Wettbewerbsfähige Reverse Transkription - Polymerase - Kettenreaktion (RT - PCR) zur Untersuchung von Apo 3 - Genexpression

Martin Rexin

Dr. med. dr rer. nat. Kompetitive Reverse Transkription - Polymerase - Kettenreaktion (RT - PCR) zur Untersuchung der Apo-Genexpression geboren am 22.03.1959 in Mannheim Reifeprüfung am 28.04.1978 in Ladenburg Studiengang der Fachrichtung Medizin von SS 1993 bis SS 1998 Physik am 30.03.1994 an der Universität Heidelberg Klinische Studie an der Universität Heidelberg

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelte ich daher eine hochsensible Methode auf der Grundlage einer Polymerase-Kette-Reaktion (PCR) zur qualitativen und quantitativen Nachweis der Expression eines Gens (Apo) in Makrophagen. Dabei wurde zunächst das gesamte RNA mit Hilfe des Enzyms Reverse Transcriptase (RT) in die komplementäre DNA (cDNA) übertragen. Schließlich wurden die cDNA-Kopien zunächst qualitativ mit Hilfe eines hochsensiven PCR nachgeprüft. Zur Quantifizierung wurde dann ein spezifisches DNA-Standardfragment konstruiert, das den einzelnen cDNA-Sampf in einer definierten Konzentration zugelassen und in der PCR ko-amplifiziert wurde (Standard).

Mit Hilfe der entwickelten Methode wurden die Apo

- mRNA - Konzentrationen in Makrophagen

Patienten mit dieser familiären Fettwechselstörung sind in der Regel homozygot für ein Apo-Allel (2), das für eine receptor-bindende Isoform des Apo E (E2) kodiert. Die Daten deuten darauf hin, dass dieses funktionell fehlerhafte Allel fast doppelt so stark ausgedrückt wird wie das des Wildtyps in gesunden Probanden.

Darüber hinaus wurde ein Patient mit klinisch schwerem HLP-Typ III und familiärem Apo-E-Mangel in Bezug auf die Apo-Genexpression untersucht. Bei diesem Patienten führt eine 10 bp-Deletion im vierten Exon des Apo-Gens zur Bildung eines vorzeitigen Stop-Codons, wodurch die Synthese einer verkürzten und offenbar sehr instabilen Apo-E-Fragmenten resultiert. Da die DNA-Sequenz, die mit der hier entwickelten PCR-Methode verstärkt wird, in einem Bereich lokalisiert ist, der wesentlich weiter in der 5' Richtung (upstream) dieser Deletion liegt, konnte ich zeigen, dass dieser Patient noch ein hohes Apo-mRNA-Synthesis hat.