben:
(Gl. 2-8)
mi Eλ: Ex ink ion bei de Wellenlänge λ
ελ: mola e Ex ink ionskoe izien bei Wellenlänge λ
c: (P o ein)-Konzen a ion (mol/l)
d: Schich dicke de Kü e e (cm)
Ma e ial und Me hoden
47
De Ex ink ionskoe izien läss sich ü P o eine aus de en P imä s uk u e mi eln. Den
Haup bei ag zu Abso p ion im P o einspek um lie e n dabei T yp ophan und Ty osin,
sowie in ge inge em Ausmaß auch Phenylalanin und Cys in (Can o & Schimmel, 1980; Pace
& Schmid, 1997). Fü die e wende en ekombinan en Spinnenseidenp o eine wu de de
Ex ink ionskoe izien basie end au de Me hode nach Gill und Hippel bzw. Pace e al. mi
Hil e des P og amms P o Pa am (h p://www.expasy.o g/ ools/p o pa am.h ml) nach
olgende Fo mel bes imm (Gill & on Hippel, 1989) (Pace e al., 1995):
(Gl. 2-9)
Tabelle 2.2: Ex ink ionskoe izien en de in de A bei e wende en ekombinan en Spinnenseidenp o eine
P o ein
Mola e Ex ink ions-
koe izien (M-1 cm-1)
eADF4(C16)
ε276nm = 46400
n agCysC16
ε276nm = 47680
C*C16, C16C*
ε276nm = 50680
2.5.2 Fluo eszenzspek oskopie
Die Fluo eszenzspek oskopie basie au de An egung on Elek onen eines Fluo opho s
du ch Lich bes imm e Wellenlänge und anschließende Emission elek omagne ische
S ahlung bei Rückkeh de ange eg en Elek onen in ih en G undzus and. Dabei is die
emi ie e S ahlung ene gieä me , d. h. langwellige , als die des An egungslich s (S okes-
Ve schiebung). In diese A bei wu de eine sei s die au den a oma ischen Aminosäu en
T yp ophan und Ty osin be uhende in insische Fluo eszenz on P o einen zu Abschä zung
de Reinhei de ekombinan en P o eine e wende , da diese kein T yp ophan besi zen.
Ande e sei s wu de die spezi ische Fluo eszenz des Fa bs o s Fluo escein eingese z , um
anhand eine au genommenen S anda dge aden die Menge an Fluo escein in eine P obe, und
dami die Kopplungse izienz bei Ma kie ung de Cys-P o eine, zu bes immen.
Die Pa ame e de An egung und Emissionsau nahme wu den wie olg gewähl :
De ek ion on
An egungswellenlänge
Au nahme de Emission
Ty /T p
275 nm
290-400 nm
T p
295 nm
310-400 nm
Fluo escein
492 nm
500-550 nm
Die An egungsbandb ei e be ug 3 nm, die Emissionsbandb ei e 5 nm, und die Dämp ung
0,5 s. Alle Spek en wu den um die Pu e luo eszenz ko igie .
Ma e ial und Me hoden
54
Zu 3D-Da s ellung de Au nahmen sowie zu E mi lung de mi le en Rauhei Ra und de
Rau ie e wu de die So wa e Nanoscope 6.14 1 (Veeco Ins umen s Inc.) e wende . P o Film
wu den meh e e Scans mi Flächen zwischen 1 µm2 und 1600 µm2 an 3-5 zu ällig gewähl en,
un e schiedlichen S ellen au genommen. Zu Bes immung de Rauhei swe e wu den meh e e
Ausschni e (mi 1 bzw. 25 µm2) gemi el . Die mi le e Rauhei Ra en sp ich dabei dem
a i hme ischen Mi el de Abweichung jedes einzelnen Messpunk es on de Mi ellinie,
wäh end die Rau ie e den maximalen Abs and zwischen höchs en und nied igs en Punk de
un e such en Fläche angib .
2.6.3 T ansmissionselek onenmik oskopie (TEM)
Zu De ek ion gekoppel e Nanogold-Pa ikel au Spinnenseiden ilmen wu den diese wie
un e 2.4.6.2 besch ieben au Goldne zchen („g ids“, 400 mesh, Plano) p äpa ie und mi els
T ansmissionselek onenmik oskopie (TEM) analysie . Dabei wi d die P obe on Elek onen
du chs ahl und au einem Leuch schi m bzw. Film abgebilde . Die Messungen e olg en an
einem 100 CX T ansmissionselek onenmik oskop (Jeol) bei eine Anodenspannung on
100 kV und wu den eundliche weise on Be ina Rich e (AG P o . Johannes Buchne ,
Leh s uhl ü Bio echnologie, TU München) du chge üh .
2.6.4 Ras e elek onenmik oskopie (REM)
Mi els Ras e elek onenmik oskopie (REM) kann ein plas isches Abbild eine P oben-
obe läche übe einen wei en Ve g öße ungsbe eich mi hohe Tie enschä e und e hal en
we den. Das Messp inzip be uh au einem ein gebündel en Elek onens ahl, de Zeile ü
Zeile übe die Obe läche eine P obe ge üh wi d und im Hoch akuum mi diese
wechselwi k . Dabei können e schiedene Signale mi un e schiedlichem In o ma ionsgehal
de ek ie we den. So lie e n Sekundä elek onen, welche du ch den au e enden
Elek onens ahl aus de P obenobe läche he ausgeschlagen we den, In o ma ionen übe die
Topog aphie de un e such en Obe läche. Zu ückges eu e Elek onen hingegen haben
höhe e Ene gie und bilden haup sächlich Un e schiede de Ma e ialzusammense zung
(hinsich lich de O dnungszahlen) ab.
Zu Analyse biologische P oben we den diese du ch Au damp en (spu e n) eine Schich
aus ypische weise Kohlens o , Gold ode Pla in lei ähig gemach . Ras e elek onen-
mik oskopischen Au nahmen on mi Gold bedamp en Spinnenseiden ilmen (gegossen au
Polys y ol) wu den am Leh s uhl Me allische We ks o e de Uni e si ä Bay eu h an einem
1540EsB C oss Beam Ras e elek onenmik oskop (Zeiss) on Claudia Blüm sowie Hend ik

Ma e ial und Me hoden
55
Ba gel, beide Leh s uhl Bioma e ialien, Uni e si ä Bay eu h, ange e ig . Die Beschleuni-
gungsspannung be ug ypische weise 3-5 kV bei einem A bei sabs and on 4-5 mm.
Um die Adhäsion und Mo phologie on Zellen au Spinnenseiden ilmen zu un e suchen,
muss en die Zellen zunächs ixie we den. Die P obenp äpa a ion e olg e in Zusammen-
a bei mi D . Raine De sch am F ied ich-Bau -Fo schungsins i u (FBI) ü Bioma e ialien
de Uni e si ä Bay eu h. REM-Au nahmen wu den eundliche weise on D . Raine De sch
sowie And eas Schmid (Leh s uhl Bioma e ialien, Uni e si ä Bay eu h) ange e ig .
Nach zweimaligem Waschen in PBS wu den die P oben zunächs in 2,5 % Glu a aldehyd-
Lösung in PBS (meh e e S unden) und anschließend ü 1 h in 0,3 % Glu a aldehyd, 0,2 M
Na iumcacodyla , 3% Pa a o maldehyd ixie . Nach Dehyd ie ung de P oben in eine
au s eigenden Ace on-Reihe (30-100 % Ace on) wu den die P oben K i isch-Punk -
ge ockne . Hie bei wi d das Ace on schonend du ch übe k i isches CO2 subs i uie (Bozzola
& Russell, 1999). Anschließend konn en die P oben mi Kohlens o und Gold bedamp und
as e elek onenmik oskopisch (bei Beschleunigungsspannung zwischen 10-15 kV) un e -
such we den.
2.7 Ma e ialanaly ische Me hoden
2.7.1 The mog a ime ische Analyse (TGA)
Um die he mische Bes ändigkei de Spinnenseiden ilme zu un e suchen, wu den sie eine
he mog a ime ischen Analyse (TGA) un e zogen. Bei diese Me hode wi d als Messg öße
die Masseände ung de P obe in Abhängigkei de Tempe a u und de Zei bes imm
(Eh ens ein e al., 1998). Vo gänge wie Ve damp en, Sublima ion ode Ze se zung de P obe
üh en dabei zu einem Gewich s e lus , wohingegen aus chemischen Reak ionen (Oxida ion)
ode Adso p ion eine Massezunahme esul ie en kann.
Die Messungen wu den am Leh s uhl ü Polyme e We ks o e de Uni e si ä Bay eu h on
U e Kuhn an einem TGA/SDTA 861e The mog a ime e (Me le Toledo) du chge üh . Die
Messgenauigkei de Mik owaage lieg hie bei 1 µg. 3-5 mg des jeweiligen un e
kon ollie e Lu euch igkei he ges ell en Films wu den in einen Aluminiumoxid-Tiegel
eingewogen und anschließend mi eine kons an en Heiz a e on 10 °C/min au 800 °C
e hi z . Um Oxida ions o gänge zu e hinde n und die Ve gleichba kei de Messung mi
DSC-Un e suchungen zu gewäh leis en, wu de de O en mi S icks o gespül (50 ml/min).
Das gemessene Gewich de P oben wu de jeweils ela i zum Ausgangsgewich in % ange-
geben. De Beginn eine Tempe a u abnahme wu de du ch den Schni punk de jeweiligen
Ma e ial und Me hoden
56
Tangen en bes imm . Als Tempe a u Tm eine Masseabnahme wu de diejenige Tempe a u
angegeben, bei de 50 % des jeweiligen Gewich s e lus s au e en. Die Messungen alle
Filme wu den als Duplika ( eilweise als T iplika ) du chge üh .
2.7.2 Dynamische Di e enzkalo ime ie (DSC)
Die dynamische Di e enzkalo ime ie (di e en ial scanning calo ime y, DSC) dien de
Bes immung de bei Umwandlungsp ozessen eiwe denden ode e b auch en Ene gie.
Gemessen wi d de Wä mes om
, d. h. die Wä memenge p o Zei einhei und Masse, in
Abhängigkei de Tempe a u und Zei (Eh ens ein e al., 1998). Hie zu we den die P obe und
eine Re e enz au eine wä melei enden T äge scheibe in einem O en e hi z . Finden in de
P obe endo he me bzw. exo he me P ozesse s a , so esul ie dies in eine Di e enz de
Tempe a u bzw. des Wä mes oms gegenübe de Re e enz.
Zu den endo he men Vo gängen zählen Schmelz- und Ve damp ungsp ozesse sowie Glas-
übe gänge. Le z e e e zeugen ypische weise einen endo he men Ve sa z in de Messku e.
Exo he me Signale hingegen we den beispielsweise du ch K is allisa ion ode Ze se zung
he o ge u en.
Die Messungen wu den an einem DSC/SDTA 821e Sys em (Me le Toledo), ausges a e mi
eine ke amischen Senso pla e mi 56- achem Au-AuPd Tempe a u ühle , am Leh s uhl ü
Polyme e We ks o e (Uni e si ä Bay eu h) on U e Kuhn du chge üh . Die P oben wu den
in e schließba e Aluminium-Tiegel eingewogen (3-4 mg) und un e S icks o a mosphä e
(20 ml/min) mi eine Ra e on 5 °C/min au geheiz . Als Re e enz dien e ein en sp echende
lee e Tiegel. Die P oben wu den en wede kon inuie lich on 20 °C au 400 °C ode zyklisch
e hi z , um bes imm e P ozesse besse au zulösen. So wu de zunächs au 110 °C e hi z , um
eies Lösungsmi el zu e damp en, und nach 10-minü ige Iso he me au -40 °C gekühl .
Op ional schloss sich da an ein wei e e Heizsch i bis 220 °C an, be o nach e neu em
Abkühlen de P obe au +20 °C bis au 400 °C geheiz wu de. Fü jede un e such e
Film a ian e wu den 2-3 unabhängige Messungen du chge üh . Zu Auswe ung de
e hal enen Messku en wu de eine Basislinie sub ahie .
2.7.3 Zugmessung
Zu Bes immung mechanische Eigenscha en de Filme wu de Zug e suche du chge üh .
Die Messung e olg e an Lu , d. h. mi ockenen Filmen, welche un e kon ollie en
Bedingungen (30 % ela i e Lu euch igkei ) he ges ell wu den, bei eine Lu euch igkei
on 41±1 % und 20±1 °C. Die Filme wu den mi einem Skalpell ode eine scha en
Rasie klinge in S ei en on 1,5-2 mm x 20 mm geschni en. Um Ve le zungen de P obe
Ma e ial und Me hoden
57
du ch das Einspannen in die Klemmbacken de Zugmaschine zu e meiden, wu den die
Films ei en mi Hil e eines Zweikomponen en-Epoxy-Klebe s au P oben äge aus s abilem
Papie be es ig (Abb. 2.4 a).
Die Ausspa ung des P oben äge s be ug 10 mm, was de An angsmesslänge en sp ich . Fü
die Messung wu de de P obenhal e in den Klemmbacken eines Uni e sal Tes e 5565
(Ins on) be es ig , de Papie s eg o sich ig du ch enn und anschließend die P obe du ch
einen Mo o mi eine kons an en Geschwindigkei on 0,2 mm/min auseinande gezogen.
Die dabei au gewende e K a wu de mi eine K a messdose mi eine Maximalbelas ung
on 10 N gemessen, de en Abweichung im ele an en K a be eich ≤ 0,2 % be ug. Die
gemessene K a wu de au den Que schni de jeweiligen P obe bezogen und somi als
Spannung gegen die Dehnung (Längenände ung ela i zu An angslänge) au ge agen. Um
die da ü benö ig e Dicke de Filme zu bes immen, wu de diese – wie auch die genaue B ei e
des S ei ens – ü jede P obe lich mik oskopisch bes imm . Die Dicke de Filme a iie e
. a. bei S ei en, welche aus dem Randbe eich des u sp ünglich gegossenen Films s amm en,
wäh end sie in den üb igen S ei en nu ge inge Abweichung zeig e und bei dem G oß eil de
un e such en P oben zwischen 10-12 µm lag.
Abb. 2.4: P obenp äpa a ion (a) und ypisches Spannungs-Dehnungs-Diag amm (b) des Zug e suchs an
ekombinan en Spinnenseiden ilmen. E: E-Modul (S eigung im linea -elas ischen Be eich). Spannung:
K a /Que schni s läche; Dehnung: Längenände ung/An angslänge x 100
Aus den ypische weise e hal enen Spannungs-Dehnungs-Diag ammen (Abb. 2.4 b) wu de
die Zug es igkei , d. h. die maximal e eich e Spannung σ, sowie die B uchdehnung e mi el .
Aus de S eigung im linea -elas ischen Be eich wu de de Elas izi ä smodul E=Δσ/Δε
be echne , welche ein Maß ü die S ei igkei de P obe da s ell .
Filme, die bei mik oskopische Be ach ung o de Messung Ve le zungen au wiesen ode
die wäh end de Messung z. B. an de Klemmbacke issen, wu den aus de Auswe ung
ausgenommen, so dass p o Film yp (Lösungsmi el, Nachbehandlungsme hode) die We e aus
10 mm
Ma e ial und Me hoden
58
8-14 Einzelmessungen gemi el wu den. Im Fall Me hanol-behandel e HFIP-Filme lag die
Zahl au g und de hohen B üchigkei nu bei 5 P oben.
Die Messungen wu den in Zusammena bei mi D . Raine Giesa (Labo ü Polyme -
e a bei ung, Mak omolekula e Chemie I, Uni e si ä Bay eu h) du chge üh .
2.7.4 Dynamisch mechanische Analyse (DMA)
Bei de dynamisch mechanischen Analyse (DMA) wi d die P obe eine sinus ö migen
dynamischen Belas ung ausgese z , welche in Abhängigkei de Tempe a u , F equenz
und/ode de Zei beobach e wi d (Eh ens ein e al., 1998). Messg ößen sind dabei die
Ampli ude de au gewende en K a und de Ve o mung sowie die Phasen e schiebung δ
beide Schwingungen (Abb. 2.5). Rein elas isches Ve hal en, d. h. keine Ve schiebung, i in
de Regel bei Fes kö pe n au . Ein Phasenwinkel on π/2 = 90° kennzeichne ein iskoses
Ve hal en. Visko-elas ische Ma e ialien schließlich zeigen Winkel zwischen beiden
Ex emen.
Aus den Messungen läss sich de komplexe Modul – bei Zugbelas ung de Elas izi ä s-
modul – bes immen. E se z sich zusammen aus dem Real eil, dem Speiche modul E`, und
dem Imaginä eil, dem Ve lus modul E``. De Speiche modul is ein Maß ü die S ei igkei
bzw. Fes igkei des Ma e ials und en sp ich de elas isch gespeiche en Ene gie. De
Ve lus modul hingegen spiegel die unwiede b inglich in ande e Fo m abgegebene Ene gie,
wie z. B. Wä me ode plas ische Ve o mung, wide . Als Maß ü das Ve häl nis beide
Komponen en dien de Ve lus ak o an δ. Mess echnische Vo ausse zung is dabei, dass die
P obe im linea -elas ischen Be eich beansp uch wi d.
Abb. 2.5: (a) Sinus ö mige Schwingung (Spannung) und An wo signal (Ve o mung) eines ein elas ischen
(g au), ein iskosen ( o ) bzw. isko-elas ischen (g ün) Ma e ials. δ: Phasenwinkel. (b) Schema ische
Messau bau de DMA. Films ei en wu den in eine Filmzugklamme eingespann , wobei de un e e, bewegliche
Teil die P obe mi eine kons an en Ampli ude bei o gegebene F equenz beansp uch . De Messau bau
be inde sich in einem O en, die Heiz a e be ug 2 °C/min.
Ma e ial und Me hoden
59
Zu Analyse wu den die Filme in S ei en mi 1-2 mm B ei e geschni en und in die Filmzug-
Klamme eine DMA 2980 (TA Ins umen s) eingespann (Abb. 2.5 b). Zunächs wu de ein
F equenzdu chlau ( equency sweep) du chge üh . Bei F equenzen < 0,5-1 Hz wu de ein
Fließ e hal en beobach e , wäh end sich ab e wa 5 Hz keine signi ikan en Ände ungen meh
e gaben. Demen sp echend wu den die olgenden empe a u abhängigen Messungen bei
1 und 5 Hz du chge üh . Um die Filme zu s ecken und in ge inge Vo spannung zu b ingen,
wu de eine s a ische An angsk a on 0,5 N angeleg . Die Ampli ude de Auslenkung wu de
au 0,08-0,1 % de bes imm en An angslänge es gese z . Mi Hil e eines O ens, welche den
Messau bau umgab, wu de mi eine kons an en Heiz a e on 2 °C/min au 300 °C geheiz .
Fü alle Filme e olg e eine Zwei-bzw. D ei achbes immung. Die zu Auswe ung benö ig e
Filmdicke wu de ü jeden S ei en indi iduell bes imm . Die Messungen e olg en am
Leh s uhl ü We ks o e a bei ung de Uni e si ä Bay eu h.
2.7.5 Kon ak winkelanalyse
Die Me hode de Kon ak winkelanalyse e möglich die Bes immung de Obe lächenene gie
es e Ma e ialien. Um Aussagen übe die Hyd ophobizi ä de Filmobe lächen zu e en,
wu de in diese A bei de Bene zungswinkel mi Wasse (liegende T op en) gemessen.
Hie zu wu de am Ende eine Kanüle, welche senk ech übe de zu un e suchenden P obe
angeb ach wa , ein T op en e zeug . Die P obe wu de mi Hil e eines T äge isches nach
oben ge ah en, um den T op en on de Kanüle abzunehmen. Mi eine Kame a wu de das
Bild des T op ens so o nach dessen Abse zen au de Obe läche es gehal en. Die
Auswe ung des Kon ak winkels e olg e nach Se zen eine Basislinie an de G enz läche
zwischen T op en und Obe läche mi els Laplace-Young-Fi .
Als Kon ak winkel θ wi d de Winkel zwischen dem Rand des Meniskus des T op ens und
de G enz läche es - lüssig bezeichne . Be ach e wi d dabei de D eiphasenpunk , in
welchem die Phasen gas/ lüssig/ es aneinande g enzen und im Gleichgewich s ehen (Kwok
& Neumann, 1999). Die Summe alle ang ei enden K ä e muss an diesem Punk gleich Null
sein und es e gib sich die Young-Gleichung:
(Gl. 2-13)
mi σs,g: Obe lächenspannung de es en Phase
σl,s: Obe lächenspannung de lüssigen Phase
σl,g: G enz lächenspannung zwischen beiden Phasen
Die Messungen e olg en am Leh s uhl Physikalische Chemie II de Uni e si ä Bay eu h.

Ma e ial und Me hoden
60
Abb. 2.6: Kon ak winkelanalyse. Fo o eines T op ens H2OMQ au einem Me hanol-behandel en eADF4(C16)
Film aus wäss ige Lösung gegossen au e schiedenen Subs a en: (a) Glas, (b) Polys y ol. (c) Kon ak winkel θ
und zugehö ige G enz lächenspannungen (s. Gl. 2-13) nach Young (modi izie nach Velzenbe ge e al., 2009).
2.8 Zellkul u echniken
Im Rahmen diese A bei wu den Zellen de Linie MC3T3-E1 (s. 2.1.3.2) e wende . Dabei
handel es sich um mu ine emb yonale Zellen de Schädeldecke, welche ib oblas ena ig
sind, abe auch zu Os eoblas en di e enzie en können. Das Wachs um e olg adhä en als
Monolage.
Alle Zellkul u a bei en wu den an eine Siche hei swe kbank (Klasse 2, He aSa e KS,
The mo Scien i ic) un e s e ilen Bedingungen ausge üh . Zen i uga ionssch i e wu den bei
≤ 1000 pm und RT du chge üh , alle e wende en Lösungen au 37 °C o gewä m .
2.8.1 Au auen, Kul i ie ung und Ein ie en on Zellen
Die Lage ung de Zellen e olg e bei -196°C in lüssigem S icks o . Aus Kul u kommend,
wu den sie nach Zen i ugie en ü 5 min zu eine Dich e on 1 x 107/ml in Ein ie medium
esuspendie . Hie zu wu de dem Medium DMEM (Dulbecco’s Minimal Essen ial Medium)
20 % ö ales Kälbe se um (FKS) sowie 10 % DMSO zugese z , um in azellulä e Eisk is all-
bildung en gegenzuwi ken. Al e na i wu de ein Fe igp oduk mi ähnliche Zusammen-
se zung (Gibco) e wende . Nach Übe üh en de esuspendie en Zellen in ein s e iles
K yoge äß wu den sie ÜN in einem mi Isop opanol ge üll en Ein ie ge äß bei -80 °C
gelage . De Alkohol gewäh leis e dabei eine langsame Abkühlung um 1 °C/min.
Anschließend wu den sie in lüssigen S icks o übe üh .
Um bei -196 °C gelage e Zellen in Kul u zu nehmen, wu den sie im Wasse bad (bei 37 °C)
au ge au und zügig mi PBS e dünn , um im Ein ie medium en hal enes DMSO zu
e dünnen. Nach Pelle ie en du ch 5-10-minü ige Zen i uga ion wu den die Zellen im
Kul u medium esuspendie und in Zellkul u laschen ausgesä (Inhal eines 1 ml K yoge äß
p o 25 cm2 Wachs ums läche).
Ma e ial und Me hoden
61
Die Kul i ie ung de Zellen e olg e bei 37 °C und 5 % CO2 in gesä ig e Wasse damp -
a mosphä e. Da es sich um adhä en und in Monolage wachsende Zellen handel , wu den sie
bei E eichen on 70-90 % Kon luenz passagie . Nach En e nen on Se um ücks änden
du ch Waschen mi PBS wu den die Zellen mi eine 0,05 %-igen T ypsin/EDTA-Lösung
(In i ogen) ü 2-5 min bei 37 °C abgelös , die Reak ion du ch Zugabe on Kul u medium
(3-5- ache Übe schuss) ges opp , die Zellen nach Zen i uga ion au neue Zellkul u laschen
e eil und mi ischem Medium au ge üll . Gespli e wu de dabei im Ve häl nis 1:3 bis 1:5.
Zu Bes immung de Zellzahl wu de ein Aliquo Zellen mi T ypanblau-Lösung (0,5 % in
PBS) e se z und mi Hil e eine Neubaue Zählkamme ausgezähl .
Kul u medium: DMEM (Dulbecco’s Minimal Essen ial Medium)
10 % FKS ( ö ales Kälbe se um)
1 % Penicillin/S ep omycin-Lösung (Endkonzen a ion 100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml
S ep omycin)
PBS: DPBS (Dulbecco's Phospha e-Bu e ed Saline) ohne Kalzium und Magnesium
2.8.2 Vi ali ä s-Tes WST (wa e soluble e azonium)-1
Zu Bes immung de Vi ali ä de Zellen nach Aussäen und Kul i ie ung au
Spinnenseiden ilmen wu de de Vi ali ä s es WST-1 (Roche) e wende . Das P inzip dabei
is die Umse zung des Te azoniumsalzes WST-1 (4-[3-(4-Iodophenyl)-2-(4-ni ophenyl)-2H-
5- e azolio]-1,3-Benzol-Disul ona ) du ch das Enzym mi ochond iale Succina -Te azolium
Dehyd ogenase zu wasse löslichem Fo mazan. Dies geh mi einem Fa bumschlag de Lösung
einhe ( on ö lich nach o ange), de pho ome isch du ch Messung de Abso p ion bei
450 nm quan i izie we den kann. Da das Enzym aus de mi ochond ialen A mungske e
s amm , gib de Tes Auskun übe die Mi ochond ienak i i ä de Zellen, was als ein Maß
ü de en Vi ali ä e wende wi d.
Die Messung e olg e in 96-well-Zellkul u pla en. Vo de Analyse wu de das al e Medium
o sich ig abgenommen, 100 µl isches Medium und 10 µl WST-1 Lösung zugegeben. Nach
3-4 h Inkuba ion bei 37 °C e olg e die Abso p ionsmessung bei 450 nm mi einem Mi h as
LB 940 Pla e eade (Be hold Technologies). Als Re e enz wu de de Abso p ionswe bei
630 nm abgezogen und alle We e um die Abso p ion eine Nega i kon olle ko igie ,
welche einen en sp echenden Film, Medium und WST-1 en hiel , jedoch keine Zellen. Alle
Messungen wu den in Vie achbes immung du chge üh .
2.8.2.1 Filmp äpa a ion
Die zu un e suchenden Filme wu den di ek aus de jeweiligen Lösung (P o einkonzen a ion
3 mg/ml; Filme 0,15 mg/cm2) in unbehandel e Zellkul u pla en ( ü Suspensionszellen,
Ma e ial und Me hoden
62
Sa s ed , Ma e ial: Polys y ol) gegossen und nach T ocknung ÜN mi de jeweiligen Lösung
nachbehandel . Bei nach ägliche Kopplung des zyklischen RGD-Pep ids c(RGD K) wu de
die Reak ion wie un e 2.4.6.2 besch ieben du chge üh .
Vo Aussäen de Zellen wu den die Filme zweimal mi PBS und einmal mi
Zellkul u medium gewaschen, um Rücks ände de Lösungsmi el zu en e nen.
2.8.2.2 Adhäsions es
Zu Bes immung de Zelladhäsion, welche in den e s en S unden nach Aussäen s a inde ,
wu den 4 x 104 Zellen p o well in 96-well Zellkul u pla en mi dem jeweiligen Film gegeben.
Da im Se um en hal ene Komponen en die Adhäsion beein lussen und so die Aussage übe
die di ek e In e ak ion de Zellen mi den Seiden ilmen e älschen können, wu de de Tes in
Medium mi bzw. ohne Zusa z on FKS du chge üh . In diesem Fall wu de dem Medium
1 % HSA (humanes Se umalbumin) zugese z . Die Anzahl de es adhä ie en Zellen wu de
nach ie s ündige Inkuba ion bei 37 °C bes imm . Hie zu wu de de Übe s and abgenommen
und zweimal mi PBS (je 200 µl) gewaschen, um lose Zellen zu en e nen. Anschließend
wu den 100 µl isches Medium zugese z und de Vi ali ä s es WST-1 du chge üh .
2.8.2.3 P oli e a ions es
Die P oli e a ion de Zellen au e schiedenen Filmen wu de übe meh e e Tage e olg . Die
An angszellzahl be ug 5 x 103 Zellen p o well. Nach jeweils 48 h wu de das Medium
gewechsel , wobei au g und de langen Inkuba ionsdaue nu das un e 2.8.1 angegebene
Zellkul u medium mi FKS e wende wu de. Nach e schiedenen Inkuba ionszei en wu de
die Zell i ali ä mi els WST-1 Assay bes imm .
Als Kon ollen ü den Adhäsions- sowie P oli e a ions es dien en unbeschich e e Zellkul u -
pla en in welche die Filme gegossen wu den (s. o.) als Nega i kon olle sowie ü gu e
Zelladhäsion op imie e Zellkul u pla en (NunclonTM, Nunc) als Posi i kon olle.
E gebnisse
63
3 E gebnisse
3.1 Cha ak e isie ung on eADF4(C16) Filmen
Um Spinnenseiden ilme als Ma e ialien ü konk e e Anwendungen einse zen zu können, is
zunächs ih e Cha ak e isie ung no wendig. Fü Seiden olien aus Fib oin, dem Seidenp o ein
des Maulbee spinne s Bombyx mo i, wu de be ei s besch ieben, dass e schiedene Pa ame e
bei de Filmhe s ellung die Eigenscha en des da aus esul ie enden Films beein lussen
können (Mu phy & Kaplan, 2009; Jin e al., 2005; Law ence e al., 2010; Lu, 2009; Ha dy e
al., 2008; Vasconcelos e al., 2008).
Die in de o liegenden A bei e wende en Filme aus dem ekombinan en Spinnen-
seidenp o ein eADF4(C16) wu den du ch Gießen eine P o einlösung au un e schiedliche
Subs a e he ges ell . Du ch Abdamp en des Lösungsmi els en s eh dabei ein in sich s abile ,
anspa en e und (abhängig on de Dicke) selbs agende Film, de bei Beda om
jeweiligen Subs a abgezogen we den kann. Die Dicke des en s ehenden Films kann dabei
übe die e wende e P o einkonzen a ion bzw. die P o einmenge p o Fläche einges ell
we den. Op ional kann de Film eine nach olgenden Behandlung un e zogen we den sowie
mi wei e en Molekülen unk ionalisie we den, um bes imm e Eigenscha en anzupassen
ode neue zu e zeugen (Schema 3.1).
Schema 3.1: (a) He s ellung ekombinan e Spinnenseiden ilme. Das gelös e P o ein eADF4(C16) wu de au ein
Subs a (s anda dmäßig Polys y ol-Pe ischalen) gegossen. Nach Abdamp en des Lösungsmi els bleib ein
P o ein ilm zu ück, de op ional nachbehandel und/ode mi ex e nen E ek o molekülen wei e unk ionalisie
und schließlich abgezogen we den kann. Angegeben sind die bei dem jeweiligen Sch i un e such en Pa ame e .
(b) Fo og aphie (links) bzw. as e elek onenmik oskopische Au nahmen (Mi e und ech s) on eADF4(C16)
Filmen.
E gebnisse
70
Be ach e man das Ve häl nis de Abso p ionswe e bei 1625 cm-1 und 1657 cm-1, so e geben
sich ü die un e schiedlich nachbehandel en Filme aus allen zum Gießen e wende en
Lösungsmi eln ähnliche We e (Abb. 3.4 d). Da dies den a sächlichen Ku en e lau de
Amid I-Bande gu wide spiegel , wi d diese Quo ien im Folgenden als quali a i e Indika o
ü die Ve schiebung on α-helikale zu β-Fal bla -S uk u e wende , wobei höhe e
Quo ien en einem höhe en β-Fal bla -An eil en sp echen.
Da nu minimale Un e schiede zwischen den e schiedenen Nachbehandlungsa en au a en,
sind die E gebnisse de mi els FSD analysie en Ve eilung on Sekundä s uk u -Elemen en
in Tabelle 3.2 s ell e e end ü mi einem Me hanol nachbehandel e Filme zusammen-
ge ass . Hie bes ä ig sich, dass Filme gegossen aus den e schiedenen Lösungsmi eln keine
signi ikan en Un e schiede au weisen. T o z un e schiedliche Zusammense zung in den
unbehandel en Filmen nimm de β-Fal bla -An eil de P o eine in allen Filmen nach
Behandlung au e wa 42 % zu. Dies geh mi eine Abnahme on andom coil und β- u n-
S uk u en einhe . De An eil an α-Helices e inge sich in Ameisensäu e- und Pu e -
Filmen leich , in HFIP-Filmen dagegen mi 10 % am s ä ks en. Typ I Pu e -Filme s ellen
eine Ausnahme da , mi einem ge inge en An eil an β-Fal bla -S uk u (37 %) und de
g öß en e bleibenden F ak ion an α-Helices.
Bei allen Filmen nimm unabhängig on dem u sp ünglichen Lösungsmi el und de
Nachbehandlungsme hode mi s eigendem β-Fal bla Gehal de ü β-Polyalanin spezi ische
Peak zu bzw. wi d im Fall on HFIP-Filmen induzie (Abb. 3.4 c). Die ela i e Peakhöhe de
indi iduellen Nachbehandlungen weisen leich e Schwankungen au . Da die We e jedoch bei
wiede hol en Messungen eben alls leich schwanken, spiegel dies e mu lich expe imen elle
Va ia ionen wide .
Tabelle 3.2: Sekundä s uk u an eile in mi Me hanol abs. behandel en, aus e schiedenen Lösungsmi eln
gegossenen eADF4(C16) Filmen. Die p ozen ualen An eile wu den du ch FSD bes imm (s. 2.5.4.1). Die
angegebenen We e wu den jeweils aus mindes ens d ei FTIR-Spek en gemi el .
Sekundä s uk u
HFIP
Ameisensäu e
wäss. Lösung
Typ I
Typ II
β-Fal bla [%]
(1616-1637 cm-1 und 1697-1703 cm-1)
42,3 ± 2%
42,5 ± 2%
37,0 ± 3%
42,0 ± 2%
α-Helix [%]
(1653-1662 cm-1)
7,7 ± 1%
9,4 ± 2%
12,1 ± 2%
8,4 ± 2%
andom coil [%]
(1637-1652 cm-1)
17 ± 2%
21,1 ± 2%
21,4 ± 3%
23,6 ± 3%
β- u ns [%]
(1663-1696 cm-1)
21,9 ± 2%
22,0 ± 1%
23,3 ± 3%
22,0 ± 2%
ande e [%]
(1595-1615 cm-1)
4,7 ± 2%
4,6 ± 2%
4,7 ± 2%
4,8 ± 2%

E gebnisse
71
Die Zunahme de β-Fal bla -S uk u ko elie dabei mi de S abili ä de Filme gegenübe
Wasse und Dena u ie ungsmi eln. Wäh end HFIP-Filme ohne Nachbehandlung
wasse löslich sind, sind alle nachbehandel en Filme bes ändig (> 24 h) gegenübe Wasse ,
8 M Ha ns o und 6 M GdmHCl und lösen sich nu noch in 6 M GdmSCN (Tabelle 3.3).
Ameisensäu e-Filme mi einem mi le en β-Fal bla An eil hingegen sind unlöslich in Wasse
und 8 M Ha ns o , jedoch löslich in 6 M GdmHCl. Unbehandel e Filme aus Pu e lösung
zeig en kein eindeu iges E gebnis, was e mu lich au die he e ogene s uk u elle
Zusammense zung zu ückzu üh en is .
Tabelle 3.3: Löslichkei on aus e schiedenen Lösungsmi eln gegossenen eADF4(C16) Filmen o und nach
Behandlung mi Me hanol abs. Die Filme wu den in das jeweiligen Dena u ie ungsmi el bzw. Wasse übe üh
und nach 24 h Inkuba ion mak oskopisch beu eil sowie de Übe s and UV-spek oskopisch un e such , um
gelös es P o ein nachzuweisen. +: löslich, -: unlöslich, n. b.: die We e konn en nich bes imm we den, unb.:
unbehandel
Inkuba ion in
HFIP
AS
wäss. Lösung
unb.
Me hanol
unb.
Me hanol
unb.
Me hanol
Wasse
+
-
-
-
n.b
-
8 M U ea
+
-
-
-
n.b
-
6 M GdmHCl
+
-
+
-
n.b
-
6 M GdmSCN
+
+
+
+
+
+
3.1.1.3 Ein luss de ela i en Lu euch igkei
Bei de Filmhe s ellung können auch Umgebungspa ame e wie Tempe a u , D uck ode
Lu euch igkei eine Rolle bei de Ausbildung on Sekundä s uk u spielen, sei es du ch
Beein lussung de Abdamp - und T ocknungsgeschwindigkei ode du ch die Menge an
o handenem Wasse als po en iellem In e ak ionspa ne . Um den Ein luss de ela i en
Lu euch igkei (LF) zu un e suchen, e olg e die He s ellung/T ocknung und Lage ung de
Filme in eine Kamme mi kon ollie ba em Feuch igkei sgehal bei 30 %, 50 % sowie 75 %
LF.
Wasse gehal
Zunächs wu de übe p ü , wie iel Wasse die un e schiedlichen Filme en hal en. Dazu
wu den die P oben (je ca. 10 mg) in einem O en au 140 °C e hi z und das dabei aus e ende
Wasse mi els Ka l-Fische -Ti a ion quan i izie . Tabelle 3.4 gib einen Übe blick übe die
e hal enen We e (wobei es sich meis nu um Ein achbes immungen handel ). Es wu den
jeweils aus HFIP, Ameisensäu e ode wL gegossene Filme in unbehandel e sowie nach-
behandel e Fo m ge es e . S ell e e end wu de als Nachbehandlungsme hode Me hanol abs.
sowie im Fall on HFIP-Filmen zusä zlich Kaliumphospha -Lösung gewähl .
E gebnisse
72
Tabelle 3.4: Wasse gehal on eADF4(C16) Filmen, die bei e schiedene ela i e Lu euch igkei (LF)
he ges ell und gelage wu den. Unbehandel e (unb.) sowie mi Me hanol abs. ode Kaliumphospha
nachbehandel e Filme wu den au 140 °C e hi z und ih Wasse gehal (angegeben in % (w/w)) mi els Ka l-
Fische -Ti a ion bes imm . (n. b.: die We e wu den nich bes imm ) Die We e ep äsen ie en g öß en eils
Ein achbes immungen.
LF [%]
HFIP
AS
wäss. Lösung
unb.
Me hanol
Phospha
unb.
Me hanol
unb.
Me hanol
30
4,6
8,5
8,3
6,1
7,3
8,4
8,3
50
7,9
9,8
11,5
n.b.
n.b.
10,3
n.b.
75
10,8
9,7
12,7
9,1
9,8
10,2
n.b.
Mi einem p ozen ualen An eil on 4,6 % bzw. 6,1 % bei 30 % LF weisen unbehandel e
Filme aus o ganischen Lösungsmi eln den nied igs en Wasse gehal au , wäh end de
Ve gleichswe on wL-Filmen bei 8,4 % lieg . Du ch Nachbehandlung mi Me hanol e höh
sich de Wasse gehal , was mögliche weise au eine Ve d ängung des o ganischen
Lösungsmi els sowie im Me hanol en hal enes Wasse zu ückzu üh en is (es wu de kein
ge ockne es Me hanol e wende ). De Wasse gehal e eich bei allen Me hanol-behandel en
Filmen We e, die im Be eich des unbehandel en Filmes aus wäss ige Lösung liegen. Mi
s eigende LF s eig auch de Gehal an Wasse on 8,3-8,5 % bei 30 % LF au 10-12 % bei
75 % LF. HFIP-Filme wu den zudem nach Kaliumphospha -Behandlung un e such . Dies
e gab in Abhängigkei on de LF ähnliche ode e was e höh e We e im Ve gleich zu
Me hanol-behandel en Filmen.
Sekundä s uk u
Des Wei e en wu den die en sp echenden Filme mi els FTIR-Spek oskopie un e such .
Wäh end die Lu euch igkei nu einen ge ingen Ein luss au die Sekundä s uk u in Filmen
aus HFIP zu haben schein , weisen Filme aus Ameisensäu e und Pu e (wL) eine deu liche
Abhängigkei au . Mi s eigende LF s eig dabei de An eil an β-Fal bla -S uk u , zu sehen
an de deu lichen Ve schiebung des Maximums on >1650 cm-1 zu 1625 cm-1 (Abb. 3.5 a).
Als Ve gleich is zudem das en sp echende Spek um nach Me hanol-Behandlung gezeig .
Di e enzspek en on Ameisensäu e- und wL-Filmen zeigen dabei eine Zunahme de
Abso p ion bei 1625 cm-1 (β-Fal bla -S uk u ) sowie eine deu liche Abnahme bei 1657 cm-1
(α-Helices/ungeo dne ) im Ve gleich zu den bei LF 30 % gegossenen Filmen (Abb. 3.5 b).
De E ek nimm dabei mi s eigende LF zu, bei 75 % LF un e scheiden sich die Spek en
diese Filme kaum on mi Me hanol nachbehandel en. Im Gegensa z dazu i bei HFIP-
Filmen mi zunehmende LF lediglich eine leich e Ve schiebung des Maximums hin zu
~1637 cm-1 au . En sp echend zeig das Ve häl nis de Abso p ionswe e bei 1625 cm-1 und
E gebnisse
73
1657 cm-1 hie nu eine leich e Zunahme, wäh end bei Filmen aus Ameisensäu e und wL ein
deu liche Ans ieg zu e kennen is (Abb. 3.5 c).
Ein ähnliches Mus e is bei de ü β-Polyalanin spezi ischen Abso p ion um 965 cm-1 zu
sehen. Mi zunehmendem An eil an β-Fal blä e n s eig diese an, wäh end in HFIP-Filmen
du ch e höh e LF im Gegensa z zu Alkoholen keine Induk ion diese speziellen β-Fal bla -
S uk u zu sehen is (Abb. 3.5 c).
Abb. 3.5: Ein luss de Lu euch igkei (LF) au die Sekundä s uk u on eADF4(C16) Filmen. Die Filme
wu den bei de jeweils angegebenen LF gegossen, ge ockne und bis zu Analyse mi els FTIR-Spek oskopie
gelage . (a) Amid I Bande de jeweiligen Filme gegossen aus AS. (b) Di e enzspek en im Ve gleich zu bei LF
30 % gegossenen Filmen. (c) Quo ien de Abso p ion bei 1625 cm-1 und 1657 cm-1 (oben) und Zunahme de ü
β-Polyalanin spezi ischen Abso p ionsbande (un en). Zu Auswe ung de β-Polyalanin-Bande wu den die
Spek en ek o no mie und die e hal enen Abso p ionswe e bei 965 cm-1 anschließend au den We des
jeweiligen Me hanol abs.-behandel en Films no mie .
Da sich die ela i e Lu euch igkei als ein k i ische Pa ame e zu He s ellung ep oduzie -
ba e Filme e wiesen ha , wu den die Filme in allen olgenden Un e suchungen – sowei nich
ande s e me k – bei eine LF on 30 % he ges ell und gegebenen alls gelage .
Zusammen assend is zu e kennen, dass das e wende e Lösungsmi el sowohl in Lösung als
auch im assemblie en Film Ein luss au die Sekundä s uk u on eADF4(C16) nimm . HFIP
induzie /s abilisie dabei die Ausbildung on α-Helices und die esul ie enden Filme weisen
den ge ings en β-Fal bla -An eil au . Bei Filmen aus Ameisensäu e und Pu e (wL Typ II)
lieg diese deu lich (ca. 10 %) höhe . Die IR-Abso p ionssignale de beiden o ganischen
Lösungsmi el in e e ie en dabei nich mi den P o ein-spezi ischen Amid I und II-Banden.
Das FTIR-Spek um on HFIP zeig meh e e cha ak e is ische Abso p ionsbanden (s. Abb.
3.8), wäh end Ameisensäu e ein Signal bei e wa 1710 cm-1 e zeug (s. Abb. 3.3).
E gebnisse
74
β-Fal bla -S uk u wi d zudem in Filmen alle Lösungsmi el du ch Nachbehandlung mi
Alkoholen, Kaliumphospha und – mi Ausnahme on HFIP-Filmen – du ch e höh e Lu -
euch igkei induzie . Gleichzei ig wu de dabei in allen Fällen eine Zunahme de ü β-Poly-
alanin spezi ischen Signale beobach e , so dass an de S uk u umlage ung (zumindes
eilweise) Alanin es e be eilig sind. Mi dem Gehal an β-Fal blä e n ko elie die
Bes ändigkei de Filme gegenübe Wasse , so dass alle nachbehandel en Filme
wasse unlöslich sind.
3.1.2 The mische S abili ä
Tempe a u abhängige Ände ungen in eADF4(C16) Filmen wu den mi els The mo-
g a ime ie (TGA) und dynamische Di e enzkalo ime ie (DSC) un e such . Neben
In o ma ionen übe Vo gänge au molekula e Ebene is die he mische Bes ändigkei de
Filme auch ü echnische Anwendungen sowie ih e S e ilisie ba kei on In e esse. Zum
di ek en Nachweis s uk u elle Ände ungen wu den zusä zlich empe a u abhängige FTIR-
Analysen du chge üh .
3.1.2.1 The mog a ime ische Analyse
Mi els TGA wi d die Massenände ung eine P obe in Abhängigkei de Tempe a u
gemessen. Es wu den sowohl unbehandel e als auch mi Me hanol abs. nachbehandel e Filme
aus HFIP, Ameisensäu e und Pu e un e such . Die e hal enen Messku en sind in Abb. 3.6
gezeig . Die da aus bes imm en p ozen ualen Ände ungen in de Masse sind in Tabelle 3.5
zusammenge ass .
Abb. 3.6: The mog a ime ische Analyse (TGA) on unbehandel en (unb.) sowie mi Me hanol abs. (MeOH)
behandel en Filmen aus HFIP, Ameisensäu e (AS), und Pu e (wL). Geheiz wu de dabei on Raum empe a u
bis 800 °C mi eine Ra e on 10 °C/min un e S icks o a mosphä e. De Tempe a u be eich bis 250 °C is
zusä zlich e g öße da ges ell . Gezeig sind ep äsen a i e Spek en on jeweils 3 indi iduellen Messungen. 1,
2, 3 bezieh sich au die im Tex und Tabelle 3.5 zugeo dne en P ozesse. P eil: E klä ung s. Tex
(nach Spiess e al., 2011 mi eundliche Genehmigung des Ve lags Royal Socie y o Chemis y)
E gebnisse
75
In allen Filmen kann im Tempe a u be eich zwischen 30 °C und 100 °C eine Abnahme de
Masse um 4,9-7,0 % beobach e we den (Tabelle 3.5, P ozess 1). Die Mi en empe a u Tm
(bei de 50 % des beobach e en Masse e lus s eines P ozesses e eich sind) a iie on
53 °C bis 69 °C. Bei diesem Masse e lus handel es sich e mu lich um eigese z es Wasse ,
e en uell in Kombina ion mi Res en on o ganischen Lösungsmi eln. Die We e liegen
dabei im selben G ößenbe eich wie de mi els Ka l-Fische -Ti a ion e mi el e Wasse gehal .
Ab e wa 280 °C i ein Masse e lus on 59-68 % au , de au he mische Ze se zung des
Ma e ials zu ückzu üh en is . Tm lieg dabei bei allen Filmen im gleichen Be eich um 335 °C,
die Masseabnahme se z sich jedoch in e minde e Fo m bis ≥800 °C o . In unbehandel en
Filmen aus HFIP i zwischen 140 °C und 226 °C ein wei e e Masse e lus on 16,8 % au
(P ozess 2, Tabelle 3.5), was au F eise zung gebundenen bzw. eingeschlossenen Lösungs-
mi els hindeu e (s. 3.1.2.3). Auch Ameisensäu e-Filme zeigen eine zusä zlich Abnahme um
5 % im Be eich on 170-280 °C. Dahingegen i bei Me hanol-behandel en Filmen kein
en sp echende Massen e lus au . Im Fall des behandel en AS-Films beginn die
Massenabnahme (P ozess 3, Tabelle 3.5) alle dings schon bei e was nied ige e Tempe a u
e glichen zu den ande en Filmen (s. P eil in Abb. 3.6), was au zwei sich übe lage nde
E ek e hindeu en könn e. Mögliche weise handel es sich hie bei um e bleibendes
Lösungsmi el, das, ande s als bei HFIP, du ch die nach olgende Me hanol-Behandlung nich
komple e d äng wu de.
Tabelle 3.5: Übe blick übe die mi els TGA bes imm e Masseabnahme (∆m) on eADF4(C16) Filmen bei
bes imm en Tempe a u en. Angegeben sind jeweils die Tempe a u des halben Masse e lus s Tm sowie (in
Klamme n) de ele an e Tempe a u be eich des jeweiligen P ozesses. (unb.: unbehandel , Me hanol: abs.)
Lösungs-
mi el
Nachbe-
handlung
P ozess 1
P ozess 2
P ozess 3
üb ige
Masse bei
800 °C [%]
Tm [°C]
∆m
[%]
T [°C]
∆m
[%]
T [°C]
∆m
[%]
HFIP
unb
57
(32-82)
4,9
183
(141-226)
16,8
332
(282-381)
59,8
18,5
Me hanol
53
(32-77)
6,7
335
(284-382)
67,5
25,8
AS
unb
64
(32-97)
7,0
197
(169-282)
5,0
334
(282-388)
65,0
23,0
Me hanol
69
(37-105)
6,6
334
(281-388)
66,9
26,5
wL
unb
68
(41-97)
5,9
336
(286-387)
65,3
28,8
Me hanol
56
(30-80)
7,1
334
(287-387)
68,0
24,9

E gebnisse
76
3.1.2.2 Analyse mi els dynamische Di e enzkalo ime ie
Eine Analyse de Filme mi els dynamische Di e enzkalo ime ie (DSC) zeig e bei allen
P oben übe lage nde E ek e. Um diese Übe lage ungen zu minimie en und zusä zliche
In o ma ionen übe den jeweilig s a indenden P ozess zu e hal en, wu den die P oben
zyklisch geheiz . Nach Au heizen au 110 °C in einem e s en Sch i wu den die P oben bis zu
eine Tempe a u on -40 °C abgekühl und anschließend in einem zwei en Sch i au 400 °C
geheiz . Die dabei e hal enen Spek en sind in Abb. 3.7 b ü den zwei en Heizsch i gezeig .
In einem wei e en Expe imen wu de ein zusä zliche Heizzyklus bis 220 °C einge üh und
nach e neu em Abkühlen de P obe e s in einem d i en Sch i au 400 °C geheiz . Die dabei
e hal enen Ku en sind in Abb. 3.7 a exempla isch ü unbehandel e HFIP-Filme da ges ell .
Alle P oben zeigen ein endo he mes Signal un e halb on 100 °C (Abb. 3.7 a). De in de
TGA beobach e e gleichzei ige Masse e lus deu e da au hin, dass hie eies Wasse bzw.
Lösungsmi el e damp . Zudem weisen alle Filme einen dominan en endo he men Peak bei
e wa 320 °C mi eine un e schiedlich s a k ausgep äg en Schul e bei ca. 265-280 °C au
(Abb. 3.7 b, g aue Rahmen). Dies is cha ak e is isch ü einen zweis u igen Schmelz- bzw.
Ze se zungs o gang (Vasconcelos e al., 2008; Go oh e al., 1997). Unbehandel e Filme aus
den o ganischen Lösungsmi eln zeigen zusä zlich wesen lich kleine e und e b ei e e
endo he me Signale im Be eich zwischen 130 °C und 185 °C (HFIP) sowie 135-195 °C (AS)
(Abb. 3.7 b, blaue Rahmen). Zusammen mi de au e enden Masseabnahme (s. o.) is dies
ein Hinweis au Ve damp en on gebundenem ode eingeschlossenem Lösungsmi el.
Ein üh en eines wei e en Heizzyklus (bis 220 °C) bek ä ig e diese Ve mu ung, da dieses
Signal nich ep oduzie ba wa (Abb. 3.7 a, g aue und blaue Ku e). Im Fall on HFIP kann
das Aus e en des Lösungsmi els zudem mi els FTIR-Spek oskopie e olg we den
(s. Kapi el 3.1.2.3.). In gu e Übe eins immung mi diese E klä ung zeigen Pu e -Filme und
Me hanol-behandel e Filme keine ode nu seh ge inge e gleichba e Signale. Du ch die
Nachbehandlung wi d das u sp üngliche Lösungsmi el g öß en eils (ode komple ) aus dem
Film e d äng .
E gebnisse
77
Abb. 3.7: Un e suchung he mische Eigenscha en on eADF4(C16) Filmen mi els DSC. Filme aus HFIP,
Ameisensäu e (AS) sowie Pu e (wL) wu den o (unb.) bzw. nach (MeOH) Me hanol abs.-Behandlung in
S icks o -A mosphä e analysie . Die P oben wu den in Zyklen geheiz , die Heiz a e be ug dabei 5 °C/min. In
(a) sind die indi iduellen Zyklen exempla isch ü unbehandel e HFIP-Filme gezeig . Im 3. Heizzyklus i
ans elle eines endo he men Peaks ein endo he me Ku en e sa z au (P eil). (b) Zusammen assung de DSC-
Ku en alle Filme, wobei de 1. Zyklus dem in (a) en sp ach und in einem 2. Zyklus di ek bis 400 °C geheiz
wu de. De Übe sich lichkei halbe is nu de 2. Heizsch i da ges ell . (LM: Lösungsmi el, Tg: Glas-
übe gangs empe a u )
(nach Spiess e al., 2011 mi eundliche Genehmigung des Ve lags Royal Socie y o Chemis y)
In allen unbehandel en Filmen e en exo he me Signale au , bei Filmen aus HFIP bei 200-
210 °C, aus AS bei e wa 215 °C und aus Pu e bei 221 °C (Abb. 3.7 b, g üne Rahmen).
Wiede um zeig e wiede hol es Au heizen, dass es sich um einen nich - e e siblen P ozess
handel . Fü egene ie es B. mo i Seiden ib oin wu den en sp echende Signale Übe gängen
in de Sekundä s uk u zugesch ieben (Hu e al., 2006; Mo a e al., 2002). Ungeo dne e
S uk u en ode α-Helices we den dabei in β-Fal bla -S uk u umgelage . Diese
In e p e a ion s imm gu mi dem Fehlen solche exo he me Signale in nachbehandel en
Filmen übe ein. Da diese be ei s du ch die Nachbehandlung in eine β-Fal bla - eiche S uk u
übe üh wo den sind, is hie keine wei e e S uk u umlage ung zu beobach en.
Wei e hin is in den DSC-Ku en de Me hanol-behandel en Filme ein Ve sa z im Be eich
on 195 °C bis 210 °C zu sehen (Abb. 3.7 b, o e Rahmen). In Anlehnung an S udien mi
B. mo i Seide kann dies als eine A Glasübe gang in e p e ie we den (Mo a e al., 2002;
Vasconcelos e al., 2008; Hu e al., 2006), bei dem sich die Beweglichkei /F eihei sg ade de
Moleküle e höh . Die en sp echenden Messku en on Filmen ohne Nachbehandlung zeigen
keinen deu lichen Ve sa z (Abb. 3.7 b). Bei Heizen in meh e en indi iduellen Zyklen i
jedoch auch hie ein Übe gang au (P eil in Abb. 3.7 a), so dass e mu lich die E apo a ion
on Lösungsmi el sowie die s a indende s uk u elle Umlage ung diesen E ek in Abb.
3.7 b übe lage n.
E gebnisse
78
3.1.2.3 Ein luss de Tempe a u au die Sekundä s uk u
Da die Un e suchung mi els DSC au empe a u abhängige Ände ungen in de Sekundä -
s uk u hindeu e e, wu den FTIR-Spek en de Filme bei e schiedenen Tempe a u en
au genommen. Die jeweilige P obe wu de dazu in eine e schlossenen heizba en Appa a u
(welche mi N2 gespül wu de) di ek in dem S ahl des Spek ome e s pla zie .
Dabei zeig sich bei allen unbehandel en Filmen eine Ve schiebung des Maximums de
Amid I-Bande hin zu Wellenzahlen spezi isch ü β-Fal bla -S uk u en (1625 cm-1) bzw.
eine Zunahme des Quo ien en 1625 cm-1/1657 cm-1 (Abb. 3.8). Diese Zunahme an β-Fal bla -
S uk u beginn bei Filmen aus HFIP bei e wa 210 °C. Bei Filmen aus Ameisensäu e und wL
i eine en sp echende Zunahme ab 220 °C bzw. 230 °C au . An Spek en on unbehandel en
HFIP-Filmen können zudem wei e e E ek e beobach e we den (Abb. 3.8 a). Zum einen is
im Tempe a u be eich de Ve schiebung de Amid I-Bande eine Induk ion des β-Polyalanin-
Peaks zu e kennen. Zum ande en kann ein Rückgang de ü HFIP spezi ischen Abso p-
ionsbanden beobach e we den. Diese ko elie dabei gu mi den beiden genann en
S uk u ände ungen.
In du ch Me hanol-Behandlung be ei s β-Fal bla - eichen Filmen hingegen wa kein
signi ikan e Ein luss e höh e Tempe a u zu e kennen (Abb. 3.8 c).
Die Tempe a u -induzie e S uk u ände ung is dabei i e e sibel und bleib nach Abkühlen
de P obe e hal en. Das Maximum bei 1625 cm-1 wa soga nach Abkühlen s ä ke ausgep äg
(Abb. 3.8 b). Ve mu lich is dies alle dings au kine ische E ek e zu ückzu üh en. Die oben
gezeig en Messungen wu den in Sch i en on 10 °C du chge üh , wobei die Spek en
inne halb 2-5 min nach E eichen de Tempe a u au genommen wu den. Um kine ische
Ein lüsse au zuklä en, wu den Filme zudem bei e schiedenen Tempe a u en (100 °C,
150 °C, 200 °C, 240 °C) in einem O en 20-60 min inkubie . Hie bei a un e halb 200 °C
auch nach 60 min keine S uk u ände ung au . Bei Inkuba ion ≥ 200 °C hingegen zeig e sich
eine zei - und empe a u abhängige Ve schiebung des Maximums im FTIR-Signal. Die
Ve schiebung wa jeweils e was ausgep äg e als bei de Ve gleichsmessung bei
kon inuie lichem Heizen und e eich e ih Maximum nach Inkuba ion de Filme bei 240 °C.
E gebnisse
79
Abb. 3.8: Ände ung de Sekundä s uk u on eADF4(C16) Filmen in Abhängigkei de Tempe a u . Die Filme
wu den in eine e schließba en Heizappa a u in dem S ahlengang des FTIR-Spek ome e s pla zie und
wäh end des Au heizens analysie . Gezeig sind die Spek en unbehandel e HFIP-Filme im Be eich 1780-
800 cm-1 (a), die Amid I-Bande unbehandel e wL-Filme (b) sowie de Quo ien de Abso p ionswe e bei
1625 cm-1/ 1657 cm-1(c). S ell e e end ü Me hanol-behandel e Filme is ein wL-Film gezeig . (MeOH:
Me hanol abs.; c-30 °C: FTIR-Spek en nach anschließendem Abkühlen de P obe)
(nach Spiess e al., 2011 mi eundliche Genehmigung des Ve lags Royal Socie y o Chemis y)
Insgesam e wiesen sich alle eADF4(C16)-Filme bis zu Tempe a u en ≥ 280 °C als s abil. Die
e hal enen FTIR-Spek en deu en au s uk u elle In eg i ä de Filme hin, wobei alle dings in
unbehandel en Filmen eine S uk u ände ung hin zu e höh em β-Fal bla -An eil au i . Auch
TGA- und DSC-Messungen zeigen ab 285 °C den Beginn he mische Ze se zung, die bei
330 °C zu einem e heblichen Masse e lus üh .
E gebnisse
86
Abb. 3.12: Au e ende Spannung bei sch i weise Dehnung on eADF4(C16)-Filmen im zei lichen Ve lau .
Die jeweils au geb ach e Dehnung (in % de u sp ünglichen Filmlänge) is eben alls angegeben. Exempla isch
is die Messung eines unbehandel en (a) sowie eines Me hanol-behandel en (b) Ameisensäu e-Films gezeig . Das
Expe imen wu de wie olg du chge üh : Die P obe wu de mi els Mik ome e sch aube um eine de inie e
Länge gedehn (0,3-0,5 % de u sp ünglichen Filmlänge), was zu einem s eilen Signal im K a senso üh (1).
Nach anschließende Relaxa ion de P obe (2) wu den pola isie e FTIR-Messungen du chge üh (3). Die
Spannung en sp ich de gemessenen K a p o Que schni s läche des Filmes, welche ü jeden Film indi iduell
bes imm wu de.
(nach Spiess e al. 2011 mi eundliche Genehmigung des Ve lags Royal Socie y o Chemis y)
Da die e hal enen FTIR-Spek en im Be eich de Amid I- und II-Bande eilweise zu s a k
s eu en und dami keine Analyse möglich wa (s. Abb. 3.11 b), konzen ie e sich die
Auswe ung de pola isie en Spek en au die ü β-Polyalanin spezi ische Abso p ionsbande
um 965 cm-1. Diese Auswe ung bie e zudem einige Vo eile. Wäh end bei de Amid I-Bande
eine genaue Zuo dnung beobach e e E ek e du ch die Übe lage ung meh e e Schwingungen
e schwe wi d, is die Zuo dnung im Fall de β-Polyalanin Bande eindeu ig. Des Wei e en
gel en Polyalanin-K is alle im na ü lichen Spinnenseiden aden als U sache de hohen
Fes igkei und S ei hei (Buehle & Yung, 2009). Demen sp echend zeig e diese Bande bei
Un e suchungen an Spinnenseiden äden die s ä ks en Ände ungen bei mechanische
Beansp uchung. Mi Hil e eines quan enmechanischen Modells konn e zudem gezeig
we den, dass eine Ve schiebung diese Bande di ek mi eine ex e n angeleg en K a
ko elie (Papadopoulos e al., 2007).
Bei Be ach ung diese Abso p ionsbande zeig sich in Filmen aus wäss ige Lösung (ohne
bzw. mi Nachbehandlung) und unbehandel en Ameisensäu e-Filmen mi zunehmende
Dehnung des Films eine leich e Ve schiebung des Peakmaximums hin zu nied ige en
Wellenzahlen (Abb. 3.13 a). Im Falle des unbehandel en wL-Filmes i diese Ve schiebung
ab eine Dehnung on 4,5 % au , in den beiden ande en Filmen be ei s ab Übe sch ei en on
1 % Dehnung. In Anlehnung an Messungen an na ü lichen Spinnen äden kann dies als
Übe agung de ex e n angeleg en K a au β-Polyalanin-S uk u en in e p e ie we den, die
bei den Filmen jedoch – ande s als im Faden – nich so o , sonde n e s nach eine gewissen
Dehnung e olg (Papadopoulos e al., 2007; Papadopoulos e al., 2009b; Ene e al., 2009).

E gebnisse
87
Mi eine Ve schiebung des Abso p ionsmaximums um 0,2-0,4 cm-1 e schein die Ände ung
zunächs klein; un e Einbeziehung de dabei au gewende en K a e gib sich jedoch
beispielsweise im Fall des AS-Films eine Ände ung on 3-5 cm-1/GPa, und lieg dami in
einem ähnlichen G ößeno dnungsbe eich wie de am na ü lichen Faden beobach e e E ek
(Ene e al., 2009; Papadopoulos e al., 2007). Alle dings muss dabei beach e we den, dass
das au ges ell e Modell de K a übe agung in de Molekülgeome ie limi ie is . Da diese
in den Filmen mögliche weise abweich , kann an diese S elle nu ein quali a i e Ve gleich
zum Seiden aden e olgen. In den Me hanol-behandel en Filmen aus HFIP und AS hingegen
is keine solche Ve schiebung zu e kennen.
Abb. 3.13: Analyse de ü β-Polyalanin spezi ischen IR-Abso p ionsbande (965 cm-1) bei sch i weise
Dehnung on e schiedenen eADF4(C16) Filmen (wie angegeben). (a) Ve schiebung des Peak-Maximums
ela i zu Posi ion im ungedehn en Film. (b) Aus pola isie en FTIR-Messungen be echne e
O dnungspa ame e Smol in Abhängigkei de Dehnung. (c) O iginalspek en de IR-Abso p ion bei 0° und 90°
Pola isa ion, jeweils o bzw. nach Dehnung de Filme. Exempla isch ü Filme ohne signi ikan e Ände ung is
ein Me hanol-behandel e AS-Film (links) da ges ell , wäh end bei unbehandel en Pu e -Filmen Ände ungen
au e en ( ech s).
(nach Spiess e al. 2011 mi eundliche Genehmigung des Ve lags Royal Socie y o Chemis y)
Aus de un e e schiedenen Pola isa ionswinkeln e hal enen Fläche des Peaks kann eine
Aussage übe die O ien ie ung de ange eg en Bindung ge o en we den (Kapi el 2.5.4.3).
De dabei be echne e molekula e O dnungspa ame e Smol e gab ü alle Filme o S eckung
einen We ~0. Dies bedeu e keine lei O ien ie ung de Bindung und bes ä ig somi die oben
ü das gesam e P o ein-IR-Spek um ge o ene Aussage. Mi zunehmende Dehnung de
Filme e höh sich Smol in den unbehandel en Filmen (aus Ameisensäu e und wäss ige Lösung
E gebnisse
88
wL) (Abb. 3.13 b). De E ek beginn wiede um e s nach eine gewissen Dehnung, die mi
de Ve schiebung des Abso p ionsmaximums übe eins imm . Danach s eig Smol linea mi
zunehmende Dehnung an und e eich einen Endwe ( o dem Reißen des Filmes) on 0,18
bzw. 0,22. Da ein We on +1 bei eine olls ändigen Aus ich ung alle Bindungen pa allel
zu P obenachse e eich wi d, deu e dieses E gebnis au eine eilweise Aus ich ung de
N-Cα-Bindungen on β-Polyalanin-S uk u en in Rich ung de Zugk a hin. De Ve gleichs-
we de hoch ausge ich e en β-Polyalanine in na ü liche d agline Seide lieg bei 0,9
(Papadopoulos e al., 2007). Hingegen wa bei keinem de Filme nach Behandlung mi
Me hanol eine Zunahme on Smol zu sehen, was da au hindeu e , dass hie keine
Aus ich ung/Umo ien ie ung on β-Polyalaninen s a inde .
Da in HFIP Filmen ohne Behandlung keine en sp echende Abso p ionsbande bei 965 cm-1
au i , konn en ü diesen Film keine Aussagen ge o en we den. Im Fall des Filmes aus
wäss ige Lösung wu de hie nu an eine S elle des Films gemessen, wodu ch e en uelle
egionale Un e schiede (wie oben besch ieben) nich e ass wu den.
Die e hal enen E gebnisse deu en somi (in einigen Filmen) au eine eilweise Aus ich ung
de β-Polyalanine hin, nich jedoch au eine Zunahme an β-Fal bla -S uk u . So a in
keinem de Filme eine E höhung de Abso p ion bei e wa 965 cm-1 au , noch wu de eine
Ände ung de Amid I-Bande beobach e , so e n es die Au lösung zuließ.
3.1.4 Cha ak e isie ung de Filmobe läche
Die Na u de Filmobe läche is bei de In e ak ion mi ang enzenden Phasen (biologisches
ode ande es Ma e ial) on en scheidende Bedeu ung. Wich ige Pa ame e sind dabei die
Topog aphie sowie die Hyd ophilie de Obe läche. Wiede um wu den Filme gegossen aus
den e schiedenen Lösungsmi eln mi bzw. ohne Nachbehandlung e glichen. Au g und de
Rele anz hinsich lich spä e e Anwendung de Filme in de Kul i ie ung on Zellen wu de
neben Me hanol und E hanol abs. auch de E ek on Kaliumphospha -Behandlung und 70 %
Me hanol bzw. E hanol un e such .
3.1.4.1 Topog aphie
Un e suchung e schiedene Filme mi els REM gab einen e s en Übe blick übe die
Filmobe läche. Ausgewähl e Beispiele sind in Abb. 3.14 gezeig , die es lichen Au nahmen
sind in Kapi el 10.2 (Anhang) zu inden. Die un e such en Filme besaßen eine Dicke on
1-2 µm (Abb. 3.14 A und E).
E gebnisse
89
Abb. 3.14: REM-Au nahmen e schiedene eADF4(C16) Filme. A-C: HFIP-Filme nachbehandel mi Me hanol
abs. (A), 1 M Kaliumphospha lösung (B) ode 70 % Me hanol (C); D: Me hanol (abs.)-behandel e
Ameisensäu e-Film; E und F: unbehandel e Filme aus wäss ige Lösung. Die Dicke de Filme be ug dabei 1-
2 µm (s. A und E).
Unbehandel e Filme aus HFIP s ellen sich gla und ohne e kennba e Obe lächens uk u da ,
was sich auch du ch Behandlung mi Me hanol nich signi ikan ände . Im Que schni sind
sowohl Blaseneinschlüsse als auch geschich e e S uk u en e kennba (A). Nach Behandlung
mi Kaliumphospha (B) e en e meh Ve ie ungen und Löche mi Du chmesse n bis zu
0,5-1 µm au . 70 % Me hanol (C) hingegen üh zu eine inhomogenen S uk u ie ung mi
egionalen Un e schieden. Bei Filmen aus Ameisensäu e hingegen sind sowohl o also auch
nach Me hanol-Behandlung iele Löche bzw. Ve ie ungen zu sehen (D), welche
mögliche weise du ch Au pla zen on eingeschlossenen Lösungsmi el-Blasen en s ehen.
REM-Au nahmen on Filmen aus wässe ige Lösung (wL) zeigen eine eilweise gla e
Obe läche (E), abe auch unebene Be eiche (F). Die ü HFIP-Filme besch iebenen E ek e
un e schiedliche Nachbehandlungen e en quali a i auch ü aus Ameisensäu e und wL
gegossene Filme zu (s. Anhang, Kapi el 10.2).
Zu de aillie e en Analyse de Obe lächen opog aphie wu den die Filme mi els Ras e -
k a mik oskopie (AFM) un e such (Abb. 3.15). Neben eine quali a i en Beu eilung de
Topog aphie wu den die Au nahmen zu Bes immung de mi le en Rauhei Ra sowie de
Rau ie e e wende (Abb. 3.16). Ra en sp ich dabei dem a i hme ischen Mi el de
Abweichung jedes einzelnen Messpunk es on de Mi ellinie, wohingegen die Rau ie e ein
Maß ü die maximale Rauhei da s ell .
Gene ell zeigen alle Filme in den gewähl en Ausschni en on 10 µm x 10 µm eine gewisse
S uk u ie ung ih e Obe läche, welche sich aus homogene en Flächen im nm-Be eich
E gebnisse
90
zusammense z (Abb. 3.15). Demen sp echend s eig die Rauhei mi de analysie en Fläche
an (Abb. 3.16). Übe eins immend mi den REM-Au nahmen weisen auch hie unbehandel e
Filme aus HFIP mi eine Mi el auhei on 2 nm (bes imm übe 25 µm2) die gla es e
Obe läche au , wobei die Rau ie e e wa 20 nm be äg . Ih e leich wellige S uk u geh du ch
Me hanol abs.-Behandlung in eine homogene e Obe läche mi ähnliche ode leich e höh e
Rauhei übe (Abb. 3.15). Eine Behandlung mi Phospha lösung ode 70 % Me hanol üh ,
wie schon im REM beobach e , auch au diese G ößenskala zu eine Zunahme de Rauhei ,
die bei de Alkoholbehandlung besonde s s a k ausgep äg is und eine mi le e Rauhei Ra
on 17 nm e gab. Dami einhe geh ein Ans ieg de Rau ie e au das 15- ache des
unbehandel en Films.
In den ansons en gla en Ameisensäu e-Filmen (unbehandel ) mi Rauhei swe en
e gleichba zu unbehandel en HFIP-Filmen wu den Löche bzw. Ve ie ungen beobach e .
Mi Du chmesse n on 0,2-1 µm en sp echen sie den be ei s mi els REM de ek ie en
S uk u en. Ih e Tie e be ug e wa 50-70 nm. Du ch Me hanol-Behandlung nimm Ra au e wa
5 nm zu und die Obe läche e schein wellige .
Um zu übe p ü en, ob die s a ke Au auhung de Filmobe läche bei Behandlung mi
Kaliumphospha und besonde s 70 % Me hanol (s. HFIP-Filme) au das da in en hal ene
Wasse zu ückzu üh en sein könn e, wu den Ameisensäu e-Filme, die im Gegensa z zu HFIP-
Filmen pe se unlöslich in Wasse sind, mi Wasse inkubie und nach anschließende
T ocknung analysie . Auch hie zeig sich eine s a ke Zunahme de Rauhei au > 40 nm
(Abb. 3.15, Abb. 3.16). Mögliche weise üh das Wasse zu ungleichmäßigem Quellen de
Filme ode e laub lokale Umlage ungen de Moleküle. Übe schich ung be ei s Me hanol-
behandel e Filme mi Wasse esul ie e dagegen nu in eine ge ingen Zunahme de Rauhei
(Abb. 3.16).
AFM-Au nahmen on wL-Filmen weisen s a k un e schiedliche E gebnisse au . Die Filme
e scheinen eils ähnlich gla wie die aus den o ganischen Lösungsmi eln, weisen an ande en
S ellen abe eine s a k gewell e Obe läche mi de höchs en beobach e en Rauhei au .
Hie bei handel es sich e mu lich um die eben alls im REM de ek ie en au ge au en
Be eiche. Auch nach Behandlung mi einem Me hanol bleiben Be eiche un e schiedliche
Rauhei de ek ie ba .
E gebnisse
91
Abb. 3.15: Ein luss e schiedene Lösungsmi el und Nachbehandlungsme hoden au die Topog aphie on aus
HFIP, Ameisensäu e (AS) und wäss ige Lösung (wL) gegossenen eADF4(C16) Filmen. Gezeig sind
ep äsen a i e AFM-Au nahmen mi 1 bzw. 10 µm Kan enlänge. Alle Messungen wu den an Filmen nach
T ocknung und Lage ung bei 30 % LF im apping mode du chge üh .

E gebnisse
92
Die Rau ie e olg insgesam bei allen P oben den T ends de Mi el auhei Ra und a iie
zwischen ~ 20 nm bei unbehandel en HFIP-Filmen und 400-500 nm bei mi Wasse
behandel en Ameisensäu e-Filmen sowie Filmen aus wäss ige Lösung.
Abb. 3.16: Mi el auhei Ra (a) und Rau ie e (b) on eADF4(C16) Filmen in Abhängigkei des Lösungsmi els
und de Nachbehandlung. Beide Pa ame e wu den aus AFM-Au nahmen de jeweiligen Filme übe eine Fläche
on 1 µm2 (hellblau) bzw. 25 µm2 (dunkelblau) e mi el , wobei die We e aus s ichp obena ig au genommenen
Au nahmen gemi el wu den. (unb.: unbehandel , MeOH: Me hanol abs.; I und II: s a k un e schiedliche
Be eiche au wL Filmen)
3.1.4.2 Bene zba kei /Hyd ophobizi ä
Die Hyd ophobizi ä de Filmobe lächen wu de übe Messung ih e Bene zba kei mi
Wasse bes imm . Kon ak winkel zwischen Obe läche und Wasse op en on ≥ 90° gel en
dabei als hyd ophob, wäh end hyd ophile Obe lächen du ch kleine e Kon ak winkel
cha ak e isie sind. Me hanol-behandel e Filme a iie en in ih em Kon ak winkel je nach
e wende em Lösungsmi el. Mi einem Messwe on 38,4° ± 6,9° (HFIP) bzw. 48,2° ± 5,8°
(wL) sind HFIP- und wL-Filme als hyd ophil einzuo dnen, wäh end Ameisensäu e-Filme mi
65,7° ± 2,0° e was hyd ophobe sind (Tabelle 3.7). Vo de Behandlung e gaben
Ameisensäu e-Filme einen leich ge inge en Messwe (56° ± 3°), ebenso wie wL-Filme
(43° ± 5°). Alle dings kann bei Filmen aus wäss ige Lösung nich ausgeschlossen we den,
dass die Kon ak winkel-Messung dadu ch beein äch ig wi d, dass sich die Filme eilweise in
Wasse lösen. HFIP-Filme konn en demen sp echend ga nich ohne Nachbehandlung
un e such we den. 70 % Me hanol und E hanol üh en genau wie Kaliumphospha bei allen
Filmen zu eine s a ken Ve inge ung des Messwe es au 11° bis 30°. Die Messwe e
schwank en dabei alle dings s a k, da de abgese z e T op en meis nich s abil wa , sonde n
sich schnell au dem Film e b ei e e. Da aus kann geschlossen we den, dass die
Filmobe lächen s a k hyd ophil sind. Jedoch is auch die Obe lächen opog aphie diese
Filme sowei e ände (s. o.), dass kein di ek e Ve gleich mi den ande en Filmen möglich
E gebnisse
93
is . Insgesam zeig en alle un e such en Filme einen deu lich kleine en Kon ak winkel als die
Polys y ol-Obe läche selbs (89,4° ± 1,1°). ~12
Tabelle 3.7: Kon ak winkel on Wasse (H2OMQ) au e schiedenen eADF4(C16)-Filmen (0,15 mg P o ein/cm2,
gegossen au Polys y ol (Pe ischale).
3.2 Modi izie ung und Funk ionalisie ung on eADF4(C16)
3.2.1 He s ellung und Cha ak e isie ung on Cys ein-Va ian en on eADF4(C16)
Zu E wei e ung des Einsa zspek ums on au eADF4(C16) basie enden Ma e ialien is eine
Funk ionalisie ung mi ex e nen E ek o molekülen on g oßem In e esse. Um eine sei s eine
schnelle und ein ache Modi ika ion des P o eins mi un e schiedlichs en Molekülen zu
e möglichen, dabei abe ande e sei s die Posi ion und Quan i ä de Modi ika ion genau
kon ollie en zu können, wu de au molekula biologischem Weg ein Cys ein in eADF4(C16)
eingeb ach . Da das P o ein u sp ünglich keine Thiole en häl , s ell die Thiolg uppe des
eingeb ach en Cys eins eine neue, spezi ische Kopplungss elle da .
3.2.1.1 Design, Exp ession und Reinigung
Konzep ion und Klonie ung
Zwei S a egien wu den e olg , um jeweils ein Cys ein in die P imä sequenz on
eADF4(C16) zu in eg ie en. In dem e s en Ansa z wu de ein Cys ein-hal iges Modul C*
gene ie , in dem das Se in des u sp ünglichen C-Moduls an Posi ion 25 du ch Cys ein e se z
wu de (Abb. 3.17). Du ch An ügen dieses Moduls am Amino- bzw. Ca boxy e minus on
eADF4(C16) e gaben sich die nun aus insgesam 17 Modulen bes ehenden P o eine C*C16
bzw. C16C* (s. Anhang, Kapi el 10.5).
De zwei e Ansa z bes and da in, das Cys ein auße halb des C-Moduls zu pla zie en. Da ü
wu de es in eine 14 Aminosäu en um assende Sequenz ( ag) in eg ie (Abb. 3.17), welche im
Folgenden als n agCys bezeichne wi d, da sie am amino e minalen Ende des P o eins ange üg
wu de. Das da aus esul ie ende P o ein wu de als n agCysC16 bezeichne .
Nachbehandlung
HFIP
Ameisensäu e
wäss. Lösung
unbehandel
n.b.
56,0° ± 3,0°
(43,5° ± 4,6°)
MeOH (abs.)
38,4° ± 6,9°
65,7° ± 2,0°
48,2° ± 5,8°
MeOH (70%)
~ 11-20°
Kaliumphospha (1 M)
~ 12-30°
E gebnisse
94
Abb. 3.17: Cys ein-hal ige Va ian en on eADF4(C16). Um jeweils ein Cys ein in die Sequenz des Cys ein-
eien eADF4(C16) einzub ingen, wu den zwei S a egien e olg . Zum einen wu de das Modul C* gene ie , in
welchem Se 25 in de u sp ünglichen Sequenz zu Cys mu ie wu de. In einem zwei en Ansa z wu de ein
Cys ein in eine 14 Aminosäu en um assenden Sequenz in eg ie („n agCys“). Sowohl C* als auch n agCys
wu den als eigens ändige Module en wede an das amino-ode ca boxy eminale Ende de Sequenz on
eADF4(C16) angeb ach . (nach Spiess e al., 2010b mi eundliche Genehmigung des Ve lags Royal Socie y o
Chemis y)
Die ü das Modul C* codie ende DNA-Sequenz wu de mi els Mu agenese-PCR un e
Ve wendung de P ime pCSmu - wd und pCS-CS25C- e (s. Kapi el 2.1.1) he ges ell . Als
Ma ize dien e das Plasmid pAZL(C), welches die ü ein C-Modul codie ende DNA-Sequenz
en häl (Huemme ich e al., 2004a). Die ü n agCys codie enden DNA-Sequenz wu de du ch
Hyb idisie ung zweie komplemen ä e , syn he isie e Oligonukleo ide (n agCys- wd und
n agCys- e , s. Kapi el 2.1.1.1) e zeug . Diese wa en so konzipie , dass an beiden Enden
komplemen ä e Übe hänge zum geschni enen Ziel ek o o lagen. Nach Klonie ung des
jeweiligen Kons uk s in den Vek o pAZL s anden somi ü beide S a egien DNA-
Sequenzen zu Ve ügung, die in einem e ablie en Klonie ungssys em zu nah losen
Oligome isie ung (Huemme ich e al., 2004a) eingese z we den konn en.
Hin e g und beide S a egien wa , unk ionelle Cha ak e is ika on eADF4(C16), wie
beispielsweise seine Assemblie ungseigenscha en, möglichs nich zu beein äch igen. So
wu de ü die e s e S a egie de Aus ausch S25C au g und de chemischen und s e ischen
Ähnlichkei beide Aminosäu en gewähl . Zudem zeig e ein Ve gleich de Hyd o-
pa hizi ä sblo s nach Ky e und Dooli le (Ky e & Dooli le, 1982) ü die jeweiligen P o eine
an diese S elle die ge ings en Ve ände ungen (s. Anhang, Kapi el 10.5).
E gebnisse
95
Mi els S a egie 2 (n agCys) soll e das Cys ein als Kopplungss elle an eine lexiblen und
möglichs nich mi de Ausbildung hyd ophobe (in e molekula e ) Wechselwi kungen
in e e ie enden S elle be ei ges ell we den und is dahe du ch einige Aminosäu en,
bes ehend aus Glycin- und Se in es en, on de u sp ünglichen Sequenz on eADF4(C16)
ge enn .
P o einp oduk ion und -Reinigung
Die Exp ession de mi els Sequenzie ung e i izie en Kons uk e e olg e in einem
Bio eak o im Expessionss amm E. coli HMS174(DE3). Alle d ei ekombinan en P o eine
C*C16, C16C* sowie n agCysC16 konn en wei gehend nach de ü eADF4(C16) en wickel en
Reinigungss a egie ge einig we den. Die Ausbeu e be ug dabei 1,2-2,3 mg/g Biomasse,
wobei on n agCysC16 die höchs en Mengen e hal en wu den. Die Reinhei und Iden i ä de
P o eine konn e mi els SDS-PAGE, Wes e nblo (Abb. 3.18) und Massenspek ome ie
(s. Kapi el 10.3, Abb. 10.5) übe p ü und bes ä ig we den.
Abb. 3.18: Analyse de ge einig en Cys-Va ian en on eADF4(C16) mi els SDS-PAGE (a) und Wes e nBlo
(b). (a) Die P o eine wu den mi bzw. ohne Zusa z on β-Me cap oe hanol inkubie , mi els SDS-PAGE
au ge enn und anschließend eine Silbe ä bung un e zogen. (b) Immunoblo de P o eine un e nich -
eduzie enden Bedingungen. Die De ek ion e olg e übe den au dem Exp essions ek o pET21a kodie en T7-
ag, welche am Amino e minus de P o eine lokalisie is . M: Monome , D: Dime
Beim Ve gleich mi dem au ge agenen G ößens anda d in de SDS-PAGE iel au , dass die
Lau s ecke de P o eine nich ih em heo e ischen Molekula gewich on 48,5 kDa
(n agCysC16) bzw. 50,6 kDa (C*C16 und C16C*) en sp ich (s. Tabelle 3.8). Dieses
Phänomen i jedoch auch bei eADF4(C16) au , welches eine Molmasse on 47,7 kDa
besi z , und g ünde sich e mu lich au dessen spezielle Aminosäu ezusammense zung. Die
massenspek ome ische Analyse bes ä ig e zudem in allen Fällen das e wa e e Molekula -
gewich (s. Anhang, Abb. 10.5). Bei Analyse un e nich - eduzie enden Bedingungen zeig e
sich bei allen d ei Cys ein-Va ian en eine zusä zliche P o einbande, die dem jeweiligen Dime
en sp ich .
E gebnisse
102
3.2.3 Modi ika ion und Funk ionalisie ung on Filmen aus Cys ein-Va ian en on
eADF4(C16)
3.2.3.1 S uk u elle Cha ak e isie ung de Filme
Im Folgenden wu de un e such , ob die ü eADF4(C16) bes imm en Cha ak e is ika de
Filmbildung sowie de Filme selbs bei Ve wendung de Cys-P o eine e hal en bleiben. Es
zeig e sich, dass alle d ei P o eine zu Filmen p ozessie we den können. Dabei a en keine
signi ikan en Un e schiede zu eADF4(C16) au , wede bei de Filmhe s ellung noch bei de
s uk u ellen Un e suchung de P o eine in den Filmen. Exempla isch sind FTIR-Spek en
on aus HFIP gegossenen Filmen gezeig (Abb. 3.24). Sie weisen sowohl o als auch nach
Behandlung mi Me hanol abs. Cha ak e is ika e gleichba zu den en sp echenden
eADF4(C16)-Filmen au . Unbehandel e Filme zeigen FTIR-Maxima bei 1654 cm-1 und eine
Schul e bei 1638 cm-1 und bes ehen somi o nehmlich aus eine Mischung aus α-Helices
und ungeo dne en S uk u en. Eine ü β-Polyalanin ypische Abso p ion (um 964 cm-1) wa
nich zu e kennen. Diese Abso p ion a e s nach Me hanol-Behandlung au , welche auch in
den Cys-P o einen die Bildung on β-Fal bla -S uk u induzie und zu eine Ve schiebung
des Abso p ionsmaximums zu 1625 cm-1 üh (Abb. 3.24 b). Genauso glichen Filme
gegossen aus AS und Pu e denen aus eADF4(C16) (Da en nich gezeig ).
Abb. 3.24: FTIR-Spek en Cys-hal ige Va ian en im Ve gleich zu eADF4(C16). Gezeig sind aus HFIP
gegossene Filme ohne (a) bzw. mi Me hanol-Behandlung (b). n agCysC16-FL: mi Fluo escein-Maleimid
gekoppel es n agCysC16; RC: andom coil.
(nach Spiess e al., 2010b, mi eundliche Genehmigung des Ve lags Royal Socie y o Chemis y)
Mi Fluo escein modi izie es n agCysC16 bilde e Filme aus, die in ih e Sekundä s uk u
denen ohne Fluo escein gleichen (Abb. 3.24). Das kleine, hyd ophobe Fluo opho -Molekül
schein dahe nich signi ikan die Ausbildung de in a- und in e molekula en Wechsel-
wi kungen des Spinnenseidenp o eins zu beein äch igen, welche bei Bildung de ypischen
Films uk u au e en. Im Gegensa z dazu beein luss Fluo escein die Bildung on

E gebnisse
103
Hyd ogelen aus eADF4(C16) bzw. die Ano dnung de da in en hal enen Nano ib illen
(Schach & Scheibel, 2011).
Filme aus den Cys ein-Va ian en en sp achen somi in ih e Sekundä s uk u denen on
eADF4(C16). Auch ih e chemische Bes ändigkei gegenübe Wasse und Dena u ie ungs-
mi eln wa iden isch zu eADF4(C16)-Filmen ( gl. Kapi el 3.1.2).
3.2.3.2 Filmmodi ika ion
Wie in Kapi el 3.2.3.1 besch ieben, können modi izie e Spinnenseiden-Filme p inzipiell
du ch Assemblie ung on in Lösung modi izie em P o ein he ges ell we den. Diese
Möglichkei is jedoch du ch die A des anzub ingenden Moleküls limi ie . Abhängig on
de chemischen Na u und de G öße is eine Wechselwi kung bzw. Beein äch igung de
na ü lichen P o einassemblie ung zu e wa en. Dahe wu de die nach ägliche Kopplung
be ei s gebilde e Filme un e such . Zusä zlich bie e dies die Op ion, spezi isch die
Filmobe läche zu modi izie en (wiede um abhängig on den Eigenscha en des zu
koppelnden Moleküls) sowie gegebenen alls die Menge an eingese z en E ek o molekülen zu
minimie en. Die Dich e de unk ionellen G uppen kann zudem du ch He s ellung on Blends
ges eue we den.
Um F agen de g undsä zlichen Reak ion, wie die Zugänglichkei de Thiole im be ei s
assemblie en Film, zu klä en, wu de zunächs Fluo escein ü die Kopplungs eak ion
e wende . Anschließend wu den Filme mi e schiedenen E ek o molekülen modi izie .
Modi ika ion mi Fluo escein
Zu Modi ika ion wu den Filme aus den Cys ein-Va ian en on eADF4(C16) aus Lösung in
HFIP he ges ell und du ch Me hanol abs.-Behandlung wasse unlöslich gemach . Die
Kopplungs eak ion e olg e analog zu de in Lösung mi Fluo escein-Maleimid in
Anwesenhei on TCEP. Nach eine Inkuba ionszei on 2 h wu de nich gekoppel es
Fluo escein du ch meh maliges Waschen en e n . Eine e s e quali a i e Einschä zung de
Kopplung konn e übe Au nahmen de Filme mi els Fluo eszenz-Image e olgen. Zu
wei e en Analyse wu den die Filme jedoch in 6 M Guanidinium hiocyana (GdmSCN) gelös
und anschließend gegen T is-Pu e (10 mM T is/HCl, pH 8) dialysie . SDS-PAGE zeig e bei
allen d ei Cys-P o einen eine e olg eiche ko alen e Kopplung (Abb. 3.25). Du ch spezi ische
An egung on Fluo escein in einem Fluo eszenz-Image zeig en die Cys-P o eine ein Signal
au Höhe des P o ein-Monome s, wäh end kein Signal bei de Kon olle ohne Fluo escein zu
sehen is . Zudem wies eADF4(C16), welches zu Übe p ü ung de Kopplungsspezi iä
genu z wu de, keine lei Signale au . Nach anschließende Silbe ä bung wu den neben
E gebnisse
104
P o ein-Monome auch Dime e sich ba . Dies deu e da au hin, dass ein G oß eil de P o eine
( e mu lich im Inne en de Filme) nich ü Reduk ion bzw. Kopplung zugänglich sind. Da
nach de Kopplungs eak ion keine lei Reduk ionsmi el meh zugese z wu de, könn e es sich
auch um Dime e handeln, die wäh end de sich anschließenden Dialyse neu gebilde wu den.
Abb. 3.25: Kopplung on Fluo escein-Maleimid an Filme aus Cys ein-Va ian en on eADF4(C16). Fluo escein-
modi izie e Filme wu den ÜN in 6 M GdmSCN gelös , gegen 10 mM T is/HCl pH 8 dialysie und
anschließend analysie . (a) SDS-PAGE: Das Gel wu de im Fluo eszenz-Image (Ex.: 480 nm, Em.: 530 nm)
gescann und nach olgend eine Silbe ä bung de P o eine un e zogen. (+) mi bzw. (-) ohne gekoppel es
Fluo escein (b) Mi els HPLC-Analyse de gelös en Filme bes imm e Menge an gebundenem Fluo escein p o
Film, wobei die Filme aus un e schiedlichen Mischungs e häl nissen aus n agCysC16 und eADF4(C16) gegossen
wa en. Die S o menge an Fluo escein wu de du ch Ve gleich mi eine S anda dge aden e mi el .
(nach Spiess e al., 2010b, mi eundliche Genehmigung des Ve lags Royal Socie y o Chemis y)
Eine quan i a i e Bes immung des gebundenen Fluo esceins übe UV-Abso p ion wa
au g und de ge ingen Konzen a ionen nich möglich. Dahe wu de zu Quan i izie ung
Fluo eszenzspek oskopie in Kombina ion mi eine e s ell en S anda dge ade eingese z
(s. Kapi el 2.5.2). Du ch Analyse mi els HPLC konn e zudem ein Bei ag on e en uell noch
o handenem eien Fluo escein ausgeschlossen we den. Fü n agCysC16 e gab sich ein We
on 15,7 pmol Fluo escein p o cm2 Film (mi ca. 0,5 µm Dicke) (Abb. 3.25 b, 100 %).
Bezogen au die gesam e P o einmenge im Film en sp ich dies e wa 0,004 mol Fluo escein
p o mol P o ein.
Modi izie ung on Filmen mi a iie endem An eil an eADF4(C16) und eines Cys-P o eins
(n agCysC16) esul ie e in s eigende Fluo escein-Menge in Abhängigkei des An eils an Cys-
P o ein, wobei ein linea e Zusammenhang beobach e wu de. Dies s ell einen wei e en
Hinweis au die Spezi i ä de Reak ion da und e möglich das geziel e Eins ellen eines
gewünsch en Modi ika ionsg ads (Abb. 3.25 b).
Bei Be ach ung de gekoppel en Filme im kon okalen Fluo eszenzmik oskop zeig e sich
di use Fluo eszenz im gesam en Film. Da dies au Di usion des Fluo esceins in den Film
hindeu e , wu den zu wei e en Analyse Di usionsexpe imen e an Me hanol-behandel en
HFIP-Filmen du chge üh . Hie zu wu den Filme so be es ig , dass sie zwei Lumen eine
E gebnisse
105
Kamme oneinande enn en (Abb. 3.26 a). Eine s a indende Di usion konn e du ch UV-
bzw. luo eszenzspek oskopische Un e suchung es ges ell we den. Wei e e Analyse mi
Fluo eszenz-ma kie en Dex anen (FD) un e schiedlichen Molekula gewich s e gaben, dass
20 kDa FD scheinba ei du ch den Film di undie en kann. Dex ane mi 40 kDa und 70 kDa
e gaben einen Messwe on e wa 10 % des We es, de bei komple e Du chmischung zu
e wa en wä e (Abb. 3.26 b). Dahe schein die Ausschlussg öße de Filme zwischen 20 kDa
und 40 kDa zu liegen. Dass Fluo escein-Maleimid einen ge inge en We e gab, könn e
mögliche weise da au zu ückzu üh en sein, dass dieses kleine Molekül du ch hyd ophobe
Wechselwi kungen im Film gebunden bleib , was wei e e Di usion e hinde .
Abb. 3.26: Di usion on Fluo escein-Maleimid (Fl-Mal.) und Fluo escein-ma kie e Dex ane mi 20 kDa
(FD20), 40 kDa (FD40) und 70 kDa (FD70) Molekula gewich du ch eADF4(C16) Filme. Die Filme (1 mg/cm2)
wu den aus HFIP gegossen und mi Me hanol abs. nachbehandel . (a) Di usion on FD20 (links) bzw. on
FD40 ( ech s) nach 2 h Inkuba ion. (b) Gemessene Konzen a ion an FD in de un e en Kamme , angegeben in
% des We es, de bei op imale Du chmischung e hal en wü de.
Funk ionalisie ung mi e schiedenen E ek o molekülen: RGD-Pep id, Nanogold, Bio in und
β-Galac osidase
Mi Fluo escein konn en alle d ei Cys-P o eine e olg eich modi izie we den. Au g und de
höhe en Ausbeu e bei de Reinigung wu de ü die olgenden Ve suche nu n agCysC16
e wende . Zudem zeig e es höhe e S abili ä gegenübe Agg ega ion als C16C* und C*C16.
S anda dmäßig wu den ü alle olgenden Modi ika ionen Me hanol abs.-behandel e Filme
aus HFIP eingese z .
a) RGD-Pep id
Das be ei s in Lösung gekoppel e c(RGD K)-Maleimid (Abb. 3.23 a) wu de al e na i auch
an be ei s assemblie e n agCysC16 Filme gebunden (Abb. 3.27 a). Die Kopplung und Analyse
e olg e wie ü Fluo escein-Maleimid besch ieben. Mi 15,3 pmol gebundenem Pep id p o
cm2 Film e gab sich ein seh ähnliche We wie bei Fluo escein. Au g und de ge ingen
G öße des Moleküls schein eine eilweise Di usion in den Film auch hie plausibel. Die übe
beide S a egien he ges ell en Filme – einmal Kopplung o und einmal nach Filmbildung –
wu den im Wei e en in Zellkul u -Expe imen en eingese z (Kapi el 3.3).
E gebnisse
106
Abb. 3.27: Funk ionalisie ung ekombinan e Spinnenseiden ilme aus n agCysC16. (a) Kopplung on c(RGD K)-
Maleimid, de ek ie übe Fluo eszenz de mi els SDS-PAGE analysie en, gelös en Filme. (b) Gebundenes
Bio in, de ek ie mi els BCIP/NBT nach Inkuba ion mi S ep a idin-AP (blau- iole es Signal). De Nachweis
e olg e di ek au dem Film ( ech s) sowie nach Au lösen des Films und anschließendem Wes e n-Blo (links).
(c) Die Ak i i ä immobilisie e β-Galak osidase wu de du ch Reak ion mi X-Gal isualisie , wobei ein blaue
Niede schlag en s eh . (d) TEM-Analyse on mi Nanogold gekoppel en Filmen nach Ve s ä kung (gold-
enhance) ü 2 min. Als Kon olle (-) is ein eADF4(C16)-Film gezeig , welche de selben Kopplungsbehand-
lung un e zogen wu de (b und c) bzw. ein n agCysC16-Film ohne Zusa z on Nanogold, jedoch mi Inkuba ion in
Ve s ä ke lösung (d). Messbalken: b und c: 0,5 cm, d: 50 nm.
(nach Spiess e al., 2010b, mi eundliche Genehmigung des Ve lags Royal Socie y o Chemis y)
b) Bio in
Bio in, ein kleines wasse lösliches Vi amin, is bekann ü seine hohe A ini ä zu A idin und
S ep a idin. Die dabei ausgebilde e Bindung zähl zu den s ä ks en bekann en In e ak ionen,
welche ein au nich -ko alen en In e ak ionen basie en. Das Molekül wu de als Maleimid-
Konjuga ko alen an Spinnenseiden ilme gebunden. De Nachweis de e olg eichen
Immobilisie ung on Bio in e olg e mi S ep a idin, welches zu De ek ion an Alkalische
Phospha ase gekoppel wa (Abb. 3.27 b). Sowohl bei Du ch üh ung de Nachweis eak ion
di ek au dem Film als auch nach SDS-PAGE und Wes e nblo des au gelös en Films zeig e
sich eine spezi ische Reak ion bei n agCysC16. eADF4(C16) als Nega i kon olle hingegen
lie e e kein Signal.
c) β-Galak osidase
Zusä zlich wu de ein Mak omolekül au den Filmen immobilisie , was beispielsweise ü die
En wicklung on Biosen so en einen wich igen Sch i da s ell . Da ü wu de das Enzym β-
Galak osidase gewähl (MW des ak i en Te ame s: ~465 kDa), welches glykosidische
Bindungen spal e . Die ko alen e Anbindung an den Film wu de übe einen he e o-
bi unk ionalen Linke in eine sequen iellen Kopplung e eich (s. Kapi el 2.1.1.2 und
2.4.6.2). Diese besaß einen NHS-Es e zu Reak ion mi p imä en Aminen des Enzyms sowie
einen Maleimid-G uppe zu Immobilisie ung des Linke -Enzym-Komplexes au dem Thiol-
E gebnisse
107
hal igen Film. Nach einigen Waschsch i en zu En e nung on nich -gebundenem Enzym
wu de dessen Anwesenhei sowie Ak i i ä du ch Zugabe on X-Gal übe p ü . Dieses wi d
du ch ak i es Enzym gespal en, wobei ein unlösliches blaues P oduk en s eh . eADF4(C16)
Filme dien en als Kon olle, ob die Waschsch i e e ek i genug wa en um unspezi ische,
nich -ko alen e In e ak ionen zu e hinde n. Abb. 3.27 c zeig den posi i en Nachweis on
ak i em Enzym.
d) Nanogold
Eine Funk ionalisie ung mi Gold-Nanopa ikeln bie e die Möglichkei , du ch anschließende
Analyse im T ansmissionselek onenmik oskop (TEM) Einblicke in die äumliche Ano dnung
de gekoppel en Moleküle zu e hal en. In de Anwendung is Gold besonde s hinsich lich
seine spezi ischen Chemie und ka aly ischen Ak i i ä sowie wegen de dadu ch
e möglich en Lei ähigkei on In e esse. Die Kopplung e olg e in Fo m on Mono-
maleimido-Nanogold (mi einem Du chmesse on 1,4 nm) wie in Kapi el 2.4.6.2
besch ieben. Zu besse en De ek ie ba kei wu den die Goldpa ikel anschließend einem
Ve s ä kungssch i un e zogen, bei dem spezi isch wei e es Gold angelage wi d. Übe die
Inkuba ionsdaue de Ve s ä kung wi d die G öße de e hal enen Goldpa ikel beein luss .
Nach zweiminü ige Inkuba ion wa en Pa ikel on 2-5 nm Du chmesse im TEM zu
e kennen (Abb. 3.27 d). Die Signale wa en dabei mi 185 mol/cm2 übe die gesam e
Filmobe läche e eil , ohne dass ein Mus e zu e kennen wa . Aus den e hal enen
Au nahmen schein eine zu ällige Ano dnung de Moleküle an de Filmobe läche
wah scheinlich.
3.3 Un e suchung po en ielle Anwendungen on (modi izie en)
eADF4(C16)-Filmen
Filme aus dem ekombinan en Spinnenseidenp o ein eADF4(C16) bzw. seine Cys-Va ian en
wu den im Hinblick au zwei Anwendungs elde analysie . Eines ziel Rich ung bio-
medizinische Be eiche, wozu zunächs die g undsä zliche Ve äglichkei /Biokompa ibili ä
de Filme ge es e wu de (Kapi el 3.3.1). Als zwei es s anden Obe lächeneigenscha en de
Filme bei Beschich ung echnische Ma e ialien im Fokus (Kapi el 3.3.2).
3.3.1 Analyse de Biokompa ibili ä in Zellkul u -Un e suchungen
Eine Anwendung on au Spinnenseide basie enden Ma e ialien is besonde s im
medizinischen Be eich on g oßem In e esse. Wäh end ü na ü liche Spinnenseide eine gu e
Ve äglichkei bekann is (Rising e al., 2010; Al man e al., 2003; Allmeling e al., 2006),
lagen keine Da en zu In e ak ion des ekombinan he ges ell en P o eins eADF4(C16) mi

E gebnisse
108
biologischem Ma e ial o . E s e Anhal spunk e da ü lie e en in diese A bei in i o
Zellkul u -Expe imen e.
3.3.1.1 Gene elle Pa ame e de Filmp äpa a ion und Zellkul i ie ung
Im Folgenden wu de dahe die Kul i ie ung on Zellen au Filmen ekombinan e Spinnen-
seidenp o eine un e such . Als Zelllinie wu de MC3T3-E1 e wende (ACC 210, DSZM).
Dabei handel es sich um mu ine emb yonale Zellen de Schädeldecke. Sie sind ib o-
blas ena ig, können sich jedoch bei en sp echende S imulie ung auch zu Os eoblas en
di e enzie en. Diese Zelllinie inde b ei e Ve wendung in de Un e suchung on
Zelladhäsion und -p oli e a ion. Auße dem weis sie ein au c(RGD K) esponsi es In eg in-
Exp essionsmus e au (Kan lehne e al., 2000).
Die Zellkul u expe imen e wu den zum einen au eADF4(C16) Filmen du chge üh , welche
aus e schiedenen Lösungsmi eln gegossen wa en. Als wei e e Punk wu de de Ein luss
e schiedene Nachbehandlungsme hoden un e such . Zum ande en kamen mi RGD-Pep id
modi izie e Filme zum Einsa z.
Alle Filme wu den di ek aus de jeweiligen P o einlösung (3 mg/ml) in Zellkul u pla en aus
(unbehandel em) Polys y ol gegossen. Die P o einmenge be ug dabei 0,15 mg/cm2, was in
Filmen on e wa 0,5-1 µm Dicke esul ie . Nach Nachbehandlung und T ocknung de Filme
wu den sie jeweils zweimal mi PBS und dem e wende en Zellkul u -Medium gewaschen,
be o die Zellen da au ausgesä wu den. Als Kon olle dien en jeweils Polys y ol-Pla en
ohne Film („unbeschich e “) bzw. speziell ü gu e Zelladhäsion en wickel e, modi izie e
Polys y ol-Pla en („ Posi i kon olle“). Sowei nich ande s e me k , wu de imme
Zellkul u medium mi Zusa z on 10 % Kälbe se um (FKS) e wende .
3.3.1.2 Ein luss des Lösungsmi els
Zu Un e suchung, ob die Wahl des Lösungsmi els die In e ak ion de da aus gegossenen
Filme mi den Zellen beein luss , kamen mi Me hanol abs. nachbehandel e eADF4(C16)
Filme aus HFIP, Ameisensäu e und wäss ige Pu e lösung (wL) zum Einsa z. Die Zellen
wu den übe einen Zei aum on sieben Tagen au den Filmen kul i ie und zu e schiedenen
Zei punk en hinsich lich ih e Vi ali ä un e such . Diese wu de mi els WST-Assay bes imm
(s. Kapi el 2.8.2), welche die mi ochond iale Enzymak i i ä miss . Un e de Annahme, dass
alle i alen Zellen eine e gleichba e Enzymak i i ä au weisen, kann da aus auch indi ek
au die ela i e Zellzahl bzw. Zell e meh ung geschlossen we den. Die gemessenen We e
wu den jeweils au die Posi i kon olle no mie .
E gebnisse
109
Abb. 3.28: Zellak i i ä on MC3T3-Zellen au eADF4(C16) Filmen in Abhängigkei de Kul i ie ungsdaue .
Die Filme wu den aus dem jeweils angegebenen Lösungsmi el gegossen und mi Me hanol abs. behandel . Nach
24 h, 48 h, 4 d sowie 7 d Kul i ie ung de Zellen au den Filmen wu de ih e Viabili ä mi els WST-Assay
bes imm und au den e hal enen We de Posi i kon olle (Kul i ie ung in op imie en Zellkul u pla en)
no mie . Die We e wu den jeweils aus Vie achbes immung e hal en (n=4). Fü die Analyse nach 24 h, 48 h
sowie 4 d wu den jeweils 5 x 103 Zellen p o well ausgesä , ü den 7 d-Ve such 2,5 x 103 Zellen p o well.
Au Ameisensäu e-Filmen lieg die Zell i ali ä be ei s nach 24 h e was höhe als bei de
Posi i kon olle, wäh end au HFIP- und wL-Filmen zunächs eine nied ige e Vi ali ä
e gleichba de au unbeschich e en Pla en ohne Film beobach e wi d (Abb. 3.28). Mi
zunehmende Kul i ie ungsdaue s eig de We und be äg nach 4 d 70 % (HFIP) bzw.
100 % (wL) im Ve gleich zu Posi i kon olle. Nach 7 d weisen die Zellen au allen Filmen
We e übe 100 % au . Somi wi k eADF4(C16) in Fo m de hie un e such en Filme nich
cy o oxisch, sonde n e möglich eine Kul i ie ung und Ve meh ung de Zellen. Au Filmen
aus HFIP und wL schein die P oli e a ion e was e zöge , au Ameisensäu e-Filmen
hingegen e gleichba de Posi i kon olle.
Als wei e es wich iges K i e ium wu de die Mo phologie de Zellen au den Spinnen-
seiden ilmen be ach e . Lich mik oskopische Au nahmen (in Abb. 3.29 gezeig nach 48 h
Kul i ie ung au Seiden ilmen) zeigen eine ypisch lache, ausgeb ei e e Zellmo phologie au
allen Filmen, wobei keine signi ikan en Un e schiede zu den Kon ollpla en zu e kennen
sind.
E gebnisse
110
Abb. 3.29: Lich mik oskopische Au nahmen on MC3T3-Zellen nach 48-s ündige Kul i ie ung au mi
Me hanol abs. nachbehandel en eADF4(C16) Filmen gegossen aus Ameisensäu e (A), HFIP (B) ode wL (C).
Als Ve gleich dien en Zellen kul i ie in en sp echenden Pla en ohne Film (unbeschich e , E) sowie in speziell
behandel en Zellkul u pla en (Posi i kon olle, D). Messbalken: 100 µm.
Nach eine gewissen Inkuba ionszei (meis ca. 4 d) lös en sich die Zellen au allen Seiden-
ilmen im Gegensa z zu Zellkul u pla en ohne Film jedoch e s ä k als Zell e bund ab.
Du ch Aussäen eine ge inge en An angszellzahl konn en die Zellen jedoch 7 d und länge
au den Filmen inkubie we den, so dass de G und ü das Ablösen nich die zei liche
Exposi ion, sonde n die Kon luenz de Zellen zu sein schein . Ab E eichen eine gewissen
Zelldich e sind anscheinend die K ä e zwischen den Zellen s ä ke als die Adhäsion au dem
P o ein ilm. Um eine s ä ke e Adhäsion au den Filmen zu e eichen, wu den diese mi dem
be ei s besch iebenen RGD-Pep id modi izie (s. Kapi el 3.3.1.4).
Um zu übe p ü en, ob mögliche weise es liches o ganisches Lösungsmi el übe die Zei aus
den Filmen abgegeben wi d und das Zell e hal en bes imm , wu den Filme in einem
pa allelen Ansa z 4 d mi Medium allein inkubie (bei 37 °C) und die Zellen nach Medien-
wechsel ausgesä . Diese Behandlung üh e jedoch zu keine Ve ände ung des beobach e en
Zell e hal ens.
3.3.1.3 Ein luss de Nachbehandlung
Wie in Kapi el 3.1.1.2 gezeig , üh en die in diese A bei ge es e en Nachbehandlungsa en
alle zu eine e meh en Ausbildung on β-Fal bla -S uk u , so dass sich die jeweiligen
Filme kaum in ih e Sekundä s uk u un e scheiden. Alle dings wu den in Abhängigkei de
Nachbehandlung Un e schiede in de Obe lächenbescha enhei de Filme es ges ell
(s. 3.1.4). Dahe wu de im Folgenden übe p ü , ob sich dies au die In e ak ion mi Zellen
auswi k . Un e such wu den Filme, die jeweils übe Nach mi Alkohol (70 % und abs.) bzw.
E gebnisse
111
mi 1 M Kaliumphospha inkubie wo den wa en. Au g und de Toxizi ä on Me hanol
sowie de wei e b ei e en Anwendung on E hanol in Zellkul u a bei en wu de neben
Me hanol auch E hanol e wende .
Abb. 3.30: Zellak i i ä on MC3T3-Zellen au eADF4(C16) Filmen in Abhängigkei de Nachbehandlungs-
me hode. Die Filme wu den aus dem jeweils angegebenen Lösungsmi el gegossen und ÜN mi Me hanol (70 %
und abs.) bzw. 1 M Kaliumphospha (pH 8) behandel . HFIP-Filme wu den zusä zlich mi E hanol (E OH, 70%
und abs.) behandel . Nach 48 h Inkuba ion wu de die Zellak i i ä mi els WST-Assay bes imm (n=4) und au
den e hal enen We de Posi i kon olle (=100 %) no mie .
Abb. 3.30 zeig , dass eine Nachbehandlung mi Alkohol abs. ode Kaliumphospha zu
ähnlichen E gebnissen üh , welche zwischen Filmen aus den e schiedenen Lösungsmi eln
leich a iie en. Zwischen Me hanol und E hanol is dabei kein signi ikan e Un e schied
es zus ellen. Dies gil auch bei Nachbehandlung mi 70 %-igem Alkohol, wobei hie bei allen
Filmen die schlech es en We e e hal en wu den. Ve glichen mi de Posi i kon olle e eich
die Mi ochond ienak i i ä au diesen Filmen nu zwischen 35 % (HFIP) und 65 % (wL).
Um zu übe p ü en, ob diese nied igen We e bei Nachbehandlung mi 70 % Alkohol
mögliche weise du ch noch o handenen Alkohol e u sach we den, wu den die Filme
zusä zlich zu den sons angewende en zwei Waschsch i en ü 4 d mi Medium inkubie
(37 °C) und die Zellen anschließend nach Medienwechsel ausgesä . Diese Behandlung üh e
jedoch zu keine Ve ände ung des beobach e en E ek s.
Lich mik oskopische Un e suchungen de jeweiligen P obe bes ä ig diese Beobach ung.
Wäh end die Zellen au Filmen nachbehandel mi E hanol abs. und Kaliumphospha lösung
gu ausgeb ei e sind und denen au de Posi i kon olle en sp echen (Abb. 3.31 D-F), sind
au den P oben mi 70 % E hanol bzw. Me hanol nu wenig ausgeb ei e e Zellen zu e kennen.
De G oß eil de Zellen lieg hie in abge unde e Fo m und als Zellagglome a e o , was au
schlech e Adhäsionsmöglichkei en ü die Zellen hindeu e (Abb. 3.31 A-C).

Diskussion
119
4 Diskussion
Seidenp o eine s ellen au g und ih e mechanischen Eigenscha en, Biokompa ibili ä und
Abbauba kei ein po en iell iel e sp echendes Ausgangsma e ial ü e schiedens e
Ma e ialien und Anwendungsbe eiche da . Eine ü Beschich ungen ode (biokompa ible)
T äge sys eme in e essan e Anwendungs o m s ellen Filme da , welche z. B. aus ekombinan
he ges ell en Spinnenseidenp o einen gebilde we den können.
Die Eigenscha en on Seiden ilmen lassen sich au zwei Aspek e zu ück üh en: ih e
mak oskopischen Eigenscha en, wie Obe lächens uk u ie ung ode mechanische S abili ä ,
sowie ih e molekula e S uk u . Beides kann übe geeigne e Wahl des P o eins sowie de
Pa ame e bei de Filmhe s ellung beein luss we den, was eine Feinabs immung de
Filmeigenscha en an die An o de ungen bes imm e Applika ionen e laub (Schema 4.1).
Die in diese A bei analysie en Filme aus dem ekombinan en Spinnenseidenp o ein
eADF4(C16) wu den im Hinblick au die Pa ame e Lösungsmi el, Nachbehandlungs-
me hode, Tempe a u und Lu euch igkei un e such . Zudem wu den die Filme mi els pos -
ansla ionale chemische Kopplung di e se Moleküle unk ionalisie .
Schema 4.1: Ein luss e schiedene Pa ame e au Ma e ialeigenscha en on eADF4(C16)-Filmen.
Schema isch da ges ell sind die einzelnen Sch i e de Filmhe s ellung. Die Filmeigenscha en können dabei
du ch die Wahl einzelne ode kombinie e Fak o en kon ollie we den.
(nach Spiess e al., 2010a, mi eundliche Genehmigung des Ve lags John Wiley & Sons)
Diskussion
120
4.1 Ein luss e schiedene Pa ame e au die eADF4(C16) Sekundä -
s uk u in Filmen
4.1.1 Ein luss des Lösungsmi els
In wäss ige Pu e lösung (wL) zeig eADF4(C16) CD-Spek en ypisch ü uns uk u ie e
P o eine bzw. Polyp olin II-Helices, mi einem kleinen An eil ande e S uk u en. Dami
ähnel es de S uk u na i e MaSps (majo ampulla e Spid oine) in de Spinnd üse. Diese
wu de als eine Mischung dynamische helikale S uk u en bzw. ungeo dne e und Polyp olin
II-helikale Be eiche (Le e e e al., 2007a; Hiji ida e al., 1996) besch ieben. Zusä zlich
wu den α-Helices beobach e , welche jedoch den nich - epe i i en Te mini zugeo dne
wu den und somi in eADF4(C16) – welches nu den epe i i en Sequenz eil en häl – nich
o handen sind. In Filmen hingegen wa ein deu liche An eil an β-Fal bla -S uk u zu
sehen. Alle dings wiesen die aus Pu e gegossenen Filme s uk u elle Inhomogeni ä au , was
sich auch in ih em mechanischen Ve hal en und ih e Topologie mani es ie e.
Mögliche weise i beding du ch Lu s ömungen in de e wende en Klimakamme eine
inhomogene T ocknung de Filme au , was zu Ausbildung lokale Un e schiede in de
P o einkonzen a ion üh en wü de. Assemblie ungss udien on eADF4(C16) zeig en, dass
die Kine ik de Ausbildung on β-Fal blä e n – neben ande en Fak o en – di ek on de
P o einkonzen a ion abhäng (Slo a e al., 2008). Im Gegensa z dazu a en keine
e gleichba en Inhomogeni ä en in Filmen aus den o ganischen Lösungsmi eln au . Da
Wasse im Ve gleich zu HFIP und Ameisensäu e den nied igs en Damp d uck besi z , können
hie die ausgep äg es en T ocknungsa e ak e au e en. Zudem wu den mi els s a ische
Lich s euung auch nach Ul azen i uga ion de P obe ge inge Mengen on eADF4(C16)
Oligome en in wäss ige Lösung (nach Dialyse) de ek ie (s. Abb. 3.20). Diese könn en als
Agg ega ionskeime ungie en und so lokale S uk u un e schiede bedingen.
Auch ein un e schiedliche Wasse an eil könn e zu den beobach e en Un e schieden im
Amid I-Be eich de FTIR-Spek en üh en, da Wasse ein b ei es IR-Abso p ionssignal bei
e wa 1650 cm-1 e zeug . Alle dings wä e dies zusä zlich an eine e ände en Abso p ion
zwischen 3000 cm-1 und 3600 cm-1 zu e kennen, da sich in diesem Wellenzahlenbe eich
Valenz-schwingungen des Wasse s und die Amid A-Bande on P o einen übe lage n.
En sp echende Spek en wu den jedoch nich e hal en, so dass die e ände e Abso p ion de
Amid I-Bande au e ände e Sekundä s uk u de P o eine und nich au un e schiedlichen
Wasse gehal in den jeweiligen Filmbe eichen zu ückzu üh en is .
Diskussion
121
Lösungen on eADF4(C16) in HFIP weisen im Ve gleich zu wäss igen P o einlösungen
einen deu lich e höh en An eil an α-Helices au . Diese Helix-induzie ende Wi kung is ü
luo ie e Alkohole allgemein bekann , wobei HFIP den s ä ks en E ek bewi k (Gas e al.,
2001; Hi o a e al., 1997). Es konn e gezeig we den, dass dies au be o zug e Bindung des
HFIP an das Polypep id be uh , obwohl ein zusä zliche Bei ag du ch Modi izie ung de
Hyd a -/Sol a hülle des P o eins nich ausgeschlossen we den kann (Gas e al., 2001). Auch
nach Abdamp en des Lösungsmi els weisen HFIP-Filme den höchs en An eil α-helikale
S uk u alle un e such en Filme au . Zudem besi zen die Filme den ge ings en An eil an
β-Fal bla -S uk u und insbesonde e keine ü Seiden ypische β-Polyalanin-S uk u en.
Analyse mi els 13C-NMR bes ä ig e, dass die Alanin es e in Filmen aus HFIP o wiegend in
helikalen S uk u en (α-Helices und/ode 31-Helices) o liegen (Spiess e al., 2011;
du chge üh on D . C. Keenan, AG P o . J. Senke , Leh s uhl ü Ano ganische Chemie III,
Uni e si ä Bay eu h). Auch Glycin und P olin wa en eilweise in 31-Helices angeo dne ,
eine S uk u , welche auch im Seiden aden o lieg (Holland e al., 2008a). Signale ü β-
Fal bla -Kon o ma ion zeig e nu Glycin, wohingegen P olin, Glu amin und Ty osin andom
coil Kon o ma ionen zugeo dne wu den (Spiess e al., 2011).
Die Sekundä s uk u on eADF4(C16) gelös in Ameisensäu e konn e nich bes imm
we den. Im Film besaß das P o ein abe mi e wa 30 % den höchs en β-Fal bla -An eil. Eine
Induk ion on β-Fal bla -S uk u du ch Ameisensäu e wu de auch bei ande en P o einen
beobach e (Vasconcelos e al., 2008; Ha e al., 2005; Um e al., 2001). Die Wi kung
esul ie e mu lich aus In e ak ion de s a k pola en Säu e mi pola en Aminosäu e es en de
P o eine. Un e suchungen mi els T übhei smessung, DLS und FTIR-Spek oskopie e gaben,
dass Ameisensäu e egene ie es Fib oin eine sei s in Lösung s abilisie en kann, das P o ein
abe eine kompak e Fo m annimm , so dass die be ei s in äumliche Nähe liegenden
hyd ophoben Be eiche bei En e nen des Lösungsmi els zu eine e meh en Ausbildung
geo dne e β-Fal blä e üh (Vasconcelos e al., 2008; Um e al., 2003).
4.1.2 Ein luss chemische und physikalische Nachbehandlungsme hoden
Eine Nachbehandlung on Seiden ilmen mi Alkoholen und Kaliumphospha üh zu eine
Zunahme an β-Fal bla -S uk u de be eilig en Seidenp o eine. De E ek be uh e mu lich
au de Beein lussung de Hyd a -/Sol a hülle de P o eine sowie de S ä kung hyd ophobe
In e ak ionen. S a k pola e Alkohole, wie Me hanol und E hanol, beein lussen die
Dielek izi ä skons an en des Lösungsmi els und üh en zu En zug de Hyd a hülle des
P o eins (Um e al., 2003). Kalium- sowie Phospha -Ionen we den den kosmo open Ionen
de Ho meis e se ie zugeo dne (Baldwin, 1996; Ho meis e , 1888; Zhang & C eme , 2006).
Diskussion
122
Somi üh en beide Nachbehandlungsme hoden zu eine S ä kung hyd ophobe In e ak ionen
und somi zu be o zug en Ausbildung in e - und in amolekula e Wechselwi kungen de
Polypep ide im Ve gleich zu In e ak ionen mi umgebenden Lösungsmi elmolekülen. Diese
E ek spiel eben alls eine en scheidende Rolle bei de S uk u bildung on Seidenp o einen
wäh end des na ü lichen Spinnp ozesses, wo die Konzen a ion an Kalium- und Phospha -
Ionen im zwei en Abschni des Spinn ak s e höh wi d. Es wu de e mu e , dass dabei
besonde s Polyp olin II-S uk u en – welche in de Spinnd üse nachgewiesen wu den –
au g und ih e Geome ie he modynamisch begüns ig in β-Fal bla -S uk u en übe üh
we den können (Le e e e al., 2007a). In den hie un e such en Filmen gegossen aus HFIP
e gab eine NMR-Analyse, dass sich nach Behandlung mi Me hanol die Kon o ma ion on
Alanin- und Se in es en on Helices hin zu β-Fal bla ände , wobei nu e wa 10 % alle
Alanin es e in helikale S uk u e bleiben. Eine ähnliche S uk u ände ung, wenn auch in
ge inge em Ausmaß, wa ü Glycin zu beobach en (Spiess e al., 2011; du chge üh on
D . C. Keenan, AG P o . J. Senke , Ls . ü Ano ganische Chemie III, Uni e si ä Bay eu h).
Eine Induk ion on β-Fal bla -S uk u wa auch bei Filmen aus den ande en Lösungsmi eln
zu beobach en. Mi els FSD on FTIR-Spek en e gaben sich gleiche p ozen uale An eile an
β-Fal bla -S uk u in behandel en Filmen, unabhängig om Lösungsmi el und de
e wende en Nachbehandlungsme hode, was da au hindeu e , dass dami die he mo-
dynamisch güns igs e Kon o ma ion e eich is . Au g und de Ausgangss uk u in
unbehandel en Filmen wa die S uk u ände ung bei HFIP-Filmen am s ä ks en ausgep äg .
Ande e A bei en besch eiben eine Abhängigkei de Menge an gebilde en β-Fal blä e n on
de Konzen a ion des Alkohols (Lammel, 2010; Kweon & Pa k, 1999). Dies konn e in de
o liegenden A bei nich beobach e we den. Alle dings a en die g öß en Un e schiede . a.
bei Konzen a ionen un e halb 60 % au , welche hie nich un e such wu den. Ein wei e e
Fak o is zudem die Inkuba ionsdaue . Alle in diese A bei e wende en Filme wu den übe
Nach (ca. 16 h) nachbehandel . Zei au gelös e Messungen e gaben, dass bei den hie
e wende en Filmen (mi eine Dicke ≤ 15 µm) die g öß e Ände ung in de S uk u inne halb
on 30-60 min au a , jedoch übe einige S unden wei e hin zunahm (Da en nich gezeig ).
Nach diese Zei wa kein signi ikan e Un e schied (bzgl. de Sekundä s uk u ) zwischen
mi 70 % bzw. 100 % Alkohol nachbehandel en P oben zu e kennen, was au das E eichen
eines Gleichgewich s schließen läss .
Eine Zunahme an β-Fal bla -S uk u konn e zudem – mi Ausnahme on HFIP Filmen – bei
e höh e Lu euch igkei es ges ell we den. Ve mu lich e möglich die dadu ch e zöge e
E apo a ion des Lösungsmi els und s ä ke e Hyd a isie ung de P o eine die Ausbildung
Diskussion
123
möglichs s abile in e - und in amolekula e In e ak ionen. Da mi s eigende Lu -
euch igkei ein e höh e Wasse gehal in den Filmen es ges ell wu de, is auch eine di ek e
Be eiligung des Wasse s (übe Ausbildungen empo ä e H-B ücken) an molekula en
Umlage ungsp ozessen seh wah scheinlich. Bei Filmen aus HFIP nimm de Wasse gehal
mi s eigende Lu euch igkei eben alls zu. Hie e hinde abe mögliche weise de s a ke
Ein luss des Lösungsmi els eine Ände ung de Sekundä s uk u . Zum einen besi z dieses
Lösungsmi el (mi einem Siedepunk on 58,2 °C) den höchs en Damp d uck (~159 hPa bei
20 °C) de e wende en Lösungsmi el und üh somi zu schnells en T ocknung. Zum
ande en zeig en TGA-, DSC- und FTIR-Messungen, dass HFIP bei RT in den Filmen
gebunden bleib (e wa 16 Gewich sp ozen ).
Auch Tempe a u en obe halb on e wa 180 °C üh en zu eine Zunahme an β-S uk u ,
wobei bei HFIP-Filmen eine Ko ela ion mi dem Abdamp en des Lösungsmi els zu
e kennen wa . Eine e gleichba e S uk u ände ung a bei Ameisensäu e- und wL-Filmen
bei e was höhe en Tempe a u en au . Zwei E ek e scheinen hie bei zusammen zu spielen:
Eine sei s das Abdamp en des S uk u -beein lussenden Lösungsmi els und ande e sei s die
Zu üh ung eine Ene giemenge, welche molekula e Umlage ungen e möglich . Ein Ve gleich
mi DSC-Messungen an Me hanol-behandel en Filmen zeig , dass auch hie in einem
ähnlichen Tempe a u be eich (e wa 200 °C) Ände ungen au e en. De Ve sa z in diesen
Ku en kann in Anlehnung an E ah ungen mi Polyme en als Glasübe gang in e p e ie
we den (Eh ens ein e al., 1998; Magoshi e al., 1977; Magoshi & Nakamu a, 1975). Im Fall
on P o einen wu de dies als E höhung de Beweglichkei de Moleküle gedeu e , e mu lich
du ch Schwächung nich -ko alen e Bindungen (Mo a e al., 2002; Hu e al., 2008; F eddi e
al., 1999). Von en scheidende Bedeu ung is dabei de Hyd a isie ungsg ad de P o eine,
wobei ein höhe e Wasse gehal mi eine nied ige en Glasübe gangs empe a u Tg ko elie
wi d (Aga wal e al., 1997; Mo a e al., 2002; Hu e al., 2007). Auch dynamisch mechanische
Analyse e gab Ände ungen in dem mechanischen Ve hal en de Filme in einem ähnlichen
Tempe a u be eich. Abhängig om e wende en Lösungsmi el und de Nachbehandlungs-
me hode e lie en sie ab 150-210 °C ih e S ei igkei und zeigen plas ische Ve o mung, was
wiede um dem Au e en eines Glasübe gangs, und somi eine E höhung de molekula en
Mobili ä en sp ich . Ohne mechanische Belas ung üh dies zu e meh en Ausbildung
s abile β-Fal bla -S uk u en, wohingegen bei Anliegen ex e ne K ä e die mechanische
In eg i ä ze s ö wi d.

Diskussion
124
4.2 Beein lussung mak oskopische Eigenscha en
4.2.1 Chemische und he mische Bes ändigkei
Neben eine Beein lussung de Sekundä s uk u zeigen sich auch E ek e des e wende en
Lösungsmi els au mak oskopische Eigenscha en. So weisen die Filme je nach gewähl em
Lösungsmi el un e schiedliche Bes ändigkei gegenübe Wasse und Dena u ie ungsmi eln
au . Dies ko elie u. a. mi dem jeweiligen Gehal an β-Fal bla -S uk u . Wäh end β-Fal -
bla - eiche Filme (unbehandel e Ameisensäu e-Filme sowie alle nachbehandel en Filme) eine
chemische S abili ä e gleichba de des na ü lichen Seiden adens au weisen, nimm mi
abnehmendem β-Fal bla -An eil die Löslichkei in schwäche en Dena u ie ungsmi eln (wie
8 M Ha ns o ) zu. HFIP-Filme schließlich sind be ei s in Wasse gu löslich.
Im Gegensa z dazu zeig sich kein au ällige Un e schied de he mischen Bes ändigkei on
Filmen aus un e schiedlichen Lösungsmi eln. Bei den be ei s e wähn en Vo gängen des
Ve damp ens on Lösungsmi el bzw. de S uk u umwandlung hin zu β-Fal bla a iie en
sie nu leich in den jeweiligen Tempe a u en. The mische Ze se zung de Filme beginn
sowohl bei unbehandel en als auch Me hanol-behandel en Filmen alle Lösungsmi el bei
e wa 280 °C und zeig ih Haup signal bei 330 °C. Diese hohe Tempe a u bes ändigkei kann
e mu lich au den hohen An eil an β-S uk u en zu ückge üh we den, welche auch nach
E hi zen au 280 °C mi els FTIR-Spek oskopie nachzuweisen wa en. Au g und de
Tempe a u -induzie en Bildung on β-Fal blä e n un e scheiden sich unbehandel e Filme
nich in ih e S abili ä on (eben alls β-Fal bla - eichen) Me hanol-behandel en Filmen.
Zudem können du ch P ozesse wie Py olyse a oma ische Aminosäu en ode Au b echen on
Pep idbindungen Pep ide unabhängig on ih e Kon o ma ion ze se z we den.
4.2.2 Topog aphie
Sowohl die Wahl des Lösungsmi els als auch die Nachbehandlungsme hode üh e zu eine
un e schiedlichen Obe lächenbescha enhei de Filme. HFIP-Filme wiesen die gla es e
Obe läche au , was e mu lich an de nied igen Obe lächenspannung und dami
einhe gehend de gu en Bene zba kei de Obe läche sowie dem hohen Damp d uck des
HFIP lieg . Ve zöge e E apo a ion des Lösungsmi els könn e hingegen zu Au pla zen de
Filmobe läche üh en und somi die U sache ü die Löche bzw. Dellen in Ameisensäu e-
Filmen da s ellen. Filme aus wäss ige Lösung ielen . a. du ch eine he e ogene und aue e
Obe lächen opog aphie au . Dies s eh e mu lich in Zusammenhang mi de be ei s
besch iebenen ungleichmäßigen T ocknung de Filme ode de Anwesenhei on
Agg ega ionskeimen, welche auch zu Ausbildung lokale Un e schiede de Sekundä s uk u -
Diskussion
125
Zusammense zung üh . Ein ähnliche E ek au die Topog aphie (he e ogene und aue
Obe läche) wu de bei Nachbehandlung alle Filme mi Wasse , wasse -hal igen Alkoholen
ode Phospha pu e beobach e . Eine mögliche U sache könn en Umlage ungen de
Moleküle nach Hyd a isie ung in Zusammenspiel mi dynamische Bildung/Au b echen on
Wasse s o -B ücken da s ellen. In e essan e weise a de E ek nich bzw. nu in seh
ge ingem Ausmaß au , wenn Me hanol-behandel e Filme mi Wasse inkubie wu den. Die
Me hanol-induzie e, kompak e β-Fal bla -S uk u schein nich meh du ch Wasse
beein luss zu we den. Ähnliches gil ü den na ü lichen Seiden aden: Du ch Bene zung mi
Wasse komm es zu Supe kon ak ion; hyd a isie und umgelage we den alle dings nu
die Be eiche mi wenige geo dne e S uk u , wohingegen k is alline β-Fal bla -Regionen
un e ände bleiben (Holland e al., 2008b; Holland e al., 2004; Liu e al., 2005).
Eine Nachbehandlung mi einem Me hanol e ände die Topog aphie de Filme nu
ge ing ügig und esul ie in den gla es en und homogens en Obe lächen de nach-
behandel en Filme.
4.2.3 Mechanische Eigenscha en und Rückschlüsse au molekula e Ano dnung
Mechanisches Ve hal en
Die Wahl des Lösungsmi els zeig e einen deu lichen E ek au die mechanischen
Eigenscha en de jeweiligen Filme, sowohl in unbehandel e als auch Me hanol-behandel e
Fo m. Wiede um läss sich ein Zusammenhang mi de in den Filmen o liegenden
Sekundä s uk u e kennen. Eine gene elle Ko ela ion bes imm e mechanische Pa ame e
mi dem Gehal an β-Fal bla -S uk u wu de be ei s ü Filme aus Seiden ib oin besch ieben
(Vasconcelos e al., 2008; Jiang e al., 2007). Die Wi kung be uh e mu lich da au , dass
egelmäßig angeo dne e β-Fal bla -Be eiche als physikalische Que e ne zung ungie en und
dem Molekül e bund so Fes igkei e leihen (Ke en & Buehle , 2010). Dies mani es ie sich
in eine E höhung de maximalen Zugspannung und de S ei igkei (E-Modul), wohingegen
die Dehnba kei abnimm . Es wu de besch ieben, dass de linea -elas ische Be eich am
Beginn eine Spannungs-Dehnungs-Ku e du ch das Zusammenspiel on β-Fal blä e n und
lexible en S uk u en bes imm wi d (Te monia, 1994). Ein höhe e An eil an β-S uk u en
üh zu s ei e em Ve hal en, da sie pe se un lexible sind und du ch Ausbildung on
„Kno enpunk en“ z usä zlich die Beweglichkei de lexible en Be eiche einsch änken. Diese
gene elle Zusammenhang i auch au die hie un e such en Filme zu: Me hanol-
Behandlung üh e bei allen Filmen zu eine Zunahme de Zugspannung und des E-Moduls.
Auch pe se β-Fal bla - eiche e Filme zeig en hie höhe e We e als jene mi nied ige em
Gehal . Dies wa auch an Filmen aus Pu e lösung zu sehen, die en sp echend ih e
Diskussion
126
s uk u ellen Inhomogeni ä un e schiedliche mechanische Kennwe e e gaben. Plas isches
Ve hal en, zu e kennen an eine Ab lachung de Spannungs-Dehnungs-Ku e mi Dehnung
bei eduzie em K a au wand, a nu bei Filmen mi nied igem β-Fal bla -An eil (HFIP und
wL Typ I) au . Dies be uh e mu lich au eine S eckung und/ode En lech ung on
Polypep idke en, beglei e om Au b echen einige Wasse s o b ücken in den lexible en
Regionen (Te monia, 1994; Ke en & Buehle , 2010). Diese Vo gänge we den in den
β-Fal bla - eichen Filmen wohl du ch dich e e Packung de Moleküle bzw. meh
In e ak ionspunk e eingesch änk . Zu mechanischem Ve sagen, d. h. dem Reißen de Filme,
komm es e mu lich du ch Au b echen in e molekula e Wechselwi kungen. Besonde s
Wasse s o -B ücken zwischen den einzelnen β-Fal bla -S ängen, abe auch die G enz läche
zwischen lex ible en Ke en und s a en β-Fal bla -K is allen sind da ü en scheidende
Fak o en (Ke en & Buehle , 2010).
Die gene elle Ko ela ion zwischen β-Fal bla -Gehal und mechanischen Pa ame e n
bes ä ig e sich jedoch nich bei Me hanol-behandel en Filmen. Ve gleich man de en
Eigenscha en un e einande , zeigen sich Un e schiede o z gleichen An eils an β-Fal -
blä e n. Beispielsweise sind Me hanol-behandel e HFIP-Filme wenige zug es und mi eine
seh ge ingen Dehnba kei die sp ödes en de un e such en Filme. De G und hie ü könn e
in de Ausdehnung und Ve knüp ung de β-Fal bla -S uk u en liegen. MD-Simula ionen
zeig en, dass die mechanische S abili ä on β-Fal blä e n zunächs mi zunehmende Anzahl
an H-B ücken bzw. mi zunehmende Länge de S änge und zunehmende S apelg öße s eig
(Ke en & Buehle , 2008a; Ke en e al., 2010). Ab Übe sch ei en eine k i ischen G öße (Höhe
und Länge) bzw. Geome ie on β-Fal bla S uk u en nimm die S abili ä jedoch apide ab
(Ke en & Buehle , 2008a; Ke en e al., 2010). Beg ünde wi d dies dami , dass die Wi kung
on Sche k ä en ab eine gewissen Geome ie ele an wi d und zum Au b echen de
S uk u üh , wohingegen bei kleine e Geome ie ein sog. slip-s ick-Mechanismus pos ulie
wi d. Diese üh zum Lösen on H-B ücken und Glei en eines β-S anges pa allel zu den
ande en S ängen, was die Neuausbildung in e molekula e In e ak ionen e möglich . Diese
wiede keh ende Zyklus on Lösen und Neuausbildung on Wasse s o -B ücken üh
schließlich zu eine höhe en mechanischen S abili ä diese β-Fal bla -S uk u en.
Au g und de s a ken und ab up en S uk u ände ung, die in HFIP-Filmen nach En e nen des
Lösungsmi els du ch Me hanol-Behandlung au i , bilden sich mögliche weise β -Fal bla -
Ano dnungen, welche sich ungüns ig au die mechanische Belas ba kei auswi ken (Abb.
4.1). Zudem äll au , dass in g oßem Ausmaß Helices de S uk u ände ung un e liegen und
die esul ie enden Filme den ge in gs en α-Helix-An eil au weisen. In Filmen mi ini ial
Diskussion
127
höhe em Gehal an β-Fal blä e n sind die Ve ände ungen du ch die Nachbehandlung wenige
ausgep äg und gleichmäßige au die Sekundä s uk u elemen e e eil . Zudem wu de ü
Filme aus egene ie em B. mo i Seiden ib oin, welche aus Ameisensäu e gegossen wu den,
pos ulie , dass die be ei s o handenen S uk u en eine Ausbildung on K is allen mi
g oße Fe no dnung (long- ange o de ) en gegenwi ken (Um e al., 2003).
Abb. 4.1: Modell übe e schiedene Ano dnung on β-Fal bla -S uk u in Me hanol-behandel en Filmen
gegossen aus HFIP ode Ameisensäu e (AS) bzw. wäss ige Pu e lösung (wL). P eile s elle n β-Fal bla -
Be eiche da , wäh end g aue Linien ungeo dne e und lexible helikale Be eich ep äsen ie en.
Au eine un e schiedliche Ano dnung/Ve knüp ung on β-Fal bla -S uk u en deu en auch
die E gebnisse de dynamisch mechanischen Analyse hin. De Ab all des Speiche moduls
kann als Ände ung de Molekül e knüp ung bzw. Zunahme de Ke enbeweglichkei
in e p e ie we den. Bei unbehandel en Filmen is eine Ko ela ion de Tempe a u dieses
Ab alls T' mi dem Gehal an β-Fal bla zu beobach en. Mi zunehmendem Gehal s eig T' in
de Reihen olge HFIP < wL I < Ameisensäu e (AS) < wL II. In Me hanol-behandel en Filmen
a iie T' eben alls, alle dings zeigen HFIP-Filme hie die höchs e Tempe a u (Reihen olge:
wL I < AS < wL II < HFIP). Somi wi d hie meh Ene gie benö ig , um eine en sp echende
Mobili ä de Moleküle zu e eichen, was ausgedehn e e β-Fal bla -Regionen e klä en
wü den.
O ien ie ung
Eine un e schiedliche s uk u elle Zusammense zung bzw. Ve knüp ung de Moleküle in den
e schiedenen Filmen spiegel sich auch in de Aus ich ung de in β-Fal bla -S uk u
o liegenden Polyalanin-Blöcke (β-Polyalanine) als Reak ion au ex e ne Zugbelas ung
Diskussion
134
Lösungsmi el-Gemisch könn e dahe auch die Rauhei de Filmobe läche eine U sache ü
die beobach e en Un e schiede in de Bene zba kei da s ellen, wobei Filme aus HFIP mi
dem kleins en Winkel am hyd ophils en und Ameisensäu e-Filme am hyd ophobs en wa en.
Zwischen den un e schiedlichen mi Seiden ilmen beschich e en Subs a en hingegen a iie e
die Rauhei nu in wesen lich ge inge em Maße als die Bene zba kei , so dass die e ände en
Obe lächeneigenscha en e mu lich au wei e e Fak o en zu ückzu üh en sind. Eine
Ände ung des Bene zungs e hal ens kann beispielsweise du ch s uk u elle Un e schiede und
Umlage ungen beg ünde sein, wenn dadu ch ande e unk ionelle G uppen exponie we den
bzw. ande e Wechselwi kungen, beispielsweise e mi el übe Wasse s o b ücken, au e en
(T e inniko & Tamada, 2001). Auch die hie un e such en eADF4(C16)-Filme un e scheiden
sich in ih e Sekundä s uk u -Zusammense zung je nach e wende em Subs a , wobei alle
Filme nach Me hanol-Behandlung analysie wu den. Die au Glas gegossenen Filme weisen
einen nied ige en An eil an β-Fal bla und einen höhe en An eil an α-Helices und andom
coil-Kon o ma ion au als die au Te lon bzw. Polys y ol.
Mögliche weise e hinde n s abilisie ende Wechselwi kungen zwischen hyd ophilen
G uppen de Glasobe läche und des P o eins eine e izien e (Me hanol-induzie e)
Umlage ung diese Be eiche in β-Fal bla -S uk u en, wohingegen hyd ophobe Obe lächen
de en Ausbildung ö de n. De dadu ch höhe e An eil lexible S uk u elemen e könn e dazu
üh en, dass be o zug hyd ophobe Sei eng uppen an de G enz läche zu Lu exponie und
pola e G uppen da on abgewand we den. Au g und ehlende In e ak ionspa ne (missing
neighbou e ec s), welche bei ungesä ig en pola en G uppen einen g öße en ene ge ischen
Ein luss haben als bei hyd ophoben, wü de diese Aus ich ung die eie Ene gie an de
G enz läche Polyme -Lu minimie en (T e inniko & Tamada, 2001). Bei Filmen mi
höhe em β-Fal bla -An eil sind hingegen die F eihei sg ade de Moleküle besch änk , so dass
hie e gleichsweise meh hyd ophile Sei enke en obe lächenexponie o liegen.
Demen sp echend esul ie da aus ein kleine e Bene zungswinkel bei Au b ingen au
hyd ophobe Subs a e und ein g öße e Bene zungswinkel – en sp echend eine hyd o-
phobe en Obe läche – des P o ein ilms au Glassubs a .
In Anlehnung an Polyme chemie kann eADF4(C16) au g und seine amphiphilen
Eigenscha en auch als Block-Copolyme be ach e we den. Dahe können die o liegenden
E gebnisse auch un e diesem Gesich spunk in e p e ie we den.
Bei Sys emen aus zwei chemisch e schiedenen Molekülklassen ode Phasen A und B e olg
meis eine eilweise En mischung und die Ausbildung on Mesophasen. Je nach Mischungs-
e häl nis bzw. Volumenan eil de Phasen A und B we den un e schiedliche Ano dnungen

Diskussion
135
eingenommen. Dazu gehö en sphä ische S uk u en (je nach Volumen e häl nis on A in
eine Ma ix aus B ode umgekeh ), zylind ische S uk u en ode bei annähe nd gleiche
Volumen e eilung on A und B Lamellen (Ma sen & Ba es, 1996; Rabo yago a e al.,
2011). Be ach e man β-Fal bla -S uk u en, welche bei Seidenp o einen o wiegend aus
unpola en bzw. hyd ophoben Aminosäu en gebilde we den, als Phase A und helikale bzw.
ungeo dne e S uk u en, welche ehe pola e und geladene Aminosäu en en hal en, als Phase
B, wä en auch hie un e schiedliche Ano dnungen denkba . Bei hohem An eil an β-
Fal blä e n s ellen diese die „Ma ix“ da , wäh end sich hyd ophile e Be eiche au g und
besse e In e ak ionsmöglichkei en zusammenlage n. An de G enzschich zu Lu wü den
sich die Moleküle dann so aus ich en, dass die pola en, hyd ophile en Be eiche de Lu
zugewand sind, da sie kaum übe Wechselwi kungen mi den Molekülen de Filmma ix
s abilisie we den. Umgekeh wü den sie sich bei eine Filmma ix aus ehe pola en
G uppen dem Film zuwenden, wohingegen hyd ophobe e Sei enke en an de G enz läche
exponie wü den (Abb. 4.2). Hinzu komm , dass bei einem nied ige em β-Fal bla -An eil
meh unpola e Aminosäu en in lexible S uk u o liegen und somi obe lächenak i
angeo dne we den können, wohingegen ein G oß eil de hyd ophoben Res e in un lexible en
β-S uk u en in eg ie sind.
Ähnliche S uk u en wu den kü zlich in einem Modell zu Ano dnung Spinnenseiden-
ähnliche Block-Copolyme e in Langmui -Blodge Filmen mi einem hyd ophoben An eil
on e wa 46 % o geschlagen. Auch hie wu de als G undlage eine Phasensepa a ion de
hyd ophoben bzw. hyd ophilen Blöcke e mu e (K ishnaji e al., 2011).
Abb. 4.2: Modell zum Ein luss des Subs a s au die Obe lächeneigenscha en eine eADF4(C16)-
Beschich ung. Abhängig on de Hyd ophobizi ä des Un e g undes o dnen sich die Moleküle un e schiedlich an
und p äsen ie en un e schiedliche Sei enke en und/ode S uk u en an de G enz läche zu Lu (Wohl ab,
Spiess e al., in Vo be ei ung)
Diskussion
136
Micellen-a ige S uk u en konn en bishe mi els kon okale Fluo eszenzmik oskopie in
Filmen gegossen au Te lon beobach e we den (Wohl ab, 2010). Alle dings wa hie
Fluo escein an eADF4(C16) gekoppel , so dass diese S uk u en auch du ch den Fa bs o
beding sein können. Ande e sei s s ell dies ein Beispiel ü Mesos uk u ie ung, induzie
du ch die chemische Na u des Moleküls, da . Um eine Aussage übe die Ano dnung de
P o eine im Film e en zu können, müssen wei e e Un e suchungen du chge üh we den.
Des Wei e en wu de bei de hie angewende en Messung de Sekundä s uk u nich zwischen
de S uk u in G enz lächennähe bzw. im Filminne en un e schieden.
Ein Ve s ändnis des zug unde liegenden Mechanismus des beobach e en Obe lächene ek s
könn e e lauben, bes imm e Obe lächeneigenscha en geziel du ch Beschich ung mi
eADF4(C16)-Filmen einzus ellen.
4.5 Biokompa ibili ä on eADF4(C16) Filmen – in i o Zellkul u -
expe imen e
Ein iel e sp echendes und b ei disku ie es Einsa zspek um on Seidenma e ialien lieg im
Be eich de Medizin echnik und des Tissue Enginee ing. Hie we den biokompa ible, s abile,
abe dennoch abbauba e Ma e ialien als Ge üs gesuch , welche die Anhe ung, Mig a ion,
P oli e a ion und Di e enzie ung de jeweiligen Zellen e lauben (Leal-Egana & Scheibel,
2010; Widhe e al., 2010). Die Biokompa ibili ä on Ma e ialien wi d haup sächlich du ch
zwei Fak o en bes imm . Diese sind eine po en iell schädliche ode oxische Wi kung des
Ma e ials bzw. da aus eigese z e Komponen en sowie die In e ak ion des Ma e ials mi
Zellen (Anselme, 2000; Ramsden, 2008). So is die Möglichkei de Adhäsion ü die meis en
Zella en nö ig zum Übe leben, wäh end bei ehlende In e ak ion Apop ose eingelei e wi d
(Leal-Egana & Scheibel, 2010). Eine e olg eiche Adhäsion um ass die Zellanha ung,
-ausb ei ung, O ganisa ion des Cy oskele s und die Ausbildung on okalen Adhäsionen
(LeBa on & A hanasiou, 2000) und beein luss die Fähigkei de Zellen zu p oli e ie en und
sich zu di e enzie en (Anselme, 2000).
Sowohl B. mo i-Seide als auch Spinnenseidenp o eine gel en als iel e sp echende
Kandida en, welche einen G oß eil de An o de ungen e üllen. So zeigen die na ü lichen
P o eine (bei B. mo i-Seide nach En e nen de Se icin-Hülle) keine bzw. ge inge Toxizi ä
und induzie en keine Immunan wo , we den langsam abgebau und können unk ionalisie
we den (Leal-Egana & Scheibel, 2010; Widhe e al., 2010; Rising e al., 2011; Mu phy &
Kaplan, 2009; Wang e al., 2006). Na ü liche Spinnenseiden äden konn en kü zlich
e olg eich zu Regene a ion pe iphe e Ne en in Ra en eingese z we den (Allmeling e al.,
Diskussion
137
2008; Allmeling e al., 2006). Im Gegensa z zu dem na ü lichen Faden lagen keine Da en übe
die Ve äglichkei des ekombinan he ges ell en eADF4(C16) o . Im Rahmen diese A bei
wu den e s mals Ve suche zu Biokompa ibili ä on eADF4(C16) du chge üh , welches
dabei in Fo m on dünnen Filmen eingese z wu de.
Gene ell zeig en die hie un e such en eADF4(C16)-Filme gu e Biokompa ibili ä , wobei die
Vi ali ä de un e such en Zellen (mu ine ib oblas ena ige P ä-Os eoblas en de Zelllinie
MC3T3-E1) nach 48 h Kul i ie ung au den Filmen zwischen 70 % und 110-120 % (im
Ve gleich zu speziell behandel en Zellkul u pla en) lag, und es somi keine Hinweise au
Cy o oxizi ä de P o ein ilme gab. Fü die e s en Ve suche wu den Filme aus e schiedenen
Lösungsmi eln sowie un e schiedliche Nachbehandlungsme hoden ge es e , auch wenn ü
spä e e Anwendungen ein wäss iges Sys em zu be o zugen is , bei dem keine po en iell
gesundhei sschädlichen Subs anzen in ol ie sind.
Ein nach eilige Ein luss de e wende en Lösungsmi el konn e in diese A bei nich
es ges ell we den. Jedoch un e schieden sich die Anhe ung und die P oli e a ion de Zellen
je nach gewähl en Pa ame e n. Au Ameisensäu e-Filmen wa das bes e Zellwachs um zu
beobach en, wäh end au Filmen aus HFIP und Pu e lösung (wL) eine A lag-Phase au a .
Mögliche weise we den on an angs schwach adhä ie en Zellen P o eine de Ex azellulä en
Ma ix (ECM) seze nie , was im Folgenden die Adhäsion sowie das Wachs um wei e e
Zellen ö de (Ramsden, 2008). Beispielsweise wu de die e meh e P oduk ion und
Ablage ung on Kollagen Typ I du ch e schiedene humane Zelllinien beobach e , welche
au Seidenma e ialien kul i ie wu den (Kasoju e al., 2009; Ga cia, 2005). Denkba wä e
auch eine Umges al ung ( emodeling) de Filmobe läche, beispielsweise du ch P o eolyse,
was die anschließende Anhe ung wei e e Zellen e leich e . Ein en sp echende
Mechanismus wu de ü die Bindung an Kollagen besch ieben (Schmid & F iedl, 2010).
Hinweise au an änglich zu wenige Adhäsionsmöglichkei en geben die eilweise beobach e en
ex em langen Zell o sä ze, welche e en uell ausgebilde we den, um g oße Dis anzen
zwischen gu en Adhäsionsmöglichkei en zu übe b ücken.
Ve schiedene Nachbehandlungsme hoden beein luss en die Anhe ung de Zellen eben alls.
Wäh end Inkuba ion mi einem Me hanol bzw. E hanol ode Kaliumphospha lösung zu
Filmen mi gu en, e gleichba en E gebnissen üh e, wa au Filmen, die mi 70 % Alkohol
nachbehandel wu den, eine wesen lich schlech e e und inkonsis en e Adhäsion zu
beobach en. Du ch meh ägige Vo inkuba ion de Filme mi Medium ohne Zellen konn e ein
nega i e E ek du ch e en uell aus e endes Lösungsmi el wei gehend ausgeschlossen
we den. Die jeweiligen Filme wiesen nach Behandlung mi allen Me hoden eine
Diskussion
138
e gleichba e S uk u zusammense zung au . Jedoch un e scheiden sie sich in ih e
Hyd ophobizi ä (wobei de Bene zungswinkel an Lu bes imm wu de) sowie ih e Rauhei
(Schema 4.3). Hie bei wiesen die mi 70 %-igem Alkohol nachbehandel en Filme die
hyd ophils e Obe läche (im ockenen Zus and) und eine aue, inhomogene Topog ahie au .
Schema 4.3: Ve gleich de Hyd ophobizi ä und Rauhei on e schieden nachbehandel en eADF4(C16) Filmen
mi ih e Eigenscha , die Adhäsion bzw. P oli e a ion on MC3T3-E1 Zellen zu e möglichen. Die angegebene
Hyd ophobizi ä bezieh sich au Kon ak winkelmessungen, welche an Lu du chge üh wu den. In de obe en
Zeile sind jeweils die Nachbehandlungsme hoden angegeben, in de un e en die Lösungsmi el.
Beide Pa ame e sind en scheidende K i e ien ü eine e olg eiche Zelladhäsion. Diese
e olg am jeweiligen Un e g und en wede übe nich -spezi ische In e ak ionen ode P o ein-
e mi el (Campillo-Fe nandez e al., 2009; Leal-Egana & Scheibel, 2010). Bei beiden
Mechanismen spiel die Obe lächenchemie und die Hydophobizi ä des Subs a s eine
wich ige Rolle, wobei hyd ophobe e Ma ices die Adso p ion on Se ump o einen, und dami
nach olgend die Adhäsion de Zellen, e leich e n (Campillo-Fe nandez e al., 2009). Die
Aussagen übe eine be o zug e Hyd ophobizi ä sind jedoch nich eindeu ig und
un e scheiden sich je nach Zell yp (Jeong e al., 2009). Zellen de Linie MC3T3-E1
adhä ie en be o zug au Pep id-beschich e en Mica-Obe lächen, welche Bene zungswinkel
mi Wasse on e wa 60° au wiesen (Qiu e al., 2010). Ein ähnliche We wu de ü
Me hanol-behandel e eADF4(C16) Filme aus Ameisensäu e bes imm , au welchen die
höchs e Zellp oli e a ion gemessen wu de.
Auch die Topog aphie des Un e g undes beein luss die Adhäsion, P oli e a ion, Aus ich ung
und Di e enzie ung on Zellen (Gil e al., 2010b; Min e al., 2004; Zhang e al., 2010). Auch
hie ehlen jedoch allgemeingül ige Aussagen. Gene ell gel en z. B. im Fall on Implan a en,
welche in ensi en Zellkon ak benö igen, aue e Obe lächen o eilha e als gla e. Hie bei
wi d eine Rauhei im Nanome e -Be eich (e wa 1 nm) genann (Ramsden, 2008). In diesem
Be eich liegen somi die gla e en de un e such en eADF4(C16) Filme, wie e wa mi
Me hanol behandel e HFIP- und Ameisensäu e-Filme. Bei Kul i ie ung on Zellen au
Subs a en mi he e ogene Obe lächens uk u ie ung wu de zudem eine e zöge e
Ausbildung okale Adhäsionspunk e au den aue en Be eichen beobach e (Zinge e al.,
Diskussion
139
2004). Somi lieg eine mögliche E klä ung ü die beobach e en Un e schiede de
Zelladhäsion und -p oli e a ion au eADF4(C16) Filmen, welche e schiedenen Nach-
behandlungsme hoden un e zogen wu den, in ih en jeweiligen Obe lächeneigenscha en.
In i o wi d das Zell e hal en du ch die Zusammense zung de ECM bes imm , wobei neben
spezi ischen In e ak ionen die mechanischen Eigenscha en des Un e g undes eine wei e e,
en scheidende Rolle spielen (Janmey e al., 2009; Yeung e al., 2005). Diese können im Fall
on P o ein ilmen u. a. du ch den Wasse gehal und die Sekundä s uk u beein luss we den,
wobei ein höhe e β-Fal bla -An eil in s ei e en Ma ices esul ie (Minou a e al., 1990).
Dahe könn e eine un e schiedliche Elas izi ä de eADF4(C16) Filme eben alls einen
k i ischen Pa ame e da s ellen; dies wu de in de o liegenden A bei jedoch nich analysie .
Insgesam wa die Anhe ung de Zellen an die un e such en eADF4(C16)-Filme jedoch nich
daue ha . Nach E eichen eine gewissen Kon luenz lös en sich die Zellen als Ve bund om
Un e g und ab, was au die P äsenz s ä ke e anziehende K ä e zwischen den Zellen (übe
Zell-Zell-Kon ak e) als zum Un e g und hindeu e . Diese schwache Adhäsionsk a in
Kombina ion mi de dennoch o handenen Biokompa ibil ä (bzw. ehlende cy o oxische
Wi kung) könn e ü Anwendungen in e essan sein, bei denen ein zu s a kes Einwachsen on
Zellen in ein Implan a nich e wünsch is , beispielsweise um eine Fib osebildung
o zubeugen.
Zusä zlich konn e die Adhäsion de Zellen an die Filme du ch Anb ingen eines zyklischen
RGD-Pep ids e besse we den. Dieses Aminosäu emo i (RGD) is Bes and eil iele
In eg in-E kennungss ellen in de ECM und wu de dahe be ei s e olg eich zu Op imie ung
de Zelladhäsion du ch spezi ische In eg in- e mi el e In e ak ion eingese z (He sel e al.,
2003; Ruoslah i, 1996). Kopplung des Pep ids an gelös es P o ein mi anschließende
Assemblie ung in den Film e wies sich als e ek i e ü e besse e Zelladhäsion als
nach ägliche Kopplung an den Film. Die Wi ksamkei des Pep ids häng eine sei s on seine
E eichba kei und Flexibili ä an de Obe läche ab, um an die en sp echende Bindes elle im
In eg in zu gelangen. Als zwei e en scheidende Fak o wu de die Menge bzw. Dich e des
Pep ids sowie seine äumliche Ano dnung besch ieben (He sel e al., 2003; Dunehoo e al.,
2006). Ausgehend on de ü die nach ägliche Kopplung on Nanogold e mi el en Dich e
(185 mol/cm2) lieg die Menge an RGD-Pep id im un e en Be eich de als e ek i
besch iebenen Moleküldich e (Shin e al., 2003). Demnach sp ich die s ä ke adhäsions-
ö de nde Wi kung des in Lösung gekoppel en RGD-Pep ids ü eine höhe e Ve ügba kei
des Pep ids an de Obe läche. In wei e üh enden A bei en soll e dahe die op imale Dich e
und Ano dnung (z. B. übe Mischungs e häl nisse des gekoppel en P o eins mi nich -

Diskussion
140
modi izie em eADF4(C16)) un e such we den. Dass auch die Kopplung on Fluo escein
alleine die Zellanha ung in gewissem Um ang begüns ig e, kann e mu lich au die dadu ch
e zeug e, s ä ke e Hyd ophobizi ä de Filmobe läche zu ückge üh we den (s. oben).
4.6 Eigenscha en und Po en ial de un e such en Spinnenseiden ilme im
Ve gleich zu B. mo i Seiden ib oin-Filmen bzw. ande en Ma e ialien
Die mechanischen Eigenscha en de hie un e such en eADF4(C16)-Filme a iie en in
Abhängigkei des e wende en Lösungsmi els sowie de Nachbehandlung. Gene ell e wiesen
sich die Filme mi eine S ei igkei on 2-4 GPa und eine maximalen Zug es igkei im
Be eich on 40-70 MPa als mechanisch belas ba , jedoch wenig dehnba . Diese mechanischen
G undcha ak e is ika bleiben bis zu Tempe a u en on 180-210 °C e hal en. Obe halb diese
Tempe a u s eig die Beweglichkei de Moleküle und das Ma e ial e weich . Die he mische
Ze se zung de Filme schließlich beginn e was un e halb on 300 °C und zeig seinen
maximalen Peak um 330 °C. En scheidend ü die hohe Tempe a u -Bes ändigkei de
eADF4(C16)-Filme is . a. die cha ak e is ische Sekundä s uk u de P o eine, da bei
P o ein-basie en Ma e ialien mi einem hohen α-Helix-An eil (z. B. Ke a in) be ei s ab
200 °C die Dena u ie ung de Helices beobach e wi d (S ini asan e al., 2010).
Mi diesen Eigenscha en liegen die eADF4(C16)-Filme im Be eich on Polylac onsäu e
(PLA) ode biologisch abbauba en Polyamiden (PA6), wobei sie jedoch eine deu lich höhe e
Glasübe gangs empe a u und somi un e ände e mechanische In eg i ä bis zu höhe en
Tempe a u en besi zen (s. Tabelle 4.1). Ve glichen zu Filmen aus Polylac id-co-Glycolid
(PLGA) ode P o einen wie Kollagen ode Soja, welche in de Medizin bzw. Nah ungsmi el-
indus ie Ve wendung inden, sind sie deu lich zug es e , jedoch auch sp öde (s. Tabelle 4.1).
Diskussion
141
Tabelle 4.1: Mechanische und he mische Kennwe e ausgewähl e Ma e ialien. TZe s.: Ze se zungs empe a u ,
Tg: Glasübe gangs empe a u . n.a: nich angegeben
Ma e ial
Zug es ig-
kei
B uch-
dehnung
E-Modul
TZe s.
Tg
Re e enz
MPa
%
GPa
°C
°C
eADF4(C16)
40-71#
1,7-3
2,4-3,8
285-336
195-210
diese A bei
eADF4(C16) + 40%
Glyce in, nachbeh. mi
50% MeOH
12
100
0,04
n. a.
n. a.
(Lammel, 2010)
B. mo i Seiden ib oin
(SF), egene ie
24 -30
1,7-1,9
2,9-3,4
270-298
178
(Vasconcelos e al., 2008;
Law ence e al., 2010; Jin
e al., 2005)
SF/Ke a in Blend (mi
40-50% Ke a in-An eil)
9,1-17,8
1,2-2,2
1,4-20
264-298
185
(Vasconcelos e al., 2008)
T opoelas in
( ekombinan , human)
n. a.
n. a.
7,2 x 10-3
(Nanoinden a ion)
310
190
(Hu e al., 2010)
Kollagen
0,5a-4,2b
45-56c
1,2-4,0
x 10-3 (a, c)
n. a.
n. a.
a (Zo lu una e al., 2009)
c (Sheu e al., 2001;
Cha ula ha & Raja am,
2003)
Ke a in (Schwamm)
0,05
17-19
n. a.
200-250‡
n. a.
(Vasconcelos e al., 2008;
S ini asan e al., 2010)
Soja (P o einisola )
1,2-4,1
105-186
0,1
n. a.
n. a.
(Gue e o e al., 2010;
P uneda e al., 2008)
PLA (Polylac onsäu e)
65
6,7
1,5-2,7
173-178
(Schmelzen)
60-65
(A men ano e al., 2010;
Cheung e al., 2008)
PLGA (Polylac id-co-
Glycolid)†
0,5-5
43-56
1,4-2,8
n.b.
50-55
(Lammel e al., 2011;
A men ano e al., 2010)
PA6 (Polyamid6)
58
17
1,5
227
n.b.
(Liu e al., 2003)
† je nach Mischungs e häl nis:50/50, 85/15, 90/10; ‡ Dena u ie ung de α-Helix; # je nach Lösungsmi el und Nachbehandlung
Ve glichen mi Filmen aus egene ie em B. mo i Seiden ib oin e geben sich ähnliche
Cha ak e is ika, wie z. B. mechanische G undeigenscha en und molekula e Vo gänge un e
he mische Belas ung. Alle dings weisen die hie un e such en eADF4(C16)-Filme bei
en sp echende Dehnba kei sowohl höhe e S ei igkei und Zug es igkei , als auch höhe e
Tempe a u bes ändigkei au .
U sachen da ü sind e mu lich in de P imä - sowie Sekundä s uk u beide P o einsys eme
zu inden. eADF4(C16) besi z wenige Ladungen (ausschließlich nega i e) und e was
ge inge e Hyd opa hizi ä als die schwe e Ke e des B. mo i Seiden ib oins (SF), jedoch bei
einem wesen lich ge inge en Molekula gewich . Dabei is zu beach en, dass g öße e
Ke enlängen p inzipiell mi höhe e mechanische S abili ä einhe gehen. Auch bes ehen
Filme aus egene ie em SF no male weise aus eine Mischung de schwe en und leich en
Ke e sowie P25, wohingegen in eADF4(C16)-Filmen nu eine P o einkomponen e o lieg .
Un e schiede inden sich zudem in de Aminosäu esequenz, insbesonde e ü die Ausbildung
de hochgeo dne en β-Fal bla -S uk u en. Diese k is allinen Be eiche we den in SF du ch
das Aminosäu emo i (GAGAGS)n gebilde , in ADF4 und dem ekombinan en eADF4(C16)
Diskussion
142
hingegen . a. du ch An (Vepa i, 2007; Heim e al., 2009; Bini e al., 2004; Huemme ich e
al., 2004a). Zusä zliche hyd ophobe Wechselwi kungen zwischen den Alanin es en könn en
dabei einen Zugewinn an S abili ä bewi ken. In dem jeweiligen na ü lichen Faden beide
Seiden ypen wu de zudem eine un e schiedliche Ano dnung de β-Fal blä e beobach e . So
en häl B. mo i Seide meh k is alline Be eiche, wäh end in d agline Seide ein höhe e An eil
eie (nich in k is allinen Be eichen angeo dne ) β-S uk u en zu inden is (Du e al., 2011).
Neben den pos ulie en Auswi kungen au mechanische Cha ak e is ika de Fäden (Du e al.,
2011) könn en ähnliche s uk u elle Un e schiede auch bei Filmen de en Mechanik
beein lussen.
Insgesam zeichnen sich die hie un e such en eADF4(C16)-Filme du ch die ekombinan e,
und dami monodispe se P oduk ion de zug unde liegenden Moleküle und ih e ep oduzie -
ba e He s ellung sowie a iable P ozessie ungsmöglichkei en aus. Übe die Wahl und
Kombina ion e schiedene Pa ame e wäh end de Filmbildung können dessen
Eigenscha en ges eue we den. Die Sekundä s uk u de P o eine im Film wi d dabei s a k
om e wende en Lösungsmi el, de Nachbehandlung sowie Umgebungspa ame e n
kon ollie . Ge ade das Lösungsmi el üh zu Un e schieden, welche auch nach
Nachbehandlung noch Auswi kungen z. B. au das mechanische Ve hal en zeigen. Inso e n
is ein Ve s ändnis de molekula en Ano dnung und Vo gänge ein wich iges K i e ium zu
He s ellung on Filmen mi passgenauen Eigenscha en. Wäh end mak oskopische
Eigenscha en wie Obe lächen opog aphie ode die chemische Bes ändigkei du ch die Wahl
des Lösungsmi els und de Nachbehandlungsme hode a iie we den können, lassen sich
Fak o en wie die Dehnba kei de Filme nu inne halb eines engen Fens e s beein lussen.
Jedoch kann du ch Zusa z on Weichmache n, wie Glyce in ode PEG, die Dehnba kei de
Filme au ≥ 100 % ges eige we den (Lammel, 2010; Spiess e al., 2010a). Auch is eine
deu liche Ände ung de mechanischen Eigenscha en bei höhe e Lu euch igkei bzw. un e
Wasse zu e wa en, was im Rahmen diese A bei jedoch nich aus üh lich ge es e wu de.
Übe e schiedene Me hoden wie sal leaching ode Zusa z on PEG können zudem Po en
eine de inie en G öße in den Filmen e zeug ode d eidimensionale Sca olds (Ge üs e)
he ges ell we den (Spiess e al., 2010a; Lammel, 2010; Teßma e al., 2005). Ein Einsa z
solche S uk u en ode de Filme selbs ü di ek en Zellkon ak und Gewebe egene ie ung
schein ealisie ba , da sich in e s en Ve suchen eine gu e Biokompa ibili ä de Filme zeig e.
Die Möglichkei , Ma e ialien mi els ausschließlich au wäss igen Lösungsmi eln
basie enden P ozessen he zus ellen, is ein wei e e en scheidende Vo eil.
Spinnenseiden ilme konn en aus wäss ige Lösung assemblie we den, und eine
Diskussion
143
Nachbehandlung mi Kaliumphospha üh zu eine Zunahme an β-Fal bla -S uk u und
dami zu eine höhe en mechanischen und chemischen S abili ä . Alle dings zeig en die Filme
– zumindes ab eine gewissen G öße – sowohl s uk u elle als auch mak oskopische
Inhomogeni ä . Um bei diesem Sys em ep oduzie ba homogene Filme zu e hal en, soll e de
He s ellungsp ozess wei e op imie we den.
Schließlich bie en die Filme die Möglichkei eine Viel al on Funk ionalisie ungen. Als
ekombinan he ges ell es P o ein kann eADF4(C16) geziel gene isch und auch chemisch
modi izie we den, was in diese A bei du ch Kopplung di e se Molekülklassen an
Cys ein-Mu an en on eADF4(C16) demons ie wu de.
Mi diesen Eigenscha en s ellen Spinnenseiden ilme basie end au eADF4(C16) in e essan e
Ma e ialien da , die sich eine sei s du ch inhä en e Eigenscha en de Spinnenseide – wie
mechanische und he mische S abili ä sowie Biokompa ibili ä – auszeichnen, ande e sei s
du ch ih e Flexibili ä in de P ozessie ung sowie iel äl ige Funk ionalisie ba kei au
e schiedens e Anwendungen angepass we den können.