Prisca-Maryla Henheik
Dr. sc. hum.
Identifizierung und Charakterisierung von GDNF und TGF-β1 als neurotrophe
Komponenten sekretorischer Speicherorganellen boviner chromaffiner Zellen
Geboren am 17.08.1962 in Ebstorf
Reifeprüfung am 14.05.1981 in Dannenberg
Studiengang der Fachrichtung Chemie Diplom vom WS 1981 bis SS 1994
Vordiplom am 16.02.1989 an der Universität Göttingen
Diplom am 06.05. 1994 an der Universität Göttingen
Promotionsfach: Anatomie und Zellbiologie
Doktorvater: Prof. Dr. med. K. Unsicker
Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die neurotrophe Aktivität isoliert aus den
sekretorischen Speicherorganellen boviner chromaffiner Zellen bzw. freigesetzt nach cholinerger
Stimulation kultivierter chromaffiner Zellen zu identifizieren und zu charakterisieren.
Die Isolierung der für die neurotrophe Aktivität verantwortlichen Proteine wurde mit
proteinchemischen Reinigungsmethoden versucht. Bei allen Aufreinigungsschritten diente der
hochspezifische Assay an Ciliarganglien-Neuronen als Kontrolle für eine mögliche Anreicherung
der neurotrophen Aktivität. Zunächst sollte eine möglichst vollständige Trennung der
neurotrophen Aktivität von Chromogranin A, der Hauptkomponente des Proteingemisches
chromaffiner Granula, erzielt werden. Dies wurde mit Hilfe von zwei Trennverfahren, der
präparativen isoelektrischen Fokussierung und der Affinitäts-Chromatographie an Heparin-
Sepharose, erreicht. Die isoelektrische Fokussierung charakterisierte basische Proteine, die im
pH-Bereich von 9,0 bis 9,2 fokussierten, als neurotroph. Bei der Affinität der neurotrophen
Aktivität zu Heparin handelte es sich um eine lockere Bindung, die bereits durch 0,6 M NaCl
eluiert wurde. Darüberhinaus ergab die Inkubation mit N-Glykosidase F eine Verschiebung der
Molekulargewichte der Proteine, so daß auf ein Vorhandensein von Glykoproteinen geschlossen
werden konnte. Bei den sich anschließenden Aufreinigungsversuchen war jedoch keine
neurotrophe Aktivität mehr zu detektieren. Im Verlauf der Arbeit stellte sich heraus, daß zwei
synergistisch wirkende Faktoren nur gemeinsam eine neurotrophe Aktivität aufwiesen. Die
verschiedenen proteinchemischen Methoden führten zur Trennung der Komponenten und daher
immer zum Verlust der neurotrophen Aktivität.
Für zwei von chromaffinen Zellen synthetisierte Wachstumsfaktoren, TGF-β1 und GDNF,
konnte durch Immunpräzipitation und anschließendem Western Blot die Lokalisation in
chromaffinen Granula und deren Freisetzung in das Kulturmedium kultivierter chromaffiner
Zellen nach cholinergem Stimulus gezeigt werden. Der Freisetzungsmodus schien Calcium-
abhängig zu sein, da einerseits die Blockade der Calciumkanäle durch Verapamil die Carbachol-
stimulierte Freisetzung beider Faktoren reduzierte und andererseits die Gabe eines Calcium-
Ionophors zur Freisetzung der Faktoren ausreichte.
Der Nachweis, daß es sich bei diesen in chromaffinen Granula lokalisierten Wachstumsfaktoren,
TGF-β1 und GDNF, um die für die neurotrophe Aktivität verantwortlichen gesuchten Proteine
handelte, gelang durch die fast vollständige Neutralisation der Aktivität an Ciliarganglien-
Neuronen von GDNF und TGF-β1 im Proteingemisch chromaffiner Granula, durch für diese
Faktoren spezifische Antikörper.
Als Gegenprobe wurden die gereinigten rekombinanten Proteine getestet. TGF-β1 und GDNF
hatten einzeln appliziert keinen überlebensfördernden Effekt auf Ciliarganglien-Neurone. Die
kombinierte Gabe von beiden Faktoren resultierte in einer CNTF-vergleichbaren Aktivität.
Dieser Synergismus von TGF-β und GDNF konnte in vitro nicht nur für das Überleben von
Ciliarganglien-Neuronen, sondern auch für Spinalganglien-Neurone und auch für die
sympathischen Neurone des Grenzstrangs des Hühnchens gezeigt werden.
Als dem Synergismus zugrundeliegender molekularer Mechanismus wurde der Einfluß von
TGF-β auf die GPI-Verankerung des Alpha-Rezeptors (GFR-α) von GDNF untersucht. TGF-β
schien an der Bereitstellung des GFR-α beteiligt zu sein.
Zusammenfassend kann man sagen, daß es im Rahmen dieser Dissertation gelungen ist, die für
die neurotrophe Aktivität verantwortlichen Proteine im Proteingemisch chromaffiner Granula als
die in Synergie agierenden Wachstumsfaktoren TGF-β1 und GDNF zu identifizieren.
