Kathrin Maria Gerda Schilke
Dr. med.
Untersuchung der molekulargenetischen Grundlage der Rifampicin- und Isoniazid-
Resistenz von afrikanischen Isolaten des M. tuberculosis Komplexes
Geboren am 02.10.1968 in Göttingen
Reifeprüfung am 11.06.1988 in Kiel
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom WS 1989 bis SS 1995
Physikum am 02.09.1991 an der Universität Heidelberg
Klinisches Studium in Heidelberg
Praktisches Jahr in Heidelberg und Stockholm
Staatsexamen am 31.10.1995 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Kinderheilkunde
Doktorvater: Prof. Dr. med. H. J. Bremer
Thema der Arbeit sind die molekulargenetischen Grundlagen der Rifampicin- und Isoniazid
(INH)-Resistenz von Mykobakterien in Ländern mit einem hohen Infektionsrisiko für
Tuberkulose. Diese Grundlagen liefern die Basis, um schnellere, molekulargenetische
Verfahren für die Resistenzdiagnostik zu entwickeln und geben die Leitlinien für das Design
zukünftiger Antituberkulotika.
Die Rifampicin-Resistenz von Mykobakterien gilt als ein Marker für Resistenzen gegen
weitere Antituberkulotika, die sogenannte Multiresistenz. Die molekulare Basis dieser
Resistenz beruht auf Mutationen in einem umschriebenen Abschnitt des rpoB Gens, das die β-
Untereinheit der RNA-Polymerase kodiert. Die Mutationen bewirken, daß Rifampicin nicht
mehr an dieses Enzym binden und die Transkription und RNA-Elongation verhindern kann.
Die Analyse des rpoB Gens Rifampicin-resistenter Stämme des M. tuberculosis Komplexes
mittels PCR und direkter Sequenzierung wurde mit einer Sensitivität von 100 % in 113
untersuchten Isolaten etabliert. Bei 94 % der 103 Rifampicin-resistenten Stämme, darunter 79
multiresistenten Stämmen aus Südafrika, wurden ‘missense’ Mutationen im zentralen
Abschnitt des rpoB Gens gefunden. Neun Codons im Abschnitt von Aminosäureposition 504
bis 533 waren von Mutationen betroffen. 18 unterschiedliche ‘missense’ Mutationen traten
auf. Bei einem Stamm wurde eine silente Mutation gefunden. Mutationen in Codon 504 lagen
außerhalb des bisher bekannten Abschnittes des Gens, der Mutationen trug. In etwa 10 % der
Isolate fanden sich Basenpaarveränderungen in zwei nicht benachbarten Codons des
Abschnittes, sogenannte Doppelmutationen. Die Frequenz und Lokalisation der häufigsten
Mutationen in den sequenzierten Stämmen unterschiedlicher geographischer Herkunft
entsprach im wesentlichen den Ergebnissen von Isolaten aus Nordamerika und Europa. Diese
Vergleichbarkeit und die gefundene hochgradige Konservierung der Sequenz bietet eine gute
Voraussetzung für die Entwicklung einer molekulargenetischen Resistenzdiagnostik für den
klinischen Einsatz. Diese sollte die Vielfalt der Punktmutationen und die Erweiterung des
zentralen Abschnittes des rpoB Gens auf 90 bp berücksichtigen. Außerdem sollten auch
resistente Subpopulationen eines Isolates, die nach Ergebnissen dieser Arbeit nicht selten sind,
erkannt werden.
Obwohl Isoniazid hochspezifisch gegen Mykobakterien wirkt, konnte der
Wirkungsmechanismus bisher nur unvollständig geklärt werden. Das Katalase-Peroxidase
Gen (katG Gen) scheint eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Isoniazid-Resistenz bei
Mykobakterien des M. tuberculosis Komplexes zu spielen. Die Analyse des katG Gens für
124 INH-resistente Isolate zeigte, daß Mutationen nicht zufällig im Gen verteilt vorkommen,
sondern in ausgewählten Positionen der gut konservierten Gensequenz liegen. Der Position
315 kann ein hoher Stellenwert bei der Entwicklung schneller Screening-Methoden für die
INH-Resistenz zugesprochen werden, da Mutationen in diesem funktionell relevanten Codon
in zwei Dritteln der Stämme des M. tuberculosis Komplexes aus Süd-, Zentral- und
Westafrika gefunden wurden.
Ein wichtiges Ergebnis ist der Polymorphismus der Sequenz von Codon 463 unter INH-
empfindlichen Isolaten von M. africanum. In dieser Position erscheint die geographische
Herkunft der Isolate und nicht ihre INH-Resistenz für die Konformität des Codons
entscheidend. Aus diesem Grund sollte Codon 463 nicht für die INH-Resistenzdiagnostik
herangezogen werden, es kann jedoch ein hilfreicher phylogenetischer Marker innerhalb von
Stämmen des M. tuberculosis Komplexes sein.
Durch Kombination mit der Analyse des DNA-Fingerabdruckes für alle Stämme wurde die
Klonalität von Isolaten mit gleichen Resistenz-Gen Mutationen untersucht. Für die Isolate aus
Südafrika ergaben sich mit der Mixed-Linker-PCR-Methode 72 individuelle Bandenmuster
des DNA-Fingerabdruckes. 27 Stämme teilten ihr Bandenmuster jeweils mit einem oder
mehreren weiteren Isolaten. Es traten neun Cluster, definiert als Stämme mit 100 %
identischem DNA-Fingerabdruck, mit je zwei Isolaten, und zwei Cluster mit vier bzw. fünf
Isolaten auf. Unter Berücksichtigung der Analysen des rpoB Gens, des katG Gens und
phänotypischer Merkmale der Stämme wie Resistenz gegen weitere Antituberkulotika und
epidemiologischer Patientendaten ergaben sich Hinweise auf Klonalität in vier der Cluster, die
jeweils aus zwei Isolaten bestanden. Ein Anhaltspunkt für eine klonale Ausbreitung
bestimmter Stämme in den einzelnen Krankenhäusern ergab sich nicht. An diese Arbeit
schließt sich eine prospektive Studie über die Klonalität der Tuberkulose in einer
südafrikanischen Provinz während eines Jahres an, die zentrale Fragestellung ist die
Ausbreitung resistenter Stämme.
