Funk ion und Ein luss de nich - epe i i en, e minalen
Domänen au Speiche ung und Assemblie ung on
Spinnenseidenp o einen
Disse a ion
Zu E langung des G ades
- Dok o de Na u wissenscha en -
im P omo ionsp og amm „Molekula e Biowissenscha en“ de
Bay eu he G aduie enschule ü Ma hema ik und Na u wissenscha en
(BayNAT)
Lukas Eisold
Molekula e Bio echnologie (Mas e o Science)
Bay eu h 2013
Die o liegende A bei wu de in de Zei on Feb ua 2008 bis Janua 2013 in Bay eu h
am Leh s uhl Bioma e ialien un e Be euung on P o esso D . Thomas Scheibel ange e -
ig .
Volls ändige Abd uck de on de Bay eu he G aduie enschule ü Ma hema ik und Na-
u wissenscha en (BayNAT) de Uni e si ä Bay eu h genehmig en Disse a ion zu E -
langung des akademischen G ades eines Dok o s de Na u wissenscha en (D . e . na ).
Disse a ion einge eich am: 05.06.2013
Zulassung du ch das Lei ungsg emium: 10.06.2013
Wissenscha liches Kolloquium: 24.09.2013
Am ie ende Di ek o : P o . D . F anz Xa e Schmid
P ü ungsausschuss:
P o . Thomas Scheibel (E s gu ach e )
P o . F anz Xa e Schmid (Zwei gu ach e )
P o . Ola S emmann (Vo si z)
PD D . S ephan Schwa zinge
Fü Tina
Inhal s e zeichnis
Inhal s e zeichnis
Tabellen- und Abbildungs e zeichnis ................................................................ I
Abkü zun gs e zeichnis .................................................................................... III
Ku z assung de A bei ...................................................................................... 1
Abs ac ................................................................................................................ 3
1. Einlei ung ......................................................................................................... 5
1.1 Seiden ................................................................................................................................ 5
1.2 Spinnenseiden ................................................................................................................... 5
1.3 Au bau on Spinnenseidenp o einen ................................................................................ 8
1.4 Die e minalen Domänen ................................................................................................ 11
1.5 Majo Ampulla e Seide ................................................................................................... 13
1.5.1 Die P o eine de MA-Seide .......................................................................................... 13
1.5.2 S uk u de epe i i en Ke ndomäne ....................................................................... 15
1.5.3 Die e minalen Domänen on MaSp-P o einen ....................................................... 16
1.5.3.1 Die S uk u de amino e minalen (NT) Domäne............................................. 17
1.5.4 Nano- und Mik os uk u ie ung de MA-Fase ........................................................ 19
1.5.5 De na ü liche Spinnp ozess .................................................................................... 20
1.6 Rekombinan e Spinnenseidenp o eine ............................................................................ 22
1.7 Assemblie ungseigenscha en on ekombinan en Spinnenseidenp o einen ................. 23
1.7.1 Fase n aus ekombinan e Seide ............................................................................... 23
1.8 Zielse zung ...................................................................................................................... 25
2. Synopsis .......................................................................................................... 27
2.1 Übe sich de e wende en P o eine ............................................................................... 27
2.2 Die NR3-Domäne ........................................................................................................... 28
2.2.1 Lösungss uk u de NR3-Domäne .......................................................................... 28
2.2.2 Ein luss on Salz und Sche k ä e au das NR3-Dime ........................................... 30
2.2.3 Zusammen assung: NR3-Domäne ........................................................................... 31
2.3 Ein luss on NR3 au das Lösungs e hal en on eADF3((AQ)n) P o einen ................. 31
2.3.1 Bildung on sup amolekula en Assembla en ........................................................... 31
Inhal s e zeichnis
2.3.2 Ein luss de NR3-Domäne au phospha induzie e Agg ega ion on Seiden-
p o einen ........................................................................................................................... 32
2.3.3 Ein luss on Sche k ä en au die Assemblie ung on eADF3-P o einen mi
NR3-Domäne .................................................................................................................... 34
2.3.4 Modell zum Ein luss de NR3-Domäne wäh end des Spinnp ozesses .................... 37
2.4 He e odime isie ung on NR3-NR4-Kons uk en .......................................................... 38
2.4.1 Bildung des He e odime s ........................................................................................ 38
2.4.2 Assemblie ungseigenscha en des He e odime s ..................................................... 39
2.4.3 Assemblie ungsmo phologien de Homodime e im Ve gleich zum
He e odime ...................................................................................................................... 39
2.4.4. Bedeu ung des He e odime s .................................................................................. 40
2.5 De Ein luss de e minalen Domänen au die O ien ie ung de epe i i en
Ke ndomäne on ekombinan en Spinnenseidenp o einen .................................................. 41
2.5.1 pH-abhängige Un e suchung de N1- und N1L-P o eine mi els CD- und
Fluo eszenzspek oskopie ................................................................................................. 42
2.5.2 SEC-MALS-Analyse de N1- und N1L-P o eine .................................................... 44
2.6 Modell des na ü lichen Spinnp ozesses .......................................................................... 45
3. Li e a u e zeichnis ...................................................................................... 48
4. Publika ionslis e............................................................................................. 56
5. Da s ellung des Eigenan eils ........................................................................ 57
6. Teila bei en .................................................................................................... 58
Teila bei I ............................................................................................................................ 58
Teila bei II ........................................................................................................................... 73
Teila bei III .......................................................................................................................... 82
Teila bei IV ....................................................................................................................... 103
Teila bei V ......................................................................................................................... 111
Rech liches ....................................................................................................... 120
Anhang ............................................................................................................. 121
Danksagung ...................................................................................................... 124
Abbildungss e zeichnis
I
Tabellen- und Abbildungs e zeichnis
Abbildung 1: O dnungen, Un e o dnungen, Familien und A en on Webspinnen. .................. 6
Abbildung 2: Die e schiedenen Seidena en eines Radne zspinne ........................................... 7
Abbildung 3: Schema ische Da s ellung de zwei Spid oinklassen ........................................... 8
Abbildung 4: Ve gleich de epe i i en Sequenzen de e schiedenen Spid oin A en. .......... 10
Abbildung 5: Ve gleich de Homologie e minale Sequenzen on e schiedenen
Spid oina en und Spezies......................................................................................................... 12
Abbildung 6: Schema ische Da s ellung on MaSp-P o einen und Sequenz e gleich
epe i i e Blöcke on MaSp 1 und 2 Spid oinen ..................................................................... 14
Abbildung 7: Sequenz e gleich de amino- und ca boxy e minalen Domänen on MA-
P o einen ................................................................................................................................... 17
Abbildung 8: S uk u de amino e minalen Domäne on MaSp1 aus E. aus alis ................. 18
Abbildung 9: Nano- und Mik os uk u ie ung de MA-Fase ................................................. 19
Abbildung 10: Schema ische Da s ellung des Spinnappa a s ................................................... 21
Abbildung 11: Übe sich de in diese A bei e wende en ekombinan en
Spinnenseidenp o eine .............................................................................................................. 27
Abbildung 12: Lösungss uk u on NR3. ................................................................................ 29
Abbildung 13: Phospha ionen induzie e Agg ega ion on eADF3-P o einen. ....................... 33
Abbildung 14: Un e suchung sche k a induzie e Assembla e on eADF3((AQ)24) und
eADF3((AQ)12NR3) mi els Lich mik oskopie. ....................................................................... 35
Abbildung 15: Pola isie e FTIR Messungen an sche k a induzie en Assembla en on
eADF3((AQ)24 und eADF3((AQ)12NR3) ............................................................................... 36
Abbildung 16: Ein luss de NR-Domäne au die Assemblie ung on
Spinnenseidenp o einen ............................................................................................................ 37
Abbildung 17: AFM-Au nahmen de d ei dime en Spezies ..................................................... 40
Abbildung 18: Molekula es Modell des Spinnp ozesses inne halb de MA-D üse ................. 46
Abbildung 20: pH-abhängige Fluo eszensmessungen on N1-P o einen. ............................... 43
Abbildung 21: SEC-MALS Analyse on N1-eADF3 und N1-eADF3-NR3 P o einen in
Abhängigkei om pH-We . .................................................................................................... 44
Tabellen e zeichnis
II
Tabelle 1: Ve gleich de mechanischen Eigenscha en on ausgewähl en
Spinnenseiden ase n und syn he ischen Fase ma e ialien. ......................................................... 7
Tabelle2: Übe sich de Sequenzmo i e de epe i i en Einhei en on MA-, MI- und
Flagelli o m-spid oinen .............................................................................................................. 9
Tabelle 3: Übe sich de häu igs en Aminosäu en in den einzelnen Spid oinsequenzen ........... 9
Tabelle 4: Mechanische We e on Fase n au Basis on ekombinan en
Spinnenseidenp o einen im e gleich mi na ü liche MA-Seide ............................................. 24
Abbildungss e zeichnis
III
Abkü zungs e zeichnis
ADF A aneus diadema us ib oin
AFM A omic o ce mic oscopy
CD Ci cula Dich oismus
CTD Ca boxy e minale Domäne
DLS Dynamische Lich s euung
eADF enginee ed ADF
FPLC as liquid ch oma og aphy
FTIR Fou ie T ans o m In a o
GdmHCl Guanidinhyd ochlo id
HSQC he e onuclea single quan um cohe ence
MaSp Majo Ampulla e Spid oin
NMR Nuclea magne ic esonance
NTD Amino e minale Domäne
ppm pa s pe million
msd oo mean squa e de ia ion
SEC size exclusion ch oma og aphy
MALDI-MS Ma ix-assis ed Lase Deso p ion/Ioniza ion Massenspek ome ie
MALS mul i angle ligh sca e ing
TEM T ansmissionselek onenmik oskopie
Einlei ung
[6]
Abbildung 1: O dnungen, Un e o dnungen, Familien und A en on Webspinnen. Die O dnung de
Webspinnen un e eil sich in die d ei Un e o dungen Vogel- Wol s- und Ech e Webspinnen. Inne halb de
Ech en Webspinnen (A aneomo phae) sind die ne zbauenden Spinnen in de Supe amilie (SF) de Ne zspin-
nen (A aneoidae) zusammenge ass . Baldachin- (Linyphiidae), Haubenne z- (The idiiae) und Ech e Radne z-
spinnen (A aneidae) s ellen die d ei a en eichs en Ne zspinnen da und e geben zusammen ca. ein Vie el
de O dnung de Webspinnen. Bekann e und gu un e such e A en de Ne zspinnen sind die Ga enk euz-
spinne (A aneus diadema us), die Goldene Radne zspinne (Nephila spp.) sowie die Schwa ze Wi we (La o-
dec us hespe us)
Weibliche Radne zspinnen sind in de Lage bis zu sieben e schiedene Seidena en, in
da ü spezialisie en D üsen zu p oduzie en. Allein ün diese Seiden we den benö ig um
ein Radne z zu bauen (Abbildung 2). Die Seiden aus den G oßen Ampullen- (Majo Am-
pulla e, MA) und Flagelli o md üsen (Flag) bilden mi Rahmen, Speichen und Fangspi ale
den Haup eil des Ne zes. Zu Ve s ä kung, z.B. an länge en Spann äden, wi d die Seide
aus de kleinen Ampullend üse (Mino Ampulla e, MI) e wende . Ve anke wi d das
Ne z mi Hil e de Py i o mseide. Dami die Beu e nach dem Einschlag du ch das Zu ück-
ede n des Ne zes nich he ausgeschleude wi d, is die Fangspi ale in egelmäßigen Ab-
s änden mi de kleb igen Agg ega seide beschich e . Die beiden nich am Ne zbau be ei-
lig en Seiden we den ü das Einwickeln de Beu e (Acini o m) sowie zu He s ellung des
Eischale (Tubili o m- bzw. auch manchmal Cylind i o mseide) e wende .
Ne zspinnen (SF)
A aneoidae
Baldachinspinnen
Linyphiidae
Ech e Radne zspinnen
A aneidae
Goldene Radne zspinne
Nephila spp.
Ga enk euzspinne
A
aneus diadema us
Haubenne zspinnen
The idiidae
Schwa ze Wi we
La odec us hespe us
Vogelspinnen
Mygalomo phae
W
ebspinne
n
A aneae
Ech e Webspinnen
A aneomo phae
Gliede spinnen
Meso helae
Einlei ung
[7]
Abbildung 2: Die e schiedenen Seidena en eines Radne zspinne. Weibliche Radne zspinnen können bis
zu sechs e schiedene Seidena en sowie eine Klebesubs anz in da ü spezialisie en D üsen bilden. Die
en sp echenden Seiden sind in de G a ik o da ges ell . Modi izie nach [3].
Ein wesen liche Teil de Faszina ion ü Spinnenseiden is in den mechanischen Eigen-
scha en de Fase n beg ünde , die denen on syn he ischen Hochleis ungs ase n zum Teil
übe legen sind (Tabelle 1).
Tabelle 1: Ve gleich de mechanischen Eigenscha en on ausgewähl en Spinnenseiden ase n und
syn he ischen Fase ma e ialien.
Beg i se klä ungen: Reis es igkei = K a , die benö ig wi d bis die Fase eiß . Dehnba kei = Länge,
bezogen au die Ausgangslänge um die die Fase gedehn we den kann, bis sie eiß . Zähigkei = Ene gie,
die benö ig wi d um die Fase zu ze eißen. De We e echne sich aus Reiß es igkei , Dehnba kei und
dem Que schni de Fase .
Ma e ial Reis es igkei
(GPa)
Dehnba kei
(%)
Zähigkei
(MJm-3)
Quelle
Majo Ampulla e-
Seide
1,1 27 160
[4]
Mino Ampulla e-
Seide
0,9 33 137
[5]
Flagelli o m-Seide 0,5 270 150 [4]
Acini o m-Seide 1,1 40 230 [5]
Hochleis ungss ahl 1,5 0,8 6
[4]
Ke la 3,6 2,7 50
Nylon 0,9 18 80
Majo Ampulla e
(MA) Seide
Rahmen, Speichen,
Abseil aden
Flagelli o m (Flag)
Seide
Fangspi ale
Agg ega -Seide
kleb ige Beschich ung
de Fangspi ale
Mino Ampulla e
(Mi) Seide
Hil sspi ale und
Ne z e s ä kung
Py i o m-Seide
Ne z e anke ung
Acini o m-Seide
Einwickeln on Beu e
Tubili o m-Seide
Eischale
Einlei ung
[8]
Die Spinnenseiden ase n weisen eine besonde s hohe Zähigkei (E klä ung siehe Tabelle
1) au , was haup sächlich au die hohe Dehnba kei zu ückzu üh en is . So zeig die Fla-
gelli o mseide de Fangspi ale eine hohe Elas izi ä und kann bis zu 600% e e sibel ge-
dehn we den, wäh end die MA-Seide des Rahmens und de Speichen eine hohe Reiß es-
igkei bei ge inge e Elas izi ä au weisen. Du ch die un e schiedlichen Reis es igkei en
und Dehnba kei en de Seiden in einem Radne z kann de Au p all on liegende Beu e,
die g öße und schwe e als die Spinne is , ohne Schädigung des Ne zes abge ede we den
[6].
1.3 Au bau on Spinnenseidenp o einen
Säm liche Spinnenseiden ase n bes ehen g öß en eils aus einem ode meh e en P o einen,
welche als Spid oine bezeichne we den, die zwischen 250 und 650 kDa g oßen sind und
alle den gleichen schema ischen Au bau besi zen. Sie bes ehen aus eine g oßen epe i i en
Ke ndomäne, die ca. 90% des P o eins ausmach sowie zwei nich - epe i i en, e minalen
Domänen. Die Spid oine lassen sich anhand de Länge de epe i i en Blöcke in zwei
Klassen un e eilen (Abbildung 3).
Abbildung 3: Schema ische Da s ellung de zwei Spid oinklassen. Säm liche Spid oine bes ehen aus
eine epe i i en Ke ndomäne (blau) und den nich - epe i i en amino e minalen (NT) und ca boxy e minalen
(CT) Domänen. Anhand de Länge de epe i i en Blöcke de Ke ndomäne lassen sich die Spid oine in zwei
Klassen ein eilen. Die Blöcke in Klasse I (A) weisen eine du chschni liche Länge on 30-60 Aminosäu en
au und we den wiede um on den Mo i en (A)n, (GA)n, GGX, GPGXX au gebau . Die Längen de bis zu
100 mal wiede hol en Blöcke un e scheiden sich inne halb des Spid oins zum Teil signi ikan . Die G öße de
Blöcke in Klasse II (B) eine Länge be äg 180-360 Aminosäu en. Sequenz und Länge de zwischen 16-25
mal o kommenden Blöcke sind inne halb eines Spid oins nahezu iden isch.
In de e s en Klassen weisen die die epe i i en Blöcke on Majo , Mino Ampulla e und
Flagelli o mseide eine du chschni liche Länge on 30-60 Aminosäu en au [7-12]. Die
Blöcke bes ehen wiede um aus de Aneinande eihung de spezi ischen Aminosäu emo i e
(Ala)4-14, (GlyAla)4-6 , GlyGlyX sowie GlyP oGlyXX, wobei X ü jede beliebige Amino-
säu e s eh (Tabelle 2). Die A und die Anzahl de Wiede holungen diese ie Mo i e
sind ü jede Seidena spezi isch. Die Länge und Sequenz de epe i i en Blöcke inne halb
ein und desselben Spid oins sind nich homogen.
A) Klasse I
Majo , Mino Ampulla e und Flagelli o m Spid oine
B) Klasse II
Acini o m,Tubili o m und Py i o m Spid oine
NTD CTD
16-25
NTD CTD
50-100
30-60
AS
(A)
n
, (GA)
n
, GGX, GPGXX
180-360
AS
Einlei ung
[9]
Tabelle2: Übe sich de Sequenzmo i e de epe i i en Einhei en on MA-, MI- und Flagelli o m-
spid oinen. Die ie Aminosäu emo i e sind bei den jeweiligen Spid oinen und dami bei den en sp echen-
den Seidena en, die am häu igs en o kommenden Sequenzmo i e.
Zu Klasse II gehö en Acini o m-, Tubili o m- und Py i o mseide, de en epe i i e Blöcke
eine Länge on ca. 180-360 Aminosäu en au weisen, welche zwischen 16-25 Mal wiede -
hol we den. [13-20]. Die Sequenzen de einzelnen epe i i en Blöcke inne halb eines P o-
eins sind un e einande seh homogen und zum Teil bis au wenige Basen au gene ische
Ebene nahezu iden isch [15]. Die Blöcke de Acini o m und Tubili o m Spid oine besi zen
eine komplexe, nich - epe i i e P imä s u k u , wäh end die epe i i en Einhei en de Py-
i o mseide als eine Mischung zwischen beiden Klassen angesehen we den kann. Ein ca.
200 Aminosäu en lange epe i i e Block de Py i o mseide bes eh aus meh e en 10-16
Res en langen, alanin eichen Blöcken sowie eine ca. 80 Aminosäu en langen komplexen
Sequenz (Abbildung 3).
Allen Spid oinen gemein is , dass einige wenige Aminosäu en in ih en Sequenzen deu lich
übe ep äsen ie sind, wobei Alanin, Glycin, Glu amin, P olin und Se in die am häu igs en
o kommenden Aminosäu en in Spinnenseidenp o einen da s ellen (Tabelle 3).
Tabelle 3: Übe sich de häu igs en Aminosäu en in den einzelnen Spid oinsequenzen. Die An eile
beziehen sich au die jeweilig bekann e Sequenz wie sie in den Quellen angegeben sind. Aminosäu en, die
meh als 25% de bekann en Sequenz ausmachen, sind a blich ( o ) he o gehoben. Die p ozen ualen Häu-
igkei en de einzelnen Aminosäu en wu den mi P o pa am e mi el .
Spid oin Häu igs e Aminosäu en (%) Quellen
Majo Ampulla e Spid oin 1 Ala: 32,7-41,4 / Gly: 29,5-42,4 / Gln: 10,0-11,3
[7-9, 21-24]
Majo Ampulla e Spid oin 2 Ala: 18,5-31,1 / Gly: 33,5-37,3 / Gln: 6,9-15,0 /
P o: 8,6-13,5%
Mino Ampulla e Spid oine Ala: 28,0-36,8 / Gly: 37,0-43,8 [10, 11, 25-
27]
Flagelli o m Spid oin Ala: 7,9-10,3 / Gly: 49,7-56,8 / P o: 15,0-17,4 [11, 28, 29]
Acini o m Spid oin Ala: 14,2-15,1 / Gly: 11,3-15,2 / Se : 13,1-21,5 [13, 15]
Tubili o m Spid oin Ala: 25,1-28,0 / Gln: 10,4-12,5 / Se : 25,9-29,9 [30]
Py i o m Spid oin Ala: 16,4-42,2 / Gln: 12,7-16,9 / Se : 8,4-25,7 [19, 31]
(A)
4-13
(GA)
~4-6
GGX GPGXX
P o ein Sequenzmo i
Seidena
Abseil aden
Hil s aden
Fangspi ale
Majo Ampulla e Spid oin 1 (MaSp1)
Majo Ampulla e Spid oin 2 (MaSp2)
Mino Ampulla e Spid oins (MiSp)
Flagelli o m Spid oin (Flag)
Einlei ung
[10]
In einigen Fällen, wie z. B. bei den MaSp- und MiSp-P o einen, können zwei Aminosäu en
zusammen meh als die Häl e de Sequenz ausmachen. Die angegebenen We e de am
häu igs en o kommenden Aminosäu en zeigen zudem, dass sich selbs inne halb eine
Spid oina übe e schiedene Spezies die Aminosäu ean eile e heblich oneinande un e -
scheiden. T o z Ähnlichkei en im Aminosäu egehal un e scheiden sich die Sequenzen de
einzelnen Spid oina en zum Teil signi ikan oneinande (Abbildung 4).
Abbildung 4: Ve gleich de epe i i en Sequenzen de e schiedenen Spid oin A en. Da ges ell sind
200 AS lange, ep äsen a i e Abschni e de epe i i en Ke ndomäne de einzelnen Spid oine aus un e -
schiedlichen Spinnen. Majo Ampulla e Sp1 & 2 aus L. hespe us (UniP o : A6YIY1, A6YIY0): Da ges ell
sind sechs epe i i e Blöcke je bes ehend aus Polyalanin- ( o ), GGX- (blau) und GPGXX-Mo i en (g ün).
Mino Ampulla e Sp1 aus A. en icosus (GeneBank: JX513956.1): Ausschni mi GA- ( o ), GX/GGX-
(g ün), Polyalaninblöcken (blau), die den G oß eil de Ke ndomäne ausmachen sowie eine Space sequenz
(lila). Flagelli o m Sp aus N. cla ipes (UniP o : Q9NHW4): Ausschni mi GPGGX- ( o ) und GGX-
Blöcken (blau), die meh als 90% de ep. Domäne ausmachen, sowie de zweimal o kommenden Space se-
quenz (lila). Py i o m Sp1 aus L. hespe us (UniP o : C7T5D2): Gezeig is ein 200 AS lange epe i i e
Block bes ehend aus 10 – 16 AS langen, kü ze en Blöcken ( o & blau) sowie eine Space -Sequenz (lila).
Acini o m Sp1 aus A. i ascia a (UniP o : Q64K55): Da s ellung eine 200 AS langen Wiede holungsein-
hei . Tubuli o m Sp1 aus L. hespe us (UniP o : Q4G1Y6): Da s ellung eine 178 AS langen Wiede holungs-
einhei .
Majo Ampulla e Sp1
AAAAAAAAGGAGQGGQGGYGQGGYGQGGYGQGGSGAAAAAAAAAGGAGQGGQGGYGQGGYGQGGAGQGGAGAAAAAAAAA
GGAGQGGYGRGGAGQGGAAAAAAAAAGAGQGGYGGQGAGQGGSGAAAAAAAAGGAGQGGQGGYGQGGYGQGGSGAAAAAA
AAGGAGQGGQGGYGQGGYGQGGAGQGGAGAAAAAAAAGGA
1
81
161
8
0
1
60
Majo Ampulla e Sp2
AAAAAASGAGPGRQLGYGPGGSGAAAAAAAGGPGYGGQQGYGPGGAGAAAAAAAGGAGPGRQQTYGPGGSGAAATAAGGS
GPGGYGQGPSGYGPSGPGGQQGYGPGGSGAAAAAAAGEAGPGRQQGYGPRGSGAAAAAAAGGPGYGGQSGYGPGGAGAAA
AAAAGGAGPGRQQEYGPGGSGAAAAAAAAAGSGPSGYGPG
8
0
1
60
1
81
161
Mino Ampulla e Sp1
GAGAGARGADSAGAAAGYGGGVGTGTGSSAGYGRGAGAGAGAGAAAGSGAGAAGGYGGGYGAGAGAGAGAGGATGNRAGD
AFAQVFSQNVINSGVITSTTVTKNSAQAAASSMVSTAAKSLGLDENTARSMANAMSSYAAAMAKSFRNSDEFIRNMSYQM
GRMLSNAGAINESTASAAASSASSTVTETVRTYGPAAIFS
8
0
1
60
1
81
161
Flagelli o m Sp
GPGGSGPGGYGPGGSGPGGYGPGGYGPGGSGPGGSGPGGSGPGGYGPGGTGPGGSGPGGYGPGGSGPGGSGPGGYGPGGS
GPGGFGPGGSGPGGYGPGGSGPGGAGPGGVGPGGFGPGGAGPGGAAPGGAGPGGAGPGGAGPGGAGPGGAGPGGAGPGGA
GGAGGAGGSGGAGGSGGTTIIEDLDITIDGADGPITISEELPIS
8
0
1
60
1
81
161
AAARAQAQAEARAKAEAAARAQAQAEARAKAEATARAKAQAEAAARAQAQAEARAIAEAAARAQAQAEARAKAEAAARAQ
AQAIARAEAAARAQAEAEARAYAEALARVQAEAAARAQAQTQSRTQAETHSQAHSASHASSQATSETHVESTAHTATETH
EHTSSNSQAASHTQAASHSQAKAQSEAHTYSQAQSAAHTI
Py i o m Sp1
8
0
1
60
1
81
161
GSAGPQGGFGATGGASAGLISRVANALANTSTLRTVLRTGVSQQIASSVVQRAAQSLASTLGVDGNNLARFAVQAVSRLP
AGSDTSAYAQAFSSALFNAGVLNASNIDTLGSRVLSALLNGVSSAAQGLGINVDSGSVQSDISSSSSFLSTSSSSASYSQ
ASASSTSGTGYTGPSGPSTGPSGYPGPLGGGAPFGQSGFG
Acini o m Sp1
8
0
1
60
1
81
161
AQAASAAQSSAFAQSQAAAQAFSQAASRSASQSAAQAGSSSTSTTTTTSQAASQAASQSASSSSSAASQSAFSQASSSAL
ASSSSFSSAFSSASSASAVGQVGYQIGLNAAQTLGISNAPALADAVSQAVRTVGVGASPFQYANAVSNAFGQLLGGQGIL
TQENAAGLASSVSSAISS
Tubuli o m Sp1
8
0
1
60
1
81
161
Einlei ung
[11]
1.4 Die e minalen Domänen
Lau UniP o -Da enbank (S and Janua 2013) sind ü ca. 90 Spid oine alle A (auße
Agg ega spid oin) die Sequenzen on mindes ens eine de nich - epe i i en, e minalen
Domänen bekann (de aillie e Übe sich s. Anhang Tabelle A1). E wa 90% s ammen on
A en aus de Un e o dnung de Ech en Webspinnen (A aneomo phae), wobei die Familie
de Ech en Radne zspinnen (A aneidae) ci ca die Häl e de bekann en Sequenzen aus-
mach . Die es lichen 10% sind Familien aus de Un e o dnung de Vogelspinnena igen
(Mygalomo phae) zugeo dne .
De übe wiegende Teil de Sequenzen s amm aus cDNA-Da enbanken au Basis on
mRNA. Dabei wi d häu ig die mRNA de be e enden D üsen mi els Poly hymidin-
P ime n (PolyT), die an den 3‘-Poly-Adeninschwanz de mRNA binden, isolie und in
cDNA übe üh . Bei de spä e en Sequenzie ung sind dahe ehe Sequenzen zu inden, die
om u sp ünglichen 3‘-Ende de mRNA s ammen, welches nach T ansla ion dem Ca -
boxy e minus en sp ich . Au g und dessen sowie den Schwie igkei en bei de Sequenzie-
ung on hoch epe i i en Be eichen sind e wa ie mal so iele ca boxy e minale wie ami-
no e minale Sequenzen bekann (Anhang Tabelle A1). Nu ü wenige Spid oinsequenzen
sind dahe beide e minale Domänen bekann [8, 15, 27, 32-35]. Die Sequenzen on e mi-
nalen Domänen zeigen im Gegensa z zu den epe i i en Ke ndomänen eine hohe spezies-
übe g ei ende Sequenzkonse ie ung (Abbildung 5) [30, 33, 36]. Die NT- Domänen sind
soga übe e schiedene Spinnenseidena en on zum Teil wei en e n en Spezies konse -
ie , was ü eine wich ige Funk ion sp ich [33, 37]. Ih e G öße lieg ohne Sek e ionssig-
nalsequenz mi 125-135 Aminosäu en zudem in einem engen Be eich. Mi 75 – 110 Ami-
nosäu en Länge sind die CT-Domänen im Schni kleine und a iable in de Länge als die
NT-Domänen. Eine hohe Sequenzkonse ie ung is nu inne halb de selben Spid oina
on nähe e wand en Spezies ode Familien (wie z.B. die Ne zspinne ) es zus ellen [24,
36, 37].
Einlei ung
[12]
A) NT-Sequenzen
Nc_MaSp1 1 ---------------QNTPWSSTELADAFINAFMNEAGRTGAFTADQLDDMSTIGDTIKT
Lh_MaSp2 1 -----------ALGQANTPWSSKENADAFIGAFMNAASQSGAFSSDQIDDMSVISNTLMA
Uldi _MiSp1 1 -FAVFCAQSYSALGQGASVWSSPQMAENFMNGFSMALSQAGAFSGQEMKDFDDVRDIMNS
Nc_Flag 1 -----------RGIIANSPFSNPNTAEAFARSFVSNIVSSGEFGAQGAEDFDDIIQSLIQ
Lh_AcSp1 1 VQVEGRKGHHHSSGSSKSPWANPAKANAFMKCLIQKISTSPVFPQQEKEDMEEIVETMMS
Agap_TuSp 1 ---QGTSFASSATAGIRNIFGNPNTANNFVDCLKGGIQASPAFPRQEQADIQSIASSILS
Bc_Fib1 1 -----------RTKVTNVPWTDEAKGKKFLSTFLDYALDHGLFPQQERDDLEAISQNLIP
Konsensus 1 pws a Fi m g F q dDm i im
Nc_MaSp1 46 AMDKMARSNKSSKGKLQALNMAFASSMAEIAAVEQG--GLSVDAKTNAIADSLNSAFYQT
Lh_MaSp2 50 AMDNMGGR--ITQSKLQALDMAFASSVAEIAVAD----GQNVGAATNAISDALRSAFYQT
Uldi _MiSp1 60 AMDKMIRSGKSGRGAMRAMNAAFGSAIAEIVAANGG-----KEYQIGAVLDAVTNTLLQL
Nc_Flag 50 AQ-SMGKGRHDTKAKAKAMQVALASSIAELVIAESS--GGDVQRKTNVISNALRNALMST
Lh_AcSp1 61 AFSSMSTSGGSNAAKLQAMNMAFASSMAELVIAEDADNPDSISIKTEALAKSLQQCFKST
Agap_TuSp 58 AGNT----ATKSKAIEQALSTALASSLAEIVITESG--GQDYSKQITDLNGILSNCFIQT
Bc_Fib1 50 VFRKTMDSGGNAAAKMKALNMAFASSIAEIAVQEGG--AGSIEEKTQAVSEALAHAFLQT
Konsensus 61 a m gkl AlnmA aSsmAEi e g g ai l q
Nc_MaSp1 104 TGAANPQFVNEIRSLINMFAQSSANEVSY------
Lh_MaSp2 104 TGVVNNQFITGISSLIGMFAQVSGNEVSYS-----
Uldi _MiSp1 115 TGNADNGFLNEISRLITLFSSVEAND---------
Nc_Flag 107 TGSPNEEFVHEVQDLIQMLSQEQINEVDTSGP---
Lh_AcSp1 121 LGSVNRHFIAEIKDLIGMFAREAAAMEEAGD----
Agap_TuSp 112 TGVENKRFVNSIQNLIRLLAESAVSETTNSIQIGP
Bc_Fib1 108 TGSVNIQFIKEIRALITLFAKEGQDNETEN-----
Konsensus 121 G n F ei LI m a e
B) CT-Sequenzen
Nc_MaSp1 1 GSGASAASAAASRLSSPQASSRVSSAVSNLV---ASG-PTNSAALSSTISNVVSQIGASN
Lh_MaSp2 1 -SVASSAASAASALSSPTTHARISSHASTLL---SSG-PTNAAALSNVISNAVSQVSASN
Uldi _MiSp1 1 -------SAASNRIVSAPAVNRMSAASSTLV---SNG-AFNVGALGSTISDMAAQIQAGS
Nc_Flag 1 --------GSPGGAY--YPSSRVPDMVNGIMSAMQGS-GFNYQMFGNMLSQYSSGSGTCN
Lh_AcSp1 1 --SLNNILDSPQGLKSPQASSRINRLSSSVVNALGPN-GLDINNFSDGLRTTLSQLSSSG
Agap_TuSp 1 -----PVLSSETGLSSASASSRVNSLASSVASAIASGQALSADSFAKSLLIQASQIQSSA
Bc_Fib1 1 -----RLLSSPSGLTSEAAKERISSIIASLLSAKSSQ-DFNALLLSNILPSLISKISQRA
Konsensus 1 al s a R s l n i sqi
Nc_MaSp1 57 PGLSGCDVLIQALLEVVSALIQILGSSSIGQVNYGSAGQATQIVGQSVYQALG------
Lh_MaSp2 56 PGSSSCDVLVQALLEIITALISILDSSSVGQVNYGSSGQYAQIVGQSMQQAMG------
Uldi _MiSp1 50 QGLSSAEATVQALLEVISVLTHMLSSANIGYVDFSRVGDSASAVSQSMAYAG-------
Nc_Flag 50 P--NNVNVLMDALLA----ALHCLSNHGSSSFAPSPTPAAMSAYSNS------------
Lh_AcSp1 58 --LSKKEAAIETLMEAMVALLQVLNSAQVNQVDTSSTVVTSSSLAKALSSLF-------
Agap_TuSp 56 PSFKADDVVHESLLEGISALIQVINSSYGSPLSLSNAQ----TVNAGLVNYFLV-----
Bc_Fib1 55 SGLSPTEMVTEALLEVLAGCMEILSSFNVGAQSISSSRTSSNALVQSISNQFSGLNAAA
Konsensus 61 s d li aLle ali il s i s qs
Abbildung 5: Ve gleich de Homologie e minale Sequenzen on e schiedenen Spid oina en und
Spezies. Um die Ve gleichba kei de Sequenzkonse ie ung zu gewäh leis en wu den nu Spid oina en
ausgewähl bei denen sowohl die amino e minale (A) als auch die ca boxy e minale (B) Domäne bekann
sind. Hochkonse ie e Aminosäu en (>70%) sind schwa z hin e leg und schwache (>50%) g au. In de
Konsensussequenz sind die en sp echenden Aminosäu en nach Konse ie ungsg ad in G oß- (100%) und
Kleinsch eibung (>70%) da ges ell . Die Quellsequenzen de NT-Domänen wu den o dem Ve gleich mi -
els SignalP4.1 au Signalsequenzen übe p ü und gg s. en e n . Ve wende e Sequenzen und Spezies:
Nc_MaSp1: Nephila cla ipes MaSp1(NT: B5SYS5; CT: P19837); Lh_MaSp2: La odec us hespe us MaSp2
(A6YIY0); Uldi _MiSp: Ulobo us di e sus MiSp1 (NT: E1AHV5; CT: Q15G88) Nc_Flag: Nephila cla ipes
Falgelli o m Spid oin (NT: O44358 – modi izie nach [33]; CT: O44359); Lh_AcSp1: La odec us hespe us
Acini o m Spid oin1 (GenBank: JX978171.1); Agap_TuSp: Agelenopsis ape a (NT: E1AHV9 CT:
E1AHV2); Bc_Fib1: Bo h iocy um cali o nicum (NT: E1AHU2 CT: A8UAJ7). Die Alignmen s wu den mi
Clus alOmega und Boxshade e s ell .
Einlei ung
[13]
1.5 Majo Ampulla e Seide
T o z de Viel al an in e essan en Spinnenseiden is die Seide de G oßen Ampullend üse
(Majo Ampulla e, MA) die mi Abs and am bes en un e such e. Sie wi d ü den Rahmen
und die Speichen eines Radne zes sowie als Abseil- ode Fluch aden in No si ua ionen
e wende . Da die Spinne deshalb imme kleines S ück MA-Seide hin e sich he zieh be-
zeichne man sie häu ig auch als d agline Seide (englisch o d ag = ziehen). De längs e je
en deck e Spann aden aus MA-Seide de Spinne Cae os is da wini is 25 m lang und
besi z zudem die höchs e je be ich e e Reiß es igkei alle Spinnenseidena en on
1,7 GPa [38]. Neben den mechanischen We en zeig d agline-Seide einige wei e e in e-
essan e Eigenscha en. Eine sich abseilende ode hängende Spinne d eh sich kaum um
ih e eigene Achse, was bedeu e , dass die d agline-Seide eine o sionsdämp ende Funk ion
besi z . Ähnliches kann man beobach en wenn man den Faden e d eh und anschließend
losläss . E oszillie nich um seine Achse, sonde n o ie langsam in seine u sp üngliche
Fo m zu ück, was ü eine A Fo mgedäch nis sp ich . [39].
Eine wei e e Eigenscha is die sogenann e Supe kon ak ion, die au i sobald die Lu -
euch igkei übe 60% lieg ode die Seide nass wi d. Dabei nimm de Fadendu chmesse
zu und die Seiden ase sch ump dabei um bis zu 50% ih e Länge [40-43].
1.5.1 Die P o eine de MA-Seide
Die MA-Seide bes eh haup sächlich aus zwei P o einen, die als Majo Ampulla e Spid oin
1 und 2 (MaSp) bezeichne we den [8, 9, 44]. Die epe i i e Ke ndomäne beide P o eine
se z sich im Wesen lichen aus al e nie enden polyalanin- und glycin eichen Blöcken zu-
sammen (Abbildung 6 A). Ein Polyalaninblock is zwischen 4 und 13 Res en lang, wäh-
end die Länge de glycin eichen Region zwischen 12 und 50 Aminosäu en a iie . Die
NT- und CT-Domänen zwischen beiden Spid oinen sind jeweils hoch homolog [7, 8, 37].
Das Haup un e scheidungsme kmal zwischen MaSp1 und 2 is die Sequenzzusammense -
zung de glycin eichen Region. In MaSp1-P o einen be inden sich in diese Region haup -
sächlich GGX-Mo i e, wäh end in MaSp2 P o einen s a dessen GPGXX-Mo i e zu inden
sind. Die einzig bekann en Volllängen MaSp-P o eine s ammen aus de schwa zen Wi we
(La odec us hespe us) sowie de Wespenspinne (A giope b uennichi) und sind 250
(MaSp1) bzw. 289 - 311 kDa (MaSp2) g oß, wobei es di e se Hinweise gib , dass ande e
MaSp-P o eine in de selben G ößeno dnung liegen [8, 45-47].
Einlei ung
[14]
Abbildung 6: Schema ische Da s ellung on MaSp-P o einen und Sequenz e gleich epe i i e
Blöcke on MaSp 1 und 2 Spid oinen. (A) Schema ische, nich maßs absge eue Da s ellung des Au baus
on MaSp-P o einen. Die epe i i e Ke ndomäne bes eh im Wesen lichen aus al e nie enden Polyalanin und
glycin eichen Blöcken. Die glycin eiche Region en häl je nach MaSp-Va ian e en wede haup sächlich GGX
(MaSp1) ode GPGXX-Mo i e (MaSp2). Die Ke ndomäne wi d zudem on nich - epe i i en amino e mina-
len (NT) sowie ca boxy e minalen (CT) Domänen lankie . (B) & (C) Sequenz e gleich on epe i i en
Blöcken on MaSp 1 (B) und MaSp2 (C) P o einen e schiedene Spezies. Da ges ell sind epe i i e Einhei-
en, die jeweils zwei Polyalaninblöcke en hal en. Aminosäu en mi einem Konse ie ungsg ad on >70%
sind schwa z he o gehoben. In de Konsensussequenz sind die en sp echenden Aminosäu en nach Konse -
ie ungsg ad in G oß- (100%) und Kleinsch eibung (>70%) da ges ell . Die Abkü zungen de e wende e
Spezies sowie die UniP o -Numme n de Sequenzen lau en: Lh = La odec us hespe us (MaSp1: A6YIY1;
MaSp2: A6YIY0), Ea = Eup os henops aus alis (MaSp1: A1INM2), Ab = A giope b uennichi (MaSp1:
I6XQ31; MaSp2: I6YNT3), Nc = Nephila cla ipes (MaSp1: P19837; MaSp2: P46804), A = A giope
i ascia a (MaSp1: Q9BIU7), Nec = Nephilengys c uen a a (MaSp1: A6YP78), Ad = A aneus diadema us
(ADF3: Q16987; ADF4: Q16988)
A)
B)
Polyalanin egion GGX-hal ige Region
Lh_MaSp1 1 -----AAAAAAAAGGAGQGGQGGYGQGGYGQ---------GGAGQGG
Ea_MaSp1 1 AAAAAAAAAAAAAGGQGGQGQGRYGQ---GAGSSAAA----------
Ab_MaSp1 1 -----AAAAAAAAGGDGGSGLGGYGA---GRGHGVGLGGAG----GA
Nc_MaSp1 1 -------AAAAAAGGAGQRGYGGLGNQGAGR---------GGLGGQG
A _MaSp1 1 ------AAAAAAASGAGGAGRGGLGAGGAGQEYGAVSGGQGGAGQGG
Nec_MaSp1 1 -----AAAAAASGAGQGGYGGPGAGQ---GAGA--------------
Konsensus aaAAAAaagG Gg G gg Gq G g g
Lh_MaSp1 60 AGAAAAAAAAGGAGQGGQGGYGQGGYGQGGAGQGG
Ea_MaSp1 61 AAAAAAAAAAAGRGQGGYGQGSGGN----------
Ab_MaSp1 62 GAASAAAAAGGQGGRGGFGGLGSQGAGGAGQGGAG
Nc_MaSp1 56 AGAAA-AAAAGGAGQGGYGGLGNQGAGRGGQG---
A _MaSp1 68 EAAAAAAAAGGQGGQGGYGGLGSQGAGQGGYGQGG
Nec_MaSp1 42 -----AAAAAGGAGQGGYGGLGGQGAG---QGAGA
Konsensus agaaaaAAAaggaGqGGyGglg qgag gg g gg
C)
Polyalanin egion GPGXX-hal ige Region
Lh_MaSp2 1 ---AAAAAA-----AAAGSGPSGYG------PGAAAAA---A--AGS-------
A _MaSp2 1 AAAAAAAAGPGYGPGAGQQGPGSGGQQGGPGSGQQGPGGAGQGGPRGQGPYGPG
Ab_MaSp2 1 -AAAAAAAAGGYGPGAGQQGPGSQG------PGSGGQ-----QGPGGQGPYGPG
Nc_MaSp2 1 AAAAAAAAS-----GPGQQGPGGYG------PGQQGPG---GYGPGQQGPSGPG
Ad_ADF3 1 ---AAAAAAGGNGPGSGQQGAGQQG------PGQQGP-----------------
Ad_ADF4 1 -----AAAA-----AAAASGPGGYG------PGSQGPS---G--PGVYGPGGPG
Konsensus aaAAAa gagqqGpg G pG qgp pg gp gpg
Lh_MaSp2 29 ------------------------AGPGTQQGYGPGGSG------
A _MaSp2 65 AAAAA-AAAAGGYGPGAGQQGPGSQGPGSGGQQGPGSQGPYGPS-
Ab_MaSp2 55 AAAAAA AV--GGYGPGAGQQGPGSQGPGSGGQQGPGGQGPYGPS-
Nc_MaSp2 53 SAAAAA AAASGPGQQGPGGYGPGQQG---PGGYGPGQQGLSGPGS
Ad_ADF3 39 -GASAA AAAAGGYGPGSGQQGPGQQGPGGQGPYGPGAS-------
Ad_ADF4 46 SSAAAAAA----AGSGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGSGSS----
Konsensus aaaaa aa g g g g gpg qGpg g yGPGg g
(A)
4-13
(A)
4-13
(A)
4-13
glycin eiche Region
MaSp1: GGX
MaSp2: GPGXX
NTD CTD
Polyalanin egion
n
Einlei ung
[15]
Die Sequenzkonse ie ung de epe i i en Ke ndomäne on MaSp P o einen is e -
gleichsweise ge ing, da Reihen olge und o allem Anzahl de Wiede holungen de GGX
und GPGXX-Mo i e inne halb de glycin eichen Region zum Teil s a k a iie en (Abbil-
dung 6 B, C). Beide MaSp-P o eine liegen im inalen Faden o , jedoch a iie das Ve -
häl nis de beiden P o eine speziesübe g ei end zum Teil s a k [44]. Die jeweilige Menge
de beiden Spid oine im Faden is zudem on iele lei Umwel bedingungen wie de Nah-
ungsquellen ode dem E näh ungszus and abhängig [48-50]. T o z a iable An eile
übe wieg in den meis en bishe un e such en d agline Seiden de MaSp1-An eil. Die ein-
zige Ausnahme s ell die MA-Seide de Ga enk euzspinne A aneus diadema us da , die
einen hohen P olinan eil on 16% au weis [7]. Do besi zen beide bekann e MaSp-
P o eine, genann A aneus diadema us Fib oin 3 und 4 (ADF3 u. 4) in epe i i en Blöcken
das GPGXX Mo i und sind demnach MaSp2-Analoga [7].
1.5.2 S uk u de epe i i en Ke ndomäne
Die S uk u -Funk ionsbeziehung de epe i i en Ke ndomäne on MaSp-P o einen wu de
mi eine Vielzahl an Me hoden, wie Fes kö pe -NMR, Rön gens euung ode IR-
Spek oskopie un e such . Schon ela i üh konn e nachgewiesen we den, dass die Poly-
alaninmo i e im Faden in eine β-Fal bla kon o ma ion o liegen [51]. Neue e Un e su-
chungen haben gezeig , dass das Mo i an ipa allele β-Fal bla k is alle mi eine G öße
on 5x2x7 nm (Länge x B ei e x Höhe) ausbilde [52-57]. Die Fal blä e im K is all sind
dabei pa allel zu Fase achse angeo dne [58-60].
Die S uk u bes immung de GGX-Mo i e inne halb de Fase hingegen is wenige ein-
deu ig. Das Mo i komm sowohl in β-Fal bla als auch in wenige geo dne en, α-
helikalen Be eichen o [56, 61-63]. Es gib zudem Hinweise, dass das Mo i in Polygly-
cin-II-Helices o lieg [56, 61, 64].
Zum Pen apep id GPGXX liegen die wenigs en S uk u da en o . Dem Mo i wi d au -
g und des P olins eine spi al ö mige Polyp olin-II-helikale S uk u zugeo dne , wie sie
auch on ähnlichen epe i i en Sequenzen (z.B. VPGVG) in Elas in gebilde wi d [65].
Diesem Mo i wi d zudem eine wich ige Rolle bei de Supe kon ak ion de d agline-
Fase zugesch ieben, da Hinweise exis ie en, dass die Hyd a isie ung diese p olin eichen
Sequenz zu eine Kon o ma ionsumlage ung üh , die das Sch ump en de Seide bewi k
[41-43, 66-71].
Einlei ung
[22]
1.6 Rekombinan e Spinnenseidenp o eine
Spinnen weisen ein kannibalisches Re ie e hal en au , weshalb die indus ielle Zuch , wie
sie z. B. ü den Seidenspinne Bombyx mo i be ieben wi d, als ökonomisch sinn olle
Quelle ü Spinnenseiden nich möglich is . Um e we ba e Mengen an Spinnenseide zu
gewinnen, können jedoch Spinnenseidenp o eine ekombinan p oduzie we den, was in
zwei un e schiedlichen Ansä zen e olg wi d.
De e s e Weg s ell die he e ologe P oduk ion on na ü lichen Sequenzen in e schiede-
nen Wi so ganismen da , wie z.B. euka o ischen Zellen, Tabakp lanzen und ansgenen
Seidenspinne n, Mäusen ode ga Ziegen [114-120]. Dabei we den häu ig s a k e kü z e
3‘-cDNA-F agmen e de Spinnenseiden e wende . Die Ausbeu en bei de jeweiligen
P oduk ion sind jedoch e gleichsweise ge ing, so dass keine diese Ansä ze übe Mach-
ba kei ss udien hinausgekommen sind. Ein G und ü die nied igen Ausbeu en lieg mög-
liche weise in de speziellen Codon e eilung de Spinnenseidengene [121]. Besonde s
deu lich wi d dies bei den häu ig o kommenden Aminosäu en Glyzin und Alanin, die nu
on eine kleinen Anzahl an möglichen Codons codie we den. Da die Spid oine hohe
An eile on lediglich zwei bis d ei Aminosäu en (z.B. Glycin und Alanin) au weisen, wi d
e mu e , dass ein besch änk e abe da ü hoch e ügba e Pool an RNA ü die Spinne
e izien e is [8, 122].
De zwei e und wesen lich häu ige e wende e Ansa z ekombinan e Spinnenseidenp o e-
ine zu gewinnen, is die Ve wendung on a i iziellen Spinnenseidengenen. Die epe i i en
Blöcke diese küns lichen Spinnenseiden bes ehen häu ig aus Konsensusmo i en de na ü -
lichen Spid oinsequenzen, weshalb die küns lichen Spinnenseidenp o eine eine hohe Ähn-
lichkei zu ih en na ü lichen Vo bilde n au weisen [121, 123, 124]. Die Ve wendung on
küns lichen Genen e laub zudem die Anpassung de Sequenz an die Codon-Ve wendung
des gewünsch en P oduk ionso ganismus. In den meis en Fällen e olg die He s ellung de
a i iziellen Spid oine in E. coli, e einzel auch in He en wie Pichia pas o is ode in Ta-
bakp lanzen [114, 121, 123, 125, 126]. Die meis en p oduzie en P o eine haben ein Mole-
kula gewich on 25 bis 120 kDa und sind dami wesen lich kleine als die na ü lichen
Spid oine. Die P oduk ion on ekombinan en Spid oinen mi einem Molekula gewich
on meh als 200 kDa is möglich, jedoch mi au wändigen Eing i en in den Me abolis-
mus on E. coli e bunden [127].
Einlei ung
[23]
Die in diese A bei e wende en ekombinan en Seiden basie en au den beiden MaSp2-
P o einen ADF3 und 4 de Ga enk euzspinne A aneus diadema us und we den zu Beginn
on Kapi el 2 im De ail besch ieben [7, 124].
1.7 Assemblie ungseigenscha en on ekombinan en Spinnenseidenp o einen
Fü di e se ekombinan e Spinnenseidep o eine exis ie en eine Vielzahl an nich -
na ü lichen Assemblie ungs o men wie Filme, Hyd ogele, Kapseln ode Kugeln. Die Cha-
ak e isie ung, Funk ionen und iel äl igen Einsa zgebie e diese Mo phologien sind ü
diese A bei nich ele an und ande e S elle seh aus üh lich besch ieben, weswegen nun
au die Fase assemblie ung eingegangen wi d [128-138].
1.7.1 Fase n aus ekombinan e Seide
Die mechanischen Eigenscha en de na ü lichen Spinnenseiden ase n sind besonde s be-
zogen au ih Gewich und die Dich e besonde s a ak i ü e schiedene Anwendungs-
elde . Die He s ellung eine Fase aus den ekombinan en Seiden s ell dahe ein wich iges
Ziel da .
Meh e e Me hoden zu P oduk ion eine Fase sind besch ieben, wobei die mi Abs and am
häu igs en angewand e das sogenann e Nassspinnen (engl. we spinning) da s ell [115,
139-142]. Bei diesem P ozess wi d eine konzen ie e Spinnlösung (>10 % w/ ) meis
du ch eine Injek ionsnadel mi einem dünnen Que schni in ein lüssiges Fällbad injizie .
Das Fällbad en häl häu ig hohe An eile an Alkoholen wie E hanol, Me hanol ode Isop o-
pnaol welche ein schnelles Assemblie en bzw. Agg egie en de P o eine bewi ken. Die so
gewonnenen Fase n sind den na ü lichen Seiden hinsich lich ih e mechanischen Eigen-
scha en jedoch zum Teil wei un e legen (Tabelle 4).
Die Zähigkei de Fase n aus ekombinan en Spid oinen lieg häu ig eine G ößeno dnung
un e den Na ü lichen. Eine mögliche E klä ung da ü lieg in de Ve wendung on P o ei-
nen, die deu lich kü ze sind als die na ü lichen. Zudem we den häu ig ekombinan e Spid-
oine e wende die nu aus epe i i en Blöcken bes ehen und nu e einzel die CT-
Domäne en hal en. Ein wei e e G und ü die schlech e en mechanischen Eigenscha en
lieg womöglich im küns lichen Spinnp ozess selbs . Um eine hochkonzen ie e Spinnlö-
sung he zus ellen we den die ekombinan en Seiden meis in o ganischen Lösungsmi eln,
wie Hexa luo oisop opanol (HFIP) gelös .
Einlei ung
[24]
Tabelle 4: Mechanische We e on Fase n au Basis on ekombinan en Spinnenseidenp o einen im
Ve gleich mi na ü liche MA-Seide. Die We e wu den di ek aus den en sp echenden Quellen en nom-
men.
Ma e ial Molekülmasse
(kDa)
Reis es igkei
(GPa)
Dehnba kei
(%)
Zähigkei
(MJm-3)
Quelle
Majo Ampulla e-
Seide 250 1,1 27 160
[4]
1) Rekomb.
MaSp2 71 0,045 ± 0,008 3,9 ± 2,6 - [143]
2) Rekomb.
MaSp1 285 0,5 ± 0,11 15 ± 5 - [127]
3) Rekomb.
MaSp1 70 0,132 ± 0,049 22,78 ± 19.06 23,7 ± 18,5 [144]
4) Rekomb.
MaSp2/Flag 61 0,049 ± 0,019 34,06 ± 25,30 10,6 ± 10,2 [141]
5) Rekomb.
MaSp2 106 0,0646 ± 0,026 10,8 ± 3,1 - [145]
6) Rekomb.
MaSp1
24 0,198 ± 0,019 - -
[22]
Du ch das anschließende Injizie en in ein Fällbad mi meh als 90 % Alkohol (z. Isop opa-
nol) en s ehen Fase n, die kaum Wasse en hal en und dadu ch seh sp öde und b üchig
we den. Hinzu komm , dass die P o eine in HFIP eine unna ü liche haup sächlich α-
helikale Sekundä s uk u annehmen, und somi eine Vo s uk u ie ung, wie sie im na ü li-
chen Spinn ak o lieg , nich möglich is .
Fü Fase n aus ekombinan en Seidenp o einen, die sich in wäss igem Milieu ausbilden,
sind lediglich zwei Un e suchungen bekann . Im e s en Fall bilden sich me e lange Fase n
aus einem ekombinan en „Mini-Spid oin“ (ca. 24 kDa) in einem Selbs assemblie ungs-
p ozess aus eine ela i ge ing konzen ie en Lösung ohne äuße e Ein lüsse [22]. Die
mechanischen Eigenscha en liegen jedoch eben alls eine G ößeno dnung un e den na ü -
lichen Seiden ( gl. Tabelle 4, Ma e ial 6). Im zwei en Fall we den die Fase n au Basis on
ekombinan en ADF3-P o einen mi Hil e eine Mik o luidikanlage gewonnen, die dem
na ü lichen Spinnkanal nachemp unden is [134]. Dazu we den die in wäss ige Lösung
be indlichen P o eine du ch ein modula es Sys em aus dünnen Kanälen gepump . Das Ve -
spinnen e olg , ähnlich wie na ü lichen Spinn ak , du ch Absenken des pH-We es on 8
au 6, de Zugabe on Phospha ionen sowie einem Elonga ions luss ini iie . Die esul ie-
enden Fase n sind wasse unlöslich und zeigen un e k euz-pola isie em Lich Doppelb e-
chung wie sie auch bei na ü lichen MA-Seiden äden beobach e wu de, was ü s a k s uk-
u ie e bzw. k is alline Be eiche sp ich [115, 146-148].
Einlei ung
[25]
1.8 Zielse zung
Zu Beginn diese A bei wa en haup sächlich einzelne Aspek e des na ü lichen Spinnp o-
zesses, wie die s uk u ellen Umlage ungen de ü MA-Spid oine ypischen Aminosäu e-
mo i e (A)n, GGX und GPGXX, besse un e such . In eine o angegangenen A bei konn-
en be ei s e s e E kenn nisse übe das Assemblie ungs e hal en on ekombinan en
eADF3 und 4 P o einen un e ähnlichen Bedingungen (pH-Absenkung, Zugabe on Phos-
pha ionen, Elonga ionsk ä e) wie sie im na ü lichen Spinnkanal au e en, gewonnen we -
den [134]. Übe die Funk ionen de nich - epe i i en e minalen Domänen wäh end de
Speiche ung und des Ve spinnens Domänen hingegen wa en nich iel bekann . Um die
Rolle de e minalen Domänen nähe zu cha ak e isie en, wu den diese mi küns lichen
epe i i en Domänen au Basis de P o eine ADF3 und 4 gekoppel , de en Löslichkei s-
und Assemblie ungseigenscha en zum Teil be ei s cha ak e isie wa en [124, 132, 134,
135, 149]. Die Un e suchung de Rolle de beiden e minalen Domänen e olg e in d ei
un e schiedlichen Teilp ojek en.
De um ang eichs e Teil s ell die Cha ak e isie ung de nich - epe i i e ca boxy e minale
Domäne NR3 des Spinnenseidenp o eins ADF3 de Ga enk euzspinne A aneus diade-
ma us da . Als Basis dien en o angegangene A bei en in denen be ei s e s e E kenn nisse
übe den Ein luss on NR3 au ekombinan e Spid oine au Basis on ADF3 gewonnen
we den konn en [124, 134, 149]. Ein wesen liche Teil de A bei mi de NR3-Domäne
bes and da in die S uk u -Funk ionsbeziehung besse zu cha ak e isie en. Die S uk u de
Domäne soll e dabei mi els NMR in Koope a ion mi P o . D . Kessle und D . F anz
Hagn (TU München) un e such we den. Die Funk ion de NR3-Domäne soll e mi Hil e
on ekombinan en eADF3 P o einen analysie we den, wobei de Schwe punk dabei au
de Analyse des Löslichkei s- und Assemblie ungs e hal en, un e Bedingungen wie sie
auch wäh end des na ü lichen Spinnp ozesses au e en, lag. So soll en die P o eine un e
Sche s ess ode in Anwesenhei on kosmo open Salzen wie Kaliumphospha un e such
we den.
Da die Spid oine de G oßen Ampullend üse alle Wah scheinlichkei nach in den gleichen
Zellen p oduzie we den [8, 35], soll en in einem zwei en Teilp ojek die Un e suchungen
au ein zwei es ekombinan es Spinnenseidenp o ein au Basis on ADF4 ausgedehn we -
den. Ein besonde e Fokus lag dabei au möglichen In e ak ionen, die du ch die s a k ho-
mologen CT-Domänen NR3 und NR4 e mi el we den.
Einlei ung
[26]
Da na ü liche MA-Spid oine zwei e minale Domänen au weisen, soll en in einem d i en
Teilp ojek ekombinan e Seidenp o eine mi NT- und CT-Domäne un e such we den. Die
NT-Domäne bilde pH-abhängig ein an ipa alleles Dime [34, 79, 85], weshalb besonde s
das Löslichkei s- und Assemblie ungs e hal en bei pH-Bedingungen wie sie in de D üse
o kommen, un e such wu den. Da die Sequenzen de NT-Domänen on ADF 3 und 4
nich bekann sind, wu den s a dessen diejenigen de MaSp-P o eine de schwa zen Wi we
La odec us hespe us e wende we den [8].
Synopsis
[27]
2. Synopsis
2.1 Übe sich de e wende en P o eine
Die in diese A bei e wende en ekombinan en Seiden basie en au den beiden MaSp2-
P o einen ADF3 und 4 de Ga enk euzspinne A aneus diadema us [7, 124]. Von den epe-
i i en Blöcken in ADF3 und 4 wu den en sp echende Konsensusmo i e abgelei e , die
modula ig mi els eines speziell en wickel en Klonie ungssys ems nah los mul ime isie
we den können. Aus den epe i i en Blöcken in ADF3 wu den die Module A (Alanin-
eich) und Q (Glu amin (Q)- eich) gene ie , wäh end aus ADF4 das Modul C (Ca -
boxylg uppe des Glu ama s) abgelei e wu de (Abbildung 11).
Abbildung 11: Übe sich de in diese A bei e wende en ekombinan en Spinnenseidenp o eine. Aus
den epe i i en Blöcken on (A) ADF3 wu den die Module A und Q, aus (B) ADF4 das Modul C abgelei e .
Die Module können nah los mul ime isie we den und mi den Sequenzen de na i en ca boxy e minalen
Domänen NR3/ NR4 aus ADF3/4 e knüp we den. Neben den ADF-Te mini wu den zudem die beiden
e minalen Domänen on Masp1 de schwa zen Wi we (L. hespe us) in di e se eADF3-P o eine eingebau .
Alle N1-hal igen P o eine liegen auch in eine Va ian e mi eine 32 Aminosäu e langen Linke sequenz o ,
die sich am ca boxy e minalen Ende de N1-Domäne be inde .
GSSAAAAAAAASGPGGYGPENQGPSGPGGYGPGGP
Modul A
A)
B)
MaSp1
L
. hespe us
Modul C
Modul Q CTD(NR3)
CTD(C1)NTD(N1) Linke *
* = op ionale Linke sequenz:
CTD(NR4)
ADF4
ADF3 GPYGPGASAAAAAAGGYGPGSGQQ GPGQQGPGQQGPGQQGPGQQ
eADF3((AQ)24) (98 kDa)
eADF4(C16NR4) (58,2 kDa)
eADF4(C16) (46 kDa)
eADF3((AQ)12NR3) (59,8 kDa)
eADF3(N1(AQ)C1) (29,6 kDa)
eADF3(N1L(AQ)C1) (33,7 kDa)
eADF3(N1(AQ)12NR3) (73,5 kDa)
eADF3(N1L(AQ)12NR3) (76,4 kDa)
eADF3(N1(AQ)12) (61,8 kDa)
eADF3(N1L(AQ)12) (65,9 kDa)
eADF3((AQ)24NR3) (110 kDa)
SGGGGYGASSASAASASAAAPSGVAYQAPAQAQISFTLRGQQPVS
Synopsis
[28]
Die epe i i en Einhei en können mi den jeweiligen na i en Sequenzen de ca boxy e mi-
nalen Domänen NR3 und NR4 aus ADF3 espek i e ADF4 kombinie we den. Die e-
kombinan en P o eine we den als eADF3 und 4 (enginee ed ADF3 und 4) bezeichne
[124]. Da die amino e minale Domäne on ADF3 und 4 nich bekann sind, wu de s a -
dessen diejenige on MaSp1 de schwa zen Wi we (L. hespe us), hie als N1 bezeichne ,
e wende . Die dazugehö ige ca boxy e minale C1 s and eben alls zu Ve ügung.
Die Sequenzen de beiden MaSp1-Te mini wu den au Basis de Ve ö en lichung on
Ayoub e al en wo en [8].
2.2 Die NR3-Domäne
2.2.1 Lösungss uk u de NR3-Domäne
Die S uk u de ca boxy e minalen Domäne NR3 des MA-P o eins ADF3 de Spinne
A aneus diadema us konn e mi els NMR gelös we den. Die Au klä ung de S uk u so-
wie Teile de biophysikalischen Cha ak e isie ung de NR3-Domäne wu den haup sächlich
on F anz Hagn du chge üh [150] (Abbildung 12).
Die nich - epe i i e ca boxy e minale Domäne NR3 des na ü lichen Spinnenseidenp o eins
ADF3 bilde in Lösung ein du ch eine Cys einb ücke ko alen e knüp es, pa allel o ien-
ie es Dime (Abbildung 12). Jedes Monome bes eh aus ün α-Helices, die die Fo m
eine gek ümm en Hand annehmen. Helix 1 ag dabei jeweils klamme a ig an das ande e
Monome he an und in e agie do mi Helix 5 (Abbildung 12 A). Die Res e zwischen
Helix 4 und 5 bilden zudem einen Bogen aus in dem de ca boxy e minale Teil on Helix
4* lieg . T o z pa allele Ano dnung de Monome e zeigen die amino e minalen Enden on
Helix 1 und 1*, welche die Ve bindung zu den epe i i en Be eichen des Seidenp o eins
da s ellen, in einem Winkel on e wa 100° ela i zueinande on de NR3-Domäne weg.
Das zen ale Dime isie ungsin e ace um Helix 4 s ell mi meh e en Leucinen und Valinen
den hyd ophobs en Teil des P o eins da (Abbildung 12 C, D). Die In e ak ion de hyd o-
phoben Sei enke en wi d du ch eine leich e Ve d ehung de beiden zen alen Helices zu-
einande e s ä k (Abbildung 12 A). Am amino e minalen Ende on Helix 4 be inde sich
ein konse ie es Cys ein, das beide Monome e übe eine Disul idb ücke ko alen e -
knüp [24, 36, 151]. In he mischen En al ungsexpe imen en un e eduzie enden Bedin-
gungen ode mi ca boxyme hylie en Cys ein es en konn e gezeig we den, dass die Disul-
idb ücke das P o ein signi ikan s abilisie . Jedes Monome en häl zudem zwei Salzb ü-
cken (R43-E101, R52-D92), die jeweils Helix 1, 2 und 4 e binden (Abbildung 12 B).
Synopsis
[29]
Abbildung 12: Lösungss uk u on NR3. A) Au - und Sei enansich des NR3-Dime s in e ein ach e
Da s ellung. Die Helices on Monome 1 (blau) sind mi H1-H5 gekennzeichne , die on Monome 2 ( o )
mi H1*-H5*. Die Sei enke en de Disul idb ücke (Cys92) sowie de Salzb ücken R43-D93 und R52-E101
sind gezeig . B) Ve g öße ung des Be eiches um die Salzb ücken sowie des Cys eins in einem Monome .
C) Da s ellung eines NR3-Monome s inne halb de dime en S uk u . Die Salzb ücken de ie geladenen
Aminosäu en sind eingezeichne . D) Molekülobe läche des Monome s aus (C) einge ä b nach de Hyd o-
phobizi ä sskala nach Ky e & Dooli le [152]. G au: hyd ophobe Res e; Blau/Dunkelblau: hyd ophile Res e.
Die S uk u en wu den mi PyMOL gezeichne .
Diese ie an de Ausbildung de ionischen Bindungen be eilig en Aminosäu en sind die
einzigen geladenen in de gesam en bekann en na ü lichen ADF3-Sequenz und ebenso wie
das Cys ein hochkonse ie inne halb de ca boxy e minalen Domänen de MaSp-P o eine
[7]. Um die Bedeu ung de Salzb ücken nähe zu beleuch en wu den he mische En al-
ungsexpe imen e mi NR3-Mu an en du chge üh , bei denen jeweils eine geladene Ami-
nosäu e gegen Alanin ausge ausch wu de. Säm liche Alanin-Mu an en weisen dabei zum
Teil e heblich eduzie e Schmelzpunk e au (Teila bei I, Supplemen -Abbildung 2 B).
Auch eine Umkeh de Polung de Salzb ücken z. B. on R43-D93 zu D43-R93 üh e zu
eine Reduk ion des Schmelzpunk es um ca. 20°C, was zeig , dass de Be eich um die
Salzb ücken seh sensi i in Bezug au die Sei enke eng öße is .
H1*
S-S B ücke
H1
H2*
H3*
H3
H2
H4*
H4
H5*
H5
S-S
B ücke
H2
R52
R43
D93
E101
H3
H3*
H2*
H4 H4*
NH3
NH3*
H5
H1
H2
H3
H4
R52
R43
D93
C92
E101
Au sich A) B)
C) D)
Sei enansich
H1
H2
R52
R43
D93
C92
E101
H3
H4
H5
Synopsis
[30]
Mi Expe imen en, die Ände ungen de chemischen Ve schiebungen einzelne Res e de ek-
ie en (chemical shi pe uba ions, CSP), konn e nachgewiesen we den, dass diese Be-
eich des Moleküls besonde s lexibel is . In Anwesenhei on Ha ns o is die Dynamik
in diesem Teil des Moleküls am g öß en, was da au schließen läss , dass das P o ein in
diesem Be eich zu en al en beginn . In wei e en CSP-Expe imen en konn e dahe auch
gezeig we den, dass de ü hyd ophobe Be eiche sensi i e Fa bs o Anilinonaph halen-
Sul onsäu e (ANS) be o zug in diesem Be eich binde (Teila bei I, Abbildung 3).
2.2.2 Ein luss on Salz und Sche k ä en au das NR3-Dime
Da die Speiche ung de hochkonzen ie en Spid oinlösung in einem Na iumchlo id-
hal igen Milieu e olg [107], wu de de Ein luss des Salzes au die S uk u und insbeson-
de e au die Region um die Salzb ücken eingehende cha ak e isie .
Dazu wu de in chemischen En al ungsexpe imen en die S abili ä de NR-Domäne bei
s eigende P o einkonzen a ion in An- und Abwesenhei on Na iumchlo id un e such .
Mi s eigende P o einkonzen a ion on 5 au 60 µM sink de Übe gangspunk bei Ha n-
s o -induzie e En al ung on ca. 2,8 M au ca. 2 M Ha ns o . Die S eigung de Ku en
und somi die Koope a i i ä des En al ungs o ganges nimm dabei s e ig ab, gezeig
du ch den Ve lus des ypischen sigmoidalen Ve lau s bei 60 µM P o einkonzen a ion
[150]. Wi d das En al ungsexpe imen bei eine P o einkonzen a ion on 60 µM in An-
wesenhei on 250 mM Na iumchlo id du chge üh , is eine S abilisie ung des P o eins
zu beobach en, wie an dem deu lich koope a i e en Übe gang sowie einem leich e höh en
Übe gangspunk zu e kennen. Du ch E höhung de NaCl-Konzen a ion au 500 mM s eig
die S abili ä des P o eins soga bei eine Konzen a ion on 60 µM wiede au einem Ni-
eau mi de 5 µM-P o einlösung (Teila bei I, Abbildung 3 B).
Ein ähnliche NaCl-abhängige E ek is bei he mischen En al ungsexpe imen en mi
NR3 in s a k eduzie endem Milieu zu beobach en, in dem sich die Disul idb ücke nich
ausbilden kann. Reduzie es NR3 zeig einen ca. 20°C nied ige en Schmelzpunk als das
oxidie e, ko alen e knüp e NR3. Die Anwesenhei on NaCl eliminie den des abili-
sie enden Ein luss de ehlenden Disul idb ücke nahezu olls ändig.
Ein G und ü die beiden beobach e en NaCl-abhängigen E ek e kann eine S abilisie ung
des hyd ophoben Be eiches um das Cys ein sein. Wie be ei s e wähn is diese Be eich
des Moleküls am dynamischs en und zugleich du ch hyd ophobe Be eiche gep äg . Wie
bei ande en P o einen be ei s beobach e , können du ch s eigende Salzkonzen a ion die
Synopsis
[31]
hyd ophoben In e ak ionen ges ä k we den, was die e höh e S abili ä bei e höh e P o-
einkonzen a ion und un e eduzie enden Bedingungen e klä [153-155].
Nach de Speiche ung bei hohen Konzen a ionen sind die na ü lichen Spinnenseidenp o e-
ine un e ande em Sche k ä en im Spinnkanal ausgese z , weshalb auch de en Ein luss au
die NR3-Domäne un e such wu de. Sche k ä e wu den en wede du ch „Vo exen“ ode
du ch Übe kop -Ro a ion bei 20-25 Umd ehungen p o Minu e e zeug . Die Expe imen e
wu den zudem in Anwesenhei on 50 und 500 mM NaCl du chge üh , um den Ein luss
on Salz mi zu un e suchen. Es zeig e sich, dass ca. 50% on NR3 selbs bei langsame
Ro a ion übe einen Zei aum on 18-24 h agg egie . Im Ve gleich zu den he mischen
En al ungsexpe imen en is du ch die Anwesenhei on 500 mM NaCl kein ausgep äg e
S abilisie ungse ek zu e kennen. Du ch An ä ben mi dem ü hyd ophobe Be eiche sen-
si i en Fa bs o ANS wi d deu lich, dass die sche k a induzie e Agg ega ion mi de
Exposi ion on hyd ophoben Be eichen einhe geh (Teila bei I, Abbildung 3D) [150].
2.2.3 Zusammen assung: NR3-Domäne
Wäh end des Spinnp ozesses s eig die P o einkonzen a ion im Spinnkanal du ch Wasse -
en zug s e ig an, wäh end die Na iumchlo idkonzen a ion imme meh abnimm . Das
wäh end de Speiche ung in de D üse o handene Na iumchlo id [107] s abilisie die
NR3-Domäne bei s eigenden P o einkonzen a ionen und kann somi une wünsch e Ag-
g ega ion un e d ücken. Sche k ä e, wie sie wäh end des Ve spinnens au e en, ö de n
hingegen die Agg ega ion de NR3-Domäne. Zusä zlich nimm die NaCl-Konzen a ion
wäh end des Ve spinnens ab, was eine gleichzei ige Des abilisie ung de NR3-Domäne
bewi k und dadu ch möglichweise die Assemblie ung wei e beschleunig . Sowohl bei de
NaCl-abhängigen S abilisie ung wie auch de sche k a induzie en Agg ega ion sind
Aminosäu en um das hochkonse ie e Cys ein sowie den Salzb ücken en scheidend in-
ol ie .
2.3 Ein luss on NR3 au das Lösungs e hal en on eADF3((AQ)n) P o einen
2.3.1 Bildung on sup amolekula en Assembla en
Um die Funk ion on NR3 besse zu e s ehen, wu de die Domäne mi ekombian en Va-
ian en de Ke ndomäne des na ü lichen Spinnenseidenp o eins ADF3 kombinie und de-
en Lösungs- und Assemblie ungs e hal en un e such ( gl. Abb. 11). Die ekombinan e
Synopsis
[38]
2.4 He e odime isie ung on NR3-NR4-Kons uk en
2.4.1 Bildung des He e odime s
Die bishe igen Un e suchungen haben sich lediglich au eines de beiden ADF-P o eine
aus de d agline-Seide on A. diadema us konzen ie . Da die beiden P o eine ADF3 und
ADF4 alle Wah scheinlichkei nach in de G oßen Ampullend üse in den gleichen Zellen
p oduzie we den [8, 35], wu den die Un e suchungen au das zwei e bekann e Spinnen-
seidenp o ein au Basis on ADF4 ausgedehn . De Fokus lag hie bei au möglichen In e -
ak ionen e mi el du ch die homologen CT-Domänen NR3 und NR4.
ADF3 und 4 un e scheiden sich haup sächlich in ih e epe i i en Ke ndomäne. eADF4-
P o eine sind hyd ophobe als eADF3-P o eine und zeigen ein ande es Löslichkei s- und
Assemblie ungs e hal en [134, 135, 160]. So sind eADF3-P o eine in wäss ige Lösung
bis zu 30% (w/ ) löslich, wäh end eADF4-P o eine bis maximal 9% (w/ ) löslich sind
[124]. Die nich - epe i i en ca boxy e minalen Domänen (CTD) NR3 und NR4 hingegen
sind zueinande , wie alle MaSp-CTD-Sequenzen, s a k homolog. Dahe s ell e sich die
F age de na ü lichen In e ak ion on eADF3-NR3 und eADF4-NR4.
Dazu wu den die beiden P o eine eADF3((AQ)12NR3) und eADF4(C16NR4) sowohl in
i o nach indi iduelle P oduk ion als auch in i o nach Coexp ession de en sp echenden
Gene un e such .
Beide P o eine bilden schon wäh end de P oduk ion in E. coli übe ih e ca boxy e mina-
len Domänen ko alen e knüp e Dime e aus, wobei de g öß e Teil de P o eine in de
löslichen F ak ion nach Zellau schluss zu inden is . Die Coexp ession ha au die Löslich-
kei de einzelnen P o eine keinen Ein luss. Mi els SDS-PAGE und anschließendem Wes-
e n Blo konn e in den Coexp essionsp oben eine Bande iden i izie we den, die eindeu ig
einem ca boxy e minal e mi el em He e odime zugeo dne we den konn e (Teila bei
III, Abbildung 2b). Solch ein He e odime kann man auch du ch in i o Expe imen e e -
hal en, indem man zu eine 1:1 Mischung chemisch dena u ie em eADF3((AQ)12NR3)
und eADF4(C16NR4) ein s a kes Reduk ionsmi el wie TCEP gib und die P o eine un e
eduzie enden Bedingungen zu ück al e . Alle dings is die Menge an gebilde en He e o-
dime in i o wesen lich ge inge als in i o, wo eine Ve eilung de d ei dime en Spezies
on nahezu 1:1:1 beobach e wu de (Teila bei III, Abbildung 2c).
Synopsis
[39]
2.4.2 Assemblie ungseigenscha en des He e odime s
Um das He e odime nähe zu cha ak e isie en, wu de es mi els eine zweis u igen Reini-
gungss a egie, bes ehend aus eine Nickel-A ini ä sch oma og a ie und einem Anionen-
ausche sch i ge einig .
Die s uk u elle In eg i ä des He e odime s wu de mi els Fe n-UV-CD-Spek oskopie
un e such . Das Fe n-UV-CD-Spek um zeig keine signi ikan en Un e schiede zu denen
de beiden Homodime en (Teila bei III, Abbildung 2d). Die S uk u des He e odime s
wi d e e sibel, genau wie die beiden Homodime e, nach dena u ie endem E hi zen und
Abkühlen quan i a i ena u ie . Die Schmelz empe a u des He e odime s lieg mi 66°C
zwei G ad übe de des (AQ)12NR3-Dime s und 1.5 G ad un e de des C16NR4-Dime s.
In einem wei e en Expe imen wu de die in i o Löslichkei de d ei dime en P o eine bei
Phospha -induzie e Agg ega ion bzw. Assemblie ung un e such . Die Expe imen e wu -
den analog zu den be ei s gezeig en aus Teila bei I und II du chge üh . Diese Assay
zeig , dass die beiden Homodime e (AQ)12NR3 und C16NR4 ca. im gleichen Phospha kon-
zen a ionsbe eich on 150 – 300 mM am s ä ks en agg egie en. In Assemblie ungskine i-
ken, die mi els Lich s euung in Anwesenhei on 100 mM Phospha au genommen wu -
den, zeig e sich, dass C16NR4 wesen lich schnelle assemblie als (AQ)12NR3. Das He e-
odime assemblie in e essan e weise nu ge ing ügig langsame als C16NR4. We den die
Assemblie ungskine iken in Anwesenhei des β-Fal bla de ek ie enden Fa bs o s
Thio la inT (ThT) du chge üh , zeig e (AQ)12NR3 signi ikan wenige ThT-Bindung als
die ande en beiden Dime e (Teila bei III, Abbildung 3c).
2.4.3 Assemblie ungsmo phologien de Homodime e im Ve gleich zum He e odime
Ein wesen liches Un e scheidungsme kmal zwischen eADF3 und eADF4-P o einen is ih
Selbs assemblie ungs e hal en. Es konn e be ei s gezeig we den, dass eADF4(C16), ein
De i a ohne die NR4-Domäne, in Anwesenhei on bis zu 300 mM Kaliumphospha Na-
no ib illen ausbilde . Diese Fib illen haben einen hohen β-Fal bla an eil [135]. eADF3-
P o eine hingegen bilden keine ib illä en S uk u en in diese G ößeno dnung aus sonde n
neigen in Anwesenhei on Phospha zu Ausbildung sup amolekula e , mizella ige As-
sembla e (Teila bei II). Um die Selbs assemblie ungseigenscha en des AQ/C-
He e odime s zu un e suchen, wu de es in Anwesenhei on 50 – 100 mM Kaliumphospha
ü 1-2 Tage inkubie und anschließend mi els Ras e k a - (AFM) und T ansmissions-
Synopsis
[40]
elek onenmik oskopie (TEM) un e such (Abbildung 17 & Teila bei III, Supplemen Ab-
bildung 1).
Abbildung 17: AFM-Au nahmen de d ei dime en Spezies. (A) C16NR4, (B) (AQ)12NR3 und (C) He e o-
dime . Die P o eine wu den o den Au nahmen ü 24 h in T is/HCl-Pu e , pH 8,0 und 50 mM Kaliumpho-
spha bei Raum empe a u inkubie . Die Bilde wu den im apping mode e s ell .
C16NR4 bilde un e den hie ge es e en Bedingungen Fib illen on meh e en hunde Na-
nome e n Länge, die denen de be ei s besch iebenen C16_ΔNR4-Fib illen seh ähnlich
sind [135]. (AQ)12NR3 bilde nich - ib illä e Mo phologien aus, die ehe an be ei s be-
sch iebenen sphä ische, mizella ige Assembla e e inne n (Teila bei II). In T ansmissions-
elek onenmik oskopischen Au nahmen konn en diese Assembla e eben alls nachgewiesen
we den (Teila bei III, Supplemen Abbildung 1). Das He e odime hingegen bilde eben-
alls Nano ib illen aus, die sich jedoch on C16NR4-Fib illen signi ikan un e scheiden. Sie
sind wesen lich dünne und bilden ein hoch e zweig es Ne zwe k, wobei die Abs ände
zwischen den einzelnen Ve zweigungspunk en manchmal nu wenige Nanome e be agen.
2.4.4. Bedeu ung des He e odime s
Beide MaSp-P o eine we den in de D üse im selben Be eich sek e ie [8, 35, 161]. Ge-
nomische Un e suchungen an egula o ischen Elemen en de Spid oingene deu en au eine
gemeinsame Regulie ung de Gene/P o eine hin [8]. Übe po en ielle In e ak ionen zwi-
schen MaSp-P o einen is wenig bekann , lediglich übe die Ve eilung im Faden [44, 46,
102].
ADF3 und 4 sind au g und ih es hohen P olingehal es MaSp2 Analoga, wobei ADF4 hyd-
ophobe is als ADF3 [7]. Die beiden zugehö igen ca boxy e minalen Domänen NR3 und
NR4 weisen eine seh hohe Homologie au [81]. Die in diesem Abschni p äsen ie en
E gebnisse zeigen, dass beide ADF P o eine übe ih e ca boxy e minalen Domänen be ei s
500 nm 500 nm500 nm
C16NR4 (AQ)12NR3 He e odime
ABC
Synopsis
[41]
wäh end de P oduk ion inne halb de Zellen, z.B. in den Kompa imen en des sek e o i-
schen Sys ems, in e agie en können. Mögliche weise agie das He e odime als zusä zli-
che „Que e ne ze “ bzw. als Assemblie ungs e mi le zwischen beiden d agline P o ei-
nen.
Aus bio echnologische Sich s ell die Möglichkei un e schiedliche Seidenp o eine mi els
de ca boxy e minalen Domänen zu e knüp en eine ein ache Me hode da um e schiede-
ne Ma e ialien mi eins ellba en Eigenscha en he zus ellen.
2.5 De Ein luss de e minalen Domänen au die O ien ie ung de epe i i en
Ke ndomäne on ekombinan en Spinnenseidenp o einen
In den bishe igen A bei en (Teila bei I-III) wu de ausschließlich de Ein luss de nich -
epe i i en ca boxy e minalen Domäne au eADF3 und 4 P o eine un e such . Um wei e e
E kenn nisse übe den Ein luss de e minalen Domänen au das Lösungs- und Assemblie-
ungs e hal en zu e hal en, wu den ekombinan e eADF3-P o eine mi beiden e minalen
Domänen un e such (Teila bei VI). Da die na i e NT-Domäne de ADF-P o eine nich
bekann is , kam s a dessen die NT-Region on MaSp1 de schwa zen Wi we (L. hespe-
us) zu Ve wendung ( gl. Abbildung 10). In eine ande en A bei wu de de en S uk u
mi els NMR un e such und gezeig , dass diese eine seh hohe s uk u elle Homologie zu
einzig bekann en K is alls uk u eine MaSp-NT-Domäne eine ande en Spinnena au -
weis [79, 85]. Die NT-Domäne aus de schwa zen Wi we dime isie eben alls du ch Ab-
senken des pH-We es on 7,2 au 6,0.
Die Sequenz de NT-Domäne N1 wu de zunächs an eADF3((AQ)12NR3) gekoppel , da
dieses bei den o angegangen A bei en in ensi cha ak e isie wu de. Als Kon olle wu de
pa allel dazu eADF3(N1-(AQ)12) ohne die CT-Domäne he ges ell . Um im Rahmen diese
Un e suchungen mögliche In e ak ionen zwischen beiden e minalen Domänen besse zu
cha ak e isie en, wu de zudem noch das ku ze eADF3-P o ein N1-AQ-C1 bes ehend aus
einem AQ-Block und den beiden e minalen Domänen on MaSp1 de schwa zen Wi we
he ges ell ( gl. Abbildung 11). Die C1-Domäne is homolog zu NR3-Domäne und bilde
gekoppel an eADF3-P o eine ebenso quan i a i Dime e aus (Da en nich gezeig ).
In de NT-Dime s uk u is am ca boxy e minalen Ende eines Monome s eine Ve ie ung
zu e kennen, on de e mu e wi d, dass do Teile eine Linke egion zu epe i i en
Ke ndomäne binden und so die Aus ich ung de Ke en a e ie en könn en [79]. Da die
bishe un e such e N1-Sequenz diese Linke egion nich en häl , wu den zusä zlich Va ian-
Synopsis
[42]
en mi de 32 Aminosäu en langen na i en Linke egion des MaSp1-P o eins de schwa -
zen Wi we he ges ell ( gl. Abbildung 10) [79].
2.5.1 pH-abhängige Un e suchung de N1- und N1L-P o eine mi els CD- und
Fluo eszenzspek oskopie
Die isolie e N1-Domäne zeig e mi allendem pH-We eine e höh e he mische S abili ä
in CD-Expe imen en, was als Indika o ü die Dime bildung gil [85]. Die N1- und N1L-
(AQ)12 Kons uk e wu den dahe eben alls mi els CD-Spek oskopie un e such (Abbil-
dung 18).
Abbildung 18: pH-abhängiges Schmelz e hal en on N1-hal igen eADF3-P o einen und de isolie en
N1-Domäne. Es sind die Schmelzku en on (A) N1-(AQ)12 & N1L-(AQ)12, (B) N1-(AQ)12NR3 & N1L-
(AQ)12NR3, (C) N1(AQ)C1 & N1L(AQ)C1 sowie de isolie en (D) N1-Domäne jeweils bei pH 6,0 und 7,2
da ges ell . Die P o einkonzen a ion be ug bei allen Messungen 4 µM. Die Heiz- und Kühl a e bei den
he mischen En al ungsanalysen be ug 1°C/min. Alle Messungen wu den in 10 mM Kaliumphospha pu e
du chge üh .
Bei allen Kons uk en sind die Schmelzku en wie bei de isolie en N1-Domäne auch bei
pH 6,0 im Ve gleich zu pH 7,2 signi ikan zu höhe en Tempe a u en e schoben (Abbil-
@ 222 nm no m.
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
@ 222 nm no m.
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
@ 222 nm no m.
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
@ 222 nm no m.
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
20 30 50
N1-(AQ)
12
NR3 pH 6,0
N1-(AQ)
12
NR3 pH 7,2
N1L-(AQ)
12
NR3 pH 6,0
N1L-(AQ)
12
NR3 pH 7,2
N1-(AQ)
12
pH 6,0
N1 pH 6,0
N1 pH 7,2
N1-(AQ)
12
pH 7,2
N1L-(AQ)
12
pH 6,0
N1L-(AQ)
12
pH 7,2
N1(AQ)C1 pH 6,0
N1-(AQ)C1 pH 7,2
N1L-(AQ)C1 pH 6,0
N1L-(AQ)C1 pH 7,2
60 70 8040 Tempe a u (°C) 20 30 50 60 70 8040 Tempe a u (°C)
20 30 50 60 70 8040 Tempe a u (°C)
20 30 50 60 70 8040
Tempe a u (°C)
AB
CD
Synopsis
[43]
400
440420400
350
380360340320
300
250
200
150
100
50
0
Fluo eszenz
Wellenlänge (nm)
N1-(AQ)
12
pH 6,0
N1-(AQ)
12
pH 7,2
N1-(AQ)
12
NR3 pH 6,0
N1-(AQ)
12
NR3 pH 7,2
N1-(AQ)C1 pH 6,0
N1-(AQ)C1 pH 7,2
N1L-(AQ)
12
pH 6,0
N1L-(AQ)
12
pH 7,2
N1L-(AQ)C1 pH 6,0
N1L-(AQ)C1 pH 7,2
NRN1 pH 6,0
NRN1 pH 7,2
dung 18). Die Linke egion beein luss die he mische S abili ä bei beiden pH-We en
dabei nu ma ginal. Bei den ie P o einen mi beiden e minalen Domänen sind bei pH 7,2
zwei Be eiche zu beobach en, die seh wah scheinlich den En al ungs o gängen de bei-
den Te mini en sp echen (Abbildung 18 B). Die Schmelz empe a u un e schiede zwischen
den pH-We en bei allen Kons uk en sind e gleichba mi denen de isolie en N1-
Domäne. Die Spek en bei 20°C o und nach dem E hi zen de P o eine übe lage n sich
nahezu olls ändig, was ü ein quan i a i es Rück al en sp ich . Die einzigen Ausnahmen
s ellen N1(AQ)C1 und die N1-Domäne bei pH 6,0 da , die beim E hi zen au 85°C un e
den gewähl en Bedingungen olls ändig agg egie en (E gebnisse nich gezeig ).
Die N1-Domäne besi z ein einzelnes T yp ophan welches abhängig om pH-We un e -
schiedliche Fluo eszenzemissionen au weis [79, 80]. Du ch Absenken des pH-We es on
7,2 au 6,0 sink bei de isolie en N1-Domäne die Fluo eszenzemission, und das Maxi-
mum e lage sich on ca. 330 nach 345 nm. Diese Fluo eszenze ek basie au eine
kon o ma ionellen Umlage ung des T yp ophans, die wäh end de Dime isie ung au i
[34, 79, 80]. Um zu übe p ü en ob diese E ek und dami eine mögliche Dime isie ung
bei den N1- und N1Linke -Kon uk en au i , wu den diese dahe bei pH 7,2 und 6,0 mi -
els Fluo eszenzspek oskopie un e such (Abbildung 19).
Abbildung 19: pH-abhängige Fluo-
eszensmessungen on N1-
P o einen. Da ges ell sind Emission-
spek en bei pH 6,0 (geschlossene
Symbole) und pH 7,2 (o ene Symbo-
le). Zum Ve gleich sind die Spek en
de isolie en N1-Domäne mi ange-
geben ( on Joschka Baue zu Ve ü-
gung ges ell ). Die Lage de un e -
schiedlichen Maxima is du ch ges i-
chel e Linien he o gehoben Die
P o eine wu den o de Messung in
Pu e n mi den en sp echenden pH-
We en äquilib ie . Die P o einkon-
zen a ion be ug bei den Messungen
zwischen 3 und 6 µM. Die An e-
gungswellenlänge be ug 295 nm.
Die Fluo eszenzmessungen zeigen, dass alle N1-(AQ)-P o eine bei den beiden pH-We en
das gleiche Ve hal en au weisen wie die isolie e N1-Domäne. Bei pH 6,0 is die Fluo es-
zenzin ensi ä ge inge und das Maximum zu ca. 345 nm e schoben. Die Maxima bei
pH 7,2 liegen alle bei ca. 330 nm. Die Spek en zeigen zudem, dass die Anwesenhei de
Linke egion keinen Ein luss au den Fluo eszenze ek ha . Lau diesen Messungen soll-
Synopsis
[44]
en dahe säm liche N1-Domänen in den eADF3-Kons uk en du ch pH-Absenkung dime-
isie en.
2.5.2 SEC-MALS-Analyse de N1- und N1L-P o eine
Die pH-abhängige Dime isie ung de N1-Domäne wu de mi els an eine G ößenausschlus-
sch oma og apie gekoppel e s a ische Lich s euungsmessung (SEC-MALS) e olg [85].
Um zu übe p ü en, ob die N1-hal igen eADF3-Kons uk e auch a sächlich Dime isie en
ode e l. Oligome isie en wu den hie eben alls SEC-MALS Expe imen e du chge üh
(Abbildung 20).
Abbildung 20: SEC-MALS Analyse on N1-eADF3 und N1-eADF3-NR3 P o einen in Abhängigkei
om pH-We . Gezeig is jeweils das UV-Ch oma og amm (du chgezogene Linie) mi de no mie en Ab-
so p ion bei 280 nm sowie die mi els MALS e mi el en Molekula gewich e de P o einspezies (Punk e).
A) N1-(AQ)12 und N1L-(AQ)12. B) N1-(AQ)12NR3 und N1L-(AQ)12NR3. C) N1-(AQ)-C1 und N1L-(AQ)-
C1. D) Tabella ische Da s ellung de mi els MALS e mi el en Molekula gewich e de einzelnen P o eine
bei pH 6,0 und 7,2. Die P o einkonzen a ion in allen Läu en be ug ca. 12 µM.
Die SEC-MALS E gebnisse on N1-(AQ)12NR3 bzw. N1L-(AQ)12NR3 zeigen, dass die
Absenkung des pH-We es keine Ände ung des Assemblie ungszus andes bewi k . Bei
beiden pH-We en liegen die P o eine nahezu olls ändig als NR3- e mi el e Dime e o .
Alle dings is die Re en ionszei des N1L-Kons uk es bei pH 6,0 signi ikan g öße , was
8 10121416182022
Zei (min)
MW pH 6,0
MW pH 7,2
MW pH 6,0
MW pH 7,2
pH 6,0
pH 7,2
pH 6,0
pH 7,2
N1-(AQ)
12
N1-(AQ)
12
N1-(AQ)
12
NR3
N1L-(AQ)
12
NR3
N1L-(AQ)
12
MW pH 6,0
MW pH 7,2
MW pH 6,0
MW pH 7,2
pH 6,0
pH 7,2
pH 6,0
pH 7,2
N1-(AQ)-C1
N1L-(AQ)-C1
MW pH 6,0
MW pH 7,2
MWpH 6,0
MW pH 7,2
pH 6,0
pH 7,2
pH 6,0
pH 7,2
N1-(AQ)
12
NR3
N1L-(AQ)
12
NR3
N1L-(AQ)
12
N1-(AQ)-C1
N1L-(AQ)-C1
8 10121416182022
Zei (min)
8 10121416182022
Zei (min)
Molekula gewich (kDa)
40
60
20
0
80
100
120
140
160
Molekula gewich (kDa)
DMolekula gewich e (kDa)
100
150
50
0
200
250
300
350
400
Molekula gewich (kDa)
50
75
25
0
100
125
150
no m.
U
V Abso p ion
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
no m. UV Abso p ion
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
no m.
U
V Abso p ion
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
AB
C
pH 6,0 pH 7,2
106 & 65,6
(75:25)
136,5 & 67,4
(81:19)
101,6 & 47,2
89:11
116,8 & 43,6
87:13
139,1137,7
156,5162,9
61,2
127,4 & 64,6
(6:94)
63,75
140,6 + 66,2
(10:90)
Synopsis
[45]
au eine Ände ung des hyd odynamischen Radius und somi de P o einpackung hinweis
(Abbildung 20 B). Die wesen lich kleine en N1- und N1L-(AQ)-C1-Kons uk e zeigen
eben alls nu eine schwache Tendenz zu Ausbildung on in e molekula en Dime en, wo-
bei hie die Anwesenhei de Linke egion sich ba zu einem höhe en Dime - om-Dime
An eil bei äg (Abbildung 20 C). Um zu übe p ü en ob die NT-abhängige Dime isie ung
a sächlich in Ve bindung mi epe i i en Blöcken unk ionie , wu de als Kon olle N1-
(AQ)12 bzw. N1L-(AQ)12 un e such . Im Gegensa z zu den P o einen mi beiden nich -
epe i i en e minalen Domänen zeigen liegen beide P o eine bei pH 6,0 haup sächlich als
N1- e mi el es Dime o . In e essan e weise dissoziie en sie auch bei pH 7,2 nich quan-
i a i . Auch hie zeig sich, alle dings ü das N1-Kons uk , eine signi ikan e schobene
Re en ionszei bei pH 6,0. Da alle P o eine in e wa bei gleiche Konzen a ion au die Säu-
le applizie wu den, deu en die E gebnisse au un e schiedliche Assozia-
ions/Dissozia ionskons an en de e schiedenen N1/N1L-P o eine hin.
Die Anwesenhei de ca boxy e minalen Domäne schein demnach einen Ein luss au die
N1- e mi el e Dime isie ung zu haben. Wäh end Fluo eszenz- und CD-Assays zeigen,
dass alle N1-hal igen P o eine au die Absenkung des pH-We es seh ähnlich eagie en,
konn e dies bei den SEC-MALS Expe imen en nich bes ä ig we den. Die E gebnisse zei-
gen, dass die ca boxy e minale Domäne NR3 mögliche weise die Kon o ma ion und/ode
Aus ich ung de epe i i en Be eiche meh als bishe angenommen beein luss . Es sind
jedoch noch wei e üh ende Expe imen e no wendig um diesen auch ü das Ve s ändnis
des na ü lichen Spinnp ozesses wich igen Sach e hal wei e zu cha ak e isie en. Die AQ-
P o eine mi beiden e minalen Domänen s ellen eine gu e Basis ü wei e üh ende Expe-
imen e da .
2.6 Modell des na ü lichen Spinnp ozesses
Im Rahmen diese A bei is es gelungen ein e s es übe g ei endes Modell ü die Ini iie-
ung de Fadenassemblie ung zu e s ellen (Teila bei en IV & V) (Abbildung 21).
Die MA-Spid oine we den zunächs on da ü spezialisie en Zellen p oduzie und ins
Lumen de D üse sek e ie , welches einen pH-We on ca. 7,2 au weis . Die Spid oinge-
ne we den alle Wah scheinlichkei nach coexp imie [8, 35, 162]. Sie liegen au g und de
CT-Domäne als pa allel o ien ie e ko alen e knüp e Dime e o und we den bis zum
Ve spinnen in de Ampulla bei hohen Konzen a ionen on bis zu 50% (w/ ) gelage .
Synopsis
[46]
Abbildung 21: Molekula es Modell des Spinnp ozesses inne halb de MA-D üse. Die Spid oine we den
als ko alen e Dime e sek e ie und anschließend bei hohen Konzen a ionen in Fo m on mizella igen As-
sembla en mi lüssigk is allinen Eigenscha en gelage (i, ii). Du ch wei e es Absenken des pH-We es im
Spinnkanal bilden die NT-Regionen an ipa allele Dime e aus, die die Spid oine wei e e ne zen. Das Au -
e en on Sche - und Elonga ionsk ä en im Spinnkanal sowie de ak i e En zug on Wasse ini iie die
Bildung de β-Fal bla k is alle (iii). Gleichzei ig en al en die CT-Domänen und exponie en so hyd ophobe
Be eiche, die die Assemblie ung wei e beschleunigen. Pa allel dazu un e s ü z die CT-domäne die Aus ich-
ung de s uk u ellen Elemen e en lang de Fase achse e möglichen (iii). Im inalen Faden sind die an ipa al-
lelen β-Fal bla k is alle en lang de Fase achse o ien ie und agen so zu mechanischen S abili ä bei.
Modi izie nach [3]
Au g und des amphiphilen Cha ak e s de epe i i en Ke ndomänen lage n sich die P o ei-
ne zu sup amolekula en, mizella igen Assembla en zusammen, die einen lüssigk is alli-
nen Cha ak e au weisen [105]. An de Bildung diese Assembla e is mögliche weise die
CT-Domäne be eilig . Das in de Ampulla o handene Na iumchlo id s abilisie die CT-
Domäne gegen En al ung und dami gegen o zei ige Assemblie ung. Die nich - epe i i e
amino e minale (NT) Domäne lieg in de Ampulla au g und des pH-We es und de An-
wesenhei on Na iumchlo id übe wiegend als Monome o . Da de pH-We inne halb
de Ampulla on 7,2 bis au ca. 6,5 ku z o Beginn des S- ö migen Spinnkanal abnimm ,
s eig die Tendenz de NT-Domäne an ipa allele Dime e zu bilden [82, 83]. Mi Ein i in
den S- ö migen Spinnkanal du ch eine A T ich e e ände n sich die physikochemischen
Bedingungen in de D üse. Es komm zu eine wei e en Ansäue ung du ch P o onenpum-
pen au ca. pH 6,0 [82, 83] sowie zu Ionenaus auschp ozessen bei denen Na iumchlo id
du ch das kosmo ope e Kaliumphospha e se z wi d. Du ch die Windungen sowie dem
ko alen e knüp e ,
dime e C-Te minus
monome e N-Te minus
Repe i i e Block
i) Fo sa z ii)Ampulla
Die Spid oine sind eilw. o s uk u ie
Fase mi β-Fal bla k is allen, die en lang de
Fase achse ausge ich e sind
Sche induzie e Elonga ion sowie pH-
beding e Dime isie ung de N- e minalen
Domäne
und zeigen lüssigk is allinen Cha ak e
iii) Spinnkanal
nich -ko alen es,
N- e minales Dime
.
i ) Außen
Wasse en zug und Sche k ä e e s ä ken die
Phasensepa a ion und die dami e bundene
Bildung de β-Fal bla s uk u en sowie die
Aus ich ung de P o eine; du ch En al ung de
C- e minalen Domäne we den hyd ophobe
Be eiche eigese z , die die Assemblie ung wei e
beschleunigen.
Synopsis
[47]
enge we denden Spinnkanal e en zusä zlich Sche - und Elonga ionsk ä e au . In Abwe-
senhei on Na iumchlo id und in Anwesenhei on Sche k ä en en al e sich die CT-
Domäne und ö de du ch die Exposi ion on hyd ophoben Be eichen die Assemblie ung
de Spid oine. Die NT-Domäne dime isie un e den Bedingungen im Spinnkanal. Diese
an ipa allelen Dime e beschleunigen du ch die mögliche Ve ne zung de Spid oine die
Assemblie ung. Du ch das Kaliumphospha sowie die Sche - und Elonga ionsk ä e bilden
sich in e molekula e β-Fal bla k is alle. Pa allel dazu wi d im Spinnkanal Wasse en zo-
gen, was die Konzen a ion de P o eine e höh und somi zu lüssig- es Phasensepa a ion
bei äg [108]. Zusammen mi den zunehmenden Sche - und Elonga ionsk ä en gegen
Ende des Spinn ak es bewi k die CT-Domäne eine Aus ich ung de s uk u ellen Elemen-
e en lang de Fase achse. Du ch ak i en Zug aus de Spinnwa ze wi d die s uk u elle
Aus ich ung inalisie .
Li e a u e zeichnis
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Publika ionslis e
[56]
4. Publika ionslis e
I. Hagn, F., Eisold , L., Ha dy, J.G., Vend ely, C., Coles, M.,Scheibel, T., Kessle ,
H. (2010) A highly conse ed spide silk domain ac s as a molecula swi ch ha
con ols ib e assembly. Na u e. 465, pp. 239-242
II. Eisold , L., Ha dy, J.G., Heim, M., Scheibel, T. (2010) The ole o sal and shea
on he s o age and assembly o spide silk p o eins. J. S uc . Biol. 170, pp. 413-
419
III. Eisold , L., Dö ing, V., Schiemann, S., Scheibel, T. Coun e play o wo MaSp2
spide silk p o eins om A. diadema us: implica ions o silk ibe assembly.
(2013) Manusc ip in p epa a ion.
IV. Eisold , L., Smi h, A., Scheibel, T. (2011) Decoding he sec e s o spide silk. Ma-
e ials Today. 40, pp. 80-86
V. Eisold , L., Thamm, C., Scheibel, T. (2012) The ole o e minal domains du ing
s o age and assembly o spide silk p o eins. Biopolyme s. 97, pp. 355-361
Die Teila bei en I-V sind nach olgend angehäng . Neben diese A bei sind noch wei e e
Publika ionen au Basis meine Da en geplan und z.T. in Vo be ei ung. Diese sind dahe
nich Teil diese Disse a ion:
VI. Eisold , L., Baue , J., Scheibel, T. (2013) In luence o he non- epe i i e e minal
domains on he spa ial o ien a ion o ecombinan spide silk p o eins in solu ion.
Manusc ip in p epa a ion – Wo k in p og ess
VII. Baue , J., Eisold , L., Schmidpe e , P., Scheibel, T. (2013) In es iga ions on he
dime iza ion mechanism o he MaSp1 NT-domain om he black widow. Manu-
sc ip in p epa a ion – Wo k in p og ess
VIII. Heideb ech , A., Eisold , L., Schmid , A., Diehl, J., Ge e s, M., Scheibel, T.
(2013) Syn he ic spide silk ibe s wi h adjus able mechanical p ope ies. Manu-
sc ip in p epa a ion - – Wo k in p og ess
Da s ellung des Eigenan eils
[57]
5. Da s ellung des Eigenan eils
I. Hagn, F., Eisold , L., Ha dy, J.G., Vend ely, C., Coles, M.,Scheibel, T., Kessle ,
H. (2010) A highly conse ed spide silk domain ac s as a molecula swi ch ha
con ols ib e assembly. Na u e. 465, pp. 239-242
Säm liche NMR-Expe imen e sowie En al ungss udien und ANS/SYPRO O ange Bin-
dungen an de NR3-Domäne wu den on F anz Hagn du chge üh . Die Klonie ung, Rei-
nigung und He s ellung de eADF3(AQ)-Kons uk e wu de on mi du chge üh . Die
Phospha - und Ro a ionsagg ega ionsassays wu den on mi du chge üh . Die Lich mik-
oskopischen Au nahmen de Agg ega e wu de on mi au genommen. Das Manusk ip
wu de on F anz Hagn, D . John Ha dy, Ho s Kessle , Thomas Schiebel und mi e ass .
II. Eisold , L., Ha dy, J.G., Heim, M., Scheibel, T. (2010) The ole o sal and shea
on he s o age and assembly o spide silk p o eins. J. S uc . Biol. 170, pp. 413-
419
Säm liche P o eine wu den on mi he ges ell und ge einig . Alle Agg ega ionsassays
sowie die lich mik oskopischen Au nahmen und Teile de FTIR-Messungen wu den on
mi du chge üh . Das Manusk ip wu de on D . John Ha dy, Thomas Scheibel und mi
e ass .
III. Eisold , L., Dö ing, V., Schiemann, S., Scheibel, T. Coun e play o wo MaSp2
spide silk p o eins om A. diadema us: implica ions o silk ibe assembly.
(2013) Manusc ip in p epa a ion.
Die Reinigungss a egie zum He e odime wu de on mi in Zusammena bei mi S enja
Schiemann und Volke Dö ing en wickel . Die P o eine wu den on Volke Dö ing, S enja
Schiemann und mi ge einig . Die CD-Messungen, AFM- und TEM-Bilde wu den on
mi ange e ig . Das Manusk ip haben Thomas Scheibel und ich e ass .
IV. Eisold , L., Smi h, A., Scheibel, T. (2011) Decoding he sec e s o spide silk. Ma-
e ials Today. 40, pp. 80-86
Die Konzep ion des A ikels s amm on Thomas Scheibel und mi . Das Manusk ip wu de
on Thomas Scheibel und mi e ass . D . And ew Smi h ha eilweise Li e a u be ei ge-
s ell .
V. Eisold , L., Thamm, C., Scheibel, T. (2012) The ole o e minal domains du ing
s o age and assembly o spide silk p o eins. Biopolyme s. 97, pp. 355-361
Die Konzep ion des A ikels s amm on Thomas Scheibel und mi . Das Manusk ip wu de
on Thomas Scheibel und mi e ass . Die Abbildungen wu den on Ch is ophe Thamm
e s ell .
Teila bei en
[58]
6. Teila bei en
Teila bei I
Hagn, F., Eisold , L., Ha dy, J.G., Vend ely, C., Coles, M., Scheibel, T., Kessle , H.
(2010) A highly conse ed spide silk domain ac s as a molecula swi ch ha con ols ib e
assembly. Na u e. 465, pp. 239-242
LETTERS
A conse ed spide silk domain ac s as a molecula
swi ch ha con ols ib e assembly
F anz Hagn
1,2
, Lukas Eisold
3
, John G. Ha dy
3
, Cha lo e Vend ely
3
{, Mu ay Coles
4
, Thomas Scheibel
3
& Ho s Kessle
1,2
A huge a ie y o p o eins a e able o o m ib illa s uc u es
1
,
especially a high p o ein concen a ions. Hence, i is su p ising
ha spide silk p o eins can be s o ed in a soluble o m a high
concen a ions and ans o med in o ex emely s able ib es on
demand
2,3
. Silk p o eins a e eminiscen o amphiphilic block co-
polyme s con aining s e ches o polyalanine and glycine- ich
pola elemen s o ming a epe i i e co e lanked by highly con-
se ed non- epe i i e amino- e minal
4,5
and ca boxy- e minal
6
domains. The N- e minal domain comp ises a sec e ion signal,
bu u he unc ions emain unassigned. The C- e minal domain
was implica ed in he con ol o solubili y and ib e o ma ion
7
ini ia ed by changes in ionic composi ion
8,9
and mechanical s imuli
known o align he epe i i e sequence elemen s and p omo e
b-shee o ma ion
10–14
. Howe e , despi e ecen s uc u al da a
15
,
li le is known abou his ema kable beha iou in molecula de ail.
He e we p esen he solu ion s uc u e o he C- e minal domain o
a spide d agline silk p o ein and p o ide e idence ha he s uc-
u al s a e o his domain is essen ial o con olled swi ching
be ween he s o age and assembly o ms o silk p o eins. In addi-
ion, he C- e minal domain also has a ole in he alignmen o
seconda y s uc u al ea u es o med by he epe i i e elemen s
in he backbone o spide silk p o eins, which is known o be
impo an o he mechanical p ope ies o he ib e.
Silk p o eins a e amphiphilic (Fig. 1a) and he C- e minal non-
epe i i e (NR) domain o such p o eins p oduced by o b-wea ing
spide s is one o he mos conse ed egions (Fig. 1b). To de e -
mine he s uc u e o he C- e minal NR domain (NR3) o A aneus
diadema us ib oin 3 (ADF-3), we used high- esolu ion NMR wi h an
op imized p o ein cons uc (Fig. 1c and Supplemen a y Tables 1 and
2). The s uc u e is a new p o ein old composed o a pa allel-o ien ed
dime ic i e-helix bundle in which he longes helix (helix 4) is he
main dime iza ion si e (Fig. 1c, Supplemen a y Fig. 1). The single
cys eine esidue o each monome in ol ed in in e molecula disul-
phide o ma ion is loca ed a he N- e minal end o helix 4. The
dime iza ion in e ace consis s p edominan ly o hyd ophobic esi-
dues. Packing o hese esidues is acili a ed by a sligh igh -handed
wis be ween helices 4 in bo h monome s. Helix 1 o one monome
and helix 5 o he second monome in e ac in a clamp-like manne .
Two sal b idges (R43–D93 and R52–E101) a e loca ed wi hin each
monome , which ix helices 1 and 2 a one side o helix 4 (Fig. 1c).
These sal b idges use he only cha ged esidues o he en i e known
sequence o ADF-3 and a e loca ed in he mos conse ed pa s o he
NR domain (Fig. 1b).
Using mu agenesis expe imen s, ou da a show ha he cha ged
esidues a e essen ial o he s uc u al in eg i y o he NR domain, as
dele ion o he sal b idges esul s in signi ican ly educed he mal
s abili y o he en i e domain (Supplemen a y Fig. 2). O pa icula
no e is ha al hough he NR domain is ela i ely hyd ophobic in
compa ison o he epe i i e backbone o he p o ein (Fig. 1a), in
he olded s a e he hyd ophobic esidues a e bu ied and he sol en -
exposed su ace displays hyd ophilic amino acids such as glu amine
and se ine, assu ing i s hyd a ion (Supplemen a y Fig. 1b). A low pH
(pH 2, whe e he sal b idges a e dis up ed) NR3 shows ma kedly
inc eased hyd ophobici y and dec eased seconda y s uc u e con en
as p obed wi h 8-anilinonaph halene-1-sulphonic acid (ANS) luo -
escence, ci cula dich oism (CD) and NMR spec oscopy (Sup-
plemen a y Fig. 3a–d). In addi ion, a des abilized NR3 sal b idge
mu an (D93A) o an enginee ed ADF-3 analogue, (AQ)
12
NR3 con-
aining 12 epea s o he ‘A’ and ‘Q’ epe i i e sequence elemen s
16
(see Me hods), also shows p onounced ANS binding (Fig. 2b) and
mol en globule-like he mal un olding beha iou (a pa ially s uc-
u ed s a e ha shows highe binding a ini y o ANS han he na i e
s a e), which can be s abilized by he addi ion o sodium chlo ide
(Fig. 2c). This emphasizes he ole o a co ec ly olded NR domain
o silk p o ein s o age and he inhibi ion o undesi ed agg ega ion.
In i o he ansi ion om soluble p o ein o solid ib es in ol es a
combina ion o chemical and mechanical s imuli (such as ion
exchange, ex ac ion o wa e , acidi ica ion and elonga ional
low
3,13,17
). Hence, we we e in e es ed in de e mining he e ec o
such s imuli on spide silk-like p o eins, and used dime ic
(AQ)
12
NR3 and monome ic (AQ)
24
(an analogue o app oxima ely
he same molecula mass as he dime wi hou he NR ca boxy-
e minal domain). In he absence o shea o ces (as silk p o eins a e
s o ed in he lumen in i o) he ex en o p o ein agg ega ion in i o is
de e mined by he concen a ion o sal , and e en a ex emely high
concen a ions o sodium chlo ide (up o 500 mM) he le el o
agg ega ion is low (less han 15%), whe eas in he p esence o equi al-
en concen a ions o sodium phospha e he le el o agg ega ion is
ma kedly highe (up o 100%) owing o he mo e kosmo opic na u e
o he phospha e anion (Fig. 2a). Such a inding explains why he
p o eins a e s o ed inside he lumen in he p esence o he ela i ely
chao opic sodium chlo ide (app oxima ely 100–150 mM)
9
,and
emphasizes he equi emen o ion exchange wi hin he spinning duc .
Highe sup amolecula assemblies a e equi ed o achie e e icien
p o ein s o age
8
and we ha e p e iously epo ed ou p o eins o be
he mo esponsi e, displaying ully e e sible lowe c i ical solu ion
empe a u e (LCST, phase sepa a ion on inc easing he empe a u e)
beha iou owing o a sel -assembly p ocess
16
. This beha iou was dis-
played only o silk p o eins inco po a ing he NR domain. Using
di e en ial scanning calo ime y (DSC) we show he e ha he LCST
is dec eased in he p esence o highe concen a ions o sal and/o
p o ein (Fig. 2d, e), he eby s abilizing he p o eins du ing s o age.
1
Cen e o In eg a ed P o ein Science (CIPS
M
)and
2
Ins i u e o Ad anced S udy, Depa men Chemie a he Technische Uni e si a
¨ Mu¨nchen, 85747 Ga ching, Ge many.
3
Leh s uhl
u¨ Bioma e ialien, Fakul a
¨ u¨ Angewand e Na u wissenscha en, Uni e si a
¨ Bay eu h, 95440 Bay eu h, Ge many.
4
Depa men o P o ein E olu ion, Max-Planck-Ins i u e o
De elopmen al Biology, 72076 Tu¨bingen, Ge many. {P esen add ess: Uni e si e
´de Ce gy-Pon oise, 95302 Ce gy-Pon oise cedex, F ance.
Vol 465
|
13 May 2010
|
doi:10.1038/na u e08936
239
Macmillan Publishe s Limi ed. All igh s ese ed
©2010
We ha e also ound ha he NR domain has an impac on he ib e
o ma ion p ocess. On i a ion o chemical dena u an s (u ea o
guanidine hyd ochlo ide) in o solu ions o
15
N-labelled NR3,
NMR chemical shi changes (indica ing s uc u al a ia ions o
binding) moni o ed wi h
15
N HSQC (he e onuclea single quan um
cohe ence) expe imen s could be obse ed mainly wi hin helix 1 and
a ound he sal b idges (Fig. 3a, Supplemen a y Fig. 4), he e o e his
egion seems o un old i s . Ti a ions wi h sodium chlo ide demon-
s a ed chemical shi changes in he same egion (whe e he wo sal
b idges a e loca ed, Fig. 3a), which also shows he highes hyd opho-
bici y in he p o ein as moni o ed wi h chemical shi changes upon
he addi ion o ANS (Fig. 3a and Supplemen a y Fig. 4). In e es ingly,
a highe p o ein concen a ions he p o ein shows a g ea e endency
o un old (Fig. 3b). Addi ionally, SYPRO O ange (an ANS-like luo -
escen dye) binding expe imen s
18
demons a e ha he pa ially
olded s a e o NR3 is mo e hyd ophobic han he na i ely olded
o he un olded s a e (Fig. 3c). I is also no ewo hy ha he p esence
o sodium chlo ide (p esen du ing p o ein s o age) s abilizes he NR
domain agains he mal o chemical dena u a ion (Fig. 3b, c and
Supplemen a y Fig. 5a) and can e en compensa e o he loss in
s abili y du ing educ ion o he in e -molecula disulphide b idge
(Supplemen a y Fig. 5b).
P e ious heological s udies emphasize he ole o he NR domain
o shea -induced agg ega ion o ADF-3, whe e solu ions o p o eins
wi h he NR domain exhibi signi ican iscosi y changes unde shea ,
−2
−1
0
1
2
−3
−2
−1
0
1
2
3
−2
−1
0
1
2
3
Bombyx mo i
Hyd ophobici y scale
E. aus alis
eADF3
Amino acid sequence
NR
NR Repe i i e sequence elemen s
NC
ab
90°
c
H1
H2
H3
H4
H5
N
H1′
H2′
H3′
H4′
H5′
S–S
b idge
C
H4′H4
N
C‘
C′
-------GPQ SSSAPVASAA ASRLSSPAAS SRVSSAVSSL
GAGQGGYGGV GSGASAASAA ASRLSSPQAS SRVSSAVSNL
--SSASASAA ASAASTVANS VSRLSSPSAV SRVSSAVSSL
ADF-3
N.c. MaSp1
E.a. MaSp1
ADF-1 --------VA GASAGSYGGA VNRLSSAGAA SRVSSNVAAI
VSSGPTNQAA LSNTISSVVS QVSASNPGLS GCDVLVQALL
VASGPTNSAA LSSTISNVVS QIGASNPGLS GCDVLIQALL
VSNGQVNMAA LPNIISNISS SVSASAPGAS GCEVIVQALL
ASAG---AAA LPNVISNIYS GVLSS--GVS SSEALIQALL
EVVSALVSIL GSSSIGQINY GASAQYTQMV GQSVAQALAG
EVVSALIHIL GSSSIGQVNY GSAGQATQIV GQSVYQALG-
EVITALVQIV SSSSVGYINP SAVNQITNVV ANAMAQVMG-
EVISALIHVL GSASIGNVSS VGVNSALNAV QNAVGAYAG-
H1 H2
H2 H3 H4
H4 H5
ADF-3
N.c. MaSp1
E.a. MaSp1
ADF-1
ADF-3
N.c. MaSp1
E.a. MaSp1
ADF-1
N′
Sal
b idges
Sal
b idges
D93
R43
E101
R52
S–S
b idge
Sal
b idges
Q97
Figu e 1
|
Sequence analysis and s uc u e o he
non- epe i i e (NR) domain o ADF-3.
a, Hyd ophobici y index o a ious silk p o eins.
b, Sequence alignmen o he C- e minal NR
domains o he majo ampulla e silk p o eins
(MaSp) o A aneus diadema us,Nephila cla ipes
and Eup os henops aus alis, and mino
ampulla e silk ib oin 1 (ADF-1) o A aneus
diadema us ( op o bo om). G ey ba s indica e
he deg ee o conse a ion be ween hese
sequences. The conse ed cha ged esidues a e
colou ed. c, O e lay o he 20 bes -ene gy
s uc u es o he C- e minal NR domain o ADF-
3 ha ing a oo mean squa e de ia ion ( .m.s.d.)
o 0.18 A
˚.
100 200 30050 150 250 500
100 200 30050 150 250 500
Agg ega ion (%)
Sal concen a ion (mM)
0
20
40
60
80
100
450 500 550 600
2 × 105
6 × 105
1 × 106
Fluo escence (a.u.)
(AQ)12NR3 D93A
(AQ)12NR3 WT
(AQ)24
Wa eleng h (nm)
b
10 15 20 25 30 35 40
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0 165 μM:
23.4 °C 50 µM:
25.4 °C
10 µM:
29.7 °C
Tempe a u e (°C)
ΔC
p(mcal °C−1)
ΔCp(mcal °C−1)
10 15 20 25 30 35 40
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
No sal :
25.4 °C
100 mM:
25.0 °C
500 mM:
20.0 °C
Tempe a u e (°C)
ed
20 40 60 80 100
4 × 103
8 × 103
1 × 104
Fluo escence (a.u.)
Tempe a u e (°C)
(AQ)12NR3 D93A (AQ)12NR3 WT
(AQ)24
c
NaCl Na-phospha e
a
(AQ)12NR3
(AQ)12NR3 D93A
(AQ)24
(AQ)24NR3
Figu e 2
|
Assembly and agg ega ion p ope ies o ou spide silk-like
p o eins. a, Sal -induced p o ein agg ega ion. E o ba s indica e s anda d
de ia ion. b, Binding o hyd ophobic ANS by p o eins. a.u., a bi a y uni s;
WT, wild ype. c, The mal ansi ion expe imen s indica e mol en globule-
like beha iou o he D93A a ian ( ed symbols), whe eas he wild- ype
p o ein binds o he dye only du ing un olding (black symbols). A s uc u al
ansi ion o he D93A a ian can be induced by sodium chlo ide (open
symbols: in p esence o 300 mM sodium chlo ide). Wi hou he NR domain,
no ansi ion can be obse ed (g een symbols). d, The concen a ion
dependence o he LCST o (AQ)
24
NR3. e, The sodium chlo ide dependence
o he LCST o (AQ)
24
NR3.
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Vol 465
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13 May 2010
240
Macmillan Publishe s Limi ed. All igh s ese ed
©2010
whe eas solu ions o p o eins wi hou he NR domain exhibi no
iscosi y changes a a ious shea a es
14,19
. ANS binding also inc eases
unde shea , indica ing ha he NR domain pa ially un olds, he eby
exposing hyd ophobic su aces (Fig. 3d and Supplemen a y Fig. 6),
leading o oligome iza ion and ul ima ely b-shee - ich ib e o ma-
ion. In u he in i o p o ein agg ega ion assays unde shea s ess,
we ind ha agg ega ion is as ly inc eased in compa ison o co es-
ponding assays in he absence o shea , and ha he p o ein wi hou
he NR domain is much mo e p one o unspeci ic agg ega ion (Figs 3e
and 4). Exposu e o solu ions o p o eins wi hou he NR domain o
shea s ess esul ed in he o ma ion o ill-de ined b-shee - ich agg e-
ga es, ypically wi h dimensions o mic o- o millime e scale (Fig. 4a).
By con as , p o eins inco po a ing he NR domain o med ela i ely
well-de ined ib ous agg ega es, which op ical mic oscopy showed o
be composed o o de ed (aligned) bundles o long ib illa agg ega es,
implying ha he NR domain has a ole in s abilizing he p o ein
agains undesi able agg ega ion. Pola ized Fou ie ans o m in a ed
spec a o he ib ous agg ega es o med om ou p o ein wi hou he
NR domain ((AQ)
24
) show ha he b-shee s a e andomly aligned,
whe eas he b-shee s wi hin ib es o med om ou p o ein wi h he
co ec ly olded NR domain ( ha is, wild ype and no he D93A
mu an ) we e p edominan ly aligned wi h he long axis o he ib es
(in analogy o na u ally spun ib es) owing o a con olled assembly
p ocess (Fig. 4b, c).
To examine he in luence o he leng h o he epe i i e backbone
on he beha iou o he p o eins, we pe o med agg ega ion assays
wi h (AQ)
24
NR3, inding ha i was signi ican ly mo e p one o
agg ega ion han he equi alen (AQ)
12
NR3 analogue (Fig. 2a),
which leads us o specula e ha he a-helical N- e minal NR domain
4
(no included in ou ecombinan p o eins) migh also play an
impo an unc ion in p o ein s o age and ib e assembly, especially
in case o he na u al sys em, whe e he p o eins a e la ge .
Ou da a indica e ha he C- e minal NR domain has a ole in bo h
spide silk p o ein s o ageand ib e assembly (Fig. 4d).Du ing s o age
o spide silk p o eins, he NR domain s abilizes a solu ion-compe en
s a e o he silk p o ein ia he o ma ion o highe sup amolecula
assemblies, and he C- e minal NR domain also ac s as a igge o he
as , con olled and e icien sal ing-ou o he p o eins in combina-
ion wi h he co ec alignmen o he b-shee o ming epe i i e
sequence elemen s du ing shea -induced assembly. The hyd ophobic
su ace o he assembly s a e o he NR domain, in addi ion o he
disulphide b idge, p o ides ancho poin s o he co ec posi ioning
o he epe i i e sequence elemen s. This mechanism is eminiscen o
o he ib illa p o eins
20
like collagen
21
, whe e he highly conse ed
e minal p o-pep ides o m in e molecula disulphide b idges
22
and
egula e p o-collagen solubili y and la e al assembly
23
.
METHODS SUMMARY
P o eins samples we e bac e ially p oduced in Esche ichia coli and pu i ied as
desc ibed
24
o by Nickel-NTA and size-exclusion ch oma og aphy. Two- and
U ea NaCl ANS
S–S b idge S–S b idge S–S b idge
H1 H1 H1
H4 H4
H5′
H2
H3 H3
H2
H4
H5′
H5′
H2
H3
U ea (M)
5 μM
34 μM
60 μM
200 μM
01 23 4
60 μM NR3
+ NaCl
0.0
0.5
1.0
F ac ion
Un oldedFolded
U ea (M)
0
5
10
15
20
SYPRO O ange
luo escence (a.u.)
No NaCl
+ NaCl
01 234
Un oldedFolded
a
bc
NR3
(AQ)12NR3
(AQ)24
0
20
40
60
80
100
−+−+−+Shea
50 mM NaCl
500 mM NaCl
Agg ega ion (%)
Wa eleng h (nm)
Fluo escence (a.u.)
de
2
×
10
5
1
×
10
5
0
440 480 520 560 600
ANS binding
Time
Figu e 3
|
S abili y and olding o spide d agline silk cons uc s. a, NMR
chemical shi pe u ba ion expe imen s wi h u ea, sodium chlo ide and
ANS indica e ha he s uc u al elemen s a ound he sal b idges ep esen
he mos labile and hyd ophobic egion wi hin he p o ein. b, U ea-induced
un olding o NR3 as de e mined by CD spec oscopy. c, Binding o
hyd ophobic SYPRO o ange o NR3 du ing u ea-induced un olding.
d, Shea -induced ANS binding o NR3. e, Agg ega ion o ou spide silk-like
p o eins wi h and wi hou shea s ess. Shea s ess leads o inc eased
agg ega ion and is he mos likely igge o he assembly p ocess in na u e.
E o ba s ep esen s anda d de ia ion.
100 µm 100 µm
a
b
1,0001,2001,4001,6001,800
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
Wa enumbe (cm–1)
Abso p ion (a.u.)
1,0001,2001,4001,6001,800
0.00
0.04
0.08
0.12
Abso p ion (a.u.)
Wa enumbe (cm–1)
(AQ)12NR3
(AQ)12NR3
(AQ)12NR3(AQ)12NR3
(AQ)24
cβ-shee con en (%)
Sal -induced agg ega ion Shea -induced agg ega ion
pH Wild ype D93A Wild ype D93A
NR
NR
Shea s ess
NR
NR
(h
(h
yd o
yd o
philic
philic
su ace)
su ace)
Repe i i e sequence
elemen s
Hyd ophobic
elemen
Hyd ophilic
elemen
Highe oligome ic assemblies
( u bid solu ions)
Re e sible
Hyd ophilic
su ace
NR
Fib e
d
(AQ)24 (AQ)24
234 ± 3 35 ± 3 31/33/32 ± 2 30/33/30 ± 238 ± 1 35/33/36 ± 2
632 ± 4 32 ± 1 36/33/30 ± 2 28/29/29 ± 141 ± 2 30/32/31 ± 2
726 ± 3 35 ± 2 28/28/25 ± 1 35/34/35 ± 132 ± 6 32/32/32 ± 1
Pa ial un olding o he NR domain
exposes a hyd ophobic su ace
which encou ages agg ega ion and
allows alignmen o he epe i i e
elemen s unde shea
Figu e 4
|
Fib e assembly mechanism o d agline silk p o eins. a, A well-
de ined ib e (d y s a e) o (AQ)
12
NR3 and ill-de ined ib ous agg ega e o
(AQ)
24
o med unde shea . b, In a ed abso p ion spec a o (AQ)
12
NR3
and (AQ)
24
ib es eco ded a 0uand 90u ela i e o he long axis o he
ib ous agg ega es (black s ed line). c, Es ima ed b-shee con en o he
agg ega es. The alues o b-shee con en o he agg ega es o med unde
shea we e eco ded a 0u,45uand 90u ela i e o he long axis o he ib ous
agg ega es. d, The silk p o eins a e s o ed as highe oligome ic assemblies.
Exposu e o hese assemblies o shea and sal ing ou leads o pa ial
un olding o NR3 and con olled ib e assembly.
NATURE
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13 May 2010 LETTERS
241
Macmillan Publishe s Limi ed. All igh s ese ed
©2010
h ee-dimensional NMR expe imen s we e pe o med wi h
13
Cand
15
N iso opi-
cally en iched p o ein samples on NMR spec ome e s (B uke Biospin) ope a ing
a 600, 750 and 900MHz p o on equency, espec i ely. Ou o 140 esidues in
each monome , he NMR signals o 138 esidues could be assigned using a se o
con en ional expe imen s
25
. S uc u al es ain s we e gene a ed wi h nuclea
O e hause enhancemen (NOE) spec oscopy expe imen s
26
and high- esolu ion
s uc u es we e ob ained wi h he p og am Xplo -NIH
27
. P o ein olding s udies
we e pe o med wi h ci cula dich oism (CD) and luo escence spec oscopy and
p o ein ib es and agg ega es we e in es iga ed wi h op ical mic oscopy and
Fou ie ans o m in a ed (FTIR) spec oscopy.
Full Me hods and any associa ed e e ences a e a ailable in he online e sion o
he pape a www.na u e.com/na u e.
Recei ed 20 May 2009; accep ed 11 Feb ua y 2010.
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Supplemen a y In o ma ion is linked o he online e sion o he pape a
www.na u e.com/na u e.
Acknowledgemen s This pape is in memo iam o R. Rudolph who igge ed spide
silk esea ch in he lab o T.S. We wan o hank D. Hu¨mme ich and J. Exle o ini ial
wo k on he p ojec , S. Quedzuwei o sample p epa a ion in ea ly s ages o he
p ojec , M. Heim and M. Suh e o cloning wo k, and H. K ause o mass
spec ome y. This wo k was suppo ed by he Cen e o In eg a ed P o ein
Science Munich (CIPS
M
) ( o H.K. and T.S.) and he Deu sche
Fo schungsgemeinscha SCHE 603/4-3 ( o T.S.). F.H. was suppo ed by he
Eli ene zwe k Baye n, CompIn . J.G.H. was suppo ed by he Alexande on
Humbold Founda ion.
Au ho Con ibu ions F.H. designed esea ch, pe o med cloning wo k, pu i ied
p o eins, pe o med p o ein olding s udies, eco ded NMR expe imen s,
pe o med s uc u e calcula ions and w o e he manusc ip ; L.E. pe o med cloning
wo k, pu i ied p o eins and pe o med agg ega ion assays. J.G.H. pe o med
agg ega ion assays, cha ac e ized he ib es and w o e he manusc ip ; C.V.
pe o med cloning wo k and pu i ied p o eins; M.C. was in ol ed in s uc u e
calcula ion and p o ided so wa e ools o s uc u e calcula ion and analysis; T.S.
designed esea ch and w o e he manusc ip ; H.K. designed esea ch and w o e he
manusc ip . All au ho s discussed he esul s and commen ed on he manusc ip .
Au ho In o ma ion The esonance assignmen ob ained was deposi ed a he
BMRB da a bank unde accession code 16249 and he a omic coo dina es o he
bes 20 s uc u es plus a egula ized a e age s uc u e ha e been deposi ed a he
P o ein Da a Bank unde accession code 2khm. Rep in s and pe missions
in o ma ion is a ailable a www.na u e.com/ ep in s. The au ho s decla e no
compe ing inancial in e es s. Co espondence and eques s o ma e ials should
be add essed o H.K. ([email p o ec ed]) o T.S.
( homas.scheibel@uni-bay eu h.de).
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Vol 465
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13 May 2010
242
Macmillan Publishe s Limi ed. All igh s ese ed
©2010
METHODS
Cloning, p o ein p oduc ion and pu i ica ion. The ini ial cons uc used o
NMR esonance assignmen (NR3-T7) was p oduced and pu i ied as desc ibed
p e iously
24
. The gene o a sho e cons uc (NR3D19) used o NOESY expe i-
men s was inse ed in o a pET28a exp ession sys em (Me ck Biosciences)encoding
an N- e minal His
6
- ag and exp essed in E.coliBL21 (DE3) (Agilen Technologies)
a 20 uC o 16–20 h. Pu i ica ion was achie ed by passage o e a Ni-NTA column
(GE heal hca e) and a Supe dex75 column. Be ween bo h columns he hexahis i-
dine ag was emo ed by diges ion wi h h ombin. Iso opically (
13
C,
15
N) en iched
p o ein samples we e p oduced by g owing bac e iain M9 medium supplemen ed
wi h 1 g l
2115
NH
4
Cl and 2 g l
2113
C glucose (Eu iso ope). Fo NMR measu e-
men s, he p o eins we e concen a ed up o 1 mM in 10mM sodium phospha e
pH 6.0. Addi ion o 1% ( / ) i luo oe hanol-d
3
(Eu iso ope) was used o sample
s abiliza ion. The gene a ion o a mixed
13
C,
15
N–
12
C,
14
N dime ic sample was
achie ed by mixing equal amoun s o labelled and unlabelled His
6
- agged p o ein
samples and a subsequen addi ion o guanidine hyd ochlo ide o a inal concen-
a ion o 4 M and 50 mM DTT o achie e un olding and educ ion o he in e -
molecula disulphide b idge. Fo e olding, he mix u e was dialyzed agains
50 mM T is/HCl pH 8.0 esul ing in an almos quan i a i e e olding yield. By his
p ocedu e, he monome s a e allowed o exchange esul ing in a 1:2:1 popula ion
o he homo-unlabelled, he he e o-labelled and he homo-
13
C,
15
N-labelled spe-
cies. Genes encoding p o eins con aining he epe i i e elemen s (AQ)
12
and
(AQ)
24
(A, hyd ophobic polyalanine- ich mo i : GPYGPGASAAAAAAGGYGPG
SGQQ; Q, hyd ophilic glu amine- and glycine- ich mo i : GPGQQGPGQQGP
GQQGPGQQ) we e cloned in o a pET29 exp ession ec o (Me ck Biosciences)
encoding an N- e minal T7- ag and we e exp essed in E. coli s ain BLR (DE3)
(Agilen Technologies) a 25 uC o 3 h. Pu i ica ion was ca ied ou as desc ibed
p e iously
24
. Si e-di ec ed mu agenesis expe imen s wi h he gene o NR3D19we e
done using he QuikChange mu agenesis ki (Agilen Technologies).
Ci cula dich oism (CD) spec oscopy. CD spec a and s abili y measu emen s
we e ca ied ou on a Jasco J-715 spec opola ime e (Jasco). Fo spec a and
he mal ansi ions, a p o ein concen a ion o 10 mM was used, and he mal
un olding was moni o ed by he CD signal a 222 nm in a 1 mm pa h leng h
cu e e using a hea ing a e o 60 K h
21
in 10 mM sodium phospha e pH 6.0. Fo
chemical un olding expe imen s, samples o 5, 34, 110, 200 and 230 mM concen-
a ion we e incuba ed wi h inc easing amoun s o u ea o e nigh a 4 uC, and
he CD signal a 222 nm was eco ded wi h a pa h leng h o 0.1 o 1 cm, espec-
i ely, a 20 uC. A bandwid h o 5 nm and a esponse o 2 s we e used. Fi ing o
he he mally and u ea-induced un olding p o iles was done as epo ed p e i-
ously
28
assuming a wo-s a e olding mechanism.
NMR spec oscopy and s uc u e calcula ion. Nuclea magne ic esonance
(NMR) spec oscopic measu emen s we e conduc ed a 298K on B uke
DMX600, DMX750 and A ance900 spec ome e s (B uke Biospin). Backbone
esonance assignmen was achie ed by a se o s anda d iple esonance expe i-
men s
25
. Side-chain assignmen was ca ied ou using a combina ion o CCH-
COSY (co ela ion spec oscopy ia he nuclei C,C,H
29
) and HCH-TOCSY ,( o al
co ela ion spec oscopy
30
) on double-labelled samples. S e eospeci ic assign-
men o p ochi al H
Cb
me hylene and aline me hyl g oups and he esul ing
o ame assignmen we e made using
3
J
NHb
couplings obse ed in he HNHB
expe imen and pa e ns o NOESY connec i i ies. Dis ance da a we e de i ed
om a se o h ee-dimensional NOESY expe imen s including
15
N-HSQC-
NOESY, NNH-NOESY on a
15
N-labelled sample and
13
C-HSQC-NOESY and
he e onuclea edi ed 3D-CCH NOESY and 3D-CNH NOESY expe imen s
26
.
Fo ob aining in e -subuni NOE dis ance es ain s, we used a
14
N,
12
C-
il e ed/
13
C edi ed wo-dimensional-NOESY expe imen on a mixed
13
C,
15
N–
12
C,
14
N labelled sample. NOESY c oss-peaks in he h ee-dimensional spec-
a we e con e ed in o dis ance anges a e escaling acco ding o he co es-
ponding HSQC in ensi ies. C oss-peaks we e di ided in o he ollowing ou
classes: s ong, medium, weak and e y weak, which esul ed in es ain s on
uppe dis ance o 2.7, 3.2, 4.0 and 5.0 A
˚, espec i ely. Lowe dis ance es ain s
we e also included o e y weak and absen sequen ial H
N
–H
N
c oss-peaks using
a minimum dis ance o 3.2 A
˚and o medium in ensi y o weake sequen ial and
in a esidual H
N
-H
a
c oss-peaks using a minimum dis ance o 2.7A
˚. Allowance
o he use o pseudo a oms (using
26
a e aging) we e added o me hyl g oups
(0.8 A
˚ o one me hyl and 1.5 A
˚ o wo me hyls) and nons e eospeci ically-
assigned me hylene g oups (0.7 A
˚). Dihed al angle es ain s we e de i ed o
backbone wand yangles based on C
a
,C
b
,C9and H
a
chemical shi s using he
p og am TALOS
31
. Res ain s we e applied o p edic ions consis en wi h he
inpu chemical shi s,
3
J
HNHa
coupling cons an s measu ed om an HNHA
expe imen and he obse ed NOE pa e n wi hin sequen ial esidues. Accep ed
p edic ions we e applied using he ole ance calcula ed by he p og am 65u. The
3
J
HNHa
couplings we e also applied as di ec coupling cons an es ain s on he
backbone wangles. Hyd ogen bond es ain s we e applied o 73 esidues in
seconda y s uc u al elemen s wi h low hyd ogen exchange a es, as measu ed
wi h MEXICO expe imen s
32,33
and whe e dono and accep o we e consis en ly
iden i ied in p elimina y calcula ions. The es ain s we e applied wi h he
inclusion o pseudo co alen bonds as desc ibed p e iously
34
. S uc u es we e
calcula ed wi h XPlo -NIH
27
using s anda d p o ocols. Expe imen al es ain s
we e applied o only one monome , wi h non-c ys allog aphic symme y
es ain s o e he backbone o o de ed esidues (S34–L138) used o assu e
he symme y o he dime . Se s o 50 s uc u es we e calcula ed and a inal se
o 20 s uc u es chosen on he basis o lowes es ain s iola ions. An a e age
s uc u e was calcula ed and egula ized o gi e a s uc u e ep esen a i e o
he ensemble. The quali y o he egula ized a e age s uc u e was assessed wi h
he p og am PROCHECK-NMR
35
. Ti a ion expe imen s we e pe o med
wi h 200–500 mM NR3 in 10mM sodium phospha e pH 6.0 a 293 K using s and-
a d
15
N-HSQC expe imen s. Chemical shi de ia ions we e calcula ed as he
mean o
1
H and
15
N chemical shi di e ences using ollowing equa ion:
Dda ~ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi
DdH2z(DdN=5)2
q
=2.
Fluo escence spec oscopy. Fluo escence spec a o 10mM ANS and SYPRO
O ange in 10 mM sodium phospha e pH 6.0 we e eco ded wi h a Fluo omax-
4 spec o luo ome e (Ho iba Jobin Y on) using exci a ion a 350 nm (5 nm
bandwid h) and by collec ing emission spec a om 420 o 600 nm wi h a band-
wid h o 5 nm. Wi h SYPRO O ange, exci a ion was se o 485 nm and emission
was eco ded om 520 o 700 nm. The mo luo expe imen s
36
we e pe o med
wi h a eal- ime PCR machine (Agilen Technologies) by de ec ion o ANS
luo escence (10 mM ANS was used). Hea ing a e was 30 K h
21
, p o ein concen-
a ion was 50 mM and sample olume was 50 ml in a 96-well pla e. Fi e indi-
idual measu emen s we e done o each p o ein sample and sol en condi ion.
Di e en ial scanning calo ime y (DSC). DSC expe imen s we e pe o med
using a VP-DSC Mic o-Calo ime e (Mic oCal). S anda d measu emen s we e
pe o med a a p o ein concen a ion o 50mM in 10 mM T is/HCl, pH 8.0, wi h
a hea ing a e o 20 K h
21
. E alua ion o he LCST beha iou was done using he
ORIGIN so wa e (Mic oCal).
Ro a ion-induced agg ega ion. Be o e he expe imen he p o eins we e dis-
sol ed in guanidine hiocyana e solu ion (6 M) and hen dialyzed agains 10 mM
T is/HCl, pH 8.0. Then he p o eins we e dilu ed in o bu e con aining 10 mM
T is/HCl, pH 8 wi h 50 mM NaCl. Final p o ein concen a ions we e adjus ed o
40 mM o NR3, 14 mMo AQ
12
NR3 and 8 mMo AQ
24
. The samples we e incu-
ba ed o 12 h a 25 uC o a ing wi h 25 .p.m. A e o a ion, he clea ly isible
agg ega es we e ans e ed on o glass slides o op ical mic oscopy (DMI3000B,
Leica). The samples we e hen cen i uged a 125,000g o emo e non- isible
agg ega es, and he amoun o emaining soluble p o ein in he supe na an was
de e mined using an ul a iole spec ome e (NanoD op ND1000, The mo
Fische ).
Fou ie ans o m in a ed (FTIR) spec oscopic s udies. FTIR spec a o
ib es we e eco ded on a liquid-ni ogen-cooled B uke Tenso 27 FTIR
spec ome e , i ed wi h a liquid-ni ogen-cooled B uke Hype ion mic oscope
wi h IR pola ize s supplied by Op ome ics Co po a ion. Spec oscopy was
pe o med on ib es o med du ing he p e iously desc ibed agg ega ion assay
ha we e washed wi h wa e o emo e sal s, ai d ied and placed on highly
polished op ical g ade calcium luo ide disks (C ys al GmbH). Spec a o all
agg ega es we e eco ded in abso bance mode a 21 uC, wi h a 4 cm
21
esolu ion
and 600 scans (co ec ed o backg ound and a mosphe e using OPUS so wa e),
and pola ized FTIR spec a o agg ega es o mic ome e scale (and la ge ) we e
eco ded a h ee di e en o ien a ions (0u,45uand 90u ela i e o he long axis o
he ib ous agg ega es) o de e mine i any o he seconda y s uc u al elemen s
we e aligned wi h he ib es.
28. P i alo , P. L. S abili y o p o eins: small globula p o eins. Ad . P o ein Chem. 33,
167
–
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H-
13
C-
1
H co ela ion
spec oscopy o a
13
C-labeled p o ein using cons an - ime e olu ion. J. Biomol.
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–
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30. Kay, L. E., Iku a, M. & Bax, A. P o on
–
p o on co ela ion ia ca bon
–
ca bon
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doi:10.1038/na u e08936
Macmillan Publishe s Limi ed. All igh s ese ed
©2010
6
www.na u e.com/na u e
doi: 10.1038/na u e08936 SUPPLEMENTARY INFORMATION
7
Supplemen a y Figu e 6
Supplemen a y Figu e 6: S uc u al changes wi hin he NR domain unde shea s ess a e independen o
he p esence o sodium chlo ide.
200 µM NR3 in 10 mM Na-phospha e pH6.0 was shaken a 900 pm a 37°C wi h 250mM ( ed symbols) o
wi hou (g ey symbols) NaCl o he indica ed ime. Fo each ime poin , 10µl o he NR3 solu ion was mixed
wi h 490 µl bu e supplemen ed wi h 10 µM ANS o luo escence measu emen s o 290 µl bu e o CD
measu emen s. ANS (an en i onmen sensi i e dye) shows high luo escence in ensi y in hyd ophobic
en i onmen (NR domain un olded) accompanied by a blue-shi o he luo escence emission maximum.
7
www.na u e.com/na u e
SUPPLEMENTARY INFORMATION
doi: 10.1038/na u e08936
8
Supplemen a y Tables
Supplemen a y Table 1: Sequences o he NR3 cons uc s used o NMR s uc u e
de e mina ion.
NR3 – T7-Tag#
10 20 30 40 50 60
MASMTGGQQM GRGSMGAASA AVSVGGYGPQ SSSAPVASAA ASRLSSPAAS SRVSSAVSSL
70 80 90 100 110 120
VSSGPTNQAA LSNTISSVVS QVSASNPGLS GCDVLVQALL EVVSALVSIL GSSSIGQINY
130 140
GASAQYTQMV GQSVAQALAG
NR3Δ19#
10 20 30 40 50 60
GSHMAAVSVG GYGPQSSSAP VASAAASRLS SPAASSRVSS AVSSLVSSGP TNQAALSNTI
70 80 90 100 110 120
SSVVSQVSAS NPGLSGCDVL VQALLEVVSA LVSILGSSSI GQINYGASAQ YTQMVGQSVA
QALAG
# ed le e s indica e emaining pep ide ags o emaining amino acids a e ag emo al, espec i ely.
Numbe ing o esidues in he s uc u e is acco ding o he i s cons uc (NR3-T7-Tag).
8
www.na u e.com/na u e
doi: 10.1038/na u e08936 SUPPLEMENTARY INFORMATION
9
Supplemen a y Table 2: S uc u al s a is ics o he 20 lowes ene gy s uc u es o he NR3
dime .
Rmsd om dis ance es ain s (Å)a
SAb
<SA>
all (1313)
0.0191±0.0009
0.019
in a esidual (337)
0.0114±0.0005
0.011
sequen ial (398)
0.021±0.001
0.021
medium ange (162)
0.015±0.001
0.015
long ange (67)
0.026±0.003
0.023
in e monome (112)
0.020±0.002
0.018
Rmsd om dihed al es ain s (174)
0.071±0.005
0.078
Rmsd om J-coupling es ain s (Hz)(58)
0.45±0.01
0.47
H-bonds es ain s (Å /deg) (73)c
2.19±0.12 / 19.0±6.9
2.13±0.10 / 16.8±6.5
De ia ions om ideal co alen geome y
Bonds (Å 10-3)
3.637±0.023
3.742
Angles (Å)
0.479±0.003
0.487
Imp ope s (Å)
1.422±0.046
1.541
Ramachand an Map egions (%)d
( esidues 34-140)
96.8 / 3.2 / 0.0 / 0.0
96.8 / 3.2 / 0.0 / 0.0
SA e sus <SA>
SA e sus <SA>
A omic Rmsd (Å)e
backbone
all
backbone
all
O de ed esidues (34-138)
0.18±0.04Å
0.37±0.05Å
0.30±0.06Å
0.51±0.06Å
a numbe s in b acke s indica e he numbe o es ain s pe monome
b s uc u es a e labeled as ollows: SA, se o 20 inal simula ed annealing s uc u es; <SA>, he mean s uc u e calcula ed by a e aging he
coo dina es o SA s uc u es a e i ing o e seconda y s uc u e elemen s; <SA> , he s uc u e ob ained by egula ising he mean
s uc u e unde expe imen al es ain s.
c H bonds we e es ained by ea ing hem as pseudoco alen bonds (see SI me hods). De ia ions a e exp essed as he a e age
dis ance/a e age de ia ion om linea i y o es ained H bonds.
d De e mined using he p og am PROCHECK-NMR. Pe cen ages a e o esidues in allowed/addi ionally allowed/gene ously
allowed/disallowed egions o he Ramachand an map. Values a e calcula ed o he egula ized s uc u e.
e Based on hea y a oms supe imposi ions.
Supplemen a y Re e ences
1 P i alo , P. L. S abili y o p o eins: small globula p o eins. Ad P o ein Chem 33,
167-241 (1979).
Teila bei en
[73]
Teila bei II
Eisold , L., Ha dy, J.G., Heim, M., Scheibel, T. (2010) The ole o sal and shea on he
s o age and assembly o spide silk p o eins. J. S uc . Biol. 170, pp. 413-419
The ole o sal and shea on he s o age and assembly o spide silk p o eins
Lukas Eisold , John G. Ha dy, Ma kus Heim, Thomas R. Scheibel
*
Fakul ä ü Angewand e Na u wissenscha en, Uni e si ä Bay eu h, Uni e si ä ss . 30, 95440 Bay eu h, Ge many
a icle in o
A icle his o y:
Recei ed 12 No embe 2009
Recei ed in e ised o m 22 Decembe 2009
Accep ed 27 Decembe 2009
A ailable online 4 Janua y 2010
Keywo ds:
Spide silk
P o ein assembly
Sal
Shea
abs ac
Majo ampulla e silk fibe s o o b web-wea ing spide s ha e imp essi e mechanical p ope ies due o he
ac ha he unde lying p o eins pa ially old in o helical/amo phous s uc u es, yielding ela i ely elas-
ic ma ices ha a e oughened by aniso opic nanopa icula e inclusions ( o med om s acks o b-shee s
o he same p o eins). In i o he ansi ion om soluble p o ein o solid fibe s in ol es a combina ion o
chemical and mechanical s imuli (such as ion exchange, ex ac ion o wa e and shea o ces). He e we
elucida e he e ec s o such s imuli on he in i o agg ega ion o enginee ed and ecombinan ly p o-
duced majo ampulla e silk-like p o eins ( ocusing on s uc u e– unc ion ela ionships wi h espec o
hei p ima y s uc u es), and discuss hei ele ance o he s o age and assembly o spide silk p o eins
in i o.
Ó2009 Else ie Inc. All igh s ese ed.
1. In oduc ion
O b web-wea ing spide s p oduce a numbe o ask-specific silk
p o ein-based fibe s. One o hese fibe s is assembled om p o-
eins p oduced by he majo ampulla e (MA) silk gland. MA silk fi-
be s a e used bo h in he cons uc ion o he web as he ame
upon which o a ach he cap u e spi al fibe s (flagelli o m silk fi-
be s coa ed wi h agg ega e silk) and as a li eline o escape om
p eda o s (Ap hisia and Voll a h, 1994; Lin e al., 1995). MA silk
fibe s o o b web-wea ing spide s ha e imp essi e mechanical
p ope ies due o he ac ha he unde lying p o eins pa ially
old in o helical/amo phous s uc u es yielding ela i ely elas ic
ma ices ha a e oughened by aniso opic nanopa icula e inclu-
sions ( o med om s acks o b-shee s o he same p o eins) (Gos-
line e al., 1999). The p ima y s uc u es o MA p o eins a e
eminiscen o amphiphilic mul iblock copolyme s (Exle e al.,
2007; Geisle e al., 2008; Zbilu e al., 2005, 2006), in which he
epe i i e sequence elemen s ( ypically composed o mul iple e-
pea s o A
n
, (GA)
n
, (GGX)
n
, and (GPGXX)
n
) a e flanked by highly
conse ed non- epe i i e (NR) amino- and ca boxy- e minal do-
mains (Bini e al., 2004; Foo e al., 2006; Hedhamma e al.,
2008; Lewis, 2006; Rising e al., 2006).
In common wi h o he silk p o eins, he MA p o eins o A aneus
diadema us spide s (ADF-3 and ADF-4) a e s o ed a e y high con-
cen a ions (>30 w .%) wi hou he onse o undesi able agg ega-
ion wi hin he lumen o he spide . Howe e , ou in i o s udies
o he epe i i e sequence elemen s o ecombinan ly p oduced
p o eins based upon he consensus sequences o he MA p o eins
o A aneus diadema us spide s (Gue e e e al., 1996) wi hou he
NR e minal domains clea ly demons a e ha hese p o eins a e
no soluble a such high concen a ions as ound in i o (Huemme-
ich e al., 2004a, 2004b). Ou findings sugges ha he NR e minal
domains con ol bo h he s o age o he p o eins (by inc easing
hei solubili y and/o de e ing undesi able agg ega ion e en s)
and fibe p oduc ion (allowing/ acili a ing con olled p o ein
assembly in o fibe s upon demand) (Hagn e al., in p ess).
In i o Raman spec omic oscopy (Le e e e al., 2008, 2007b)
and in i o
13
C NMR (Hiji ida e al., 1996) s udies o he spinning
dope indica e ha he epe i i e sequence elemen s adop highly
hyd a ed andom coil and 3
1
-helix (polyp oline II-like) seconda y
s uc u es which can be easily ans o med in o b-shee s. We
(Huemme ich e al., 2004b) and subsequen ly o he s (Huang
e al., 2006; I ah e al., 2007, 2006; Lin e al., 2009; S a k e al.,
2007) ha e shown he C- e minal NR domains o adop a p edom-
inan ly
a
-helical con o ma ion in i o. These domains ha e been
pos ula ed o o m he ou e laye o d ople -like s uc u es ob-
se ed in he spinning dope in i o (Jin and Kaplan, 2003; Lin
e al., 2009; Voll a h and Knigh , 1999). We ha e also shown ha
he C- e minal NR domain is a p e equisi e o ce ain sup amolec-
ula sel -assembly p ocesses (mani es ed in he o m o ully
e e sible lowe c i ical solubilisa ion empe a u e beha io ) o
ou ecombinan ly p oduced p o eins (Exle e al., 2007).
In i o he ansi ion om soluble p o ein o solid fibe s in-
ol es a combina ion o chemical and mechanical s imuli (such
as ion exchange, acidifica ion, ex ac ion o wa e and shea o ces
(Bini e al., 2004; Foo e al., 2006; Heim e al., 2009; Voll a h and
Knigh , 2001) ha ha e also been demons a ed o p omo e p o-
ein assembly in o fibe s in i o (Ha dy and Scheibel, 2009a; Ha dy
e al., 2008; Rammensee e al., 2008). We we e consequen ly
1047-8477/$ - see on ma e Ó2009 Else ie Inc. All igh s ese ed.
doi:10.1016/j.jsb.2009.12.027
*Co esponding au ho .
E-mail add ess: [email p o ec ed] (T.R. Scheibel).
Jou nal o S uc u al Biology 170 (2010) 413–419
Con en s lis s a ailable a ScienceDi ec
Jou nal o S uc u al Biology
jou nal homepage: www.else ie .com/loca e/yjsbi
in e es ed in de e mining he e ec o such s imuli upon he s abil-
i y o ou MA silk-like p o eins (Ha dy and Scheibel, 2009b).
A p o ein’s solubili y in aqueous solu ion is go e ned by many
ac o s, o which, one o he mos impo an is i s p ima y s uc-
u e, which also de e mines i ’s seconda y, e ia y and qua e na y
s uc u es (Le y e al., 2006; Rossmann and A gos, 1981; SenGup a
and Scheibel, 2007). The p esence o o he solu es (such as ions)
also has an e ec upon a p o ein’s solubili y in wa e , as hey in e -
e e wi h he highly o de ed laye o wa e (known as he hyd a-
ion laye ) on he p o ein’s su ace (Ge s ein and Cho hia, 1996;
Kim and C eme , 2001; Lesk e al., 1980; Zhang and C eme ,
2006). Low concen a ions o sal end o imp o e he solubili y
o p o eins (known as ‘sal ing in’), due o he o ma ion o ion- ich
hyd a ion laye s in he icini y o cha ged and pola amino acid
esidues (as desc ibed by he Debye–Hückel heo y), whe eas high
concen a ions o sal end o ha e he opposi e e ec , causing he
p o ein o p ecipi a e (known as ‘sal ing ou ’). The magni ude o
his e ec is dependen upon he pa icula ions and usually ol-
lows he Ho meis e se ies, in which ‘chao opic’ ions a o sal -
ing-in o p o eins and ‘kosmo opic’ ions a o sal ing-ou o
p o eins, and anions a e well-known o ha e a much g ea e e ec
han ca ions (Baldwin, 1996; Geisle e al., 2008; Gu au e al., 2004;
Ho inek e al., 2008; Peg am and Reco d, 2008; Pi ze e al., 2009;
Zhang and C eme , 2006; Zhang e al., 2005).
Knigh and Voll a h ha e in es iga ed he MA gland o Nephila
edulis spide s, finding ha he physiological concen a ion o so-
dium chlo ide in he spinning dope in he lumen o be o he o de
o 150 mM, and he o al concen a ion o sal s was obse ed o de-
c ease du ing he spinning p ocess. They also ound ha as he
dope flowed h ough he spinning duc , sodium ca ions we e e-
placed by po assium ca ions, ye o he me al ca ions (e.g. calcium,
coppe o magnesium) we e almos unde ec able in he lumen,
duc and he na u ally spun fibe s. Fu he mo e, hey obse ed
ha weakly chao opic chlo ide anions a e eplaced wi h s ongly
kosmo opic phospha e anions (significan ly inc eased concen a-
ions) and sul a e anions (small inc ease wi h a ela i ely high le el
o expe imen al e o ) du ing he passage o he spinning dope
along he spinning duc (Knigh and Voll a h, 2001). He e we
in es iga e he e ec s o sal s (sodium chlo ide and sodium phos-
pha e) and shea on he in i o agg ega ion o ou ecombinan ly
p oduced MA silk-like p o eins, and discuss hei ele ance o he
s o age and assembly o spide silk p o eins in i o.
In his s udy we use ecombinan ly p oduced silk p o eins
based on he consensus mo i s o he MA silk A anaeus diadema us
fib oin 3 (ADF3) om he ga den c oss spide . The epe i i e co e
domains o ou p o eins a e composed o wo di e en sequence
modules, deno ed A and Q, whe e module A is a hyd ophobic poly-
alanine- ich mo i , and module Q is a mo e hyd ophilic glu amine-
and glycine- ich mo i (see ma e ials and me hods). In his s udy
we use p o eins con aining 12 o 24 epea s o (AQ). The C- e mi-
nal NR3 domain is de i ed om ad 3 (gi|1263286, ob ained om J.
Gosline, Vancou e , BC) by using PCR. This domain is mainly
a
-
helical and dime ises ia disulfide bond o ma ion be ween he
single cys eine esidues con ained in wo indi idual NR3 domains
(Huemme ich e al., 2004b)(Fig. 1); he e o e p o eins bea ing he
NR3 domain a e dime ic unde non- educing condi ions.
2. Ma e ials and me hods
2.1. Cloning, p o ein exp ession and pu ifica ion
The p o eins (AQ)
12
NR3 (dime o 116 kDa), (AQ)
24
NR3 (dime
o 212 kDa) and (AQ)
24
(monome o 95 kDa), con aining he
epe i i e elemen s (A, hyd ophobic polyalanine- ich mo i :
GPYGPGASAAAAAAGGYGPGSGQQ; Q, hyd ophilic glu amine- and
glycine- ich mo i : GPGQQGPGQQGPGQQGPGQQ) we e cloned, ex-
p essed and pu ified as p e iously epo ed. A D93A mu an (num-
be ing acco ding o he esidues o he NR domain; see Fig. 1C) o
(AQ)
12
NR3 was ob ained acco ding o he QuikChange p o ocol
om S a agene (USA).
2.2. Sal -induced agg ega ion assay
Expe imen s we e ca ied ou in acco dance wi h ou p e i-
ously desc ibed p o ocol (Huemme ich e al., 2004b). P io o he
expe imen he p o eins we e dissol ed in guanidinium hiocya-
na e solu ion (6 M) and hen dialyzed agains 10 mM T is/HCl,
pH 8.0, 50 mM NaCl. The assay was s a ed by he addi ion o bu -
e ed (10 mM T is/HCl, pH 8.0) solu ions o NaCl and NaH
2
PO
4
(pH
8.0). P o ein concen a ions we e, espec i ely, 8.8
l
M, 5.3
l
M and
4.7
l
M o AQ
12
NR3 (w and D93A), AQ
24
and AQ
24
NR3. A e 1 h o
incuba ion a 25 °C he samples we e cen i uged a 17700 g o e-
mo e any isible agg ega es, and he amoun o soluble p o ein
emaining in he supe na an was de e mined using a UV spec-
ome e (NanoD op ND1000, The moFische , USA).
2.3. Shea -induced agg ega ion assay
P io o he expe imen he p o eins we e dissol ed in
guanidinium hiocyana e solu ion (6 M) and hen dialyzed agains
10 mM T is/HCl, pH 8.0. Then he p o eins we e dilu ed in o bu e
con aining 10 mM T is/HCl, pH 8.0 wi h 50 mM NaCl. Final p o ein
concen a ions we e adjus ed o 17.6
l
Mo AQ
12
NR3 and 10.6
l
M
o AQ
24
. The samples we e incuba ed o 16 h a 25 °C wi hou /
wi h o a ion a 25 pm (In ellimixe RM-2, NeoLab, Ge many).
A e o a ion, he clea ly isible agg ega es we e ans e ed on o
A
B
C
Fig. 1. Employed ecombinan ly p oduced p o eins based on he consensus
sequences o he majo ampulla e p o ein (ADF-3) o A aneus diadema us spide s.
(A) A schema ic ep esen a ion o he epe i i e sequence elemen s (A, hyd ophobic
polyalanine- ich mo i and Q, hyd ophilic glu amine- and glycine- ich mo i ) and
he C- e minal non- epe i i e domain (NR3). (B) A schema ic ep esen a ion o he
enginee ed and ecombinan ly p oduced majo ampulla e silk-like p o eins com-
posed o he elemen s shown abo e. Fo each p o ein he molecula weigh in kDa is
gi en in b acke s. No e ha p o eins bea ing he NR domain a e dime ic due o
in e domain disulfide bond o ma ion. (C) The p ima y sequence o he C- e minal
non- epe i i e domain (NR3) o he majo ampulla e p o ein (ADF-3) o A aneus
diadema us spide s, highligh ing he esidues in ol ed in sal b idges and he
cys eine esidue esponsible o in e p o ein dime iza ion. In he (AQ)
12
NR3 (D93A)
mu an he single aspa ic acid esidue is eplaced by an alanine esidue, inhibi ing
he o ma ion o one o he wo possible sal b idges.
414 L. Eisold e al. / Jou nal o S uc u al Biology 170 (2010) 413–419
glass slides o op ical mic oscopy (DMI3000B, Leica, Swi ze land).
The samples we e hen cen i uged a 125000 g o emo e non- is-
ible agg ega es, and he amoun o emaining soluble p o ein in he
supe na an was de e mined using a UV spec ome e (NanoD op
ND1000, The moFische , USA). The pe cen age o agg ega ed p o-
ein was calcula ed as desc ibed in sec ion 2.2.
2.4. Fou ie ans o m in a ed (FTIR) spec oscopic s udies
FTIR spec a o fibe s we e eco ded on a liquid ni ogen cooled
B uke Tenso 27 FTIR spec ome e , fi ed wi h a liquid ni ogen
cooled B uke Hype ion mic oscope wi h IR pola ize s supplied
by Op ome ics Co po a ion (Aye , MA, USA). Spec oscopy was
pe o med on fibe s o med du ing he p e iously desc ibed agg e-
ga ion assay ha we e washed wi h wa e o emo e sal s, ai
d ied and placed on highly polished op ical g ade calcium fluo ide
disks (C ys al GmbH, Be lin, Ge many). Spec a o all agg ega es
we e eco ded in abso bance mode a 21 °C, wi h a 4 cm
1
esolu-
ion and 60 scans (co ec ed o backg ound and a mosphe e using
OPUS so wa e), and pola ized FTIR spec a o agg ega es o
l
m
scale (and la ge ) we e eco ded a h ee di e en o ien a ions
(0°,45°and 90° ela i e o he long axis o he fib ous agg ega es)
o de e mine i any o he seconda y s uc u al elemen s we e
aligned wi h he fibe s.
2.5. T ansmission elec on mic oscopy
P io o he expe imen he p o eins we e dissol ed in guanid-
inium hiocyana e solu ion (6 M) and hen dialyzed agains 10 mM
T is/HCl, pH 8.0. A d ople (3
l
L) was placed on piolo o m-coa ed
coppe g ids and he excess liquid was emo ed by wicking using
a Kimwipe (Kimbe ly-Cla k Co po a ion, USA). The g id was hen
100
80
60
40
20
0
100 200 300 400 500
]%[ y ilibulos nie o p
100 200 300 400 500
100
80
60
40
20
0
]%[ y ilibulos nie o p
sal concen a ion [mM]
A
C
100 200 300 400 500
B
100 200 300 400 500
sal concen a ion [mM]
D
(AQ)24
(AQ)12NR3
no shea
no shea
shea
shea
solubili y [%]
0 20 40 60 80 100
E
Fig. 2. Sal -induced agg ega ion o enginee ed and ecombinan ly p oduced majo ampulla e silk-like p o eins a e incuba ion o 1 h a RT: induced by he p esence o
sodium chlo ide (g ey ci cles) and by he p esence o sodium phospha e (black ci cles), he concen a ion egime equi ed o agg ega e he p o eins is indica ed by s iped
boxes. (A) (AQ)
12
NR3 (wild ype). (B) (AQ)
12
NR3 (D93A). (C) (AQ)
24
NR3 (wild ype). (D) (AQ)
24
. (E) A compa ison o he deg ee o agg ega ion o ou spide silk p o eins wi h
and wi hou shea ; induced in he p esence o 50 mM sodium chlo ide (g ey ba s), o 500 mM sodium chlo ide (black ba s).
L. Eisold e al. / Jou nal o S uc u al Biology 170 (2010) 413–419 415
s ained wi h u anyl ace a e (1% in wa e , pH 4.5) and he excess li-
quid was emo ed by wicking using a Kimwipe, and allowed o d y
in a dus ee dessica o . The g ids we e iewed wi h a JEOL JEM-
2100 ansmission elec on mic oscope (Jeol, Eching, Ge many).
3. Resul s and discussion
3.1. The e ec o sal on p o ein agg ega ion
As no ed in he in oduc ion, MA spid oins a e s o ed in he lu-
men o he gland in he p esence o sodium and chlo ide ions, and
du ing fibe spinning hese ions a e exchanged o po assium and
phospha e ions (Knigh and Voll a h, 2001). He e we in es iga e
he e ec s o chlo ide and phospha e anions on he in i o agg e-
ga ion o ou ecombinan ly p oduced MA silk-like p o eins
(Fig. 1).
Ou solubili y/agg ega ion assays in he absence o shea o ces
(simila o he si ua ion o he silk p o eins in he lumen o he
gland) show ha he ex en o p o ein agg ega ion is de e mined
by he concen a ion o sal . Ou assays wi h sodium chlo ide
( ound in he lumen) indica e ha he le el o agg ega ion is low
(less han 20%) o all o he es ed enginee ed p o eins, e en a ex-
emely high sal concen a ions (up o 500 mM); whe eas in he
p esence o equi alen concen a ions o sodium phospha e ( ound
in he spinning duc ) he le el o agg ega ion o each p o ein is
100 µm
100 µm
20 µm
AB
DC
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
a.u.
wa enumbe [cm-1 mc[ ebmune aw] -1]
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
a.u.
3500 3000 1500 1000 3500 3000 1500 1000
1100 1050 1000 950 900 1100 1050 1000 950 900
20 µm
EF
HG
Fig. 3. Shea -induced agg ega ion o ou ecombinan ly p oduced majo ampulla e silk-like p o eins. (A) Op ical mic oscope image o agg ega es p oduced by shea -induced
agg ega ion o aqueous solu ions o (AQ)
24
. (B) Magnified image o he (AQ)
24
agg ega es shown in A) (whi e ame). (C) Op ical mic oscope image o well-defined fib ous
agg ega es p oduced by shea -induced agg ega ion o aqueous solu ions o (AQ)
12
NR3. (D) Magnified image o one pa o he (AQ)
12
NR3 fibe (black ame). (E) Pola ized FTIR
spec a om (AQ)
24
agg ega es om A/B eco ded a 0°(black ci cles) and 90°(g ey squa es) ela i e o he long fibe axis. (F) Pola ized FTIR spec a om AQ
12
NR3 fib ils
om C/D eco ded a 0°(black ci cles) and 90°(g ey squa es) ela i e o he long fibe axis. (G) Magnifica ion o he egion be ween 1100 and 900 cm
1
om he AQ
24
spec a
(E). The a ow indica es he cha ac e is ic polyalanine b-shee band a a ound 960 cm
1
(Papadopoulos e al., 2009). (H) Magnifica ion o he egion be ween 1100 and
900 cm
1
om he (AQ)
12
NR3 spec a (F). The a ow indica es he cha ac e is ic polyalanine b-shee band a a ound 960 cm
1
.
416 L. Eisold e al. / Jou nal o S uc u al Biology 170 (2010) 413–419
no ably highe (up o 100%) due o he mo e kosmo opic na u e o
he phospha e anion (Fig. 2). The e o e, weakly chao opic chlo ide
anions aid he long e m s o age o MA spid oins in he lumen
(sal ing-in) and a e subs i u ed o s ongly kosmo opic phos-
pha e anions (sal ing ou ) du ing he na u al fibe spinning
p ocess.
3.2. The e ec o shea on p o ein agg ega ion
Du ing he passage o he spinning dope om he lumen
h ough he spinning duc o he spigo ( he poin a which he fi-
be exi s he animal), he dope is exposed o shea o ces which a e
known o encou age agg ega ion in a a ie y o globula and fib il-
la p o eins (Beka d and Duns an, 2009; C omwell e al., 2006;
Hamil on-B own e al., 2008; Hill e al., 2006; Vezy e al., 2009;
Yamau a e al., 1982, 1985); we we e he e o e keen o find ou
i shea o ces ha e an e ec upon he agg ega ion o ou ecombi-
nan ly p oduced MA silk-like p o eins in i o.
Ou agg ega ion assays in he p esence o shea o ces (as he
silk p o eins a e exposed o in he duc du ing fibe spinning) show
ha he ex en o p o ein agg ega ion is d ama ically inc eased in
ela ion o co esponding assays in he absence o shea , in he
p esence o bo h low and high concen a ions o sal ; mo eo e ,
he agg ega es o med a e longe pe iods o exposu e o shea
we e fib ous wi h dimensions o
l
m o mm scale (Fig. 3).
Pa icula ly no ewo hy is ha wa e is abso bed om he dope
du ing i s passage along he spinning duc (Kojic e al., 2004; Tillin-
ghas e al., 1984), which inc eases he concen a ion o p o eins
and consequen ly inc eases he shea o ces be ween he p o eins
in he dope due o s eng hened hyd ophobic in e ac ions. This
leads us o sugges ha shea o ces a e likely o play a g ea e ole
han sal e ec s du ing he fibe spinning p ocess in i o (Casem
e al., 2002; Knigh and Voll a h, 2002; Pe ez-Riguei o e al.,
2001a, 2001b).
3.3. The ole o he C- e minal NR domain in fibe s o age and
assembly
I is widely accep ed ha highe o de sup amolecula assem-
blies a e equi ed o achie e silk p o ein s o age a high concen a-
ions wi hin he lumen, and as no ed in he in oduc ion, we ha e
p e iously shown he highly conse ed C- e minal NR domain o
be a p e equisi e o ce ain sup amolecula sel -assembly p o-
cesses (mani es ed in he o m o ully e e sible lowe c i ical sol-
ubilisa ion empe a u e beha io ) o ou ecombinan ly p oduced
p o eins (Exle e al., 2007). In e es ingly, ou ansmission elec-
on mic oscope s udies o eshly dialyzed solu ions o (AQ)
12
NR3
show e idence o esicle-like sup amolecula assemblies (o nm o
l
m scale), which is no he case o (AQ)
24
, a p o ein o simila
molecula weigh wi hou he C- e minal NR domain (Fig. 4),
which has also been obse ed by ligh mic oscopy in a p e ious
s udy (Rammensee e al., 2008).
Ou sal -induced agg ega ion s udies e ealed no significan
di e ences in he beha io o (AQ)
12
NR3 and (AQ)
24
in he p es-
ence o sodium chlo ide, whe eas in he p esence o sodium phos-
pha e (>200 mM) (AQ)
24
is much mo e p one o agg ega ion
(Fig. 2A–D) sugges ing ha he C- e minal NR domain dependen
sup amolecula assemblies a e s abilized o a ce ain deg ee
agains agg ega ion. Shea s ess had a e en p onounced e ec
on p o ein agg ega ion (Fig. 2E). Fu he mo e, exposu e o solu-
ions o (AQ)
24
o shea s ess esul ed in he o ma ion o ill-de-
fined b-shee ich agg ega es (Fig. 3A and B and Supplemen a y
Table 1), whe eas exposu e o solu ions o (AQ)
12
NR3 o shea
s ess yielded ela i ely well-defined fib ous agg ega es which
op ical mic oscopy e ealed o be composed o o de ed (aligned)
bundles o long fib ous agg ega es (Fig. 3C and D). In e es ingly,
pola ized Fou ie T ans o m In a ed Spec a eco ded a wo di -
e en o ien a ions (0°and 90° ela i e o he long axis o he fi-
b ous agg ega es) showed ha he b-shee s wi hin he fib ous
agg ega es o (AQ)
24
a e andomly aligned, whe eas he b-shee s
wi hin he fib ous agg ega es o (AQ)
12
NR3 we e p edominan ly
aligned wi h he long axis o he fibe s (in analogy o na u ally
spun fibe s (Boule -Aude e al., 2008; Le e e e al., 2007a; Rous-
seau e al., 2009, 2004)) due o a con olled assembly p ocess
(Fig. 3E and F) (Hagn e al., in p ess). This finding was u he con-
fi med by FTIR in he egion be ween 1100 and 900 cm
1
whe e
specific signals o b-polyalanine c ys als (964 cm
1
) can be ob-
se ed, as epo ed ecen ly (Papadopoulos e al., 2009). In e es -
ingly, a clea di e ence a he wo employed angles using he
pola ize can be seen o (AQ)
12
NR3 agg ega es (Fig. 3H), while
he e is no spec al di e ence o he (AQ)
24
agg ega es, poin ing
ou ha he polyalanine c ys als a e o ien ed in he fibe s o med
esicle
200 nm
100 nm
100 nm
A
BC
bu e c l
(AQ)
24
(AQ)
12
NR3
Fig. 4. Images ob ained ia ansmission elec on mic oscopy. (A) Dialysis bu e . (B) F eshly dialyzed solu ions o (AQ)
24
. (C) F eshly dialyzed solu ions o (AQ)
12
NR3,
showing e idence o highe o de sup amolecula assemblies.
L. Eisold e al. / Jou nal o S uc u al Biology 170 (2010) 413–419 417
om he p o ein wi h he NR domain, bu no in he fibe s o med
om he p o ein wi hou he NR domain. These findings sugges
ha he C- e minal NR domain con ols bo h he s o age o he
p o eins (by inc easing hei solubili y and/o de e ing undesi -
able agg ega ion e en s) and fibe o ma ion (by acili a ing con-
olled p o ein assembly in o fibe s upon demand).
3.4. The ole o he N- e minal NR domain in fibe s o age and
assembly
The N- e minal NR domains o silk p o eins ha e been shown o
be highly conse ed be ween di e en spide species (Hedhamma
e al., 2008; Lin e al., 2009; Mo iuk-Smi h e al., 2005; Rising
e al., 2006). Howe e , due o a lack o any published sequence da a
o he N- e minal NR domains o MA silk p o eins o A aneus dia-
dema us, his domain was no included in ou enginee ed p o ein
cons uc s. Despi e his ac , ou in i o sal -induced agg ega ion
assays wi h p o eins wi h highe molecula weigh s and wi h long-
e epe i i e sequence elemen s ((AQ)
24
NR3 as opposed o
(AQ)
12
NR3) showed hem o be mo e p one o agg ega ion
(Fig. 2), which leads us o specula e ha he N- e minal NR domain
migh also ha e an e ec on highe o de sup amolecula assembly
o silk p o eins and he e o e play an impo an ole in p o ein
s o age and fibe assembly in i o, as he na u al p o eins a e la ge
han ou ecombinan ly p oduced analogues (Gue e e e al., 1996;
Huemme ich e al., 2004b).
4. Conclusions
Ou sal -induced agg ega ion assays clea ly demons a e ha
chlo ide (which is p esen in he lumen du ing silk p o ein s o age)
does no induce significan le els o p o ein agg ega ion, whe eas
phospha e (p esen in he spinning duc ) does induce significan
le els o p o ein agg ega ion, due o he s ongly kosmo opic
na u e o he phospha e anion. Ou shea -induced agg ega ion as-
says clea ly show ha shea o ces a e likely o play a g ea e ole
han sal e ec s du ing he fibe spinning p ocess in i o, and
mo eo e , a key ole in he alignmen o he seconda y s uc u al
elemen s wi hin he fibe s (which con ols hei mechanical
p ope ies). Ou ansmission elec on mic oscope s udies show
ha he C- e minal NR domain is a p e equisi e o highe o de
sup amolecula assembly o he p o eins, which is impo an o
bo h p o ein s o age and he con olled assembly o fibe s. Finally,
we specula e ha he N- e minal NR domains also play a ole in
p o ein s o age (and po en ially fibe o ma ion).
Acknowledgmen s
We g a e ully acknowledge he help o S e an Geime (Uni e -
si ä Bay eu h) o assis ance wi h he ansmission elec on
mic oscopy s udies. We also acknowledge F anz Hagn and Ho s
Kessle (Technische Uni e si ä München) o supplying us wi h
p ime s o he D93A mu an s. L.E. acknowledges financial suppo
om he Ge man Fede al Minis y o Educa ion and Resea ch (Bun-
desminis e ium ü Bildung und Fo schung, BMBF 13N9736). J.G.H.
acknowledges financial suppo om he Alexande on Humbold
Founda ion. M.H acknowledges financial suppo om he ‘G adu-
ie en ö de ung nach dem baye ischen Eli e ö de ungsgese z‘
(Uni e si ä en Baye n, e.V.). T.R.S. acknowledges financial suppo
om he Ge man Resea ch Founda ion (Deu sche Fo schungs-
gemeinscha , DFG SCHE 603/4-3) and he Ge man Fede al Minis-
y o Educa ion and Resea ch (Bundesminis e ium ü Bildung
und Fo schung, BMBF 13N9736). This manusc ip is in memo iam
o Raine Rudolph.
Appendix A. Supplemen a y ma e ial
Supplemen a y da a associa ed wi h his a icle can be ound, in
he online e sion, a doi:10.1016/j.jsb.2009.12.027.
Re e ences
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4
as ecen ly desc ibed20. To in es iga e he possible in e ac ions o he wo
ecombinan spide silk p o eins eADF3((AQ)12NR3) and eADF4(C16NR4) he
encoding genes we e co-exp essed in E. coli om a plasmid whe e each gene is
unde he con ol o i s own T7-p omo e (Figu e 1c).To dis inguish be ween bo h
simila sized p o eins in a ious assays eADF3((AQ)12NR3) was used wi h an
amino e minal T7- ag and eADF4(C16NR4) wi h a hexahis idine (His6)- ag. When
eADF3((AQ)12NR3) and eADF4(C16NR4) a e p oduced indi idually hey o m
disul ide linked dime s e en in he educing cy oplasm o E.coli, since he
edoxpo en ial o he in ol ed cys eins is signi ican ly lowe han ha o he cy osol o
E. coli2. When p oduced indi idually he majo i y (>66%) can be ound in he soluble
ac ions as judged by wes e n blo analysis (Figu e 2a). Coexp ession has no
in luence on he solubili y o he p o eins unde he condi ions es ed (Figu e 2a).
S ikingly a ca boxy e minal domain media ed he e odime isa ion o bo h p o eins
could be de ec ed (Figu e 2b). Nex , we es ed he o ma ion o such he e odime in
i o. The e o e, a s ong educing agen (TCEP) was added o a 1:1 mix u e o ully
chemically dena u ed (AQ)12NR3 and C16NR4, and he p o eins we e e old unde
educing condi ions. A e e olding, bo h homodime s as well as he he e odime
could be de ec ed (Fig 2c). Howe e , he amoun o he e odime o med in i o was
much lowe in i o wi h a nea ly s a is ical dis ibu ion o 1:1:1 (Figu e 2b). To
cha ac e ize he he e odime , a pu i ica ion s a egy was es ablished (see Ma e ials
and Me hod sec ion) yielding pu e he e odime (Figu e 2c). Fa -UV CD spec a o he
h ee p o eins showed no subs an ial di e ences (Figu e 2d). The b oad minimum a
205 nm and a pla eau a 219 nm indica e a mainly andom-coil/PPI-II domina ed
s uc u e wi h α-helical po ions. The andom coil signals a ise om he epe i i e
co e domain20, whe eas he α-helical con ibu ions a e solely om he
ca boxy e minal egions NR3 and NR42, 20. Mel ing expe imen s showed a mel ing
5
poin o 66°C o he he e odime which is 2°C abo e he one o he (AQ)12NR3
homodime and 1.5 °C below ha o he C16NR4 dime (Figu e 2e). Upon cooling,
a e he mal dena u a ion he he e odime e olds quan i a i ely like he homodime s
(Figu e 2d)20. These expe imen s indica e ha he NR3-NR4-he e odime has a
simila s uc u al in eg i y as he espec i e homodime s.
As shown p e iously, eADF3 and eADF4 p o eins ha e di e en assembly p ope ies
when exposed phospha e ions20, 21. He e, we es ed he assembly p opensi y o he
h ee dime ic species in he p esence o inc easing phospha e ion concen a ions.
(AQ)12NR3 as well as he he e odime agg ega ed a phospha e concen a ions
abo e 50 mM, whe eas C16NR4 s a e o agg ega e abo e 150 mM phospha e
(Figu e 3a). Wi h inc easing phospha e concen a ion he agg ega ion kine ics o
C16NR4 we e accele a ed (Figu e 3b). In e es ingly, he kine ics o he he e odime
we e only sligh ly slowe han ha o C16NR4. Nex , binding o he β-shee sensi i e
dye Thio la inT o he di e en assemblies we e es ed (Figu e 3c). (AQ)12NR3
showed signi ican ly (5-10 imes) less ThT binding han he o he wo dime ic
species.
To cha ac e ize he sel -assemblies o he he e odime in compa ison o ha o he
homodime s hey we e in es iga ed by a omic o ce mic oscopy (AFM). AFM images
o he C16NR4 samples showed ib ils ha a e mainly unb anched wi h an a e age
heigh o 3-3.5 nm simila o p e iously epo ed C16_∆CTD ib ils 22 (Figu e 3d). In
case o (AQ)12NR3 only amo phous mo phologies a he han dis inc ib ils could be
de ec ed (Figu e 3e), wi h a sphe ical micelle-like assembly o m as ecen ly epo ed
(Suppl. Figu e 1)16. In e es ingly he he e odime also o med nano ib ils which a e
clea ly dis inc i e in o m and shape om he C16NR4 ib ils (Figu e 3C and F), wi h a
ne wo k o sho , some imes b anched ib ils wi h an a e age heigh o 1 nm. The
6
dis ances be ween he b anching poin s is some imes only a ew nanome e s in
leng h.
In summa y, we p esen e idence ha he wo MaSp2-like silk p o eins ADF3 and 4
om A. diadema us can o m co alen ly linked he e odime s h ough hei na i e non-
epe i i e ca boxy e minal domains (CTD), wi h di e en assembly p ope ies han he
indi idual homodime s (Figu e 3d-h), since he he e odime is able o o m ib illa
ne wo ks (Figu e 3 /i). The indings ha e impac on unde s anding he na u al silk
ibe o ma ion. Bo h p o eins a e sec e ed in he same compa men o he spinning
gland 23, 24. Recen indings om genomic analysis sugges ha bo h MA p o eins a e
p oduced wi hin he same a he han in sepa a ed cells which leads o he
assump ion ha bo h p o eins can al eady in e ac sho ly a e ansla ion wi hin he
cells (e.g. in he sec e o y pa hway compa men s) 25, 26
Fu he , ou esul s highligh he possibili y o con enien ly combine di e en
ecombinan silk p o eins ia he highly simila CTDs o ob ain new silk ma e ials wi h
adjus able p ope ies.
Acknowledgmen s
We hank D . Ma in Humenik and D . And ew Smi h o hei aluable inpu ega ding
he ibe assembly expe imen s. We also hank K is in Schach o helping o ob ain
he TEM images. This wo k was unded by he Bundesminis e ium ü Bildung und
Fo schung (BMBF) and he Deu sche Fo schungsgemeinscha (DFG).
Con lic o in e es s
The au ho s decla e no con lic o in e es .
7
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Figu es and Legends
Figu e 1: Co-P oduc ion o ecombinan a ian s o ADF3 and ADF4.
(A) Simpli ied scheme o he d agline silk om A. diadema us. The wo MaSp2-like
p o eins ADF3 and ADF4 a e colacilzed wi hin he ibe . (B) S uc u e o he pa allel
dime o he non epe i i e ca boxy e minal domain NR3. Each monome , one
depic ed in blue and one in cyan, comp ises a i e helix bundle each wi h one
conse ed cys eine in helix 4 able o o m a disul ide bond co alen ly linking he wo
monome s. The amino e minal egions (NH
3
and NH
3*
) a e highligh ed whe e he
CTD is connec ed o he epe i i e domain. (C) Illus a ion o he plasmid used o he
coexp ession o he genes encoding eADF3((AQ)
12
NR3) and eADF4(C
16
NR4). Each
silk gene is unde he con ol o i s own T7 p omo e (T7-1 and T7-2). C
16
NR4 is
p oduced wi h an amino e minal hexahis idine ag, whe eas (AQ)
12
NR3 has T7- ag.
10
Figu e 2: Analysis o he e odime o ma ion. (a) Compa ison o he soluble and
insoluble ac ion a e p oduc ion and cell dis up ion o indi idually p oduced
(AQ)
12
NR3 and C
16
NR4 and he espec i e co-exp essed (dual p oduced) samples. P
= pelle (insoluble) ac ion, SN = supe na an (soluble) ac ion. (b) Wes e nblo
analysis o (AQ)
12
NR3 and C
16
NR4 he e odime o ma ion. Lysa e: E. coli lysa e
con aining bo h eADF a ian s. he e odime : pu i ied (AQ)
12
NR3-C
16
NR4
he e odime . (AQ)
12
NR3 and C
16
NR4 : pu i ied homodime s, espec i ely. M:
monome ic (AQ)
12
NR3. (c) SDS-PAGE analysis (sil e s ained) o
(AQ)
12
NR3/C
16
NR4 he e odime s o med in i o and in i o. In i o o ma ion was
achie ed by e olding a mix u e o bo h p o eins unde educing condi ions. The black
a ows depic he he e odime . The las lane shows he pu i ied he e odime used o
all assays in his s udy. (d) Fa UV spec a o homodime s o eADF3((AQ)
12
NR3)
(black) and eADF4(C
16
NR4) (blue) as well as he he e odime be o e and a e
hea ing o 90°C ( ed). (e) The mal mel ing poin s. P o ein concen a ions in all
expe imen s we e 3.4 µM.
11
Figu e 3: Assembly p ope ies o he h ee dime ic species. (a) Silk p o ein
assembly in dependence o phospha e concen a ion a e 1 hou o incuba ion a RT.
Da a poin s we e i ed wi h a bol zman unc ion o be e isualiza ion. (b) Assembly
kine ics o he h ee dime species in p esence o 100 mM sodium phospha e (pH
8.0) a 20 °C. Sel assembly was de e mined by measu ing u bidi y a 340 nm. (c)
Binding o Thio la inT in p esence o 100 mM po assium phospha e a e 24 h o
incuba ion clea ly indica ed he p esence o β-shee ich s uc u es in samples made
o he he e odime o C
16
NR4. Mo phologies o he assemblies we e in es iga ed by
AFM. P io o analysis he h ee dime ic species we e incuba ed o 24h in T is-bu e
12
pH 8.0 wi h 50 mM o po assium phospha e a oom empe a u e. (d) C16NR4, (e)
(AQ)12NR3, ( ) he e odime . AFM pic u es we e made in apping mode. (g) Model o
he di e en in p esence o phospha e ions. eADF3 p e e en ially o ms la ge,
globula shaped assemblies. eADF4 in con as o ms nanosized unb anched ib ils
ha a e β-shee ich. The he e odime o ms a highly in e connec ed ne wo k o
nano ilamen s ha also ha e a high β-shee s con en .
13
Ma e ials & Me hods
Cloning. Enginee ed silk genes based on A anaeus diadema us ib oin (ADF) 3 and
4 as desc ibed p e iously20 we e cloned in o a pRSFdue -1mu plasmid (a modi ied
pRSFdue -1 plasmid (No agen – Me k, Ge many) wi h one addi ional base pai p io
o he NdeI es ic ion si e in MCS2) con aining wo mul iple cloning si es (MCS) each
wi h a p eceding T7-p omo e . Sequences encoding o eADF4(C16NR4) we e cu
ou om pCS_C16NR420 using BamHI/HindIII. The gene encoding o
eADF3((AQ)12NR3 wi h an amino e minal T7 ag was ob ained by diges ing
pET29_(AQ)12NR3 wi h NdeI/XhoI. Bo h genes we e cloned s epwise in o pRSFdue -
1mu diges ed wi h he espec i e es ic ion enzymes. The inal cons uc encodes
o eADF3((AQ)12NR3) bea ing an amino e minal T7 ag and eADF4(C16NR4) wi h an
amino e minal hexa-his idine ag. To isola e he desi ed genes a e es ic ion diges
he samples we e sepa a ed on a 0.8% aga ose gel. The desi ed bands we e sliced
ou and pu i ied using a ki (P omega, Ge many). T4-Ligase and es ic ion enzymes
we e pu chased om New England Biolabs (USA).
Exp ession analysis wi h SDS-PAGE and Wes e n Blo . F eshly p epa ed
HMS174 (DE3) E. coli cells we e ans o med wi h he plasmid con aining he wo
ecombinan silk genes and pla ed on aga pla es wi h kanamycin. 4 ml p ecul u es
om single colonies we e g own o e nigh a 30-37°C o e nigh . Shaking lasks wi h
100 ml LB media we e inocula ed 1:500 ( / ) wi h he p ecul u es and g own a 30-
37°C. The cul u es we e allowed o g ow un il hey eached an op ical densi y a 600
nm (OD600) o 0.6 – 0.8 un il p o ein p oduc ion was s a ed wi h he addi ion o 0.1
mM IPTG. Du ing exp ession he cells we e incuba ed a 30-37°C. A e 4 h o
exp ession he cells we e ha es ed by cen i uga ion a 6000xg and 6°C in a So all
RC6 Plus cen i uge (The mo Scien i ic, USA). Fo cell dis up ion 1 g o cell pelle
20
Supplemen al In o ma ion
Supplemen al Figu e 1: T ansmission elec on mic oscopy images o he h ee
dime ic species. (A) C16NR4 o ming ib ils wi h leng h o se e al hund ed
nanome e s. (B) (AQ)12NR3 was obse ed o ming mainly sphe ical, micelle-like
assemblies (B-1) and spo adic as ib illa s uc u es wi h a low elec on densi y (B-2).
(C) The he e odime o ms a ne wo k o hin and sho (<10 nm), some imes s ick-like
ib ils. P io o analysis he h ee dime ic species we e incuba ed o 18-24h in T is-
bu e pH 8.0 wi h 50 mM o po assium phospha e a oom empe a u e. D ople s
con aining he samples we e placed on piolo o m-coa ed coppe g ids and he excess
liquid was emo ed using pape owels (Kimbe ly-Cla K Co p, USA). The g id was
s ained wi h u anyl ace a e (1% in wa e ) and he excess liquid was again emo ed
wi h pape owels. The samples we e iewed wi h a JEOL JEM-2100 ansmission
elec on mic oscope (Jeol, Ge many).
Teila bei en
[103]
Teila bei IV
Eisold , L., Smi h, A., Scheibel, T. (2011) Decoding he sec e s o spide silk. Ma e ials
Today. 40, pp. 80-86
ISSN:1369 7021 © Else ie L d 2011
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Decoding he sec e s o
spide silk
Silk has been p oduced by a la ge a ie y o a h opods o
hund eds o millions o yea s. Humans ha e used silk ma e ials o
se e al housands o yea s o all kinds o applica ions, anging
om ex iles o wound d essings o uses in he mili a y. The main
sou ce o silk is he mulbe y silkwo m Bombyx mo i, since i is
easy o a m ( a ming s a ed abou 5000 yea s ago in China).
The silk o spide s canno be collec ed as easily, bu he ne s
o o b wea ing spide s (A aneidae) ha e also been his o ically
employed o applica ions such as ishing o wound co e age, due
o hei ou s anding mechanical and biomedical p ope ies. O b
webs can be ound all o e he wo ld, wi h web diame e s anging
om a ew cen ime e s o se e al me e s. Ve y ecen ly spide s
in Madagasca ha e been disco e ed o spin single h eads which
span ac oss i e s, wi h a leng h o abou 25 m1. O b webs ha e
been adap ed o e millions o yea s o wi hs and and compensa e
o he kine ic impac s o he la ge (in compa ison o he ibe
diame e ) p ey o he spide . When examined by he naked eye
all h eads in an o b web appea o be he same, bu in ac a web
is buil om up o i e di e en silk ypes. A emale o b wea ing
spide is e en able o p oduce up o se en di e en silks, including
one special silk o egg cases2 (Fig. 1). Spide silks a e ailo ed
o speci ic pu poses and exhibi a g ea a ia ion in mechanical
p ope ies. Be ween he di e en silk ypes hei s eng h ( he
s ess needed o b eak he ibe ) anges om 0.02 o a ema kable
1.7 GPa, which exceeds s eel (1.5 GPa), while he ex ensibili y
a ies be ween 10 and 500 %3,4. In e es ingly, mos spide silks
ha e a sophis ica ed combina ion o s eng h and ex ensibili y,
which yields a e y high oughness ( he amoun o ene gy
abso bed pe olume be o e b eakage) ha exceeds mos na u al
o man-made ibe s. Also common o all silks is hei iscoelas ic
beha io , since upon s e ching ene gy is dissipa ed in he o m o
hea , diminishing any elas ic ecoil5.
The mos in es iga ed spide silk is d agline silk, he li eline a spide
always d ags behind, which shows he mos ema kable combina ion o
s eng h and ex ensibili y. I is p oduced in he majo ampulla e gland
(indi idual glands exis o each silk ype) o a spide , and he e o e i s
Spide silks ha e been employed by man o se e al housands o
yea s. Spide silks possess ex ao dina y mechanical p ope ies due
o a combina ion o s eng h and ex ensibili y ha a e supe io o
mos man-made ibe s. Spide silk ibe s a e a p o ein-based ma e ial
p oduced in a highly sophis ica ed hie a chical p ocess unde mild
condi ions. He e, we e iew he cu en unde s anding o spide silk and
i s assembly p ocess, as well as discuss he applica ion o silk-based
ma e ials o he ields o biomedicine and ma e ials enginee ing.
Lukas Eisold , And ew Smi h, Thomas Scheibel*
Uni e si ä Bay eu h, Fakul ä ü Angewand e Na u wissenscha en, Leh s uhl ü Bioma e ialien, Uni e si ä ss aße 30, 95447 Bay eu h,
Ge many
*E-mail: [email p o ec ed]
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co ec biological name is majo ampulla e silk (MAS). MAS is used o
he ame and adii o an o b web, as well as he a o emen ioned li eline
by mos spide s. The mechanical p ope ies o d agline silk o se e al
di e en species ha e been ex ensi ely analyzed4,6-8. In compa ison o
man-made ibe s, he maximum s eng h o up o 1.7 GPa (d agline
o Cae os is da wini) is in he ange o high- ech ma e ials. Al hough,
Ke la o ca bon ibe s ha e a highe s eng h and s i ness, spide silk
ibe s ha e a much highe oughness due o hei g ea e ex ensibili y9.
Howe e , d agline silk o e s e en mo e in e es ing ea u es. Fo
example, a hanging spide ha dly e e wis s, indica ing an in e es ing
o sional dampening beha io o he d agline h ead. When a d agline
h ead is wis ed i does no oscilla e a ound he new posi ion, like a
Ke la ibe would. A e a while, he ibe slowly e u ns o i s ini ial
posi ion, indica ing ha he e is a so o a shape memo y wi hin he
ibe 10. Ano he in e es ing ea u e o spide silk is i s abili y o unde go
supe con ac ion. When d agline silk is we ed, o when he ela i e
humidi y is abo e 60 %, a silk h ead swells in diame e and sh inks in
leng h by abou 50 %11,12. O he spide silk ypes show his beha io as
well, bu in hese cases his beha io is much less p onounced13.
Besides d agline silk he o he silk ypes also show in e es ing
p ope ies like an ex ao dina y ex ensibili y o up o 500 %
( lagelli o m silk) o a glue-like beha io (agg ega e silk), bu in his
e iew we will con inue o ocus on d agline silks.
P ima y s uc u e o spide silks –
less (complexi y) is mo e
All spide silk h eads a e mainly composed o one o mo e
p o eins, called spid oins, which end o be la ge (up o 350 kDa pe
monome )14. Despi e hei di e en p ope ies, all spid oins sha e a
common p ima y s uc u e pa e n comp ising a la ge cen al co e o
epea ed modula uni s, accoun ing o app oxima ely 90 % o he
amino acids o he p o ein, lanked by non- epe i i e domains (Fig. 2a).
These non- epe i i e e minal domains ha e a olded globula s uc u e
and a e comp ised o app oxima ely 100 – 140 amino acids. Thei
sequences a e highly conse ed h oughou di e en spide species
and silk ypes15-17. The e minal domains a e essen ial o s o age
o spid oins in he silk glands and ibe o ma ion in he spinning
duc , since i is he e ha hey igge c ucial s eps in he complex
assembly o he spid oins upon en i onmen al changes, like pH o ionic
composi ion and s eng h18,19.
The sequence o he epe i i e co e is ailo ed o he indi idual
mechanical unc ions o he di e en silk ypes. In gene al, i consis s
o modula uni s each wi h abou 40 – 200 amino acids7,14,20,21,
and he modula uni s a e epea ed up o app oxima ely 100 imes
wi hin he co e domain14. In majo ampulla e, mino ampulla e and
lagelli o m silk, he modula uni s a e mainly comp ised o a subse
o he sequence mo i s (Ala)4-14, (GlyAla)n, GlyGlyX and GlyP oGlyXX,
Fig. 1 Schema ic o e iew o di e en silk ypes p oduced by emale o b wea ing spide s (A aneae). Each si lk ype (highligh ed in ed) is ailo ed o a speci ic pu pose.
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wi h X ep esen ing a a iable amino acid (Fig. 2b). The subse , he
sequen ial o de and he numbe o hese mo i s in each module a e
impo an o he mechanical p ope ies o he inal ibe . In con as
o e minal domains, he co e egion is in insically un olded, as long as
he spid oins a e s o ed in he gland22-25.
F om sequence o s uc u e
The d agline ibe is no only he bes cha ac e ized spide silk in
e ms o mechanical p ope ies, bu also conce ning i s s uc u e-
unc ion ela ionship. Unlike o he spide silks, d agline ibe s can be
collec ed om o b webs o by “milking” ( o ced silking) o spide s.
Elec on, a omic o ce and ligh mic oscopy ha e e ealed a co e-
shell s uc u e o he d agline ibe 26,27. The shell is qui e hin and
con ains di e en biomolecules like lipids, glycop o eins and o he
silk p o eins28. The co e consis s mainly o wo p o eins p oduced
in he majo ampulla e gland named MaSp (Majo ampulla e Spid oin)
1 and 2.
A single modula uni o MaSp1 usually comp ises a polyalanine
block and se e al GGX mo i s. In modules o MaSp2 he GGX mo i is
eplaced by he mo i GPGXX, inc easing he p oline con en o MaSp2
d ama ically. Se e al dozens o epea s o hese modula uni s build
he comple e co e egion o hese spid oins. The po en ial s uc u es
o he indi idual mo i s and hei con ibu ion o he p ope ies o he
inal ibe ha e been in ensi ely in es iga ed o e he las wo decades
(Fig. 2b). Using di e en NMR echniques and x- ay di ac ion i
has been shown ha he polyalanine mo i o ms de ined nano-
sized c ys als (2 x 5 x 7 nm) based on igh ly packed an i-pa allel
β-shee s22,29-34, in which i is e y likely ha polyalanine s e ches
om di e en silk molecules cons i u ing e y s ong non-co alen
c oss-links. The s uc u e o he GGX mo i in d agline silk is less
unde s ood. Recen NMR s udies p o ided e idence ha hese mo i s
migh o m β-shee s as well as less o de ed helical s uc u es33,35-37.
Meanwhile, he s uc u e o he GPGXX mo i om MaSp2 seems o
be clea . Due o he p oline esidue, his pen apep ide likely o ms
β- u ns which, when epea ed, yield a spi al s uc u e as sugges ed o
elas in38.
I should be no ed ha in he case o A aneus diadema us bo h
MAS componen s, named ADF 3 and 4 (A aneus diadema us ib oin)
due o his o ical biological easons, ha e simila p oline con en s
(~ 13 %)21. Compa ed o o he MAS ibe s A aneus silk shows no
signi ican di e ences conce ning i s mechanical beha io indica ing
ha he p esence o low-p oline-con en spid oins is no necessa y
o he mechanical pe o mance. I is wo h no ing ha a mac oscopic
e ec o he p oline con en is only seen when d agline silk is we ed.
The amoun o p oline in luences he deg ee o supe con ac ion
and he mechanical p ope ies o we ed silk39-41. Howe e , i seems
o be mo e impo an o ha e a pai o hyd ophobic/hyd ophilic
spid oins, since compa ing he hyd ophobici y o MA spid oins be ween
di e en species e ealed ha MaSp1/ADF4 a e mo e hyd ophobic and
MaSp2/ADF3 a e mo e hyd ophilic.
Fig. 2 The hie a chical se up o spide silk p o eins. (a) Illus a ion o a spid oin comp ised o up o 100 epe i i e modules (blue) and wo e minal domains
( ed and g een). The componen s a e no d awn o scale. (b) The epe i i e modules o he mos p ominen silk ypes comp ise a dis inc subse o amino acid
mo i s. (c) Each mo i is hough o ul ill a dis inc s uc u al ole and con ibu es o he mechanical p ope ies o he inal ibe .
(b)
(a)
(c)
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The na u al spinning p ocess
The p ima y s uc u e o silk p o eins alone does no explain he
ou s anding p ope ies o a d agline silk ibe . Fibe s echnically spun om
econs i u ed spid oins (i.e. spid oins ob ained om chemically dissol ed
spide silk ibe s) o om spid oins om he o iginal spinning dope show
comple ely di e en mechanical p ope ies compa ed o ibe s spun by
spide s, indica ing ha he spinning p ocess is also c ucial42,43.
The spide s spinning appa a us can be di ided in o ou pa s
(Fig. 3a). In he i s pa , he ail, he spid oins a e sec e ed om
specialized cells. In he second pa , he sac o ampulla, he spid oins
a e s o ed, and u he compounds a e added la e o ming he
skin o he ibe . The p o ein concen a ion du ing s o age in he
ampulla can each up o 50 % (w/ )22,44. This is a ema kably high
concen a ion, since mos p o eins end o agg ega e i e e sibly unde
such condi ions. To p e en unspeci ic agg ega ion, spid oins o m
micella -like s uc u es con olled by hei amphiphilici y19,45-48 and by
he non- epe i i e e mini which induce o suppo he o ma ion o
such sup amolecula assemblies18,19,48 (Fig. 3b). The s o ed spid oins
in he ampulla, cons i u e he so-called spinning dope which has
cha ac e is ics o a nema ic liquid c ys alline phase47,49. In he hi d
pa o he spinning appa a us, an S-shaped duc , he liquid c ys alline
luid is exposed o a cons an elonga ional low. The liquid c ys allini y
allows he molecules o low in a p e-aligned manne and o u he
align along he low axis du ing he passage h ough he duc . Due o
i s ape ing, he shea o ces inc ease along he duc leading o he
o ma ion o β-shee c ys als19,40-50. In he las pa o he spinning
appa a us he shea s ess u he inc eases, due o pulling o he ibe
ou o he spigo (Fig. 3b). The pulling o ces lead o some s uc u al
changes in he spid oins (especially hei e minal egions) accompanied
by exposu e o hyd ophobic a eas ollowed by a phase sepa a ion
be ween he sol en (i.e. wa e which is ac i ely emo ed by epi helial
cells51-53) and he spid oins54,55 (Fig. 3b). The s uc u al changes in he
e minal domains e-a ange he posi ion o he co e egions wi hin
he micella -like s uc u es, and his oge he wi h mechanical o ces
suppo s phase sepa a ion and spid oin assembly.
As well as mechanical in luences, chemical changes igge a s uc u al
a angemen , especially in he S-shaped duc . The e he exchange o
sodium and chlo ide ions o he ela i ely kosmo opic po assium and
phospha e ions is esponsible o he exposu e o hyd ophobic a eas
wi hin he C- e minal non- epe i i e domain19,56. Upon lowe ing he
Fig. 3 The na u al spinning p ocess. (a) Illus a ion o a spide ’s spinning gland di ided in o ou pa s. (b) Schema ic model o he silk ibe assembly mechanism
occu ing along he spinning appa a us.
(b)
(a)
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pH alue om oughly 7 o 6, he amino- e minal non- epe i i e domains
dime ize, likely ac ing as addi ional physical c oss-links be ween he
spid oins48,57,58.
Be o e he ibe exi s he spigo i passes he so-called “ al e”,
an o gan ha assis s in es a ing he spinning p ocess a e in e nal
up u e52. I wis s he duc back and o h, he eby mo ing he
up u ed ibe end in o he opened al e. Once he ibe has le he
spide , he spide pulls and s e ches he ibe leading o u he wa e
e apo a ion and addi ional alignmen o he molecules inside he ibe .
All he mechanisms o his highly sophis ica ed spinning p ocess
enable he spide o e icien ly p oduce a e y ough ibe unde mild
condi ions; a p ocess ye un i aled by any man-made ibe spinning
p ocess.
The s uc u al o ganiza ion o a
d agline ibe
The s uc u e o d agline silk ibe s e eals h ee hie a chical le els59. On
he mac oscopic le el he ibe shows a co e-shell s uc u e (Fig. 4a). On
he mesoscopic le el, ib ils o ien ed along he ibe axis o m he co e o
he ibe , esembling he s uc u e o a ope. On he molecula le el small
c ys alli es (2 x 5 x 7 nm) comp ising igh ly packed alanine β-shee s and
la ge c ys alline egions (> 100 nm) based on glycine-alanine sequences
wi h high β-shee con en can be ound. Bo h c ys alline egions a e
in e connec ed by a so-called amo phous ma ix which con ains loosely
a anged helical s uc u es o ien ed along he ibe axis (Fig. 4b). In
his wo-phase-model he c ys alline egions media e he s eng h o
he ibe , whe eas he ma ix is esponsible o he elas ici y o he
ibe . Howe e , esul s ob ained om a ious x- ay and NMR me hods
indica e ha pa s o he amo phous egions a e much mo e o de ed and
o ien ed, leading o a model wi h a hi d phase which in e connec s he
c ys alline egions wi h he amo phous phase60-62. Fo u he de ailed
in o ma ion we ecommend consul ing addi ional li e a u e63-66.
Bio echnological p oduc ion o spide
silk p o eins
In con as o silkwo ms (Bombyx mo i), mos spide s canno be a med
due o hei cannibalis ic beha io . Collec ing silks om webs is also
e y ime-consuming and he e o e no p o i able, especially i a
speci ic silk ype (o he han d agline silk) is desi ed. In o de o achie e
spide silk on a la ge scale, bio echnological p oduc ion o spid oins
is he only easible solu ion. Fo ecombinan p o ein p oduc ion, he
DNA sequence om a dono o ganism (he e he spide ) has o be
ecombined wi h ha om an accep o (a so-called hos ) which is
used o he p oduc ion. Mos ecombinan silk p o eins a e p oduced
in he bac e ium Esche ichia coli which is a well-es ablished hos o
he indus ial scale p oduc ion o p o eins. I allows a as and scalable
p oduc ion wi hin 3 – 4 days om he ini ia ion o p oduc ion o he
inally pu i ied p o ein.
A emp s o p oduce ecombinan MA silk p o eins based on
agmen s o na i e silk genes om spide s in bac e ia esul ed
in low yields, mainly due o he di e en codon usage o spide s
and E. coli67. Howe e , in gene enginee ing app oaches he codon
usage o he genes can be adap ed o he hos o ganism. In he
case o silk genes, he epe i i e cha ac e allows a s aigh o wa d
app oach. As depic ed abo e, mos spide silk p o eins show a
simple p ima y s uc u e composed o epea ed modula uni s which
con ain 100 – 200 amino acids based on smalle sequence mo i s
(e.g. polyalanine). The a angemen and he exac sequence o he
mo i s di e om silk ype o silk ype and om species o species,
bu wi hin an indi idual spid oin hey a e qui e egula . Thus, by
analyzing a spid oin’s amino acid sequence, one can iden i y he
modula uni s and design a i icial gene encoding o silk p o eins
using hos -speci ic codons. Wi h his me hod i is possible o c ea e
ecombinan silk p o eins wi h a high sequence simila i y (on a
p o ein le el) o he na u al bluep in s. Addi ionally, comple ely
no el silk-p o eins can be c ea ed by hyb idizing mo i s o di e en
silk ypes. This app oach has been used by se e al g oups o p oduce
a ious enginee ed silk p o eins. Mos o hese enginee ed p o eins
a e based on he sequences o MaSp1/268,69 om a ious species
o ADF3/470, bu some also enginee ed ecombinan lagelli o m
spid oins71-74.
The majo i y o he ecombinan ly p oduced silk p o eins a e
smalle (30 – 110 kDa) han na u al spid oins (300 – 350 kDa).
This is due o he biological limi a ion o E. coli, which lowe s
he p o ein yields d ama ically wi h inc easing p o ein size75,76.
Howe e , his p oblem can be pa ly ci cum en ed by modi ying
he p oduc ion hos 77. S ikingly, all a i icial spid oins, excep
one p o ein based on he sequence o ADF346, show much
lowe solubili ies in aqueous solu ion han he na u al spid oins
(see68,69 and e e ences he ein). A lo o hese p o eins end
o sel -assemble o agg ega e in o small ib illa s uc u es wi h
sizes anging om a ew mic ome e s o cen ime e s78. Al hough
hese spon aneously o med ib ils show β-shee s uc u es, hey
a e only emo ely eminiscen o na u al silk ibe s, since in his sel -
assembly p ocess some c ucial s uc u al alignmen s eps do no ake
place.
Fig. 4 Illus a ion o he hie a chical spide silk s uc u e. (a) The ibe shows a
skin-co e s uc u e wi h ib ils o ming he co e. (b) On he nanos uc u al le el
he ib ils comp ise small igh ly packed
β
-shee c ys als ( ed a ow) and la ge
c ys alline egions (black a ow) in e connec ed by an amo phous ma ix .
(b)
(a)
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Exploi ing he applica ion po en ial o
ecombinan spide silks
So a , no biomime ic spinning p ocess exis s ha would allow he
o ma ion o na i e-like spide silk ibe s om ecombinan silk
p o eins. Howe e , despi e he nonexis en spinning p ocess mos
ecombinan spide silks can sel -assemble in o non-na u al shapes
such as sphe es, capsules, ilms, non-wo ens o hyd ogels (Fig. 5),
which ha e a high applica ion po en ial79-83.
Depending on he p ocessing condi ions he assembly o ms ha e
di e en ma e ial p ope ies linked o he molecula s uc u e o
he employed silk p o ein. Mo phologies wi h high β-shee con en s
(sphe es, hyd ogels) ha a e o med by as sal ing-ou o slow sel -
assembly p ocesses a e wa e -insoluble55,81,84,85. In con as , o ced
assembly (e.g. in o ilms o non-wo ens) ou o as e apo a ing
o ganic sol en s such as hexa luo oisop opanol yields α-helical ich
composi ions ende ing he s uc u es wa e soluble. In e es ingly, such
s uc u es can be pos - ea ed wi h subs ances ha induce β-shee
o ma ion leading o he gain o wa e -insolubili y80,82,86. No only
wa e solubili y, bu he mechanical p ope ies o he silk ma e ials
a e also linked o he β-shee con en . Since ecombinan spide silk
p o eins a e monodispe se (in compa ison o syn he ic polyme s),
high deg ees o assembly con ol and, he e o e, he inal ma e ial’s
p ope ies a e possible.
Conce ning applica ions, he a o emen ioned silk shapes can be
used as ca ie s o d ugs o as sca olds in issue enginee ing80, since
na u al silks show a good biocompa ibili y (cy ocompa ibili y, low
immunogenici y, biodeg adeabili y, low oxici y) in i o and in i o69,87-92.
Recombinan spide silk p o eins ha e a simila cy ocompa ibili y o
na u al silks making hem sui able o biomedical applica ions93-95.
Besides i s biocompa ibili y ecombinan spide silk s uc u es sha e
some o he in e es ing ea u es wi h na u al spide silk ibe s, like i s
smoo h su ace, making hem sui able o echnical applica ions as well.
These ea u es can be used in echnical applica ions, e.g. non-wo ens
as ai il e ing de ices o sphe es, as addi i es o cosme ics o gi e he
p oduc a “silken” smoo h eeling.
Fu u e pe spec i e
Spide silks a e imp essi e biopolyme s ha ha e e ol ed o e
millions o yea s. O e he las se e al decades a lo o p og ess has
been made in un a eling some o i s sec e s. Ne e heless, ce ain
ques ions, especially conce ning solubili y, s o age and assembly o
he unde lying spide silk p o eins, which a e c ucial o he echnical
p oduc ion o e.g. silk ibe s, a e s ill unanswe ed. The bio echnological
p oduc ion o ecombinan spide silk in la ge scales is a landma k in
spide silk esea ch, since now in es iga ions a e enabled o answe
such ques ions. Fu he mo e, ecombinan spide silk p o eins can be
Fig. 5 Di e en non-na u al assembly o ms (bold ex ) o ecombinan spide silk p o eins and po en ial applica ions he eo .
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g ea po en ial in a ious echnical and biomedical applica ions. Wi h
ecombinan p oduc ion echnologies i is possible o c ea e ailo -
made silk-based biopolyme s o many di e en pu poses on a la ge
scale wi hin a ela i ely sho amoun o ime.
Acknowledgemen s:
This wo k was suppo ed by he Bay ische S aa sminis e ium ü Umwel
und Gesundhei , p ojec U8793-2008/11-2. We would o hank D .
Ma in Humenik o his c ea i e inpu and echnical suppo in c ea ing
he a wo k.
MT14_3p80-87.indd 86 2/24/2011 11:25:19 AM
Teila bei en
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Re iewing Edi o : Da id Na e B eslaue
S o age and Assembly o Spide Silk P o eins 361
Biopolyme s
Rech liches
[120]
Rech liches
Fü die Publika ionen in den Teila bei en II, IV und V wu den die Rech e zu elek oni-
schen und ged uck en Ve iel äl igung des jeweiligen olls ändigen A ikels im Rahmen
diese Disse a ion bei den Ve lagen eingehol . Fü Teila bei I gewäh de Ve lag (Na u e
Publishing G oup) jedem Au o das Rech den olls ändigen A ikel im Rahmen eine The-
sis/Disse a ion in elek onische und ged uck e Fo m zu e iel äl igen (Punk a. un e
„Au ho Reques s“ au h p://www.na u e.com/ ep in s/pe mission- eques s.h ml).
Anhang
[121]
Anhang
Tabelle A1: Übe sich bekann e ca boxy e minale (CT) und amino e minale (NT) Sequenzen on
e schiedenen Spid oinen und A en. Die Sequenzen wu den de UniP o -Da enbank en nommen
(h p://www.unip o .o g/unip o /, S and Janua 2013) und sowei möglich publizie e Quellen mi angege-
ben. De Übe sich halbe wu den edundan e Spid oinsequenzen, die au un e schiedlichen cDNA-Klonen
basie en nich mi au genommen. Die Sequenzen sind nach Un e o dnung und jeweilige Familie so ie . Die
A en inne halb de Familien sind alphabe isch so ie . Bei Spid oin ypen, die mi „Fib oin“ gekennzeichne
sind, konn en die jeweiligen epe i i en Be eiche nich den bekann en Spid oinklassen zugeo dne we den.
Die e minalen Domänen zeigen jedoch eine signi ikan e Ve wand scha zu Sequenzen on e minalen Spid-
oindomänen. Die publizie e Nucleo idsequenz aus de die mi * gekennzeichne en NT-Sequenz des Fla-
gelli o m Spid oins on N. cla ipes (O44358) he o geh en häl an Posi ion 110 ein Adenosin zu iel, wel-
ches die P o einsequenz ab Posi ion 36 e älsch . Die ko igie e Sequenz is in [33] angegeben, Ve wende e
Abkü zungen: MaSp: Majo Ampulla e Spid oin; MiSp: Mino Ampulla e Spid oin; Flag: Flagelli o m Spid-
oin; AcSp:Acini o m Spid oin; TuSp: Tubuli o m Spid oin; Py i o m Spid oin
Spezies Spid oin
Bekann e
Te minus UniP o -Numme Quelle
Un e o dnung Ech e Webspinnen (A aneomo phae)
Ech e Radne zspinnen (A aneidae)
A aneus bicen ena ius MaSp1 CT P46802 [24]
MaSp2 CT Q9TY62 [24]
A aneus diadema us MaSp1 CT Q16986 [7]
MaSp2 CT Q16987 [7]
A aneus genmoides TuSp1 CT Q3BCG3 [163]
A aneus en icosus
MaSp1 CT G9JKN1 -
MiSp NT + CT K4MTL7 [27]
Flag CT A0FK72 [164]
AcSp1 CT E1AW39 -
A giope amonea
MaSp1 CT Q2TV51 -
MaSp2 CT Q3ZTQ8 -
AcSp1 CT E1AW40 -
A giope a gen a a MiSp1 CT I4CJN7 [165]
TuSp1 NT + CT NT: E1AHW1 CT: Q4G1Y5 [30, 37]
A giope au an ia MaSp2 CT Q9BIV0 [29]
TuSp1 CT Q4G1X5 [30]
A giope b uennichi MaSp1 CT I6XQ31 [47]
MaSp2 NT + CT I6YNT3 [47]
A giope i ascia a
MaSp1 CT Q9BIU7 [29]
MaSp2 NT + CT NT: Q2VLH1 CT: Q9BIU6 [21]
Flag CT Q9BIU9 [29]
AcSp1 CT Q64K55 [13]
PySp1 CT E2DEK3 -
Cy opho a moluccensis MaSp1 CT Q5UNI2 [166]
TuSp1 CT Q4G1X3 [30]
Gas e acan ha canc i o -
mis
MaSp2 CT Q9BIU1 [29]
Gea hap agon TuSp1 CT Q4G1X4 [30]
Me epei a g andiosa MiSp1 NT + CT NT: E1AHV7 CT: E1AHU9 [37]
Nephila cla ipes
MaSp1 NT + CT NT: B5SYS5 CT: P19837 [23, 35]
MaSp2 NT + CT NT: B5SYS7 CT: P46804 [9, 35]
Flag NT + CT *NT: O44358 CT: O44359 [12]
TuSp1 CT Q3BCG2 [163]
PySp1 CT E2DEK5 [20]
PySp2 CT G0WJI5 [31]
Anhang
[122]
Nephila inau a a mada-
gasca iensis
MaSp1 CT Q9BIT6 [29]
MaSp2 NT + CT NT: Q2VLH2 CT: Q9BIT5 [21, 29]
Flag NT Q9NHW2 [28]
Nephila pilipes MaSp1 CT Q5UNI6 [166]
Nephila senegalensis MaSp1 CT Q9BIT4 [28]
Masp2 CT Q9BIT3 [28]
Nephilengyys c uen a a
MaSp1 CT A6YP78 [11]
MiSp1 CT A6YP79 [11]
Flag CT A6YP76 [11]
TuSp1 CT A6YP77 [11]
PySp1 CT E3SH49 -
Pa awixia bis ia a
MaSp1 CT I6LKZ4 -
MaSp2 CT I6LKZ5 -
MiSp1 CT E9JEC3 -
AcSp1 CT I6LKZ2 -
Te agna ha kauaiensis MaSp1 CT Q9BIS8 [29]
Te agna ha e sicolo MaSp1 CT Q9BIS7 [29]
Haubenne zspinnen (The idiidae)
La odec us geome icus
MaSp1 NT+ CT NT: B0F665 CT: Q9BIU0 [29, 167]
MaSp2 NT + CT NT: B0F656 CT: Q9BIT8 [29, 167]
TuSp1 CT Q4G1X7 [30]
La odec us hassel ii TuSp1 CT Q4G1X6 [30]
La odec us hespe us
MaSp1 NT + CT A6YIY1 [8]
Masp2 NT + CT A6YIY0 [8]
MiSp NT + CT NT: E1AHV0, CT: E1AHV1 [37]
AcSp1 NT + CT GenBank: JX978171.1 [15]
TuSp NT + CT NT: Q1KXY8 CT: Q4G1Y6 [30]
PySp CT C7T5D2 [19]
La odec us mac ans MaSp1 NT E5G5R4 [34]
Tusp1 CT Q4G1X9 [30]
Ne zwe ende Spinnen (Deinopidae)
Deinopis spinosa
MaSp2 CT Q15G92 [168]
MiSp1 CT Q15G96 [168]
Flag CT Q15G95 [168]
TuSp1 CT Q4G1Y3 [168]
K äusel adne zspinnen (Ulobo idae)
Ulobo us di e sus
MaSp1 CT Q15G89 [168]
MaSp2 CT Q15G85 [168]
MiSp1 NT + CT NT: E1AHV5 CT: Q15G88 [37]
AcSp1 CT Q15G87 [168]
TuSp1 CT Q4G1Y4 [168]
Oc onoba a ians MaSp1 CT Q5UNK3 [166]
T ich e spinnen (Agelenidae)
Agelenopsis ape a MaSp1 NT + CT NT: E1AHV3 CT: Q6Q294 [37, 169]
TuSp1 NT + CT NT: E1AHV9 CT: E1AHV2 [37]
Raubspinnen (Pisau idae)
Eup os henops aus alis MaSp1 NT + CT NT: Q05H60 CT: A7M8L1 [32, 33]
MaSp2 CT A7M8K6 [32]
Psech idae
Psech us sinensis MaSp1 CT Q5UNJ3 [166]
Luchsspinnen (Oxyopidae)
Peuce ia i idans MaSp1 CT D5JG83 [47]
Digue idae
Digue ia cani ies MaSp1 NT + CT NT: E1AHU4 CT: E1AHU5 [37]
Loch öh enspinnen (Filis a idae)
Anhang
[123]
Kukulcania hibe nalis MaSp1 NT E1AHU3 [37]
Un e o dnung Vogelspinna ige (Mygalomo phae)
Cy aucheniidae
Ap os ichus spp. Fib oin1 CT A8UAJ5 [170]
Fib oin2 CT A8UAJ6 [170]
An odiae idae
A ypoides i e si Fib oin1 CT I6ULS5 [171]
Eigen liche Fall ü spinnen (C enizidae)
Bo h iocy um cali o ni-
cum
Fib oin1 NT + CT NT: E1AHU2 CT: A8UAJ7 [37, 170]
Doppelschwanzspinnen (Diplu idae)
Euag us chisoseus Fib oin1 CT Q9BIU2 [29]
Mecicobo h iidae
Megahexu a ul a Fib oin1 CT I6ULT0 [171]
Vogelspinnen (The aphosidae)
A icula ia ju uensis MaSp1 CT D4HL83 [169]
MaSp2 CT D4HL84 [169]
T ich e ne zspinnen (Hexa helidae)
Mac o hele hols i MaSp1 CT Q5UNJ2 [166]
Danksagung
[124]
Danksagung
Ein g oße Dank geh an meinen Be eue und wissenscha lichen Men o P o . Thomas
Scheibel, de s e s ü mich da wa und mi die Gelegenhei wie auch die F eihei en gab
au diesem spannenden P ojek zu p omo ie en.
Den Mi gliede n des u sp ünglichen „Fibe labs“, namen lich Anja, Ch is ian, K is ina,
Simone und U e, möch e ich ü all die Hil en, schon o Beginn de Dok o a bei , und
den schönen S unden in und o allem auch auße halb des Labo s danken.
All meinen Kollegen und F eunden des Leh s uhls Bioma e ialien gebüh eben alls mein
Dank. Hie sei na ü lich besonde s die Gummibä chen e p legungss a ion um Claudia
Mädels-Bü o, die unzählige Male ü den nö igen Zucke schub e wähn . Das ha so man-
chen Fo sche ag ode –abend ge e e . Ein Dank auch an die egelmäßigen Gäs e des
T ipleB, Aniela, Ch is, Elena, Felix, K is in, Ma ina und S e i ü die seh gemü liche
Zei sowie an den ap e en Mi s ei e Ma kus ü gewisse FAN-Fe en-Ba s. Eileen, danke
ü die ku zweiligen Fah en on Bay eu h nach München und zu ück. Vielen Dank auch
an unse e Pos -Docs Ma in, And ew und John ü all die kleinen und nü zlichen Tipps.
John gebüh mein au ich ige Dank, besonde s in den e s en 2,5 Jah en de A bei !
Ein spezielle G uß geh an diese S elle an den He z Ach e bzw. die Bay eu he Scha -
kop unde um And eas, G ego , Ma kus, Johannes und Michi. Ande l und Johannes, sowie
hie na ü lich auch Jasmin, Claudia S. und Dani, danke ich na ü lich auch ü die a k ä i-
ge Un e s ü zung im Labo .
Ein besonde e Dank geh an meine Kollegen und F eunde im Bü o Ma in und Michael.
Ohne die ielen wissenscha lichen Diskussionen und An egungen wä e ieles nich so
gekommen wie es heu e hie s eh . Auch die wenige wissenscha lichen Gesp äche wa en
wich ig und we den in gu e E inne ung bleiben. Meinem langjäh igen Mi s ei e Michael
gebüh ein besonde e Dank, nich nu ü all die gemeinsamen und mühe ollen S unden
au de Suche nach dem einen Haken, de Be euung on OSI-Laye 8 ode sons eine de
unzähligen Adminis a ions ä igkei en, sonde n auch ü all die Hil en, Gesp äche und das
gesam e D umhe um.
Na ü lich möch e ich mich bei meine Familie bedanken, ohne die das alles, beginnend mi
dem S udium, nich möglich gewesen wä e. Ohne eu e Un e s ü zung wä e das nich ge-
gangen. Zule z geh das g öß e Dankeschön an meine F au Tina, die wäh end de gesam-
en Zei an meine Sei e wa und ieles e möglich und auch e agen muss e. Vielen, ie-
len lieben Dank, mein Scha z.
E klä ung
[125]
Hie mi e siche e ich an Eides s a , die o liegende A bei selbs ändig ange e ig und
keine ande en als die angegebenen Quellen und Hil smi el e wende zu haben. Des Wei-
e en e klä e ich, dass ich nich ande wei ig mi ode ohne E olg e such habe, diese Dis-
se a ion einzu eichen. Ich habe keine gleicha ige Dok o p ü ung an eine ande en Hoch-
schule endgül ig nich bes anden.
Bay eu h, den 05.06.2013 ………………………………
Lukas Eisold
