Martin Rexin
Dr. med. Dr. rer. nat.
Kompetitive Reverse Transkription - Polymerase - Kettenreaktion (RT - PCR) zur
Untersuchung der Apo ε - Genexpression
Geboren am 22.03.1959 in Mannheim
Reifeprüfung am 28.04.1978 in Ladenburg
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom SS 1993 bis SS 1998
Physikum am 30.03.1994 an der Universität Heidelberg
Klinisches Studium in Heidelberg
Praktisches Jahr in Pforzheim
Staatsexamen am 13.05.1998 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Innere Medizin
Doktorvater: Herr Priv.-Doz. Dr. med. G. Feussner
Die klassische Methode zur Untersuchung der Expression von Genen besteht in der Analyse von
deren mRNA mittels Gelelektrophorese, Blotting und anschließender Hybridisierung mit spezifisch
markierten DNA - Sonden („Northern.Blot“). Diese Methode ist aufwendig und mit gewissen
Nachteilen behaftet. Zum einen tendiert man immer mehr dazu, das Arbeiten mit Radioaktivität zu
vermeiden, was zur Entwicklung fluoreszenzmarkierter DNA - Proben führte. Zum anderen werden
für derartige Hybridisierungsexperimente große Mengen an mRNA benötigt, die bei der
Untersuchung von nur wenigen Zellen einfach nicht zur Verfügung stehen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelte ich daher eine hochsensitive Methode auf der Basis
einer Polymerase - Kettenreaktion (PCR), um die Expression eines Gens (Apo ε) in Makrophagen
sowohl qualitativ als auch quantitativ nachzuweisen. Dabei wurde Gesamt - RNA zunächst mittels
des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) in die komplementäre DNA (cDNA) überführt. An-
schließend wurden die cDNA - Kopien mithilfe einer hochsensitiven PCR zunächst qualitativ nach-
gewiesen. Zur Quantifizierung wurde dann ein spezifisches DNA - Standardfragment konstruiert,
welches den einzelnen cDNA - Proben in definierter Konzentration zugegeben und in der PCR
koamplifiziert wurde (interner Standard). Aufgrund identischer Primersequenzen kompetierte dieses
Fragment die PCR - Amplifikation des Zielgens, wodurch die Quantifizierung desselben ermöglicht
wurde (kompetitive PCR). Die Messungen konnten mit Gesamt - RNA - Mengen von nur 1 - 2 µg
durchgeführt werden.
Mittels der entwickelten Methode wurden die Apo ε - mRNA - Konzentrationen in Makrophagen
von Patienten mit Typ III - Hyperlipoproteinämie (HLP) gemessen und mit denen einer alters- und
geschlechtsangeglichenen Kontrollgruppe verglichen. Patienten mit dieser familiären Fettstoff-
wechselstörung sind in aller Regel homozygot für ein Apo ε - Allel (ε2), das für eine rezeptor-
bindungsdefekte Isoform des Apo E (E2) kodiert. Die Daten weisen darauf hin, daß dieses
funktionell fehlerhafte Allel nahezu doppelt so stark exprimiert wird wie das des Wildtyps bei
gesunden Probanden. Wir schlußfolgern, daß es sich dabei am ehesten um einen physiologischen
Mechanismus zur Kompensation des defekten Genprodukts handelt.
Darüberhinaus wurde ein Patient mit klinisch schwerer Typ III - HLP und familiärem Apo E -
Mangel hinsichtlich der Apo ε - Genexpression untersucht. Bei diesem Patienten führt eine 10 bp -
Deletion im vierten Exon des Apo ε - Gens zur Bildung eines vorzeitigen Stop-Kodons, woraus die
Synthese eines verkürzten und offenbar sehr instabilen Apo E - Fragments resultiert. Da die DNA -
Sequenz, die mittels der hier entwickelten PCR - Methode amplifiziert wird, in einem Bereich
lokalisiert ist, der sich wesentlich weiter in 5´- Richtung („upstream“) dieser Deletion befindet,
konnte ich zeigen, daß bei diesem Patienten dennoch eine normal hohe Apo ε - mRNA - Synthese
vorlag. Hinsichtlich des molekularen Gendefekts unterscheidet sich dieser Patient somit von zwei
anderen in der Literatur beschriebenen Fällen von familiärem Apo E - Mangel, bei denen kaum
nachweisbare Mengen an Apo ε - mRNA gebildet werden.
